CN112342278A - 一种具有防污染功能的阳性对照及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于PCR技术领域，具体涉及一种具有防污染功能的阳性对照，含有：含dU的模板DNA和UDG酶抑制剂，加入UDG酶防污染体系进行PCR扩增时，含dU的模板DNA的拷贝数与UDG酶抑制剂的单位数的比值不小于10000：1；UDG酶的单位数与UDG酶抑制剂的单位数的比值不大于20：1，简化PCR反应步骤，从源头上防止PCR污染的同时，保证dU模板的阳性对照功能，结果准确，重复性好；另采用本发明阳性对照进行PCR扩增检测时，一步完成，无二次污染，操作简便，环境要求温和，缩短检测周期及投入。

Description

一种具有防污染功能的阳性对照及应用

技术领域

本发明属于PCR检测技术领域，具体涉及一种具有防污染功能的阳性对照及应用，利用人工制备的含dU的DNA模板和UDG酶抑制剂混合，有效避免阳性对照飘散出来引起的气溶胶污染，减少实验室污染机率，提高检测效率，可广泛应用到PCR检测技术领域。

背景技术

在众多的生物实验室，分子生物学检测方法如PCR因其高灵敏度、快速、操作方便等优势已经被广泛应用，不过正是由于它灵敏度极高，极微量的污染源都有可能导致检测结果的假阳性，所以对环境污染的控制也极为严格。

面对众多的污染源，比如样本交叉污染、试剂仪器交叉污染、克隆质粒污染、PCR扩增产物污染、还有极容易忽视的气溶胶污染，气溶胶是悬浮于气体介质中粒径一般为0.001μm～1000μm的固体、液体微小粒子形成的胶溶状态散体系。核酸气溶胶即DNA/RNA气溶胶，是分散并悬浮在气体介质中的核酸聚合物，广泛存在于实验室桌面、仪器、耗材以及空气中，据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝。核酸气溶胶与PCR过程相伴相生，操作时空气与液体面摩擦，离心机离心，剧烈地摇动反应管，反应管开盖，吸样时及移液器的反复吸样，污染物的外泄等途径，都会产生核酸气溶胶。因而由其造成的污染是一个非常重要而被忽视的污染源。

虽然这些污染对PCR实验结果的影响已经受到了广泛重视，多数实验室对污染控制采取了各种办法，比如：1、合理的实验室分区，实验室内各工作区的实验用品，包括移液器等应专用，定期大扫除清理。2、正确的实验操作，吸加PCR试剂和模板的操作应严格按要求进行，吸样要慢，尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。3、实验的过程中应勤换手套，在进出不同区域或进行模板操作后，都应及时更换手套。4、装试剂的微量离心管在打开之前先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部，从而减少污染手套或加样器的机会。开管动作要轻，以防管内液体溅出或形成气溶胶，造成污染。5、实验器具和试剂，实验室自己配置的试剂，如去离子水、缓冲液等，在使用之前均应高压灭菌或过滤除菌。6、分装PCR试剂：所有的PCR试剂都应小量分装，以减少重复取样次数，并置于-20℃保存，另外，PCR试剂、PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或冰箱。所有吸头、反应管等应一次性使用，尽量使用带滤器的枪头。但是微量的核酸片段就能被扩增，所以对污染物的控制不仅仅是做到这些就能够杜绝和避免的，关键是需要从源头控制。

出现污染后常用消除手段如下：1、购买商品化的DNA降解溶剂，比如DNAaway，DNA-ExitusPlus等，其作用原理水解散落的扩增子或模板；2、紫外灯照射至少半小时空气中喷上酒精，然后1M的盐酸擦拭，反复几次，几天后在做测试；3、开门通风，卸掉实验室玻璃，空气流动会稀释拷贝数，并用次氯酸钠等擦拭；但这些手段往往会耽误工时，而且不能立竿见影，周期较长，影响实验室检测效能。

因此，建立一种简单且行之有效的防PCR污染方法，从源头做好控制，成为亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发提供一种具有防污染功能的阳性对照，相较于常规的非dU模板，本发明采用含dU模板，并混合添加UDG酶抑制剂，同时摸索出含dU模板、UDG酶抑制剂与UDG酶之间的用量比，有效防止PCR污染的同时，不影响dU模板的阳性对照功能，且结果准确。采用本发明具有防污染功能的阳性对照，防污染与阳性对照扩增检测一步同时完成，操作简便，无二次污染，环境要求温和，缩短检测周期及投入。

本发明的技术方案为，一种具有防污染功能的阳性对照，含有：a.含dU的模板DNA，和b.UDG酶抑制剂。

加入UDG酶防污染体系进行PCR扩增时，所述含dU的模板DNA的拷贝数与UDG酶抑制剂的单位数的比值不小于10000(拷贝数)：1(U)，优选不小于12000(拷贝数)：1(U)，更优选为12000～30000(拷贝数)：1(U)，具体为12000～20000(拷贝数)：1(U)，更具体为12000～15000(拷贝数)：1(U)，作为优选实施例为12700(拷贝数)：1(U)；UDG酶的单位数与UDG酶抑制剂的单位数的比值不大于20：1，优选为不大于10：1，更优选为2～8：1，更具体地为3～6：1，作为本发明优选实施例，为4：1。

本发明使用的DNA模板为含dU的模板DNA，若以较低的浓度直接进行扩增，则会被扩增体系中的UDG酶切割，导致扩增失败，固而选择事先和UDG酶抑制剂混合，有效抑制UDG酶的水解活性。

所述UDG酶抑制剂包括但不限于UGI、抑制UDG水解糖苷键活性的生物材料、抑制UDG水解糖苷键活性的无机材料、及抑制UDG水解糖苷键活性的有机材料等。

所述含dU的模板DNA制备方法包含：采用核酸扩增技术，以dUTP完全或部分替代dTTP，扩增阳性对照靶区域，得到含dU的模板DNA。实现核酸扩增的技术有多种，包含但不限于聚合酶链反应技术、荧光定量PCR技术、核酸序列依赖性扩增技术、连接酶链反应及分枝DNA信号放大系统等。以聚合酶链反应技术(PCR)为例，含dU的模板DNA制备方法具体如下：以dUTP完全或部分替代dTTP，在扩增引物作用下，扩增阳性对照靶区域，得到含dU的模板DNA。

如本发明实施例所示，含dU的模板DNA通过以下方法制得：以dUTP完全替代dTTP，再扩增引物actb-94-19-57.9-F primer(SEQ ID NO.1)与actb 343-20-58-R primer(SEQID NO.2)作用下，扩增interstand-1模板(SEQ ID NO.3)的阳性对照靶区域，得到含dU的模板DNA。

所述扩增阳性对照靶区域根据不同检测目的自行设定，扩增长度亦可自行设定。其中，阳性对照靶区域尽量选择A、T、C、G四种碱基分布均匀的区域，优选为A、T碱基含量为50％-70％的区域。

所述扩增引物为普通无标记引物，长度为18-40个碱基，TM值为52-62℃，根据程序的退火温度选择合适的TM值进行设计，同时应避免引物自身形成二级结构或引物之间相互配对形成二聚体等。扩增引物可以是检测引物，也可以是检测引物外围的大片段扩增引物。

所述dUTP替代dTTP，可以完全替代，即扩增体系中无dTTP，也可以按比例进行部分替代，在不影响扩增效率的情况下，优选采用dUTP完全替代dTTP。以dUTP完全或部分替代dTTP扩增阳性对照靶区域的目的是为了让扩增的产物上聚合尿嘧啶碱基，便于被UDG酶识别并切割，达到防污染的作用。

所述扩增阳性对照靶区域后，进行扩增产物的纯化回收处理，以获得单一目的片段，即含dU的模板DNA。纯化回收处理去除非dUTP的起始模板和扩增引物残留对后续实验的影响，获得较纯较单一的扩增产物。若扩增产物单一，可直接采用吸附材料进行吸附漂洗除杂后，经洗脱回收。若产物非单一，则采用切胶回收或电泳分离的方式回收。

本发明具有防污染功能的阳性对照可用于制备PCR扩增检测用标准对照品，进行PCR扩增检测，其方法为：在以本发明具有防污染功能的阳性对照为基础的扩增体系中，加入UDG酶防污染体系，进行PCR扩增检测。PCR反应条件为：第一阶段：37℃2min，1个循环；第二阶段：95℃5min，1个循环；第三阶段：95℃15s，60℃45s(采集信号)，40个循环。

加入UDG酶防污染体系进行PCR扩增时，所述含dU的模板DNA的拷贝数与UDG酶抑制剂的单位数的比值不小于10000(拷贝数)：1(U)，优选不小于12000(拷贝数)：1(U)，更优选为12000～30000(拷贝数)：1(U)，具体为12000～20000(拷贝数)：1(U)，更具体为12000～15000(拷贝数)：1(U)，作为优选实施例为12700(拷贝数)：1(U)；UDG酶的单位数与UDG酶抑制剂的单位数的比值不大于20：1，优选为不大于10：1，更优选为2～8：1，更具体地为3～6：1，作为本发明优选实施例，为4：1。

所述UDG酶防污染体系含有UDG酶，还含有合成底物：支持dUTP掺入的聚合酶及包含dUTP在内的dNTPs。

所述PCR扩增检测包括定性检测、和/或定量检测、和/或基因突变的类别检测、和/或基因突变频率检测、和/或基因拷贝数检测。

本发明提供的具有防污染功能的阳性对照，从源头上控制气溶胶污染，污染通常可能来源有扩增子飘散形成的气溶胶和阳性对照飘散引起的气溶胶，前者采用UDG系统可以得到根本性的防治，但对于后者，因常规阳性对照为非dU模板，不被UDG系统识别，所以易造成污染。本发明提供的含dU模板的对照，即使形成气溶胶污染，也会被UDG系统识别水解，同时为了使得U模板的阳性对照能行使“阳性对照”功能，在阳性对照孔内引入UGI，抑制阳性扩增孔内的UDG，使得U模板制成阳性对照能顺利完成扩增。

本发明具有防污染功能的阳性对照，进行PCR检测时，确定最佳的含dU模板与UDG酶之间的用量比，UDG酶抑制剂与UDG酶之间的用量比，及PCR的反应条件，无需在PCR反应前进行UDG酶保温活性反应及UDG酶升温失活反应步骤，简化步骤的同时，保证结果准确度，避免重复实验，节省投入。

附图说明

图1为本发明的原理示意图。

图2为实施例2模拟阳性对照飘散实验结果图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，通过以下实施例对本发明进行说明，但不构成对本发明的限制。

实施例1：具有防污染功能的阳性对照制备过程举例。

1、含dU模板扩增

表1阳性对照制备引物和模板序列

表2扩增反应体系

操作步骤：按上述扩增反应体系配制表进行相关液体配制，震荡混匀15秒，快速离心15秒，加入模板后小心盖上PCR管盖，快速离心数秒，将PCR反应管放置于PCR上，如下程序设定后进行扩增：

第一阶段：95℃3min，1个循环；

第二阶段：95℃30s，60℃30s，72℃30s，33个循环；

第三阶段：72℃10min，1个循环；

2、含dU模板纯化及拷贝数转换

对以上扩增产物进行琼脂糖胶电泳，然后切下目的条带后经胶回收试剂盒回收后测定浓度，根据产物长度，换算成拷贝数备用，换算公式如下：

dsDNA摩尔数(mol)＝dsDNA质量(g)/((dsDNA长度(bp)×617.96g/mol/bp)+36.04g/mol)

DNA拷贝数＝dsDNA摩尔数×6.022e²³分子数/mol

3、含dU模板和UGI混合

将一定拷贝数的含dU模板和UGI混合，根据体系中UDG加入量、阳性对照孔模板加入体积，保证阳性对照孔里UDG的量和UGI的量成一定比例关系。根据UDG的水解能力，建议模板拷贝数设定在10³～10⁴附近，假定体系中UDG的量为a单位，阳性对照控模板加入体积为bμL，UDG的量设定为UGI的量c倍，UGI母液浓度d单位/μL，含dU模板和UGI混合总体积为eμL，则可以采用如下公式计算UGI的加入体积，含dU模板加入体积为总体积减去UGI的加入体积。

实施例2：参照图1，模拟测试具有防污染功能的阳性对照的抗污染能力。如图1所示，常规阳性对照组，因体系中的UDG无法识别非U模板，水解受阻，形成污染。防污染功能的阳性对照组，(1)组中，UDG相对飘入的UGI和U模板是过量的，UDG水解至U模板断裂，无法形成污染；(2)组中，体系中的UDG被UGI抑制，水解受阻，U模板完整，形成扩增产物。

实验选用的含dU模板浓度为0.2*10³，阳性对照体系中模板加10μL。反应总体系为25μL，UDG体系中总量为0.625单位，测试UDG和UGI不同比例下的实验差异，模拟污染方法是将本发明方法制备的具有防污染阳性对照梯度添加至反应体系中，同时设定非dU模板作为阳性对照；含dU模板作为阴性对照，采用相同的操作方式梯度添加至反应体系中。

表3三个实验组选定的相关参数

表4扩增反应引物和探针序列

表5扩增反应体系

操作步骤：按上述扩增反应体系配制表进行相关液体配制，震荡混匀15秒，快速离心15秒，以每管15μL分装至PCR反应管中，分别加入对应体积的模板然后加水至25μL体系，然后小心盖上PCR管盖，快速离心数秒，将PCR反应管放置于实时PCR仪器中。

实时PCR反应在AB 7500上进行。

第一阶段：37℃2min，1个循环；

第二阶段：95℃5min，1个循环；

第三阶段：95℃15s，60℃45s(采集信号)，40个循环。

结果如图2所示，阳性对照组为非dU模板，在不同的梯度加量下均能扩增，说明常规的阳性对照易引起实验污染，阴性对照为含dU模板，在不同的梯度加量下均不能扩增，说明UDG体系发挥作用，三个实验组相比，实验组1中含有较高浓度的UGI，只有在加入0.2μL时没有扩增，其他梯度加量均能扩增，实验组2和实验组3，直到加入1μL时才开始扩增，说明UGI的浓度越低，越不容易出现污染，反之就越易出现污染，实验组2和实验组3扩增效果和阳性对照相比，实验组2加入4μL扩增效果和阳性对照相当，实验组3需要递增至7μL扩增效果才和阳性对照相当，说明UGI不可过低否则会影响其发挥“阳性对照”功能；作为优选，体系中阳性对照模板拷贝数在2*10³且UDG含量为0.625单位时，设定UGI和UDG比例在1：4为佳。

可知，本发明提供的具有防污染功能的阳性对照，从源头上控制气溶胶污染，大大降低实验室污染机率，提高运作效能。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

序列表

<110> 上海鼎晶生物医药科技股份有限公司

<120> 一种具有防污染功能的阳性对照及应用

<141> 2020-09-17

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

caccccagcc atgtacgtt 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ggccatctct tgctcgaagt 20

<210> 4

<211> 399

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

tcccgaggag caccccgtgc tgctgaccga ggcccccctg aaccccaagg ccaaccgcga 60

gaagatgacc cagatcatgt ttgagacctt caacacccca gccatgtacg ttgctatcca 120

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ctccctggag aagagctacg agctgcctga cggccaggt 399

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

caccccagcc atgtacgtt 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ggccatctct tgctcgaagt 20

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

tccaggctgt gctagggtaa aagccgat 28

Claims (10)

1.一种具有防污染功能的阳性对照，其特征在于，包含：a.含dU的模板DNA，和b.UDG酶抑制剂；加入UDG酶防污染体系进行PCR扩增时，含dU的模板DNA的拷贝数与UDG酶抑制剂的单位数的比值不小于10000：1；UDG酶的单位数与UDG酶抑制剂的单位数的比值不大于20：1。

2.根据权利要求1所述的阳性对照，其特征在于，含dU的模板DNA的拷贝数与UDG酶抑制剂的单位数的比值不小于12000：1，加入UDG酶防污染体系进行PCR扩增时，UDG酶的单位数与UDG酶抑制剂的单位数的比值不大于10：1。

3.根据权利要求2所述的阳性对照，其特征在于，含dU的模板DNA的拷贝数与UDG酶抑制剂的单位数的比值不小于12000～30000：1，加入UDG酶防污染体系进行PCR扩增时，UDG酶的单位数与UDG酶抑制剂的单位数的比值不大于2～8：1。

4.根据权利要求1-3任一项所述的阳性对照，其特征在于，所述UDG酶抑制剂包括但不限于UGI、抑制UDG水解糖苷键活性的生物材料、抑制UDG水解糖苷键活性的无机材料、及抑制UDG水解糖苷键活性的有机材料。

5.根据权利要求1-3任一项所述的阳性对照，其特征在于，所述含dU的模板DNA制备方法包含：采用核酸扩增技术，以dUTP完全或部分替代dTTP，扩增阳性对照靶区域，得到含dU的模板DNA。

6.权利要求1-5任一项所述阳性对照可用于制备PCR扩增检测用标准对照品。

7.利用权利要求1-5任一项所述阳性对照进行PCR扩增检测。

8.根据权利要求7所述PCR扩增检测，其特征在于，步骤为：在以权利要求1-4任一项所述阳性对照为基础的扩增体系中，加入UDG酶防污染体系。

9.根据权利要求8所述所述PCR扩增检测，其特征在于，UDG酶防污染体系含有UDG酶及合成底物：支持dUTP掺入的聚合酶及包含dUTP在内的dNTPs。

10.根据权利要求8或9所述PCR扩增检测，其特征在于，PCR扩增检测包括定性检测、和/或定量检测、和/或基因突变的类别检测、和/或基因突变频率检测、和/或基因拷贝数检测。

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