JPH074248B2 - 核酸増幅反応の汚染を制御する方法 - Google Patents

核酸増幅反応の汚染を制御する方法

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JPH074248B2
JPH074248B2 JP2143233A JP14323390A JPH074248B2 JP H074248 B2 JPH074248 B2 JP H074248B2 JP 2143233 A JP2143233 A JP 2143233A JP 14323390 A JP14323390 A JP 14323390A JP H074248 B2 JPH074248 B2 JP H074248B2
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Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、核酸配列を増幅する方法に関する。特に、本
発明は、その後の増幅方法の実施に悪影響を及ぼす、核
酸増幅方法の実施産物を排除する方法を開示する。
［従来の技術］ ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）方法は、変性、プライマ
ーのアニーリングおよびDNAポリメラーゼによるプライ
マーの延長を含む一連の操作を通して特定の核酸配列を
増幅する（ムリンス・ケービー等、アメリカ特許第4,68
3,202号、アメリカ特許第4,683,195号、ムリンス・ケー
ビー、ヨーロッパ特許第201,184号、エルリッヒ・エイ
チ、ヨーロッパ特許第50,424号、第84,796号、第258,01
7号、第237,362号、エルリッヒ・エイチ、アメリカ特許
第4,582,788号、サイキ・アール等、アメリカ特許第4,6
83,202号、ルリンス・ケービー等、コールド・スプリン
グ・ハーバー・シンポジウム、クオンティタティブ・バ
イオロジー（Cold Spring Habor Symp.Quant.Bio
l.）、51巻263頁（1986年）、サイキ・アール等、サイ
エンス（Science）、230巻1350頁（1985年）、サイキ・
アール、サイエンス（Science）、231巻487頁（1988
年）、ロー・イーワイ等、サイエンス（Science）、243
巻217頁（1988年）参照）上記引用文献は、引用して本
明細書に包含させる。）。これらの段階は何回も反復す
ることができ、原特定配列のコピー数の大きな増幅をも
たらすことができる。DNA1分子でさえも増幅して数百ナ
ノグラムの産生物を産生することができる（リー・エイ
チ等、ネイチャー（Nature）、335巻414頁（1988
年））。
他の既知核酸増幅方法はコウ・ディー等、プロシーディ
ングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシーズ・ユーエスーエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA）、86巻1173頁（1989年）の転写に基づく増幅システ
ムを含んでいる。
技術用語である「ウラシルDNAグリコシラーゼ」（UDG）
は塩基ウラシルおよび糖デオキシリボーズ間のグリコシ
ド結合を開裂する酵素を意味し、単量体ヌクレオチドdU
TPがDNA分子に組み入れられているときだけ、デオキシ
ウリジン部分の組み入れをもたらす（デュカン・ビー、
ザ・エンザイムズ（The Enzymes）、14巻565頁（1981
年）、編集：ボイヤー・ピー）。この酵素は遊離dUTP、
遊離デオキシウリジンまたはRNAには作用しない（デュ
カン、前掲）。
PCRのような増幅方法の結果は、増幅産生物自体がその
後のPCR法の基質となることができることである。さら
に、増幅産生物の量が大きくなり得るため、実験質の中
でのPCR反応のような反応のごく小さい分画の散乱でさ
えも、その後の他のサンプルを増幅する試みの汚染を導
くことがあり得る。
本発明は、天然に産するDNAを増幅産生物から識別可能
とすることにより一般にインビトロ核酸増幅法における
改善を表す。したがって、上記産生物は次の増幅反応の
開始前にその後の増幅に対する鋳型として不活性化され
る。
［発明の構成］ 本発明は増幅法の間のDNAまたはRNAの中へエキソサンプ
ルヌクレオチドを組み入れる方法を含む。本発明は、サ
ンプルからの核酸を増幅する能力に影響を受けないまま
残す処理によって、以前の増幅生成物を以後の増幅から
除去する。この処理は核酸の増幅に関連する主な問題、
すなわち、以前増幅方法の最終産生物による出発原料の
汚染を大きく減少させる。言い替えれば、本発明は増幅
産生物に対する識別方法であって、一般に次の増幅反応
の出発より前に行なうもので、天然に見られる核酸を有
利に扱うものである。
さらに具体的に、本発明は特定の核酸配列の増幅に酵素
を利用するインビトロ製法に関する。上記製法の１つの
冷としてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）が知られてい
る。PCR法および他の同様な方法の重要な制限因子は、
それぞれの反応の最終産生である増幅核酸による実験環
境の汚染である。上記汚染は一般に関心のあるサンプル
中に存在することのできる標準核酸の増幅だけでなく、
前の反応の汚染最終産生物の増幅ももたらす。本発明は
標準核酸の望ましい増幅に影響しないでこの型の汚染を
できるだけ除去する方法を提供する。
本発明は、増幅が望まれているサンプル中に見られる核
酸中では一般的に欠如しているかまたはまれにしか存在
しない１つまたはそれ以上のエキソサンプルヌクレオチ
ドにより、４つの正常リボヌクレオシドトリホスフェー
ト（rNTPs）またはデオキシリボヌクレオシドトリホス
フェート（dNTPS）の１つまたはそれ以上が置換され
る、増幅法をまず実施することを含む。上記増幅方法の
間で製造されたDNAまたはRNAはサンプル核酸から区別す
ることができる。すなわち、増幅方法の前または次の増
幅方法の間にサンプルDNAまたはRNAを目的として増幅で
産生した核酸にたいして区別し、その結果前の増幅した
核酸はこれ以上増幅することができないが、サンプルDN
AまたRNAは増幅し続けるようにすることができる。
様々な核酸増幅方法の発明以来、増幅の前回路の産生物
によりインプット核酸の汚染を除去する方法を開示した
ものは今までにない。
［発明の記載］ ここで使われる用語「増幅」はヌクレオチド配列または
複数の配列のコピー数を増加する任意のインビトロ方法
を表している。核酸増幅はDNAまたはRNAの中へのヌクレ
オチドの組み入れをもたらす。
「ヌクレオチド」は塩基−糖−りん酸塩結合物を表す技
術用語である。ヌクレオチドは核酸ポリマー、すなわち
DNAおよびRNAの単量体ユニットである。この語はrATP、
rCTP、rGTPまたはrUTPのようなリボヌクレオシドトリホ
スフェートおよびdATP、dCTP、dGTPまたはdTTPのような
デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートを含む。
「ヌクレオシド」は、塩基−糖結合物、すなわちりん酸
部分を欠失しているヌクレオチドを表す技術用語であ
る。ヌクレオシドおよびヌクレオチドという用語の使用
においてある種の交換可能性があることが当分野で認め
られている。冷えば、ヌクレオチドであるデオキシウリ
ジントリホスフェート、dUTPはデオキシリボヌクレオシ
ドトリホスフェートである。DNAに組み入られた後、そ
れはDNAモノマーとして働き、形式的にデオキシウリジ
レート、すなわちdUMPまたはデオキシウリジンモノホス
フェートである。結果として生ずるDNA中にdUTP部分が
なくても、DNAの中にdUTPを組み入れたということがで
きる。同様に、基質分子の１部分にすぎないとしても、
DNAの中にデオキシウリジンを組み入れたということが
できる。
ここで使われる用語「エキソサンプルヌクレオチド」は
一般に増幅すべきサンプル中に見られないヌクレオチド
を表している。ほとんどのDNAサンプルでは、デオキシ
ウリジンがエキソサンプルヌクレオチドの例である。デ
オキシウリジントリホスフェート型、dUTPは代謝中間体
として生物体に存在しているが、ほとんどDNA中に組み
入れられない。dUTPが偶然DNA中に組み入れられると、
結果として生ずるデオキシウリジンは例えば酵素UDGが
関与する方法のような正常過程によりインビトロで素早
く除去される。すなわち、デオキシウリジンは天然DNA
中ではほとんどまたは決して存在しない。ある種の生物
体はDNA中にデオキシウリジンを自然に組み入れること
ができることが認められている。これらの生物体の核酸
サンプルではデオキシウリジンはエキソサンプルヌクレ
オチドと考えられない。デオキシウリジンまたは他のエ
キソサンプルヌクレオチドの存在は当業者によく知られ
た方法により容易に測定することができる。他のエキソ
サンプルヌクレオチドも想像することができる。多くの
DNAグリコシラーゼは当業者には知られている。増幅の
間にDNAに組み入れることのできるエキソサンプルヌク
レオチドおよびそれに作用するDNAグリコシラーゼは本
発明中で使うことができる。同様に、ブロモデオキシウ
リジン（BduR）はDNAに組み入れ得ることが当業者に知
られている。BduRを含むDNAは適当は条件下光にさらす
ことにより分解することができる。
「組み入れる」という用語は、核酸ポリマーの部分にな
っていることを表す。
「終結する」という用語は、ここでは処理の停止をひき
起こすことを表す。この用語は永久的および条件付きの
両方の停止方法を含む。例えば処理が酵素的ならば、永
久的熱変性および酵素活性範囲の範囲外の温度のための
酵素活性喪失の両方がこの用語の範囲内にある。
本発明の方法では、増幅法は、４つの正常リボヌクレオ
シドトトリホスフェート（rNTRs）またはデオキシリボ
ヌクレオシドトリホスフェート（dNTPs）の１つまたは
それ以上がエキソサンプルヌクレオチドで置きかえられ
ている第１サンプルで実施する。増幅後、残っている可
能性がある汚染増幅産生は、エキソサンプルヌクレオチ
ドを含む核酸を実質的に増幅できなくする物理的、化学
的、酵素的または生物学的処理に付する。処理は分割し
た段階として行なうことができ、または好ましくは増幅
すべき核酸配列を含む第２サンプルの存在下でなされる
ことができる。第２サンプルを汚染する第１サンプルか
ら由来した増幅核酸配列は、第２サンプルの核酸配列の
増幅間に実質的にこれ以上増幅しない。
デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートであるdUTP
は、ここでPCRにより例示された酵素的DNA増幅製法を都
合よく組み入れることができ、それにより、デオキシウ
リジン−含有DNAがもたらすエキソサンプルヌクレオチ
ドの例である。上記反応のDNA産生は普通多くのウラシ
ル塩基を含む。天然DNAおよび生成物である、増幅法の
デオキシウリジン含有産生物の識別は、ウラシルDNAグ
リコシラーゼ（UDG）という酵素で得られる。ウラシルD
NAグリコシラーゼによるウラシル塩基含有DNAの処理はD
NA糖−りん酸塩骨核およびウラシル塩基の間のグリコシ
ド結合の開裂をもたらす。ウラシルの欠失によりDNA中
に非ピリミジン部位をつくることになり、これが相補DN
A鎖の合成鋳型として使用されるDNA鎖からDNAポリメラ
ーゼを遮断する（シャッパー・アール等、プロシーディ
ングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシース・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.US
A）、第80巻487頁（1983年））。各DNA標的分子中の非
ピリミジン部位の実質的な数の存在は、標的DNAのコピ
ーを合成するDNAポリメラーゼを使用する増幅法を妨げ
る。
ここに例示したように、基礎的な増幅プロトコールはPC
R方法としてよく知られている。PCRは次の３つの方法で
修飾されている。（１）dUTPはdTTPで置換され、（２）
UDGが最初のPCR反応混合物に加えられ、および（３）最
初のインキュベーション時間が、UDGが前のPCR反応の汚
染産生を破壊するために加えられる。UDG自体は最初のP
CRサイクルで高温により永久的に不活性化させるか、現
在望ましいPCRプロトコールではTagポリメラーゼで使っ
た高温で活性でないかのどちからである。この不活性化
のためにUDGは最近合成されたPCR産生物を破壊すること
ができない。UDG活性を除去しない核酸増幅プロトコー
ルは普通別のUDG不活性段階を必要とする。
エキソサンプルヌクレオチドを含む核酸に増幅方法に抵
抗性を付与する物理的、化学的、酵素的または生物学的
処理の終結が望ましいが（ここに例示した、UDGの熱不
活性化のように）、本発明は終結段階が欠失した具体例
を含む。例えば出発原料の予期される汚染を除くのに充
分高いが増殖速度に張りあうには不充分な量の酸素およ
び処理時間を使うことができる。すなわち、処理は汚染
核酸を破壊することができるが、増幅方法は、処理が最
近合成された核酸を破壊するより速く新しい核酸を製造
し得ることである。
ここで記載した本発明に様々な変化を考えることができ
る。例えば増幅はエキソサンプルヌクレオチドなしで、
正常ヌクレオチドを用いてなされる。増幅したDNAの正
常ヌクレオチドはその後エキソサンプルヌクレオチドに
置換される。変換したDNAはその後それが後に汚染する
サンプルから除去することができる。その例は隣りのピ
リミジン残基、特にチミジンをピリジン二量体（チミジ
ン二量体）に変換することで、これはDNAは鋳型として
不適当にする。チミジン二量体はエクソヌクレアーゼVI
IおよびrecBCのような酵素により除去され得る。
実施例 ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）はヒト乳頭腫ウイル型16
（HPV16）DNAの１領域を増幅するために実施した（デュ
ルスト・エム等、プロシーディングス・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・ユーエス
エイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、第80巻3812頁（1983
年））。使用したプライマーの配列は５′GGTCGATGTATG
TCTTGTTG3′および５′GTCTACGTGTGTGCTTTGTAC3′であ
る。
HPV16DNAは制限酵素BamHIで完全な長さのプラスミドク
ローンpT7HPV16から切り出した（本発明の目的としてシ
ードフ・ケイ等、バイロロジー（Virol.）、145巻181頁
（1985年）記載のpUC8プラスミドと均等）。直鎖DNA（1
0ピコグラム）を、50マイクロリットルの25mMトリス−H
ClpH8.3、MgCl25mM、NaCl50mM、0.01％ゼラチン、dAT
P、dGTP、dCTPをそれぞれ0.2mM、dUTPまたはdTTPのいず
れかを0.2mM、それぞれのプライマーを１マイクロモル
およびテルムス・アクアティクス（Thermus aqaticu
s）（シータス／パーキン−エルマー社）からの熱安定D
NAポリメラーゼ12.5ユニットを含むPCR反応物に加え
る。反応は次を温度表を使ってサーマルシルサー（シー
タス／パーキン−エルマー社）で増幅した。94℃５分
間、その後94℃１分を（変性）、55℃で２分間（アニー
リング）および72℃３分間（プライマー延長）を30サイ
クル。温度サイクル完了後、72℃10分間、最後の延長を
した。PCR反応産生物（レイン当り各反応物５マイクロ
リットル）のアガロース／臭化エチルジウムゲル電気泳
動（マニアティス・ティー等、モレキュラー、クローニ
ング（Molecular Cuoning）、コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー（1982年））で84塩基対HPV16D
NAフラグメントの増幅を確認した。全反応物は実質的増
幅を示した。HPV16DNAのない陰性対照反応ではDNA産生
物は製造されなかった。
PCR増幅産生物の濃度はアガロースゲルから推定した。
新規PCR反応物はdTTPの組み入れから生ずるデオキシチ
ミジンまたはdUTP含有反応から生ずるデオキシウリジン
のいずれかを含む増幅産生物の10フェントグラム量で汚
染されていた。陽性対照反応物は直鎖HPV16DNA10ピコグ
ラムを含む。新規PCR反応物はdTTPのかわりにdTTP、UDG
5ナノグラム（ファン・デ・サンデ・イェー、ユニバー
シティ・オブ・カルガリー、デュカン・ラボラトリーズ
（Ducan Laboratories）、アメリカ合衆国10301 ペン
シルバニア、パオリ、イー・セントラル・アベニュー
19番）を含むかまたはUDGなしであった。全反応物は37
℃15分間インキュベートし、デオキシウリジン含有DNA
に対してUDGを作用させ、その後上記と同じ熱サイクル
プロトコール通りに行う。各反応の一定量をアガロース
／臭化エチジウムゲル電気泳動により分析した。
アガロースゲル分析では、UDG処理なしでデオキシウリ
ジン含有PCR産生物は再増幅することができ、ゲル電気
泳動で明らかなように正常HPV16DNAを増幅することによ
り得られる産生物から大きさでは区別することのできな
いDNA産生物を得ることが示された。デオシウリジン含
有DNAをPCRより間にUDGとインキュベートする反応でア
ガロースゲル上で可視産生物を与えなかった。デオキシ
チミジンを含むPCR増幅産生物はUDGとインキュベートし
てもしなくてもうまく増幅する。この実験はUDGが実質
的にデオキシウリジンを含むPCR産生物の増幅を停止す
るが、デオキシチミジンを含むDNAの増幅に実質的に影
響を与えないことを示した。
上記は特に好ましい実施例を述べたが、それにより本発
明が制限されるものではないことは理解できる。様々な
修飾は記載した実施態様についてなされ、上記修飾は本
発明の範囲内であることが当業者に理解される。

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ａ）核酸配列の増幅の間に第１サンプルの
    核酸にデオキシウリジンを組み入れる段階と、 ｂ）第２サンプルの核酸にウラシルDNAグリコシラーゼ
    処理を施す段階 を含み、それにより第２サンプルを汚染する第１サンプ
    ル由来の増幅核酸配列が第２サンプルの核酸配列の増幅
    の間に実質的にこれ以上増幅しないようにすることから
    なる、１つまたはそれ以上の核酸配列を増幅する方法。
  2. 【請求項２】さらに ｃ）第２サンプルの核酸配列を増幅する段階を含む請求
    項１記載の方法。
  3. 【請求項３】さらに ｄ）段階ｂ）の処理を終結させる段階を含む請求項１記
    載の方法。
  4. 【請求項４】終結を熱により達成する請求項３記載の方
    法。
  5. 【請求項５】増幅が、１種の核酸または核酸の混合物
    （各核酸は同じまたは異なった長さの２種の別の相補鎖
    を含む）中に含まれる少なくとも１種の特定の核酸配列
    を増幅する方法であり、さらに ｅ）鎖を、増幅させているぞれぞれの異なった配列につ
    いて、それぞれの核酸鎖に相補的なそれぞれのプライマ
    ーの延長産生物が合成されるような条件下で、増幅され
    ているそれぞれの異なった特定配列に対する２種のオリ
    ゴヌクレオチドプライマーで処理し、上記プライマー
    は、それぞれの特定配列の異なった鎖に充分相補的で相
    手とハイブリダイズし、その結果１種のプライマーから
    合成された延長産生物がその相補体から分離するとき、
    他方のプライマーの延長産生物の合成と鋳型として働く
    ように選ばれたものであり、 ｆ）プライマー延長産生物をそれらが合成された鋳型か
    ら分離して一本鎖分子を生じ、 ｇ）プライマー延長産生物が段階ｆ）で製造された一本
    鎖のそれぞれを鋳型として使って合成される条件下にお
    いて段階ｅ）のプライマーで段階ｆ）から発生した一本
    鎖分子を処理する ことからなる請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】（Ａ）１種の核酸配列または核酸配列混合
    物（それぞれの核酸配列は同じまたは異なった長さの２
    種の別の相補鎖を有する）を含む第１サンプルについ
    て、 ａ）鎖を、増幅させているそれぞれの異なった配列につ
    いて、それぞれの核酸鎖に相補的でデオキシウリジンを
    組み込んでいるそれぞれのプライマーの延長産生物が合
    成されるような条件下で、増幅されているそれぞれの異
    なった特定配列に対する２種のオリゴヌクレオチドプラ
    イマーで処理し、上記プライマーは、それぞれの特定配
    列の異なった鎖に充分相補的で相手とハイブリダイズ
    し、その結果１種のプライマーから合成された延長産生
    物がその相補体から分離するとき、他方のプライマーの
    延長産生物の合成の鋳型として働くように選ばれたもの
    であり、 ｂ）プライマー延長産生物をそれらが合成された鋳型か
    ら分離して一本鎖分子を生じ、 ｃ）プライマー延長産生物が段階ｂ）で製造された一本
    鎖のそれぞれを鋳型として使って合成される条件下にお
    いて段階ａ）のプライマーで段階ｂ）から発生した上記
    一本鎖分子を処理し、 ｄ）少なくとも１回は段階（ａ）から（ｃ）を反復しそ
    れにより第１サンプルに含まれる特定核酸配列を増幅
    し、および （Ｂ）１種の核酸配列または核酸配列混合物（それぞれ
    の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
    鎖を有し、段階（Ａ）の増幅核酸配列は第２サンプル中
    に存在することができる）を含む第２サンプルについ
    て、 ｅ）鎖をウラシルDNAグリコシラーゼで処理し、 それにより段階（Ａ）中で増幅し、第２サンプル中に存
    在する第１サンプルのプライマー延長産生物が実質的に
    これ以上段階（Ｂ）では増幅しないようにする段階を含
    む、１つまたはそれ以上の核酸配列を増幅する方法。
  7. 【請求項７】段階（Ｂ）の間に ｆ）少なくとも１回は段階（ａ）から（ｃ）を反復しそ
    れにより第２サンプルに含まれる特異核酸配列の任意の
    ものを増幅する 段階を含む請求項６記載の方法。
  8. 【請求項８】段階（Ｂ）の間に ｇ）ウラシルDNAグリコシラーゼ処理を終結させる 段階を含む請求項６記載の方法。
  9. 【請求項９】終結を熱により達成する請求項８記載の方
    法。
  10. 【請求項１０】（Ａ）１種の核酸配列または核酸配列混
    合物（それぞれの核酸配列は同じまたは異なった長さの
    ２種の別の相補鎖を有する）を含む第１サンプルについ
    て、 ａ）鎖を、増幅させているそれぞれの異なった配列につ
    いて、それぞれの核酸鎖に相補的でデオキシウリジンを
    組み込んでいるそれぞれのプライマーの延長産生物が合
    成されるような条件下で、増幅されているそれぞれの異
    なった特定配列に対する２種のオリゴヌクレオチドプラ
    イマーで処理し、上記プライマーは、それぞれの特定配
    列の異なった鎖に充分相補的で相手とハイブリダイズ
    し、その結果１種のプライマーから合成された延長産生
    物がその相補体から分離するとき、他方のプライマーの
    延長産生物の合成の鋳型として働くように選ばれたもの
    であり、 ｂ）プライマー延長産生物をそれらが合成された鋳型か
    ら分離して一本鎖分子を生じ、 ｃ）プライマー延長産生物が段階ｂ）で製造された一本
    鎖のそれぞれを鋳型として使って合成される条件下にお
    いて段階ａ）のプライマーで段階ｂ）から発生した上記
    一本鎖分子を処理し、 ｄ）少なくとも１回は段階（ａ）から（ｃ）を反復しそ
    れにより第１サンプルに含まれる特定核酸配列を増幅
    し、および （Ｂ）１種の核酸配列または核酸配列混合物（それぞれ
    の核酸配列は同じまたは異なった長さの２種の別の相補
    鎖を有し、段階（Ａ）の増幅核酸配列は第２サンプル中
    に存在することができる）を含む第２サンプルについ
    て、 ｅ）鎖をウラシルDNAグリコシラーゼで処理し、 ｆ）ウラシルDNAグリコシラーゼの鎖上における作用を
    熱により終結させ、 ｇ）少なくとも１回は段階（ａ）から（ｃ）を反復しそ
    れにより第２サンプルに含まれる特定核酸配列を増幅
    し、 それにより段階（Ａ）中で増幅し、第２サンプル中に存
    在する第１サンプルのプライマー延長産生物が実質的に
    これ以上段階（Ｂ）では増幅しないようにする段階を含
    む、１つまたはそれ以上の核酸配列を増幅する方法。
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