JP2009511016A - 希薄な過酸化水素を使用する核酸汚染の除去方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、除染対象の表面に過酸化水素水溶液を接触させるステップと、続いて前記表面から前記溶液を拭き取るステップとを含む、表面上の核酸汚染を低減する方法を提供する。好ましくは、前記溶液は過酸化水素と水から本質的に成る。また、前記溶液は、表面上にスプレーするか、または最初にペーパータオルなどに付けてから表面に塗布してもよい。前記過酸化水素溶液の濃度は希薄である。約０．５％から約３０％の濃度が好ましい。約３％の濃度が最も好ましい。

Description

本発明は、表面領域から核酸汚染を除去するための処理に関する。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術およびその他ＤＮＡ増幅関連技術に関与する表面からの核酸の除染はきわめて重要である。ＰＣＲおよび関連技術は、無縁の核酸、例えば、前回の増幅からキャリーオーバーされている核酸を増幅することがある。このことは、誤った陽性結果や誤解につながるおそれがある。従来の表面除染方法では、高価で取扱いの難しい溶液が除染剤として一般に配備されてきた。ほとんどの場合、除染試薬残留物の除去を含む除染後ステップも必要である。当業界では、安価で使いやすく、また、入手が容易で扱いが簡単な試薬を利用する除染プロセスが求められている。

本発明は、表面領域から核酸汚染を除去するための、希薄な過酸化水素水溶液を用いた前記表面の処理に関する。過酸化水素の希薄溶液は安価で扱いやすく、表面からの核酸汚染除去においてきわめて有効である。本発明の好ましい溶液は、過酸化水素および水から本質的に成る。これらの溶液は、他の除染溶液を通常必要とするさらなる表面浄化ステップを要さずに使用できる。本発明の前記溶液は、以後の増幅を妨害する可能性のある残留物を残さない。

したがって、本発明は、除染対象の表面に過酸化水素水溶液を接触させるステップと、続いて前記表面から前記溶液を拭き取るステップとを含む、表面上の核酸汚染を低減する方法を提供する。好ましくは、前記溶液は、過酸化水素と水から本質的に成る。また、前記溶液は、表面（例えば、垂直表面）上にスプレーするか、または最初にペーパータオルなどに付けてから表面に塗布し、その後拭き取ってもよい。

典型的な実施形態では、前記過酸化水素溶液は、拭取り前に少なくとも約３分間乾燥させる。しかし、前記過酸化水素溶液は、３０分間、または１時間、またはそれを超える時間乾燥させてもよい。

前記過酸化水素溶液の濃度は希薄である。約０．５％から約３０％の濃度が好ましい。より好ましい濃度は約２％から約１０％の範囲内である。約３％の濃度が最も好ましい。

［過酸化水素］ 本発明の前記過酸化水素溶液は、商業的供給源から手軽かつ安価に入手できる。例えば、ＶＷＲ、Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＶＷ４５４０−２）から市販されているＨｙｄｒｏｇｅｎ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ ３％を使用することができる。しかし、本発明では、市販され一般に入手可能な任意の過酸化水素水溶液の使用を考慮している。前記過酸化水素溶液は、市販の過酸化水素溶液に通常使われている追加の添加剤（安定化剤など）を含有してもよい。

過酸化水素と水「から本質的に成る」溶液は、本発明に無関係の成分、例えば前記過酸化水素の分解防止のための安定化剤などをさらに含有してもよいが、漂白剤などの酸化剤または界面活性剤または酵素をさらに含有することはないだろう。

［表面］ 処理できる表面および物品は、実験室環境中で通常見られる任意のものである。好ましくはこれには、核酸増幅の実施中に存在すると考えられる任意の表面が含まれる。これには、金属、ガラス、プラスチック、およびセラミックの表面が含まれよう。好ましくは、実験台、機器、および設備上の表面が含まれよう。また、核酸増幅で使用する分注機（自動分注機を含む）内の表面も含まれよう。例えば、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ製のＢＤ ＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ Ｐｉｐｅｔｔｏｒといった機器などを視野に入れている。また、核酸増幅で使用するアレイ、マイクロアレイ、およびマイクロウェル内の表面も含まれよう。

［汚染物質］ 本方法により浄化できる前記汚染物質には、核酸由来の任意の汚染物質を含む。これには、好ましくはＤＮＡ増幅実験に関連する実験室機器の表面上に存在しうる残留汚染物質が含まれよう。特に、以後の酵素反応を妨害する可能性のある任意の残留汚染を含む。本方法は、放射性汚染物質で汚染されている表面および物品を除染することもできる。

［好ましい実施形態］ 好ましい一実施形態では、除染対象の前記表面に前記過酸化水素溶液を接触させ、前記溶液を乾燥させた後、最終ステップで拭き取る。この実施形態では、前記表面のそれ以上の拭取りまたは浄化は実施しない。したがって、本発明は、前記除染溶液そのものにより残された残留物を除去するためにしばしば必要となるさらなる浄化ステップの必要性を取り除く。

別の好ましい実施形態では、除染対象の前記表面に前記過酸化水素溶液を十分に接触させた後、拭取りおよび乾燥前に前記表面を水ですすぐ。

さらに別の好ましい実施形態では、除染対象の物品を前記過酸化水素溶液中に浸漬し、その後排液して水ですすぎ、乾燥する。

さらに別の好ましい実施形態では、最初に前記過酸化水素溶液中に布巾またはタオルを浸漬した後、浄化対象の前記表面を前記布巾またはタオルで拭く。特定の用途のために必要または望ましい場合には、その後、前記表面を乾いたタオルもしくは布巾、または水で浸漬したタオルでさらに拭くか、或いは前記表面を水ですすぐことができる。

［実施例］
［全般的な材料および方法］
典型的な試験手順では、１”×１”のます目４８個を含む表面領域を、１０×１０^３コピー／ｍＬのＧＣプラスミドを使って汚染する。前記プラスミド保存液は１０×１０^２コピー／ｍＬの濃度に希釈し、前記表面に塗布する。各ます目からスワブを２個ずつ取り、前記表面が汚染されていることを確認する。次に、前記汚染表面領域に希薄な過酸化水素を塗布し、除染試薬として使用する。各ます目からさらにスワブを２個ずつ取り、次にＢＤ ＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ上で試験する。一試験では、両アッセイにおいて９３／９６個のスワブが陰性であり、９７％の低減率を示した。

前記過酸化水素がＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）反応を妨害していなかったことを確認するため、すべてのモノプレックス（ｍｏｎｏｐｌｅｘ）は増幅制御（ＡＣ）マイクロウェルを組み込んで実施する。本試験を通じて、ＡＣの判定保留はなかった。したがって、過酸化水素は前記アッセイの阻害原因とはならず、製品に対するリスク因子と考えるべきではないと結論づけることができる。

［定義］ ＧＣ：淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）。ＡＣ：増幅制御。ＩＡＣ：内部増幅制御。モノプレックス：外部増幅制御（ＡＣ）を用いたＧＣアッセイ。ダイプレックス（Ｑｘ）：内部増幅制御（ＩＡＣ）を用いたＧＣアッセイ。ＭＯＴＡ：加速法以外の方法。ＰＡＴ：閾値超過。Ｈ_２Ｏ_２：過酸化水素。ＳＤ：試料希釈剤（リン酸カリウム緩衝液）ｗ／ＤＭＳＯ（１０％）（ＣＴ／ＧＣキット部品）。

［材料］ ＢＤ ＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ Ｓｙｓｔｅｍは、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ製の、ロボットによるハイスループット、リアルタイムの核酸増幅システムである。前記システム用の一連の付属品は、臨床検体中のクラミジアトラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（ＣＴ）および淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）（ＧＣ）の検出用に前記メーカーから市販されている。ＢＤ Ｖｉｐｅｒ（商標）Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒは、大量増幅分子試験に関する試料の取扱いを自動で行うロボットシステムであり、同じくＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから市販されている。ＢＤ Ｖｉｐｅｒ（商標）Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒは、クラミジアトラコマチスおよび淋菌の検出用に、ＢＤ ＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴシステムと一緒に使用することができる。ＢＤ ＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ ＧＣ Ｐｒｉｍｉｎｇ ａｎｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌｓ、ＢＤ ＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ ＡＣ Ｐｒｉｍｉｎｇ ａｎｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌｓ、ＢＤ ＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ ＧＣＱｘ Ｐｒｉｍｉｎｇ ａｎｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌｓ、ＢＤ ＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ ＣＴ／ＧＣ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ、ＢＤ ＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ ＣＴＱｘ／ＧＣＱｘ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ、ＢＤ ＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ、ＢＤ ＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ Ｓａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔ Ｔｕｂｅｓ、ＢＤ ＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ Ｐｉｐｅｔｔｅ Ｔｉｐｓ、ＢＤ ＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ ａｎｄ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＣＴ／ＧＣ）は、ＢＤ ＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）およびＢＤ Ｖｉｐｅｒ（商標）システムと一緒に用いると有用な付属品である。前記製品は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎのウェブサイトに詳しく記載されており、同ウェブサイト経由で注文することができる。

Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｅｎｄｏｃｅｒｖｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉｍｅｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｒｙ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｋｉｔ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ。ＢＤ ＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ。ＢＤ ＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ Ｍａｔｒｉｘ Ｐｉｐｅｔｔｏｒ。

［追加材料］：
ＶＷＲ（商標）Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ ３％、Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＶＷ３５４０−２）ＧＣ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｔｏｃｋ １０×１０^３ ｃｏｐｉｅｓ／μＬ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ ＬＳ Ｐｉｐｅｔｔｅ Ｔｉｐｓ（１００μＬ〜１０００μＬ）。

［全般的な試験手順］
薄いラベリングテープを使い、１”×１”のます目６個掛ける１”×１”のます目８個で形成する１”×１”のます目合計４８個を含む「格子」を用意する。１０×１０^３のＧＣプラスミド保存液を１０×１０^２コピー／ｍＬの濃度に希釈する。希薄な前記ＧＣプラスミド保存液１００ｍＬを、前記格子の各ます目上に分配する。ＢＤ ＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ ａｎｄ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＣＴ／ＧＣ）Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｅｎｄｏｃｅｒｖｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉｍｅｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｒｙ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｋｉｔ中に添付されている洗浄用スワブを使い、前記ＧＣプラスミド１００ｍＬを個別の各ます目全体に均等に広げる。前記格子の表面を完全に乾燥させる。（３０分〜１時間。）ＢＤ ＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ ａｎｄ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＣＴ／ＧＣ）Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｅｎｄｏｃｅｒｖｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉｍｅｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｒｙ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｋｉｔ中に添付されている子宮頸管内用スワブを使用して各格子からスワブ試料を２個ずつ取り、合計９６試料とする。各スワブをＢＤ ＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＥＴ ＣＴ／ＧＣ Ｓｗａｂ Ｄｉｌｕｅｎｔ Ｔｕｂｅ内に絞り出す。各チューブに蓋をし、５秒間ボルテックスする。ＢＤ ＰｒｏｂｅＴｅｃ（商標）ＣＴ／ＧＣ Ｓａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔを各チューブに２ｍＬ加え５秒間ボルテックスすることにより、陰性および陽性対照チューブを調製する。すべての試料および対照を１１４℃で３０分間熱溶解する。次に、試料を室温で１５分〜６時間冷却する。試料希釈剤の蓋をはずして捨てる。付録Ｉに従ってプライミングおよび増幅プレートを準備する。増幅反応を実施する。陽性と見なすためには、各スワブは２つのアッセイ（ＧＣモノプレックス／ＧＣ Ｑｘ）の少なくとも１つで結果が陽性となる必要がある。

希薄な（３％）Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｐｅｒｏｘｉｄｅを開封し格子の表面全体にわたってたっぷり塗布し、３分間放置する。表面をＴｅｒｉ−Ｔｏｗｅｌで一方向の動作で拭く。前述の「全般的な試験手順」を繰り返す。

ＥＬＩＭＩＮＡＳＥ（商標）と過酸化水素の比較
実験台の天板上で１’×２’の区画を合計６個測りテープで区切った。以下に示すように３つの区画が各々の浄化方法を代表している。

４８個のＰｏｓｉｔｉｖｅ ＣｏｎｔｒｏｌをＣＴ／ＧＣ ＳＤ １ｍＬで再懸濁し、３０分間１１４℃で溶解した後、１５分間冷却した。８個（８ｍＬ）のＰｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌを６つの区画各々の上に「こぼし」、スワブを使って広げた。前記区画を約３０分間乾燥させた。

浄化の前に、各区画から８個ずつスワブ試料を取り、充填済のＳＤチューブ内に絞り出した。次に、各区画について指定した浄化方法に従い前記区画を浄化した。浄化後、各区画からさらに８個ずつスワブ試料を取り、充填済のＳＤチューブ内に絞り出した。ＳＤ ２ｍＬをＣＴ／ＧＣ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ＣｏｎｔｒｏｌおよびＮｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌに加えた。次に、前記チューブを１１４℃にて３０分間溶解ブロック中で溶解した後、１５分間冷却した。試料１５０μＬを試験対象のプライミングウェルに加えてから室温で２０分間インキュベートした。ＣＴ／ＧＣの陽性および陰性対照１５０μＬを対照プライミングウェルに加えた。

前記プライミングプレートを７２℃の加熱ブロック上に載せ、増幅プレートを５４℃の加熱ブロック上に１０分間載せた。プライマー混合物１００μＬを、対応する増幅ウェルに移した。前記プレートに封をし、前記ＰｒｏｂｅＴｅｃの機器中で６０分間試験した。Ｅｌｉｍｉｎａｓｅおよび過酸化水素はいずれも有効な除染試薬であった。いずれも、汚染されたスワブ数を１００％低減させた。この結果は、「結果」セクションの表１および表２に示してある。

除染試薬としての希薄な過酸化水素の有効性
天板上に１”×１”の区画合計４８個を測りテープで区切った。１０．１１×１０^３の濃度のＧＣプラスミド保存液を使用して、ＧＣプラスミド希釈液を作製した。１：１０希釈剤を使用して、１０．１１×１０^２の最終的なＧＣプラスミド濃度を調製した。前記４８区画を「汚染する」のに十分な量を作製するため、前記ＧＣプラスミド保存液５００μＬと脱イオン水４５００μＬを混合した。

前記区画を約１時間乾燥させた。各区画からスワブ試料を２個ずつ取り、充填済のＳＤチューブ内に絞り出した。ＣＴ／ＧＣ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ＣｏｎｔｒｏｌおよびＮｅｇａｔｉｖｅ ＣｏｎｔｒｏｌならびにＱｘ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ＣｏｎｔｒｏｌにＳＤを２ｍＬ加えた。次に、前記チューブを１１４℃で３０分間溶解ブロック中で溶解し、その後１５分間冷却した。試験対象の前記プライミングウェルに試料１５０μＬを加えた後、室温で２０分間インキュベートした。

ＣＴ／ＧＣの陽性および陰性対照１５０μＬを対照プライミングウェルに加えた。前記プライミングプレートを７２℃の加熱ブロック上に載せ、増幅プレートを５４℃の加熱ブロック上に１０分間載せた。プライマー混合物１００μＬを、対応する増幅ウェルに移した。前記プレートに封をし、ＰｒｏｂｅＴｅｃ（登録商標）の機器中で６０分間試験した。本試験ではＧＣモノプレックスおよびＧＣダイプレックス（ｄｉｐｌｅｘ）の両方を試験した。汚染された前記４８個のます目上に希薄な過酸化水素をたっぷり注ぎ、３分間放置した後、一方向の動作で拭き取った。これらのステップを繰り返した後、各ます目からスワブを２個ずつ取り、処理の後、試験した。前記表面を過酸化水素で浄化した後の両アッセイにおいて９３／９６個のスワブが陰性であり、低減率は９７％となった。「結果」セクションの表３〜１０は、浄化前に得たデータを示している。表１１〜１８は、浄化後のデータを示している。

過酸化水素の効力安定性
前記過酸化水素の効力安定性も検証してある。実施例２で使用した前述の方法と同じ方法を１、３、５、および８日目に使用した。１日目に、前記過酸化水素の瓶を開封し、この同じ瓶を試験期間中使用した。各日の陽性低減率は以下のとおりであった：１日目９５％、３日目８１％、５日目８８％、および８日目８１％。汚染の低減における前記過酸化水素の効力はわずかに低下しているようであるが、この結果は、前記溶液の有効性がこの期間を通じ非常に高く保たれていることを示している。この結果は、「結果」セクションの表１９〜８２に示してある。

Claims (20)

1. 除染対象の表面に過酸化水素と水から本質的に成る溶液を接触させるステップと、
   前記表面から前記過酸化水素水溶液を拭き取るステップと
   を含むことを特徴とする表面上の核酸汚染を低減する方法。
2. 前記過酸化水素水溶液を拭き取る前に少なくとも約３分間放置するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記溶液中の過酸化水素の濃度は約０．５％と約３０％の間であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 前記溶液中の過酸化水素の濃度は約２％と約１０％の間であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
5. 前記溶液中の過酸化水素の濃度は約３％であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
6. 前記表面を水ですすぐ追加のステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. 前記汚染は放射性汚染物質を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
8. 過酸化水素と水から本質的に成る溶液中に物品を浸漬すること
   を含むことを特徴とする物品上の核酸汚染を低減する方法。
9. 前記溶液中の過酸化水素の濃度は約０．５％と約３０％の間であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
10. 前記溶液中の過酸化水素の濃度は約３％であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
11. 前記汚染は放射性汚染物質を含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
12. 過酸化水素と水から本質的に成る溶液中にタオルまたは布巾を浸漬するステップと、
    前記浸漬した布巾またはタオルで浄化対象の表面を拭くステップと
    を含むことを特徴とする表面上の核酸汚染を低減する方法。
13. 前記溶液中の過酸化水素の濃度は約０．５％と約３０％の間であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
14. 前記溶液中の過酸化水素の濃度は約３％であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
15. 乾いたタオルまたは布巾で前記表面を拭くステップをさらに含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
16. 水で浸漬したタオルで前記表面を拭くステップをさらに含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
17. 前記表面を水ですすぐステップをさらに含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
18. 除染対象の表面に過酸化水素と水から本質的に成る溶液を接触させるステップと、
    前記表面から前記溶液を拭き取るステップと
    から成ることを特徴とする表面上の核酸汚染を低減する方法。
19. 前記溶液中の過酸化水素の濃度は約０．５％と約３０％の間であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
20. 前記溶液中の過酸化水素の濃度は約３％であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。