CN109652520B - 检测在dna甲基化检测中亚硫酸氢盐处理dna的转化效率的组合物 - Google Patents

检测在dna甲基化检测中亚硫酸氢盐处理dna的转化效率的组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于检测在DNA甲基化检测中亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的组合物，所述组合物包括参考品核酸，以及用于检测参考品核酸的引物和探针。本发明还提供了一种用于检测在DNA甲基化检测中亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的方法。通过本发明的方法，能够有效准确地检测在DNA甲基化检测中亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率，尤其能够帮助发现转化时间不足、转化温度过低、转化试剂过效期等转化过程中可能发生的问题。

Description

检测在DNA甲基化检测中亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的组 合物
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于检测在DNA甲基化检测中亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的组合物，本发明还涉及一种用于检测在DNA甲基化检测中亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的方法及其试剂盒。
背景技术
DNA甲基化是表观遗传学的一种调控机制。通过对基因组序列特定区域内CpG碱基组合中的胞嘧啶进行甲基化修饰，生成5-甲基胞嘧啶，DNA胞嘧啶的甲基化修饰在基因表达调控、基因组印记、胚胎发育、维持正常细胞功能以及疾病发生过程中都起着极其重要的表观调控作用。
由于甲基化DNA中的5-甲基胞嘧啶与非甲基化DNA中的胞嘧啶具有相同的碱基配对特性，因此无法直接使用基于碱基配对的技术(例如DNA杂交、PCR等)检测甲基化DNA。因此，当前的DNA甲基化分析中，用于检测甲基化DNA的主要技术都是基于亚硫酸氢盐转化(bisμlfite conversion)，即：亚硫酸氢盐与非甲基化的胞嘧啶发生特异生化反应，经过随后的碱性水解，非甲基化的胞嘧啶被转变为尿嘧啶；而5-甲基胞嘧啶在相同条件下不发生变化。因此，初始DNA序列中不能区分的胞嘧啶和5-甲基化胞嘧啶，在经亚硫酸氢盐转化之后，能够被基于DNA杂交或PCR的分子生物学技术检测到。
利用亚硫酸氢盐转化检测DNA甲基化的关键是保证亚硫酸氢盐转化为非甲基化的胞嘧啶进行完全，既：保证DNA中非甲基化的胞嘧啶在亚硫酸氢盐处理后，全部或基本全部变为尿嘧啶。胞嘧啶转化不完全会导致后续检测的不准确，导致错误的假阳性加过。在实际检测工作中，由于一方面需要简化流程、缩短检测过程所需时间，另一方面需要保证亚硫酸氢盐转化完全，这对实验流程的可靠性有较高的要求，如：转化时间、转化温度、转化试剂活性等。检测过程中的实验条件的不稳定对亚硫酸氢盐转化有很大的影响。
申请号为CN201610015862.0的发明专利申请公开了一种通过使用核酸标准品浓度梯度和标准曲线绝对定量的方式评估亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的方法。该方法由于使用浓度梯度，需要的检测工作量大；同时，该方法使用SYBER GREEN试剂进行PCR检测，易于受到非特异产物的影响；此外，该方法无法与待测样本在一个PCR体系中进行，因此无法对待检测样本的亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率进行最可靠的评估。
此外，使用焦磷酸测序技术能够直接对亚硫酸氢盐处理后DNA的PCR产物进行测序检测，并对亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率进行测定。但是焦磷酸测序设备昂贵，大多数分子生物学实验室不具备焦磷酸测序设备，而且送检既不方便，也不经济。但是，大多数分子生物学实验室都拥有实时定量PCR仪，因此，基于PCR的亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的测定技术更有实际应用的价值。
因此，当前对检测在DNA甲基化检测中亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的简单、可靠地方法存在需求。
发明内容
基于此，本发明的目的是针对在DNA甲基化检测中亚硫酸氢盐处理DNA这一步骤，提供了一种用于检测亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的组合物，本发明还提供了用于检测在DNA甲基化检测中亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的方法及其试剂盒。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于检测在DNA甲基化检测中亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的组合物，所述组合物包括至少一种用于检测亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的参考品核酸，和用于检测参考品核酸的引物和探针；
其中，所述参考品核酸的长度为80-120bp，仅包含1-5个胞嘧啶，并且所述胞嘧啶位于长度为1-35bp的第一片段内；
优选地，所述参考品核酸仅包含3个胞嘧啶，并且所述胞嘧啶位于长度为3-20bp的第一片段内；
更优选地，在所述参考品核酸中还存在通过用鸟嘌呤替换所述第一片段的胞嘧啶而形成的另一片段；
优选地，所述参考品核酸包含等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核酸片段及其互补序列。
优选地，所述参考品核酸如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示；
优选地，参考品核酸的亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率可以通过PCR检测。
优选地，用于检测SEQ ID NO:1的引物和探针如SEQ ID NO:3-6中任一项所示；
引物F:
SEQ ID NO:3：GGTTGGTGAGAGGGATGGTGAT
引物R:
SEQ ID NO:4：CTTCTCTCACCAACCACACCCA
探针P1:
SEQ ID NO:5：AAGTAATGGGTTTAGGTAAAGTTAGATAG
探针P2:
SEQ ID NO:6：AAGTAATGGGCTTAGGCAAAGCTAGATAG
优选地，用于检测SEQ ID NO:2的引物和探针如SEQ ID NO:3-5和7中任一项所示；
引物F:
SEQ ID NO:3：GGTTGGTGAGAGGGATGGTGAT
引物R:
SEQ ID NO:4：CTTCTCTCACCAACCACACCCA
探针P1:
SEQ ID NO:5：AAGTAATGGGTTTAGGTAAAGTTAGATAG
探针P3:
SEQ ID NO:7：CTATCTACCTTTCCCTAACCCCATTACTT
根据本发明的第二个方面，提供了包括所述组合物的试剂盒。
根据本发明的第三个方面，提供了一种用于检测在DNA甲基化检测中亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的方法，所述方法包括以下步骤：
1)在待检测的样品DNA中加入参考品核酸；
其中，所述参考品核酸的长度为80-120bp，仅包含1-5个胞嘧啶，并且所述胞嘧啶位于长度为1-35bp的第一片段内；
优选地，所述参考品核酸仅包含3个胞嘧啶，并且所述胞嘧啶位于长度为3-20bp的第一片段内；
更优选地，在所述参考品核酸中还存在通过用鸟嘌呤替换所述第一片段的胞嘧啶而形成的另一片段；
更优选地，所述参考品核酸包含等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的DNA片段及其互补序列；
优选地，所述参考品核酸如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示；
其中，所述参考品核酸的加入量为103-105拷贝/μl样品DNA，优选地为104拷贝/μl样品DNA；
2)使用亚硫酸氢盐处理步骤1)得到的待检测的样品DNA和参考品核酸的混合物；
3)扩增步骤2)得到的产物中的参考品核酸，并使用探针检测，获得样品DNA中亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率。
优选地，在步骤3)中，将步骤2)得到的产物与扩增酶和引物以及探针接触，使得所述产物中参考品核酸被扩增，并使用探针检测扩增产物；基于所述扩增产物的Ct值，检测亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率。
典型的引物包括等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的DNA片段及其互补序列。
检测亚硫酸氢盐转化如SEQ ID NO:1所示的参考品核酸的探针包括等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的DNA片段及其互补序列；检测亚硫酸氢盐转化如SEQ ID NO:2所示的参考品核酸的探针包括等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7的DNA片段及其互补序列。
并且，所述接触或扩增包括至少一种选自如下的方法：使用耐热DNA聚合酶作为所述扩增酶、使用缺乏5’-3’外切酶活性的聚合酶、使用聚合酶链式反应(PCR)、产生带有可检测标记的扩增产物核酸分子。
优选地，所述亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率由使用不同的探针检测步骤2)处理后的参考品核酸的循环阈值Ct值来确定；
优选地，对于如SEQ ID NO:1所示的参考品核酸，所述亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率使用如下的计算公式确定：
亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率＝探针P1检测的DNA量/(探针P1检测的DNA量+探针P2检测的DNA量)＝2-Ct(P1)/(2-Ct(P1)+2-Ct(P2))×100；
优选地，对于如SEQ ID NO:2所示的参考品核酸，所述亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率使用如下的计算公式确定：
亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率＝探针P1检测的DNA量/探针P3检测的DNA量＝2-Ct(P1)/2-Ct(P3)×100。
根据某些优选实施方式，所述参考品核酸是由聚合酶链式反应的循环阈值Ct值来确定的。
通过本发明的方法，能够有效准确地检测亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率，尤其能够帮助发现转化时间不足、转化温度过低、转化试剂过效期等转化过程中可能发生的问题。
除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。
本发明的其他特点和优势将由下面的具体说明和权利要求书作详细的描述。
附图说明
本发明的上述及其它特征将通过下面结合附图及其详细描述作进一步说明。应当理解的是，这些附图仅示出了根据本发明的若干示例性的实施方式，因此不应被视为是对本发明保护范围的限制。除非特别说明，附图不必是成比例的，并且其中类似的标号表示类似的部件。
图1为本发明的用于检测在DNA甲基化检测中亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的参考品核酸和用于检测所述参考品核酸的引物和探针的一个设计示意图。
图2为本发明的用于检测在DNA甲基化检测中亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的参考品核酸和用于检测所述参考品核酸的引物和探针的另一个设计示意图。
具体实施方式
本申请提供了一种检测亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的组合物和方法。通过使用本发明描述的组合物和方法，能够方便、快捷地检测亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率。
下述为本申请的组合物、试剂盒、核酸序列以及检测方法的实施例。可以理解，考虑到上文所提供的一般性描述，可以实施多种其他的实施方式。
在实施方案中，公开用于检测亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的组合物，包含等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的DNA片段及其互补序列。优选地，包含等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于SEQ ID NO:2的DNA片段及其互补序列。
如SEQ ID NO:1所示的参考品核酸，其中，所述第一片段以下划线标识：
SEQ ID NO:1
GGTTGGTGAGAGGGATGGTGATGATGTAAGTAATGGGCTTAGGCAAAGCTAGATAGGATGTTGGGTGTGGTTGGTGAGAGAAG
如SEQ ID NO:2所示的参考品核酸，其中，所述第一片段以下划线标识，所述加粗斜体标识通过用鸟嘌呤替换所述第一片段的胞嘧啶而形成的另一片段：
SEQ ID NO:2
Figure BDA0001430795960000051
Figure BDA0001430795960000061
具体而言，在优选的实施方案中，所述方法包括以下步骤：
在第一步中，获得待检测的样品DNA，并在其中加入参考品核酸，加入量为103-105拷贝/μl样品DNA。
所述待检测的样品来源可以是任何适合的来源，例如细胞系、组织学切片、活检组织、石蜡包埋的组织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液分离的细胞及其所有可能的组合。然后从所述样品分离基因组DNA。可通过现有技术中的任何标准手段来分离，包括使用可商购的试剂盒。简言之，当目的DNA被包裹在细胞膜中时，该生物样品必须被破碎并通过酶、化学或机械手段被裂解。随后例如通过蛋白激酶K的消化而清除蛋白和其它的污染物。接着从溶液回收基因组DNA。这可以通过各种方法来实现，包括盐析、有机提取或将DNA结合到固相支持物。对方法的选择会受到多种因素的影响，包括时间、费用和所需的DNA的量。当所述样品DNA未被包裹在细胞膜中时(例如来自血液样品的循环DNA)，可以使用现有技术中分离和/或纯化DNA的标准方法。这些方法包括使用蛋白降解试剂，例如离液盐，如盐酸胍或脲；或去污剂，如十二烷基磺酸钠(SDS)、溴化氰。其它方法包括但不限于乙醇沉淀或丙醇沉淀、通过离心的真空浓缩等。本领域技术人员也可以利用装置，例如诸如超滤的滤器，硅表面或膜，磁性颗粒，聚苯乙烯颗粒，聚苯乙烯表面，带正电荷的表面以及带阳性电荷的膜，带电膜，带电表面，带电转换膜，带电转换表面。
在所述方法的第二步中，使用亚硫酸氢盐处理步骤1)得到的待检测的DNA和参考品核酸的混合物。优选地，亚硫酸氢盐转化处理在变性溶剂存在下进行，所述变性溶剂诸如但不限于正烷基二醇，尤其是二乙二醇二甲基醚(DME)，或者在二噁烷或二噁烷衍生物存在下进行；在优选的实施方案中，所述变性溶剂以1％至35％(v/v)的浓度使用。优选地，亚硫酸氢盐处理在清除剂存在下进行，所述清除剂包括但不限于色原烷衍生物，如：6-羟基-2，5，7，8-四甲基色原烷、2-羧酸或三羟基苯甲酸及其衍生物。优选地，亚硫酸氢盐处理在30℃至85℃的反应温度下进行。优选地，经亚硫酸氢盐转化处理的待检测的DNA和参考品核酸的混合物在进一步的检测之前进行纯化。这可通过任何现有技术中已知的方法来进行，例如但不限于超滤，优选通过MicroconTM柱进行。
在所述方法的第三步中，扩增第二步得到的产物中的参考品核酸；并使用探针检测，获得样品DNA中亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率。其中，将第二步得到的产物与扩增酶和引物以及探针接触，使得所述产物中参考品核酸被扩增，并使用探针检测扩增产物；基于所述扩增产物的Ct值，检测亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率。
检测第二步得到的产物中参考品核酸；采用本发明的针对参考品核酸的引物以及扩增酶扩增第二步得到的产物。通常，该扩增反应采用聚合酶链式反应(PCR)进行。利用针对参考品核酸的探针对参考品进行检测：
对如SEQ ID NO:1所示的参考品核酸的检测使用针对SEQ ID NO.1序列的引物和探针。：
参考品引物F:
SEQ ID NO:3：GGTTGGTGAGAGGGATGGTGAT
参考品引物R:
SEQ ID NO:4：CTTCTCTCACCAACCACACCCA
参考品探针P1:
SEQ ID NO:5：AAGTAATGGGTTTAGGTAAAGTTAGATAG
参考品探针P2:
SEQ ID NO:6：AAGTAATGGGCTTAGGCAAAGCTAGATAG
对如SEQ ID NO:2所示的参考品核酸的检测使用针对SEQ ID NO.2序列的引物和探针：
参考品引物F:
SEQ ID NO:3：GGTTGGTGAGAGGGATGGTGAT
参考品引物R:
SEQ ID NO:4：CTTCTCTCACCAACCACACCCA
参考品探针P1:
SEQ ID NO:5：AAGTAATGGGTTTAGGTAAAGTTAGATAG
参考品探针P3:
SEQ ID NO:7：CTATCTACCTTTCCCTAACCCCATTACTT
对扩增产物的检测是通过实时检测探针来进行。
在本发明中，可以利用各种商业用实时PCR仪器设备上根据现有技术的标准操作进行实时PCR的检测。根据某些具体实施方式，在Life Technologies仪器(7500Fast)上进行实时PCR的检测。
PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化处理的DNA混合物、300-600nM引物、150-300nM探针、1UTaq聚合酶、50-400uM的各个dNTP、1至10mM的MgCl2和2XPCR缓冲至最终的2-100μl的体积。在85-99℃持续3-60分钟，以用预循环扩增样品，紧接着进行35-55个循环：50-72℃下退火1-30秒，在45-80℃下退火5-90秒，在85-99℃下变性5-90秒。
亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率是通过参考品核酸的特异性探针检测，由聚合酶链式反应的循环阈值Ct值来确定，进一步包括以下步骤：
1)对于如SEQ ID NO:1所示的参考品核酸：由于探针P1(SEQ ID NO:5)所检测的参考品核酸是亚硫酸氢盐处理后转化的DNA，探针P2(SEQ ID NO:6)所检测的参考品核酸是亚硫酸氢盐处理后未转化的DNA，因此亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率为：探针P1检测的DNA量/(探针P1检测的DNA量+探针P2检测的DNA量)＝2-Ct(P1)/(2-Ct(P1)+2-Ct(P2))×100；
2)对于如SEQ ID NO:2所示的参考品核酸：由于探针P1(SEQ ID NO:5)所检测的参考品核酸是亚硫酸氢盐处理后转化的DNA，探针P3(SEQ ID NO:7)所检测的参考品核酸是加入的参考品核酸的总量，因此亚硫酸氢盐的转化程度(百分率)为：探针P1检测的DNA量/探针P3检测的DNA量＝2-Ct(P1)/2-Ct(P3)×100。
综上所述，本申请通过以上所述的组合物、核酸序列、试剂盒及其用途，以及上述检测方法，实现了亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的检测。
以下将详述具体的实施例。
实施例
实施例1 检测亚硫酸氢盐处理DNA的转化率
1)使用全血DNA提取试剂盒(博尔诚(北京)科技有限公司)提取外周血白细胞基因组DNA(样品来自博尔诚(北京)科技有限公司)，人工合成SEQ ID NO:2所示序列的单链脱氧核糖核酸寡聚物，并制备为终浓度104拷贝/μl样品的溶液。
2)对上述DNA溶液进行亚硫酸氢盐转化处理：使用有效期内的亚硫酸氢盐转化试剂盒((博尔诚(北京)科技有限公司，商品名为Septin9基因甲基化检测试剂盒(PCR荧光探针法)血浆处理试剂盒，生产批号201610004)，在85℃下分别处理0、10、20、45、90分钟；在60℃进行45分钟；同时使用超过有效期的亚硫酸氢盐转化试剂盒((博尔诚(北京)科技有限公司，商品名为Septin9基因甲基化检测试剂盒(PCR荧光探针法)血浆处理试剂盒，生产批号201512007)，在85℃进行45分钟。
3)将经亚硫酸氢盐转化处理过DNA混合物通过磁珠法进行纯化，之后进行实时定量PCR检测。
PCR反应使用针对SEQ ID NO:2的引物和探针：
参考品引物F:
SEQ ID NO:3：GGTTGGTGAGAGGGATGGTGAT
参考品引物R:
SEQ ID NO:4：CTTCTCTCACCAACCACACCCA
参考品探针P1:
SEQ ID NO:5：AAGTAATGGGTTTAGGTAAAGTTAGATAG
参考品探针P3:
SEQ ID NO:7：CTATCTACCTTTCCCTAACCCCATTACTT
PCR扩增和检测是在Life Technologies仪器(7500Fast)上进行。PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化处理的参考品核酸104拷贝/μl、300nM的引物F和R、150nM的探针P1和P3、1U的Taq聚合酶、250uM的dNTPs、1mM的MgCl2组成。PCR反应条件为：94℃持续25分钟，以用预循环扩增样品，紧接着进行45个循环：1)55℃退火15秒；2)72℃延伸15秒；3)94℃变性15秒。通过探针P1和P3的Ct值计算亚硫酸氢盐的转化程度(百分率)：2-Ct(P1)/2-Ct(P3)×100。
检测结果如表1所示，从表中可以看出，利用亚硫酸氢盐转化参考品，通过PCR检测，能够检测亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率，尤其能够提供参考数据，从而帮助发现转化时间不足、转化温度过低、转化试剂过效期等转化过程中可能发生的问题。
结果如下表1所示
亚硫酸氢盐处理DNA的转化率
Figure BDA0001430795960000091
序列表
<110> 博尔诚（北京）科技有限公司
<120> 检测在DNA甲基化检测中亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的组合物
<130> DIC17110003
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggttggtgag agggatggtg atgatgtaag taatgggctt aggcaaagct agataggatg 60
ttgggtgtgg ttggtgagag aag 83
<210> 2
<211> 117
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggttggtgag agggatggtg atgatgtaag taatgggctt aggcaaagct agataggatg 60
taagtaatgg ggttagggaa aggtagatag gatgttgggt gtggttggtg agagaag 117
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggttggtgag agggatggtg at 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttctctcacc aaccacaccc a 21
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aagtaatggg tttaggtaaa gttagatag 29
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aagtaatggg cttaggcaaa gctagatag 29
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctatctacct ttccctaacc ccattactt 29

Claims (8)

1.一种用于检测在DNA甲基化检测中亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的组合物，所述组合物包括至少一种用于检测亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的参考品核酸，和用于检测参考品核酸的引物和探针；
其中，所述参考品核酸如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示；
用于检测SEQ ID NO: 1的引物F、R分别如SEQ ID NO: 3-4所示和用于检测SEQ ID NO:1的探针P1、P2分别如SEQ ID NO: 5-6所示；
用于检测SEQ ID NO: 2的引物F、R分别如SEQ ID NO: 3-4所示和用于检测SEQ ID NO:2的探针P1、P3分别如SEQ ID NO: 5和7所示。
2.一种用于检测在DNA甲基化检测中亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1所述的组合物。
3.一种用于检测在DNA甲基化检测中亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率的方法，所述方法包括以下步骤：
1）在待检测的样品DNA中加入参考品核酸；
其中，所述参考品核酸如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示；
其中，所述参考品核酸的加入量为103-105拷贝/μl样品DNA；
2）使用亚硫酸氢盐处理步骤1）得到的待检测的样品DNA和参考品核酸的混合物；
3）扩增步骤2）得到的产物中的参考品核酸，并使用探针检测，获得样品DNA中亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率；
用于检测SEQ ID NO: 1的引物F、R分别如SEQ ID NO: 3-4所示和用于检测SEQ ID NO:1的探针P1、P2分别如SEQ ID NO: 5-6所示；
用于检测SEQ ID NO: 2的引物F、R分别如SEQ ID NO: 3-4所示和用于检测SEQ ID NO:2的探针P1、P3分别如SEQ ID NO: 5和7所示。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤1）中，所述参考品核酸的加入量为104拷贝/μl样品DNA。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤3）中，将步骤2）得到的产物与扩增酶和引物以及探针接触，使得所述产物中参考品核酸被扩增，并使用探针检测扩增产物；基于所述扩增产物的Ct值，检测亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率由使用不同的探针检测经步骤2）处理后的参考品核酸的循环阈值Ct值来确定。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，对于如SEQ ID NO: 1所示的参考品核酸，所述亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率使用如下的计算公式确定：
亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率=探针P1检测的DNA量/（探针P1检测的DNA量+探针P2检测的DNA量） = 2-Ct(P1)/（2-Ct(P1)+2-Ct(P2)）× 100%。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，对于如SEQ ID NO: 2所示的参考品核酸，所述亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率使用如下的计算公式确定：
亚硫酸氢盐处理DNA的转化效率=探针P1检测的DNA量/探针P3检测的DNA量= 2-Ct(P1)/2-Ct(P3)× 100%。
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