CN113564157B - Pcr反应体系、试剂盒和pcr方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种PCR反应体系、试剂盒和PCR方法。所述PCR试剂包括KOH、SDS、精氨酸、Brij‑35、TritonX‑100、尿素和DTT。还公开了一种包括该PCR试剂的PCR反应体系。利用本发明的方法扩增DNA，在前处理阶段无需对样本进行加热或离心等处理，操作非常简便。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种PCR反应体系、试剂盒和PCR方法。
背景技术
目前主流的免提取/快速提取qPCR方法主要包括蛋白变性方法和蛋白分离方法，蛋白变性方法往往和蛋白分离方法组合使用。蛋白变性方法包括水煮法、碱裂解法和蛋白酶法。蛋白分离方法包括鳌合树脂、有机沉淀、超滤方法和SDS-K+法。然而这些方法具有各种缺陷，例如水煮法存在需要加热，容易污染，且不能提取RNA，或对RNA灵敏度不够等问题；破裂解法存在不足以裂解蛋白等问题；蛋白酶法存在消化完需要分离，否则会消化Taq酶等问题。鳌合树脂法存在Chelex-100不溶于水，生产不便，且必须搭配水煮法使用等问题；有机试剂法存在试剂毒性较大等问题；超滤方法的成本高，且通常还需要热缩管或离心机。SDS-K+法则会有较多的基因组损失。
目前免提取/快速提取qPCR方法还包括耐抑制酶法，但该方法需要特殊的酶，成本较高，而且通常一种突变酶只会耐受某些种类的抑制剂，对另外一些抑制剂不会有作用；且另一些耐抑制剂酶(截短的Taq—Stoffel片段)失去5-3外切活性，仅能用于普通PCR，无法进行荧光PCR。因此亟需发明一种新的提取/快速提取qPCR的方法。
发明内容
本发明的目的在于发明一种新的将PCR成分前置免提取扩增DNA的方法。
具体的，本发明的技术方案如下：
本发明第一个方面公开了一种PCR试剂，所述PCR试剂包括KOH、SDS、精氨酸、Brij-35、TritonX-100、尿素和DTT。
优选的，所述KOH的浓度为0.5-2M；
优选的，所述精氨酸的浓度为25-40mM；优选的，所述DTT的浓度为18-40mM；优选的，所述尿素的浓度为1-2M。
优选的，所述PCR试剂包括0.5-2M KOH、(5-15)％SDS、25-40mM精氨酸、(1-5)％Brij-35、(1-5)％TritonX-100、1-2M尿素和18-40mM DTT。
本发明第二个方面公开了一种PCR反应体系，所述PCR反应体系包括上述的PCR试剂。
优选的，所述PCR反应体系还包括盐、dNTPs和Taq酶。
更优选的，所述PCR反应体系还包括引物和荧光探针。
优选的，所述PCR反应体系中，KOH的终浓度为40-60mM；优选的，精氨酸的终浓度为0.5-2mM；优选的，所述尿素的终浓度为60-90mM；优选的，所述DTT的终浓度为0.5-2mM。
本发明第三个方面公开了一种包含上述PCR反应体系的产品；优选的，所述产品为试剂盒。
本发明第四个方面公开了一种PCR方法，所述方法包括使用上述的PCR试剂或上述的PCR反应体系进行反应，或使用上述的产品进行反应。
优选的，先将PCR试剂加入到样品中进行前置处理，然后再将PCR反应体系加入样品中继续处理，接着进行PCR反应；
优选的，所述样品为全血样品。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。
PCR中的一些添加剂对抑制剂有去除作用，当这些添加剂浓度较低时，不会抑制Taq酶，但对样本中的杂质也没有去除效果；当这些添加剂浓度较高时，会抑制Taq酶，同时也可以去除样本中的杂质。由此，本发明创新性的将PCR试剂的一部分成分以高浓度提前加入以处理样本，之后和处理后的样本同步稀释，以直接进行PCR。
本发明的方法中，通过稀释比例提高核酸纯度，同时由于不引入额外的胍盐、乙醇、异丙醇、Na+等抑制剂，所有成分浓度经测试均不会抑制PCR。
所述添加剂还包括精氨酸，精氨酸是一种含有胍基的氨基酸，呈强碱性，具有一定的裂解作用。
所述添加剂还包括SDS，SDS由于其对PCR的强抑制性，通常用于裂解液，而不会被用于PCR，本发明使用低浓度的SDS，确保其终浓度不超过0.005％。
通常PCR的主要成分包括Tris，K+(通常是KCl或KOAc)。本发明首次将K+用KOH的形式前置，在提供同等浓度K+的同时，使用碱裂解的方式对样本中的病毒或细菌进行裂解，同时也使样本中的蛋白类抑制剂变性失活。
本发明中将PCR中的这些成分等比例提高浓度，用于先行对样本进行提取，而后配制成反应液后稀释到普通PCR浓度。
本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：
(1)不在PCR体系中额外引入任何抑制PCR扩增的成分，包括胍盐、乙醇、异丙醇等。
(2)PCR核心组分前置，如果样本没有经过处理，无法扩增。例如典型的以气溶胶形式存在的质粒、PCR产物并不会获得扩增。
(3)利用本发明的方法扩增DNA，在前处理阶段无需对样本进行加热、离心处理，操作非常简便。
附图说明
图1为实施例1的实验结果图；
图2为实施例2的实验结果图；
图3为实施例3的实验结果图；
图4为实施例4的实验结果图(图中A为实验组，B为对照组1，C为对照组2)
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。
实施例1：
本实施例包含实验组和对照组实验。
一、实验组实验：
将2000IU/ml的HCMV血清(广州邦德盛生物BDS-BW-003，用阴性牛血清稀释120倍制备)加入9倍体积的如下表1所示的稀释液中，混匀后静置10min。
表1
取处理后的稀释液5μL，加入50μL 2x Direct PCR buffer，4U Taq酶，0.4μL上游引物(50μM母液)，0.4μL下游引物(50μM母液)，0.2μL探针(50μM母液)，1.5μL dNTP(25mM)，37μL去离子水，上机PCR，所述2x Direct PCR buffer成分如表2所示：
表2
所述上、下游引物及荧光探针依次为：
CMV-F：ACCCTGGTTGGTGGAGAAGA(SEQ ID NO：1)
CMV-R：GCCTGCCCCTGATGCA(SEQ ID NO：2)
CMV-P：FAM-CGCACCATGACCTGTTTGGGRAACTT-BHQ1(SEQ ID NO：3)
上机程序为：
95℃5min；95℃15s，60℃45s，40cycler。
PCR体系中各成分终浓度如下表3所示：
表3
二、对照组实验：
将2000IU/ml的HCMV血清加入9倍体积的PBS中稀释，混匀后静置10min。
取处理后的稀释液5μl，加入50μL 2x Normal PCR buffer，4U Taq酶，0.4μL上游引物(50μM母液)，0.4μL下游引物(50μM母液)，0.2μL探针(50μM母液)，1.5μL dNTP(25mM)，37μL去离子水，上机PCR，所述2x Normal PCR buffer如表4所示：
表4
所述上、下游引物及荧光探针为：
CMV-F：ACCCTGGTTGGTGGAGAAGA(SEQ ID NO：1)
CMV-R：GCCTGCCCCTGATGCA(SEQ ID NO：2)
CMV-P：FAM-CGCACCATGACCTGTTTGGGRAACTT-BHQ1(SEQ ID NO：3)
上机程序为：
95℃5min；95℃15s，60℃45s，40cycler。
PCR体系中各成分终浓度同实验组，如下表5所示：
表5
| 稀释液 | PCR体系中终浓度 |
| KCl | 50mM |
| 10％SDS | 0.001％ |
| 精氨酸 | 1.5mM |
| Brij-35 | 0.1％ |
| TX-100 | 0.1％ |
| 尿素 | 80mM |
| DTT | 1mM |
| MgCl2 | 4mM |
| 上游引物 | 200nM |
| 下游引物 | 200nM |
| 荧光探针 | 100nM |
| dNTPs | 400μM |
| Taq | 4U/100μL扩增体系 |
本实施例结果如图1所示，从图1中可以看出实验组的实验结果明显优于对照组。
实施例2
一、实验组实验：
将2000cp/ml的FPV病毒(某宠物医院惠赠，我公司自行以质粒标定浓度后，以阴性牛血清稀释至2000cp/ml)血清加入9倍体积的如下表6所示的稀释液中，混匀后静置10min。
表6
取处理后的稀释液5μL，加入50μL 2x Direct PCR buffer，4U Taq酶，0.4μL上游引物(50μM母液)，0.4μL下游引物(50μM母液)，0.2μL探针(50μM母液)，1.5μL dNTP(25mM)，37μL去离子水，上机PCR，所述2x Direct PCR buffer如下表7所示：
表7
所述上、下游引物及荧光探针为：
FPV-F：ACCAGCTGAGGTTGGTTATAGTG(SEQ ID NO:4)
FPV-R：TGGATCACCATCTGCTGCTT(SEQ ID NO:5)
FPV-P：FAM-CATTTAAAACACCTATTGCAGCAGGACGG-BHQ1(SEQ ID NO:6)
上机程序为：
95℃5min；95℃15s，60℃45s，40cycler。
PCR体系中各成分终浓度如下表8所示：
表8
对照组实验：
将2000cp/ml的FPV病毒血清(某宠物医院惠赠，我公司自行以质粒标定浓度后，以阴性牛血清稀释至2000cp/ml)加入9倍体积的PBS中稀释，混匀后静置10min。
取处理后的稀释液5μL，加入50μL 2x Normal PCR buffer，4U Taq酶，0.4μL上游引物(50μM母液)，0.4μL下游引物(50μM母液)，0.2μL探针(50μM母液)，1.5μL dNTP(25mM)，37μL去离子水，上机PCR，所述2x Normal PCR buffer如下表9所示：
表9
所述上、下游引物及荧光探针为：
FPV-F ACCCTGGTTGGTGGAGAAGA
FPV-R GCCTGCCCCTGATGCA
FPV-P FAM-CGCACCATGACCTGTTTGGGRAACTT-BHQ1
上机程序为：
95℃5min；95℃15s，60℃45s，40cycler。
PCR体系中各成分终浓度同实验组，见下表10：
表10
结果如图2所示，从图2中可以得出，实验组的实验结果优于对照组。对照组无扩增，说明成分前置起到了作用；本实施例确认对FPV病毒也是有效的。
实施例3
一、实验组实验：
将2000IU/ml的HCMV血清(广州邦德盛生物BDS-BW-003，用阴性牛血清稀释120倍制备)加入9倍体积的如下表11所示的稀释液中，混匀后静置10min。
表11
/>
取处理后的稀释液5μL，加入50μL 2x Direct PCR buffer，4U Taq酶，0.4μL上游引物(50μM母液)，0.4μL下游引物(50μM母液)，0.2μL探针(50μM母液)，1.5μL dNTP(25mM)，37μL去离子水，上机PCR，所述2x Direct PCR buffer如下表12所示：
表12
所述上、下游引物及荧光探针为：
CMV-F：ACCCTGGTTGGTGGAGAAGA(SEQ ID NO:1)
CMV-R：GCCTGCCCCTGATGCA(SEQ ID NO:2)
CMV-P：FAM-CGCACCATGACCTGTTTGGGRAACTT-BHQ1(SEQ ID NO:3)
上机程序为：
95℃5min；95℃15s，60℃45s，40cycler。
PCR体系中各成分终浓度如下表13所示：
表13
二、对照组实验：
将2000IU/ml的HCMV血清加入9倍体积的PBS中稀释，混匀后静置10min。
取处理后的稀释液5μL，加入50μL 2x Normal PCR buffer，4U Taq酶，0.4μL上游引物(50μM母液)，0.4μL下游引物(50μM母液)，0.2μL探针(50μM母液)，1.5μL dNTP(25mM)，37μL去离子水，上机PCR，所述2x Normal PCR buffer如表14所示：
表14
| 2xNormal PCR buffer中浓度 | PCR终浓度(100μl扩增体系) | |
| Tris-Cl pH 8.5 | 80mM | 40mM |
| KCl | 100mM | 50mM |
| MgCl2 | 8mM | 4mM |
| SDS | 0.001％ | 0.0005％ |
| 精氨酸 | 2mM | 1mM |
| Brij-35 | 0.2％ | 0.1％ |
| Triton X-100 | 0.2％ | 0.1％ |
| 尿素 | 160mM | 80mM |
| DTT | 2mM | 1mM |
| 上游引物 | 400nM | 200nM |
| 下游引物 | 400nM | 200nM |
| 荧光探针 | 200nM | 100nM |
| dNTPs | 800μM | 400μM |
| Taq | 8U/100μl扩增体系 | 4U/100μl扩增体系 |
所述上、下游引物及荧光探针为：
CMV-F：ACCCTGGTTGGTGGAGAAGA(SEQ ID NO:1)
CMV-R：GCCTGCCCCTGATGCA(SEQ ID NO:2)
CMV-P：FAM-CGCACCATGACCTGTTTGGGRAACTT-BHQ1(SEQ ID NO:3)
上机程序为：
95℃5min；95℃15s，60℃45s，40cycler。
PCR体系中各成分终浓度同实验组，如表15所示：
表15
结果如下图3所示，从图中可以看出对照组无扩增，说明成分前置起到了作用。
本实施例和实施例1的区别在于，验证降低SDS和精氨酸仍然可以起到作用，但有一个重复曲线已经压到很低，已接近临界的检出能力，故不进行进一步的低浓度测试。
实施例4
一、实验组实验如下：
将120000、12000、1200IU/ml的HCMV全血(广州邦德盛生物BDS-BW-003，用阴性猪抗凝稀释制备)加入9倍体积的如下表16所示的稀释液中，混匀后静置10min。
表16
取处理后的稀释液5μL，加入50μL 2x Direct PCR buffer，4U Taq酶，0.4μL上游引物(50μM母液)，0.4μL下游引物(50μM母液)，0.2μL探针(50μM母液)，1.5μL dNTP(25mM)，37μL去离子水，上机PCR，所述2x Direct PCR buffer如下表17所示：
表17
| 2xDirect PCR buffer中浓度 | PCR终浓度(100μl扩增体系) | |
| Tris-Cl pH 8.5 | 80mM | 40mM |
| MgCl2 | 8mM | 4mM |
| 上游引物 | 400nM | 200nM |
| 下游引物 | 400nM | 200nM |
| 荧光探针 | 200nM | 100nM |
| dNTPs | 800μM | 400μM |
| Taq | 8U/100μl扩增体系 | 4U/100μl扩增体系 |
所述上、下游引物及荧光探针为：
CMV-F：ACCCTGGTTGGTGGAGAAGA(SEQ ID NO:1)
CMV-R：GCCTGCCCCTGATGCA(SEQ ID NO:2)
CMV-P：FAM-CGCACCATGACCTGTTTGGGRAACTT-BHQ1(SEQ ID NO:3)
上机程序为：
95℃5min；95℃15s，60℃45s，40cycler。
PCR体系中各成分终浓度如下表18所示：
表18
二、对照组1(磁珠法试剂)：
使用商品化的济凡生物的磁珠法病毒提取试剂盒(Cat.FMY502T5)、Takara qPCR预混液(Cat.RR064A)，参考RR064A说明书的程序95℃10s；95℃5s，60℃20s，40cycler进行扩增，引物、探针同实验组。
对照组2(Bioline直接扩增)：
使用美国bioline的直扩试剂盒(MDX016)，扩增程序为95℃2min，95℃5s，60℃20s，40cycler，引物、探针同实验组。
实验结果如图4所示，从图中可以看出实验组可以全部检出。
从实施例1-4可以得出，本发明的方法基于稀释和变性蛋白提高纯度，对于全血这样的复杂样本，反而更优，而一些市售磁珠法试剂对全血的支持并不佳，本发明的方法在复杂样本检测时有一定价值。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖南冠牧生物科技有限公司
<120> PCR反应体系、试剂盒和PCR方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
accctggttg gtggagaaga 20
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcctgcccct gatgca 16
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgcaccatga cctgtttggg raactt 26
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
accagctgag gttggttata gtg 23
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tggatcacca tctgctgctt 20
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
catttaaaac acctattgca gcaggacgg 29
Claims (5)
1.一种PCR反应体系，其特征在于，所述PCR反应体系包括PCR试剂、MgCl2、上游引物、下游引物、荧光探针、dNTPs和Taq，所述PCR反应体系中不包括KCl；
其中，所述PCR试剂由0.5-2M KOH、(5-15)％SDS、25-40mM精氨酸、(1-5)％Brij-35、(1-5)％TritonX-100、1-2M尿素和18-40mM DTT组成；
在所述PCR反应体系中，KOH的终浓度为40-60mM，SDS的终浓度不超过0.005％，精氨酸的终浓度为0.5-2mM，Brij-35的终浓度为0.1％，TritonX-100的终浓度为0.1％，尿素的终浓度为60-90mM，DTT的终浓度为0.5-2mM。
2.一种包含权利要求1所述PCR反应体系的产品。
3.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述产品为试剂盒。
4.一种PCR方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1所述的PCR反应体系进行反应，或使用权利要求2或3所述的产品进行反应；
其中，先将PCR试剂加入到样品中进行前置处理，获得含有所述PCR试剂的样品-稀释液混合液，然后再将所述样品-稀释液混合液加入含有MgCl2、上游引物、下游引物、荧光探针、dNTPs和Taq的PCR反应液中继续处理，接着进行PCR反应。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述样品为全血样品。
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