CN105296645B - 一种核酸扩增体系的阳性参照物及有效防止阳性参照物污染的方法 - Google Patents

一种核酸扩增体系的阳性参照物及有效防止阳性参照物污染的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种核酸扩增体系的阳性参照物和能够有效防止阳性参照物的污染的方法，能够有效防止来自于阳性参照物如阳性参考品、阳性对照品、阳性标准品、定量标准品等对核酸扩增体系的污染。首先，使用以尿嘧啶U部分或全部取代胸腺嘧啶T的模板作为阳性参照物，然后在阳性参照物中加入UNG酶抑制剂，使用时阳性参照物的扩增不受影响，但阳性参照物无法对其他加入了UNG酶的核酸扩增体系造成污染。

Description

一种核酸扩增体系的阳性参照物及有效防止阳性参照物污染的方法
技术领域
本发明提供一种核酸扩增体系的阳性参照物和能够有效防止来自于阳性参照物如阳性参考品、阳性对照品、阳性标准品、定量标准品等对核酸扩增体系的污染的方法，属于医药生物技术体外诊断试剂领域。
背景技术
核酸扩增反应中最常见的污染物是核酸扩增产物的污染。由于核酸扩增产物的拷贝数量非常大，极微量的核酸扩增产物污染就可造成假阳性结果。造成核酸扩增产物污染的形式最可能是气溶胶污染，核酸扩增反应体系在开盖、摇动、吸样过程中与空气接触形成气溶胶，造成严重的核酸扩增产物污染现象，导致后续实验无法正常进行。
为防止核酸扩增产物的污染，专利US5035996提出了dUTP取代dTTP的核酸扩增体系，这样的核酸扩增体系扩增后的核酸扩增产物都是含有尿嘧啶U的DNA链。在下次核酸扩增开始前，体系中加入尿嘧啶糖基化酶(可降解核酸链中的尿嘧啶碱基，但不降解反应体系中游离的dUTP，简称UNG酶或UDG酶，下称UNG酶)并增加50℃的保温步骤，UNG酶即可将反应体系中已有的U-DNA污染物中的尿嘧啶碱基降解，并在后面变性这步的条件下DNA链断裂，消除由于污染DNA产生的扩增，从而保证扩增结果的特异性、准确性；随后UNG酶被灭活，不会对之后新扩增的产物U-DNA产生影响。即使这些新扩增的产物U-DNA污染了下一次的核酸扩增体系，在下一次核酸扩增开始前也会被降解，从而避免了核酸扩增产物的污染。这一体系被广泛地应用于诊断试剂中，并且起到了较好的效果。
在诊断试剂研发、生产和使用过程中，除了核酸扩增产物外，另一个重要的污染源是阳性参考品、阳性对照品、阳性标准品或定量标准品(本发明中统称阳性参照物质)。由于诊断试剂需具备质控机制，生产企业必须使用阳性参考品对其进行灵敏度、专一性、线性范围等的性能评估以及产品出厂质检，使用单位需以阳性对照品或阳性标准品作为阳性判定标准，以定量标准品来作标准曲线以对样本标的物定量，因此阳性参考物质是诊断试剂中必不可少的组分。
阳性参照物多采用经过纯化和标定的阳性质粒、核酸扩增产物或人工合成的模板制备，其浓度可达108拷贝/ul，在诊断试剂研发过程中，来自阳性参照物的污染使得后续实验无法进行，拖累整个研发进程；生产过程中，来自阳性参照物的污染会导致停产数月之久；为了解决阳性参照物污染问题，企业专门设立万级标准的阳性对照室，尚可避免污染。然而在使用过程中，阳性参照物需与正常样本在统一条件下运行，来自阳性参照物的污染是很难避免的。技术人员为避免来自这些阳性参考物的污染，常常弃置不用，导致诊断试剂的作用不能完全发挥，造成结果误判。来自阳性参考物的污染对很多涉及到核酸扩增的体外诊断试剂研发、生产、使用的技术人员造成困扰。
常规制备的阳性参照物不含尿嘧啶U，因此UNG酶对其不起作用；如果采用了含尿嘧啶U的模板作为阳性参照物，采用与样本一样的含UNG酶的扩增体系则会被降解；如果为其单独配置不含UNG酶的扩增体系，一是增加了工作量，降低了工作效率，二是无法与样品扩增体系完全一致，也就失去了其作为质控标准的意义。因此，阳性参照物污染的问题始终无法解决。
发明内容
本发明人经过反复研究，结果出乎意料地发现，采用含尿嘧啶U的质粒或核酸片段(人工合成或核酸扩增产物)来作为阳性参照物质，采用以dUTP全部或部分取代dTTP的核酸扩增体系扩增受试样本和阴阳性参照物，使得受试样本不受阳性参照物和核酸扩增产物污染；同时在阳性参照物中加入UNG酶抑制剂来抑制UNG酶活性，使得阳性标准品不受UNG酶影响。从而解决了长期以来存在的阳性参照物污染的问题。
因此，本发明的目的是提供一种核酸扩增体系的阳性参照物检测部分以及有效防止阳性参照物对核酸扩增体系的污染的方法。
本发明的阳性参照物检测部分至少包括：UNG酶抑制剂、以尿嘧啶U部分或全部替代胸腺嘧啶T的阳性参照物模板。
本发明的阳性参照物的核酸扩增体系至少包括以单独或混合物形式配制的：
(A)dUTP、dATP、dGTP、dCTP，镁离子，DNA聚合酶；
(B)UNG酶(尿嘧啶糖基化酶)；
(C)UNG酶抑制剂；
(D)扩增用引物；
(E)上述阳性参照物。
所述UNG酶抑制剂选自UNG酶抗体、或UNG酶专一性结合蛋白、或UNG酶小分子抑制剂、或dUTP及其衍生物、或无机离子等中的一种或多种。UNG酶抑制剂可以混合在阳性参照物中，也可以在使用阳性参照物前加入，但是不能在核酸扩增反应时或反应后加入。
在所述阳性参照物中，核酸扩增体系至少包括dUTP、dATP、dGTP、dCTP，镁离子，DNA聚合酶，例如热启动Taq酶、高保真DNA聚合酶。作为一个示例，所述阳性参照物例如包括dUTP100-1000mM、dATP100-1000mM、dGTP100-1000mM、dCTP100-1000mM，镁离子浓度1-6mM，热启动Taq酶0.1-5U，优选1-2U；UNG酶0.1-5U，优选约2U，UNG酶抑制剂0.1-5U，优选约2U；扩增用引物例如0.1-0.4uM，优选约0.2uM，阳性标准品例如设置浓度梯度100-10^10拷贝/ul。
核酸扩增体系可以是PCR扩增体系、转录介导扩增体系TMA、或核酸依赖性扩增体系NASBA。
本发明的另一个目的是提供一种核酸扩增体系的试剂盒，其特征在于包括上述阳性参照物检测部分。
本发明的再一个目的是提供一种有效防止核酸扩增体系中阳性参照物污染的方法，所述方法包括：
(A)使用以尿嘧啶U部分或全部取代胸腺嘧啶T的阳性参照物；
(B)在阳性参照物中预混或使用前加入UNG酶抑制剂；
(C)制备诊断试剂时，使用的dNTP混合物，用dUTP部分或全部替代dTTP，配方中添加UNG酶；扩增程序前增加UNG酶保温步骤和UNG酶灭活步骤。
所述UNG酶抑制剂选自UNG酶抗体、或UNG酶专一性结合蛋白、或UNG酶小分子抑制剂、或dUTP及其衍生物、或无机离子等中的一种或多种。UNG酶抑制剂可以混合在阳性参照物中，也可以在使用阳性参照物前加入，但是不能在核酸扩增反应时或反应后加入。
所述UNG酶抗体可以按常规方法来制备，例如可以通过用UNG酶来免疫动物，取被免疫动物血清通过纯化来制备。例如采用纯种新西兰兔，用UNG酶500ug加福氏完全佐剂皮下多点注射，3周后采用福氏不完全佐剂进行第二次免疫(UNG酶剂量150ug)，3周后不加佐剂进行第三次免疫(UNG酶剂量150ug)，2周后取耳缘静脉血2-3ml测其效价，如未达预期可再加强免疫，直至效价达到预期，效价达到预期后，耳缘静脉放血30-40ml，置室温1小时待其凝固，后置于4℃过夜，离心吸出血清，测定抗体效价、特异性、亲和力，并进行分离纯化，分装后低温或真空干燥保存备用。
所述UNG酶保温步骤是在40-60℃，优选50℃下保温例如1-5分钟，优选约2分钟，所述UNG酶灭活步骤是在70～110℃下灭活例如5-20分钟，优选约10分钟。
上述方法的第一点，在设计诊断试剂的核酸反应体系时，可以设计成PCR技术，也可以是其他核酸扩增方法如转录介导扩增技术TMA、依赖核酸序列的扩增技术NASBA；UNG酶可单独存放或添加于其他组分中。
上述方法的第二点，阳性参照物可以采用UNG、dUTPase缺陷的基因工程菌株，如dut,ungE.colistrainRZ1032，制备阳性质粒；也可采用人工合成或核酸扩增方法制备阳性参照物，阳性参照物可以是部分U取代T、也可以全部是U取代T。
采用dut,ungE.colistrainRZ1032菌株生产阳性质粒的基本步骤与一般菌株相同，选用带抗性标记的克隆载体，将阳性参照物片段重组到质粒中后，转化到dut,ungE.colistrainRZ1032菌株感受态细胞中，筛选后扩大培养即可获得目的质粒。
使用本发明生产的诊断试剂，在检测时，使用统一的核酸扩增体系和核酸扩增程序，对样本和阳性参照物进行核酸扩增，正式扩增程序前需要添加UNG酶保温步骤和UNG酶灭活步骤，以消除扩增产物的污染，同时不影响后续扩增反应的进行。
附图说明
图1是A、B、C组扩增曲线图。
其中，3组12条阳性标准品扩增曲线，从左至右分别是：A组4号(简称A4，下同)、C4、A3、C3、A2、C2、B4、C1、A1、B3、B2和B1。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明进行阐述。
实施例1
利用本发明控制HPV16型阳性标准品污染
实验目的：测试按发明思路制备的HPV16型阳性标准品能否被UNG酶降解，以及在阳性标准品中的UNG酶抑制剂能否完全抑制UNG酶活性。为摸索系统防污染程度，设置4个梯度的HPV16型阳性标准品。
实验设计思路：设计3组实验，分别是：
A组：对照组，不含UNG酶和UNG酶抑制剂，查看阳性标准品不被降解情况下扩增效率
B组：加入UNG酶，查看阳性标准品是否被UNG酶降解
C组：在B组基础上加入UNG酶抑制剂，查看UNG酶抑制剂抑制程度
实验过程和结果：
1.制备HPV16型含U的PCR产物片段，并进行标定
2.将上述模板稀释成4个梯度，分别是1号标准品：5×102拷贝/μl、2号标准品：5×104拷贝/μl、
3号标准品：5×106拷贝/μl、4号标准品：5×108拷贝/μl
3.3组实验的PCR体系终浓度见表1：
表1
A组 B组 C组
UNG酶 - 0.2U 0.2U
UNG酶抗体 - - 1U
Taq MasterMix(含dUTP) 1× 1× 1×
HPV 16型阳性标准品(1-4号) 1ul 1ul 1ul
HPV 16型引物 0.2uM 0.2uM 0.2uM
HPV 16型探针 0.2uM 0.2uM 0.2uM
其中HPV16型阳性标准品(1-4号)终浓度见表2
表2
A组 B组 C组
1 250拷贝 250拷贝 250拷贝
2 2500拷贝 2500拷贝 2500拷贝
3 2.5×105拷贝 2.5×105拷贝 2.5×105拷贝
4 2.5×107拷贝 2.5×107拷贝 2.5×107拷贝
上述体系中UNG酶、TaqMasterMix(含dUTP)采用市售试剂，主要成分终浓度为：dUTP600mM、dATP200mM、dGTP200mM、dCTP200mM，镁离子浓度2.25mM，热启动Taq酶1.25U；HPV16型阳性含UPCR产物由发明人自行制备；HPV16型引物、探针由上海生工合成。
实施例中采用的UNG酶抗体的制备的详细过程如下：
采用纯种新西兰兔，用UNG酶500ug加福氏完全佐剂皮下多点注射，3周后采用福氏不完全佐剂进行第二次免疫(UNG酶剂量150ug)，3周后不加佐剂进行第三次免疫(UNG酶剂量150ug)，2周后取耳缘静脉血2-3ml测其效价，如未达预期可再加强免疫，直至效价达到预期，效价达到预期后，耳缘静脉放血30-40ml，置室温1小时待其凝固，后置于4℃过夜，离心吸出血清，测定抗体效价、特异性、亲和力，并进行分离纯化，分装后低温或真空干燥保存备用。
4.使用罗氏lightcycler480II实时荧光PCR仪，PCR反应程序设定如表3：
表3
5.实验结果Ct值见表4(图1)：
表4
A组 B组 C组
1 34.95 未检出 34.93
2 28.43 未检出 28.23
3 21.26 38.53 21.28
4 14.08 30.92 14.07
说明：Ct值越小，扩增效果越好；Ct值未检出表明未扩增。
实验结果分析：
B组与A组比较，UNG酶能够完全降解样品中2500个拷贝的阳性标准品污染，基本完全降解25万个拷贝的极重度污染，能够满足抗污染要求。
C组与A组比较，C组与A组扩增效率没有差别，说明加入适量的UNG酶抑制剂后，能够完全抑制UNG酶的活性，使标准品扩增不受影响。
实施例2
采用UNG酶结合蛋白作为UNG酶抑制剂，按上述相同实验思路进行实验，各组分终浓度见表5：
表5
A组 B组 C组
UNG酶 - 0.2U 0.2U
UNG酶结合蛋白 - - 0.2U
Taq MasterMix(含dUTP) 1× 1× 1×
HPV 16型阳性标准品(1-4号) 1ul 1ul 1ul
HPV 16型引物 0.2uM 0.2uM 0.2uM
HPV 16型探针 0.2uM 0.2uM 0.2uM
上述UNG酶结合蛋白的制备的过程如下：
该基因来自于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)噬菌体PBS1的UGI基因(NCBI，GI:215789)，将其重组到大肠杆菌带抗性标记的克隆载体中，筛选重组成功并能够稳定表达UGI蛋白(UNG酶结合蛋白)的菌株，经发酵后，分离纯化获得UGI蛋白。
实验结果Ct值见表6
表6
A组 B组 C组
1 34.87 未检出 34.79
2 28.24 未检出 28.16
3 21.56 38.88 21.7
4 13.89 31.45 13.95
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让本领域技术人员能够了解发明内容并据此实施，并不能以此限制本发明保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰均应属于本发明保护范围。

Claims (12)

1.一种核酸扩增体系的阳性参照物检测部分，其至少包括：
（A）UNG酶抑制剂；
（B）以尿嘧啶U部分或全部替代胸腺嘧啶T的阳性参照物模板。
2.根据权利要求1所述的阳性参照物检测部分，其中所述UNG酶抑制剂选自UNG酶专一性结合蛋白和UNG酶小分子抑制剂中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的阳性参照物检测部分，其中所述UNG酶专一性结合蛋白是UNG酶抗体。
4.根据权利要求2所述的阳性参照物检测部分，其中所述UNG酶小分子抑制剂选自dUTP及其衍生物或无机离子。
5.根据权利要求2所述的阳性参照物检测部分，扩增该阳性参照物的核酸扩增体系至少包括单独或以混合物形式配制的dUTP、dATP、dGTP、dCTP，镁离子，DNA聚合酶，UNG酶，引物。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的阳性参照物检测部分，其中，阳性参照物是质粒、或核酸扩增产物、或人工合成核酸片段中的一种或多种。
7.包括权利要求1-6中任一项所述的阳性参照物检测部分的核酸扩增体系的试剂盒。
8.一种有效防止核酸扩增体系中阳性参照物污染的方法，所述方法包括：
（A）使用以尿嘧啶U部分或全部取代胸腺嘧啶T的阳性参照物；
（B）在阳性参照物中预混或使用前加入UNG酶抑制剂；
（C）制备诊断试剂时，使用的dNTP混合物，用dUTP部分或全部替代dTTP，配方中添加UNG酶；扩增程序前增加UNG酶保温步骤和UNG酶灭活步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述UNG酶抑制剂选自UNG酶专一性结合蛋白和UNG酶小分子抑制剂中的一种或多种。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述UNG酶专一性结合蛋白是UNG酶抗体。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述UNG酶小分子抑制剂选自dUTP及其衍生物或无机离子。
12.根据权利要求8-11中任一项所述的方法，其中，核酸扩增体系是PCR扩增体系、转录介导扩增体系TMA、或核酸依赖性扩增体系NASBA。
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