JP2024505686A - ヒトパラインフルエンザウイルス１－４（ｈｐｉｖ１－４）の検出のための組成物及び方法 - Google Patents
ヒトパラインフルエンザウイルス１－４（ｈｐｉｖ１－４）の検出のための組成物及び方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2024505686A JP2024505686A JP2023547435A JP2023547435A JP2024505686A JP 2024505686 A JP2024505686 A JP 2024505686A JP 2023547435 A JP2023547435 A JP 2023547435A JP 2023547435 A JP2023547435 A JP 2023547435A JP 2024505686 A JP2024505686 A JP 2024505686A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- hpiv
- target nucleic
- seq
- primers
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 113
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 77
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 61
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 title claims abstract description 26
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 22
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 568
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 169
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 169
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 49
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 822
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 636
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 636
- 241000712003 Human respirovirus 3 Species 0.000 claims description 213
- 241000726041 Human respirovirus 1 Species 0.000 claims description 201
- 241001559187 Human rubulavirus 2 Species 0.000 claims description 196
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 174
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 159
- 241001559186 Human rubulavirus 4 Species 0.000 claims description 149
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 58
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 46
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 46
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 43
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 claims description 34
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 28
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 claims description 25
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 22
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 16
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 14
- 238000009640 blood culture Methods 0.000 claims description 13
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 claims description 13
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 10
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 10
- -1 Here Chemical class 0.000 claims description 6
- 206010062255 Soft tissue infection Diseases 0.000 claims description 6
- 206010040872 skin infection Diseases 0.000 claims description 6
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 abstract description 207
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 181
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 abstract description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 abstract 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 322
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 154
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 88
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 76
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 47
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 41
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 39
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 39
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 36
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 32
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 30
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 26
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 24
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 24
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 15
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 14
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 13
- 238000007837 multiplex assay Methods 0.000 description 13
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 12
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 12
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 10
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 9
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 9
- 241000342334 Human metapneumovirus Species 0.000 description 9
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 9
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 9
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 7
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 7
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 108010037497 3'-nucleotidase Proteins 0.000 description 5
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 5
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 5
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 5
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 4
- 101001065501 Escherichia phage MS2 Lysis protein Proteins 0.000 description 4
- 101710133291 Hemagglutinin-neuraminidase Proteins 0.000 description 4
- 101710181008 P protein Proteins 0.000 description 4
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 4
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 4
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 201000010549 croup Diseases 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 4
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 4
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 4
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 3
- 206010011416 Croup infectious Diseases 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 241000711504 Paramyxoviridae Species 0.000 description 3
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 3
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 description 3
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N argon Substances [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 3
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 3
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- LIZDKDDCWIEQIN-UHFFFAOYSA-N 6-[2-[5-(3-ethyl-1,1-dimethyl-6,8-disulfobenzo[e]indol-2-ylidene)penta-1,3-dienyl]-1,1-dimethyl-6,8-disulfobenzo[e]indol-3-ium-3-yl]hexanoate Chemical compound C1=CC2=C(S(O)(=O)=O)C=C(S(O)(=O)=O)C=C2C(C2(C)C)=C1N(CC)\C2=C\C=C\C=C\C1=[N+](CCCCCC([O-])=O)C2=CC=C(C(=CC(=C3)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)C3=C2C1(C)C LIZDKDDCWIEQIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 2
- 241000264368 Coptotermes lacteus Species 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 102100034574 P protein Human genes 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 2
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000000695 excitation spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000011330 nucleic acid test Methods 0.000 description 2
- 230000005257 nucleotidylation Effects 0.000 description 2
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000006862 quantum yield reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 238000001429 visible spectrum Methods 0.000 description 2
- 229910052724 xenon Inorganic materials 0.000 description 2
- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon atom Chemical compound [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(dimethylamino)-6-dimethylazaniumylidenexanthen-9-yl]-4-isothiocyanatobenzoate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC(N=C=S)=CC=C1C([O-])=O OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HCGYMSSYSAKGPK-UHFFFAOYSA-N 2-nitro-1h-indole Chemical compound C1=CC=C2NC([N+](=O)[O-])=CC2=C1 HCGYMSSYSAKGPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FTBBGQKRYUTLMP-UHFFFAOYSA-N 2-nitro-1h-pyrrole Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=CN1 FTBBGQKRYUTLMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YJCCSLGGODRWKK-NSCUHMNNSA-N 4-Acetamido-4'-isothiocyanostilbene-2,2'-disulphonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC(NC(=O)C)=CC=C1\C=C\C1=CC=C(N=C=S)C=C1S(O)(=O)=O YJCCSLGGODRWKK-NSCUHMNNSA-N 0.000 description 1
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 description 1
- QXYRRCOJHNZVDJ-UHFFFAOYSA-N 4-pyren-1-ylbutanoic acid Chemical compound C1=C2C(CCCC(=O)O)=CC=C(C=C3)C2=C2C3=CC=CC2=C1 QXYRRCOJHNZVDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JZFTYFVKMBSMFP-UHFFFAOYSA-N 5-chloro-1,3-thiazole-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1=NC=C(Cl)S1 JZFTYFVKMBSMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YERWMQJEYUIJBO-UHFFFAOYSA-N 5-chlorosulfonyl-2-[3-(diethylamino)-6-diethylazaniumylidenexanthen-9-yl]benzenesulfonate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=C(S(Cl)(=O)=O)C=C1S([O-])(=O)=O YERWMQJEYUIJBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TXSWURLNYUQATR-UHFFFAOYSA-N 6-amino-2-(3-ethenylsulfonylphenyl)-1,3-dioxobenzo[de]isoquinoline-5,8-disulfonic acid Chemical compound O=C1C(C2=3)=CC(S(O)(=O)=O)=CC=3C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C2C(=O)N1C1=CC=CC(S(=O)(=O)C=C)=C1 TXSWURLNYUQATR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YALJZNKPECPZAS-UHFFFAOYSA-N 7-(diethylamino)-3-(4-isothiocyanatophenyl)-4-methylchromen-2-one Chemical compound O=C1OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C(C)=C1C1=CC=C(N=C=S)C=C1 YALJZNKPECPZAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035742 Air-borne transmission Diseases 0.000 description 1
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 206010006448 Bronchiolitis Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical class NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000794020 Homo sapiens Bromodomain-containing protein 8 Proteins 0.000 description 1
- 101001006782 Homo sapiens Kinesin-associated protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000615355 Homo sapiens Small acidic protein Proteins 0.000 description 1
- 244000309467 Human Coronavirus Species 0.000 description 1
- 108010000178 IGF-I-IGFBP-3 complex Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100027930 Kinesin-associated protein 3 Human genes 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000203367 Methanothermus fervidus Species 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WGKGADVPRVLHHZ-ZHRMCQFGSA-N N-[(1R,2R,3S)-2-hydroxy-3-phenoxazin-10-ylcyclohexyl]-4-(trifluoromethoxy)benzenesulfonamide Chemical compound O[C@H]1[C@@H](CCC[C@@H]1N1C2=CC=CC=C2OC2=C1C=CC=C2)NS(=O)(=O)C1=CC=C(OC(F)(F)F)C=C1 WGKGADVPRVLHHZ-ZHRMCQFGSA-N 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 201000007100 Pharyngitis Diseases 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N PicoGreen Chemical compound CN(C)CCCN(CCCN(C)C)C1=CC(=CC2=[N+](C3=CC=CC=C3S2)C)C2=CC=CC=C2N1C1=CC=CC=C1 ZYFVNVRFVHJEIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000933967 Pseudomonas phage KPP25 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 241001113283 Respirovirus Species 0.000 description 1
- IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N Ribavirin Chemical compound N1=C(C(=O)N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 229910052771 Terbium Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000042515 Tetraselmis rubens Species 0.000 description 1
- 241000191098 Thermoflexibacter ruber Species 0.000 description 1
- 240000001085 Trapa natans Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102000006943 Uracil-DNA Glycosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010072685 Uracil-DNA Glycosidase Proteins 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Natural products NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000012387 aerosolization Methods 0.000 description 1
- 230000005557 airborne transmission Effects 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N aminothiocarboxamide Natural products NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 1
- 235000021028 berry Nutrition 0.000 description 1
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 description 1
- UIZLQMLDSWKZGC-UHFFFAOYSA-N cadmium helium Chemical compound [He].[Cd] UIZLQMLDSWKZGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010410 calcium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000648 calcium alginate Substances 0.000 description 1
- 229960002681 calcium alginate Drugs 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- OKHHGHGGPDJQHR-YMOPUZKJSA-L calcium;(2s,3s,4s,5s,6r)-6-[(2r,3s,4r,5s,6r)-2-carboxy-6-[(2r,3s,4r,5s,6r)-2-carboxylato-4,5,6-trihydroxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylate Chemical compound [Ca+2].O[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H](C([O-])=O)[C@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O2)C([O-])=O)O)[C@H](C(O)=O)O1 OKHHGHGGPDJQHR-YMOPUZKJSA-L 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- OGEBRHQLRGFBNV-RZDIXWSQSA-N chembl2036808 Chemical class C12=NC(NCCCC)=NC=C2C(C=2C=CC(F)=CC=2)=NN1C[C@H]1CC[C@H](N)CC1 OGEBRHQLRGFBNV-RZDIXWSQSA-N 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000013523 data management Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- KPBGWWXVWRSIAY-UHFFFAOYSA-L disodium;2',4',5',7'-tetraiodo-6-isothiocyanato-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3',6'-diolate Chemical compound [Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=C(N=C=S)C=C2C21C1=CC(I)=C([O-])C(I)=C1OC1=C(I)C([O-])=C(I)C=C21 KPBGWWXVWRSIAY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001317 epifluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical group [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 229910021644 lanthanide ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- DLBFLQKQABVKGT-UHFFFAOYSA-L lucifer yellow dye Chemical compound [Li+].[Li+].[O-]S(=O)(=O)C1=CC(C(N(C(=O)NN)C2=O)=O)=C3C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC3=C1N DLBFLQKQABVKGT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000329 ribavirin Drugs 0.000 description 1
- HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N ribavirin Natural products O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1N=CN=C1 HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000011309 routine diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 125000006488 t-butyl benzyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- GZCRRIHWUXGPOV-UHFFFAOYSA-N terbium atom Chemical compound [Tb] GZCRRIHWUXGPOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000006163 transport media Substances 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
生物学的サンプル又は非生物学的サンプル中のＨＰＩＶ１－４を含むヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）の存在又は非存在を迅速に検出するための方法が記載される。本方法は、増幅する工程、ハイブリダイズする工程、及び検出する工程を実施することを含み得る。さらに、ＨＰＩＶ１－４を標的とするプライマー及びプローブ、並びにＨＰＩＶ１－４の標的領域を検出するために設計されたキットが提供される。ＨＰＩＶ１－４の増幅及び検出のためのキット、反応混合物、及びオリゴヌクレオチド（例えば、プライマー及びプローブ）も記載される。【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
この特許出願は、２０２１年１月２９日に出願された米国仮特許出願番号ＵＳ６３／１４３，１４４及び２０２１年２月５日に出願された米国仮特許出願番号ＵＳ６３／１４６，１５８号に対する優先権を主張し、これらの出願は両方ともその全体が本明細書に援用される。
この特許出願は、２０２１年１月２９日に出願された米国仮特許出願番号ＵＳ６３／１４３，１４４及び２０２１年２月５日に出願された米国仮特許出願番号ＵＳ６３／１４６，１５８号に対する優先権を主張し、これらの出願は両方ともその全体が本明細書に援用される。
発明の分野
本開示は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断の分野に関する。この分野では、本発明は、サンプル中に存在し得る標的核酸の増幅及び検出、特に、プライマー及びプローブを使用した、ヒトパラインフルエンザウイルス１－４（ＨＰＩＶ１－４）の配列変異及び／又は個々の変異を含む標的核酸の増幅、検出及び／又は定量に関する。本発明はさらに、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）を含むＨＰＩＶの増幅及び検出のためのプライマー及びプローブを含有する反応混合物及びキットを提供する。
本開示は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断の分野に関する。この分野では、本発明は、サンプル中に存在し得る標的核酸の増幅及び検出、特に、プライマー及びプローブを使用した、ヒトパラインフルエンザウイルス１－４（ＨＰＩＶ１－４）の配列変異及び／又は個々の変異を含む標的核酸の増幅、検出及び／又は定量に関する。本発明はさらに、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）を含むＨＰＩＶの増幅及び検出のためのプライマー及びプローブを含有する反応混合物及びキットを提供する。
発明の背景
ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）は、ヒトパラインフルエンザを引き起こすウイルスである。ＨＰＩＶは、パラミクソウイルス科に属する４つの異なる一本鎖ＲＮＡウイルスのグループであり、ヒトパラインフルエンザウイルス１型（ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ－１、又はＨＰＩＶ血清型１と呼ばれる）、ヒトパラインフルエンザウイルス２型（ＨＰＩＶ２又はＨＰＩＶ－２又はＨＰＩＶ血清型２と呼ばれる）、ヒトパラインフルエンザウイルス３型（ＨＰＩＶ３又はＨＰＩＶ－３又はＨＰＩＶ血清型３と呼ばれる）、及びヒトパラインフルエンザウイルス４型（ＨＰＩＶ４又はＨＰＩＶ－４又はＨＰＩＶ血清型４と呼ばれる）（すなわち、まとめてＨＰＩＶ１－４又はＨＰＩＶ血清型１－４）として知られる。これら４つの異なるウイルスを合わせて、ヒトパラインフルエンザウイルス１－４型、又はＨＰＩＶ１－４と呼ぶことがある。ＨＰＩＶ１－４は遺伝的にも抗原的にも異なる。それらの構造的及び生物学的特徴の大部分は類似しているが、しかし、ＨＰＩＶ１－４はそれぞれ、異なる年齢のヒトに感染し、異なる疾患を引き起こすように適応している。全体として、ＨＰＩＶ１－４が属するパラミクソウイルス科のウイルスは、疾病負荷と経済的影響の観点から最もコストがかかるウイルスの１つである。ＨＰＩＶは２つの属に分類される；（１）ＨＰＩＶ１及びＨＰＩＶ３を含むレスピロウイルス；及び（２）ＨＰＩＶ２及びＨＰＩＶ４を含むルブラウイルス。ＨＰＩＶ４はまた、モノクローナル抗体との反応性に基づいて、２つの異なる抗原性サブグループ４ａ及び４ｂに分類されている。特に、ＨＰＩＶは、セグメント化されていないマイナス鎖ゲノムＲＮＡを含むエンベロープウイルスである。ＨＰＩＶの複製は、付着による侵入、融合、ゲノム転写、及び複製によって開始される。続いて、新たに合成されたウイルス成分は細胞膜の集合部位に輸送され、そこで新たに形成されたビリオンが細胞から出芽する。
ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）は、ヒトパラインフルエンザを引き起こすウイルスである。ＨＰＩＶは、パラミクソウイルス科に属する４つの異なる一本鎖ＲＮＡウイルスのグループであり、ヒトパラインフルエンザウイルス１型（ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ－１、又はＨＰＩＶ血清型１と呼ばれる）、ヒトパラインフルエンザウイルス２型（ＨＰＩＶ２又はＨＰＩＶ－２又はＨＰＩＶ血清型２と呼ばれる）、ヒトパラインフルエンザウイルス３型（ＨＰＩＶ３又はＨＰＩＶ－３又はＨＰＩＶ血清型３と呼ばれる）、及びヒトパラインフルエンザウイルス４型（ＨＰＩＶ４又はＨＰＩＶ－４又はＨＰＩＶ血清型４と呼ばれる）（すなわち、まとめてＨＰＩＶ１－４又はＨＰＩＶ血清型１－４）として知られる。これら４つの異なるウイルスを合わせて、ヒトパラインフルエンザウイルス１－４型、又はＨＰＩＶ１－４と呼ぶことがある。ＨＰＩＶ１－４は遺伝的にも抗原的にも異なる。それらの構造的及び生物学的特徴の大部分は類似しているが、しかし、ＨＰＩＶ１－４はそれぞれ、異なる年齢のヒトに感染し、異なる疾患を引き起こすように適応している。全体として、ＨＰＩＶ１－４が属するパラミクソウイルス科のウイルスは、疾病負荷と経済的影響の観点から最もコストがかかるウイルスの１つである。ＨＰＩＶは２つの属に分類される；（１）ＨＰＩＶ１及びＨＰＩＶ３を含むレスピロウイルス；及び（２）ＨＰＩＶ２及びＨＰＩＶ４を含むルブラウイルス。ＨＰＩＶ４はまた、モノクローナル抗体との反応性に基づいて、２つの異なる抗原性サブグループ４ａ及び４ｂに分類されている。特に、ＨＰＩＶは、セグメント化されていないマイナス鎖ゲノムＲＮＡを含むエンベロープウイルスである。ＨＰＩＶの複製は、付着による侵入、融合、ゲノム転写、及び複製によって開始される。続いて、新たに合成されたウイルス成分は細胞膜の集合部位に輸送され、そこで新たに形成されたビリオンが細胞から出芽する。
すべてのＨＰＩＶ１－４について、ＲＮＡゲノムは核タンパク質と強固に結合してらせん状のヌクレオキャプシドを形成し、ウイルスのＲＮＡポリメラーゼがヌクレオカプシドに結合する。複製は完全に細胞質内で起こり、子孫ビリオンが感染細胞の原形質膜で組み立てられ、出芽によって放出される。ビリオンは、ウイルス特異的糖タンパク質スパイクを備えた脂質エンベロープによって囲まれた線維状のヌクレオカプシドコアで構成されている。ゲノムを含むことに加えて、ＨＰＩＶ１－４のヌクレオカプシドには、リンタンパク質（Ｐタンパク質）と巨大タンパク質（Ｌタンパク質）という２つの他のタンパク質も含まれている。脂質膜の外層にはスパイク状のヘマグルチニンノイラミニダーゼ（ＨＮ）及び融合（Ｆ）糖タンパク質があり、ウイルス膜又は感染細胞の表面から伸びている。ウイルスの脂質二重層の下にはマトリックス（Ｍ）タンパク質があり、これは主要な構造タンパク質の中で最も小さく、パラミクソウイルスで生成される最も豊富なタンパク質でもある。ウイルス膜はウイルスＲＮＡを包含しており、このＲＮＡは核タンパク質（ＮＰ）でカプシド形成されてヌクレオカプシドを形成し、このヌクレオカプシドはＰタンパク質とＬタンパク質で構成されるポリメラーゼ複合体に結合して生物学的に活性なリボヌクレオカプシドを形成する。ヌクレオカプシドタンパク質（又は核タンパク質又はＮＰ）は、（Ｐ及びＬタンパク質とともに）ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性に関与すると考えられている。すべてのパラインフルエンザウイルスのゲノムＲＮＡは、ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、及びＬタンパク質をコードする６つの別々の非重複ポリアデニル化ｍＲＮＡを生成する。Ｐタンパク質をコードするｍＲＮＡは、Ｃ及びＶ（アクセサリータンパク質）をコードするいくつかの追加のＯＲＦを含んでいる。ゲノムは、３’から５’の順に、リーダー配列、ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、Ｌの遺伝子、及びトレーラー配列から構成されている。
ＨＰＩＶ１－４を含むパラインフルエンザウイルスは、クループ、気管支炎、及び肺炎の原因物質として機能する呼吸器病原体である。ＨＰＩＶ感染症は、米国で毎年数十万人の入院の原因となっている。ＨＰＩＶは、特に小児に重篤な呼吸器感染症を引き起こす。ＨＰＩＶは主に気道で複製され、エアロゾル化によって感染する。小児において、パラインフルエンザによる最も一般的な種類の病気は、鼻炎、咽頭炎、及び気管支炎である。しかし、免疫無防備状態の患者の感染症は通常長期化し、さらに重症化する可能性がある。様々な型のＨＰＩＶの臨床症状には大きな多様性がある。例えば、ＨＰＩＶ１及びＨＰＩＶ２は小児の喉頭気管気管支炎（クループ）のほとんどの症例（米国では年間約６０万症例）を引き起こすが、一方、ＨＰＩＶ３は入院の３～１０％の原因であり、通常は気管支炎、肺炎、クループ、又は肺炎を引き起こす。ＨＰＩＶ４はあまり認識されていないが、軽度から重度の気道疾患を引き起こす可能性がある。ＨＰＩＶは通常、乳児や幼児、免疫系が低下している人に感染するが、誰でもＨＰＩＶに感染する可能性がある。さらに、人は一生のうちに複数回のＨＰＩＶ感染症にかかる可能性がある。再感染は通常、風邪のような症状を伴う軽度の上気道疾患を引き起こすが、人によっては再感染によって肺炎、気管支炎、細気管支炎などの重篤な下気道疾患を引き起こす可能性もある。高齢者や免疫力が低下又は弱くなっている人は、重度の感染症にかかるリスクが高くなる。ＨＰＩＶは通常、感染性の飛沫との直接接触によって、又は感染者の呼吸、咳、くしゃみによる空気感染によって伝染する。ＨＰＩＶは、空気中の飛沫中では１時間以上、表面では数時間、最長で１０時間感染力を維持する可能性がある。残念ながら、ＨＰＩＶ感染症に対する効果的な治療法は、あったとしてもごくわずかである。リバビリンは、ＨＰＩＶ３感染症に対する潜在的な有効性を有することが示されている薬物のひとつである。さらに、ＨＰＩＶ１－４のいずれも含むＨＰＩＶに対する有効なワクチンはない。
ＨＰＩＶ感染症を検査室で診断する既存の方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイによるウイルスゲノムの直接検出、免疫蛍光法又は酵素イムノアッセイ法による呼吸器分泌物（症状発現後１週間以内に採取）中のウイルス抗原の直接検出、細胞培養物におけるウイルスの分離と同定、及び／又は適切に採取されたペアの血清検体間のＨＰＩＶ特異的ＩｇＧ抗体、又は単一血清検体中の特異的ＩｇＭ抗体の有意な上昇の実証が挙げられる。咽頭スワブ、鼻咽頭スワブ、鼻洗浄液、鼻吸引はすべてＨＰＩＶを回収するために成功裏に使用されているが、ＨＰＩＶの臨床サンプルを採取する最適な方法は十分に研究されていないが、使用される検出方法（例えば、ＰＣＲ又は組織培養など）、患者の年齢、及び患者の一般的な健康状態（すなわち、免疫無防備状態、又は慢性肺疾患を患っている）に依存すると考えられている（例えば、Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，“Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１６（２）：２４２－２６４（２００３）を参照）。高いウイルス回収率を達成した少数の研究（ＨＰＩＶ－１及びＨＰＩＶ－３）では、最適なウイルス分離のために推奨される鼻洗浄液又は鼻吸引液が使用されていた。サンプル中のＨＰＩＶに対する抗体を検出する方法もあり、これには酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、ＨＩ、補体結合、ウェスタンブロット法、及び中和アッセイが含まれる。しかし、ＨＰＩＶの感染中に、密接に関連したＨＰＩＶ血清群に対する異種抗体が発生することは、血清学的診断を行おうとする際の永続的な問題である。ＨＰＩＶ抗原を直接検出するために、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、及びフルオロイムノアッセイも開発されている。さらに、電子顕微鏡はＨＰＩＶの存在を簡単に示すことができるが、多くのパラミクソウイルスは同じように見えるため、電子顕微鏡の使用は高価である。さらに、免疫蛍光もサンプル中のＨＰＩＶを検出する手段として広く使用されているが、臨床材料の直接ＩＦ染色によるＨＰＩＶの検出は、非常にばらつきがあり、時には期待はずれの結果をもたらすこともあった。組織培養物をスライド上で増殖させ、ウイルスの吸収と細胞感染を促進するために最初に遠心分離を使用するシェルバイアルアッセイは、ＨＰＩＶを迅速に同定するための別の方法であるが、これらの技術では感度の問題が報告されている。ＨＰＩＶ ＲＮＡは、ノーザンハイブリダイゼーション又はウイルス特異的プローブを使用したドットブロット分析によって直接検出できるが、これらの方法は時間がかかり、一貫性のない結果が得られ、感度が不足している。多くの臨床サンプル中のＨＰＩＶ ＲＮＡの量は、生物学的（組織培養）又は分子増幅のいずれかを行わなければ、検出を可能にするのに十分ではない。ＰＣＲがＨＰＩＶの検出に適切であることを実証した研究がいくつかあり、ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、及びＨＰＩＶ－３を検出するための多重ＲＴ－ＰＣＲアッセイが開発されている。別のグループは、サンプル中のＨＰＩＶ１－４を検出するための多重ＲＴ－ＰＣＲアッセイを開発したと主張しているが、このアッセイには感度の問題がある（例えば、Ａｇｕｉｌａｒ，ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ １，２，３，ａｎｄ ４ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｂｙ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ＰＣＲ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３８（３）：１１９１－１１９５（２０００）を参照）。したがって、当技術分野では、サンプル中のＨＰＩＶ１－４の存在を検出及び／又は定量するための、迅速で信頼性があり、特異的かつ高感度な方法が依然として必要とされている。
分子診断の分野では、核酸の増幅及び検出はかなり重要である。そのような方法は、ウイルスや細菌などの任意の数の微生物を検出するために使用することができる。最も顕著で広く使用されている増幅技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。他の増幅技術としては、リガーゼ連鎖反応、ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応、Ｇａｐ－ＬＣＲ、修復連鎖反応、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡ、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）及びＱβ増幅が挙げられる。ＰＣＲに基づく分析のための自動化されたシステムは、しばしば、同じ反応容器におけるＰＣＲプロセス中の産物増幅のリアルタイム検出を利用する。そのような方法の重要な点は、レポーター基又は標識を有する修飾オリゴヌクレオチドの使用である。
本発明は、ヒトパラインフルエンザウイルス１－４（ＨＰＩＶ１－４）の信頼性が高く、感度が高く、再現性のある増幅及び検出を対象とする。プライマー及びプローブは、ヒトパラインフルエンザウイルス１－４（ＨＰＩＶ１－４）に対する包括性を最大化し、同じ科（パラミクソウイルス科）の他のウイルスを除外するように設計されており、それによって他のテンプレート（例えば、他のウイルステンプレート）との交差反応を防止している。このヒトパラインフルエンザウイルス１－４（ＨＰＩＶ１－４）アッセイは、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００システムで使用することができる。本発明のプライマー及びプローブは、４つのＨＰＩＶ標的すべてを検出するために、多重標的アッセイとして使用され得る。設計戦略は、ＨＰＩＶ１－４ゲノムから保存された配列領域を選択し、各標的についていくつかのプライマー及びプローブの組み合わせを評価することであった。これらの候補は、単一の個別のＨＰＩＶ型を検出するために個別に使用することができ、例えば、サンプル中のＨＰＩＶ１を検出するための１つのアッセイ、サンプル中のＨＰＩＶ２を検出するための１つのアッセイ、サンプル中のＨＰＩＶ３を検出するための１つのアッセイ、及びサンプル中のＨＰＩＶ４を検出するための１つのアッセイである。あるいは、これらの候補を多重アッセイにおいて同時に使用して、単一サンプル中のＨＰＩＶ１－４を検出することもできる。このようにして、単一のアッセイでサンプル中の４つの異なる型のＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４）の存在を検出することができる。４つの型のＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４）を標的とする多重アッセイとして使用する場合、プライマーの４つの異なるセットとプローブが使用される（プライマーの各セットとプローブはＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、ＨＰＩＶ３、及びＨＰＩＶ４を検出する）。もちろん、候補を二重アッセイ又は三重アッセイにおいて使用して、それぞれ２つの標的又は３つの標的を同時に検出することができる。候補は、ヒトパラインフルエンザウイルス１－４（ＨＰＩＶ１－４）の１～４つのＨＰＩＶ標的の間の任意の場所を検出するアッセイの任意の構成で使用することができる。
本開示の特定の実施態様は、生物学的サンプル又は非生物学的サンプル中のヒトパラインフルエンザウイルス１－４（ＨＰＩＶ１－４）の存在又は非存在の迅速な検出、例えば、単一の試験管又は容器内でのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＨＰＩＶ１－４の多重検出及び定量化のための方法に関する。実施態様は、増幅工程及びハイブリダイズ工程を含み得る、少なくとも１つのサイクリング工程を実施することを含む、ヒトパラインフルエンザウイルス１－４（ＨＰＩＶ１－４）の検出方法を含む。さらに、実施態様は、単一のチューブ又は容器内でヒトパラインフルエンザウイルス１－４（ＨＰＩＶ１－４）を検出するために設計されたプライマー、プローブ、及びキットを含む。
本開示の一実施態様は、ヒトパラインフルエンザウイルス１－４（ＨＰＩＶ１－４）の１つ又は複数の標的核酸を検出する方法を対象とする。特に、本開示の一実施態様は、ウイルス収集培地／ユニバーサルトランスポート培地（ＵＴＭ）で収集された鼻咽頭サンプル中のヒトパラインフルエンザウイルス１－４（ＨＰＩＶ１－４）の１つ又は複数の標的核酸を検出するための方法を対象とする。
本開示の１つの態様は、サンプル中のヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）を検出するための方法であって、ここでＨＰＩＶは、ヒトパラインフルエンザウイルス１型（ＨＰＩＶ－１）、ヒトパラインフルエンザウイルス２型（ＨＰＩＶ－２）、ヒトパラインフルエンザウイルス３型（ＨＰＩＶ－３）、及び／又はヒトパラインフルエンザウイルス４型（ＨＰＩＶ－４）を含み、（ａ）ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４のうちの１つ又は複数の標的核酸がサンプル中に存在する場合、サンプルをプライマーの１つ又は複数のセットと接触させてＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸の増幅産物を生成することを含む増幅工程を実施すること；（ｂ）ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４のうちの１つ又は複数の標的核酸がサンプル中に存在する場合、１つ又は複数のプローブをＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸の増幅産物と接触させることを含むハイブリダイゼーション工程を実施すること；並びに（ｃ）ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸の増幅産物の存在又は非存在を検出することであって、ここで、ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸の増幅産物の存在は、サンプル中の、それぞれ、ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の存在を示し、ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸の増幅産物の非存在は、サンプルからの、それぞれ、ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の非存在を示す、ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸の増幅産物の存在又は非存在を検出すること、を含み；プライマーの１つ又は複数のセット及び１つ又は複数のプローブは、（１）ＨＰＩＶ－１の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブであって、ここで、ＨＰＩＶ－１の標的核酸に特異的なプライマーのセットは、配列番号１の核酸配列若しくはその相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号２の核酸配列若しくはその相補体を含む第２のプライマーを含み；ＨＰＩＶ－１の標的核酸に特異的なプローブは、配列番号３の核酸配列若しくはその相補体を含む、ＨＰＩＶ－１の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブ；並びに／又は（２）ＨＰＩＶ－２の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブであって、ここで、ＨＰＩＶ－２の標的核酸に特異的なプライマーのセットは、配列番号４の核酸配列若しくはその相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号５の核酸配列若しくはその相補体を含む第２のプライマーを含み；ＨＰＩＶ－２の標的核酸に特異的なプローブは、配列番号６若しくは配列番号７の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む、ＨＰＩＶ－２の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブ；並びに／又は（３）ＨＰＩＶ－３の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブであって、ここで、ＨＰＩＶ－３の標的核酸に特異的なプライマーのセットは、配列番号８若しくは配列番号１５の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号９若しくは配列番号１６の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む第２のプライマーを含み；ＨＰＩＶ－３の標的核酸に特異的なプローブは、配列番号１０若しくは配列番号１７の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む、ＨＰＩＶ－３の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブ；並びに／又は（４）ＨＰＩＶ－４の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブであって、ここで、ＨＰＩＶ－４の標的核酸に特異的なプライマーのセットは、配列番号１１若しくは配列番号１８の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む第１のプライマー、配列番号１２若しくは配列番号１９の核酸配列、又はそれらの相補体を含む第２のプライマーを含み；ＨＰＩＶ－４の標的核酸に特異的なプローブは、配列番号１３若しくは配列番号１４の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む、ＨＰＩＶ－４の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブ、を含む方法を対象とする。別の実施態様では、サンプルは、生物学的サンプルである。別の実施態様では、生物学的サンプルは、全血、呼吸器検体、鼻咽頭サンプル、尿、糞便検体、血液検体、血漿、皮膚スワブ、鼻腔スワブ、創傷スワブ、血液培養物、皮膚、及び軟部組織感染部である。別の実施態様では、生物学的サンプルは、鼻咽頭サンプルである。別の実施態様では、１つ又は複数のプローブが標識される。別の実施態様では、１つ又は複数のプローブは、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分で標識されている。別の実施態様では、工程（ｃ）におけるＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸の増幅産物の存在又は非存在を検出することは、ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸に特異的なプローブのドナー蛍光部分とアクセプター部分との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の存在又は非存在を検出することを含み、ここで、蛍光の存在又は非存在は、それぞれ、サンプル中のＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の存在又は非存在を示す。
本開示の別の態様は、サンプル中のＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の１つ又は複数の標的核酸を同時に検出するための方法であって、（ａ）ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４のうちの１つ又は複数の標的核酸がサンプル中に存在する場合、サンプルをプライマーの１つ又は複数のセットと接触させてＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸の増幅産物を生成することを含む増幅工程を実施すること；（ｂ）ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４のうちの１つ又は複数の標的核酸がサンプル中に存在する場合、１つ又は複数のプローブをＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸の増幅産物と接触させることを含むハイブリダイゼーション工程を実施すること；並びに（ｃ）ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸の増幅産物の存在又は非存在を検出することであって、ここで、ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸の増幅産物の存在は、サンプル中の、それぞれ、ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の存在を示し、ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸の増幅産物の非存在は、サンプルからの、それぞれ、ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の非存在を示す、ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸の増幅産物の存在又は非存在を検出すること、を含み；プライマーの１つ又は複数のセット及び１つ又は複数のプローブは、（１）ＨＰＩＶ－１の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブであって、ここで、ＨＰＩＶ－１の標的核酸に特異的なプライマーのセットは、配列番号１の核酸配列若しくはその相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号２の核酸配列若しくはその相補体を含む第２のプライマーを含み；ＨＰＩＶ－１の標的核酸に特異的なプローブは、配列番号３の核酸配列若しくはその相補体を含む、ＨＰＩＶ－１の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブ；並びに／又は（２）ＨＰＩＶ－２の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブであって、ここで、ＨＰＩＶ－２の標的核酸に特異的なプライマーのセットは、配列番号４の核酸配列若しくはその相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号５の核酸配列若しくはその相補体を含む第２のプライマーを含み；ＨＰＩＶ－２の標的核酸に特異的なプローブは、配列番号６若しくは配列番号７の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む、ＨＰＩＶ－２の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブ；並びに／又は（３）ＨＰＩＶ－３の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブであって、ここで、ＨＰＩＶ－３の標的核酸に特異的なプライマーのセットは、配列番号８若しくは配列番号１５の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号９若しくは配列番号１６の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む第２のプライマーを含み；ＨＰＩＶ－３の標的核酸に特異的なプローブは、配列番号１０若しくは配列番号１７の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む、ＨＰＩＶ－３の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブ；並びに／又は（４）ＨＰＩＶ－４の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブであって、ここで、ＨＰＩＶ－４の標的核酸に特異的なプライマーのセットは、配列番号１１若しくは配列番号１８の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む第１のプライマー、配列番号１２若しくは配列番号１９の核酸配列、又はそれらの相補体を含む第２のプライマーを含み；ＨＰＩＶ－４の標的核酸に特異的なプローブは、配列番号１３若しくは配列番号１４の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む、ＨＰＩＶ－４の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブ、を含む方法を対象とする。別の実施態様では、サンプルは、生物学的サンプルである。別の実施態様では、生物学的サンプルは、全血、呼吸器検体、鼻咽頭サンプル、尿、糞便検体、血液検体、血漿、皮膚スワブ、鼻腔スワブ、創傷スワブ、血液培養物、皮膚、及び軟部組織感染部である。別の実施態様では、生物学的サンプルは、鼻咽頭サンプルである。別の実施態様では、１つ又は複数のプローブが標識されている。実施態様では、１つ又は複数のプローブは、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分で標識されている。別の実施態様では、工程（ｃ）におけるＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸の増幅産物の存在又は非存在を検出することは、ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸に特異的なプローブのドナー蛍光部分とアクセプター部分との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の存在又は非存在を検出することを含み、ここで、蛍光の存在又は非存在は、それぞれ、サンプル中のＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の存在又は非存在を示す。
本開示の別の態様は、第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸がサンプル中に存在する場合、サンプル中の第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸を検出するための方法であって、（ａ）第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸がサンプル中に存在する場合、サンプルをプライマーの１つ又は複数のセットと接触させて、第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸の増幅産物を生成することを含む増幅工程を実施すること；（ｂ）第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸がサンプル中に存在する場合、１つ又は複数のプローブを前記増幅産物と接触させることを含むハイブリダイゼーション工程を実施すること；並びに（ｃ）第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸の増幅産物の存在又は非存在を検出することであって、ここで、第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸の増幅産物の存在は、サンプル中の、それぞれ、第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸の存在を示し、第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸の増幅産物の非存在は、サンプル中の、それぞれ、第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸の非存在を示す、第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸の増幅産物の存在又は非存在を検出すること、を含み；プライマーの１つ又は複数のセット及び１つ又は複数のプローブは、（１）第１の標的核酸に対するプライマーのセット及びプローブであって、ここで、第１の標的核酸に対するプライマーのセットは、配列番号１の核酸配列若しくはその相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号２の核酸配列若しくはその相補体を含む第２のプライマーを含み；第１の標的核酸に対するプローブは、配列番号３の核酸配列、若しくはその相補体を含む、第１の標的核酸に対するプライマーのセット及びプローブ；並びに／又は（２）第２の標的核酸に対するプライマーのセット及びプローブであって、ここで、第２の標的核酸に対するプライマーのセットは、配列番号４の核酸配列若しくはその相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号５の核酸配列若しくはその相補体を含む第２のプライマーを含み；第２の標的核酸に対するプローブは、配列番号６若しくは配列番号７の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む、第２の標的核酸に対するプライマーのセット及びプローブ；並びに／又は（３）第３の標的核酸に対するプライマーのセット及びプローブであって、ここで、第３の標的核酸に対するプライマーのセットは、配列番号８若しくは配列番号１５の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号９若しくは配列番号１６の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む第２のプライマーを含み；第３の標的核酸に対するプローブは、配列番号１０若しくは配列番号１７の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む、第３の標的核酸に対するプライマーのセット及びプローブ；並びに／又は（４）第４の標的核酸に対するプライマーのセット及びプローブであって、ここで、第４の標的核酸に対するプライマーのセットは、配列番号１１若しくは配列番号１８の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号１２若しくは配列番号１９の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む第２のプライマーを含み；第４の標的核酸に対するプローブは、配列番号１３若しくは配列番号１４の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む、第４の標的核酸に対するプライマーのセット及びプローブ、を含み；第１の標的核酸はＨＰＩＶ－１の標的核酸であり、第２の標的核酸はＨＰＩＶ－２の標的核酸であり、第３の標的核酸はＨＰＩＶ－３の標的核酸であり、第４の標的核酸はＨＰＩＶ－４の標的核酸である、方法を対象とする。別の実施態様では、サンプルは、生物学的サンプルである。別の実施態様では、生物学的サンプルは、全血、呼吸器検体、鼻咽頭サンプル、尿、糞便検体、血液検体、血漿、皮膚スワブ、鼻腔スワブ、創傷スワブ、血液培養物、皮膚、及び軟部組織感染部である。別の実施態様では、生物学的サンプルは、鼻咽頭サンプルである。別の実施態様では、１つ又は複数のプローブが標識されている。別の実施態様では、１つ又は複数のプローブは、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分で標識されている。別の実施態様では、工程（ｃ）において、第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸の増幅産物の存在又は非存在を検出することは、第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸に対するプローブのドナー蛍光部分とアクセプター部分との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の存在又は非存在を検出することを含み、ここで、蛍光の存在は、サンプル中のＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の存在を示し、蛍光の非存在は、サンプル中のＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の非存在を示す。
別の態様は、第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸がサンプル中に存在する場合、サンプル中の第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸を同時に検出するための方法であって、（ａ）第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸がサンプル中に存在する場合、サンプルをプライマーの１つ又は複数のセットと接触させて、第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸の増幅産物を生成することを含む増幅工程を実施すること；（ｂ）第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸がサンプル中に存在する場合、１つ又は複数のプローブを、第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸の増幅産物と接触させることを含むハイブリダイゼーション工程を実施すること；並びに（ｃ）第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸の増幅産物の存在又は非存在を検出することであって、ここで、第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸の増幅産物の存在は、サンプル中の、それぞれ、第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸の存在を示し、第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸の増幅産物の非存在は、サンプル中の、それぞれ、第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸の非存在を示す、第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸の増幅産物の存在又は非存在を検出すること、を含み；プライマーの１つ又は複数のセット及び１つ又は複数のプローブは、（１）第１の標的核酸に対するプライマーのセット及びプローブであって、ここで、第１の標的核酸に対するプライマーのセットは、配列番号１の核酸配列又はその相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号２の核酸配列又はその相補体を含む第２のプライマーを含み；第１の標的核酸に対するプローブは、配列番号３の核酸配列、又はその相補体を含む、第１の標的核酸に対するプライマーのセット及びプローブ；（２）第２の標的核酸に対するプライマーのセット及びプローブであって、ここで、第２の標的核酸に対するプライマーのセットは、配列番号４の核酸配列又はその相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号５の核酸配列又はその相補体を含む第２のプライマーを含み；第２の標的核酸に対するプローブは、配列番号６若しくは配列番号７の核酸配列、又はそれらの相補体を含む、第２の標的核酸に対するプライマーのセット及びプローブ；（３）第３の標的核酸に対するプライマーのセット及びプローブであって、ここで、第３の標的核酸に対するプライマーのセットは、配列番号８若しくは配列番号１５の核酸配列、又はそれらの相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号９若しくは配列番号１６の核酸配列、又はそれらの相補体を含む第２のプライマーを含み；第３の標的核酸に対するプローブは、配列番号１０若しくは配列番号１７の核酸配列、又はそれらの相補体を含む、第３の標的核酸に対するプライマーのセット及びプローブ；並びに（４）第４の標的核酸に対するプライマーのセット及びプローブであって、ここで、第４の標的核酸に対するプライマーのセットは、配列番号１１若しくは配列番号１８の核酸配列、又はそれらの相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号１２若しくは配列番号１９の核酸配列、又はそれらの相補体を含む第２のプライマーを含み；第４の標的核酸に対するプローブは、配列番号１３若しくは配列番号１４の核酸配列、又はそれらの相補体を含む、第４の標的核酸に対するプライマーのセット及びプローブ、を含み；第１の標的核酸はＨＰＩＶ－１の標的核酸であり、第２の標的核酸はＨＰＩＶ－２の標的核酸であり、第３の標的核酸はＨＰＩＶ－３の標的核酸であり、第４の標的核酸はＨＰＩＶ－４の標的核酸である、方法を対象とする。別の実施態様では、サンプルは、生物学的サンプルである。別の実施態様では、生物学的サンプルは、全血、呼吸器検体、鼻咽頭サンプル、尿、糞便検体、血液検体、血漿、皮膚スワブ、鼻腔スワブ、創傷スワブ、血液培養物、皮膚、及び軟部組織感染部である。別の実施態様では、生物学的サンプルは、鼻咽頭サンプルである。別の実施態様では、１つ又は複数のプローブが標識されている。別の実施態様では、１つ又は複数のプローブは、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分で標識されている。別の実施態様では、工程（ｃ）において、第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸の増幅産物の存在又は非存在を検出することは、第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸に対するプローブのドナー蛍光部分とアクセプター部分との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の存在又は非存在を検出することを含み、ここで、蛍光の存在は、サンプル中のＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の存在を示し、蛍光の非存在は、サンプル中のＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の非存在を示す。
別の態様は、サンプル中に存在し得るＨＰＩＶを検出するためのキットであって、ＨＰＩＶがＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４を含み、キットが増幅試薬及び検出試薬を含む、キットを対象とし、ここで、増幅試薬及び検出試薬は、（ｉ）ＤＮＡポリメラーゼ；（ｉｉ）ヌクレオチドモノマー；並びに（ｉｉｉ）プライマーの１つ又は複数のセット及び１つ又は複数のプローブを含み、ここで、プライマーの１つ又は複数のセット及び１つ又は複数のプローブは、（１）ＨＰＩＶ－１の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブであって、ここで、ＨＰＩＶ－１の標的核酸に特異的なプライマーのセットは、配列番号１の核酸配列若しくはその相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号２の核酸配列若しくはその相補体を含む第２のプライマーを含み；ＨＰＩＶ－１の標的核酸に特異的なプローブは、配列番号３の核酸配列若しくはその相補体を含む、ＨＰＩＶ－１の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブ；並びに／又は（２）ＨＰＩＶ－２の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブであって、ここで、ＨＰＩＶ－２の標的核酸に特異的なプライマーのセットは、配列番号４の核酸配列若しくはその相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号５の核酸配列若しくはその相補体を含む第２のプライマーを含み；ＨＰＩＶ－２の標的核酸に特異的なプローブは、配列番号６若しくは配列番号７の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む、ＨＰＩＶ－２の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブ；並びに／又は（３）ＨＰＩＶ－３の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブであって、ここで、ＨＰＩＶ－３の標的核酸に特異的なプライマーのセットは、配列番号８若しくは配列番号１５の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号９若しくは配列番号１６の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む第２のプライマーを含み；ＨＰＩＶ－３の標的核酸に特異的なプローブは、配列番号１０若しくは配列番号１７の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む、ＨＰＩＶ－３の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブ；並びに／又は（４）ＨＰＩＶ－４の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブであって、ここで、ＨＰＩＶ－４の標的核酸に特異的なプライマーのセットは、配列番号１１若しくは配列番号１８の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号１２若しくは配列番号１９の核酸配列、又はそれらの相補体を含む第２のプライマーを含み；ＨＰＩＶ－４の標的核酸に特異的なプローブは、配列番号１３若しくは配列番号１４の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む、ＨＰＩＶ－４の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブ、を含む。別の実施態様では、サンプルは、生物学的サンプルである。別の実施態様では、生物学的サンプルは、全血、呼吸器検体、鼻咽頭サンプル、尿、糞便検体、血液検体、血漿、皮膚スワブ、鼻腔スワブ、創傷スワブ、血液培養物、皮膚、及び軟部組織感染部である。別の実施態様では、生物学的サンプルは、鼻咽頭サンプルである。別の実施態様では、１つ又は複数のプローブが標識されている。別の実施態様では、１つ又は複数のプローブは、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分で標識されている。
別の態様は、ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸がサンプル中に存在する場合、サンプル中のＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸を同時検出するためのキットであって、増幅試薬及び検出試薬を含むキットを対象とし、ここで、増幅試薬及び検出試薬は、（ｉ）ＤＮＡポリメラーゼ；（ｉｉ）ヌクレオチドモノマー；並びに（ｉｉｉ）プライマーの１つ又は複数のセット及び１つ又は複数のプローブを含み、ここで、プライマーの１つ又は複数のセット及び１つ又は複数のプローブは、（１）ＨＰＩＶ－１の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブであって、ここで、プライマーのセットは、配列番号１の核酸配列又はその相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号２の核酸配列又はその相補体を含む第２のプライマーを含み；プローブは、配列番号３の核酸配列又はその相補体を含む、ＨＰＩＶ－１の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブ；（２）ＨＰＩＶ－２の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブであって、ここで、プライマーのセットは、配列番号４の核酸配列又はその相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号５の核酸配列又はその相補体を含む第２のプライマーを含み；プローブは、配列番号６若しくは配列番号７の核酸配列、又はそれらの相補体を含む、ＨＰＩＶ－２の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブ；（３）ＨＰＩＶ－３の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブであって、ここで、プライマーのセットは、配列番号８若しくは配列番号１５の核酸配列、又はそれらの相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号９若しくは配列番号１６の核酸配列、又はそれらの相補体を含む第２のプライマーを含み；プローブは、配列番号１０若しくは配列番号１７の核酸配列、又はそれらの相補体を含む、ＨＰＩＶ－３の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブ；並びに（４）ＨＰＩＶ－４の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブであって、ここで、プライマーのセットは、配列番号１１若しくは配列番号１８の核酸配列、又はそれらの相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号１２若しくは配列番号１９の核酸配列、又はそれらの相補体を含む第２のプライマーを含み；プローブは、配列番号１３若しくは配列番号１４の核酸配列、又はそれらの相補体を含む、ＨＰＩＶ－４の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブ、を含む。別の実施態様では、サンプルは、生物学的サンプルである。別の実施態様では、生物学的サンプルは、全血、呼吸器検体、鼻咽頭サンプル、尿、糞便検体、血液検体、血漿、皮膚スワブ、鼻腔スワブ、創傷スワブ、血液培養物、皮膚、及び軟部組織感染部である。別の実施態様では、生物学的サンプルは、鼻咽頭サンプルである。別の実施態様では、１つ又は複数のプローブが標識されている。別の実施態様では、１つ又は複数のプローブは、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分で標識されている。
別の態様は、サンプル中のＨＰＩＶ－１を検出する方法であって、（ａ）ＨＰＩＶ－１の１つ又は複数の標的核酸がサンプル中に存在する場合、サンプルをプライマーの１つ又は複数のセットと接触させてＨＰＩＶ－１の標的核酸の増幅産物を生成することを含む増幅工程を実施すること；（ｂ）ＨＰＩＶ－１の１つ又は複数の標的核酸がサンプル中に存在する場合、１つ又は複数のプローブをＨＰＩＶ－１の標的核酸の増幅産物と接触させることを含むハイブリダイゼーション工程を実施すること；並びに（ｃ）ＨＰＩＶ－１の標的核酸の増幅産物の存在又は非存在を検出することであって、ここで、ＨＰＩＶ－１の標的核酸の増幅産物の存在は、サンプル中のＨＰＩＶ－１の存在を示し、ＨＰＩＶ－１の標的核酸の増幅産物の非存在は、サンプルからのＨＰＩＶ－１の非存在を示す、ＨＰＩＶ－１の標的核酸の増幅産物の存在又は非存在を検出すること、を含み；プライマーの１つ又は複数のセット及び１つ又は複数のプローブは、ＨＰＩＶ－１の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブを含み、ここで、ＨＰＩＶ－１の標的核酸に特異的なプライマーのセットは、配列番号１の核酸配列又はその相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号２の核酸配列又はその相補体を含む第２のプライマーを含み；ＨＰＩＶ－１の標的核酸に特異的なプローブは、配列番号３の核酸配列又はその相補体を含む、方法を対象とする。別の実施態様は、サンプル中のＨＰＩＶ－２を検出する方法であって、（ａ）ＨＰＩＶ－２の１つ又は複数の標的核酸がサンプル中に存在する場合、サンプルをプライマーの１つ又は複数のセットと接触させてＨＰＩＶ－２の標的核酸の増幅産物を生成することを含む増幅工程を実施すること；（ｂ）ＨＰＩＶ－２の１つ又は複数の標的核酸がサンプル中に存在する場合、１つ又は複数のプローブをＨＰＩＶ－２の標的核酸の増幅産物と接触させることを含むハイブリダイゼーション工程を実施すること；並びに（ｃ）ＨＰＩＶ－２の標的核酸の増幅産物の存在又は非存在を検出することであって、ここで、ＨＰＩＶ－２の標的核酸の増幅産物の存在は、サンプル中のＨＰＩＶ－２の存在を示し、ＨＰＩＶ－２の標的核酸の増幅産物の非存在は、サンプルからのＨＰＩＶ－２の非存在を示す、ＨＰＩＶ－２の標的核酸の増幅産物の存在又は非存在を検出すること、を含み；プライマーの１つ又は複数のセット及び１つ又は複数のプローブは、ＨＰＩＶ－２の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブを含み、ここで、ＨＰＩＶ－２の標的核酸に特異的なプライマーのセットは、配列番号４の核酸配列又はその相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号５の核酸配列又はその相補体を含む第２のプライマーを含み；ＨＰＩＶ－２の標的核酸に特異的なプローブは、配列番号６若しくは配列番号７の核酸配列又はその相補体を含む、方法を対象とする。別の実施態様は、サンプル中のＨＰＩＶ－３を検出する方法であって、（ａ）ＨＰＩＶ－３の１つ又は複数の標的核酸がサンプル中に存在する場合、サンプルをプライマーの１つ又は複数のセットと接触させてＨＰＩＶ－３の標的核酸の増幅産物を生成することを含む増幅工程を実施すること；（ｂ）ＨＰＩＶ－３の１つ又は複数の標的核酸がサンプル中に存在する場合、１つ又は複数のプローブをＨＰＩＶ－３の標的核酸の増幅産物と接触させることを含むハイブリダイゼーション工程を実施すること；並びに（ｃ）ＨＰＩＶ－３の標的核酸の増幅産物の存在又は非存在を検出することであって、ここで、ＨＰＩＶ－３の標的核酸の増幅産物の存在は、サンプル中のＨＰＩＶ－３の存在を示し、ＨＰＩＶ－３の標的核酸の増幅産物の非存在は、サンプルからのＨＰＩＶ－３の非存在を示す、ＨＰＩＶ－３の標的核酸の増幅産物の存在又は非存在を検出すること、を含み；プライマーの１つ又は複数のセット及び１つ又は複数のプローブは、ＨＰＩＶ－３の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブを含み、ここで、ＨＰＩＶ－３の標的核酸に特異的なプライマーのセットは、配列番号８若しくは配列番号１５の核酸配列又はその相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号９若しくは配列番号１６の核酸配列又はその相補体を含む第２のプライマーを含み；ＨＰＩＶ－３の標的核酸に特異的なプローブは、配列番号１０若しくは配列番号１７の核酸配列又はその相補体を含む、方法を対象とする。別の実施態様は、サンプル中のＨＰＩＶ－４を検出する方法であって、（ａ）ＨＰＩＶ－４の１つ又は複数の標的核酸がサンプル中に存在する場合、サンプルをプライマーの１つ又は複数のセットと接触させてＨＰＩＶ－４の標的核酸の増幅産物を生成することを含む増幅工程を実施すること；（ｂ）ＨＰＩＶ－４の１つ又は複数の標的核酸がサンプル中に存在する場合、１つ又は複数のプローブをＨＰＩＶ－４の標的核酸の増幅産物と接触させることを含むハイブリダイゼーション工程を実施すること；並びに（ｃ）ＨＰＩＶ－４の標的核酸の増幅産物の存在又は非存在を検出することであって、ここで、ＨＰＩＶ－４の標的核酸の増幅産物の存在は、サンプル中のＨＰＩＶ－４の存在を示し、ＨＰＩＶ－４の標的核酸の増幅産物の非存在は、サンプルからのＨＰＩＶ－４の非存在を示す、ＨＰＩＶ－４の標的核酸の増幅産物の存在又は非存在を検出すること、を含み；プライマーの１つ又は複数のセット及び１つ又は複数のプローブは、ＨＰＩＶ－４の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブを含み、ここで、ＨＰＩＶ－４の標的核酸に特異的なプライマーのセットは、配列番号１１若しくは配列番号１８の核酸配列又はその相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号１２若しくは配列番号１９の核酸配列又はその相補体を含む第２のプライマーを含み；ＨＰＩＶ－３の標的核酸に特異的なプローブは、配列番号１３若しくは配列番号１４の核酸配列又はその相補体を含む、方法を対象とする。別の関連する実施態様は、サンプル中のＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４を検出する方法であって、これらの方法を実行することを含む方法を対象とする。別の実施態様では、サンプルは、生物学的サンプルである。別の実施態様では、生物学的サンプルは、全血、呼吸器検体、鼻咽頭サンプル、尿、糞便検体、血液検体、血漿、皮膚スワブ、鼻腔スワブ、創傷スワブ、血液培養物、皮膚、及び軟部組織感染部である。別の実施態様では、生物学的サンプルは、鼻咽頭サンプルである。別の実施態様では、１つ又は複数のプローブが標識されている。別の実施態様では、１つ又は複数のプローブは、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分で標識されている。
他の態様は、１００以下のヌクレオチドを有する、配列番号１～１９から選択されるヌクレオチドの配列若しくはその相補体を含むか、又はそれらからなるオリゴヌクレオチドを提供する。別の態様では、本開示は、配列番号１～１９のうちの１つ若しくはその相補体と少なくとも７０％の配列同一性（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％など）を有する核酸を含むオリゴヌクレオチドであって、１００個以下のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを提供する。一般に、これらのオリゴヌクレオチドは、これらの実施態様では、プライマー核酸、プローブ核酸などであり得る。これらの特定の実施態様では、オリゴヌクレオチドは４０以下のヌクレオチド（例えば、３５以下のヌクレオチド、３０以下のヌクレオチド、２５以下のヌクレオチド、２０以下のヌクレオチド、１５以下のヌクレオチド等）を有する。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、例えば非修飾ヌクレオチドと比較して核酸ハイブリダイゼーション安定性を変化させるために、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、任意に少なくとも１つの標識及び／又は任意に少なくとも１つのクエンチャー部分を含む。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの保存的に修飾された変異を含む。特定の核酸配列の「保存的に修飾された変異」若しくは単に「保存的変異」とは、同一若しくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、若しくは核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。当技術分野の当業者であれば、コードされた配列中の単一のヌクレオチド又は低いパーセント比率のヌクレオチド（典型的には５％未満、より典型的には４％、２％又は１％未満）を変更、付加又は欠失させる個々の置換、欠失又は付加は、改変がアミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、又は化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす「保存的に修飾された変異」であることを認識するであろう。
一態様では、増幅は、５’から３’へのヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を使用することができる。したがって、ドナー蛍光部分及びアクセプター部分、例えばクエンチャーは、プローブの長さに沿って互いに５～２０ヌクレオチド（例えば、７又は１０ヌクレオチド）以内であり得る。他の態様では、プローブは、二次構造の形成を可能にする核酸配列を含む。そのような二次構造の形成は、第１の蛍光部分と第２の蛍光部分との間の空間的近接をもたらし得る。この方法によれば、プローブ上の第２の蛍光部分はクエンチャーであり得る。
本開示はまた、個体からの生体サンプル中のＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）又はＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）核酸の存在又は非存在を検出する方法を提供する。これらの方法は、例えば、血液スクリーニング及び診断試験における使用のために、血漿中のＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）核酸の存在若しくは非存在を検出するために使用することができる。さらに、当業者であれば、同じ試験を使用して、尿及び他の種類のサンプルを評価し、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）核酸を検出及び／又は定量することができる。そのような方法は、一般に、増幅工程及び色素結合工程を含む少なくとも１つのサイクリング工程を実施することを含む。典型的には、増幅工程は、サンプル中に核酸分子が存在する場合、サンプルを複数対のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させて１つ又は複数の増幅産物を生成することを含み、色素結合工程は、増幅産物を二本鎖ＤＮＡ結合色素と接触させることを含む。そのような方法はまた、増幅産物への二本鎖ＤＮＡ結合色素の結合の存在又は非存在を検出することを含み、結合の存在はサンプル中のＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）核酸の存在を示し、結合の非存在はサンプル中のＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）核酸の非存在を示す。代表的な二本鎖ＤＮＡ結合色素は、臭化エチジウムである。他の核酸結合色素としては、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＯｌｉＧｒｅｅｎ（登録商標）、及びシアニン色素、例えばＹＯ－ＹＯ（登録商標）及びＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎが挙げられる。さらに、そのような方法は、増幅産物と二本鎖ＤＮＡ結合色素との間の融解温度を決定することを含むことができ、ここで、融解温度は、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）核酸の存在又は非存在を確認する。
さらなる態様では、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）の１つ又は複数の核酸を検出及び／又は定量するためのキットが提供される。キットは、遺伝子標的の増幅に特異的なプライマーの１つ又は複数のセット；及び増幅産物の検出に特異的な１つ又は複数の検出可能なオリゴヌクレオチドプローブを含み得る。
一態様では、キットは、ドナー及び対応するアクセプター部分、例えば他の蛍光部分又はダーククエンチャーで既に標識されているプローブを含むことができ、又はプローブを標識するためのフルオロフォア部分を含み得る。キットはまた、ヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、及び核酸ポリメラーゼの機能に必要な緩衝液を含むことができる。
キットはまた、サンプル中のＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）核酸の存在若しくは非存在を検出するためのプライマー、プローブ、及びフルオロフォア部分を使用するための添付文書及び説明書を含むことができる。
キットはまた、サンプル中のＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）核酸の存在若しくは非存在を検出するためのプライマー、プローブ、及びフルオロフォア部分を使用するための添付文書及び説明書を含むことができる。
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び材料が本主題の実施又は試験で使用され得るが、好適な方法及び材料が以下に記載される。さらに、材料、方法、及び実施例は、単なる例示であり、限定することを意図したものではない。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体が援用される。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先する。
本発明の１つ又は複数の実施態様の詳細は、添付の図面及び以下の説明に示されている。本発明の他の特徴、目的及び利点は、図面及び発明を実施するための形態、並びに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
特許又は出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含む本特許又は特許出願公開の写しは、請求に応じて、必要な手数料を支払うことにより、特許庁によって提供されることになる。
核酸増幅によるＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）感染症の診断は、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）感染症を迅速、正確、確実に、特異的且つ高感度に検出及び／又は定量するための方法を提供する。非生物学的サンプル又は生物学的サンプル中のＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含むＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）核酸を検出及び／又は定量するためのリアルタイムＰＣＲアッセイが本明細書に記載される。ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）を検出及び／又は定量するためのプライマー及びローブが提供され、そのようなプライマー及びプローブを含む製造品又はキットも提供される。他の方法と比較してＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）の検出のためのリアルタイムＰＣＲの特異性及び感度が上昇し、サンプルの封じ込め、増幅産物のリアルタイム検出及び定量化を含むリアルタイムＰＣＲの機能が改善されたことにより、臨床検査室におけるＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）感染症の日常的な診断のためのこの技術の実施が実現可能になる。さらに、この技術は、血液スクリーニング並びに予後診断に使用することができる。このＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）検出アッセイはまた、ＨＰＩＶ１－４の検出及び増幅のためのオリゴヌクレオチドのすべてがサンプルに添加され、ＨＰＩＶ１－４のためのオリゴヌクレオチドが、サンプル中に存在する場合、それぞれの標的核酸を並行して同時に増幅及び検出することができるように、多重化することもできる。このようにして、単一のサンプルを単一の反応及び反応容器内で４つの異なる型のＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４）の存在についてアッセイすることができる。このような多重アッセイは、コスト削減の観点からも、またサンプルが制限される状況においても有利である。
本開示は、例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅及び検出技術を使用してＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）を特異的に同定するために、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）ゲノムにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー及び蛍光標識加水分解プローブを含む。
開示される方法は、１つ又は複数のプライマー対を使用してサンプルからの核酸分子遺伝子標的の１つ又は複数の部分を増幅することを含む、少なくとも１つのサイクリング工程を実施することを含み得る。本明細書で使用される「ＨＰＩＶプライマー」又は「ＨＰＩＶ１－４プライマー」は、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）ゲノムに見出される核酸配列に特異的にアニールし、それぞれの増幅産物を生成する適切な条件下でそこからＤＮＡ合成を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを指す。議論されるＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）プライマーの各々は、各増幅産物の少なくとも一部が標的に対応する核酸配列を含むように標的にアニールする。１つ又は複数の核酸がサンプル中に存在すれば、１つ又は複数の増幅産物が生成され、したがって、１つ又は複数の増幅産物の存在がサンプル中にＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）が存在することを示す。増幅産物は、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）に対する１つ又は複数の検出可能なプローブに相補的な核酸配列を含まなければならない）。本明細書で使用される「ＨＰＩＶプローブ（複数可）」又は「ＨＰＩＶ１－４プローブ（複数可）」は、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）ゲノムに見出される核酸配列に特異的にアニールするオリゴヌクレオチドプローブを指す。各サイクリング工程は、増幅工程、ハイブリダイゼーション工程、及び検出工程を含み、試料は、試料中のＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）の存在又は非存在を検出するために１つ又は複数の検出可能なＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）プローブと接触させる。
本明細書で使用される場合、「増幅する」という用語は、鋳型核酸分子（例えばＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）ゲノムからの核酸分子）の一方若しくは両方の鎖に相補的な核酸分子を合成するプロセスを指す。核酸分子を増幅することは、典型的には、テンプレート核酸を変性すること、プライマーの融解温度未満の温度でプライマーをテンプレート核酸にアニールすること、及び増幅産物を生成するためにプライマーから酵素的に伸長することを含む。増幅には、典型的には、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼ酵素（例えば、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ）並びにポリメラーゼ酵素の最適な活性のための適切な緩衝液及び／又は補因子（例えば、ＭｇＣｌ２及び／又はＫＣｌ）の存在が必要である。
本明細書で使用される「プライマー」という用語は、当業者に知られており、オリゴマー化合物、主にオリゴヌクレオチドを指すが、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を「プライミング」することができる修飾オリゴヌクレオチドも指しており、すなわち、例えばオリゴヌクレオチドの３’末端が遊離３’－ＯＨ基を提供し、そこに、３’から５’へのホスホジエステル結合を確立する鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによってさらに「ヌクレオチド」が結合され得て、それによってデオキシヌクレオシド三リン酸が使用され、それによってピロリン酸が放出される。
「ハイブリダイズする」という用語は、増幅産物への１つ又は複数のプローブのアニーリングを指す。「ハイブリダイゼーション条件」は、典型的には、プローブの融解温度より低いが、プローブの非特異的ハイブリダイゼーションを回避する温度を含む。
「５’から３’へのヌクレアーゼ活性」という用語は、典型的には核酸鎖合成に関連し、それによってヌクレオチドが核酸鎖の５’末端から除去される核酸ポリメラーゼの活性を指す。
「熱安定性ポリメラーゼ」という用語は、熱安定性であるポリメラーゼ酵素を指し、すなわち、該酵素は、鋳型に相補的なプライマー伸長産物の形成を触媒し、二本鎖鋳型核酸の変性をもたらすのに必要な時間にわたり高温に曝された場合、不可逆的には変性しない。一般に、合成は各プライマーの３’末端で開始され、テンプレート鎖に沿って５’から３’方向へ進行する。熱安定性ポリメラーゼは、例えば、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、Ｔ．ルーバー（Ｔ．ｒｕｂｅｒ）、Ｔ．サーモフィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｔ．アクアティカス（Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、Ｔ．ラクテウス（Ｔ．ｌａｃｔｅｕｓ）、Ｔ．ルベンス（Ｔ．ｒｕｂｅｎｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、及びメタノサーマス・フェルビダス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ ｆｅｒｖｉｄｕｓ）から単離されている。それにもかかわらず、必要に応じて酵素が補充されるならば、熱安定性でないポリメラーゼをＰＣＲアッセイに用いることもできる。
「その相補体」という用語は、所与の核酸と同じ長さであり、正確に相補的である核酸を指す。
核酸に関して使用される場合の「伸長」又は「延長」という用語は、追加のヌクレオチド（又は他の類似の分子）が核酸に組み込まれる場合を指す。例えば、核酸は、ヌクレオチドを取り込む生体触媒によって、例えば、典型的には核酸の３’末端にヌクレオチドを付加するポリメラーゼによって、任意に伸長される。
２つ以上の核酸配列の文脈における「同一」又は「同一性パーセント」という用語は、例えば、当業者が利用できる配列比較アルゴリズムの１つを使用して測定した場合、又は目視検査によって測定した場合に、最大の一致を得るために比較及び整列された場合同一であるか、又は同一ヌクレオチドの特定の割合を有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。パーセント配列同一性及び配列類似性の決定に適した例示的なアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴプログラムであり、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）“Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０，Ｇｉｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９９３）“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｂｙ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｓｅａｒｃｈ”Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２，Ｍａｄｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ｓｅｒｖｅｒ”Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）“Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２、及びＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７）“ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ：Ａ ｎｅｗ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ”Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
オリゴヌクレオチドの文脈における「修飾ヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドに所望の特性を提供する異なるヌクレオチドによって置き換えられる変化を指す。本明細書に記載のオリゴヌクレオチド中で置換され得る例示的な修飾ヌクレオチドとしては、例えば、ｔ－ブチルベンジル、Ｃ５－メチル－ｄＣ、Ｃ５－エチル－ｄＣ、Ｃ５－メチル－ｄＵ、Ｃ５－エチル－ｄＵ、２，６－ジアミノプリン、Ｃ５－プロピニル－ｄＣ、Ｃ５－プロピニル－ｄＵ、Ｃ７－プロピニル－ｄＡ、Ｃ７－プロピニル－ｄＧ、Ｃ５－プロパルギルアミノ－ｄＣ、Ｃ５－プロパルギルアミノ－ｄＵ、Ｃ７－プロパルギルアミノ－ｄＡ、Ｃ７－プロパルギルアミノ－ｄＧ、７－デアザ－２－デオキシ－キサントシン、ピラゾロピリミジン類似体、擬似ｄＵ、ニトロピロール、ニトロインドール、２’－０－メチルリボ－Ｕ、２’－０－メチルリボ－Ｃ、Ｎ４－エチル－ｄＣ、Ｎ６－メチル－ｄＡ、５－プロピニルｄＵ、５－プロピニルｄＣ、７－デアザ－デオキシグアノシン（デアザＧ（ｕ－デアザ））などが挙げられる。オリゴヌクレオチド中で置換され得る多くの他の修飾ヌクレオチドは、本明細書で言及されるか、又は当技術分野で知られている。特定の実施態様では、修飾ヌクレオチド置換は、対応する非修飾オリゴヌクレオチドの融解温度と比較して、オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）を修飾する。さらに説明すると、いくつかの実施態様では、特定の修飾ヌクレオチド置換は、非特異的核酸増幅を減少させ（例えば、プライマー二量体形成などを最小限に抑え）、意図した標的アンプリコンの収率を増加させることなどができる。これらのタイプの核酸修飾の例は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，００１，６１１号に記載されている。他の修飾ヌクレオチド置換は、オリゴヌクレオチドの安定性を変化させ得るか、又は他の望ましい特徴を提供し得る。
ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）標的核酸の検出／定量
本開示は、例えば、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）核酸配列の一部を増幅することによってＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）を検出する方法を提供する。具体的には、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）核酸分子標的を増幅し、検出及び／又は定量するためのプライマー及びプローブが、本開示の実施態様によって提供される。
本開示は、例えば、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）核酸配列の一部を増幅することによってＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）を検出する方法を提供する。具体的には、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）核酸分子標的を増幅し、検出及び／又は定量するためのプライマー及びプローブが、本開示の実施態様によって提供される。
ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）の検出及び／又は定量のために、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）を増幅及び検出／定量するためのプライマー及びプローブが提供される。本明細書に例示されるもの以外のＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）核酸もまた、サンプル中のＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）を検出するために使用することができる。例えば、機能的変異体は、日常的な方法を使用して当業者によって特異性及び／又は感度について評価され得る。代表的な機能的バリアントには、例えば、本明細書に開示されるＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）核酸における１つ以上の欠失、挿入、及び／又は置換が含まれ得る。
より具体的には、オリゴヌクレオチドの実施態様はそれぞれ、配列番号１～１９から選択される配列を有する核酸、配列番号１～１９の１つと少なくとも、例えば８０％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有するその実質的に同一のバリアント、又は配列番号１～１９の相補体及びそのバリアントを含む。
一実施態様では、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶを含むと疑われる生物学的サンプル中のＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）の検出を提供するために、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）プライマーのセット及びプローブが使用される（表１）。プライマーのセット及びプローブは、配列番号１～１９の核酸配列を含むか又はそれらからなる、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）核酸配列に特異的なプライマー及びプローブを含むか、又はそれらからなり得る。別の実施態様では、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）標的のためのプライマー及びプローブは、配列番号１～１９のプライマー及びプローブのいずれかの機能的に活性なバリアントを含むか、又はそれらからなる。
配列番号１～１９のプライマー及び／又はプローブのいずれかの機能的に活性なバリアントは、開示される方法においてプライマー及び／又はプローブを使用することによって同定され得る。配列番号１～１９のいずれかのプライマー及び／又はプローブの機能的に活性なバリアントは、記載された方法又はキットにおいて、配列番号１～１９のそれぞれの配列と比較して、同様又はより高い特異性及び感度を提供するプライマー及び／又はプローブに関する。
バリアントは、例えば、配列番号１～１９のそれぞれの配列の５’末端及び／又は３’末端における１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失又は置換などの１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失又は置換によって、配列番号１～１９の配列から変化し得る。上に詳述したように、プライマー及び／又はプローブは化学的に修飾されていてもよく、すなわち、プライマー及び／又はプローブは修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチド化合物を含んでいてもよい。したがって、プローブ（又はプライマー）は修飾オリゴヌクレオチドである。「修飾ヌクレオチド」（又は「ヌクレオチド類似体」）は、いくつかの修飾によって天然の「ヌクレオチド」とは異なるが、依然として、塩基若しくは塩基様化合物、ペントフラノシル糖若しくはペントフラノシル糖様化合物、リン酸部分若しくはリン酸様部分、又はそれらの組み合わせからなる。例えば、「ヌクレオチド」の塩基部分に「標識」を結合させて、「修飾ヌクレオチド」を得ることができる。「ヌクレオチド」中の天然塩基は、例えば、７－デアザプリンで置き換えられてもよく、それによっても同様に「修飾ヌクレオチド」が得られる。用語「修飾ヌクレオチド」又は「ヌクレオチド類似体」は、本出願において互換的に使用される。「修飾ヌクレオシド」（又は「ヌクレオシド類似体」）は、「修飾ヌクレオチド」（又は「ヌクレオチド類似体」）について上に概説したように、何らかの修飾によって天然のヌクレオシドとは異なる。
ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）標的をコードする核酸分子を増幅する修飾オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類似体を含むオリゴヌクレオチド、例えば、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）の別の部分をコードする核酸は、例えば、ＯＯＬＩＧＯ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ Ｉｎｃ．Ｃａｓｃａｄｅ，Ｃｏｌｏ．）などのコンピュータプログラムを使用して設計することができる。増幅プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドを設計する際の重要な特徴としては、検出（例えば、電気泳動によって）を容易にするための適切なサイズの増幅産物、一対のプライマーのメンバーに対する同様の融解温度、及び各プライマーの長さ（すなわち、プライマーは、配列特異性でアニールし、合成を開始するのに十分な長さである必要があるが、オリゴヌクレオチド合成中に正確性が低下するほど長くはない）が挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、オリゴヌクレオチドプライマーは８～５０ヌクレオチド長（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８又は５０ヌクレオチド長）である。
プライマーのセットに加えて、本方法は、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）の存在又は非存在を検出するために１つ又は複数のプローブを使用し得る。「プローブ」という用語は、合成又は生物学的に生成された核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を指し、これは、設計又は選択により、定義された所定のストリンジェンシーの下で、「標的核酸」、この場合はＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）（標的）核酸に特異的に（すなわち、優先的に）ハイブリダイズすることを可能にする特定のヌクレオチド配列を含む。「プローブ」は、標的核酸を検出することを意味する「検出プローブ」と呼ぶこともできる。
いくつかの実施態様では、記載されたＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）プローブは、少なくとも１つの蛍光標識で標識することができる。一実施態様では、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）プローブは、ドナー蛍光部分、例えば蛍光色素、及び対応するアクセプター部分、例えばクエンチャーで標識することができる。一実施態様では、プローブは、蛍光部分を含むか、又は蛍光部分からなり、核酸配列は、配列番号３、６、７、１０、１３、１４及び／又は１７を含むか、又はそれらからなる。
プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドの設計は、プライマーの設計と同様の方法で行うことができる。実施態様は、増幅産物の検出のために単一のプローブ又は一対のプローブを使用することができる。実施態様に応じて、使用するプローブは、少なくとも１つの標識及び／又は少なくとも１種のクエンチャー部分を含み得る。プライマーと同様に、プローブは通常、同様の融解温度を有し、各プローブの長さは、配列特異的ハイブリダイゼーションが起こるのに十分でなければならないが、合成中に忠実度が低下するほど長くはない。オリゴヌクレオチドプローブは、一般に１５～４０（例えば、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５）ヌクレオチド長である。
コンストラクトは、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）プライマー及びプローブの核酸分子（例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８及び１９）のうちの１つをそれぞれ含むベクターを含むことができる。コンストラクトは、例えば、対照鋳型核酸分子として使用することができる。使用に適したベクターは、市販されており、且つ／又は当技術分野で日常的な組換え核酸技術法によって製造される。ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）核酸分子は、例えば、化学合成、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）からの直接クローニング、又は核酸増幅によって得ることができる。
本方法での使用に適したコンストラクトは、典型的には、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）核酸分子（例えば、配列番号１～１９のうちの１つ又は複数の配列を含む核酸分子）に加えて、所望のコンストラクト及び／又は形質転換体を選択するための選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）をコードする配列、並びに複製起点を含む。ベクター系の選択は、通常、宿主細胞の選択、複製効率、選択性、誘導性及び回収の容易さを含むがこれらに限定されない、いくつかの要因に依存する。
ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）核酸分子を含むコンストラクトは、宿主細胞内で増殖させることができる。本明細書で使用される宿主細胞という用語は、原核生物及び真核生物、例えば酵母、植物及び動物細胞を含むことを意味する。原核生物宿主としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）及びバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が挙げられる。真核生物宿主としては、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母、ＣＯＳ細胞又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞、昆虫細胞、並びにアラビドプシス タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）及びニコチアナ タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）などの植物細胞が挙げられる。コンストラクトを、当業者に一般的に知られている技術のいずれかを使用して宿主細胞に導入することができる。例えば、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、熱ショック、リポフェクション、マイクロインジェクション及びウイルス媒介核酸移入は、核酸を宿主細胞に導入するための一般的な方法である。さらに、ネイキッドＤＮＡを細胞に直接送達することができる（例えば、米国特許第５，５８０，８５９号及び同第５，５８９，４６６号参照）。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号及び同第４，９６５，１８８号は、従来のＰＣＲ技術を開示している。ＰＣＲは、典型的には、選択された核酸鋳型（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）に結合する２種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。いくつかの実施態様において有用なプライマーには、記載されたＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）核酸配列内で核酸合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドが含まれる（例えば、配列番号１、２、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１８及び／又は１９）。プライマーは、従来の方法によって制限消化物から精製することができるか、又は合成的に生成することができる。プライマーは増幅効率を最大にするために一本鎖であることが好ましいが、プライマーは二本鎖であってもよい。二本鎖プライマーは、最初に変性され、すなわち、鎖を分離するために処理される。二本鎖核酸を変性させる１つの方法は、加熱によるものである。
米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号及び同第４，９６５，１８８号は、従来のＰＣＲ技術を開示している。ＰＣＲは、典型的には、選択された核酸鋳型（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）に結合する２種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。いくつかの実施態様において有用なプライマーには、記載されたＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）核酸配列内で核酸合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドが含まれる（例えば、配列番号１、２、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１８及び／又は１９）。プライマーは、従来の方法によって制限消化物から精製することができるか、又は合成的に生成することができる。プライマーは増幅効率を最大にするために一本鎖であることが好ましいが、プライマーは二本鎖であってもよい。二本鎖プライマーは、最初に変性され、すなわち、鎖を分離するために処理される。二本鎖核酸を変性させる１つの方法は、加熱によるものである。
鋳型核酸が二本鎖である場合、ＰＣＲで鋳型として使用することができるようにする前に、二本の鎖を分離することが必要である。鎖分離は、物理的、化学的、又は酵素的手段を含む任意の好適な変性方法によって達成することができる。核酸鎖を分離する１つの方法は、核酸が優位に変性する（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％を超える変性）まで加熱することを含む。鋳型核酸を変性させるのに必要な加熱条件は、例えば、緩衝塩濃度、並びに変性される核酸の長さ及びヌクレオチド組成に依存するが、典型的には、温度及び核酸長などの反応の特徴に応じて、一定時間は約９０℃～約１０５℃の範囲である。変性は、典型的には、約３０秒間～４分間（例えば、１分～２分３０秒、又は１．５分）行われる。
二本鎖の鋳型核酸が熱により変性された場合、反応混合物は、その標的配列に対する各プライマーのアニーリングを促進する温度まで冷却される。アニーリングの温度は、通常、約３５℃～約６５℃、（例えば、約４０℃～約６０℃、約４５℃～約５０℃）である。アニーリング時間は、約１０秒～約１分（例えば、約２０秒～約５０秒、約３０秒～約４０秒）であり得る。次に反応混合物は、ポリメラーゼの活性が促進又は最適化される温度、すなわち、アニールされたプライマーから伸長が起こり、鋳型核酸に相補的な産物を生成するのに十分な温度に調整される。温度は、核酸鋳型にアニーリングされる各プライマーから伸長産物を合成するのに十分である必要があるが、その相補的な鋳型から伸長産物を変性させるほど高温であってはならない（例えば、伸長のための温度は、一般的に、約４０℃～約８０℃（例えば、約５０℃～約７０℃、約６０℃）の範囲である）。伸長時間は、約１０秒～約５分（例えば、約３０秒～約４分、約１分～約３分、約１分３０秒～約２分）であり得る。
レトロウイルス又はＲＮＡウイルスのゲノム、あるいはＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）などのＤＮＡウイルスによって産生されるｍＲＮＡは、リボ核酸、すなわちＲＮＡで構成されている。そのような場合、鋳型核酸であるＲＮＡは、酵素逆転写酵素の作用を介して相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に最初に転写されなければならない。逆転写酵素は、ＲＮＡ鋳型及びＲＮＡの３’末端に相補的な短いプライマーを使用して、第１鎖ｃＤＮＡの合成を指示し、次いでこれをポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として直接使用することができる。
ＰＣＲアッセイは、ＲＮＡ又はＤＮＡ（ｃＤＮＡ）などのＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）核酸を用いることができる。鋳型核酸は精製される必要はなく、ヒト細胞に含まれるＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）核酸等の複合混合物の微量画分であり得る。ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）核酸分子は、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐｅｒｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），１９９３，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．）に記載されているような日常的な技術によって生物学的サンプルから抽出され得る。核酸は、任意の数の供給源、例えばプラスミド、又は、細菌、酵母、ウイルス、細胞小器官、又は植物若しくは動物などの高等生物を含む天然供給源から得ることができる。
オリゴヌクレオチドプライマー（例えば、配列番号１、２、４、及び５）を、プライマー伸長を誘導する反応条件下でＰＣＲ試薬と組み合わせる。例えば、鎖伸長反応には、一般に、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．００１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、０．５～１．０μｇの変性された鋳型ＤＮＡ、５０ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチドプライマー、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ及び１０％ＤＭＳＯ）が含まれる。反応物は、通常、それぞれ１５０～３２０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、又はそれらの１つ以上の類似体を含有する。
新規に合成された鎖は、反応の後続工程で使用できる二本鎖分子を形成する。標的ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）核酸分子に対応する所望の量の増幅産物を生成するために、鎖分離、アニーリング、及び伸長の工程を必要に応じて何度でも繰り返すことができる。反応の制限因子は、反応中に存在するプライマー、熱安定性酵素、及びヌクレオシド三リン酸の量である。サイクリング工程（すなわち、変性、アニーリング、及び伸長）は、好ましくは少なくとも１回繰り返される。検出での使用では、サイクリング工程の数は、例えば、サンプルの性質による。サンプルが核酸の複雑な混合物である場合、検出に十分な標的配列を増幅するために、より多くのサイクリング工程が必要となる。一般に、サイクリング工程は少なくとも約２０回繰り返されるが、４０、６０、又は１００回繰り返してもよい。
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）
ＦＲＥＴ技術（例えば、米国特許第４，９９６，１４３号、同第５，５６５，３２２号、同第５，８４９，４８９号、同第６，１６２，６０３号を参照）は、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター蛍光部分が互いに一定の距離内に配置されると、２つの蛍光部分間でエネルギー移動が生じ、それを可視化することができ、又は他の方法で検出及び／又は定量することができるという概念に基づいている。典型的に、ドナーは好適な波長の光照射によって励起されると、アクセプターにエネルギーを移動させる。典型的に、アクセプターは移動されたエネルギーを異なる波長の光照射の形態で再発光する。特定の系では、非蛍光エネルギーは、実質的に非蛍光のドナー部分（例えば、米国特許第７，７４１，４６７号を参照されたい）を含む生体分子を介して、ドナー部分とアクセプター部分との間で移動され得る。
ＦＲＥＴ技術（例えば、米国特許第４，９９６，１４３号、同第５，５６５，３２２号、同第５，８４９，４８９号、同第６，１６２，６０３号を参照）は、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター蛍光部分が互いに一定の距離内に配置されると、２つの蛍光部分間でエネルギー移動が生じ、それを可視化することができ、又は他の方法で検出及び／又は定量することができるという概念に基づいている。典型的に、ドナーは好適な波長の光照射によって励起されると、アクセプターにエネルギーを移動させる。典型的に、アクセプターは移動されたエネルギーを異なる波長の光照射の形態で再発光する。特定の系では、非蛍光エネルギーは、実質的に非蛍光のドナー部分（例えば、米国特許第７，７４１，４６７号を参照されたい）を含む生体分子を介して、ドナー部分とアクセプター部分との間で移動され得る。
一例では、オリゴヌクレオチドプローブは、ドナー蛍光部分又は色素（例えば、ＨＥＸ又はＦＡＭ）と、蛍光性であってもなくてもよく、光以外の形態で伝達されたエネルギーを散逸させる対応するクエンチャー（例えば、ＢｌａｃｋＨｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）（ＢＨＱ）（ＢＨＱ－２など））とを含むことができる。プローブがインタクトである場合、エネルギー移動は、典型的には、ドナー蛍光部分からの蛍光発光がアクセプター部分によってクエンチされるように、ドナー部分とアクセプター部分との間で起こる。ポリメラーゼ連鎖反応の伸長工程中、増幅産物に結合したプローブは、ドナー蛍光部分の蛍光発光がもはやクエンチされないように、例えばＴａｑポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性によって切断される。この目的のための例示的なプローブは、例えば、米国特許第５，２１０，０１５号、同第５，９９４，０５６号、及び同第６，１７１，７８５号に記載されている。一般的に使用されるドナー－アクセプター対は、ＦＡＭ－ＴＡＭＲＡ対を包含する。一般的に使用されるクエンチャーは、ＤＡＢＣＹＬ及びＴＡＭＲＡである。一般的に使用されるダーククエンチャーは、ＢｌａｃｋＨｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）（ＢＨＱ）（ＢＨＱ２など）、（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ノヴァト）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈ．，Ｉｎｃ．、アイオワ州コーラルビル）、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ（登録商標）Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ６５０（ＢＢＱ－６５０）（Ｂｅｒｒｙ＆Ａｓｓｏｃ、ミシガン州デクスタ）を包含する。
別の例では、それぞれ蛍光部分を含む２つのオリゴヌクレオチドプローブは、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドプローブの相補性によって決定される特定の位置で増幅産物にハイブリダイズすることができる。オリゴヌクレオチドプローブが適切な位置で増幅産物核酸にハイブリダイゼーションすると、ＦＲＥＴシグナルが生成される。ハイブリダイゼーション温度は、約１０秒間～約１分間、約３５℃～約６５℃の範囲であり得る。
蛍光分析は、例えば、光子計数落射蛍光顕微鏡システム（適切なダイクロイックミラー及び特定の範囲の蛍光発光を監視するためのフィルターを備える）、光子計数光電子増倍管システム、又は蛍光光度計を使用して行うことができる。エネルギー移動を開始するため、又は蛍光体の直接検出を可能にするための励起は、アルゴンイオンレーザー、高強度水銀（Ｈｇ）アークランプ、キセノンランプ、光ファイバー光源、又は所望の範囲の励起のために適切にフィルタリングされた他の高強度光源を用いて行うことができる。
ドナー部分及び対応するアクセプター部分に関して本明細書で使用される場合、「対応する」とは、ドナー蛍光部分の発光スペクトルと重複する吸光度スペクトルを有するアクセプター蛍光部分又はダーククエンチャーを指す。アクセプター蛍光部分の発光スペクトルの波長最大値は、ドナー蛍光部分の励起スペクトルの波長最大値よりも少なくとも１００ｎｍ大きくなければならない。したがって、それらの間で効率的な非照射エネルギー移動を生じさせることができる。
蛍光ドナー部分及び対応するアクセプター部分は、一般に、（ａ）高効率Ｆｏｅｒｓｔｅｒエネルギー移動、（ｂ）大きな最終ストークスシフト（＞１００ｎｍ）、（ｃ）可能な限り可視スペクトルの赤色部分（＞６００ｎｍ）への発光のシフト；及び（ｄ）ドナー励起波長での励起によって生じるラマン水蛍光発光よりも高い波長への発光のシフトのために選択される。例えば、ドナー蛍光部分は、レーザー線付近のその最大励起波長（例えば、ヘリウム－カドミウム４４２ｎｍ又はアルゴン４８８ｎｍ）、高い吸光係数、高い量子収率、及び、その蛍光発光の対応するアクセプター蛍光部分の励起スペクトルとの良好な重複を有するものを選択することができる。対応するアクセプター蛍光部分は、高い吸光係数、高い量子収率、ドナー蛍光部分の発光とのその励起の良好な重複、及び可視スペクトルの赤色部分（＞６００ｎｍ）の発光を有するものを選択することができる。
ＦＲＥＴ技術において様々なアクセプター蛍光部分と共に使用することができる代表的なドナー蛍光部分としては、フルオレセイン、ルシファーイエロー、Ｂ－フィコエリトリン、９－アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエローＶＳ、４－アセトアミド－４’－イソチオ－シアナトスチルベン－２、２’－ジスルホン酸、７－ジエチルアミノ－３－（４’－イソチオシアナトフェニル）－４－メチルクマリン、スクシンミル１－ピレンブチレート、及び４－アセトアミド－４’－イソチオシアナトスチルベン－２，２’－ジスルホン酸誘導体が挙げられる。代表的なアクセプター蛍光部分としては、使用されるドナー蛍光部分に応じて、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０、ＬＣ Ｒｅｄ ７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ローダミンｘイソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、フルオレセイン、ジエチレントリアミンペンタアセテート、又はランタニドイオンの他のキレート（例えば、ユウロピウム、又はテルビウム）が挙げられる。ドナー蛍光部分及びアクセプター蛍光部分は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州ジャンクションシティ）又はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ミズーリ州セントルイス）から得ることができる。
ドナー及びアクセプターの蛍光部分は、リンカーアームを介して適切なプローブオリゴヌクレオチドに結合させることができる。リンカーアームはドナー蛍光部分とアクセプター蛍光部分との間の距離に影響を及ぼすので、各リンカーアームの長さは重要である。リンカーアームの長さは、ヌクレオチド塩基から蛍光部分までのオングストローム（Å）の距離であり得る。一般に、リンカーアームは約１０Å～約２５Åである。リンカーアームは、国際公開第８４／０３２８５号に記載されている種類のものであってもよい。国際公開第８４／０３２８５号はまた、リンカーアームを特定のヌクレオチド塩基に結合させる方法、及び蛍光部分をリンカーアームに結合させる方法も開示している。
ＬＣ Ｒｅｄ ６４０などのアクセプター蛍光部分を、アミノリンカー（例えば、ＡＢＩ（カリフォルニア州フォスターシティ）又はＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（バージニア州スターリング）から入手可能なＣ６－アミノホスホラミダイト）を含有するオリゴヌクレオチドと組み合わせて、例えば、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０標識オリゴヌクレオチドを生成することができる。フルオレセインなどのドナー蛍光部分をオリゴヌクレオチドに結合させるためによく使用されるリンカーとしては、チオ尿素リンカー（ＦＩＴＣ由来、例えばＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ又はＣｈｅｍＧｅｎｅ（マサチューセッツ州アッシュランド）製のフルオレセイン－ＣＰＧ）、アミド－リンカー（ＢｉｏＧｅｎｅｘ（カリフォルニア州サンラモン）製のＣＸ－フルオレセイン－ＣＰＧなどの、フルオレセイン－ＮＨＳ－エステル由来）、又はオリゴヌクレオチド合成後にフルオレセイン－ＮＨＳ－エステルの結合を必要とする３’－アミノ－ＣＰＧが挙げられる。
ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）増幅産物（アンプリコン）の検出
本開示は、生物学的サンプル又は非生物学的サンプル中のＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）の存在又は非存在を検出するための方法を提供する。提供される方法は、サンプルの汚染、偽陰性、及び偽陽性の問題を回避する。本方法は、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）プライマーの１つ又は複数の対を使用してサンプルからＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）標的核酸分子の一部を増幅することを含む少なくとも１つのサイクリング工程を実施すること、及びＦＲＥＴ検出工程を含む。複数のサイクリング工程は、好ましくはサーモサイクラーで行われる。方法は、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）の存在を検出するためにＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）プライマー及びプローブを使用して実施することができ、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）の検出は、サンプル中のＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）の存在を示す。
本開示は、生物学的サンプル又は非生物学的サンプル中のＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）の存在又は非存在を検出するための方法を提供する。提供される方法は、サンプルの汚染、偽陰性、及び偽陽性の問題を回避する。本方法は、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）プライマーの１つ又は複数の対を使用してサンプルからＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）標的核酸分子の一部を増幅することを含む少なくとも１つのサイクリング工程を実施すること、及びＦＲＥＴ検出工程を含む。複数のサイクリング工程は、好ましくはサーモサイクラーで行われる。方法は、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）の存在を検出するためにＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）プライマー及びプローブを使用して実施することができ、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）の検出は、サンプル中のＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）の存在を示す。
本明細書に記載されるように、増幅産物は、ＦＲＥＴ技術を利用する標識ハイブリダイゼーションプローブを使用して検出することができる。１つのＦＲＥＴフォーマットは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を利用して増幅産物の存在又は非存在、したがってＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）の存在又は非存在を検出する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術は、例えば１種の蛍光部分又は色素（例えばＨＥＸ又はＦＡＭ）と、蛍光性であってもなくてもよい１種のクエンチャー（例えば、ＢＨＱ－２）で標識された１つの一本鎖ハイブリダイゼーションプローブとを利用する。第１の蛍光部分が適切な波長の光で励起されると、吸収されたエネルギーは、ＦＲＥＴの原理に従って第２の蛍光部分又はダーククエンチャーに移動する。第２の蛍光部分は、一般的には、クエンチャー分子である。ＰＣＲ反応のアニーリング工程中、標識されたハイブリダイゼーションプローブは、標的ＤＮＡ（すなわち、増幅産物）に結合し、その後の伸長段階中に、例えばＴａｑポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性によって分解される。その結果、蛍光部分とクエンチャー部分とが互いに空間的に分離される。結果として、クエンチャーの非存在下において第１の蛍光部分を励起すると、第１の蛍光部分からの蛍光発光を検出することができる。例として、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を使用し、サンプル中のＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）の存在又は非存在を検出するための本明細書に記載の方法を実施するのに適している。
ＦＲＥＴと組み合わせた分子ビーコンを使用して、リアルタイムＰＣＲ法を使用して増幅産物の存在を検出することもできる。分子ビーコン技術は、第１の蛍光部分及び第２の蛍光部分で標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用する。第２の蛍光部分は一般的にはクエンチャーであり、蛍光標識は典型的にはプローブの各端部に配置される。分子ビーコン技術は、二次構造形成を可能にする配列（例えば、ヘアピン）を有するプローブオリゴヌクレオチドを使用する。プローブ内で二次構造が形成された結果、プローブが溶液中にある場合、両方の蛍光部位が空間的に近接する。標的核酸（すなわち、増幅産物）へのハイブリダイゼーション後、プローブの二次構造が破壊され、蛍光部分が互いに分離され、それにより、適切な波長の光による励起後、第１の蛍光部分の発光を検出することができる。
ＦＲＥＴ技術の別の一般的な形式は、２つのハイブリダイゼーションプローブを利用する。各プローブは、異なる蛍光部分で標識することができ、一般に、標的ＤＮＡ分子（例えば、増幅産物）内で互いに近接してハイブリダイズするように設計される。ドナー蛍光部分、例えばフルオレセインは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔの光源によって４７０ｎｍで励起される。ＦＲＥＴの間、フルオレセインは、そのエネルギーをアクセプター蛍光部分、例えばＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）－Ｒｅｄ ６４０（ＬＣ Ｒｅｄ ６４０）又はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）－Ｒｅｄ ７０５（ＬＣ Ｒｅｄ ７０５）に伝達する。次いで、アクセプター蛍光部分はより長い波長の光を放出し、これはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器の光学検出システムによって検出される。効率的なＦＲＥＴは、蛍光部分が直接局所的に近接しており、ドナー蛍光部分の発光スペクトルがアクセプター蛍光部分の吸収スペクトルと重なっている場合にのみ起こり得る。放出されたシグナルの強度は、元の標的ＤＮＡ分子の数（例えば、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）ゲノムの数）と相関させることができる。ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）標的核酸の増幅が起こり、増幅産物が産生される場合、ハイブリダイズする工程は、プローブ対のメンバー間のＦＲＥＴに基づく検出可能なシグナルをもたらす。
一般に、ＦＲＥＴの存在はサンプル中のＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）の存在を示し、ＦＲＥＴの非存在はサンプル中のＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）の非存在を示す。しかしながら、不十分な検体収集、輸送遅延、不適切な輸送条件、又は特定の収集スワブ（アルギン酸カルシウム又はアルミニウムシャフト）の使用はいずれも、試験結果の成功及び／又は精度に影響を及ぼし得る条件である。
本方法の実施に使用することができる代表的な生物学的サンプルとしては、全血、呼吸器検体、尿、糞便検体、血液検体、血漿、皮膚スワブ、鼻スワブ、鼻咽頭サンプル、創傷スワブ、血液培養物、皮膚及び軟部組織感染部が挙げられるが、これらに限定されない。生物学的サンプルの収集及び保存方法は、当業者に知られている。生物学的サンプルを（例えば、当技術分野で知られている核酸抽出方法及び／又はキットによって）処理してＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）核酸を放出させ得、又はいくつかの場合では、生物学的サンプルをＰＣＲ反応成分及び適切なオリゴヌクレオチドと直接接触させ得る。一部の例では、生物学的サンプルは全血である。全血を典型的に収集する場合、全血を適切な温度で保存することを可能にする、ヘパリン、クエン酸塩、又はＥＤＴＡなどの抗凝固剤を含む容器に収集することが多い。しかし、そのような条件下では、全血内の核酸はかなりの量の分解を受ける。したがって、核酸を含む全血成分を溶解、変性及び安定化する試薬、例えば、核酸安定化溶液中に血液を回収することが有利であり得る。そのような場合、核酸は、後続の単離及びＰＣＲなどの核酸試験などによる分析のために、より良好に保存及び安定化され得る。そのような核酸安定化溶液は当技術分野で周知であり、これには、限定するものではないが、ｐＨ７．５で４．２Ｍグアニジニウム塩（ＧｕＨＣｌ）及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓを含有するｃｏｂａｓ ＰＣＲ培地が含まれる。
サンプルは、分析前にサンプルを適切に保持及び保存するように設計された任意の方法又は装置によって回収することができる。そのような方法及び装置は、当技術分野で周知である。サンプルが全血などの生物学的サンプルである場合、方法又は装置は、採血管を含むことができる。このような採血管は、当該技術において周知であり、例えば採血チューブを含むことができる。多くの場合、採血チューブを使用することが有利であり得、この場合、採血管は、サンプル取り込みのために意図された空間内で圧力下にあり、例えば、バキュテナー採血チューブのような、真空チャンバを有する血液管などである。真空チャンバを有するそのような採血チューブ、例えばバキュテナー採血チューブは、当技術分野で周知である。核酸を含む全血成分を溶解、変性、及び安定化する溶液、例えば核酸安定化溶液を内部に含む採血管内に、吸引される全血が採血管内の核酸安定化溶液と直ちに接触するように、真空チャンバの有無にかかわらず、血液を回収することがさらに有利であり得る。
融解曲線分析は、サイクルプロファイルに含めることができる追加の工程である。融解曲線分析は、ＤＮＡ二本鎖の半分が一本鎖に分離した温度として定義される融解温度（Ｔｍ）と呼ばれる特徴的な温度でＤＮＡが融解するという事実に基づいている。ＤＮＡの融解温度は、主にそのヌクレオチド組成に依存する。したがって、Ｇ及びＣヌクレオチドが豊富なＤＮＡ分子は、Ａ及びＴヌクレオチドが豊富なＤＮＡ分子よりも高いＴｍを有する。シグナルが失われる温度を検出することにより、プローブの融解温度を決定することができる。同様に、シグナルが発生する温度を検出することにより、プローブのアニール温度を決定することができる。ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）増幅産物からのＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）プローブの融解温度（複数可）により、サンプル中のＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）の存在又は非存在を確認することができる。
各サーモサイクラーを運転している間に、対照サンプルも同様にサイクルすることができる。陽性対照サンプルは、例えば、対照プライマー及び対照プローブを使用して、（記載された標的遺伝子の増幅産物以外の）標的核酸対照鋳型を増幅することができる。陽性対照サンプルはまた、例えば、標的核酸分子を含むプラスミドコンストラクトを増幅することができる。そのようなプラスミド対照は、意図された標的の検出に使用されるのと同じプライマー及びプローブを使用して、内部で（例えば、サンプル中で）又は患者のサンプルと並んで実行される別々のサンプル中で増幅することができる。そのような対照は、増幅、ハイブリダイゼーション及び／又はＦＲＥＴ反応の成功又は失敗の指標である。各サーモサイクラーの実行には、例えば、標的鋳型ＤＮＡを欠く陰性対照を含めることもできる。陰性対照は汚染を測定することができる。これにより、システム及び試薬が偽陽性シグナルを生じないことが保証される。したがって、対照反応は、例えば、プライマーが配列特異性によりアニールし、伸長を開始する能力、並びにプローブが配列特異性によりハイブリダイズし、ＦＲＥＴが発生する能力を容易に決定することができる。
一実施態様では、本方法は、汚染を回避するための工程を含む。例えば、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼを利用する酵素的方法は、あるサーモサイクラー運転と次のサーモサイクラー運転との間の汚染を低減又は排除するために、米国特許第５，０３５，９９６号、同第５，６８３，８９６号及び同第５，９４５，３１３号に記載される。
ＦＲＥＴ技術と組み合わせた従来のＰＣＲ法を使用して、この方法を実施することができる。一実施態様では、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器が使用される。以下の特許出願は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）技術で使用されるリアルタイムＰＣＲを記載している：国際公開第９７／４６７０７号、同第９７／４６７１４号、及び同第９７／４６７１２号。
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）は、ＰＣワークステーションを使用して操作することができる。サンプルからのシグナルは、機械が光学ユニット上に毛細管を順次配置するときに得られる。ソフトウェアは、各測定の直後にリアルタイムで蛍光シグナルを表示することができる。蛍光取得時間は１０～１００ミリ秒（ｍｓｅｃ）である。各サイクリング工程の後、蛍光対サイクル数の定量的表示を、すべてのサンプルについて連続的に更新することができる。生成されたデータは、さらなる分析のために保存することができる。
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ ＩＩ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍは、ＰＣワークステーションを使用して操作することもできる。機器はサーマルブロックサイクラーを有し、ペルチェ素子を使用して加熱及び冷却が達成される。サンプルからの蛍光シグナルは、広域スペクトルにわたって光を発する高強度キセノンランプを使用して９６ウェルプレートから得られる。特定の励起及び発光のための内蔵フィルターの柔軟な組み合わせによって、様々な蛍光色素及び検出フォーマットの使用が可能になる。ソフトウェアは、蛍光シグナルを表示し、ＣＴ値を計算することができ、生成されたデータは、さらなる分析のために保存することができる。
ＦＲＥＴの代替として、蛍光ＤＮＡ結合色素（例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ又はＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））のような二本鎖ＤＮＡ結合色素を用いて、増幅産物を検出することができる。二本鎖核酸との相互作用の際、このような蛍光ＤＮＡ結合色素は、適当な波長の光で励起した後、蛍光シグナルを発する。また、核酸インターカレート色素などの二本鎖ＤＮＡ結合色素を用いることもできる。二本鎖ＤＮＡ結合色素を使用する場合、増幅産物の存在を確認するために、通常は融解曲線分析を行う。
当業者は、他の核酸又はシグナル増幅方法も使用され得ることを理解するであろう。そのような方法の例としては、限定されないが、分岐ＤＮＡシグナル増幅、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、自立配列複製（３ ＳＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、又はスマート増幅プロセスバージョン２（ＳＭＡＰ ２）が挙げられる。
本開示の実施態様は、１つ又は複数の市販の機器の構成によって限定されないことが理解される。
製造品／キット
本開示の実施態様は、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）を検出するための製造品又はキットをさらに提供する。製造品は、適切な包装材料と共に、標的ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）遺伝子を検出するために使用されるプライマー及びプローブを含み得る。ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）を検出するための代表的なプライマー及びプローブは、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）標的核酸分子にハイブリダイズし得る。さらに、キットはまた、固体支持体、緩衝液、酵素及びＤＮＡ標準のような、ＤＮＡ固定化、ハイブリダイゼーション及び検出に必要な適切に包装された試薬及び材料を含み得る。プライマー及びプローブを設計する方法が本明細書に開示され、増幅してＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）標的核酸分子にハイブリダイズするプライマー及びプローブの代表的な例が提供される。
本開示の実施態様は、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）を検出するための製造品又はキットをさらに提供する。製造品は、適切な包装材料と共に、標的ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）遺伝子を検出するために使用されるプライマー及びプローブを含み得る。ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）を検出するための代表的なプライマー及びプローブは、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）標的核酸分子にハイブリダイズし得る。さらに、キットはまた、固体支持体、緩衝液、酵素及びＤＮＡ標準のような、ＤＮＡ固定化、ハイブリダイゼーション及び検出に必要な適切に包装された試薬及び材料を含み得る。プライマー及びプローブを設計する方法が本明細書に開示され、増幅してＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）標的核酸分子にハイブリダイズするプライマー及びプローブの代表的な例が提供される。
製造品はまた、プローブを標識するための１つ以上の蛍光部分を含むことができ、あるいは、キットと共に供給されるプローブを標識することができる。例えば、製造品は、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）プローブを標識するためのドナー及び／又はアクセプター蛍光部分を含み得る。好適なＦＲＥＴドナー蛍光部分及び対応するアクセプター蛍光部分の例を上に提供する。
製造品はまた、サンプル中のＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）を検出するＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）プライマー及びプローブを使用するための説明書を有する添付文書若しくは包装ラベルを含み得る。製造品は、本明細書に開示される方法を実施するための試薬（例えば、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、補因子、又は汚染を防止するための薬剤）をさらに含み得る。そのような試薬は、本明細書に記載の市販の機器の１つに特異的であり得る。
本開示の実施態様はまた、サンプル中のＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４を含む）を優先的及び／又は選択的に検出及び／又は定量するためのプライマーのセット及び１つ以上の検出可能なプローブを提供する。
本発明の実施態様を以下の実施例でさらに説明するが、これらの実施例は特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない。
以下の実施例及び図は、主題の理解を助けるために提供されており、その範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の趣旨から逸脱することなく、記載された手順に修正を加えることができることが理解される。
この試験では、完全に自動化されたサンプル調製（核酸の抽出及び精製）に続いてＰＣＲ増幅及び検出を実施した。使用したシステムは、サンプル供給モジュール、移動モジュール、処理モジュール、及び分析モジュールからなる、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００システムであった。自動化したデータ管理は、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００のシステムによって実行された。
マスターミックスは、ヒトパラインフルエンザウイルス１－４（ＨＰＩＶ１－４）及び対照核酸に特異的な検出プローブを含んでいた。特定のヒトパラインフルエンザウイルス１－４（ＨＰＩＶ１－４）及び対照検出プローブは、それぞれレポーターとして機能する固有の蛍光色素で標識された。それぞれのプローブは、クエンチャーとして作用する第２の色素も有していた。レポーター色素は定義された波長で測定されるため、増幅されたヒトパラインフルエンザウイルス１－４（ＨＰＩＶ１－４）標的及び対照の検出及び識別が可能になる。完全なプローブの蛍光シグナルは、クエンチャー色素によって抑制された。ＰＣＲ増幅工程の間、プローブの特異的な一本鎖ＤＮＡ鋳型へのハイブリダイゼーションにより、ＤＮＡポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性により切断され、レポーター色素及びクエンチャー色素が分離し、蛍光シグナルが産生された。各ＰＣＲサイクルに伴い、切断プローブ量が増加し、レポーター色素の累積シグナルが同時に増加した。２つの特異的なレポーター色素が定義された波長で測定されるため、増幅されたヒトパラインフルエンザウイルス１－４（ＨＰＩＶ１－４）標的及び対照の同時検出及び識別が可能であった。
ヒトパラインフルエンザウイルス１－４（ＨＰＩＶ１－４）試験用のプライマー及びプローブは、アライメントに基づいて最も保存されている領域中のゲノムに従ってプライマー及びプローブをシーディングすること（ｓｅｅｄｉｎｇ）によって設計した。オリゴヌクレオチドの１つのセット（配列番号１～３）は、ＨＰＩＶ１標的核酸を検出及び増幅するように設計された。オリゴヌクレオチドの別のセット（配列番号４～７）は、ＨＰＩＶ２標的核酸を検出及び増幅するように設計された。オリゴヌクレオチドの別のセット（配列番号８～１０）は、ＨＰＩＶ３標的核酸を検出及び増幅するように設計された。オリゴヌクレオチドの別のセット（配列番号１１～１４）は、ＨＰＩＶ４標的核酸を検出及び増幅するように設計された。オリゴヌクレオチドの別のセット（配列番号１５～１７）は、ＨＰＩＶ３標的核酸を検出及び増幅するように設計された。オリゴヌクレオチドの別のセット（配列番号１８～１９及び１３～１４）は、ＨＰＩＶ４標的核酸を検出及び増幅するように設計された。オリゴヌクレオチドの別のセット（配列番号１１、１８～１９及び１３～１４）は、ＨＰＩＶ４標的核酸を検出及び増幅するように設計された。
オリゴヌクレオチド（又はプライマー／プローブ）の各セットは、目的の特定の標的領域（すなわち、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、ＨＰＩＶ３、又はＨＰＩＶ４）を増幅及び検出するために、それ自体の反応においてシングルプレックスで使用することができる。しかしながら、オリゴヌクレオチドのセットは、多重標的アッセイにおいても組み合わせることができ、それにより、反応混合物には１つ又は複数のオリゴヌクレオチドのセットが含まれるため（ＨＰＩＶ１については配列番号１～３、ＨＰＩＶ２については配列番号３～７、ＨＰＩＶ３については配列番号８～１０又は配列番号１５～１７；及びＨＰＩＶ４については配列番号１１～１４、又は配列番号１８～１９及び１３～１４、又は配列番号１１、１８～１９及び１３～１４）、１回のリアルタイムＰＣＲ反応において、ＨＰＩＶ１－４標的核酸のいずれか又はすべてが増幅され、サンプル中で検出される（標的がサンプル中に存在する場合）。ＨＰＩＶ１標的核酸の検出については、フォワードプライマーは配列番号１の核酸配列に対応し、リバースプライマーは配列番号２の核酸配列に対応し、プローブは配列番号３の核酸配列に対応する。ＨＰＩＶ２標的核酸の検出については、フォワードプライマーは配列番号４の核酸配列に対応し、リバースプライマーは配列番号５の核酸配列に対応し、プローブは配列番号６及び／又は７の核酸配列に対応する。ＨＰＩＶ３標的核酸の検出については、フォワードプライマーは配列番号８の核酸配列に対応し、リバースプライマーは配列番号９の核酸配列に対応し、プローブは配列番号１０の核酸配列に対応する。あるいは、ＨＰＩＶ３標的核酸の検出については、フォワードプライマーは配列番号１５の核酸配列に対応し、リバースプライマーは配列番号１６の核酸配列に対応し、プローブは配列番号１７の核酸配列に対応する。ＨＰＩＶ４標的核酸の検出については、フォワードプライマーは配列番号１１の核酸配列に対応し、リバースプライマーは配列番号１２の核酸配列に対応し、プローブは配列番号１３及び／又は１４の核酸配列に対応する。あるいは、ＨＰＩＶ４標的核酸の検出については、フォワードプライマーは配列番号１８の核酸配列に対応し、リバースプライマーは配列番号１９の核酸配列に対応し、プローブは配列番号１３及び／又は１４の核酸配列に対応する。場合によっては、ＨＰＩＶ４標的核酸の検出のためのセットは、配列番号１１の核酸配列に対応する第２のフォワードプライマーをさらに含む。これらのオリゴヌクレオチドは、ＨＰＩＶ１標的核酸（配列番号１～３に対応するオリゴヌクレオチドを使用）、ＨＰＩＶ２標的核酸（配列番号４～７に対応するオリゴヌクレオチドを使用）、ＨＰＩＶ３標的核酸（配列番号８～１０又は配列番号１５～１７に対応するオリゴヌクレオチドを使用）、及びＨＰＩＶ４標的核酸（配列番号１１～１４又は配列番号１８～１９及び１３～１４又は配列番号１１、１８～１９及び１３～１４に対応するオリゴヌクレオチドを使用）の検出及び増幅のための個々のアッセイにおいて使用することができる。あるいは、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドが異なる型のＨＰＩＶ（例えば、ＨＰＩＶ１－４）からの複数の核酸標的を同時に検出及び増幅するように設計された多重標的アッセイにおいて使用することができる。例えば、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、ＨＰＩＶ３、及び／又はＨＰＩＶ４の検出及び増幅のためのオリゴヌクレオチドを同時にサンプルに添加することができる。多重アッセイには、４つの型のＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４）のいずれか又ははすべてを、追加リソースを使用することなく、単一サンプルで検出できるという利点がある。このようにして、多重アッセイでは、リソース（例えば、ＰＣＲ試薬、サンプル）、コスト、時間が節約される。多重アッセイにより、効率的、迅速、信頼性が高く、安価な方法で、単一のサンプルにおいて複数のＨＰＩＶ型を同時に検出することができる。
実施例１：リアルタイムＰＣＲによるＨＰＩＶ１－４の検出のためのプライマー及びプローブの設計
ＨＰＩＶ１－４核酸試験は、４つの型のＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４）をすべて検出するように設計された。ウイルス病原体特異的アッセイは、ゲノム内に見出された最適なオリゴヌクレオチド配列を用い、特定の包括性と排他性の要件に基づいて、独自のソフトウェアによって設計された。ＨＰＩＶ１－４アッセイの各々に対して特定の標的領域（すなわち、合計４つの標的領域）が選択された。ＨＰＩＶ１アッセイはＬポリメラーゼタンパク質遺伝子を標的とし（図３を参照）、ＨＰＩＶ２アッセイは巨大タンパク質を標的とし（図４を参照）、ＨＰＩＶ３アッセイはヌクレオカプシドタンパク質において設計されており（図５を参照）、ＨＰＩＶ４アッセイは巨大タンパク質を標的とする（図６を参照）。各アッセイには、各ＨＰＩＶ型（ＨＰＩＶ１－４）に対して、１つのフォワードプライマー、１つのリバースプライマー、及び１つのプローブを有する。
ＨＰＩＶ１－４核酸試験は、４つの型のＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４）をすべて検出するように設計された。ウイルス病原体特異的アッセイは、ゲノム内に見出された最適なオリゴヌクレオチド配列を用い、特定の包括性と排他性の要件に基づいて、独自のソフトウェアによって設計された。ＨＰＩＶ１－４アッセイの各々に対して特定の標的領域（すなわち、合計４つの標的領域）が選択された。ＨＰＩＶ１アッセイはＬポリメラーゼタンパク質遺伝子を標的とし（図３を参照）、ＨＰＩＶ２アッセイは巨大タンパク質を標的とし（図４を参照）、ＨＰＩＶ３アッセイはヌクレオカプシドタンパク質において設計されており（図５を参照）、ＨＰＩＶ４アッセイは巨大タンパク質を標的とする（図６を参照）。各アッセイには、各ＨＰＩＶ型（ＨＰＩＶ１－４）に対して、１つのフォワードプライマー、１つのリバースプライマー、及び１つのプローブを有する。
実施例２：ＨＰＩＶ１プライマー及びプローブは、リアルタイムＰＣＲアッセイでＨＰＩＶ１のＬポリメラーゼタンパク質遺伝子を増幅及び検出する
ＨＰＩＶ１オリゴヌクレオチドは、ＨＰＩＶ１（配列番号１～３）を検出するためのプライマー／プローブを使用して試験した。フォワードプライマー（配列番号１）の最終濃度は２００ｎＭ、リバースプライマー（配列番号２）は１５０ｎＭ、プローブ（配列番号３）は７５ｎＭであった。ＨＰＩＶ１アッセイはＨＥＸチャネルにおいて試験された。ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成された転写物は、以下の濃度で使用された：反応あたり１０、１０２、１０３、１０４、及び１０５コピー。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００で使用するためのプロファイルと条件を備え、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅及び検出技術を使用するｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００汎用ＰＣＲマスターミックスが含まれる。使用したｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００ ＰＣＲプロファイルを以下の表２に示す：
ＨＰＩＶ１オリゴヌクレオチドは、ＨＰＩＶ１（配列番号１～３）を検出するためのプライマー／プローブを使用して試験した。フォワードプライマー（配列番号１）の最終濃度は２００ｎＭ、リバースプライマー（配列番号２）は１５０ｎＭ、プローブ（配列番号３）は７５ｎＭであった。ＨＰＩＶ１アッセイはＨＥＸチャネルにおいて試験された。ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成された転写物は、以下の濃度で使用された：反応あたり１０、１０２、１０３、１０４、及び１０５コピー。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００で使用するためのプロファイルと条件を備え、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅及び検出技術を使用するｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００汎用ＰＣＲマスターミックスが含まれる。使用したｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００ ＰＣＲプロファイルを以下の表２に示す：
結果を図７Ａに示し、これは、ＨＰＩＶ１アッセイの性能の希釈系列のＰＣＲ増殖曲線を示している。図７Ａは、使用したＨＰＩＶ１プライマー及びプローブ（配列番号１～３）がＨＰＩＶ１を増幅及び検出できることを示している。図７Ｂは、ＨＰＩＶ１アッセイの効率を示し、ＨＰＩＶ１リアルタイムＰＣＲアッセイが効率的であり、低い標的濃度で優れた感度を示すことを実証する。これらのデータは、ＨＰＩＶ１リアルタイムＰＣＲアッセイが試験された範囲にわたって直線的であり、１回の反応あたり最大１０コピーの標的を検出できることを示している。まとめると、これらのデータは、ＨＰＩＶ１リアルタイムアッセイ（配列番号１～３のオリゴヌクレオチド配列を含む）がＨＰＩＶ１を検出及び増幅できることを実証する。
実施例３：ＨＰＩＶ２プライマー及びプローブは、リアルタイムＰＣＲアッセイでＨＰＩＶ１の巨大タンパク質遺伝子を増幅及び検出する
ＨＰＩＶ２オリゴヌクレオチドは、ＨＰＩＶ２（配列番号４、５及び７）を検出するためのプライマー／プローブを使用して試験した。フォワードプライマー（配列番号４）の最終濃度は１５０ｎＭ、リバースプライマー（配列番号５）は１５０ｎＭ、プローブ（配列番号７）は７５ｎＭであった。ＨＰＩＶ２アッセイはＣＯＵチャネルにおいて試験された。ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成された転写物は、以下の濃度で使用された：反応あたり１０、１０２、１０３、１０４、１０５及び１０６コピー。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００で使用するためのプロファイルと条件を備え、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅及び検出技術を使用するｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００汎用ＰＣＲマスターミックスが含まれる。使用したｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００ＰＣＲプロファイルは上の表２に示される。結果を図８Ａに示し、これは、ＨＰＩＶ２アッセイの性能の希釈系列のＰＣＲ増殖曲線を示している。図８Ａは、使用したＨＰＩＶ２プライマー及びプローブ（配列番号４、５及び７）がＨＰＩＶ２を増幅及び検出できることを示している。図８Ｂは、ＨＰＩＶ２アッセイの効率を示し、ＨＰＩＶ２リアルタイムＰＣＲアッセイが効率的であり、低い標的濃度で優れた感度を示すことを実証する。これらのデータは、ＨＰＩＶ１リアルタイムＰＣＲアッセイが試験された範囲にわたって直線的であることを示している。しかし、全体として、これらの結果は、ＲＦＩがより高い可能性があり、ＨＰＩＶ２アッセイの性能に関して改善が可能であることを示しており、アッセイの最適化（例えば、プライマー／プローブのオリゴヌクレオチド濃度）が必要であることを示唆している。この目的のために、プライマーとプローブの濃度が滴定された。３つの異なる濃度条件を試験した：（１）プライマー濃度１５０ｎＭ、プローブ濃度７５ｎＭ；（２）プライマー濃度２００ｎＭ、プローブ濃度１００ｎＭ；（３）プライマー濃度３００ｎＭ及びプローブ濃度１００ｎＭ（図８Ｃに示される）。ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成された転写物は、以下の濃度で使用された：反応あたり１０、１０２、１０３、及び１０４コピー。３つの異なる濃度条件のそれぞれの結果が図８Ｄに示されており、プライマー及びプローブの濃度が増加するとシグナルが改善されることを示している。これらの研究は、ＨＰＩＶ２アッセイが、反応あたり１０コピーまで検出できるほど堅牢であることを示している。まとめると、これらのデータは、ＨＰＩＶ１リアルタイムアッセイ（配列番号４、５及び７のオリゴヌクレオチド配列を含む）がＨＰＩＶ２を検出及び増幅できることを実証する。
ＨＰＩＶ２オリゴヌクレオチドは、ＨＰＩＶ２（配列番号４、５及び７）を検出するためのプライマー／プローブを使用して試験した。フォワードプライマー（配列番号４）の最終濃度は１５０ｎＭ、リバースプライマー（配列番号５）は１５０ｎＭ、プローブ（配列番号７）は７５ｎＭであった。ＨＰＩＶ２アッセイはＣＯＵチャネルにおいて試験された。ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成された転写物は、以下の濃度で使用された：反応あたり１０、１０２、１０３、１０４、１０５及び１０６コピー。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００で使用するためのプロファイルと条件を備え、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅及び検出技術を使用するｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００汎用ＰＣＲマスターミックスが含まれる。使用したｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００ＰＣＲプロファイルは上の表２に示される。結果を図８Ａに示し、これは、ＨＰＩＶ２アッセイの性能の希釈系列のＰＣＲ増殖曲線を示している。図８Ａは、使用したＨＰＩＶ２プライマー及びプローブ（配列番号４、５及び７）がＨＰＩＶ２を増幅及び検出できることを示している。図８Ｂは、ＨＰＩＶ２アッセイの効率を示し、ＨＰＩＶ２リアルタイムＰＣＲアッセイが効率的であり、低い標的濃度で優れた感度を示すことを実証する。これらのデータは、ＨＰＩＶ１リアルタイムＰＣＲアッセイが試験された範囲にわたって直線的であることを示している。しかし、全体として、これらの結果は、ＲＦＩがより高い可能性があり、ＨＰＩＶ２アッセイの性能に関して改善が可能であることを示しており、アッセイの最適化（例えば、プライマー／プローブのオリゴヌクレオチド濃度）が必要であることを示唆している。この目的のために、プライマーとプローブの濃度が滴定された。３つの異なる濃度条件を試験した：（１）プライマー濃度１５０ｎＭ、プローブ濃度７５ｎＭ；（２）プライマー濃度２００ｎＭ、プローブ濃度１００ｎＭ；（３）プライマー濃度３００ｎＭ及びプローブ濃度１００ｎＭ（図８Ｃに示される）。ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成された転写物は、以下の濃度で使用された：反応あたり１０、１０２、１０３、及び１０４コピー。３つの異なる濃度条件のそれぞれの結果が図８Ｄに示されており、プライマー及びプローブの濃度が増加するとシグナルが改善されることを示している。これらの研究は、ＨＰＩＶ２アッセイが、反応あたり１０コピーまで検出できるほど堅牢であることを示している。まとめると、これらのデータは、ＨＰＩＶ１リアルタイムアッセイ（配列番号４、５及び７のオリゴヌクレオチド配列を含む）がＨＰＩＶ２を検出及び増幅できることを実証する。
実施例４：ＨＰＩＶ３プライマー及びプローブは、リアルタイムＰＣＲアッセイでＨＰＩＶ３のヌクレオカプシドタンパク質遺伝子を増幅及び検出する
ＨＰＩＶ３オリゴヌクレオチドは、ＨＰＩＶ３（配列番号８～１０）を検出するためのプライマー／プローブを使用して試験した。フォワードプライマー（配列番号８）の最終濃度は２００ｎＭ、リバースプライマー（配列番号９）は１５０ｎＭ、プローブ（配列番号１０）は１００ｎＭであった。ＨＰＩＶ３アッセイはＪＡ２７０チャネルにおいて試験された。ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成された転写物は、以下の濃度で使用された：反応あたり１０、１０２、１０３、１０４、１０５及び１０６コピー。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００で使用するためのプロファイルと条件を備え、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅及び検出技術を使用するｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００汎用ＰＣＲマスターミックスが含まれる。使用したｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００ ＰＣＲプロファイルは上の表２に示される。結果を図９Ａに示し、これは、ＨＰＩＶ３アッセイの性能の希釈系列のＰＣＲ増殖曲線を示している。図９Ａは、使用したＨＰＩＶ３プライマー及びプローブ（配列番号９～１０）がＨＰＩＶ３を増幅及び検出できることを示している。図９Ｂは、ＨＰＩＶ３アッセイの効率を示し、ＨＰＩＶ３リアルタイムＰＣＲアッセイが効率的であり、低い標的濃度で優れた感度を示すことを実証する。これらのデータは、ＨＰＩＶ３リアルタイムＰＣＲアッセイが試験された範囲にわたって直線的であり、１回の反応あたり最大１０コピーを検出できることを示している。まとめると、これらのデータは、ＨＰＩＶ３リアルタイムアッセイ（配列番号８～１０のオリゴヌクレオチド配列を含む）がＨＰＩＶ３を検出及び増幅できることを実証する。
ＨＰＩＶ３オリゴヌクレオチドは、ＨＰＩＶ３（配列番号８～１０）を検出するためのプライマー／プローブを使用して試験した。フォワードプライマー（配列番号８）の最終濃度は２００ｎＭ、リバースプライマー（配列番号９）は１５０ｎＭ、プローブ（配列番号１０）は１００ｎＭであった。ＨＰＩＶ３アッセイはＪＡ２７０チャネルにおいて試験された。ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成された転写物は、以下の濃度で使用された：反応あたり１０、１０２、１０３、１０４、１０５及び１０６コピー。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００で使用するためのプロファイルと条件を備え、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅及び検出技術を使用するｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００汎用ＰＣＲマスターミックスが含まれる。使用したｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００ ＰＣＲプロファイルは上の表２に示される。結果を図９Ａに示し、これは、ＨＰＩＶ３アッセイの性能の希釈系列のＰＣＲ増殖曲線を示している。図９Ａは、使用したＨＰＩＶ３プライマー及びプローブ（配列番号９～１０）がＨＰＩＶ３を増幅及び検出できることを示している。図９Ｂは、ＨＰＩＶ３アッセイの効率を示し、ＨＰＩＶ３リアルタイムＰＣＲアッセイが効率的であり、低い標的濃度で優れた感度を示すことを実証する。これらのデータは、ＨＰＩＶ３リアルタイムＰＣＲアッセイが試験された範囲にわたって直線的であり、１回の反応あたり最大１０コピーを検出できることを示している。まとめると、これらのデータは、ＨＰＩＶ３リアルタイムアッセイ（配列番号８～１０のオリゴヌクレオチド配列を含む）がＨＰＩＶ３を検出及び増幅できることを実証する。
実施例５：ＨＰＩＶ４プライマー及びプローブは、リアルタイムＰＣＲアッセイでＨＰＩＶ４の巨大タンパク質遺伝子を増幅及び検出する
ＨＰＩＶ４オリゴヌクレオチドは、ＨＰＩＶ３（配列番号１１～１３）を検出するためのプライマー／プローブを使用して試験した。フォワードプライマー（配列番号１１）の最終濃度は２００ｎＭ、リバースプライマー（配列番号１２）は２００ｎＭ、プローブ（配列番号１３）は１００ｎＭであった。ＨＰＩＶ４アッセイはＦＡＭチャネルにおいて試験された。ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成された転写物は、以下の濃度で使用された：反応あたり１０、１０２、１０３、１０４、１０５及び１０６コピー。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００で使用するためのプロファイルと条件を備え、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅及び検出技術を使用するｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００汎用ＰＣＲマスターミックスが含まれる。使用したｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００ ＰＣＲプロファイルは上の表２に示される。結果を図１０Ａに示し、これは、ＨＰＩＶ４アッセイの性能の希釈系列のＰＣＲ増殖曲線を示している。図１０Ａは、使用したＨＰＩＶ４プライマー及びプローブ（配列番号１１～１３）がＨＰＩＶ４を増幅及び検出できることを示している。図１０Ｂは、ＨＰＩＶ４アッセイの効率を示し、ＨＰＩＶ４リアルタイムＰＣＲアッセイが効率的であり、低い標的濃度で優れた感度を示すことを実証する。これらのデータは、ＨＰＩＶ１リアルタイムＰＣＲアッセイが試験された範囲にわたって直線的であり、４回の反応あたり最大１０コピーを検出できることを示している。まとめると、これらのデータは、ＨＰＩＶ４リアルタイムアッセイ（配列番号１１～１３のオリゴヌクレオチド配列を含む）がＨＰＩＶ４を検出及び増幅できることを実証する。
ＨＰＩＶ４オリゴヌクレオチドは、ＨＰＩＶ３（配列番号１１～１３）を検出するためのプライマー／プローブを使用して試験した。フォワードプライマー（配列番号１１）の最終濃度は２００ｎＭ、リバースプライマー（配列番号１２）は２００ｎＭ、プローブ（配列番号１３）は１００ｎＭであった。ＨＰＩＶ４アッセイはＦＡＭチャネルにおいて試験された。ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成された転写物は、以下の濃度で使用された：反応あたり１０、１０２、１０３、１０４、１０５及び１０６コピー。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００で使用するためのプロファイルと条件を備え、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅及び検出技術を使用するｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００汎用ＰＣＲマスターミックスが含まれる。使用したｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００ ＰＣＲプロファイルは上の表２に示される。結果を図１０Ａに示し、これは、ＨＰＩＶ４アッセイの性能の希釈系列のＰＣＲ増殖曲線を示している。図１０Ａは、使用したＨＰＩＶ４プライマー及びプローブ（配列番号１１～１３）がＨＰＩＶ４を増幅及び検出できることを示している。図１０Ｂは、ＨＰＩＶ４アッセイの効率を示し、ＨＰＩＶ４リアルタイムＰＣＲアッセイが効率的であり、低い標的濃度で優れた感度を示すことを実証する。これらのデータは、ＨＰＩＶ１リアルタイムＰＣＲアッセイが試験された範囲にわたって直線的であり、４回の反応あたり最大１０コピーを検出できることを示している。まとめると、これらのデータは、ＨＰＩＶ４リアルタイムアッセイ（配列番号１１～１３のオリゴヌクレオチド配列を含む）がＨＰＩＶ４を検出及び増幅できることを実証する。
実施例６：ＨＰＩＶ１－４プライマー及びプローブは、ＨＰＩＶ１－４多重リアルタイムＰＣＲアッセイにおいて、ウイルス溶出物からの標的ＨＰＩＶ１－４核酸を同時に増幅及び検出する
ＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドを、ＨＰＩＶ１（配列番号１～３）、ＨＰＩＶ２（配列番号４、５、及び７）、ＨＰＩＶ３（配列番号８～１０）、及びＨＰＩＶ４（配列番号１１～１３）を検出するためのプライマー／プローブを使用して試験した。ＨＰＩＶ１－４のオリゴヌクレオチドは、サンプルがＨＰＩＶ１－４に対するすべてのオリゴヌクレオチドに同時に曝露されるように、多重条件下で試験された。ＨＰＩＶ１アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＨＥＸチャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ２アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＣＯＵチャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ３アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＪＡ２７０チャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ４アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＦＡＭチャンネルにおいて試験された。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００で使用するためのプロファイルと条件を備え、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅及び検出技術を使用するｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００汎用ＰＣＲマスターミックスが含まれる。使用したｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００ ＰＣＲプロファイルは上の表２に示される。ウイルス溶出サンプルはＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ（カタログ番号ＮＡＴＲＶＰ－ＩＤＩ（バッチ３１８３０２））から入手した。結果は図１１Ａ及び図１１Ｂに示されており、ウイルス溶出液１～４の多重アッセイのそれぞれについてのＰＣＲ増殖曲線を示している。図１１Ａ及び図１１Ｂは、使用したＨＰＩＶ１－４プライマー及びプローブ（配列番号１～５及び７～１３）がウイルス溶出液からＨＰＩＶ１－４を増幅及び検出できることを示す。つまり、試験したウイルス溶出液はすべて、予想されたチャネルで検出された。まとめると、これらのデータは、ＨＰＩＶ１－４多重リアルタイムアッセイ（配列番号１～５及び６～１３のオリゴヌクレオチド配列を含む）は、ＨＰＩＶ１－４の標的核酸配列を含むウイルス溶出液を検出及び増幅することができることを実証する。さらに、ＨＰＩＶ１－４アッセイの排他性について試験し、ＨＰＩＶ１－４を検出及び増幅するためのオリゴヌクレオチドと他の呼吸器ウイルス標的との間に交差反応性があるかどうかを確認した。この目的を達成するために、高力価ウイルス培養物からのアデノウイルス（ＡＶ）、エンテロウイルス／ライノウイルス（ＥＶ／ＲＶ）、及びヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）を含む他の呼吸器ウイルス標的が使用された。この研究では、ＨＰＩＶ１－４（配列番号１～５及び６～１３）の検出及び増幅用のオリゴヌクレオチドを、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４）並びにＡＶ（ＡＶＢ、ＡＶＥ、ＡＶＣ、及びＡＶＡ株）、ＥＶ／ＲＶ（ＥＶＡ、ＥＶＢ、ＥＶＤ６８、及びＲＶＡ株）及びＨＭＰＶ標的に対するＰＣＲアッセイにおいて試験した。ＡＶ、ＥＶ／ＲＶ、ＨＭＰＶ標的に対して特異的なプライマーも使用した。図１１Ｂに示す結果は、ＨＰＩＶ１－４のオリゴヌクレオチドが、高力価ウイルス培養物からの複数の呼吸器ウイルス標的との交差反応性を示さないことを示している。したがって、これらの研究は、ＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドのＨＰＩＶ１－４標的のみに対する排他性及び特異性を実証している。
ＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドを、ＨＰＩＶ１（配列番号１～３）、ＨＰＩＶ２（配列番号４、５、及び７）、ＨＰＩＶ３（配列番号８～１０）、及びＨＰＩＶ４（配列番号１１～１３）を検出するためのプライマー／プローブを使用して試験した。ＨＰＩＶ１－４のオリゴヌクレオチドは、サンプルがＨＰＩＶ１－４に対するすべてのオリゴヌクレオチドに同時に曝露されるように、多重条件下で試験された。ＨＰＩＶ１アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＨＥＸチャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ２アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＣＯＵチャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ３アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＪＡ２７０チャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ４アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＦＡＭチャンネルにおいて試験された。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００で使用するためのプロファイルと条件を備え、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅及び検出技術を使用するｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００汎用ＰＣＲマスターミックスが含まれる。使用したｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００ ＰＣＲプロファイルは上の表２に示される。ウイルス溶出サンプルはＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ（カタログ番号ＮＡＴＲＶＰ－ＩＤＩ（バッチ３１８３０２））から入手した。結果は図１１Ａ及び図１１Ｂに示されており、ウイルス溶出液１～４の多重アッセイのそれぞれについてのＰＣＲ増殖曲線を示している。図１１Ａ及び図１１Ｂは、使用したＨＰＩＶ１－４プライマー及びプローブ（配列番号１～５及び７～１３）がウイルス溶出液からＨＰＩＶ１－４を増幅及び検出できることを示す。つまり、試験したウイルス溶出液はすべて、予想されたチャネルで検出された。まとめると、これらのデータは、ＨＰＩＶ１－４多重リアルタイムアッセイ（配列番号１～５及び６～１３のオリゴヌクレオチド配列を含む）は、ＨＰＩＶ１－４の標的核酸配列を含むウイルス溶出液を検出及び増幅することができることを実証する。さらに、ＨＰＩＶ１－４アッセイの排他性について試験し、ＨＰＩＶ１－４を検出及び増幅するためのオリゴヌクレオチドと他の呼吸器ウイルス標的との間に交差反応性があるかどうかを確認した。この目的を達成するために、高力価ウイルス培養物からのアデノウイルス（ＡＶ）、エンテロウイルス／ライノウイルス（ＥＶ／ＲＶ）、及びヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）を含む他の呼吸器ウイルス標的が使用された。この研究では、ＨＰＩＶ１－４（配列番号１～５及び６～１３）の検出及び増幅用のオリゴヌクレオチドを、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４）並びにＡＶ（ＡＶＢ、ＡＶＥ、ＡＶＣ、及びＡＶＡ株）、ＥＶ／ＲＶ（ＥＶＡ、ＥＶＢ、ＥＶＤ６８、及びＲＶＡ株）及びＨＭＰＶ標的に対するＰＣＲアッセイにおいて試験した。ＡＶ、ＥＶ／ＲＶ、ＨＭＰＶ標的に対して特異的なプライマーも使用した。図１１Ｂに示す結果は、ＨＰＩＶ１－４のオリゴヌクレオチドが、高力価ウイルス培養物からの複数の呼吸器ウイルス標的との交差反応性を示さないことを示している。したがって、これらの研究は、ＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドのＨＰＩＶ１－４標的のみに対する排他性及び特異性を実証している。
実施例７：ＨＰＩＶ１－４プライマー及びプローブは、ＨＰＩＶ１－４多重リアルタイムＰＣＲアッセイにおいて、人為的鼻咽頭模擬臨床サンプルからの標的ＨＰＩＶ１－４核酸を同時に増幅及び検出する
ＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドを、ＨＰＩＶ１（配列番号１～３）、ＨＰＩＶ２（配列番号４、５、及び７）、ＨＰＩＶ３（配列番号８～１０）、及びＨＰＩＶ４（配列番号１１～１３）を検出するためのプライマー／プローブを使用して試験した。ＨＰＩＶ１－４のオリゴヌクレオチドは、サンプルがＨＰＩＶ１－４に対するすべてのオリゴヌクレオチドに同時に曝露されるように、多重条件下で試験された。ＨＰＩＶ１アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＨＥＸチャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ２アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＣＯＵチャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ３アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＪＡ２７０チャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ４アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＦＡＭチャンネルにおいて試験された。試験サンプルは、細胞、アルブミン、ムチンを含む臨床サンプルのバックグラウンドをシミュレートすることを意図した、人為的人工鼻咽頭マトリックス溶出液の存在下で試験され、以下の濃度で使用された：１回の反応あたり、１０、１０２、１０３、及び１０４コピー。マトリックスの組成を図１２Ａに示す。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００で使用するためのプロファイルと条件を備え、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅及び検出技術を使用するｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００汎用ＰＣＲマスターミックスが含まれる。使用したｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００ ＰＣＲプロファイルは上の表２に示される。結果を、図１２Ｂ（ＨＰＩＶ１）、図１２Ｃ（ＨＰＩＶ２）、図１２Ｄ（ＨＰＩＶ３）、及び図１２Ｅ（ＨＰＩＶ４）に示し、これらはＨＰＩＶ１－４アッセイの性能の希釈系列のＰＣＲ増殖曲線を示す。結果は、鼻咽頭マトリックスの存在下で、ＨＰＩＶ１－４型の感度が最小１００コピー／反応までであることを示した。図１２Ｂ～１２Ｄは、ＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドが、多重設定において人為的人工鼻咽頭模擬臨床サンプルから標的ＨＰＩＶ１－４核酸を同時に増幅及び検出できることを実証する。人為的人工鼻咽頭マトリックスは鼻咽頭臨床サンプルをシミュレートしているため、これらのデータは、ＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドが実際の鼻咽頭サンプルから標的ＨＰＩＶ１－４核酸を同時に増幅及び検出できることを示唆している。
ＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドを、ＨＰＩＶ１（配列番号１～３）、ＨＰＩＶ２（配列番号４、５、及び７）、ＨＰＩＶ３（配列番号８～１０）、及びＨＰＩＶ４（配列番号１１～１３）を検出するためのプライマー／プローブを使用して試験した。ＨＰＩＶ１－４のオリゴヌクレオチドは、サンプルがＨＰＩＶ１－４に対するすべてのオリゴヌクレオチドに同時に曝露されるように、多重条件下で試験された。ＨＰＩＶ１アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＨＥＸチャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ２アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＣＯＵチャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ３アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＪＡ２７０チャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ４アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＦＡＭチャンネルにおいて試験された。試験サンプルは、細胞、アルブミン、ムチンを含む臨床サンプルのバックグラウンドをシミュレートすることを意図した、人為的人工鼻咽頭マトリックス溶出液の存在下で試験され、以下の濃度で使用された：１回の反応あたり、１０、１０２、１０３、及び１０４コピー。マトリックスの組成を図１２Ａに示す。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００で使用するためのプロファイルと条件を備え、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅及び検出技術を使用するｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００汎用ＰＣＲマスターミックスが含まれる。使用したｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００ ＰＣＲプロファイルは上の表２に示される。結果を、図１２Ｂ（ＨＰＩＶ１）、図１２Ｃ（ＨＰＩＶ２）、図１２Ｄ（ＨＰＩＶ３）、及び図１２Ｅ（ＨＰＩＶ４）に示し、これらはＨＰＩＶ１－４アッセイの性能の希釈系列のＰＣＲ増殖曲線を示す。結果は、鼻咽頭マトリックスの存在下で、ＨＰＩＶ１－４型の感度が最小１００コピー／反応までであることを示した。図１２Ｂ～１２Ｄは、ＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドが、多重設定において人為的人工鼻咽頭模擬臨床サンプルから標的ＨＰＩＶ１－４核酸を同時に増幅及び検出できることを実証する。人為的人工鼻咽頭マトリックスは鼻咽頭臨床サンプルをシミュレートしているため、これらのデータは、ＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドが実際の鼻咽頭サンプルから標的ＨＰＩＶ１－４核酸を同時に増幅及び検出できることを示唆している。
実施例８：ＨＰＩＶ１－４プライマー及びプローブは、ＨＰＩＶ１－４多重リアルタイムＰＣＲアッセイにおいて、ウイルス溶出物からの標的ＨＰＩＶ１－４核酸を同時に特異的に増幅及び検出する
ＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドを、ＨＰＩＶ１（配列番号１～３）、ＨＰＩＶ２（配列番号４、５、及び７）、ＨＰＩＶ３（配列番号８～１０）、及びＨＰＩＶ４（配列番号１１～１３）を検出するためのプライマー／プローブを使用して試験した。ＨＰＩＶ１－４のオリゴヌクレオチドは、サンプルがＨＰＩＶ１－４に対するすべてのオリゴヌクレオチドに同時に曝露されるように、多重条件下で試験された。ＨＰＩＶ１アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＨＥＸチャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ２アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＣＯＵチャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ３アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＪＡ２７０チャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ４アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＦＡＭチャンネルにおいて試験された。試験したサンプルはウイルス溶出液（ＡＴＣＣカタログ番号：ＨＰＩＶ１－ＶＲ－９４；ＨＰＩＶ２－ＶＲ－９２；ＨＰＩＶ３－ＶＲ－１７８２）；ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘカタログ番号：ＨＰＩＶ４Ａ－０８１００６０ＣＦ）であって、ニートと１：１００，０００希釈の２つの濃度で試験した。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００で使用するためのプロファイルと条件を備え、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅及び検出技術を使用するｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００汎用ＰＣＲマスターミックスが含まれる。使用したｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００ ＰＣＲプロファイルは上の表２に示される。これらの研究は、ウイルス溶出液に対するＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドの特異性を試験するために設計された。結果を、図１３Ａ（ＨＰＩＶ１）、図１３Ｂ（ＨＰＩＶ２）、図１３Ｃ（ＨＰＩＶ３）、及び図１３Ｄ（ＨＰＩＶ４）に示し、これらはＨＰＩＶ１－４アッセイの性能の希釈系列のＰＣＲ増殖曲線を示す。これらの結果は、ＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドが、意図されたそれぞれの標的に対して特異的であることを示している。図１３Ａ～１３Ｄに見られるように、特定のＨＰＩＶ型に対する意図しないチャネルにおいてこれらのウイルス溶出液を使用した場合、交差反応性は観察されなかった。まとめると、これらの研究は、ＨＰＩＶ１－４のオリゴヌクレオチドが多重設定において意図した標的を特異的に増幅及び検出することを実証する。
ＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドを、ＨＰＩＶ１（配列番号１～３）、ＨＰＩＶ２（配列番号４、５、及び７）、ＨＰＩＶ３（配列番号８～１０）、及びＨＰＩＶ４（配列番号１１～１３）を検出するためのプライマー／プローブを使用して試験した。ＨＰＩＶ１－４のオリゴヌクレオチドは、サンプルがＨＰＩＶ１－４に対するすべてのオリゴヌクレオチドに同時に曝露されるように、多重条件下で試験された。ＨＰＩＶ１アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＨＥＸチャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ２アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＣＯＵチャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ３アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＪＡ２７０チャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ４アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＦＡＭチャンネルにおいて試験された。試験したサンプルはウイルス溶出液（ＡＴＣＣカタログ番号：ＨＰＩＶ１－ＶＲ－９４；ＨＰＩＶ２－ＶＲ－９２；ＨＰＩＶ３－ＶＲ－１７８２）；ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘカタログ番号：ＨＰＩＶ４Ａ－０８１００６０ＣＦ）であって、ニートと１：１００，０００希釈の２つの濃度で試験した。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００で使用するためのプロファイルと条件を備え、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅及び検出技術を使用するｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００汎用ＰＣＲマスターミックスが含まれる。使用したｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００ ＰＣＲプロファイルは上の表２に示される。これらの研究は、ウイルス溶出液に対するＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドの特異性を試験するために設計された。結果を、図１３Ａ（ＨＰＩＶ１）、図１３Ｂ（ＨＰＩＶ２）、図１３Ｃ（ＨＰＩＶ３）、及び図１３Ｄ（ＨＰＩＶ４）に示し、これらはＨＰＩＶ１－４アッセイの性能の希釈系列のＰＣＲ増殖曲線を示す。これらの結果は、ＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドが、意図されたそれぞれの標的に対して特異的であることを示している。図１３Ａ～１３Ｄに見られるように、特定のＨＰＩＶ型に対する意図しないチャネルにおいてこれらのウイルス溶出液を使用した場合、交差反応性は観察されなかった。まとめると、これらの研究は、ＨＰＩＶ１－４のオリゴヌクレオチドが多重設定において意図した標的を特異的に増幅及び検出することを実証する。
実施例９：ＨＰＩＶ１－４プライマー及びプローブは、ＨＰＩＶ１－４に対して陰性であることが知られている臨床サンプル中のＨＰＩＶ１－４標的を増幅及び検出できないため、ＨＰＩＶ１－４標的に対する特異性を示す
ＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドを、ＨＰＩＶ１（配列番号１～３）、ＨＰＩＶ２（配列番号４、５、及び７）、ＨＰＩＶ３（配列番号８～１０）、及びＨＰＩＶ４（配列番号１１～１３）を検出するためのプライマー／プローブを使用して試験した。ＨＰＩＶ１－４のオリゴヌクレオチドは、サンプルがＨＰＩＶ１－４に対するすべてのオリゴヌクレオチドに同時に曝露されるように、多重条件下で試験された。ＨＰＩＶ１アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＨＥＸチャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ２アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＣＯＵチャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ３アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＪＡ２７０チャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ４アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＦＡＭチャンネルにおいて試験された。試験されたサンプルは、ＨＰＩＶ１－４に対して陰性であることが知られている６人の個々の患者からの鼻咽頭溶出液であった。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００で使用するためのプロファイルと条件を備え、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅及び検出技術を使用するｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００汎用ＰＣＲマスターミックスが含まれる。使用したｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００ ＰＣＲプロファイルは上の表２に示される。これらの研究は、ＨＰＩＶ１－４陰性溶出液に対するＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドの特異性を試験するために設計された。結果は図１４Ａ及び図１４Ｂに示されており、これらはＨＰＩＶ１－４アッセイの性能のＰＣＲ増殖曲線を示している。これらの結果は、ＨＰＩＶ１－４に対して陰性であることが知られている鼻咽頭溶出液に対してＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドを用いても、どのチャンネルにおいても増幅が無いことを示している。これらの結果は、意図した標的が鼻咽頭溶出液中に存在しない場合、ＨＰＩＶ１－４のオリゴヌクレオチドが交差反応し、且つ／又は不用意に核酸を増幅したりしないことを示している。
ＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドを、ＨＰＩＶ１（配列番号１～３）、ＨＰＩＶ２（配列番号４、５、及び７）、ＨＰＩＶ３（配列番号８～１０）、及びＨＰＩＶ４（配列番号１１～１３）を検出するためのプライマー／プローブを使用して試験した。ＨＰＩＶ１－４のオリゴヌクレオチドは、サンプルがＨＰＩＶ１－４に対するすべてのオリゴヌクレオチドに同時に曝露されるように、多重条件下で試験された。ＨＰＩＶ１アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＨＥＸチャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ２アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＣＯＵチャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ３アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＪＡ２７０チャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ４アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＦＡＭチャンネルにおいて試験された。試験されたサンプルは、ＨＰＩＶ１－４に対して陰性であることが知られている６人の個々の患者からの鼻咽頭溶出液であった。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００で使用するためのプロファイルと条件を備え、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅及び検出技術を使用するｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００汎用ＰＣＲマスターミックスが含まれる。使用したｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００ ＰＣＲプロファイルは上の表２に示される。これらの研究は、ＨＰＩＶ１－４陰性溶出液に対するＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドの特異性を試験するために設計された。結果は図１４Ａ及び図１４Ｂに示されており、これらはＨＰＩＶ１－４アッセイの性能のＰＣＲ増殖曲線を示している。これらの結果は、ＨＰＩＶ１－４に対して陰性であることが知られている鼻咽頭溶出液に対してＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドを用いても、どのチャンネルにおいても増幅が無いことを示している。これらの結果は、意図した標的が鼻咽頭溶出液中に存在しない場合、ＨＰＩＶ１－４のオリゴヌクレオチドが交差反応し、且つ／又は不用意に核酸を増幅したりしないことを示している。
実施例１０：ＨＰＩＶ１－４プライマー及びプローブは、ＨＰＩＶ１－４多重リアルタイムＰＣＲアッセイにおいて、ウイルス溶出物からの標的ＨＰＩＶ１－４核酸を同時に特異的に増幅及び検出する
ＨＰＩＶ１オリゴヌクレオチドは、ＨＰＩＶ１（配列番号１～３）を検出するためのプライマー／プローブを使用して試験した。ＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドを、ＨＰＩＶ１（配列番号１～３）、ＨＰＩＶ２（配列番号４～６）、ＨＰＩＶ３（配列番号１５～１７）、及びＨＰＩＶ４（配列番号１１、１３、１８、及び１９）を検出するためのプライマー／プローブを使用して試験した。ＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドを図１５に示す。ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成された転写物は、以下の濃度で使用された：反応あたり１０、１０２、１０３、１０４、１０５及び１０６コピー。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００で使用するためのプロファイルと条件を備え、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅及び検出技術を使用するｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００汎用ＰＣＲマスターミックスが含まれる。使用したｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００ ＰＣＲプロファイルは上の表２に示される。ＨＰＩＶ１について、フォワードプライマー（配列番号１）は４００ｎＭの濃度であり、リバースプライマー（配列番号２）は３００ｎＭの濃度であり、プローブ（配列番号３）は１００ｎＭの濃度である。ＨＰＩＶ２について、フォワードプライマー（配列番号４）は２００ｎＭの濃度であり、リバースプライマー（配列番号５）は１５０ｎＭの濃度であり、プローブ（配列番号６）は１００ｎＭの濃度である。ＨＰＩＶ３について、フォワードプライマー（配列番号１５）は５００ｎＭの濃度であり、リバースプライマー（配列番号１６）は３００ｎＭの濃度であり、プローブ（配列番号１７）は１００ｎＭの濃度である。ＨＰＩＶ４について、フォワードプライマー（配列番号１１及び１８）はそれぞれ１００ｎＭ及び４００ｎＭの濃度であり、リバースプライマー（配列番号１９）は４００ｎＭの濃度であり、プローブ（配列番号１３）は１００ｎＭの濃度である。結果を、図１６Ａ（ＨＰＩＶ１）、図１６Ｂ（ＨＰＩＶ２）、図１６Ｃ（ＨＰＩＶ３）、及び図１６Ｄ（ＨＰＩＶ４）に示し、これらはＨＰＩＶ１－４アッセイの性能の希釈系列のＰＣＲ増殖曲線を示す。
ＨＰＩＶ１オリゴヌクレオチドは、ＨＰＩＶ１（配列番号１～３）を検出するためのプライマー／プローブを使用して試験した。ＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドを、ＨＰＩＶ１（配列番号１～３）、ＨＰＩＶ２（配列番号４～６）、ＨＰＩＶ３（配列番号１５～１７）、及びＨＰＩＶ４（配列番号１１、１３、１８、及び１９）を検出するためのプライマー／プローブを使用して試験した。ＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドを図１５に示す。ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成された転写物は、以下の濃度で使用された：反応あたり１０、１０２、１０３、１０４、１０５及び１０６コピー。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００で使用するためのプロファイルと条件を備え、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅及び検出技術を使用するｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００汎用ＰＣＲマスターミックスが含まれる。使用したｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００ ＰＣＲプロファイルは上の表２に示される。ＨＰＩＶ１について、フォワードプライマー（配列番号１）は４００ｎＭの濃度であり、リバースプライマー（配列番号２）は３００ｎＭの濃度であり、プローブ（配列番号３）は１００ｎＭの濃度である。ＨＰＩＶ２について、フォワードプライマー（配列番号４）は２００ｎＭの濃度であり、リバースプライマー（配列番号５）は１５０ｎＭの濃度であり、プローブ（配列番号６）は１００ｎＭの濃度である。ＨＰＩＶ３について、フォワードプライマー（配列番号１５）は５００ｎＭの濃度であり、リバースプライマー（配列番号１６）は３００ｎＭの濃度であり、プローブ（配列番号１７）は１００ｎＭの濃度である。ＨＰＩＶ４について、フォワードプライマー（配列番号１１及び１８）はそれぞれ１００ｎＭ及び４００ｎＭの濃度であり、リバースプライマー（配列番号１９）は４００ｎＭの濃度であり、プローブ（配列番号１３）は１００ｎＭの濃度である。結果を、図１６Ａ（ＨＰＩＶ１）、図１６Ｂ（ＨＰＩＶ２）、図１６Ｃ（ＨＰＩＶ３）、及び図１６Ｄ（ＨＰＩＶ４）に示し、これらはＨＰＩＶ１－４アッセイの性能の希釈系列のＰＣＲ増殖曲線を示す。
結果を図１６Ａに示し、これは、ＨＰＩＶ１アッセイの性能の希釈系列のＰＣＲ増殖曲線を示している。図１６Ａは、使用したＨＰＩＶ１プライマー及びプローブ（配列番号１～３）がＨＰＩＶ１を増幅及び検出できることを示している。図１６Ｂは、ＨＰＩＶ１アッセイの効率を示し、ＨＰＩＶ１リアルタイムＰＣＲアッセイが効率的であり、低い標的濃度で優れた感度を示すことを実証する。結果を図１６Ｃに示し、これは、ＨＰＩＶ２アッセイの性能の希釈系列のＰＣＲ増殖曲線を示している。図１６Ｃは、使用したＨＰＩＶ２プライマー及びプローブ（配列番号４～６）がＨＰＩＶ２を増幅及び検出できることを示している。図１６Ｄは、ＨＰＩＶ２アッセイの効率を示し、ＨＰＩＶ２リアルタイムＰＣＲアッセイが効率的であり、低い標的濃度で優れた感度を示すことを実証する。結果を図１６Ｅに示し、これは、ＨＰＩＶ３アッセイの性能の希釈系列のＰＣＲ増殖曲線を示している。図１６Ｅは、使用したＨＰＩＶ３プライマー及びプローブ（配列番号１５～１７）がＨＰＩＶ３を増幅及び検出できることを示している。図１６Ｆは、ＨＰＩＶ３アッセイの効率を示し、ＨＰＩＶ３リアルタイムＰＣＲアッセイが効率的であり、低い標的濃度で優れた感度を示すことを実証する。結果を図１６Ｇに示し、これは、ＨＰＩＶ４アッセイの性能の希釈系列のＰＣＲ増殖曲線を示している。図１６Ｇは、使用したＨＰＩＶ４プライマー及びプローブ（配列番号１１、１３、１８及び１９）がＨＰＩＶ４を増幅及び検出できることを示している。図１６Ｈは、ＨＰＩＶ４アッセイの効率を示し、ＨＰＩＶ４リアルタイムＰＣＲアッセイが効率的であり、低い標的濃度で優れた感度を示すことを実証する。
これらのデータは、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、ＨＰＩＶ３、及びＨＰＩＶ４のリアルタイムＰＣＲアッセイが試験された範囲にわたって直線的であり、１回の反応あたり最大１０コピーの標的を検出できることを示している。まとめると、これらのデータは、ＨＰＩＶ１（配列番号１～３）、ＨＰＩＶ２（配列番号４～６）、ＨＰＩＶ３（配列番号１５～１７）、及びＨＰＩＶ４（配列番号１１、１３、１８、及び１９）のリアルタイムアッセイは、それぞれＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、ＨＰＩＶ３、及びＨＰＩＶ４を検出及び増幅できることを実証する。
実施例１１：ＨＰＩＶ１－４プライマー及びプローブは、ＨＰＩＶ１－４多重リアルタイムＰＣＲアッセイにおいて、ウイルス溶出物からの標的ＨＰＩＶ１－４核酸を同時に増幅及び検出する
ＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドを、ＨＰＩＶ１（配列番号１～３）、ＨＰＩＶ２（配列番号４～６）、ＨＰＩＶ３（配列番号１５～１７）、及びＨＰＩＶ４（配列番号１１、１３、１８、及び１９）を検出するためのプライマー／プローブを使用して試験した。ＨＰＩＶ１－４のオリゴヌクレオチドは、サンプルがＨＰＩＶ１－４に対するすべてのオリゴヌクレオチドに同時に曝露されるように、多重条件下で試験された。ＨＰＩＶ１アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＨＥＸチャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ２アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＣＯＵチャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ３アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＪＡ２７０チャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ４アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＦＡＭチャンネルにおいて試験された。ＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドを、ＨＰＩＶ１（配列番号１～３）、ＨＰＩＶ２（配列番号４～６）、ＨＰＩＶ３（配列番号１５～１７）、及びＨＰＩＶ４（配列番号１１、１３、１８、及び１９）を検出するためのプライマー／プローブを使用して試験した。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００で使用するためのプロファイルと条件を備え、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅及び検出技術を使用するｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００汎用ＰＣＲマスターミックスが含まれる。使用したｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００ ＰＣＲプロファイルは上の表２に示される。ウイルス培養物は、ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ（カタログ番号ＮＡＴＲＶＰ－ＩＤＩ（バッチ３１８３０２））及びＡＴＣＣから入手した。結果を図１７Ａに示し、これは、ウイルス溶出液ＨＰＩＶ１－４シングルプレックスアッセイのそれぞれについてのＰＣＲ増殖曲線を示している。図１７Ａは、使用したＨＰＩＶ１－４プライマー及びプローブ（ＨＰＩＶ１（配列番号１～３）、ＨＰＩＶ２（配列番号４～６）、ＨＰＩＶ３（配列番号１５～１７）、及びＨＰＩＶ４（配列番号１１、１３、１８、及び１９））は、ウイルス溶出液からＨＰＩＶ１－４を検出及び増幅できることを示している。つまり、試験したウイルス溶出液はすべて、予想されたチャネルで検出された。まとめると、これらのデータは、ＨＰＩＶ１－４多重リアルタイムアッセイ（ＨＰＩＶ１（配列番号１～３）、ＨＰＩＶ２（配列番号４～６）、ＨＰＩＶ３（配列番号１５～１７）、及びＨＰＩＶ４（配列番号１１、１３、１８、及び１９））は、ＨＰＩＶ１－４の標的核酸配列を含むウイルス溶出液を検出及び増幅することができることを実証する。
ＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドを、ＨＰＩＶ１（配列番号１～３）、ＨＰＩＶ２（配列番号４～６）、ＨＰＩＶ３（配列番号１５～１７）、及びＨＰＩＶ４（配列番号１１、１３、１８、及び１９）を検出するためのプライマー／プローブを使用して試験した。ＨＰＩＶ１－４のオリゴヌクレオチドは、サンプルがＨＰＩＶ１－４に対するすべてのオリゴヌクレオチドに同時に曝露されるように、多重条件下で試験された。ＨＰＩＶ１アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＨＥＸチャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ２アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＣＯＵチャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ３アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＪＡ２７０チャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ４アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＦＡＭチャンネルにおいて試験された。ＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドを、ＨＰＩＶ１（配列番号１～３）、ＨＰＩＶ２（配列番号４～６）、ＨＰＩＶ３（配列番号１５～１７）、及びＨＰＩＶ４（配列番号１１、１３、１８、及び１９）を検出するためのプライマー／プローブを使用して試験した。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００で使用するためのプロファイルと条件を備え、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅及び検出技術を使用するｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００汎用ＰＣＲマスターミックスが含まれる。使用したｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００ ＰＣＲプロファイルは上の表２に示される。ウイルス培養物は、ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ（カタログ番号ＮＡＴＲＶＰ－ＩＤＩ（バッチ３１８３０２））及びＡＴＣＣから入手した。結果を図１７Ａに示し、これは、ウイルス溶出液ＨＰＩＶ１－４シングルプレックスアッセイのそれぞれについてのＰＣＲ増殖曲線を示している。図１７Ａは、使用したＨＰＩＶ１－４プライマー及びプローブ（ＨＰＩＶ１（配列番号１～３）、ＨＰＩＶ２（配列番号４～６）、ＨＰＩＶ３（配列番号１５～１７）、及びＨＰＩＶ４（配列番号１１、１３、１８、及び１９））は、ウイルス溶出液からＨＰＩＶ１－４を検出及び増幅できることを示している。つまり、試験したウイルス溶出液はすべて、予想されたチャネルで検出された。まとめると、これらのデータは、ＨＰＩＶ１－４多重リアルタイムアッセイ（ＨＰＩＶ１（配列番号１～３）、ＨＰＩＶ２（配列番号４～６）、ＨＰＩＶ３（配列番号１５～１７）、及びＨＰＩＶ４（配列番号１１、１３、１８、及び１９））は、ＨＰＩＶ１－４の標的核酸配列を含むウイルス溶出液を検出及び増幅することができることを実証する。
さらに、ＨＰＩＶ１－４アッセイの排他性について試験し、ＨＰＩＶ１－４を検出及び増幅するためのオリゴヌクレオチドと他の呼吸器ウイルス標的との間に交差反応性があるかどうかを確認した。そのために、高力価ウイルス培養物からのアデノウイルス（ＡｄＶ）、ヒトコロナウイルス（ＣｏＶ）、エンテロウイルス（ＥＶ）、インフルエンザ、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス（ＲＶ）、及び重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を含む、他の呼吸器ウイルスの標的が使用された。この研究において、ＨＰＩＶ１－４の検出及び増幅のためのオリゴヌクレオチド（ＨＰＩＶ１（配列番号１～３）、ＨＰＩＶ２（配列番号４～６）、ＨＰＩＶ３（配列番号１５～１７）、及びＨＰＩＶ４（配列番号１１、１３、１８、及び１９））を、ＨＰＩＶ（ＨＰＩＶ１－４）、ＡｄＶ（ＡｄＶ－Ｂ、ＡｄＶ－Ｅ、ＡｄＶ－Ｃ株）、ＣｏＶ（ＣｏＶ２２９Ｅ、ＣｏＶ ＨＫＵ１＋ＨＰＩＶ３（臨床サンプル）、ＣｏＶ ＮＬ６３、ＣｏＶ ＯＣ４３）、ＥＶ（ＥＶ Ｄ６８及びＥＶ Ｃ）、インフルエンザ（ＦｌｕＡ Ｈ１Ｎ１、ＦｌｕＡ Ｈ３Ｎ２、及びＦｌｕＢ）、ＨＭＰＶ（ＨＭＰＶ Ａ１及びＨＭＰＶ Ｂ１）、ＲＳＶ（ＲＳＶＡ及びＲＳＶＢ）、ライノウイルス（ＲＶ Ａ及びＲＶ Ｂ）、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２溶出物に対するＰＣＲアッセイにおいて試験した。図１７Ｂに示す結果は、多重設定におけるＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドは、高力価の複数の呼吸器ウイルス培養物からの複数の呼吸器ウイルス標的との交差反応性を示さないことを示している。したがって、これらの研究は、多重設定におけるＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドのＨＰＩＶ１－４標的のみに対する排他性及び特異性を実証している。
実施例１２：ＨＰＩＶ１－４プライマー及びプローブは、ＨＰＩＶ１－４多重リアルタイムＰＣＲアッセイにおいて、人為的鼻咽頭模擬臨床サンプルからの標的ＨＰＩＶ１－４核酸を同時に増幅及び検出する
ＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドを、ＨＰＩＶ１（配列番号１～３）、ＨＰＩＶ２（配列番号４～６）、ＨＰＩＶ３（配列番号１５～１７）、及びＨＰＩＶ４（配列番号１１、１３、１８、及び１９）を検出するためのプライマー／プローブを使用して試験した。ＨＰＩＶ１－４のオリゴヌクレオチドは、サンプルがＨＰＩＶ１－４に対するすべてのオリゴヌクレオチドに同時に曝露されるように、多重条件下で試験された。ＨＰＩＶ１アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＨＥＸチャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ２アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＣＯＵチャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ３アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＪＡ２７０チャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ４アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＦＡＭチャンネルにおいて試験された。試験サンプルは、細胞、及びムチンを含む臨床サンプルのバックグラウンドをシミュレートすることを意図した、人為的人工鼻咽頭マトリックス溶出液の存在下で試験され、以下の濃度で使用された：反応あたり５ｘ１００、５ｘ１０１、５ｘ１０２、５ｘ１０３、及び５ｘ１０４コピー。マトリックスの組成を図１８Ａに示す。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００で使用するためのプロファイルと条件を備え、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅及び検出技術を使用するｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００汎用ＰＣＲマスターミックスが含まれる。使用したｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００ ＰＣＲプロファイルは上の表２に示される。結果を、図１８Ｂ（ＨＰＩＶ１）、図１８Ｃ（ＨＰＩＶ２）、図１８Ｄ（ＨＰＩＶ３）、及び図１８Ｅ（ＨＰＩＶ４）に示し、これらはＨＰＩＶ１－４アッセイの性能の希釈系列のＰＣＲ増殖曲線を示す。結果は、鼻咽頭マトリックスの存在下で、ＨＰＩＶ１－４型の感度が最小５０コピー／反応までであることを示した。図１８Ｂ、図１８Ｃ、図１８Ｄ、及び図１８Ｅは、ＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドが、多重設定において人為的人工鼻咽頭模擬臨床サンプルから標的ＨＰＩＶ１－４核酸を同時に増幅及び検出できることを示す。データは、ＨＰＩＶ１－４多重アッセイが、鼻咽頭バックグラウンドの存在下で４つのＨＰＩＶ型の感度を最小５０コピー／反応まで示すことを示している。人為的人工鼻咽頭マトリックスは鼻咽頭臨床サンプルをシミュレートしているため、これらのデータは、ＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドが実際の鼻咽頭サンプルから標的ＨＰＩＶ１－４核酸を同時に増幅及び検出できることを示唆している。
ＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドを、ＨＰＩＶ１（配列番号１～３）、ＨＰＩＶ２（配列番号４～６）、ＨＰＩＶ３（配列番号１５～１７）、及びＨＰＩＶ４（配列番号１１、１３、１８、及び１９）を検出するためのプライマー／プローブを使用して試験した。ＨＰＩＶ１－４のオリゴヌクレオチドは、サンプルがＨＰＩＶ１－４に対するすべてのオリゴヌクレオチドに同時に曝露されるように、多重条件下で試験された。ＨＰＩＶ１アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＨＥＸチャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ２アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＣＯＵチャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ３アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＪＡ２７０チャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ４アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＦＡＭチャンネルにおいて試験された。試験サンプルは、細胞、及びムチンを含む臨床サンプルのバックグラウンドをシミュレートすることを意図した、人為的人工鼻咽頭マトリックス溶出液の存在下で試験され、以下の濃度で使用された：反応あたり５ｘ１００、５ｘ１０１、５ｘ１０２、５ｘ１０３、及び５ｘ１０４コピー。マトリックスの組成を図１８Ａに示す。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００で使用するためのプロファイルと条件を備え、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅及び検出技術を使用するｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００汎用ＰＣＲマスターミックスが含まれる。使用したｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００ ＰＣＲプロファイルは上の表２に示される。結果を、図１８Ｂ（ＨＰＩＶ１）、図１８Ｃ（ＨＰＩＶ２）、図１８Ｄ（ＨＰＩＶ３）、及び図１８Ｅ（ＨＰＩＶ４）に示し、これらはＨＰＩＶ１－４アッセイの性能の希釈系列のＰＣＲ増殖曲線を示す。結果は、鼻咽頭マトリックスの存在下で、ＨＰＩＶ１－４型の感度が最小５０コピー／反応までであることを示した。図１８Ｂ、図１８Ｃ、図１８Ｄ、及び図１８Ｅは、ＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドが、多重設定において人為的人工鼻咽頭模擬臨床サンプルから標的ＨＰＩＶ１－４核酸を同時に増幅及び検出できることを示す。データは、ＨＰＩＶ１－４多重アッセイが、鼻咽頭バックグラウンドの存在下で４つのＨＰＩＶ型の感度を最小５０コピー／反応まで示すことを示している。人為的人工鼻咽頭マトリックスは鼻咽頭臨床サンプルをシミュレートしているため、これらのデータは、ＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドが実際の鼻咽頭サンプルから標的ＨＰＩＶ１－４核酸を同時に増幅及び検出できることを示唆している。
実施例１３：ＨＰＩＶ１－４プライマー及びプローブは、ＨＰＩＶ１－４多重リアルタイムＰＣＲアッセイにおいて、ウイルス溶出物からの標的ＨＰＩＶ１－４核酸を同時に特異的に増幅及び検出する
ＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドを、ＨＰＩＶ１（配列番号１～３）、ＨＰＩＶ２（配列番号４～６）、ＨＰＩＶ３（配列番号１５～１７）、及びＨＰＩＶ４（配列番号１１、１３、１８、及び１９）を検出するためのプライマー／プローブを使用して試験した。ＨＰＩＶ１－４のオリゴヌクレオチドは、サンプルがＨＰＩＶ１－４に対するすべてのオリゴヌクレオチドに同時に曝露されるように、多重条件下で試験された。ＨＰＩＶ１アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＨＥＸチャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ２アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＣＯＵチャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ３アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＪＡ２７０チャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ４アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＦＡＭチャンネルにおいて試験された。試験したサンプルはウイルス溶出液（ＡＴＣＣカタログ番号：ＨＰＩＶ１－ＶＲ－９４；ＨＰＩＶ２－ＶＲ－９２；ＨＰＩＶ３－ＶＲ－１７８２；ＨＰＩＶ－４Ｂ－ＶＲ１３７７）；ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘカタログ番号：ＨＰＩＶ４Ａ－０８１００６０ＣＦ）であって、ニートと１：１００，０００希釈の２つの濃度で試験した。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００で使用するためのプロファイルと条件を備え、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅及び検出技術を使用するｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００汎用ＰＣＲマスターミックスが含まれる。使用したｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００ ＰＣＲプロファイルは上の表２に示される。これらの研究は、ウイルス溶出液に対するＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドの特異性を試験するために設計された。結果を、図１９Ａ（ＨＰＩＶ１）、図１９Ｂ（ＨＰＩＶ２）、図１９Ｃ（ＨＰＩＶ３）、及び図１９Ｄ（ＨＰＩＶ４）に示し、これらはＨＰＩＶ１－４アッセイの性能の希釈系列のＰＣＲ増殖曲線を示す。これらの結果は、ＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドが、意図されたそれぞれの標的に対して特異的であることを示している。図１９Ａ、図１９Ｂ、図１９Ｃ、及び図１９Ｄに見られるように、特定のＨＰＩＶ型に対する意図しないチャネルにおいてこれらのウイルス溶出液を使用した場合、交差反応性は観察されなかった。まとめると、これらの研究は、ＨＰＩＶ１－４のオリゴヌクレオチドが多重設定において意図した標的を特異的に増幅及び検出することを実証する。
ＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドを、ＨＰＩＶ１（配列番号１～３）、ＨＰＩＶ２（配列番号４～６）、ＨＰＩＶ３（配列番号１５～１７）、及びＨＰＩＶ４（配列番号１１、１３、１８、及び１９）を検出するためのプライマー／プローブを使用して試験した。ＨＰＩＶ１－４のオリゴヌクレオチドは、サンプルがＨＰＩＶ１－４に対するすべてのオリゴヌクレオチドに同時に曝露されるように、多重条件下で試験された。ＨＰＩＶ１アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＨＥＸチャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ２アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＣＯＵチャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ３アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＪＡ２７０チャンネルにおいて試験され、ＨＰＩＶ４アッセイ用のオリゴヌクレオチドはＦＡＭチャンネルにおいて試験された。試験したサンプルはウイルス溶出液（ＡＴＣＣカタログ番号：ＨＰＩＶ１－ＶＲ－９４；ＨＰＩＶ２－ＶＲ－９２；ＨＰＩＶ３－ＶＲ－１７８２；ＨＰＩＶ－４Ｂ－ＶＲ１３７７）；ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘカタログ番号：ＨＰＩＶ４Ａ－０８１００６０ＣＦ）であって、ニートと１：１００，０００希釈の２つの濃度で試験した。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００で使用するためのプロファイルと条件を備え、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅及び検出技術を使用するｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００汎用ＰＣＲマスターミックスが含まれる。使用したｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００ ＰＣＲプロファイルは上の表２に示される。これらの研究は、ウイルス溶出液に対するＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドの特異性を試験するために設計された。結果を、図１９Ａ（ＨＰＩＶ１）、図１９Ｂ（ＨＰＩＶ２）、図１９Ｃ（ＨＰＩＶ３）、及び図１９Ｄ（ＨＰＩＶ４）に示し、これらはＨＰＩＶ１－４アッセイの性能の希釈系列のＰＣＲ増殖曲線を示す。これらの結果は、ＨＰＩＶ１－４オリゴヌクレオチドが、意図されたそれぞれの標的に対して特異的であることを示している。図１９Ａ、図１９Ｂ、図１９Ｃ、及び図１９Ｄに見られるように、特定のＨＰＩＶ型に対する意図しないチャネルにおいてこれらのウイルス溶出液を使用した場合、交差反応性は観察されなかった。まとめると、これらの研究は、ＨＰＩＶ１－４のオリゴヌクレオチドが多重設定において意図した標的を特異的に増幅及び検出することを実証する。
前述の発明を明確化及び理解するためにある程度詳細に説明してきたが、本開示を読むことにより、本発明の真の範囲から逸脱することなく、形態及び詳細の様々な変更を行うことができることが当業者には明らかであろう。例えば、上述したすべての技術及び装置を、様々な組み合わせで使用することができる。本出願で引用されるすべての刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献は、あたかも各個別の刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献がすべての目的のために参照により組み込まれることが個別に示されているのと同程度に、すべての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
Claims (34)
- サンプル中のヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）を検出するための方法であって、ここで前記ＨＰＩＶは、ヒトパラインフルエンザウイルス１型（ＨＰＩＶ－１）、ヒトパラインフルエンザウイルス２型（ＨＰＩＶ－２）、ヒトパラインフルエンザウイルス３型（ＨＰＩＶ－３）、及び／又はヒトパラインフルエンザウイルス４型（ＨＰＩＶ－４）を含み、前記方法は、
（ａ）ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４のうちの１つ又は複数の標的核酸がサンプル中に存在する場合、サンプルをプライマーの１つ又は複数のセットと接触させてＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸の増幅産物を生成することを含む増幅工程を実施すること；
（ｂ）ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４のうちの１つ又は複数の標的核酸がサンプル中に存在する場合、１つ又は複数のプローブをＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸の増幅産物と接触させることを含むハイブリダイゼーション工程を実施すること；並びに
（ｃ）ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸の増幅産物の存在又は非存在を検出することであって、ここで、ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸の増幅産物の存在は、サンプル中の、それぞれ、ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の存在を示し、ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸の増幅産物の非存在は、サンプルからの、それぞれ、ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の非存在を示す、ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸の増幅産物の存在又は非存在を検出すること、
を含み；
ここで、前記プライマーの１つ又は複数のセット及び前記１つ又は複数のプローブは、
（１）ＨＰＩＶ－１の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブであって、ここで、ＨＰＩＶ－１の標的核酸に特異的なプライマーのセットは、配列番号１の核酸配列若しくはその相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号２の核酸配列若しくはその相補体を含む第２のプライマーを含み；ＨＰＩＶ－１の標的核酸に特異的なプローブは、配列番号３の核酸配列若しくはその相補体を含む、ＨＰＩＶ－１の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブ；並びに／又は
（２）ＨＰＩＶ－２の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブであって、ここで、ＨＰＩＶ－２の標的核酸に特異的なプライマーのセットは、配列番号４の核酸配列若しくはその相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号５の核酸配列若しくはその相補体を含む第２のプライマーを含み；ＨＰＩＶ－２の標的核酸に特異的なプローブは、配列番号６若しくは配列番号７の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む、ＨＰＩＶ－２の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブ；並びに／又は
（３）ＨＰＩＶ－３の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブであって、ここで、ＨＰＩＶ－３の標的核酸に特異的なプライマーのセットは、配列番号８若しくは配列番号１５の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号９若しくは配列番号１６の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む第２のプライマーを含み；ＨＰＩＶ－３の標的核酸に特異的なプローブは、配列番号１０若しくは配列番号１７の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む、ＨＰＩＶ－３の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブ；並びに／又は
（４）ＨＰＩＶ－４の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブであって、ここで、ＨＰＩＶ－４の標的核酸に特異的なプライマーのセットは、配列番号１１若しくは配列番号１８の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号１２若しくは配列番号１９の核酸配列、又はそれらの相補体を含む第２のプライマーを含み；ＨＰＩＶ－４の標的核酸に特異的なプローブは、配列番号１３若しくは配列番号１４の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む、ＨＰＩＶ－４の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブ、
を含む、方法。 - 前記サンプルが、生物学的サンプルである、請求項１に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、全血、呼吸器検体、鼻咽頭サンプル、尿、糞便検体、血液検体、血漿、皮膚スワブ、鼻腔スワブ、創傷スワブ、血液培養物、皮膚、及び軟部組織感染部である、請求項２に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、鼻咽頭サンプルである、請求項３に記載の方法。
- 前記１つ又は複数のプローブが標識されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記１つ又は複数のプローブが、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分で標識されている、請求項５に記載の方法。
- 工程（ｃ）におけるＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸の増幅産物の存在又は非存在を検出することは、ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸に特異的なプローブのドナー蛍光部分とアクセプター部分との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の存在又は非存在を検出することを含み、ここで、蛍光の存在又は非存在は、それぞれ、サンプル中のＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の存在又は非存在を示す、請求項６に記載の方法。
- サンプル中のＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の１つ又は複数の標的核酸を同時に検出するための方法であって、前記方法は、
（ａ）ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４のうちの１つ又は複数の標的核酸がサンプル中に存在する場合、サンプルをプライマーの１つ又は複数のセットと接触させてＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸の増幅産物を生成することを含む増幅工程を実施すること；
（ｂ）ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４のうちの１つ又は複数の標的核酸がサンプル中に存在する場合、１つ又は複数のプローブをＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸の増幅産物と接触させることを含むハイブリダイゼーション工程を実施すること；並びに
（ｃ）ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸の増幅産物の存在又は非存在を検出することであって、ここで、ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸の増幅産物の存在は、サンプル中の、それぞれ、ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の存在を示し、ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸の増幅産物の非存在は、サンプルからの、それぞれ、ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の非存在を示す、ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸の増幅産物の存在又は非存在を検出すること、
を含み；
ここで、前記プライマーの１つ又は複数のセット及び前記１つ又は複数のプローブは、
（１）ＨＰＩＶ－１の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブであって、ここで、ＨＰＩＶ－１の標的核酸に特異的なプライマーのセットは、配列番号１の核酸配列若しくはその相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号２の核酸配列若しくはその相補体を含む第２のプライマーを含み；ＨＰＩＶ－１の標的核酸に特異的なプローブは、配列番号３の核酸配列若しくはその相補体を含む、ＨＰＩＶ－１の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブ；並びに／又は
（２）ＨＰＩＶ－２の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブであって、ここで、ＨＰＩＶ－２の標的核酸に特異的なプライマーのセットは、配列番号４の核酸配列若しくはその相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号５の核酸配列若しくはその相補体を含む第２のプライマーを含み；ＨＰＩＶ－２の標的核酸に特異的なプローブは、配列番号６若しくは配列番号７の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む、ＨＰＩＶ－２の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブ；並びに／又は
（３）ＨＰＩＶ－３の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブであって、ここで、ＨＰＩＶ－３の標的核酸に特異的なプライマーのセットは、配列番号８若しくは配列番号１５の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号９若しくは配列番号１６の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む第２のプライマーを含み；ＨＰＩＶ－３の標的核酸に特異的なプローブは、配列番号１０若しくは配列番号１７の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む、ＨＰＩＶ－３の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブ；並びに／又は
（４）ＨＰＩＶ－４の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブであって、ここで、ＨＰＩＶ－４の標的核酸に特異的なプライマーのセットは、配列番号１１若しくは配列番号１８の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号１２若しくは配列番号１９の核酸配列、又はそれらの相補体を含む第２のプライマーを含み；ＨＰＩＶ－４の標的核酸に特異的なプローブは、配列番号１３若しくは配列番号１４の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む、ＨＰＩＶ－４の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブ、
を含む、方法。 - 前記サンプルが、生物学的サンプルである、請求項８に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、全血、呼吸器検体、鼻咽頭サンプル、尿、糞便検体、血液検体、血漿、皮膚スワブ、鼻腔スワブ、創傷スワブ、血液培養物、皮膚、及び軟部組織感染部である、請求項９に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、鼻咽頭サンプルである、請求項１０に記載の方法。
- 前記１つ又は複数のプローブが標識されている、請求項８～１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記１つ又は複数のプローブが、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分で標識されている、請求項１２に記載の方法。
- 工程（ｃ）におけるＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸の増幅産物の存在又は非存在を検出することは、ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸に特異的なプローブのドナー蛍光部分とアクセプター部分との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の存在又は非存在を検出することを含み、ここで、蛍光の存在又は非存在は、それぞれ、サンプル中のＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の存在又は非存在を示す、請求項１３に記載の方法。
- 第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸がサンプル中に存在する場合、サンプル中の第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸を検出するための方法であって、前記方法は、
（ａ）第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸がサンプル中に存在する場合、サンプルをプライマーの１つ又は複数のセットと接触させて、第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸の増幅産物を生成することを含む増幅工程を実施すること；
（ｂ）第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸がサンプル中に存在する場合、１つ又は複数のプローブを前記増幅産物と接触させることを含むハイブリダイゼーション工程を実施すること；並びに
（ｃ）第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸の増幅産物の存在又は非存在を検出することであって、ここで、第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸の増幅産物の存在は、サンプル中の、それぞれ、第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸の存在を示し、第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸の増幅産物の非存在は、サンプル中の、それぞれ、第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸の非存在を示す、第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸の増幅産物の存在又は非存在を検出すること、
を含み；
ここで、前記プライマーの１つ又は複数のセット及び前記１つ又は複数のプローブは、
（１）第１の標的核酸に対するプライマーのセット及びプローブであって、ここで、第１の標的核酸に対するプライマーのセットは、配列番号１の核酸配列若しくはその相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号２の核酸配列若しくはその相補体を含む第２のプライマーを含み；第１の標的核酸に対するプローブは、配列番号３の核酸配列、若しくはその相補体を含む、第１の標的核酸に対するプライマーのセット及びプローブ；並びに／又は
（２）第２の標的核酸に対するプライマーのセット及びプローブであって、ここで、第２の標的核酸に対するプライマーのセットは、配列番号４の核酸配列若しくはその相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号５の核酸配列若しくはその相補体を含む第２のプライマーを含み；第２の標的核酸に対するプローブは、配列番号６若しくは配列番号７の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む、第２の標的核酸に対するプライマーのセット及びプローブ；並びに／又は
（３）第３の標的核酸に対するプライマーのセット及びプローブであって、ここで、第３の標的核酸に対するプライマーのセットは、配列番号８若しくは配列番号１５の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号９若しくは配列番号１６の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む第２のプライマーを含み；第３の標的核酸に対するプローブは、配列番号１０若しくは配列番号１７の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む、第３の標的核酸に対するプライマーのセット及びプローブ；並びに／又は
（４）第４の標的核酸に対するプライマーのセット及びプローブであって、ここで、第４の標的核酸に対するプライマーのセットは、配列番号１１若しくは配列番号１８の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号１２若しくは配列番号１９の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む第２のプライマーを含み；第４の標的核酸に対するプローブは、配列番号１３若しくは配列番号１４の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む、第４の標的核酸に対するプライマーのセット及びプローブ、
を含み；
ここで、前記第１の標的核酸はＨＰＩＶ－１の標的核酸であり、前記第２の標的核酸はＨＰＩＶ－２の標的核酸であり、前記第３の標的核酸はＨＰＩＶ－３の標的核酸であり、前記第４の標的核酸はＨＰＩＶ－４の標的核酸である、方法。 - 第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸がサンプル中に存在する場合、サンプル中の第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸を同時に検出するための方法であって、前記方法は、
（ａ）第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸がサンプル中に存在する場合、サンプルをプライマーの１つ又は複数のセットと接触させて、第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸の増幅産物を生成することを含む増幅工程を実施すること；
（ｂ）第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸がサンプル中に存在する場合、１つ又は複数のプローブを、第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸の増幅産物と接触させることを含むハイブリダイゼーション工程を実施すること；並びに
（ｃ）第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸の増幅産物の存在又は非存在を検出することであって、ここで、第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸の増幅産物の存在は、サンプル中の、それぞれ、第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸の存在を示し、第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸の増幅産物の非存在は、サンプル中の、それぞれ、第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸の非存在を示す、第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸の増幅産物の存在又は非存在を検出すること、
を含み；
ここで、前記プライマーの１つ又は複数のセット及び前記１つ又は複数のプローブは、
（１）第１の標的核酸に対するプライマーのセット及びプローブであって、ここで、第１の標的核酸に対するプライマーのセットは、配列番号１の核酸配列又はその相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号２の核酸配列又はその相補体を含む第２のプライマーを含み；第１の標的核酸に対するプローブは、配列番号３の核酸配列、又はその相補体を含む、第１の標的核酸に対するプライマーのセット及びプローブ；
（２）第２の標的核酸に対するプライマーのセット及びプローブであって、ここで、第２の標的核酸に対するプライマーのセットは、配列番号４の核酸配列又はその相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号５の核酸配列又はその相補体を含む第２のプライマーを含み；第２の標的核酸に対するプローブは、配列番号６若しくは配列番号７の核酸配列、又はそれらの相補体を含む、第２の標的核酸に対するプライマーのセット及びプローブ；
（３）第３の標的核酸に対するプライマーのセット及びプローブであって、ここで、第３の標的核酸に対するプライマーのセットは、配列番号８若しくは配列番号１５の核酸配列、又はそれらの相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号９若しくは配列番号１６の核酸配列、又はそれらの相補体を含む第２のプライマーを含み；第３の標的核酸に対するプローブは、配列番号１０若しくは配列番号１７の核酸配列、又はそれらの相補体を含む、第３の標的核酸に対するプライマーのセット及びプローブ；並びに
（４）第４の標的核酸に対するプライマーのセット及びプローブであって、ここで、第４の標的核酸に対するプライマーのセットは、配列番号１１若しくは配列番号１８の核酸配列、又はそれらの相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号１２若しくは配列番号１９の核酸配列、又はそれらの相補体を含む第２のプライマーを含み；第４の標的核酸に対するプローブは、配列番号１３若しくは配列番号１４の核酸配列、又はそれらの相補体を含む、第４の標的核酸に対するプライマーのセット及びプローブ、
を含み；
ここで、前記第１の標的核酸はＨＰＩＶ－１の標的核酸であり、前記第２の標的核酸はＨＰＩＶ－２の標的核酸であり、前記第３の標的核酸はＨＰＩＶ－３の標的核酸であり、前記第４の標的核酸はＨＰＩＶ－４の標的核酸である、方法。 - 前記サンプルが、生物学的サンプルである、請求項１５又は１６に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、全血、呼吸器検体、鼻咽頭サンプル、尿、糞便検体、血液検体、血漿、皮膚スワブ、鼻腔スワブ、創傷スワブ、血液培養物、皮膚、及び軟部組織感染部である、請求項１７に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが、鼻咽頭サンプルである、請求項１８に記載の方法。
- 前記１つ又は複数のプローブが標識されている、請求項１５～１９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記１つ又は複数のプローブが、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分で標識されている、請求項２０に記載の方法。
- 工程（ｃ）において、第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸の増幅産物の存在又は非存在を検出することは、第１の標的核酸、第２の標的核酸、第３の標的核酸、及び／又は第４の標的核酸に対するプローブのドナー蛍光部分とアクセプター部分との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の存在又は非存在を検出することを含み、ここで、蛍光の存在は、サンプル中のＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の存在を示し、蛍光の非存在は、サンプル中のＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の非存在を示す、請求項２１に記載の方法。
- サンプル中に存在し得るＨＰＩＶを検出するためのキットであって、前記ＨＰＩＶがＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４を含み、前記キットは増幅試薬及び検出試薬を含み、ここで、前記増幅試薬及び検出試薬は、（ｉ）ＤＮＡポリメラーゼ；（ｉｉ）ヌクレオチドモノマー；並びに（ｉｉｉ）プライマーの１つ又は複数のセット及び１つ又は複数のプローブを含み、ここで、前記プライマーの１つ又は複数のセット及び１つ又は複数のプローブは、
（１）ＨＰＩＶ－１の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブであって、ここで、ＨＰＩＶ－１の標的核酸に特異的なプライマーのセットは、配列番号１の核酸配列若しくはその相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号２の核酸配列若しくはその相補体を含む第２のプライマーを含み；ＨＰＩＶ－１の標的核酸に特異的なプローブは、配列番号３の核酸配列若しくはその相補体を含む、ＨＰＩＶ－１の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブ；並びに／又は
（２）ＨＰＩＶ－２の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブであって、ここで、ＨＰＩＶ－２の標的核酸に特異的なプライマーのセットは、配列番号４の核酸配列若しくはその相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号５の核酸配列若しくはその相補体を含む第２のプライマーを含み；ＨＰＩＶ－２の標的核酸に特異的なプローブは、配列番号６若しくは配列番号７の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む、ＨＰＩＶ－２の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブ；並びに／又は
（３）ＨＰＩＶ－３の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブであって、ここで、ＨＰＩＶ－３の標的核酸に特異的なプライマーのセットは、配列番号８若しくは配列番号１５の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号９若しくは配列番号１６の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む第２のプライマーを含み；ＨＰＩＶ－３の標的核酸に特異的なプローブは、配列番号１０若しくは配列番号１７の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む、ＨＰＩＶ－３の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブ；並びに／又は
（４）ＨＰＩＶ－４の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブであって、ここで、ＨＰＩＶ－４の標的核酸に特異的なプライマーのセットは、配列番号１１若しくは配列番号１８の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号１２若しくは配列番号１９の核酸配列、又はそれらの相補体を含む第２のプライマーを含み；ＨＰＩＶ－４の標的核酸に特異的なプローブは、配列番号１３若しくは配列番号１４の核酸配列、あるいはそれらの相補体を含む、ＨＰＩＶ－４の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブ
を含む、キット。 - 前記サンプルが、生物学的サンプルである、請求項２３に記載のキット。
- 前記生物学的サンプルが、全血、呼吸器検体、鼻咽頭サンプル、尿、糞便検体、血液検体、血漿、皮膚スワブ、鼻腔スワブ、創傷スワブ、血液培養物、皮膚、及び軟部組織感染部である、請求項２４に記載のキット。
- 前記生物学的サンプルが、鼻咽頭サンプルである、請求項２５に記載のキット。
- 前記１つ又は複数のプローブが標識されている、請求項２３～２６のいずれか一項に記載のキット。
- 前記１つ又は複数のプローブが、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分で標識されている、請求項２７に記載のキット。
- ＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸がサンプル中に存在する場合、サンプル中のＨＰＩＶ－１、ＨＰＩＶ－２、ＨＰＩＶ－３、及び／又はＨＰＩＶ－４の標的核酸を同時検出するためのキットであって、前記キットは増幅試薬及び検出試薬を含み、ここで、前記増幅試薬及び検出試薬は、（ｉ）ＤＮＡポリメラーゼ；（ｉｉ）ヌクレオチドモノマー；並びに（ｉｉｉ）プライマーの１つ又は複数のセット及び１つ又は複数のプローブを含み、ここで、前記プライマーの１つ又は複数のセット及び１つ又は複数のプローブは、
（１）ＨＰＩＶ－１の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブであって、ここで、プライマーのセットは、配列番号１の核酸配列又はその相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号２の核酸配列又はその相補体を含む第２のプライマーを含み；プローブは、配列番号３の核酸配列又はその相補体を含む、ＨＰＩＶ－１の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブ；
（２）ＨＰＩＶ－２の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブであって、ここで、プライマーのセットは、配列番号４の核酸配列又はその相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号５の核酸配列又はその相補体を含む第２のプライマーを含み；プローブは、配列番号６若しくは配列番号７の核酸配列、又はそれらの相補体を含む、ＨＰＩＶ－２の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブ；
（３）ＨＰＩＶ－３の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブであって、ここで、プライマーのセットは、配列番号８若しくは配列番号１５の核酸配列、又はそれらの相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号９若しくは配列番号１６の核酸配列、又はそれらの相補体を含む第２のプライマーを含み；プローブは、配列番号１０若しくは配列番号１７の核酸配列、又はそれらの相補体を含む、ＨＰＩＶ－３の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブ；並びに
（４）ＨＰＩＶ－４の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブであって、ここで、プライマーのセットは、配列番号１１若しくは配列番号１８の核酸配列、又はそれらの相補体を含む第１のプライマー、及び配列番号１２若しくは配列番号１９の核酸配列、又はそれらの相補体を含む第２のプライマーを含み；プローブは、配列番号１３若しくは配列番号１４の核酸配列、又はそれらの相補体を含む、ＨＰＩＶ－４の標的核酸に特異的なプライマーのセット及びプローブ
を含む、キット。 - 前記サンプルが、生物学的サンプルである、請求項２９に記載のキット。
- 前記生物学的サンプルが、全血、呼吸器検体、鼻咽頭サンプル、尿、糞便検体、血液検体、血漿、皮膚スワブ、鼻腔スワブ、創傷スワブ、血液培養物、皮膚、及び軟部組織感染部である、請求項３０に記載のキット。
- 前記生物学的サンプルが、鼻咽頭サンプルである、請求項３１に記載のキット。
- 前記１つ又は複数のプローブが標識されている、請求項２９～３２のいずれか一項に記載のキット。
- 前記１つ又は複数のプローブが、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分で標識されている、請求項３３に記載のキット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US202163146158P | 2021-02-05 | 2021-02-05 | |
| US63/146,158 | 2021-02-05 | ||
| PCT/EP2022/052689 WO2022167570A1 (en) | 2021-02-05 | 2022-02-04 | Compositions and methods for detection of human parainfluenza viruses 1-4 (hpiv 1-4) |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2024505686A true JP2024505686A (ja) | 2024-02-07 |
Family
ID=81325148
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023547435A Pending JP2024505686A (ja) | 2021-02-05 | 2022-02-04 | ヒトパラインフルエンザウイルス１－４（ｈｐｉｖ１－４）の検出のための組成物及び方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20240124946A1 (ja) |
| EP (1) | EP4288567A1 (ja) |
| JP (1) | JP2024505686A (ja) |
| CN (1) | CN116806268A (ja) |
| WO (1) | WO2022167570A1 (ja) |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU596068B2 (en) | 1983-02-22 | 1990-04-26 | Syngene, Inc. | Defined sequence single strand oligonucleotides incorporating reporter groups, process for the chemical synthesis thereof, and nucleosides useful in such synthesis |
| US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US4965188A (en) | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
| US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4996143A (en) | 1985-12-23 | 1991-02-26 | Syngene, Inc. | Fluorescent stokes shift probes for polynucleotide hybridization |
| US4800159A (en) | 1986-02-07 | 1989-01-24 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences |
| US5703055A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
| US5683896A (en) | 1989-06-01 | 1997-11-04 | Life Technologies, Inc. | Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions |
| US5035996A (en) | 1989-06-01 | 1991-07-30 | Life Technologies, Inc. | Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions |
| US5210015A (en) | 1990-08-06 | 1993-05-11 | Hoffman-La Roche Inc. | Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase |
| US5994056A (en) | 1991-05-02 | 1999-11-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection |
| DE69231853T2 (de) | 1991-11-07 | 2001-09-13 | Nanotronics Inc | Hybridisierung von mit chromophoren und fluorophoren konjugierten polynukleotiden zur erzeugung eines donor-zu-donor energietransfersystems |
| NZ333137A (en) | 1996-06-04 | 2000-03-27 | Univ Utah Res Found | System and method for carrying out thermal cycling for biological processes such as the polymerase chain reaction |
| ATE295427T1 (de) | 1996-06-04 | 2005-05-15 | Univ Utah Res Found | Überwachung der hybridisierung während pcr |
| DE69827060T2 (de) | 1997-03-20 | 2005-03-24 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Modifizierte Primer |
| WO2006102695A1 (en) * | 2005-04-01 | 2006-10-05 | Medvet Science Pty Ltd | Identifying respiratory infectious organisms |
| JP4843044B2 (ja) | 2005-10-05 | 2011-12-21 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 非蛍光性エネルギー移動 |
| CN111926114B (zh) * | 2020-07-15 | 2023-10-13 | 四川大学华西医院 | 一种检测副流感病毒多重real-time PCR试剂盒、方法和应用 |
-
2022
- 2022-02-04 CN CN202280013037.0A patent/CN116806268A/zh active Pending
- 2022-02-04 EP EP22705040.8A patent/EP4288567A1/en active Pending
- 2022-02-04 WO PCT/EP2022/052689 patent/WO2022167570A1/en active Application Filing
- 2022-02-04 JP JP2023547435A patent/JP2024505686A/ja active Pending
- 2022-02-04 US US18/275,507 patent/US20240124946A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116806268A (zh) | 2023-09-26 |
| US20240124946A1 (en) | 2024-04-18 |
| EP4288567A1 (en) | 2023-12-13 |
| WO2022167570A1 (en) | 2022-08-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7141488B2 (ja) | マイコプラズマ・ジェニタリウムを検出するための組成物と方法 | |
| JP2023516472A (ja) | 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２）、インフルエンザａ及びインフルエンザｂを検出するための組成物及び方法 | |
| CN110651051B (zh) | 用于检测巴贝虫的组合物和方法 | |
| CN108779500B (zh) | 用于检测寨卡病毒的组合物和方法 | |
| JP2022546443A (ja) | ｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡを含む、Ｂ型肝炎ウイルスＲＮＡの増幅および検出のための組成物および方法 | |
| JP7478734B2 (ja) | カンジダ・アウリス（ｃａｎｄｉｄａ ａｕｒｉｓ）の検出のための組成物および方法 | |
| US20220290221A1 (en) | Compositions and methods for detecting severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-cov-2) variants having spike protein mutations | |
| JP2018500024A (ja) | 薬物耐性結核菌の検出のための組成物及び方法 | |
| US20240124946A1 (en) | Compositions and methods for detection of human parainfluenza viruses 1-4 (hpiv 1-4) | |
| JP5529530B2 (ja) | インフルエンザａ型ウイルスの検出法 | |
| JP2024517835A (ja) | 二重標的アッセイによりデルタ型肝炎ウイルスを検出するための組成物及び方法 | |
| CA2994606C (en) | Compositions and methods for detection of mycobacterium tuberculosis | |
| CN117441029A (zh) | 用于检测具有刺突蛋白突变的严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)变体的组合物和方法 | |
| JP2022531348A (ja) | 鎖分離温度に基づくＤＮＡに対してＲＮＡ標的の優先的／選択的増幅のためのｄＩＴＰの利用 | |
| JP2021532787A (ja) | エプスタイン−バールウイルスの核酸を検出するための組成物および方法 |