CN112808690B - 一种消除核酸残留的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及耗材再生技术领域，特别涉及一种消除核酸残留的方法，所述消除核酸残留的方法，包括如下步骤：将耗材依次用核酸祛除溶液浸泡、乙醇浸泡、纯水超声处理和紫外光照射。本发明提供的消除核酸残留的方法，能够清除耗材上的核酸残留，清洗效率高、清洗效果好，能实现耗材的循环利用，极大程度的节约了成本。

Description

一种消除核酸残留的方法
技术领域
本发明涉及耗材再生技术领域，特别涉及一种消除核酸残留的方法，特别用于消除核酸用实验耗材上核酸残留的方法。
背景技术
聚合酶链式反应(polymerase chain reacton，PCR)是一种模拟天然DNA复制的核酸扩增技术，在体外选择性的扩增DNA片段，即进行基因复制或称基因克隆。PCR能通过体外扩增将目的基因片段百万倍的放大，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。目前，这项已广泛应用于分子生物学的各个领域。
然而，PCR测定的高敏感度意味着，在PCR的操作过程中，环境和实验室极其轻微的核酸污染就有可能引起扩增产物的大量扩增，从而导致扩增结果的假阳性。常见的核酸污染包括：扩增产物的污染、提取核酸的污染、阳性对照的污染、外来核酸的污染等。外来核酸污染可能是来源于环境，可以游离形式存在，或者包含在活细胞如微生物、病毒或原生动物中；可能是“遗留污染”，其中先前测定的PCR产物污染后续的PCR测定，污染物可由技术人员、一起甚至经气雾剂传播。为了避免外来核酸污染，一般通过各种方法对环境和仪器进行处理，而核酸实验过程中使用的耗材则直接丢弃。核酸试验中的实验耗材一般价格都比较昂贵，例如，Covaris microTUBE核酸剪切管，其是专门设计生产用于Covaris超声波剪切仪处理少量核酸样本，microTUBE-50特别针对更低DNA即需要50到55μL样本量的方案进行了优化，优化后的特点是：准确，可调和无偏向的片段DNA、从低样本量回收高DNA、等温，高度可控，可重复的DNA剪切过程。但是microTUBE-50剪切管的价格昂贵，片段化一个DNA样本的成本就近百元，因此，对于实验样本较多的研究来讲，仅实验耗材就是非常大的一笔消耗。对于核酸用实验耗材采用常规水洗等方法并不能去除之前使用时残余样本的核酸污染，无法实现实验耗材的重复利用。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，提供了一种消除核酸残留的方法，能够去除核酸容器的核酸残留，实现实验耗材的重复利用，极大程度节约了成本。
本发明的技术方案如下文所示。
本发明一方面提供了一种消除核酸残留的方法，包括如下步骤：
将耗材依次用核酸祛除溶液浸泡、乙醇浸泡、纯水超声处理和紫外光照射；其中，所述核酸祛除溶液可以选自次氯酸钠溶液、过氧化氢溶液、pH<4的酸溶液或pH>10的碱溶液中的至少一种，优选次氯酸钠溶液。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸祛除溶液为次氯酸钠溶液；优选地，所述次氯酸钠溶液中有效氯含量大于等于2.5％。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸祛除溶液浸泡的时间为15～30min。
在本发明的一些实施方式中，所述乙醇的体积百分含量为70～80％。
在本发明的一些实施方式中，所述乙醇浸泡的时间为5～15min。
在本发明的一些实施方式中，所述纯水超声处理的温度为30～50℃。
在本发明的一些实施方式中，所述纯水超声处理的时间为20～40min。
在本发明的一些实施方式中，所述纯水超声处理的次数为1～3次。
在本发明的一些实施方式中，所述纯水超声处理的超声频率为300～500W；优选为400W。
在本发明的一些实施方式中，所述紫外光照射的波长为200～280nm，优选为254nm。
在本发明的一些实施方式中，所述紫外光照射的时间为30～60min。
在本发明的一些实施方式中，在用所述核酸祛除溶液浸泡的步骤后，还包括用纯水浸泡5～15min的步骤。
在本发明的一些实施方式中，在用所述乙醇浸泡的步骤后，还包括用纯水浸泡5～15min的步骤。
在本发明的一些实施方式中，每次浸泡后，都需要使所述耗材干燥。
在本发明的一些实施方式中，使所述耗材干燥的方法可以是烘干、晾干或擦干；优选地，每次浸泡后，都需要将所述耗材用棉签擦干。
在本发明的一些实施方式中，消除核酸残留的方法，包括如下步骤：
S1.核酸祛除溶液浸泡：耗材用核酸祛除溶液浸泡15～30min；浸泡结束后，滤掉浸泡液，擦拭耗材；再用超纯水清洗2～3次，清洗结束后，再次加入超纯水，浸泡5～15min；超纯水浸泡结束后，滤掉超纯水，再将耗材擦拭干净；
S2.乙醇浸泡：耗材继续用乙醇浸泡5～15min；浸泡结束后，再用超纯水清洗2～3次，再加入超纯水浸泡5～15min，滤掉超纯水，再将耗材擦拭干净；
S3.纯水超声处理：将耗材浸泡到超纯水中，30～50℃，超声20～40min；更换超纯水，重复1～3次；
S4.紫外光照射：将耗材用紫外光照射30min～60min。
在本发明的一些实施方式中，所述耗材，如核酸扩增反应容器、核酸保存容器、核酸处理容器等，优选为核酸剪切管。
本发明另一个方面还提供了上述消除核酸残留的方法在耗材循环利用方面的应用。
本发明中，“耗材”用来表示在操作过程中可能涉及到核酸的任何容器或器材，例如，PCR管、恒温金属浴的金属模块、microTUBE-50剪切管；耗材可以由不同材料制成。所述耗材更具体地在需要进行核酸扩增或核酸处理的操作的情况下使用。
在本发明中，“核酸残留”是指必须在使用耗材进行核酸分析前被除去的核酸分子。核酸残留可以是任何种类的核酸分子，包括例如单或双链的RNA或DNA、引物、探针、扩增子、基因组DNA、重组DNA等。
在本发明中，“消除核酸残留”意为在处理之后，在所述耗材中检测不到核酸污染。在本发明的一个实施方式中，使用了所述耗材后，进行扩增反应时，检测不到核酸污染。不意在受具体机制的限制，消除核酸残留可包括降解核酸以及将核酸分子或片段或衍生物物理转移出所述耗材。当核酸不能在核酸反应中发挥引物、探针或模板作用时，则所述核酸是失活的。
本发明中，“纯水”是只不含杂质的水，还可以是超纯水、双蒸水、无核酸酶水。
本发明人为了实现核酸试验中耗材的重复利用，以microTUBE-50剪切管为例，进行了消除耗材表面核酸残留的研究，在研究过程中发现，单一的处理方式，比如仅使用纯水超声处理、核酸祛除溶液浸泡、紫外照射等方法，或简单的组合，比如先使用纯水超声处理，再进行核酸去除溶液浸泡和紫外照射等方法，在PCR扩增后，样本(经过处理重复使用的剪切管中的样本)的变异情况与新管中样本的变异情况存在一定的差异。由于次氯酸钠和乙醇均作为降解核酸的有效成分，最先用次氯酸钠和乙醇浸泡能有效降解剪切管中残余的大量核酸物质，也能将残余的大片段核酸降解成若干个碱基，经过浸泡、擦拭、纯水浸泡和擦拭处理后，将残余的大部分核酸物质清除，再用超声清洗机清洗，不但能将附着的残余的少量核酸物质消除，还能将附着的次氯酸钠和乙醇去除，以保证后续的再次使用。本发明这种特定的结合，能消除核酸残留的影响，使剪切管再生，在核酸反应中实现与新剪切管相同的效果。
本发明中，使用核酸祛除溶液先去除回收的耗材中残余的大部分核酸物质，使用超声去除微量残余核酸物质，上述方法可以批量处理回收的耗材，且成本低，效果好。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种消除核酸残留的方法，能够清除耗材上的核酸残留，清洗效率高、清洗效果好，实现耗材的循环利用，极大程度的节约了成本。
具体实施方式
以下结合具体的实施例对本发明的技术方案和技术效果做进一步说明和阐释，但本发明并不限于这些具体实施方式。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法，如分子克隆操作手册或按照试剂制造商所建议的方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
无菌水(ddH2O)、磷酸缓冲液(PBS)，75％消毒酒精、无水乙醇等购自上海生工生物，T4 DNA Polymerase、T4 DNA Ligase(Rapid)、T4 Polynucleotide Kinase均购自emzymatics，rTaq、dNTPs、dATP、dGTP等均购自Takara，纯化用的AMPure XP Beads购自Beckman，Qubit浓度测定用的仪器和试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司；次氯酸钠溶液购自福晨化学；超声清洗机购自宁波新芝，型号SB-4200DTD；
实施例1模板基因组DNA的制备
(1)白细胞基因组的提取，采用的提取试剂盒(购自QIAOGEN，货号为55114，规格大小为50人份)进行提取；提取流程参照该试剂盒使用说明书，具体如下：
(1.1)血液样本置于室温解冻，混匀，瞬离，取100μL白细胞至1.5mL离心管，加100μL PBS，混匀，瞬离；
(1.2)加入10μL RnaseA，20μL蛋白酶K，混匀，涡旋离心，放置1min，加入200μLBuffer AL，混匀离心；
(1.3)金属浴上56℃，10min；
(1.4)取下，降至室温后，加入200μL无水乙醇，混匀，瞬离；
(1.5)转移至离心柱上，室温放置5min，10000g，1min，弃滤液；
(1.6)加入500μL Buffer AW1，10000g，1min，弃滤液；
(1.7)加入500μL的Buffer AW2，20000g，3min，弃滤液；20000g，空转1min；
(1.8)柱子转移至新的离心管，开盖室温放置5min，加入100μL Buffer AE，放置5min；10000g，1min；再加100μL Buffer AE，放置1min；10000g，1min。
(2)基因组DNA纯化，采用的纯化试剂盒(购自ZYMO RESEEARCH，货号为D4011，规格大小为100人份)进行纯化，纯化流程参照该试剂盒使用说明书，具体如下：
(2.1)在上述提取的200μL DNA中加400μL(2倍体积的)DNABindingBuffer，混匀，瞬离；
(2.2)转移至柱子中，13000g，30s，弃滤液；
(2.3)加入200μL Washing Buffer，13000g，30s，弃滤液；
(2.4)重复步骤2.3；
(2.5)柱子转移至新的离心管中，加入40μL Buffer AE，放置1min，10000g，30s；
(2.6)再加入40μL Buffer AE，放置1min；10000g，30s；
(2.7)Qubit浓度测定。
(3)超声打断：
(3.1)准备好超声打断仪器(购自Covaris，型号为M220)和50μL专用超声打断管，即microTUBE-50AFAFiber Screw-Cap剪切管(购自Covaris)，取500ng上述纯化好的DNA，用10mM Tris-HCl，pH8.0稀释至体积为50μL，转移至专用管中；
(3.2)设置程序为150bp，运行360s；
(3.3)超声结束后，用2倍体积的AMPure XP Beads纯化，35μL ddH2O洗脱；
(3.4)Qubit浓度测定，片段化DNA回收率及浓度详情见表1。
回收率W的计算公式：W＝Qubit浓度(ng/μL)×30μL/500ng×100％。
超声打断时，设置对照组和实验组A～E，不同组别间，仅使用的microTUBE-50AFAFiber Screw-Cap剪切管有差异，其它处理步骤、程序和相关参数均相同。
对照组使用的microTUBE-50AFA Fiber Screw-Cap剪切管为新管；实验组A～E使用microTUBE-50AFA Fiber Screw-Cap剪切管为基因组DNA超声打断使用后回收(各管中污染源相同)的经过相应处理的管；其对应的处理方法如下：
实验组A：次氯酸钠溶液浸泡和乙醇浸泡
(1)准备由Millipore制水系统制备的超纯水和次氯酸钠溶液(有效氯Cl≥10％)，用超纯水稀释次氯酸钠溶液，超纯水和次氯酸钠的稀释比例为体积比2.5：1，配制成稀释后的次氯酸钠溶液A；
(2)将使用后回收的剪切管拧开，小心地将拧开后的管帽、管身以及管中的小棒都放入一个干净的烧杯中，倒入稀释后的次氯酸钠溶液A，使烧杯中的所有剪切管元件均能浸润，浸泡时间25min；
(3)浸泡结束后，滤掉烧杯中的浸泡液，用一次性棉签擦拭剪切管元件；
(4)再用超纯水清洗3次，清洗结束后，再次加入超纯水，浸泡10min；
(5)超纯水浸泡结束后，滤掉烧杯中的超纯水，尽量不要残余，再用一次性棉签擦拭，再倒入75％的消毒酒精，使所有的剪切管元件均能浸润，浸泡10min；
(6)浸泡结束后，再用超纯水清洗3次，再加入超纯水浸泡10min，滤掉烧杯中的超纯水，再用一次性棉签擦拭。
(7)将清洗好的剪切管元件在超净工作台检出，尽量将元件上的液体弄干，将检出的元件放在干净的无尘纸上，尽量吸干残余液；风干剪切管的元件；
(8)组装：将剪切管的元件进行组装，每个剪切管需包括管帽、管身和管内的小棒，组装好后置于干净的自封袋内备用。
实验组B：纯水超声处理
(1)先用超纯水将超声波清洗机的水槽清洗3次；
(2)将使用后回收的剪切管拧开，小心地将拧开后的管帽、管身以及管中的小棒都放入一个干净的烧杯中，倒入超纯水覆盖所有剪切管元件；
(3)将烧杯放入超声波清洗机水槽内，往超声波清洗机水槽内注水，水面至超过烧杯内部液面即可，打开超声波清洗机，40℃，超声30min；
(4)将烧杯内的水倒掉，小心弃水，勿将剪切管的原件尤其是小棒倒出，换干净的超纯水，再将烧杯放入超声波清洗机水槽内，再次超声清洗，40℃，超声30min；
(5)超声清洗结束后，将烧杯内的超纯水弃干净；
(6)将超声清洗好的剪切管元件在超净工作台检出，尽量将元件上的液体弄干，将检出的元件放在干净的无尘纸上，尽量吸干残余液；风干剪切管的元件；
(7)组装：将剪切管的元件进行组装，每个剪切管需包括管帽、管身和管内的小棒，组装好后置于干净的自封袋内备用。
实验组C：紫外光照射
(1)将使用后回收的剪切管拧开，小心地将拧开后的管帽、管身以及管中的小棒都放入一个干净的烧杯中，倒入超纯水覆盖所有剪切管元件，浸泡液面使所有元器件均能浸润，浸泡时长为25min，浸泡结束后，弃超纯水；
(2)用超纯水反复浸泡3次；
(3)超纯水浸泡结束后，滤掉烧杯中的超纯水，尽量不要残余；
(4)将清洗好的剪切管元件在超净工作台检出，尽量将元件上的液体弄干，将检出的元件放在干净的无尘纸上，尽量吸干残余液；
(5)开启超净工作台的紫外灯照射60min；
(6)紫外照射结束后，开启通风，30min，风干剪切管的元件；
(7)组装：将剪切管的元件进行组装，每个剪切管需包括管帽、管身和管内的小棒，组装好后置于干净的自封袋内备用。
实验组D：依次用次氯酸钠溶液浸泡、乙醇浸泡、纯水超声处理和紫外光照射
次氯酸钠溶液浸泡和乙醇浸泡：
(1)准备由Millipore制水系统制备的超纯水和次氯酸钠溶液(有效氯Cl≥10％)，用超纯水稀释次氯酸钠溶液，超纯水和次氯酸钠的稀释比例为体积比2.5：1，配制成稀释后的次氯酸钠溶液A；
(2)将使用后回收的剪切管拧开，小心地将拧开后的管帽、管身以及管中的小棒都放入一个干净的烧杯中，倒入稀释后的次氯酸钠溶液A，使烧杯中的所有剪切管元件均能浸润，浸泡时间25min；
(3)浸泡结束后，滤掉烧杯中的浸泡液，用一次性棉签擦拭剪切管元件；
(4)再用超纯水清洗3次，清洗结束后，再次加入超纯水，浸泡10min；
(5)超纯水浸泡结束后，滤掉烧杯中的超纯水，尽量不要残余，再用一次性棉签擦拭，再倒入75％的消毒酒精，使所有的剪切管元件均能浸润，浸泡10min；
(6)浸泡结束后，再用超纯水清洗3次，再加入超纯水浸泡10min，滤掉烧杯中的超纯水，再用一次性棉签擦拭；
纯水超声处理：
(1)先用超纯水将超声波清洗机的水槽清洗3次；
(2)将次氯酸钠浸泡步骤处理好的剪切管元件放回洗净的烧杯中，倒入超纯水覆盖所有剪切管元件；
(3)将烧杯放入超声波清洗机水槽内，往超声波清洗机水槽内注水，水面至超过烧杯内部液面即可，打开超声波清洗机，40℃，超声30min；
(4)将烧杯内的水倒掉，小心弃水，勿将剪切管的原件尤其是小棒倒出，换干净的超纯水，再将烧杯放入超声波清洗机水槽内，再次超声清洗，40℃，超声30min；
(5)超声清洗结束后，将烧杯内的超纯水弃干净；
紫外光照射：
(1)将清洗好的剪切管元件在超净工作台捡出，尽量将元件上的液体弄干，将检出的元件放在干净的无尘纸上，尽量吸干残余液；
(2)开启超净工作台的紫外灯照射60min；
(3)紫外照射结束后，开启通风，30min，风干剪切管的元件；
(4)组装：将剪切管的元件进行组装，每个剪切管需包括管帽、管身和管内的小棒，组装好后置于干净的自封袋内备用。
实验组E：依次用纯水超声处理、次氯酸钠溶液浸泡、乙醇浸泡和紫外光照射
纯水超声处理：
(1)先用超纯水将超声波清洗机的水槽清洗3次；
(2)将使用后回收的剪切管拧开，小心地将拧开后的管帽、管身以及管中的小棒都放入一个干净的烧杯中，倒入超纯水覆盖所有剪切管元件；
(3)将烧杯放入超声波清洗机水槽内，往超声波清洗机水槽内注水，水面至超过烧杯内部液面即可，打开超声波清洗机，40℃，超声30min；
(4)将烧杯内的水倒掉，小心弃水，勿将剪切管的原件尤其是小棒倒出，换干净的超纯水，再将烧杯放入超声波清洗机水槽内，再次超声清洗，40℃，超声30min；
(5)超声清洗结束后，将烧杯内的超纯水弃干净；
次氯酸钠溶液浸泡和乙醇浸泡：
(1)准备由Millipore制水系统制备的超纯水和次氯酸钠溶液(有效氯Cl≥10％)，用超纯水稀释次氯酸钠溶液，超纯水和次氯酸钠的稀释比例为体积比2.5：1，配制成稀释后的次氯酸钠溶液A；
(2)将超声清洗处理后的剪切管元件(包括管帽、管身以及管中的小棒)都放入一个干净的烧杯中，倒入稀释后的次氯酸钠溶液A，使烧杯中的所有剪切管元件均能浸润，浸泡时间25min；
(3)浸泡结束后，滤掉烧杯中的浸泡液，用一次性棉签擦拭剪切管元件；
(4)再用超纯水清洗3次，清洗结束后，再次加入超纯水，浸泡10min；
(5)超纯水浸泡结束后，滤掉烧杯中的超纯水，尽量不要残余，再用一次性棉签擦拭，再倒入75％的消毒酒精，使所有的剪切管元件均能浸润，浸泡10min；
(6)浸泡结束后，再用超纯水清洗3次，再加入超纯水浸泡10min，滤掉烧杯中的超纯水，再用一次性棉签擦拭；
紫外光照射：
(1)将浸泡处理好的剪切管元件在超净工作台捡出，尽量将元件上的液体弄干，将检出的元件放在干净的无尘纸上，尽量吸干残余液；
(2)开启超净工作台的紫外灯照射60min；
(3)紫外照射结束后，开启通风，30min，风干剪切管的元件；
(4)组装：将剪切管的元件进行组装，每个剪切管需包括管帽、管身和管内的小棒，组装好后置于干净的自封袋内备用。
表1对照组和实验组A～E样本片段化DNA浓度及回收率
Figure BDA0002909134940000101
从回收率的比较来分析，对照组和5个实验组的回收率均在质控范围内，均为60％左右，初步推测，经本发明清洗方法处理的回收剪切管及不同处理方式处理后的剪切管和新的剪切管一样可用。
实施例2.文库构建
文库构建试剂盒采用KAPA Hyper Prep Kit(购自KAPA)，构建流程按照试剂盒说明书操作，具体如下：
(1)预文库构建步骤：
末端修复及加A：将PCR热循环仪设置为20℃30分钟，65℃30分钟，4℃保存。热盖105℃。末端修复及加A酶(End Repair&A-Tailing Enzyme)及对应的缓冲液(End Repair&A-Tailing Buffer)从-20℃取出，置于冰上融化，融化后涡旋混匀，瞬离置于冰上备用。
配制如表2所示反应体系：
表2末端修复及加A反应体系
组分 加入量
片段化DNA 20ng
末端修复及加A酶 3μL
对应的缓冲液 7μL
ddH2O 补足至60μL
总体积 60μL
轻弹混匀后瞬时离心，置于设置好程序的PCR热循环仪上，程序如表3所示。
表3 PCR反应程序
Figure BDA0002909134940000111
上述反应结束，立即进行接头连接。
接头连接：末端修复及加A反应完成后，加入2μL 2.5μM的接头储存液，吹吸混匀，然后再分别按表4加入试剂盒中的相应组分，缓慢吹吸混匀后瞬时离心，置于设置好程序的PCR热循环仪上，PCR程序如表6所示。
表4接头连接反应体系
组分 加入量
末端修复及加A反应结束后产物 60μL
接头储存液(2.5μM) 2μL
DNA连接酶 10μL
连接酶缓冲液 30μL
ddH2O 8μL
总体积 110μL
每个反应所对应的接头index序列见下表5：
表5各测试对应的Index序号及序列
Figure BDA0002909134940000121
表6 PCR反应程序
温度 时间
20℃ 15分钟
65℃ 10分钟
4℃ 保存
65℃10分钟结束后，立即进行磁珠纯化。提前30分钟将AMPure XP Beads从冰箱取出混匀，并室温平衡。重新混匀后的AMPure XP Beads取出88μL置于1.5mL EP管中，将上述110μL连接后的反应体系加入，使用移液枪充分吹吸混匀。室温放置5分钟。置于磁力架上，放置7-8分钟待液体澄清后吸弃上清。保持EP管在磁力架上，向管中沿壁加入200μL新配制的80％乙醇，倾斜磁力架使乙醇冲洗磁珠30秒。吸弃液体乙醇。重复使用200μL新配制的80％乙醇再冲洗磁珠一次，吸弃液体乙醇。将EP管从磁力架上取下，磁珠一面管壁朝上进行低速瞬时离心，将管壁上残留的乙醇离心到管底。将EP管重新放置在磁力架上，10秒钟后使用小型移液枪头吸弃管底残留乙醇。取下EP管，开盖室温放置3分钟。加入22μL洗脱缓冲液，移液枪反复轻轻吹打磁珠，使磁珠悬浮后，室温放置5分钟。将EP管放置在磁力架上，待液体完全澄清后吸取20μL液体到新的EP管中。至此纯化洗脱完毕，得到接头连接产物，即预文库。
(2)文库富集
将纯化好的连接产物按照表7的反应体系配制：
表7文库富集PCR反应体系
组分 加入量
KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X) 25μL
KAPA Library Amplification Primer Mix(10X) 5μL
纯化好的连接产物 20μL
总体积 50μL
将上述配制好的反应体系用移液器请请吹吸混匀，瞬离，置于PCR热循环仪上，运行如表8所示反应程序：
表8文库富集PCR反应程序
Figure BDA0002909134940000131
PCR反应结束后，用1倍体积的AMPure XP Beads对PCR产物进行纯化，纯化后的终文库置于-20℃保存待二代测序平台测序用。本发明所使用的测序平台是Illumina的NextSeq平台，测序步骤严格按照供应商的要求使用。
测序结果如表9所示。通过检测的6个样本的变异情况来判断本发明中所述的剪切管清洗效果。结果显示：采用新的剪切管打断来制备的待检样本(对照组)检出的变异情况和采用本发明所述的清洗方法处理的剪切管来制备的待检样本(实验组D)基本一致，但是用其余方法和流程处理的剪切管来制备的待检样本(实验组A、B、C、E)检出了其余变异。各样本检测的变异情况见表3。其中，单独用次氯酸钠和乙醇浸泡、超声清洗机清洗、紫外照射等方式清洗处理(实验组A、B、C)的效果远远不如本发明的组合流程处理效果。若将本发明的清洗流程如次氯酸钠和乙醇浸泡和超声清洗机超声清洗顺序进行互换(实验组E)，效果也达不到本发明描述的清洗流程。由于次氯酸钠和乙醇均作为降解核酸的有效成分，最先用次氯酸钠和乙醇浸泡能有效降解剪切管中残余的大量核酸物质，也能将残余的大片段核酸降解成若干个碱基，经过浸泡、擦拭、纯水浸泡和擦拭处理后，将残余的大部分核酸物质清除，再用超声清洗机清洗，不但能将附着的残余的少量核酸物质消除，还能将附着的次氯酸钠和乙醇去除，避免影响后续的再次使用。
表9各样本检测的变异详情
Figure BDA0002909134940000141
Figure BDA0002909134940000151
Figure BDA0002909134940000161
Figure BDA0002909134940000171
注：chr表示染色体位置；Start表示变异的起始位置；end表示变异的终止位置；Size(M)表示变异区间的大小，单位为M；l表示统计分析过程中的算式平均值；l.median表示统计过程中的中位数；z表示该样本的统计Z值；arm表示染色体臂，Q表示长臂，P表示短臂；CNV＿type表示该CNV区域的变异类型，Del表示缺失，Dup表示重复；cytoband表示该变异位点所处的染色体区段。
从测序结果可以看出：采用新的剪切管打断来制备的待检样本(对照组)检出的CNV重复或者缺失区间和采用本发明所述的清洗方法处理的剪切管来制备的待检样本(实验组D)基本一致，但是采用其他清洗方法或流程处理的剪切管来制备的待检样本(实验组A、B、C、E)除了检出与对照组一致的CNV变异区间外，其中部分样本还检出了不一致的CNV变异区间。综上所述：本发明采用的针对microTUBE-50 AFA Fiber Screw-Cap剪切管的清洗方法可去除残余的核酸物质，且效果良好。
尽管已参照具体实施方式公开了本发明，但是显而易见的是，在不背离本发明的真正精神和范围的情况下，本领域的其他技术人员可以设计本发明的其它实施方式和变化，所附权利要求书目的在于被解释为包括所有这样的实施方式和等价的变化。此外，本文引用的所有参考文献的内容据此引入本文以供参考。

Claims (4)

1.一种消除核酸剪切管核酸残留的方法在核酸剪切管循环利用方面的应用，其特征在于，包括如下步骤：
将核酸剪切管依次用核酸祛除溶液浸泡15~30 min、纯水浸泡5~15min、70~80%乙醇浸泡5~15 min、纯水浸泡5~15min、30~50℃纯水超声处理20~40 min，超声处理的次数为1~3次，超声频率为300~500 W和200~280 nm紫外光照射30~60 min；其中，所述核酸祛除溶液选自次氯酸钠溶液、过氧化氢溶液、pH<4的酸溶液或pH>10的碱溶液中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述核酸祛除溶液为次氯酸钠溶液。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述次氯酸钠溶液中有效氯含量大于等于2.5%。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，每次浸泡后，都需要使所述核酸剪切管干燥。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105209186A (zh) * 2013-04-30 2015-12-30 格瑞诺瓦有限责任公司 移液器吸头清洗装置

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070289605A1 (en) * 2005-10-07 2007-12-20 Becton, Dickinson And Company Use of dilute hydrogen peroxide to remove DNA contamination
ATE428448T1 (de) * 2005-11-30 2009-05-15 Hoffmann La Roche Verfahren zur dna-dekontamination
FR2966056B1 (fr) * 2010-10-19 2016-03-18 Millipore Corp Procede de traitement des acides nucleiques residuels presents a la surface des consommables de laboratoire
CN104931568A (zh) * 2015-06-29 2015-09-23 彭梓 氧化铟锡电化学发光反应电极的再生清洗方法
CN110684605B (zh) * 2019-11-18 2021-08-10 青岛立见生物科技有限公司 一种核酸祛除剂

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105209186A (zh) * 2013-04-30 2015-12-30 格瑞诺瓦有限责任公司 移液器吸头清洗装置

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