CN105441556A - Dna甲基化转化效率的判断方法及其试剂盒和应用 - Google Patents

Dna甲基化转化效率的判断方法及其试剂盒和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种DNA甲基化转化效率的判断方法，设置转化效率的目标值为η%；制备DNA样本，DNA样本经甲基化转化试剂盒处理后得到转化液,对照液由阳性甲基化质粒和DNA样本按照质量比为η%﹕1-η%配制而成；引物探针组X用于检测未转化DNA，引物探针组Y用于检测已转化的DNA；采用引物探针组X对所述转化液进行PCR检测，得到CTX-M，采用引物探针组X对所述对照液进行PCR检测，得到CTX-D；采用引物探针组Y对所述转化液进行PCR检测，得到CTY-M，采用引物探针组Y对所述对照液进行PCR检测，得到CTY-D；ΔΔCT=？CTX-M-CTY-M+CTY-D-CTX-D；当ΔΔCT≥0时，DNA甲基化转化效率≥η%。本发明的DNA甲基化转化效率的判断方法可以快速判断样本DNA的亚硫酸盐处理转化率过高或过低。

Description

DNA甲基化转化效率的判断方法及其试剂盒和应用
技术领域
本发明涉及一种DNA经过亚硫酸盐处理后判断未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶的转化率的方法，属于生物技术领域。
背景技术
DNA甲基化(DNAmethylation)是最早发现的修饰途径之一，它主要发生在富含双核苷酸CpG岛的区域，在人类基因组中有近5万个CpG岛。正常情况下CpG岛是以非甲基化形式(活跃形式)存在的。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。
检测甲基化的方法包括：甲基化敏感的限制性内切酶(Methylation-sensitiverestrictionEndonuclease，MS-RE)法，甲基化特异性PCR法(Methylation-specificPCR,MSP)，甲基化敏感性解链曲线分析法(MS-HighResolutionMeltingCurve，MS-HRM)，亚硫酸氢盐基因测序法(bisulfitesequencingPCR，BSP)，以及荧光法(Methylight)等。
荧光法(Methylight)先用甲基化处理试剂盒对样本DNA进行亚硫酸盐处理转化，即将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，再用普通PCR探针的方法检测经过处理后的转化液，从而判断基因是否甲基化。虽然检测方法快速便捷，但是，如果样本DNA的亚硫酸盐处理转化过度，会造成检测转化液无法获得实验结果；如果样本DNA的亚硫酸盐处理转化率过低，会造成检测结果假阳性。因此，对于本领域的技术人员来说如何获得样本DNA的亚硫酸盐处理转化率是亟待解决的技术难题。
中文文献《DNA甲基化分析中重亚硫酸盐处理DNA转化效率的评估方法》发表于《遗传》杂志第2015年9月刊，939页至944页，其中公开了一种评估重亚硫酸盐处理DNA样本后胞嘧啶转化效率的有效方法，需要通过不同梯度浓度DNA模板建立标准曲线，再进行转化效率的计算，较为繁琐。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可以快速判断样本DNA的亚硫酸盐处理转化率过高或过低的DNA甲基化转化效率的判断方法及其试剂盒，以及该方法在制备检测产品方面的应用。
本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种DNA甲基化转化效率的判断方法，设置转化效率的目标值为η％；制备合格的DNA样本，所述DNA样本经甲基化转化试剂盒处理后得到转化液,制备对照液，所述对照液由阳性甲基化质粒和DNA样本按照质量比为η％﹕1-η％配制而成；
所述引物探针组X针对管家基因的序列设计且用于检测未转化DNA，所述引物探针组Y针对基因甲基化区域的目标序列设计且用于检测已转化的DNA；
采用引物探针组X对所述转化液进行PCR检测，得到的扩增曲线CT值为CTX-M，采用引物探针组X对所述对照液进行PCR检测，得到的扩增曲线CT值为CTX-D；采用引物探针组Y对所述转化液进行PCR检测，得到的扩增曲线CT值为CTY-M，采用引物探针组Y对所述对照液进行PCR检测，得到的扩增曲线CT值为CTY-D；
ΔΔCT＝CTX-M-CTY-M+CTY-D-CTX-D；当ΔΔCT≥0时，DNA甲基化转化效率≥η％；当ΔΔCT＜0时，DNA甲基化转化效率＜η％。
其中η的取值范围是：97≤η≤100。
优选的是：η取97、98或99。
优选的管家基因是ACTB或GAPDH。
上述引物探针组Y针对MGMT启动子甲基化区域的目标序列设计；
所述引物探针组X包括正向引物a、反向引物a和探针a；所述引物探针组Y包括正向引物b、反向引物b和探针b；
所述正向引物a的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；所述反向引物a的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；所述探针a的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；
所述正向引物b的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；所述反向引物b的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示；所述探针b的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示；
所述探针a和探针b的5’端设有报告荧光基团，所述探针a和探针b的3’端设有淬灭荧光基团。
上述探针a和探针b的5’端设有相互区别的报告荧光基团。
上述相互区别的报告荧光基团有三种，第一种是FAM，第二种是HEX、VIC、TET或Cy3，第三种是Cy5或ROX；所述淬灭荧光基团是BHQ1。
采用引物探针组X或Y对进行PCR检测时，所配制的PCR反应体系的组分中包括DNA模板0.5体积，十倍浓度的PCR缓冲液1体积，2mM的dNTPs试剂1体积，15mM的MgCl2溶液1体积，4μM的正向引物1体积，4μM的反向引物1体积，4μM的探针0.5体积，5U/μl的热启动Taq聚合酶0.2体积，其余为纯水；所述PCR缓冲液包括100mM的Tris-HCl和500mM的KCl；所述dNTPs试剂包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP；PCR反应体系中，各引物应用于PCR反应中的终浓度为0.4μM；各探针应用于PCR反应中的终浓度为0.2μM；所述DNA模板的使用浓度为10～50ng/μl。
本发明为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是：一种采用上述的DNA甲基化转化效率的判断方法的检测试剂盒。
本发明为解决上述技术问题提出的又一种技术方案是：一种上述的DNA甲基化转化效率的判断方法在制备甲基化检测产品的应用。
本发明具有积极的效果：本发明的DNA甲基化转化效率的判断方法，引物探针组X针对未经亚硫酸盐处理的模板进行针对管家基因的引物和探针设计；引物探针组Y针对目标甲基化检测区域上下游约200bp范围内进行设计,且针对的模板为经过亚硫酸盐处理的模板。根据CT值的大小关系，列出判定公式，可以判断转化效率是否高于η，如果等于或高于η说明转化效率可以接受，可进行后续检测，如果低于η说明则应该重新转化或者更换新的临床样本基因组DNA，重新开始检测。本发明的DNA甲基化转化效率的判断方法巧妙的设立由阳性甲基化质粒和DNA样本按照质量比为η％﹕1-η％配制而成的对照液，利用简单的PCR反应判断甲基化转化效率，从而保证后续检测的进行。利用本发明的DNA甲基化转化效率的判断方法进行判断后，一般在大于97％的转化率前提下，进行后续如甲基化特异性PCR法或荧光探针法等进行甲基化判定，可极大提高反应准确性及减少假阳性率。
附图说明
图1是采用反应体系X检测样本A1及其转化液M1的扩增图；
图2是采用反应体系Z检测阴性对照C、阳性对照E和样本A1的转化液M1的扩增图；
图3是采用反应体系X检测阳性对照D、样本A2及其转化液M2的扩增图；
图4是采用反应体系Y检测阳性对照D、样本A2的转化液M2的扩增图；
图5是采用反应体系Z检测阴性对照C、阳性对照E和样本A2的转化液M2的扩增图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
实施例1
一、试剂盒的组成。
本实施例的甲基化检测试剂盒包括混合液X、混合液Y、混合液Z和热启动酶(TaqHotstar)。混合液X、混合液Y、混合液Z和热启动酶(TaqHotstar)分别置于不同的试管中，如表1至表3所示。
表1混合液X的组分表
组分 浓度 体积(μl)
PCR缓冲液(PCR Buffer) 10× 1
dNTPs 2mM 1
MgCl2 15mM 1
正向引物a 4μM 1
反向引物a 4μM 1
探针a 4μM 0.5
纯水(ddH2O) / 1.5
合计 / 7
表2混合液Y的组分表
组分 浓度 体积(μl)
PCR缓冲液(PCR Buffer) 10× 1
dNTPs 2mM 13 -->
MgCl2 15mM 1
正向引物b 4μM 1
反向引物b 4μM 1
探针b 4μM 0.5
纯水(ddH2O) / 1.5
合计 / 7
表3混合液Z的组分表
组分 浓度 体积(μl)
PCR缓冲液(PCR Buffer) 10× 1
dNTPs 2mM 1
MgCl2 15mM 1
正向引物b 4μM 1
反向引物b 4μM 1
探针c 4μM 0.5
探针d 4μM 0.5
纯水(ddH2O) / 1
合计 / 7
引物和探针的核苷酸序列如表4所示。
表4引物和探针的核苷酸序列表
引物名称 序列号(Sequence No.) 核苷酸序列(5’-3’)
正向引物a 1 CCCCTGTCTGCCTCACC
反向引物a 2 TCGAACATCCTCATCTCCCC
探针a 3 AGGGTCCAGGGTTGGTC
正向引物b 4 AAATCTAAAACGAAACGAAACCGA
反向引物b 5 GTGCGGAGTTTTTTTTTCGGG
探针b 6 GAGTGTTTGGGTCGTTTCGTTTTCGG
探针c 7 AGAACGTTTTGCGTTTCGACGTTCG
探针d 8 CGAAACGCAAAACGTTCT
混合液X中包括引物探针组X，混合液Y中包括引物探针组Y，混合液Z中包括引物探针组Z。引物探针组X针对管家基因GAPDH的序列设计且用于检测未转化DNA。引物探针组Y针对MGMT启动子甲基化区域的目标序列设计且用于检测已转化的DNA。
其中，正向引物a、反向引物a和探针a是针对人类GAPDH基因设计。探针a的5’端设有ROX修饰(报告荧光基团)，探针a的3’端设有BHQ1修饰(淬灭荧光基团)。探针b的5’端设有Hex修饰(报告荧光基团)，探针b的3’端设有BHQ1修饰(淬灭荧光基团)。探针c的5’端设有FAM修饰(报告荧光基团)，探针c的3’端设有BHQ1修饰(淬灭荧光基团)。探针d的5’端没有设报告荧光基团，探针d的3’端设有BHQ1修饰(淬灭荧光基团)。
PCR缓冲液(PCRBuffer)、dNTPs、MgCl2和热启动酶来自Takara公司(货号：R007A)。
二、试剂盒的使用方法。
本实施例的甲基化检测试剂盒的具体检测步骤如下：
1、DNA提取。
采用试剂盒(AxygenMultisourceGenomicDNAMiniprepc-kit)提取样本DNA，具体的操作参见试剂盒产品说明书。
2、样本DNA质量检测。
获得样本DNA后，使用微量分光光度计测量浓度，通过测定浓度和OD260/OD280的比值控制样本质量，最终加入反应体系中的样本浓度为100ng/μl，1.9≥A260/280≥1.8，A260/230≥1.0。合格的样本DNA液即为样本A，-20℃保存。
3、甲基化处理。
采用甲基化处理试剂盒(EZDNAmethylation-GoldKit，ZYMORESEARCH，美国，产品编号：5005)对样本进行亚硫酸盐处理转化，具体步骤参照甲基化试剂盒说明书，得到转化液M。
4、准备样本及对照品。
各样本及对照品具体成分如表5所示。
表5样本及对照品说明
样本 说明
A 待测DNA样本液
B 阳性甲基化质粒
C 阴性甲基化质粒
D 98％样本B+2％样本A
E 1.5625％样本B
M 样本A经甲基化转化试剂盒处理后的对应转化液
B：阳性甲基化质粒。采用常规构建质粒方法构建。从随机样本里提取人类基因组DNA液经亚硫酸盐处理，采用引物正向引物b(按照常规在5’端加酶切点的碱基序列)和反向引物b(按照常规在5’端加酶切点的碱基序列)进行PCR扩增(扩增程序如表9所示)，产物测序验证，将MGMT基因启动子没有被转化的产物作为构建阳性质粒的PCR产物1，即其MGMT基因启动子为甲基化形式。将PCR产物1与Puc57质粒(生工A9196，编号：150311R5876-1)相应酶切后的片段1连接，转化至DH-5α感受态细菌，LB平板培养，蓝白斑筛选出阳性克隆，测序验证，扩大再培养，提取质粒DNA，经测序验证后，-20℃保存，保存浓度为100ng/μl。
C：阴性甲基化质粒。采用常规构建质粒方法构建。从随机样本里提取人类基因组DNA液经亚硫酸盐处理，采用引物正向引物b(按照常规在5’端加酶切点的碱基序列)和反向引物b(按照常规在5’端加酶切点的碱基序列)进行PCR扩增(扩增程序如表9所示)，产物测序验证，将MGMT基因启动子被完全转化的产物作为构建阴性质粒的PCR产物2，即其MGMT基因启动子为非甲基化形式；将PCR产物2与Puc57质粒(生工A9126，编号：150311R5876-1)相应酶切后的片段2连接，转化至DH-5α感受态细菌，LB平板培养，蓝白斑筛选出阳性克隆，测序验证，扩大再培养，提取质粒DNA，经测序验证后，-20℃保存，保存浓度为100ng/μl。
D：98％样本B+2％样本A。其配制方法如下：以体积比B(100ng/μl)﹕A(100ng/μl)＝98:2配制即得。
E：1.5625％样本B。其配制采用如下方法，以下均为体积比：
1)以B(100ng/μl)﹕C(100ng/μl)＝1﹕1配制，得E1，为50％B；
2)以E1﹕C(100ng/μl)＝1﹕1配制，得E2，为25％B；
3)以E2﹕C(100ng/μl)＝1﹕1配制，得E3，为12.5％B；
4)以E3﹕C(100ng/μl)＝1﹕1配制，得E4，为6.25％B；
5)以E4﹕C(100ng/μl)＝1﹕1配制，得E5，为3.125％B；
6)以E5﹕C(100ng/μl)＝1﹕1配制，得E6，即为1.5625％B。
M：样本A经甲基化转化试剂盒处理后的对应转化液。保存浓度为20～50ng/μl。
5、采用混合液X配制成反应体系X进行基因组DNA质量的检测。
配制反应体系X，利用荧光PCR定量仪(Agilent3100)对基因组DNA的质量进行检测分析。反应体系X的组分如表6所示，反应体系X的PCR反应程序如表7所示。
表6反应体系X的组分表
组分 浓度 体积(μl)
混合液X 7
热启动酶(Taq Hotstar) 5U/μl 0.2
DNA模板(样本) 0.5
纯水(ddH2O) 2.3
合计 10
表7反应体系X的PCR反应程序
在延伸阶段收集ROX荧光信号。
采用反应体系X检测样本A，可获得典型S型扩增曲线，可确认反应体系X正常。
6、采用混合液Y配制成反应体系Y进行转化液质量分析。
配制反应体系Y，利用荧光PCR定量仪(Agilent3100)对转化液质量进行检测分析。反应体系Y的组分如表8所示，反应体系Y的PCR反应程序如表9所示。
表8反应体系Y的组分表
组分 浓度 体积(μl)
混合液X 7
热启动酶(Taq Hotstar) 5U/μl 0.2
DNA模板(样本) 1
纯水(ddH2O) 1.86 -->
合计 10
表9反应体系Y的PCR反应程序
在延伸阶段收集HEX荧光信号。
采用反应体系Y检测样本B或样本C，若可获得正常S型扩增曲线，可确认反应体系Y正常。
7、采用混合液Z配制成反应体系Z进行甲基化检测分析。
配制反应体系Z，利用荧光PCR定量仪(Agilent3100)，进行甲基化检测分析。反应体系Z的组分如表10所示，反应体系Z的PCR反应程序如表11所示。
表10反应体系Z的组分表
表11反应体系Z的PCR反应程序
在传统三步PCR反应的基础上，增加在较低退火温度收集FAM荧光信号这一步骤。
采用反应体系Z检测样本B和样本D，若均能获得正常S型扩增曲线，则确认反应体系Z工作正常。反应体系Z可检测MGMT启动子区的低至1.5625％的甲基化状态。
三、结果判断。
以下反应体系X、Y、Z进行检测时，均以不加DNA模板(补足水)的PCR液为空白对照，按以下步骤进行。
1、采用反应体系X检测样本A。
i.反应体系X检测样本A，若不能获得正常S型扩增曲线，表明样本A的质量不合格，需重新制备后再进行检测；
ii.反应体系X检测样本A，若获得正常S型扩增曲线，则进行步骤2的检测。
2、反应体系X检测样本M。
i.反应体系X检测样本M，若不能获得典型S型扩增曲线，表明临床样本基因组DNA(样本A)的转化液(样本M)无人类基因组残留，转化率100％。可直接进行步骤6的反应体系Z的检测。
ii.反应体系X检测样本M，若能获得典型S型扩增曲线，扩增曲线CT值为CTX-M，则有两个可能：
A.样本A的GAPDH启动区可能为完全甲基化样本；但因反应体系X所采用的引物是针对GAPDH这个管家基因的，管家基因是一类始终保持着低水平的甲基化从而一直处于活性转录状态，样本A的GAPDH启动区不可能完全甲基化，故排除这种可能性。
B.样本A的转化未进行完全，必须进行转化率的判定，进行步骤3～5。
3、采用反应体系X检测样本D。
采用反应体系X检测样本D，可获得正常S型扩增曲线，扩增曲线CT值命名为CTX-D。
4、采用反应体系Y检测样本D。
采用反应体系Y检测样本D，可获得正常S型扩增曲线，扩增曲线CT值为CTY-D。
5、采用反应体系Y检测样本M。
采用反应体系Y检测样本M，可获得正常S型扩增曲线，扩增曲线CT值为CTY-M，需进行样本A的转化率是否大于98％转化率的判定：
ΔCt1＝CTY-D-CTX-D；ΔCt2＝CTY-M-CTX-M。
ΔΔCT＝-(实验组ΔCT值-对照组ΔCT值)＝-(ΔCt2-ΔCt1)。
若ΔΔCT>0，说明临床样本基因组DNA(样本A)转变为转化液(即样本M)的转化率大于98％，可进行反应体系Z的检测(步骤6)。
若ΔΔCT<0，应重新转化或者更换新的临床样本基因组DNA，重新开始检测。
6、采用反应体系Z检测样本M。
以样本C为阴性对照，以样本E为阳性对照。
采用反应体系Z检测样本M，若获得正常S型扩增曲线，表明样本A的MGMT基因启动子为甲基化；
采用反应体系Z检测样本M，若未获得S型扩增曲线，表明样本A的MGMT基因启动子为非甲基化。
四、应用示例。
1、应用例。
(1)采用本实施例的试剂盒检测样本A1的MGMT基因启动子甲基化状态。
反应体系X检测：采用反应体系X检测样本A1及其转化液M1的扩增图如图1所示。反应体系X检测样本A1，获得正常S型扩增曲线；反应体系X检测转化液M1，不能获得正常S型扩增曲线，表明样本A1转化完全，接下来可直接进行反应体系Z的检测。
反应体系Z检测：采用反应体系Z检测样本C(阴性对照)、样本E(阳性对照)和样本A1的转化液M1，扩增图如图2所示。采用反应体系Z检测样本A1的转化液M1，得到S型扩增曲线，可判断样本A1的MGMT基因启动子为甲基化状态。
(2)采用本实施例的试剂盒检测样本A2的MGMT基因启动子甲基化状态。
反应体系X检测：采用反应体系X检测阳性对照样本D2、样本A2及其转化液M2的扩增图如图3所示。
反应体系X检测样本A2，获得正常S型扩增曲线；反应体系X检测转化液M2，也获得S型扩增曲线，其扩增曲线CT值为CTX-M2＝39.54，表明样本A2转化不完全，接下来需进行转化率的判定。
反应体系X检测样本D2，获得正常S型扩增曲线，扩增曲线CT值为CTX-D＝37.55。
反应体系Y的检测：采用反应体系Y检测阳性对照样本D2、样本A2的转化液M2的扩增图如图4所示。
采用反应体系Y检测样本D2，获得正常S型扩增曲线，其扩增曲线CT值为CTY-D＝33.69。采用反应体系Y检测转化液M2，获得正常S型扩增曲线，扩增曲线CT值为CTY-M2＝30.97。
ΔCt1＝CTY-D-CTX-D＝33.69-37.55＝-3.86；
ΔCt2＝CTY-M2-CTX-M2＝30.97-39.54＝-8.57。
ΔΔCT＝-(ΔCt2-ΔCt1)＝4.71>0，说明临床样本基因组DNA(样本A)转变为转化液(即样本M)的转化率大于98％，再接着进行反应体系Z的检测。
反应体系Z检测：采用反应体系Z检测样本C(阴性对照)、样本E(阳性对照)和样本A2的转化液M2，扩增图如图5所示。
反应体系Z检测转化液M，若获得正常S型扩增曲线，表明样本A2的MGMT基因启动子为甲基化。
2、PCR结果验证。
采用亚硫酸氢盐基因测序法检测各样本，测序结果与采用本试剂盒的检测样本1和样本2的结果完全一致。
五、试剂盒特性。
1、对反应体系X、Y进行扩增效率检测。
利用反应体系X、Y，对各自模板进行倍比稀释，进行扩增效率检测，可验证扩增效率一致。
2、灵敏度分析：采用本实施例的试剂盒对不同程度甲基化模板的检测，可检测低至1.5625％MGMT启动子区甲基化的阳性质粒。低至1.5625％MGMT启动子区甲基化判定已能满足临床应用需求。
3、重复性分析。
上述检测反应均采用复孔，每次重复三次，其间的CT值相差不超过0.2个循环。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
SEQUENCELISTING
<110>上海赛安生物医药科技有限公司
<120>DNA甲基化转化效率的判断方法及其试剂盒和应用
<130>无
<160>8
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>17
<212>DNA
<213>人工合成
<400>1
cccctgtctgcctcacc17
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<212>DNA
<213>人工合成
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<212>DNA
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<212>DNA
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<212>DNA
<213>人工合成
<400>8
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Claims (10)

1.一种DNA甲基化转化效率的判断方法，其特征在于：
设置转化效率的目标值为η%；制备合格的DNA样本，所述DNA样本经甲基化转化试剂盒处理后得到转化液,制备对照液，所述对照液由阳性甲基化质粒和DNA样本按照质量比为η%﹕1-η%配制而成；
所述引物探针组X针对管家基因的序列设计且用于检测未转化DNA，所述引物探针组Y针对基因甲基化区域的目标序列设计且用于检测已转化的DNA；
采用引物探针组X对所述转化液进行PCR检测，得到的扩增曲线CT值为CTX-M，采用引物探针组X对所述对照液进行PCR检测，得到的扩增曲线CT值为CTX-D；采用引物探针组Y对所述转化液进行PCR检测，得到的扩增曲线CT值为CTY-M，采用引物探针组Y对所述对照液进行PCR检测，得到的扩增曲线CT值为CTY-D；
ΔΔCT=CTX-M-CTY-M+CTY-D-CTX-D；当ΔΔCT≥0时，DNA甲基化转化效率≥η%；当ΔΔCT＜0时，DNA甲基化转化效率＜η%。
2.根据权利要求1所述DNA甲基化转化效率的判断方法，其特征在于：97≤η≤100。
3.根据权利要求1所述DNA甲基化转化效率的判断方法，其特征在于：η取97、98或99。
4.根据权利要求1所述DNA甲基化转化效率的判断方法，其特征在于：所述管家基因是ACTB或GAPDH。
5.根据权利要求1至4中任一项所述DNA甲基化转化效率的判断方法，其特征在于：所述引物探针组Y针对MGMT启动子甲基化区域的目标序列设计；
所述引物探针组X包括正向引物a、反向引物a和探针a；所述引物探针组Y包括正向引物b、反向引物b和探针b；
所述正向引物a的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；所述反向引物a的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；所述探针a的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；
所述正向引物b的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；所述反向引物b的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示；所述探针b的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示；
所述探针a和探针b的5’端设有报告荧光基团，所述探针a和探针b的3’端设有淬灭荧光基团。
6.根据权利要求5所述DNA甲基化转化效率的判断方法，其特征在于：所述探针a和探针b的5’端设有相互区别的报告荧光基团。
7.根据权利要求6所述DNA甲基化转化效率的判断方法，其特征在于：所述相互区别的报告荧光基团有三种，第一种是FAM，第二种是HEX、VIC、TET或Cy3，第三种是Cy5或ROX；所述淬灭荧光基团是BHQ1。
8.根据权利要求5所述DNA甲基化转化效率的判断方法，其特征在于：采用引物探针组X或Y对进行PCR检测时，所配制的PCR反应体系的组分中包括DNA模板0.5体积，十倍浓度的PCR缓冲液1体积，2mM的dNTPs试剂1体积，15mM的MgCl2溶液1体积，4μM的正向引物1体积，4μM的反向引物1体积，4μM的探针0.5体积，5U/μl的热启动Taq聚合酶0.2体积，其余为纯水；所述PCR缓冲液包括100mM的Tris-HCl和500mM的KCl；所述dNTPs试剂包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP；PCR反应体系中，各引物应用于PCR反应中的终浓度为0.4μM；各探针应用于PCR反应中的终浓度为0.2μM；所述DNA模板的使用浓度为10～50ng/μl。
9.一种采用如权利要求1所述的DNA甲基化转化效率的判断方法的检测试剂盒。
10.一种如权利要求1所述的DNA甲基化转化效率的判断方法在制备甲基化检测产品的应用。
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