CN114480573A - 一种dna直接扩增试剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种DNA直接扩增试剂及其应用。具体地说，本发明提供了一种核酸释放剂，包含多铵、N,N‑二甲基甲酰胺、酒石酸和Brij 30等。本发明还提供了一种直接扩增试剂，包含硫酸铵、BSA、DNA聚合酶和聚(4‑苯乙烯磺酸‑共聚‑马来酸)钠盐等。本发明还提供了包括用于配制所述核酸释放剂和/或直接扩增试剂的试剂的试剂盒和采用所述试剂盒对生物样本的DNA进行定量或定性分析的方法。本发明可以对多样本中的DNA进行荧光定量PCR的直接扩增技术。本发明可以在室温条件下快速、有效释放液体样本的DNA，固体组织样本也无需过夜消化并进行核酸提取，所得粗样本可直接用于PCR扩增，无需核酸提取步骤，大大提高了检测效率。

Description

一种DNA直接扩增试剂及其应用
技术领域
本发明涉从粗样本直接扩增核酸，尤其涉及从多种样本中直接扩增DNA的试剂及其应用。
背景技术
分子直扩又称Direct PCR技术或免提取扩增技术，它能够将原始未经DNA提取与纯化的样本直接加入PCR反应体系并获得扩增产物，减少检验步骤，降低检验成本，是PCR技术的一种。在该项技术出现之前，样品的预处理是科研人员难以避免并头疼的一项工作，动植物组织样本的研磨、核酸的提取与纯化步骤多、时间长，不仅容易造成样本的交叉污染、降解，还会增加实验的试剂、仪器和时间成本。
对于生物样本快速高效检验而言，分子直扩无疑是一个巨大的革命性进步。然而，实际应用过程中发现，采用传统的直接扩增试剂并不能得到理想的实验结果。其主要的原因是生物样本通常伴随着大量的PCR抑制剂释放至PCR体系中，使DNA聚合酶活性降低或者失活，从而严重降低PCR效率甚至导致假阴性结果的产生。研究人员建立通过添加不同PCR增强剂或使用具有抗抑制能力的聚合酶配合多种不同直接扩增试剂体系，很多商业化直接扩增试剂也先后被推出并应用于实践。随着技术的不断演进和发展，分子直扩已经实现了第一代PCR的直接扩增，但是对基于第二代荧光定量PCR的直扩技术还未有深入研究和突破。
中国专利CN 112662779 A公开了一种直接扩增检测口腔肿瘤基因生存相关的引物组、试剂盒及其方法，虽然流程已经减少，但是依然需要对组织样本进行蛋白酶K消化和过柱纯化等步骤。
中国专利CN113444771A公开了一种适合DNA或RNA病毒直接扩增的裂解剂、试剂盒及其在病毒PCR检测中的应用，其本质是发明了一种对于病毒样本的裂解试剂，只能处理拭子、病毒培养物等较为简单的样本，且其裂解剂组分主要为Tris-HCl、离液盐、表面活性剂、还原剂、EDTA及RNA酶抑制剂Rnasin，我们清楚地知道商品化qPCR Mix大都不能耐受离液盐、还原剂和EDTA，因此其发明的裂解剂应用领域将非常受限。
综上所述，虽然现有技术中不能提供完整的方案或方法能解决多种类型样本(血液、唾液、拭子、动物组织和植物组织等)的基于第二代荧光定量PCR的DNA直接扩增的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以对多样本中的DNA进行荧光定量PCR的直接扩增技术。本发明的方案包含一种针对多种生物类型样本的核酸释放剂和2X Direct qPCRMaster Mix。
本发明在第一方面提供了一种核酸释放剂，所述核酸释放剂可以快速释放多种生物类型样本中的DNA且去除绝大部分PCR抑制剂。
具体地说，本发明的核酸释放剂包含：多铵、还原剂、N,N-二甲基甲酰胺、酒石酸、十二烷基二苯醚二磺酸钠、Brij 30和水。
优选的是，所述核酸释放剂包含：10-200mM多铵、1-10mM还原剂、1-20％N,N-二甲基甲酰胺、0.1-10mM酒石酸、0.01-0.5％的十二烷基二苯醚二磺酸钠、0.01-5％Brij 30和余量的水。
优选的是，所述核酸释放剂包含：20-100mM多铵、2-5mM还原剂、2-10％N,N-二甲基甲酰胺、0.2-5mM酒石酸、0.02-0.2％的十二烷基二苯醚二磺酸钠、0.05-2％的Brij 30和余量的水。
更优选的是，所述核酸释放剂包含：50mM多铵、2mM还原剂、5％N,N-二甲基甲酰胺、1mM酒石酸、0.15％的十二烷基二苯醚二磺酸钠、1.5％的Brij 30和余量的水。
优选的是，所述核酸释放剂的pH为10.0-13.5，优选为10.5-12.5，更优选为12.0。
优选的是，所述多铵为三亚乙基四胺或二亚乙基三胺和/或其组合。
优选的是，所述还原剂为二硫苏糖醇、TCEP-HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)、巯基乙醇、半胱氨酸、维生素C、连二亚硫酸盐、巯基乙酸和/或其组合。
在本发明的核酸释放剂中，所述多铵提供了一种较强的碱性环境，在阴离子表面活性剂十二烷基二苯醚二磺酸钠和非离子表面活性剂Brij 30(CAS：9002-92-0)的作用下，可以快速裂解细胞释放DNA，并且多铵可以快速结合细胞中的蛋白杂质，如血红蛋白、抗体等，使其不会抑制DNA聚合酶的活性。
所述N,N-二甲基甲酰胺增加了细胞的通透性，可以使多铵和表面活性剂快速裂解细胞成为可能。
所述的酒石酸可以螯合金属离子，抑制细胞裂解后释放的核酸酶活性，以减少DNA的降解。
所述还原剂可以破坏细核酸酶的二硫键，减弱其活性，与酒石酸配合可以抑制超过90％的DNA酶的活性。
优选的是，所述还原剂和酒石酸的组合可以抑制超过99％的DNA酶的活性。
所述十二烷基二苯醚二磺酸钠是一种高性能的阴离子表面活性剂，在强碱溶液中表现出非常好的稳定性，可以在室温下裂解细胞，并变性蛋白质，令人意料不到的是，在弱碱性条件下，十二烷基二苯醚二磺酸钠与Brij30相互作用能快速裂解细胞，释放DNA至溶液中。
所述Brij 30是一种非离子表面活性剂，可以与十二烷基二苯醚二磺酸钠配合在弱碱性下快速裂解细胞释放核酸，并且Brij 30是一种对PCR影响较小的非离子表面活性剂，不会对下游扩增反应产生影响。
在一些更具体的实施方式中，本发明公开了一种可以快速释放多种生物类型样本中的DNA且去除绝大部分抑制剂的核酸释放剂，所述的核酸释放剂由以下组成：50mM多铵、2mM还原剂、5％N,N-二甲基甲酰胺、1mM酒石酸、0.15％的十二烷基二苯醚二磺酸钠、1.5％Brij 30，余量的水，样本释放剂的pH为12.0。
所述的多铵为三亚乙基四胺或二亚乙基三胺和/或其组合。
所述还原剂为二硫苏糖醇、TCEP-HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)和/或其组合。
本发明在第二方面提供了一种可以使用上述粗样本的直接扩增试剂，其中所述直接扩增试剂(2X Direct qPCR Master Mix)包含：Tris-HCl，硫酸铵，dNTPs，BSA，MgCl2，耐受型热启动DNA聚合酶和聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)钠盐。
优选的是，所述直接扩增试剂包含：10-200mM Tris-HCl，10-100mM硫酸铵，100-500μM的dNTPs，100-800μg/mL的BSA，1-10mM的MgCl2，1-5U的耐受型热启动DNA聚合酶和0.1-10mM的聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)钠盐。
更优选的是，所述直接扩增试剂包含如下物质：20-100mM Tris-HCl，20-80mM硫酸铵，200-400μM的dNTPs，200-500μg/mL的BSA，2-6mM的MgCl2，2-5U的耐受型热启动DNA聚合酶和1-5mM的聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)钠盐。
优选的是，所述聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)钠盐的分子量为20000；更优选的是，在聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)钠盐中，苯乙烯磺酸单元与马来酸单元的摩尔比为3:1。
所述BSA可以中和粗样本中的血红蛋白等杂质，聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)钠盐可以结合变性的血红蛋白、抗体等抑制PCR抑制剂，使其不再抑制DNA聚合酶的活性。
在一些具体的实施方式中，所述直接扩增的试剂包含：50mM Tris-HCl，40mM硫酸铵，300μM的dNTPs，300μg/mL的BSA，2mM的MgCl2，2U的耐受型热启动DNA聚合酶和2.5mM的聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)钠盐。
所述耐受型热启动DNA聚合酶可以为JumboTM Taq Hot-Start DNA Polymerase，该DNA聚合酶经过定向改造，具有较强的抗抑制性和高灵敏度的特点。
本发明在第三方面提供了一种使用本发明第一方面所述的核酸释放剂和/或本发明第二方面所述的直接扩增试剂对生物样本中的DNA进行定量或定性分析的方法。
优选的是，所述方法包括如下步骤：
(1)向生物样本中加入核酸释放剂，利用所述核酸释放剂从所述生物样本中释放出核酸，从而制得粗样本；
(2)向所述粗样本中加入直接扩增试剂，然后加入相应检测靶标的引物和探针，获得反应工作液；
(3)利用所述反应工作液通过定量PCR方法进行定量或定性分析；
其中，所述核酸释放剂为本发明第一方面所述的核酸释放剂；和/或所述直接扩增试剂为本发明第二方面所述的直接扩增试剂。
优选的是，在步骤(2)中，释放后的粗样本体积占反应工作液(即整个扩增反应液)的体积的5-40％，更优选为10-30％。
优选的是，所述生物样本为液体样本；更优选的是，所述液体样本选自由全血、唾液、血浆、血清和拭子洗脱液中的一种。
另外优选的是，所述固体组织样本为来自生物(例如动物、植物或微生物)或者包含生物组织的至少一种。
优选的是，在所述生物样本为液体样本的情况下，可以通过如下方式获得粗样本：取20-50μL的液体样本，然后加入等体积的核酸释放剂，在室温混合均匀(例如通过涡旋振荡)，静置1min。
优选的是，在所述生物样本为固体组织样本的情况下，可以通过如下方式获得粗样本：1-10mg的固体组织样本，然后加入50-200μL的核酸释放剂，在室温混合均匀(例如通过涡旋振荡)，在90℃加热5-20min，恢复至室温。
优选的是，在步骤(2)中，可以向粗样本加入直接扩增试剂，然后加入相应检测靶标的引物和探针，取水尤其是去离子水补足体积至直接扩增试剂的两倍体积，获得反应工作液，即，所述直接扩增试剂以两倍浓度添加(即2X Direct qPCR Master Mix)，并且反应工作液的体积为直接扩增试剂的两倍体积。
在一些更具体的实施方式中，所述方法包括如下步骤：
(1)在所述生物样本是液体样本(全血、唾液、血浆、血清或拭子洗脱液)的情况下，取20-50μL，加入等体积的核酸释放剂，室温涡旋混合均匀，静置1min，获得液体来源粗制样本；在所述生物样本为固体组织样本的情况下，取固体组织样本1-10mg，加入50-200μL的所述核酸释放剂，在室温涡旋混合均匀，然后在90℃加热5-20min，恢复至室温，获得固体来源粗制样本；
(2)取所述粗样本加入直接扩增试剂(2X Direct qPCR Master Mix)，加入相应检测靶标的引物和探针，取去离子水补足体积使2X Direct qPCR Master Mix稀释成1X反应工作液；
(3)使用qPCR仪进行定量分析。
本发明在第四方面还提供了一种直接扩增检测试剂盒，所述试剂盒包括：
(1)用于配制本发明第一方面所述的核酸释放剂的试剂；和/或
(2)用于配制本发明第二方面所述的直接扩增试剂的试剂。
使用本发明的核酸释放剂和直接扩增试剂处理全血、血清、血浆、拭子、组织等样本，体液样本能在室温条件下快速、有效释放DNA，组织样本也无需过夜消化并进行核酸提取，裂解后的粗样本可直接用于qPCR扩增，无需核酸提取步骤，大大提高了检测效率。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请进行进一步的介绍。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。不同实施例之间可以替换或者合并组合，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些实施例获得其他的实施方式。
实施例
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
制备例1
本制备例提供了一种核酸释放剂，其由组成如下：50mM三亚乙基四胺、2mM TCEP-HCl、5％N,N-二甲基甲酰胺、1mM酒石酸、0.15％的十二烷基二苯醚二磺酸钠、1.5％Brij 30和余量的水，使用氢氧化钠将pH调节至pH为12.0。
制备例2
本制备例提供了一种可以使用粗样本直接扩增的直接扩增试剂(2XDirect qPCRMaster Mix)，其包含如下组分：50mM Tris-HCl，40mM硫酸铵，300μM的dNTPs，300μg/mL的BSA，2mM的MgCl2，2U的JumboTM Taq Hot-Start DNA Polymerase和2.5mM的聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)钠盐。其中，聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)钠盐的分子量为20000，并且其中所含的苯乙烯磺酸单元与马来酸单元的摩尔比为3:1。
实施例1：口腔拭子、唾液样本基因组的DNA进行直接扩增和核酸提取后扩增对比
受试者当天采取口腔拭子和唾液样本，口腔拭子使用植绒拭子刮取后分散于1mL的生理盐水中，重悬后待用。唾液样本使用生理盐水1:1进行稀释后混匀待用。
核酸提取试剂选用QIAamp DNA Micro Kit(凯杰公司，Cat#56304)，样本使用200μL进行核酸提取，最后使用200μL Buffer AE进行洗脱，得到核酸提取产物。另外，采用制备例1制得的核酸释放剂，取50μL样本(拭子重悬液或唾液稀释样本)加入50μL制备例1制得的核酸释放剂，涡旋混匀1min后得到用于直接扩增的粗样本(简称直接扩增粗样本)待用。核酸提取产物和直接扩增粗样本都使用制备例2的提供的2X Direct qPCR Master Mix进行测试，选用RNase P内参基因进行扩增，选用ABI 7500Fast进行定量，样本上样量都取4μL模版进行测试。
所使用到的引物和探针如下表所示：
Rnase P-F TAGAAATAAGAGGGCCATATGACGT
Rnase P-R AGCCTTGGCGTCACTTTCAG
Rnase P-探针 CAAATCTAGGCTTGCTGTTTGGGCTCA(5'VIC；3'BHQ1)
qPCR反应体系如下表所示：
组分 体积(μL)
2X Direct qPCR Master Mix(制备例1制得) 10
引物RNase P-F(10μM) 0.5
引物RNase P-R(10μM) 0.5
探针RNase P-P(10μM) 0.5
去离子水 4.5
模版 4
总体积 20
扩增程序：
Figure BDA0003447531650000081
检测结果如下表所示：
表1.口腔拭子和唾液基因组DNA直接扩增与核酸提取对比
样本 直接扩增粗样本(Ct) Qiagen核酸提取产物(Ct)
受试者1-拭子 24.6 24.9
受试者2-拭子 25.9 25.6
受试者3-拭子 23.3 24.1
受试者4-拭子 25.4 24.8
受试者5-拭子 24.9 24.1
受试者6-唾液 23.1 22.7
受试者7-唾液 24.5 24.0
受试者8-唾液 22.9 22.8
受试者9-唾液 23.1 23.9
受试者10-唾液 22.1 21.2
结果如表1所示。从表1可以看出，经核酸释放剂处理的拭子样本和唾液样本中的基因组DNA与经过核酸提取的DNA产物通过荧光定量PCR检测Ct值差距小于1个，可以用于相对准确的定量检测和分析。
实施例2：血液样本中非洲猪瘟病毒DNA的直接扩增和核酸提取后扩增对比
取阳性和阴性的非洲猪瘟的血液样本，核酸提取试剂选用QIAamp DNA Micro Kit(凯杰公司，Cat#56304)，样本使用200μL进行核酸提取，最后使用200μL Buffer AE进行洗脱，得到核酸提取产物。用于直接扩增的核酸释放剂选用制备例1所制得的核酸释放剂，取50μL样本加入50μL制备例1的核酸释放剂，涡旋混匀1min后得到直接扩增粗样本待用。核酸提取后的产物和直接扩增粗样本都使用制备例2提供的2X Direct qPCR Master Mix进行测试，扩增程序参考实施例1，选用ABI 7500Fast进行定量，样本上样量都取4μL模版进行测试。非洲猪瘟的引物和探针序列如下：
引物：ASFV-PF205：5′-ACTACGGAGGCAATTCGATTA-3′
ASFV-PR285：5′-GTTAATATGACCACTGGGTTGGTA-3′
探针：ASFV-Pb229：5′-CCCCCGATGATCCGGGTGCG-3′
检测结果如下表所示：
表2.血液样本中非洲猪瘟病毒DNA直接扩增与核酸提取对比
样本 直接扩增粗样本(Ct) Qiagen核酸提取产物(Ct)
样本1 27.5 26.7
样本2 33.4 34.5
样本3(阴性) 未检出 未检出
样本4 31.2 32.4
样本5 26.7 25.8
样本6 29.4 30.4
样本7 26.9 27.4
样本8 33.9 34.4
结果发现，直接扩增粗样本的Ct值和Qiagen核酸提取产物的提取结果基本一致，两者检出率基本一致。
实施例3：组织样本基因组DNA的直接扩增和核酸提取产物扩增对比
取人类切片肿瘤组织3份，每份样本都用切片机均分成2片，先在1mL二甲苯溶液中进行脱蜡处理，使用无水乙醇清洗3次后，晾干。其中一片使用核酸提取试剂QIAamp DNAMicro Kit(凯杰公司，Cat#56304)进行核酸提取，最后使用200μL Buffer AE进行洗脱。另一片可用于直接扩增的核酸释放剂选用制备例1，1片加入50μL制备例1的核酸释放剂，涡旋混匀，90℃加热处理10min后得到粗样本待用。核酸提取产物和直接扩增粗样本都使用制备例2提供的2X Direct qPCR Master Mix进行测试，选用RNase P内参基因进行扩增，选用ABI 7500Fast进行定量，样本上样量都取4μL模版进行测试(引物和探针与实施例1的相同)。结果如下表所示。
表3.组织样本基因组DNA直接扩增与核酸提取对比
样本 直接扩增粗样本(Ct) Qiagen核酸提取产物(Ct)
组织切片1号 25.6 26.1
组织切片2号 28.7 28.4
组织切片3号 25.6 24.9
从表3的结果可以看出，经核酸释放剂处理的组织样本中的基因组DNA与经过核酸提取的DNA产物通过荧光定量PCR检测Ct值差距小于1个，可以用于相对准确的定量检测和分析。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上介绍仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州白垩纪生物科技有限公司
<120> 一种DNA直接扩增试剂及其应用
<130> GY21101101
<160> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tagaaataag agggccatat gacgt 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agccttggcg tcactttcag 20
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caaatctagg cttgctgttt gggctca 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cccccgatga tccgggtgcg 20

Claims (10)

1.一种核酸释放剂，其特征在于，所述核酸释放剂包含：多铵、还原剂、N,N-二甲基甲酰胺、酒石酸、十二烷基二苯醚二磺酸钠、Brij 30和水。
2.根据权利要求1所述的核酸释放剂，其特征在于：
所述核酸释放剂包含：10-200mM多铵、1-10mM还原剂、1-20％N,N-二甲基甲酰胺、0.1-10mM酒石酸、0.01-0.5％的十二烷基二苯醚二磺酸钠、0.01-5％Brij 30和余量的水；优选的是，所述核酸释放剂的pH为10.0-13.5；
另外优选的是，所述核酸释放剂包含：20-100mM多铵、2-5mM还原剂、2-10％N,N-二甲基甲酰胺、0.2-5mM酒石酸、0.02-0.2％的十二烷基二苯醚二磺酸钠、0.05-2％的Brij 30和余量的水；更优选的是，所述核酸释放剂的pH为10.5-12.5；
另外优选的是，所述核酸释放剂包含：50mM多铵、2mM还原剂、5％N,N-二甲基甲酰胺、1mM酒石酸、0.15％的十二烷基二苯醚二磺酸钠、1.5％的Brij 30和余量的水；更优选的是，所述核酸释放剂的pH为12.0。
3.根据权利要求1或2所述的核酸释放剂，其特征在于：
所述多铵为三亚乙基四胺或二亚乙基三胺和/或其组合；和/或
所述还原剂为二硫苏糖醇、TCEP-HCl(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)、巯基乙醇、半胱氨酸、维生素C、连二亚硫酸盐、巯基乙酸和/或其组合。
4.一种直接扩增试剂，其特征在于，所述直接扩增试剂包含：Tris-HCl，硫酸铵，dNTPs，BSA，MgCl2，耐受型热启动DNA聚合酶和聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)钠盐。
5.根据权利要求4所述直接扩增试剂，其特征在于：
所述直接扩增试剂包含：10-200mM Tris-HCl，10-100mM硫酸铵，100-500μM的dNTPs，100-800μg/mL的BSA，1-10mM的MgCl2，1-5U的耐受型热启动DNA聚合酶和0.1-10mM的聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)钠盐；
优选的是，所述直接扩增试剂包含如下物质：20-100mM Tris-HCl，20-80mM硫酸铵，200-400μM的dNTPs，200-500μg/mL的BSA，2-6mM的MgCl2，2-5U的耐受型热启动DNA聚合酶和1-5mM的聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)钠盐；
更优选的是，所述直接扩增的试剂包含：50mM Tris-HCl，40mM硫酸铵，300μM的dNTPs，300μg/mL的BSA，2mM的MgCl2，2U的耐受型热启动DNA聚合酶和2.5mM的聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)钠盐。
6.根据权利要求4或5所述的直接扩增试剂，其特征在于：
所述聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)钠盐的分子量为20000；
优选的是，在聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸)钠盐中，苯乙烯磺酸单元与马来酸单元的摩尔比为3:1；
另外优选的是，所述耐受型热启动DNA聚合酶为JumboTM Taq Hot-Start DNAPolymerase。
7.一种对生物样本的DNA进行定量或定性分析的方法，其特征在于：
所述方法使用权利要求1至3中任一项所述的核酸释放剂制备待检测样本；和/或
所述方法采用权利要求4或5所述的直接扩增试剂通过PCR扩增来对所述生物样本中的DNA进行定量或定性分析。
8.一种对生物样本的DNA进行定量或定性分析的方法，其特征在于：
所述方法包括如下步骤：
(1)向生物样本中加入核酸释放剂，利用所述核酸释放剂从所述生物样本中释放出核酸，从而制得粗样本；
(2)向所述粗样本中加入直接扩增试剂，然后加入相应检测靶标的引物和探针，获得反应工作液；
(3)利用所述反应工作液通过定量PCR方法进行定量或定性分析；
其中，所述核酸释放剂为权利要求1至3中任一项所述的核酸释放剂；和/或所述直接扩增试剂为权利要求4或5所述的直接扩增试剂；
优选的是，所述粗样本的体积占所述反应工作液的体积的5-40％，更优选为10-30％。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：
所述生物样本为液体样本，优选的是，所述液体样本选自由全血、唾液、血浆、血清和拭子洗脱液中的一种；更优选的是，在步骤(1)中，通过如下方式获得粗样本：取20-50μL的液体样本，然后加入等体积的所述核酸释放剂，在室温混合均匀并静置，获得所述粗样本；
另外优选的是，所述生物样本为固体组织样本；优选的是，在所述生物样本为固体组织样本的情况下，通过如下方式获得粗样本：取1-10mg的固体组织样本，然后加入50-200μL的所述核酸释放剂，在室温混合均匀，在90℃加热5-20min，恢复至室温，获得所述粗样本。
10.一种直接扩增检测试剂盒，所述试剂盒包括：
(1)用于配制权利要求1至3中任一项所述的核酸释放剂的试剂；和/或
(2)用于配制权利要求4至6中任一项所述的直接扩增试剂的试剂。
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