CN106893721A - 一种用于核酸纯化或片段筛选的试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于核酸纯化或片段筛选的试剂盒，其包括磁珠溶液、洗涤试剂和洗脱试剂；其中，所述磁珠溶液包含浓度为1～100ng/μL的氧化硅羧基磁珠、浓度为0.1～100mol/L的氯化钠、体积百分比浓度为1％～50％的聚乙二醇和缓冲液。本发明还公开了使用所述试剂盒进行核酸纯化和片段筛选的方法。本发明的试剂盒用磁珠法进行核酸纯化与片段筛选操作，不受通量限制，可以实现高通量，同时本发明基于磁珠的磁性特性，可配合自动化操作仪器进行自动化操作。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种用于核酸纯化或片段筛选的试剂盒及其使用方法。
背景技术
高通量测序技术，即下一代测序技术(next generation sequencing)能一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定及量化，为基础生物医学研究和临床检测提供了一个强大的工具，并推动基因组学的科学研究和临床转化，奠定了其在精准医学的基石地位。而一个待检样品在走上高通量DNA测序机器测序前还需要做大量的工作，其中的关键步骤就是文库构建。文库构建包括核酸片段化、修复反应、加A反应、连接反应、片段筛选与纯化、PCR扩增、PCR产物纯化、文库质检等过程，这些过程需要做大量的核酸纯化及片段筛选的工作。
目前核酸纯化及片段筛选的方法有胶回收法、离心柱法等。胶回收法是根据凝胶电泳中不同片段大小的核酸在凝胶上的泳动距离不同而通过对含特定大小核酸片段的凝胶切割下来，再将切割下来的凝胶中的核酸分离纯化出来，达到核酸片段选择纯化的目的。离心柱法是利用硅胶膜配合特定的溶液环境来吸附核酸片段而达到核酸片段选择纯化的目的。但这些方法存在操作繁琐，耗时，或需要凝胶电泳或需要离心，无法实现高通量、自动化操作。胶回收法首先需要制备凝胶、电泳、切胶、回收等过程需要消耗大量的时间、花费不少人力操作成本。离心柱法一般需要吸附、洗涤、洗脱等步骤，其间需要大量的离心操作步骤，每次离心5min左右，而离心机的通量有限，限制了操作的简便性，当然少量样品以上两种方法可以是种选择，但当需要实现批量操作的时候，以上方法无法满足。
发明内容
一方面，本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种用于核酸纯化或片段筛选的试剂盒，本发明的试剂盒用磁珠法进行核酸纯化与片段筛选操作，不受通量限制，可以实现高通量，同时本发明基于磁珠的磁性特性，可配合自动化操作仪器进行自动化操作。
本发明采用的技术方案为：一种用于核酸纯化或片段筛选的试剂盒，包括磁珠溶液、洗涤试剂和洗脱试剂；其中，所述磁珠溶液包含浓度为1～100ng/μL的氧化硅羧基磁珠、0.1～100mol/L的氯化钠、体积百分比浓度为1％～50％的聚乙二醇和缓冲液。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述缓冲液为pH为5.5～6.5的1～100mol/L三羟基甲烷-盐酸。所述PH优选为6.0。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述聚乙二醇的分子量为5000～10000道尔顿，优选为8000道尔顿。PEG最早应用于提纯免疫球蛋白(IgG)和沉淀一些细菌病毒，近年来逐渐应用于核酸和酶的分离纯化，特别是用PEG分离质粒DNA，已相当普遍。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA，可以在500ul DNA液中加入200ul 20％PEG8000(含1.2mol/LNaCl)，冰浴20min。该操作的优点在于：操作条件温和，不易引起生物大分子的变性。同时具有极高的沉淀效能，少量的PEG可以沉淀相当多的生物大分子。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述氧化硅羧基磁珠的浓度为5～50ng/μL，所述氯化钠的浓度为0.5～10mol/L，所述聚乙二醇的体积百分比浓度为2％～30％。各组分在以上浓度范围内时，试剂盒的使用效果更佳，对盐、引物、引物二聚体、dNTPs、小片段的DNA分子等去除效率更高，对目标片段的回收率更高。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述洗涤试剂包含体积百分比浓度为1％～85％的乙醇，1～100mmol/L氯化钠，0.1～10mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，pH为7.5～8.5的0.1～10mmol/L三羟基甲烷-盐酸。三羟基甲烷-盐酸的pH优选为8.0。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述洗脱试剂含有pH为8.0～9.0的0.1～10mmol/L三羟基甲烷-盐酸。三羟基甲烷-盐酸的pH优选为8.5。
另一方面，本发明还提供了使用以上所述的试剂盒进行核酸纯化的方法，其包括以下步骤：
1)向盛有待纯化核酸样品的反应管中加入所述磁珠溶液，混匀，室温下静置3～10min；
2)将所述反应管置于磁力架，静置2～5min，待溶液澄清后，吸走上清液；
3)向所述反应管中加入所述洗涤试剂，室温静置20～60s，吸走上清液；此步骤至少进行一次；
4)保持所述反应管置于磁力架上状态，室温开盖晾干2～5min；
5)将所述反应管从磁力架上取下来，加入洗脱试剂，混匀，室温静置2～6min；
6)将所述反应管重新放置在磁力架上，室温静置1～3min，上清液即纯化后的DNA产物。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤1)中，磁珠溶液的加入体积为待纯化核酸样品体积的0.5～2倍，优选为1.8倍。
又一方面，本发明还提供了使用以上所述的试剂盒进行片段筛选的方法，其包括以下步骤：
1')将第一轮磁珠溶液加入盛有待筛选核酸样品的反应管中，混匀，室温下静置3～10min；
2')将所述反应管放置在磁力架上，静置2～5min，待溶液澄清后将上清液转移置新的反应管；
3')向上述装有上清液的反应管加入第二轮磁珠溶液，室温静置3～10min，置于磁力架上，静置2～5min，待溶液澄清后吸走上清液；所述第一轮磁珠溶液与第二轮磁珠溶液的总和即为所述磁珠溶液；
4')向反应管中加入洗涤试剂，室温静置20～60s，吸走上清液；此步骤至少进行一次；
5')保持反应管置于磁力架上状态，室温开盖晾干2～5min；
6')将反应管从磁力架上取下来，加入洗脱试剂，混匀，室温静置2～6min；
7')将反应管重新放置在磁力架上，室温静置1～3min，上清液即筛选的核酸片段。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述第一轮磁珠溶液的加入量为待筛选核酸样品体积的0.4～0.8倍，所述第二轮磁珠溶液的加入量为待筛选核酸样品体积的0.1～0.3倍，所述筛选的核酸片段的平均长度为250～700bp。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述第一轮磁珠溶液的加入量、第二轮磁珠溶液的加入量与对应的筛选的核酸片段的平均长度如下表所示：
表中”ד表示待筛选核酸样品的体积。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
1)实现高通量：本发明用磁珠法进行核酸纯化与片段筛选操作，不受通量限制，可以实现高通量。
2)实现自动化：本发明基于磁珠的磁性特性，可配合自动化操作仪器进先自动化操作。
3)实现核酸纯化：本发明中的吸附试剂在特定的溶液环境下(高盐低PH)对核酸样品中的大片段DNA的结合效率优于小片段DNA，基于这一特性，可通过调节吸附试剂的加入比例，选择性地去除盐、引物、引物二聚体、dNTPs、小片段的DNA分子等。
4)实现片段筛选：本发明中的吸附试剂加入待纯化的核酸样品的比例越小，对于中小DNA片段的吸附能力越小，通过配合操作流程，两次加入不同比例的吸附试剂，可实现一定长度范围的核酸片段筛选。
附图说明
图1为核酸纯化方法的流程示意图；
图2为片段筛选方法的流程示意图；
图3显示了不同的磁珠溶液的加入比例对核酸样品的纯化效果的影响；
图4显示了分别使用AMPureXP磁珠和本发明的试剂盒进行核酸纯化的结果；
图5显示了使用本发明的试剂盒进行3个不同批次的试验所得的核酸纯化结果；
图6显示了不同条件下的磁珠片段筛选结果。
具体实施方式
二代测序如火如荼，但文库制备仍然繁琐，核酸纯化与片段筛选作为文库构建的一个关键步骤，其操作是否简便快捷，可否实现自动化是个需解决的问题。
磁珠法可克服以上所述缺点，磁珠法是采用超顺磁性纳米磁珠在两种不同的溶液环境中特异吸附和解吸附核酸的特性，配合磁力分离装置，针对性地设计试剂系统和核酸片段选择性纯化流程，从而达到快速实现核酸样品纯化及片段筛选的目的。磁珠法核酸纯化过程安全无毒、操作简便，可对核酸片段进行选择性纯化，且基于磁性特质可实现自动化、高通量。
本发明的实施例提供了一种用于核酸纯化或片段筛选的试剂盒，其包括磁珠溶液、洗涤试剂和洗脱试剂；其中，所述磁珠溶液包含浓度为1～100ng/μL的氧化硅羧基磁珠、0.1～100mol/L的氯化钠、体积百分比浓度为1％～50％的聚乙二醇和缓冲液。
本发明试剂盒中的磁珠溶液(即吸附试剂)在特定的溶液环境下(高盐低PH)对核酸样品中的大片段DNA的结合效率优于小片段DNA，基于这一特性，可通过调节吸附试剂的加入比例，吸附试剂加入待纯化的核酸样品的比例越小，对于中小DNA片段的吸附能力越小，通过配合特殊设计的操作流程，可实现核酸纯化与片段筛选的目的。
进一步地，所述缓冲液为pH为5.5～6.5的1～100mol/L三羟基甲烷-盐酸。所述PH优选为6.0。
进一步地，所述聚乙二醇的分子量为5000～10000道尔顿，优选为8000道尔顿。
进一步地，所述氧化硅羧基磁珠的浓度为30～70ng/μL，所述氯化钠的浓度为30～70mol/L，所述聚乙二醇的体积百分比浓度为15％～35％。当各组分的浓度在上述数值范围之内时，试剂盒的使用效果更佳。
所述洗涤试剂用于清洗掉非目的片段，为了实现更佳的洗涤效果，进一步地，所述洗涤试剂包含体积百分比浓度为1％～85％的乙醇，1～100mmol/L氯化钠，0.1～10mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，pH为7.5～8.5的0.1～10mmol/L三羟基甲烷-盐酸。三羟基甲烷-盐酸的pH优选为8.0。
所述洗脱试剂用于将磁珠上的目的片段清洗下来，为了实现更佳的洗脱效果，进一步地，所述洗脱试剂含有pH为8.0～9.0的0.1～10mmol/L三羟基甲烷-盐酸。三羟基甲烷-盐酸的pH优选为8.5。
在一个优选的实施例中，一种核酸纯化或片段筛选试剂盒，包括磁珠溶液(即吸附试剂)、洗涤试剂、洗脱试剂；其中，
所述磁珠溶液包含浓度为1～100ng/μL的氧化硅羧基磁珠、浓度为0.1～100mol/L的氯化钠，体积百分比浓度为1％～50％的PEG8000，1～100mol/L的三羟基甲烷-盐酸(Tris-HCL pH＝6.0)。
所述洗涤试剂含有体积百分比浓度为1％～85％的乙醇，1～100mmol/L氯化钠，0.1～10mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，0.1～10mmol/L三羟基甲烷-盐酸(Tris-HCL pH＝8.0)，现配现用。
所述洗脱试剂含有0.1～10mmol/L三羟基甲烷-盐酸(Tris-HCL pH＝8.5)。
本发明的实施例还提供了使用以上所述的试剂盒进行核酸纯化的方法，该方法的流程示意图如图1所示，该方法具体包括以下步骤：
1)向盛有待纯化核酸样品的反应管中加入所述磁珠溶液，混匀，室温下静置3～10min；
2)将所述反应管置于磁力架，静置2～5min，待溶液澄清后，吸走上清液；
3)向所述反应管中加入所述洗涤试剂，室温静置20～60s，吸走上清液；此步骤至少进行一次；
4)保持所述反应管置于磁力架上状态，室温开盖晾干2～5min；
5)将所述反应管从磁力架上取下来，加入洗脱试剂，混匀，室温静置2～6min；
6)将所述反应管重新放置在磁力架上，室温静置1～3min，上清液即纯化后的DNA产物。
磁珠溶液的加入比例对核酸的纯化有较大影响，可通过调节磁珠溶液的加入比例，来提高核酸纯化效果，对于本发明的磁珠溶液来说，磁珠溶液加入待纯化的核酸样品的比例越小，对于中小DNA片段的吸附能力越小，进一步地，所述步骤1)中，磁珠溶液的加入体积为待纯化核酸样品体积的0.5～2倍，优选为1.8倍。当磁珠溶液的加入体积为待纯化核酸样品体积的1.8倍时，相比于其他的用量纯化效果更好，此时核酸纯化效率可稳定地达到80％以上。
本发明的实施例还提供了使用以上所述的试剂盒进行片段筛选的方法，该方法的流程示意图如图2所示，该方法具体包括以下步骤：
1')将第一轮磁珠溶液加入盛有待筛选核酸样品的反应管中，混匀，室温下静置3～10min；
2')将所述反应管放置在磁力架上，静置2～5min，待溶液澄清后将上清液转移置新的反应管；
3')向上述装有上清液的反应管加入第二轮磁珠溶液，室温静置3～10min，置于磁力架上，静置2～5min，待溶液澄清后吸走上清液；所述第一轮磁珠溶液与第二轮磁珠溶液的总和即为所述磁珠溶液；
4')向反应管中加入洗涤试剂，室温静置20～60s，吸走上清液；此步骤至少进行一次；
5')保持反应管置于磁力架上状态，室温开盖晾干2～5min；
6')将反应管从磁力架上取下来，加入洗脱试剂，混匀，室温静置2～6min；
7')将反应管重新放置在磁力架上，室温静置1～3min，上清液即筛选的核酸片段。
进一步地，所述第一轮磁珠溶液的加入量为待筛选核酸样品体积的0.4～0.8倍，所述第二轮磁珠溶液的加入量为待筛选核酸样品体积的0.1～0.3倍，所述筛选的核酸片段的平均长度为250～700bp。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
核酸纯化或片段筛选试剂盒
一种核酸纯化或片段筛选试剂盒，包括磁珠溶液(即吸附试剂)、洗涤试剂、洗脱试剂；其中，
所述磁珠溶液包含浓度为10ng/μL的氧化硅羧基磁珠、浓度为2.5mol/L的氯化钠，体积百分比浓度为12％的PEG8000，1mol/L的三羟基甲烷-盐酸(Tris-HCL pH＝6.0)，2℃-8℃储存。
所述洗涤试剂含有体积百分比浓度为70％的乙醇，100mmol/L氯化钠，10mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，10mmol/L三羟基甲烷-盐酸(Tris-HCLpH＝8.0)，现配现用，室温储存。
所述洗脱试剂含有10mmol/L三羟基甲烷-盐酸(Tris-HCL pH＝8.5)，室温储存。
核酸纯化方法
使用本实施例的试剂盒进行核酸纯化的方法，其包括以下步骤：
(1)使用前，将磁珠溶液从2-8℃冰箱中取出，室温下震荡混匀，平衡30min。
(2)根据纯化目的往待纯化核酸样品加入0.5～2×已混匀的磁珠，×表示待纯化核酸样品的体积，若加入磁珠的比例为1.8X，待纯化核酸样品体积为100μL，则加入磁珠的比例为1.8×100μL，即180μL。
(3)用移液器反复吹打10次使磁珠溶液和待纯化样本充分混匀，室温下静置5min。
(4)将反应管置于磁力架，静置2min，待溶液澄清后，吸走上清。
(5)向反应管中加入洗涤试剂200μL，室温静置30s，吸走上清。
注意不可将反应管从磁力分离架上拿下或将磁珠吹散。
(6)重复步骤5。
(7)保持反应管置于磁力架上状态，室温开盖晾干2min。
(8)将反应管从磁力架上取下来，加入50μL洗脱试剂，移液器反复吹打10次混匀，室温静置3min。
(9)将反应管重新放置在磁力架上，室温静置1min，上清液即纯化后的DNA产物。
(10)将该上清液转入新的反应管或者反应板中，供下一步反应或检测使用。
核酸片段筛选方法
使用本实施例的试剂盒进行核酸片段筛选的方法，其包括以下步骤：
(1)向盛有待筛选核酸样品的反应管中加入第一轮磁珠溶液，将充分震荡混匀平衡后的磁珠溶液加入待筛选的核酸片段样品。
(2)用移液器反复吹打10次，将磁珠溶液和待筛选的核酸样本充分混匀，室温静置5min。
(3)将反应管放置在磁力架上，静置2min，待溶液澄清后将上清转移置新的反应管。
(4)向上述装有上清液的反应管加入第二轮磁珠溶液，室温静置5min；
(5)置于磁力架，静置2min，待溶液澄清后吸走上清。
(6)向反应管中加入洗涤试剂200μL，室温静置30s，吸走上清。
(7)重复步骤(6)。
(8)保持反应管置于磁力架上状态，室温开盖晾干2min。
(9)将反应管从磁力架上取下来，加入50μL洗脱试剂，移液器反复吹打10次混匀，室温静置3min。
(10)将反应管重新放置在磁力架上，室温静置1min，上清液即纯化后的DNA产物。
(11)将该上清液转入新的反应管或者反应板中，供下一步反应或检测使用。
所述第一轮磁珠溶液与第二轮磁珠溶液的总和即为所述磁珠溶液；所述第一轮磁珠溶液的加入量为待筛选核酸样品体积的0.4～0.8倍，所述第二轮磁珠溶液的加入量为待筛选核酸样品体积的0.1～0.3倍，所述筛选的核酸片段的平均长度为250～700bp。
实施例2
核酸纯化或片段筛选试剂盒
一种核酸纯化或片段筛选试剂盒，包括磁珠溶液(即吸附试剂)、洗涤试剂、洗脱试剂；其中，
所述磁珠溶液包含浓度为1ng/μL的氧化硅羧基磁珠、浓度为0.1mol/L的氯化钠，体积百分比浓度为10％的PEG8000，10mol/L的三羟基甲烷-盐酸(Tris-HCL pH＝6.0)，2℃-8℃储存。
所述洗涤试剂含有体积百分比浓度为1％的乙醇，1mmol/L氯化钠，0.5mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，0.5mmol/L三羟基甲烷-盐酸(Tris-HCLpH＝8.0)，现配现用，室温储存。
所述洗脱试剂含有0.1mmol/L三羟基甲烷-盐酸(Tris-HCL pH＝8.5)，室温储存。
核酸纯化方法和核酸片段筛选方法同实施例1。
实施例3
核酸纯化或片段筛选试剂盒
一种核酸纯化或片段筛选试剂盒，包括磁珠溶液(即吸附试剂)、洗涤试剂、洗脱试剂；其中，
所述磁珠溶液包含浓度为100ng/μL的氧化硅羧基磁珠、浓度为100mol/L的氯化钠，体积百分比浓度为50％的PEG8000，100mol/L的三羟基甲烷-盐酸(Tris-HCL pH＝6.0)，2℃-8℃储存。
所述洗涤试剂含有体积百分比浓度为85％的乙醇，100mmol/L氯化钠，10mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，10mmol/L三羟基甲烷-盐酸(Tris-HCLpH＝8.0)，现配现用，室温储存。
所述洗脱试剂含有10mmol/L三羟基甲烷-盐酸(Tris-HCL pH＝8.5)，室温储存。
核酸纯化方法和核酸片段筛选方法同实施例1。
实施例4
核酸纯化或片段筛选试剂盒
一种核酸纯化或片段筛选试剂盒，包括磁珠溶液(即吸附试剂)、洗涤试剂、洗脱试剂；其中，
所述磁珠溶液包含浓度为10ng/μL的氧化硅羧基磁珠、浓度为10mol/L的氯化钠，体积百分比浓度为1％的PEG8000，1mol/L的三羟基甲烷-盐酸(Tris-HCLpH＝6.0)，2℃-8℃储存。
所述洗涤试剂含有体积百分比浓度为20％的乙醇，30mmol/L氯化钠，5mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，5mmol/L三羟基甲烷-盐酸(Tris-HCL pH＝8.0)，现配现用，室温储存。
所述洗脱试剂含有5mmol/L三羟基甲烷-盐酸(Tris-HCL pH＝8.5)，室温储存。
核酸纯化方法和核酸片段筛选方法同实施例1。
实施例5
核酸纯化或片段筛选试剂盒
一种核酸纯化或片段筛选试剂盒，包括磁珠溶液(即吸附试剂)、洗涤试剂、洗脱试剂；其中，
所述磁珠溶液包含浓度为30ng/μL的氧化硅羧基磁珠、浓度为30mol/L的氯化钠，体积百分比浓度为15％的PEG8000，15mol/L的三羟基甲烷-盐酸(Tris-HCL pH＝6.0)，2℃-8℃储存。
所述洗涤试剂含有体积百分比浓度为50％的乙醇，60mmol/L氯化钠，7mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，7mmol/L三羟基甲烷-盐酸(Tris-HCL pH＝8.0)，现配现用，室温储存。
所述洗脱试剂含有7mmol/L三羟基甲烷-盐酸(Tris-HCL pH＝8.5)，室温储存。
核酸纯化方法和核酸片段筛选方法同实施例1。
实施例6
核酸纯化或片段筛选试剂盒
一种核酸纯化或片段筛选试剂盒，包括磁珠溶液(即吸附试剂)、洗涤试剂、洗脱试剂；其中，
所述磁珠溶液包含浓度为70ng/μL的氧化硅羧基磁珠、浓度为70mol/L的氯化钠，体积百分比浓度为35％的PEG8000，50mol/L的三羟基甲烷-盐酸(Tris-HCL pH＝6.0)，2℃-8℃储存。
所述洗涤试剂含有体积百分比浓度为70％的乙醇，80mmol/L氯化钠，8mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，9mmol/L三羟基甲烷-盐酸(Tris-HCL pH＝8.0)，现配现用，室温储存。
所述洗脱试剂含有9mmol/L三羟基甲烷-盐酸(Tris-HCL pH＝8.5)，室温储存。
核酸纯化方法和核酸片段筛选方法同实施例1。
实施例7
以实施例1的核酸纯化或片段筛选试剂盒为例，当利用此试剂盒处理待纯化的核酸样品时，对不同的磁珠溶液的加入比例对核酸样品的纯化效果影响进行测试分析，结果如图3所示。从图中可知，磁珠溶液加入待纯化的核酸样品的比例越小，对于中小DNA片段的吸附能力越小，因此可通过配合特殊设计的操作流程，可实现核酸纯化与片段筛选的目的。
实施例8
以实施例1的核酸纯化或片段筛选试剂盒为例，与进口品牌磁珠比较，在进行核酸纯化时，使用相对于待纯化核酸样品体积1.8倍的磁珠溶液体积进行纯化，纯化效率达80％以上。与同类型产品AMPureXP磁珠(操作步骤与实施例1的核酸纯化步骤相同)比较，纯化效率更高。批次间稳定性良好，CV值<8％，结果如图4、图5所示，其中，横坐标的AMPureXP代表使用AMPureXP磁珠进行核酸纯化的结果，ECOgene B1、ECOgene B2、ECOgene B3分别代表使用本发明的试剂盒进行3个不同批次的试验所得的核酸纯化结果。
实施例9
以实施例1的核酸纯化或片段筛选试剂盒为例，在利用该试剂盒进行片段筛选时，设置六组不同的第一轮磁珠溶液的加入量和第二轮磁珠溶液的加入量(具体详见表1)，筛选后得到的片段结果如图6所示。
表1
表中”ד表示待筛选核酸样品的体积，如筛选的目的片段平均长度为320bp，样品DNA体积为100μL，则第一轮磁珠溶液使用体积为0.7×100μL＝70μL；第二轮磁珠溶液使用体积为0.20×100μL＝20μL。图6为2100检测模拟电泳图，其中，1～6分别代表表1中的第一组～第六组，7代表采用只加入一轮磁珠溶液进行核酸片段筛选的结果，从图6可知，采用加入两轮磁珠溶液的方式，可实现更精准的核酸片段筛选，通过选择不同的第一轮磁珠溶液的加入量和第二轮磁珠溶液的加入量，可实现不同大小的核酸片段筛选。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种用于核酸纯化或片段筛选的试剂盒，其特征在于：包括磁珠溶液、洗涤试剂和洗脱试剂；其中，所述磁珠溶液包含浓度为1～100ng/μL的氧化硅羧基磁珠、浓度为0.1～100mol/L的氯化钠、体积百分比浓度为1％～50％的聚乙二醇和缓冲液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述缓冲液为pH为5.5～6.5的1～100mol/L三羟基甲烷-盐酸。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述聚乙二醇的分子量为5000～10000道尔顿，优选为8000道尔顿。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述氧化硅羧基磁珠的浓度为5～50ng/μL，所述氯化钠的浓度为0.5～10mol/L，所述聚乙二醇的体积百分比浓度为2％～30％。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述洗涤试剂包含体积百分比浓度为1％～85％的乙醇，1～100mmol/L氯化钠，0.1～10mmol/L乙二胺四乙酸，pH为7.5～8.5的0.1～10mmol/L三羟基甲烷-盐酸；
所述洗脱试剂含有pH为8.0～9.0的0.1～10mmol/L三羟基甲烷-盐酸。
6.使用权利要求1～5中任一项所述的试剂盒进行核酸纯化的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)向盛有待纯化核酸样品的反应管中加入所述磁珠溶液，混匀，室温下静置3～10min；
2)将所述反应管置于磁力架，静置2～5min，待溶液澄清后，吸走上清液；
3)向所述反应管中加入所述洗涤试剂，室温静置20～60s，吸走上清液；此步骤至少进行一次；
4)保持所述反应管置于磁力架上状态，室温开盖晾干2～5min；
5)将所述反应管从磁力架上取下来，加入洗脱试剂，混匀，室温静置2～6min；
6)将所述反应管重新放置在磁力架上，室温静置1～3min，上清液即纯化后的DNA产物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，磁珠溶液的加入体积为待纯化核酸样品体积的0.5～2倍，优选为1.8倍。
8.使用权利要求1～5中任一项所述的试剂盒进行片段筛选的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1')将第一轮磁珠溶液加入盛有待筛选核酸样品的反应管中，混匀，室温下静置3～10min；
2')将所述反应管放置在磁力架上，静置2～5min，待溶液澄清后将上清液转移置新的反应管；
3')向上述装有上清液的反应管加入第二轮磁珠溶液，室温静置3～10min，置于磁力架上，静置2～5min，待溶液澄清后吸走上清液；所述第一轮磁珠溶液与第二轮磁珠溶液的总和即为所述磁珠溶液；
4')向反应管中加入洗涤试剂，室温静置20～60s，吸走上清液；此步骤至少进行一次；
5')保持反应管置于磁力架上状态，室温开盖晾干2～5min；
6')将反应管从磁力架上取下来，加入洗脱试剂，混匀，室温静置2～6min；
7')将反应管重新放置在磁力架上，室温静置1～3min，上清液即筛选的核酸片段。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述第一轮磁珠溶液的加入量为待筛选核酸样品体积的0.4～0.8倍，所述第二轮磁珠溶液的加入量为待筛选核酸样品体积的0.1～0.3倍，所述筛选的核酸片段的平均长度为250～700bp。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述第一轮磁珠溶液的加入量、第二轮磁珠溶液的加入量与对应的筛选的核酸片段的平均长度如下表所示：
表中”ד表示待筛选核酸样品的体积。
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