JPH0866200A - その後の増幅のターゲットとなることができない核酸増幅反応産物の製造方法、該方法を使用する診断アッセイ、並びに該方法及びアッセイを実施するために適切なキット及び容器 - Google Patents
その後の増幅のターゲットとなることができない核酸増幅反応産物の製造方法、該方法を使用する診断アッセイ、並びに該方法及びアッセイを実施するために適切なキット及び容器Info
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- JPH0866200A JPH0866200A JP7217902A JP21790295A JPH0866200A JP H0866200 A JPH0866200 A JP H0866200A JP 7217902 A JP7217902 A JP 7217902A JP 21790295 A JP21790295 A JP 21790295A JP H0866200 A JPH0866200 A JP H0866200A
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 核酸増幅反応の汚染を解消する方法を提供す
る。 【解決手段】 その後の増幅のターゲットとなることが
できない１対以上のプライマーを使用する核酸増幅反応
産物の製造方法であって、１対のプライマーのハイブリ
ダイゼーション部位間に位置するヌクレオチド長の増幅
産物とハイブリダイズすることが可能であり且つ分解か
らのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしたハイブリ
ダイゼーション複合体の２本鎖部分を保護するように修
飾されたオリゴヌクレオチドと増幅産物との間にハイブ
リダイゼーション複合体を形成し得る条件下で、増幅産
物を前記オリゴヌクレオチドと接触させる段階と、少な
くともプライマーとハイブリダイズすることが可能なハ
イブリダイゼーション複合体の部分を分解するような状
況下でハイブリダイゼーション複合体を分解処理する段
階とを含む方法。
る。 【解決手段】 その後の増幅のターゲットとなることが
できない１対以上のプライマーを使用する核酸増幅反応
産物の製造方法であって、１対のプライマーのハイブリ
ダイゼーション部位間に位置するヌクレオチド長の増幅
産物とハイブリダイズすることが可能であり且つ分解か
らのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしたハイブリ
ダイゼーション複合体の２本鎖部分を保護するように修
飾されたオリゴヌクレオチドと増幅産物との間にハイブ
リダイゼーション複合体を形成し得る条件下で、増幅産
物を前記オリゴヌクレオチドと接触させる段階と、少な
くともプライマーとハイブリダイズすることが可能なハ
イブリダイゼーション複合体の部分を分解するような状
況下でハイブリダイゼーション複合体を分解処理する段
階とを含む方法。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はバイオテクノロジー
の分野、特に核酸増幅分野に関する。
の分野、特に核酸増幅分野に関する。
【０００２】
【従来技術及び発明が解決しようとする課題】ＰＣＲ及
び他の核酸増幅法の診断利用に立ちはだかる最大の問題
は、汚染性核酸による偽陽性である（Ｋｗｏｋ，Ｓ．，
ａｎｄ Ｒ．Ｈｉｇｕｃｈｉ．１９８９． Ａｗａｒｄ
ｉｎｇ ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｗｉｔｈ Ｐ
ＣＲ．Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３３９：２３７−
２３８）。ＰＣＲは感度が非常に高いので利用できない
ことが分かっており、僅かな量でもこのような配列が隣
接容器に移入すると、偽陽性結果を生じ得る。核酸汚染
は３種の汚染源に由来し得る。第１の汚染源は多数のタ
ーゲット分子を含む臨床試料に由来し、試料間の交差汚
染をもたらす。第２の汚染源は、先にクローニングした
プラスミドＤＮＡがＰＣＲで使用する試薬を汚染するこ
とに起因する。第３の汚染源は同一ターゲット配列の反
復増幅により実験室内でＰＣＲ産物（アンプリコン）が
蓄積することに起因する。この第３の汚染源は診断利用
に特に関係がある。
び他の核酸増幅法の診断利用に立ちはだかる最大の問題
は、汚染性核酸による偽陽性である（Ｋｗｏｋ，Ｓ．，
ａｎｄ Ｒ．Ｈｉｇｕｃｈｉ．１９８９． Ａｗａｒｄ
ｉｎｇ ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｗｉｔｈ Ｐ
ＣＲ．Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３３９：２３７−
２３８）。ＰＣＲは感度が非常に高いので利用できない
ことが分かっており、僅かな量でもこのような配列が隣
接容器に移入すると、偽陽性結果を生じ得る。核酸汚染
は３種の汚染源に由来し得る。第１の汚染源は多数のタ
ーゲット分子を含む臨床試料に由来し、試料間の交差汚
染をもたらす。第２の汚染源は、先にクローニングした
プラスミドＤＮＡがＰＣＲで使用する試薬を汚染するこ
とに起因する。第３の汚染源は同一ターゲット配列の反
復増幅により実験室内でＰＣＲ産物（アンプリコン）が
蓄積することに起因する。この第３の汚染源は診断利用
に特に関係がある。
【０００３】先の増幅からのＰＣＲ産物の制限フラグメ
ントであるプラスミドがこぼれたりはねたりすることに
より生じるＰＣＲの潜在的汚染以外に、他の持ち越し汚
染源もある。ピペット装置のバレルがエアゾールで汚染
され、交差汚染をもたらす恐れがある。ミクロトームや
かみそりの刃に着いたＤＮＡがその後のＰＣＲに持ち越
される恐れもある。また、サンプル調製中又はＰＣＲ産
物の分析中に使用する装置（例えばゲル装置、ドットブ
ロット装置、遠心機又はドライアイス／エタノール浴）
も潜在的汚染源であり得る（Ｓ．Ｋｗｏｋ（１９８
９）， Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２，ｐ．４）。
核酸をサンプルから単離する実験室領域と、増幅反応を
生じさせる実験室領域と、実際の増幅及び検出を実施す
る実験室領域とを分離するといった一般的な物理的予防
策により、偽陰性率は劇的に低下した。更に、サンプル
調製と反応実施に別個の供給源及びピペット装置の組み
合わせを使用しても低下を助長することができる。しか
しながら、実験室構成に関するこれらの手段では核酸材
料の増幅後に反応物の汚染を完全に阻止することはでき
ず、煩瑣で費用がかかる。研究実験室が予防策を講じる
ことはできるが、プレパッケージ品質管理診断キットを
入手可能になるまでは作業実験室に厳しい制約がある。
現状では臨床微生物学実験室にはＰＣＲ専用スペースも
なければ、偽陽性を頻繁に検査する意向もない。
ントであるプラスミドがこぼれたりはねたりすることに
より生じるＰＣＲの潜在的汚染以外に、他の持ち越し汚
染源もある。ピペット装置のバレルがエアゾールで汚染
され、交差汚染をもたらす恐れがある。ミクロトームや
かみそりの刃に着いたＤＮＡがその後のＰＣＲに持ち越
される恐れもある。また、サンプル調製中又はＰＣＲ産
物の分析中に使用する装置（例えばゲル装置、ドットブ
ロット装置、遠心機又はドライアイス／エタノール浴）
も潜在的汚染源であり得る（Ｓ．Ｋｗｏｋ（１９８
９）， Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２，ｐ．４）。
核酸をサンプルから単離する実験室領域と、増幅反応を
生じさせる実験室領域と、実際の増幅及び検出を実施す
る実験室領域とを分離するといった一般的な物理的予防
策により、偽陰性率は劇的に低下した。更に、サンプル
調製と反応実施に別個の供給源及びピペット装置の組み
合わせを使用しても低下を助長することができる。しか
しながら、実験室構成に関するこれらの手段では核酸材
料の増幅後に反応物の汚染を完全に阻止することはでき
ず、煩瑣で費用がかかる。研究実験室が予防策を講じる
ことはできるが、プレパッケージ品質管理診断キットを
入手可能になるまでは作業実験室に厳しい制約がある。
現状では臨床微生物学実験室にはＰＣＲ専用スペースも
なければ、偽陽性を頻繁に検査する意向もない。
【０００４】アンプリコン汚染は最も深刻な種類の汚染
であるが、標準反応では多数の分子が生成されるので、
遺憾ながら最も発生し易い。各増幅容器は１０12コピー
にも及ぶアンプリコンを含み得るので、最も小さいエア
ゾール液滴（１０-6μｌ）でも１０5個までの潜在ター
ゲットを含み得る。アンプリコンは定義によるとＰＣＲ
基質であることが分かっており、従って、その後の増幅
の理想的なターゲットである。試薬の新しい組合わせを
最適化及び試験する際には数百〜数千の増幅反応が実施
され得るという事実を考慮すると、アンプリコンの蓄積
が試薬、緩衝液、実験室ガラス器具類、オートクレーブ
及び換気システムの汚染に関与しているのは当然であ
る。この問題は、アッセイを一般に最大感度（１〜１０
鋳型分子）に調整する伝染病の診断では特に深刻であ
る。
であるが、標準反応では多数の分子が生成されるので、
遺憾ながら最も発生し易い。各増幅容器は１０12コピー
にも及ぶアンプリコンを含み得るので、最も小さいエア
ゾール液滴（１０-6μｌ）でも１０5個までの潜在ター
ゲットを含み得る。アンプリコンは定義によるとＰＣＲ
基質であることが分かっており、従って、その後の増幅
の理想的なターゲットである。試薬の新しい組合わせを
最適化及び試験する際には数百〜数千の増幅反応が実施
され得るという事実を考慮すると、アンプリコンの蓄積
が試薬、緩衝液、実験室ガラス器具類、オートクレーブ
及び換気システムの汚染に関与しているのは当然であ
る。この問題は、アッセイを一般に最大感度（１〜１０
鋳型分子）に調整する伝染病の診断では特に深刻であ
る。
【０００５】一般的な実験室予防策以外に、非ターゲッ
トＤＮＡによる増幅反応の汚染を解消するために数種の
物理的方法が開発されている。
トＤＮＡによる増幅反応の汚染を解消するために数種の
物理的方法が開発されている。
【０００６】先に増幅された核酸産物による増幅反応の
汚染の低減を目的とする多数の特許出願が提出されてい
る。ＷＯ９１１７．２７０号には、修飾増幅プライマー
を使用して区別可能に修飾した増幅産物を調製する段階
と、修飾増幅産物（ＡＰ）を選択的に除去するための手
段と修飾ＡＰを接触させる段階とを含む増幅手順で増幅
産物汚染を低減させるための方法が記載されている。修
飾はリガンド、架橋剤、酵素認識部位から選択される。
修飾ＡＰを選択的に除去する好適手段はＲＮアーゼ酵素
部位の使用である。このアプローチはＤＮＡプライマー
上にＲＮアーゼ部位を組み込むことによってのみ有効で
あり、他の方法ではＲＮアーゼは無効である。この方法
はＰＣＲ又はＬＣＲにしか使用することができず、ＮＡ
ＳＢＡ（ＲＮＡ増幅）反応では使用することができな
い。また、修飾ＡＰを除去するための手段はリガンドの
固定化特異的パートナー、特にビオチン又はフルオレセ
インであると記載されている。しかしながら、記載の方
法では増幅産物の持ち越し後にしか再増幅を阻止するこ
とができない。従って、増幅産物の検出反応後も増幅産
物はその後の増幅反応に持ち越され得る。
汚染の低減を目的とする多数の特許出願が提出されてい
る。ＷＯ９１１７．２７０号には、修飾増幅プライマー
を使用して区別可能に修飾した増幅産物を調製する段階
と、修飾増幅産物（ＡＰ）を選択的に除去するための手
段と修飾ＡＰを接触させる段階とを含む増幅手順で増幅
産物汚染を低減させるための方法が記載されている。修
飾はリガンド、架橋剤、酵素認識部位から選択される。
修飾ＡＰを選択的に除去する好適手段はＲＮアーゼ酵素
部位の使用である。このアプローチはＤＮＡプライマー
上にＲＮアーゼ部位を組み込むことによってのみ有効で
あり、他の方法ではＲＮアーゼは無効である。この方法
はＰＣＲ又はＬＣＲにしか使用することができず、ＮＡ
ＳＢＡ（ＲＮＡ増幅）反応では使用することができな
い。また、修飾ＡＰを除去するための手段はリガンドの
固定化特異的パートナー、特にビオチン又はフルオレセ
インであると記載されている。しかしながら、記載の方
法では増幅産物の持ち越し後にしか再増幅を阻止するこ
とができない。従って、増幅産物の検出反応後も増幅産
物はその後の増幅反応に持ち越され得る。
【０００７】ＷＯ９２０１−８１４号には、慣用及び非
慣用ｎＴＰの混合により先の増幅からの核酸配列で汚染
した核酸増幅反応系の滅菌方法が開示されており、該方
法は、非慣用ヌクレオチドの共有結合を加水分解するこ
とにより汚染性増幅産物を分解する。
慣用ｎＴＰの混合により先の増幅からの核酸配列で汚染
した核酸増幅反応系の滅菌方法が開示されており、該方
法は、非慣用ヌクレオチドの共有結合を加水分解するこ
とにより汚染性増幅産物を分解する。
【０００８】Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．のヨーロッパ特許第４９６
４８３号には、核酸増幅反応でリボース残基を含むプラ
イマー又はポリヌクレオチド基質を使用した後、増幅産
物内のリボヌクレオチド結合を開裂させることにより、
核酸増幅反応における増幅産物による汚染を低減させる
方法が記載されている。増幅産物を除去し、持ち越しを
阻止する開裂操作は、増幅産物の検出後に行われるの
で、場合によっては増幅産物の持ち越し後に行われる。
従って、その後の増幅反応前にリボースの開裂を実施す
べきである。この方法を使用可能な増幅反応はＰＣＲ、
ＬＣＲ又は転写に基づく反応であり得る。ＮＡＳＢＡ又
はＲＮＡを使用する他の増幅反応には使用することがで
きない。
ｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．のヨーロッパ特許第４９６
４８３号には、核酸増幅反応でリボース残基を含むプラ
イマー又はポリヌクレオチド基質を使用した後、増幅産
物内のリボヌクレオチド結合を開裂させることにより、
核酸増幅反応における増幅産物による汚染を低減させる
方法が記載されている。増幅産物を除去し、持ち越しを
阻止する開裂操作は、増幅産物の検出後に行われるの
で、場合によっては増幅産物の持ち越し後に行われる。
従って、その後の増幅反応前にリボースの開裂を実施す
べきである。この方法を使用可能な増幅反応はＰＣＲ、
ＬＣＲ又は転写に基づく反応であり得る。ＮＡＳＢＡ又
はＲＮＡを使用する他の増幅反応には使用することがで
きない。
【０００９】Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉ
ｎｃ．のヨーロッパ特許第５２２８８４号には、その末
端の１個以上又はその近傍にエキソサンプルヌクレオチ
ドを含む１個以上のオリゴヌクレオチドに依存して第１
のサンプルで増幅を行い、増幅核酸を生成する段階と、
エキソヌクレオチドを含まない核酸の増幅を妨げずに増
幅核酸を増幅不能にするように第２のサンプルを処理す
る段階とを含む核酸のオリゴヌクレオチド依存性増幅方
法が記載されている。１本鎖核酸及び４個以上のＤＮＡ
プローブを提供した後、プローブをハイブリダイズさ
せ、連結してプローブ配列を形成し、サンプル中のＤＮ
Ａを変性させるサイクルを繰り返し実施し、結合したプ
ローブ配列を検出することにより、サンプル中のターゲ
ット核酸を検出する方法も開示されている。第１及び第
２のプローブは一次プローブである。これらのプローブ
は１本鎖であり、プローブを結合できるように鎖又はタ
ーゲット核酸の部分とハイブリダイズすることが可能で
ある。第３及び第４のプローブは夫々第１及び第２のプ
ローブとハイブリダイズする。少なくとも第１のプロー
ブの３’ヌクレオチド及び第２のプローブの５’ヌクレ
オチドは第４のプローブの３’ヌクレオチド及び第３の
プローブの５’ヌクレオチドと同様にデオキシウリジン
である。結合したプローブ配列を検出する前にサンプル
をＵＤＧで処理し、結合プローブのウラシル及びデオキ
シリボース部分間のグリコシド結合を切断する。この方
法の変形として、ヨーロッパ特許第４０１−０３７号の
開示では、増幅核酸にもデオキシウリジンを取り込むの
で、増幅産物をそのままでは鋳型として使用することが
できない。
ｎｃ．のヨーロッパ特許第５２２８８４号には、その末
端の１個以上又はその近傍にエキソサンプルヌクレオチ
ドを含む１個以上のオリゴヌクレオチドに依存して第１
のサンプルで増幅を行い、増幅核酸を生成する段階と、
エキソヌクレオチドを含まない核酸の増幅を妨げずに増
幅核酸を増幅不能にするように第２のサンプルを処理す
る段階とを含む核酸のオリゴヌクレオチド依存性増幅方
法が記載されている。１本鎖核酸及び４個以上のＤＮＡ
プローブを提供した後、プローブをハイブリダイズさ
せ、連結してプローブ配列を形成し、サンプル中のＤＮ
Ａを変性させるサイクルを繰り返し実施し、結合したプ
ローブ配列を検出することにより、サンプル中のターゲ
ット核酸を検出する方法も開示されている。第１及び第
２のプローブは一次プローブである。これらのプローブ
は１本鎖であり、プローブを結合できるように鎖又はタ
ーゲット核酸の部分とハイブリダイズすることが可能で
ある。第３及び第４のプローブは夫々第１及び第２のプ
ローブとハイブリダイズする。少なくとも第１のプロー
ブの３’ヌクレオチド及び第２のプローブの５’ヌクレ
オチドは第４のプローブの３’ヌクレオチド及び第３の
プローブの５’ヌクレオチドと同様にデオキシウリジン
である。結合したプローブ配列を検出する前にサンプル
をＵＤＧで処理し、結合プローブのウラシル及びデオキ
シリボース部分間のグリコシド結合を切断する。この方
法の変形として、ヨーロッパ特許第４０１−０３７号の
開示では、増幅核酸にもデオキシウリジンを取り込むの
で、増幅産物をそのままでは鋳型として使用することが
できない。
【００１０】ＷＯ９２００３８４号には、増幅サイクル
の停止後に増幅産物をそれ以上増幅できないようにする
こと及び／又はＰＣＲの開始前に同一プライマーを使用
してＰＣＲ反応で先に形成された増幅産物の反応を選択
的に阻止する前処理を適用することが記載されている。
プライマーはリボース残基と、相補的配列に切断を生じ
るか又は２個のプライマーにより結合したＤＮＡの２本
の鎖間に共有結合架橋を形成する物質（例えばプソラレ
ン）とを含み得る。プソラレンは２本鎖ＤＮＡへの挿入
及び２３〜４００ｎｍの波長の光による光活性化後に鎖
間架橋を形成する。あるいは、Ｔａｑ ＤＮＡ−ポリメ
ラーゼを許容する全ＰＣＲ試薬の存在下でゲノムＤＮＡ
のγ線照射を使用することもできる。照射後もＰＣＲ混
合物は新たに加えるターゲットＤＮＡを増幅することが
できるが、線量が高いと増幅効率は低下すると思われ
る。不活性化はＤＮＡ鋳型の長さ及び種類に依存し、個
々の増幅システム毎に最適化しなければならない。
の停止後に増幅産物をそれ以上増幅できないようにする
こと及び／又はＰＣＲの開始前に同一プライマーを使用
してＰＣＲ反応で先に形成された増幅産物の反応を選択
的に阻止する前処理を適用することが記載されている。
プライマーはリボース残基と、相補的配列に切断を生じ
るか又は２個のプライマーにより結合したＤＮＡの２本
の鎖間に共有結合架橋を形成する物質（例えばプソラレ
ン）とを含み得る。プソラレンは２本鎖ＤＮＡへの挿入
及び２３〜４００ｎｍの波長の光による光活性化後に鎖
間架橋を形成する。あるいは、Ｔａｑ ＤＮＡ−ポリメ
ラーゼを許容する全ＰＣＲ試薬の存在下でゲノムＤＮＡ
のγ線照射を使用することもできる。照射後もＰＣＲ混
合物は新たに加えるターゲットＤＮＡを増幅することが
できるが、線量が高いと増幅効率は低下すると思われ
る。不活性化はＤＮＡ鋳型の長さ及び種類に依存し、個
々の増幅システム毎に最適化しなければならない。
【００１１】ＰＣＲにおける汚染を防ぐために紫外線照
射を使用することと、その予想される欠点も広く論じら
れている。ＤＮＡの非二量体光損傷以外に、紫外線不活
性化の主要な経路は同一ＤＮＡ鎖上の隣接ピリミジンの
架橋である。反応は光可逆的であり、二量体化及び非二
量体化ピリミジン対の間には定常状態が存在する。二量
体化ピリミジンのフラクションは所与のＤＮＡターゲッ
トで観察される紫外線不活性化の百分率に相当する。
射を使用することと、その予想される欠点も広く論じら
れている。ＤＮＡの非二量体光損傷以外に、紫外線不活
性化の主要な経路は同一ＤＮＡ鎖上の隣接ピリミジンの
架橋である。反応は光可逆的であり、二量体化及び非二
量体化ピリミジン対の間には定常状態が存在する。二量
体化ピリミジンのフラクションは所与のＤＮＡターゲッ
トで観察される紫外線不活性化の百分率に相当する。
【００１２】二量体化は可逆性であるため、ＤＮＡター
ゲットの長さと内部配列の双方を考慮しなければならな
い。チミジン対の数が多く長い配列のほうが、短い配列
よりも不活性化し易い。しかしながら、紫外線照射の成
功後にＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及び真のターゲット
ＤＮＡを加えると、多少のレベルの偽陽性ＰＣＲシグナ
ルが生じ得る（ＢＦＥ ｖｏｌ．８ ｎｒ．１０， ｏ
ｋｔｏｂｅｒ １９９１， Ｍａｒｔｉｎ Ｈｅｉｎｒ
ｉｃｈ，ＰＣＲ ｃａｒｒｙ−ｏｖｅｒ）。
ゲットの長さと内部配列の双方を考慮しなければならな
い。チミジン対の数が多く長い配列のほうが、短い配列
よりも不活性化し易い。しかしながら、紫外線照射の成
功後にＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及び真のターゲット
ＤＮＡを加えると、多少のレベルの偽陽性ＰＣＲシグナ
ルが生じ得る（ＢＦＥ ｖｏｌ．８ ｎｒ．１０， ｏ
ｋｔｏｂｅｒ １９９１， Ｍａｒｔｉｎ Ｈｅｉｎｒ
ｉｃｈ，ＰＣＲ ｃａｒｒｙ−ｏｖｅｒ）。
【００１３】プソラレン誘導体である４’−アミノエチ
ル−４，５’−ジメチルイソプソラレン（４’−ＡＭＤ
ＭＩＰ）の使用は記載されている（Ｃｉｍｉｎｏ，Ｇ．
Ｄ．， Ｋ．Ｃ．Ｍｅｔｃｈｅｔｔｅ， Ｊ．Ｗ．Ｔｅ
ｓｓｍａｎ， Ｊ．Ｅ．Ｈｅａｒｓｔ， ａｎｄ Ｓ．
Ｔ．Ｉｓｓａｃｓ． １９９１， ＮｕｃｌｅｉｃＡｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：９９−１０７及びＩｓｓａｃ
ｓ，Ｓ．Ｔ．ら，１９９１， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ． １９：１０９−１１６）。この化合物
は増幅前にＰＣＲ混合物に加え、プライマーアニーリン
グ又はＴａｑポリメラーゼ活性を実質的に妨げず、熱的
に安定である。増幅後で且つポリプロピレン反応管の開
放後、管に長波長ＵＶ光を照射すると、長波長ＵＶ光は
管に侵入してイソプソラレンを光化学的に活性化する
が、ＤＮＡは損傷しない。次いで活性化されたプソラレ
ンはピリミジン残基との間でシクロブタン付加物を増幅
ＤＮＡ上に形成し、その後の増幅でＴａｑポリメラーゼ
が分子を横断できないようにする。この方法の効率は一
部には確率により表され、アンプリコンの長さ及びヌク
レオチド塩基組成に依存して著しく高くすることができ
る。一般に、約５０％Ｇ＋Ｃ含量を有する３００ｂｐ長
を越えるアンプリコンの場合には、ほぼ完全な滅菌に達
することができる。しかしながら、イソプソラレンやウ
リジンを使用する滅菌方法はいずれも改善の余地があ
る。光化学法では、非常に短いアンプリコン又はＧＣに
富むアンプリコンを不活性化するために必要な高イソプ
ソラレン濃度でＰＣＲの阻害が観察された。更に、アン
プリコンの検出に内部ハイブリダイゼーションプローブ
を使用する場合には、増幅ＤＮＡにおけるイソプソラレ
ン架橋の存在を相殺するためにより低いハイブリダイゼ
ーションストリンジェンシーが必要であり得る。ＵＮＧ
プロトコルに伴う潜在的問題としては、ＰＣＲ法で変性
及びアニーリングに使用する高温ではＵＮＧ活性を完全
に除去できないという問題がある。ＰＣＲの初期サイク
ルではウラシル含有鎖は生成されるや否や不活性化され
得るので、残留ＵＮＧ活性は系の感度に影響し得る。更
に、多くのＰＣＲプロトコルではＴＴＰの代わりにｄＵ
ＴＰを使用すると増幅効率が低下し、感度を回復するた
めにはデオキシヌクレオシド三リン酸プールを補う必要
がある。
ル−４，５’−ジメチルイソプソラレン（４’−ＡＭＤ
ＭＩＰ）の使用は記載されている（Ｃｉｍｉｎｏ，Ｇ．
Ｄ．， Ｋ．Ｃ．Ｍｅｔｃｈｅｔｔｅ， Ｊ．Ｗ．Ｔｅ
ｓｓｍａｎ， Ｊ．Ｅ．Ｈｅａｒｓｔ， ａｎｄ Ｓ．
Ｔ．Ｉｓｓａｃｓ． １９９１， ＮｕｃｌｅｉｃＡｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：９９−１０７及びＩｓｓａｃ
ｓ，Ｓ．Ｔ．ら，１９９１， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ． １９：１０９−１１６）。この化合物
は増幅前にＰＣＲ混合物に加え、プライマーアニーリン
グ又はＴａｑポリメラーゼ活性を実質的に妨げず、熱的
に安定である。増幅後で且つポリプロピレン反応管の開
放後、管に長波長ＵＶ光を照射すると、長波長ＵＶ光は
管に侵入してイソプソラレンを光化学的に活性化する
が、ＤＮＡは損傷しない。次いで活性化されたプソラレ
ンはピリミジン残基との間でシクロブタン付加物を増幅
ＤＮＡ上に形成し、その後の増幅でＴａｑポリメラーゼ
が分子を横断できないようにする。この方法の効率は一
部には確率により表され、アンプリコンの長さ及びヌク
レオチド塩基組成に依存して著しく高くすることができ
る。一般に、約５０％Ｇ＋Ｃ含量を有する３００ｂｐ長
を越えるアンプリコンの場合には、ほぼ完全な滅菌に達
することができる。しかしながら、イソプソラレンやウ
リジンを使用する滅菌方法はいずれも改善の余地があ
る。光化学法では、非常に短いアンプリコン又はＧＣに
富むアンプリコンを不活性化するために必要な高イソプ
ソラレン濃度でＰＣＲの阻害が観察された。更に、アン
プリコンの検出に内部ハイブリダイゼーションプローブ
を使用する場合には、増幅ＤＮＡにおけるイソプソラレ
ン架橋の存在を相殺するためにより低いハイブリダイゼ
ーションストリンジェンシーが必要であり得る。ＵＮＧ
プロトコルに伴う潜在的問題としては、ＰＣＲ法で変性
及びアニーリングに使用する高温ではＵＮＧ活性を完全
に除去できないという問題がある。ＰＣＲの初期サイク
ルではウラシル含有鎖は生成されるや否や不活性化され
得るので、残留ＵＮＧ活性は系の感度に影響し得る。更
に、多くのＰＣＲプロトコルではＴＴＰの代わりにｄＵ
ＴＰを使用すると増幅効率が低下し、感度を回復するた
めにはデオキシヌクレオシド三リン酸プールを補う必要
がある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記種々の方
法の欠点を示さずに核酸の増幅反応後の反応の汚染を化
学的に防止する方法の開発に関する。特に、ＲＮＡを使
用する方法（例えばＮＡＳＢＡ）の化学的汚染防止法が
望ましい。更に、本発明の方法は増幅産物の部分的分解
に基づくが、依然としてオリゴヌクレオチドハイブリダ
イゼーションによる増幅産物の検出が可能である。核酸
の分解は、特異的ＤＮアーゼ（ＤＮアーゼＩ、制限酵
素、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ）及びＲ
Ｎアーゼ（ＲＮアーゼＡ、ＲＮアーゼＴ１、ＲＮアーゼ
Ｕ、エキソヌクレアーゼ）を使用するか又はＤＮＡとＲ
ＮＡを同時に分解することが可能な非特異的ヌクレアー
ゼ（Ｓ１ヌクレアーゼ、ＲＮアーゼを含むＤＮアーゼＩ
等）を使用して実施することができる。
法の欠点を示さずに核酸の増幅反応後の反応の汚染を化
学的に防止する方法の開発に関する。特に、ＲＮＡを使
用する方法（例えばＮＡＳＢＡ）の化学的汚染防止法が
望ましい。更に、本発明の方法は増幅産物の部分的分解
に基づくが、依然としてオリゴヌクレオチドハイブリダ
イゼーションによる増幅産物の検出が可能である。核酸
の分解は、特異的ＤＮアーゼ（ＤＮアーゼＩ、制限酵
素、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ）及びＲ
Ｎアーゼ（ＲＮアーゼＡ、ＲＮアーゼＴ１、ＲＮアーゼ
Ｕ、エキソヌクレアーゼ）を使用するか又はＤＮＡとＲ
ＮＡを同時に分解することが可能な非特異的ヌクレアー
ゼ（Ｓ１ヌクレアーゼ、ＲＮアーゼを含むＤＮアーゼＩ
等）を使用して実施することができる。
【００１５】本発明はその後の増幅のためのターゲット
となることができない１対以上のプライマーを使用する
核酸増幅反応産物の製造方法に係り、該方法は、１対の
プライマーのハイブリダイゼーション部位間に位置する
ヌクレオチド長の増幅産物とハイブリダイズすることが
可能であり且つ分解からのオリゴヌクレオチドとハイブ
リダイズしたハイブリダイゼーション複合体の２本鎖部
分を保護するように修飾されたオリゴヌクレオチドと増
幅産物との間にハイブリダイゼーション複合体を形成し
得る条件下で、増幅産物を前記オリゴヌクレオチドと接
触させる段階と、少なくともプライマーとハイブリダイ
ズすることが可能なハイブリダイゼーション複合体の部
分を分解するような状況でハイブリダイゼーション複合
体を分解処理する段階とを含む。
となることができない１対以上のプライマーを使用する
核酸増幅反応産物の製造方法に係り、該方法は、１対の
プライマーのハイブリダイゼーション部位間に位置する
ヌクレオチド長の増幅産物とハイブリダイズすることが
可能であり且つ分解からのオリゴヌクレオチドとハイブ
リダイズしたハイブリダイゼーション複合体の２本鎖部
分を保護するように修飾されたオリゴヌクレオチドと増
幅産物との間にハイブリダイゼーション複合体を形成し
得る条件下で、増幅産物を前記オリゴヌクレオチドと接
触させる段階と、少なくともプライマーとハイブリダイ
ズすることが可能なハイブリダイゼーション複合体の部
分を分解するような状況でハイブリダイゼーション複合
体を分解処理する段階とを含む。
【００１６】本発明の方法では、検出オリゴヌクレオチ
ドは好ましくは、別のヌクレオチドを付加して伸長する
ことができない３’末端を含む。このための手段は当業
者に公知である。更に、本発明の適切な態様では、ハイ
ブリダイゼーション複合体の部分的分解段階は、増幅産
物と検出オリゴヌクレオチドの複合体を分解することが
できないヌクレアーゼを使用することにより実施するこ
とができる。ヌクレアーゼにより分解することができな
い検出オリゴヌクレオチドの１例は、ヌクレアーゼによ
り分解できないようにするために十分な数のヌクレオチ
ドの２’−Ｏ−メチル修飾を含むオリゴヌクレオチド、
好ましくはこうして修飾されたヌクレオチドのみを含む
オリゴヌクレオチドである。ＮＡＳＢＡ増幅反応の場合
には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両者を増幅するので、方法を
成功させるためにはＤＮＡ及びＲＮＡの両者を同時に分
解すべきである。従って、このような場合にはＤＮＡ及
びＲＮＡの両者を分解するヌクレアーゼ又はヌクレアー
ゼ混合物を用いて本発明の方法を実施することができ
る。ＤＮアーゼ Ｉ、制限酵素、エンドヌクレアーゼ又
はエキソヌクレアーゼ等の特異的ＤＮアーゼを使用して
分解を実施し、ＤＮＡのみを分解することも可能であ
る。特にＲＮＡを分解するためには、ＲＮアーゼＴ、Ｒ
Ｎアーゼ Ｕ、ＲＮアーゼ Ａ又はエキソヌクレアーゼ
等の特異的ＲＮアーゼを使用することができる。ＤＮＡ
及びＲＮＡの両者を同時に分解することが可能な非特異
的ヌクレアーゼを使用して分解を実施することも可能で
ある。別の態様によると、本発明の方法の分解段階は、
ヌクレアーゼを用いて酵素的に実施するのでなく、化学
的に実施することもできる。
ドは好ましくは、別のヌクレオチドを付加して伸長する
ことができない３’末端を含む。このための手段は当業
者に公知である。更に、本発明の適切な態様では、ハイ
ブリダイゼーション複合体の部分的分解段階は、増幅産
物と検出オリゴヌクレオチドの複合体を分解することが
できないヌクレアーゼを使用することにより実施するこ
とができる。ヌクレアーゼにより分解することができな
い検出オリゴヌクレオチドの１例は、ヌクレアーゼによ
り分解できないようにするために十分な数のヌクレオチ
ドの２’−Ｏ−メチル修飾を含むオリゴヌクレオチド、
好ましくはこうして修飾されたヌクレオチドのみを含む
オリゴヌクレオチドである。ＮＡＳＢＡ増幅反応の場合
には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両者を増幅するので、方法を
成功させるためにはＤＮＡ及びＲＮＡの両者を同時に分
解すべきである。従って、このような場合にはＤＮＡ及
びＲＮＡの両者を分解するヌクレアーゼ又はヌクレアー
ゼ混合物を用いて本発明の方法を実施することができ
る。ＤＮアーゼ Ｉ、制限酵素、エンドヌクレアーゼ又
はエキソヌクレアーゼ等の特異的ＤＮアーゼを使用して
分解を実施し、ＤＮＡのみを分解することも可能であ
る。特にＲＮＡを分解するためには、ＲＮアーゼＴ、Ｒ
Ｎアーゼ Ｕ、ＲＮアーゼ Ａ又はエキソヌクレアーゼ
等の特異的ＲＮアーゼを使用することができる。ＤＮＡ
及びＲＮＡの両者を同時に分解することが可能な非特異
的ヌクレアーゼを使用して分解を実施することも可能で
ある。別の態様によると、本発明の方法の分解段階は、
ヌクレアーゼを用いて酵素的に実施するのでなく、化学
的に実施することもできる。
【００１７】要約すると、本発明の特定態様では例えば
ハイブリダイゼーション分析により増幅産物の検出が可
能でありながら、先に生成された増幅産物が増幅反応
物、特にＲＮＡを使用する増幅反応物（例えばＮＡＳＢ
Ａ増幅反応物）を汚染しないようにするためにヌクレア
ーゼとヌクレアーゼ耐性プローブ（２’−Ｏ−Ｍｅ−オ
リゴヌクレオチド）を併用するという点が独自である。
従来記載されている汚染防止化学又は従来公知の方法は
ＮＡＳＢＡ等のＲＮＡ増幅反応では有効ではない。唯一
の例外は、理論的に使用可能なイソプソラレンを使用す
る増幅産物の増幅後滅菌方法である。しかしながら、Ｎ
ＡＳＢＡ増幅に実際に適合可能な適切なイソプソラレン
は未だ発見されていない。本発明の方法はあらゆるタイ
プの増幅反応の汚染を防止するために使用することがで
きるが、特にＮＡＳＢＡ反応等のＲＮＡ増幅反応の汚染
の問題を解決する。方法が特にエアゾール液滴による持
ち越しの除去に関する場合には、最終反応混合物のエア
ゾール液滴中に存在する増幅可能な増幅産物の量が検出
不能となるように方法を使用すべきであり、即ち増幅可
能な産物１０5分子／μｌ以下、好ましくは１０4分子／
μｌ以下となるようにすべきである。これは十分な量の
ヌクレアーゼを使用することにより対処することができ
る。当業者はヌクレアーゼの活性に基づいてこの量を決
定することができよう。バッチ当たりのヌクレアーゼ活
性は一定していないので、具体的な量を与えることはで
きない。この量は当業者に周知の通り、個々に決定しな
ければならない。
ハイブリダイゼーション分析により増幅産物の検出が可
能でありながら、先に生成された増幅産物が増幅反応
物、特にＲＮＡを使用する増幅反応物（例えばＮＡＳＢ
Ａ増幅反応物）を汚染しないようにするためにヌクレア
ーゼとヌクレアーゼ耐性プローブ（２’−Ｏ−Ｍｅ−オ
リゴヌクレオチド）を併用するという点が独自である。
従来記載されている汚染防止化学又は従来公知の方法は
ＮＡＳＢＡ等のＲＮＡ増幅反応では有効ではない。唯一
の例外は、理論的に使用可能なイソプソラレンを使用す
る増幅産物の増幅後滅菌方法である。しかしながら、Ｎ
ＡＳＢＡ増幅に実際に適合可能な適切なイソプソラレン
は未だ発見されていない。本発明の方法はあらゆるタイ
プの増幅反応の汚染を防止するために使用することがで
きるが、特にＮＡＳＢＡ反応等のＲＮＡ増幅反応の汚染
の問題を解決する。方法が特にエアゾール液滴による持
ち越しの除去に関する場合には、最終反応混合物のエア
ゾール液滴中に存在する増幅可能な増幅産物の量が検出
不能となるように方法を使用すべきであり、即ち増幅可
能な産物１０5分子／μｌ以下、好ましくは１０4分子／
μｌ以下となるようにすべきである。これは十分な量の
ヌクレアーゼを使用することにより対処することができ
る。当業者はヌクレアーゼの活性に基づいてこの量を決
定することができよう。バッチ当たりのヌクレアーゼ活
性は一定していないので、具体的な量を与えることはで
きない。この量は当業者に周知の通り、個々に決定しな
ければならない。
【００１８】本発明の方法では、検出の目的にオリゴヌ
クレオチドを使用することができるが、固定にも有用で
ある。オリゴヌクレオチドを検出目的に使用する場合に
は、酵素（ＨＲＰ，ＡＰ）、蛍光基、電気化学発光ラベ
ル、染料又は放射性同位体等の検出可能なマーカーを備
えることができる。本発明の方法では当業者に自明の通
り、ハイブリダイズした核酸の検出に使用することが一
般に知られている任意の検出可能なマーカーを使用する
ことができる。本発明の方法は分解前に第２のオリゴヌ
クレオチドを加えることにより実施することもでき、該
第２のオリゴヌクレオチドは増幅核酸とのハイブリダイ
ゼーションを生じるために増幅産物のヌクレオチド長と
十分相同である。第１のオリゴヌクレオチドを固定目的
に使用する場合にはこのような第２のオリゴヌクレオチ
ドに検出可能なマーカーを備え、逆に第２のオリゴヌク
レオチドを固定目的に使用する場合には第１のオリゴヌ
クレオチドに検出可能なマーカーを備える。第２のオリ
ゴヌクレオチドを第１のオリゴヌクレオチドと同時に加
えてもよい。第２のオリゴヌクレオチドのハイブリダイ
ゼーションのためのヌクレオチド長は増幅に使用する２
個のプライマーのハイブリダイゼーション部位の間に位
置し且つ、第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズ
する増幅産物長の最後のヌクレオチドの４ヌクレオチド
以内である。好ましくは、オリゴヌクレオチドは２個の
オリゴヌクレオチド間のギャップができるだけ小さく、
最適には隣接するように選択され、ハイブリダイゼーシ
ョンにより２個のオリゴヌクレオチドと増幅産物とのハ
イブリダイゼーション複合体が形成されるような状況を
形成する。中間濯ぎ段階を介して２個のオリゴヌクレオ
チドを順次加えることも可能である。オリゴヌクレオチ
ドはそれ自体公知の方法で５’又は３’末端を介して固
定することができ、その後、それ自体公知の方法で検出
することができる。第２のオリゴヌクレオチドを加える
場合には、第２のヌクレオチドの５’又は３’末端に検
出可能なマーカーを備えてもよいし、逆に第１のヌクレ
オチドに検出可能なマーカーを備えて第２のヌクレオチ
ドを複合体に固定してもよい。本発明の１態様ではオリ
ゴヌクレオチドの一方が他方のオリゴヌクレオチドとハ
イブリダイズする増幅産物長の最後のヌクレオチドに近
い側、好ましくは隣接する側にテーリングを示すことも
可能である。好適態様によると、２個のオリゴヌクレオ
チドが夫々他方のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズ
する増幅産物長の最後のヌクレオチドに近い側、好まし
くは隣接するヌクレオチド部位にテーリングを示すこと
も可能である。その場合、テールは少なくとも２ヌクレ
オチド長、好ましくは５ヌクレオチド長以上にわたって
相補的であることが好ましく、複合体を安定化できると
思われる。
クレオチドを使用することができるが、固定にも有用で
ある。オリゴヌクレオチドを検出目的に使用する場合に
は、酵素（ＨＲＰ，ＡＰ）、蛍光基、電気化学発光ラベ
ル、染料又は放射性同位体等の検出可能なマーカーを備
えることができる。本発明の方法では当業者に自明の通
り、ハイブリダイズした核酸の検出に使用することが一
般に知られている任意の検出可能なマーカーを使用する
ことができる。本発明の方法は分解前に第２のオリゴヌ
クレオチドを加えることにより実施することもでき、該
第２のオリゴヌクレオチドは増幅核酸とのハイブリダイ
ゼーションを生じるために増幅産物のヌクレオチド長と
十分相同である。第１のオリゴヌクレオチドを固定目的
に使用する場合にはこのような第２のオリゴヌクレオチ
ドに検出可能なマーカーを備え、逆に第２のオリゴヌク
レオチドを固定目的に使用する場合には第１のオリゴヌ
クレオチドに検出可能なマーカーを備える。第２のオリ
ゴヌクレオチドを第１のオリゴヌクレオチドと同時に加
えてもよい。第２のオリゴヌクレオチドのハイブリダイ
ゼーションのためのヌクレオチド長は増幅に使用する２
個のプライマーのハイブリダイゼーション部位の間に位
置し且つ、第１のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズ
する増幅産物長の最後のヌクレオチドの４ヌクレオチド
以内である。好ましくは、オリゴヌクレオチドは２個の
オリゴヌクレオチド間のギャップができるだけ小さく、
最適には隣接するように選択され、ハイブリダイゼーシ
ョンにより２個のオリゴヌクレオチドと増幅産物とのハ
イブリダイゼーション複合体が形成されるような状況を
形成する。中間濯ぎ段階を介して２個のオリゴヌクレオ
チドを順次加えることも可能である。オリゴヌクレオチ
ドはそれ自体公知の方法で５’又は３’末端を介して固
定することができ、その後、それ自体公知の方法で検出
することができる。第２のオリゴヌクレオチドを加える
場合には、第２のヌクレオチドの５’又は３’末端に検
出可能なマーカーを備えてもよいし、逆に第１のヌクレ
オチドに検出可能なマーカーを備えて第２のヌクレオチ
ドを複合体に固定してもよい。本発明の１態様ではオリ
ゴヌクレオチドの一方が他方のオリゴヌクレオチドとハ
イブリダイズする増幅産物長の最後のヌクレオチドに近
い側、好ましくは隣接する側にテーリングを示すことも
可能である。好適態様によると、２個のオリゴヌクレオ
チドが夫々他方のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズ
する増幅産物長の最後のヌクレオチドに近い側、好まし
くは隣接するヌクレオチド部位にテーリングを示すこと
も可能である。その場合、テールは少なくとも２ヌクレ
オチド長、好ましくは５ヌクレオチド長以上にわたって
相補的であることが好ましく、複合体を安定化できると
思われる。
【００１９】本発明で使用するオリゴヌクレオチドは、
増幅反応条件下で良好なハイブリダイゼーション及び安
定性を確保するために、好ましくは少なくとも１０ヌク
レオチド長、好ましくは１１〜３０ヌクレオチド長にわ
たって増幅産物とハイブリダイズする。プライマー対間
の核酸を認識する核酸特異抗体を使用して検出又は固定
の目的で本発明の方法を実施することもできる。
増幅反応条件下で良好なハイブリダイゼーション及び安
定性を確保するために、好ましくは少なくとも１０ヌク
レオチド長、好ましくは１１〜３０ヌクレオチド長にわ
たって増幅産物とハイブリダイズする。プライマー対間
の核酸を認識する核酸特異抗体を使用して検出又は固定
の目的で本発明の方法を実施することもできる。
【００２０】ハイブリダイゼーション及び分解段階は３
０〜８０℃、好ましくは４０〜７０℃、より好ましくは
４０〜６４℃の温度で首尾よく実施することができる。
この温度範囲は、方法がＮＡＳＢＡ増幅反応で使用する
のに非常に適していることを意味する。
０〜８０℃、好ましくは４０〜７０℃、より好ましくは
４０〜６４℃の温度で首尾よく実施することができる。
この温度範囲は、方法がＮＡＳＢＡ増幅反応で使用する
のに非常に適していることを意味する。
【００２１】持ち越し汚染の危険を最小限にするために
は、増幅産物の分解前に増幅産物の容器の開放回数をで
きるだけ少なくし、好ましくはただ１回だけ開放し、よ
り好ましくは全く開放しないように本発明の方法を実施
することが好ましい。本発明の方法では、容器内で分解
前にハイブリダイゼーションが行われるように反応体を
加える。本発明は上記方法のみならず、サンプル中の特
定核酸配列の存在を診断するためのアッセイにも関し、
該アッセイは、ａ）それ自体公知の方法でサンプルから
核酸を単離する段階と、ｂ）それ自体公知の方法で検出
すべき配列の少なくとも一部を隣接（フランキング）す
る１又は複数のプライマー対を使用して検出すべき配列
の少なくとも一部を含む核酸の一部を増幅する段階と、
ｃ）ｂ）からの増幅混合物で上記本発明の方法を実施す
る段階と、ｄ）それ自体公知の方法で段階ｃ）からのオ
リゴヌクレオチド増幅産物の検出可能なマーカーを検出
する段階とを含む。このような方法は臨床実験室で常習
的に実施し、アンプリコンによる持ち越し汚染の危険を
付随することなく増幅反応後に診断試験を実施すること
ができる。
は、増幅産物の分解前に増幅産物の容器の開放回数をで
きるだけ少なくし、好ましくはただ１回だけ開放し、よ
り好ましくは全く開放しないように本発明の方法を実施
することが好ましい。本発明の方法では、容器内で分解
前にハイブリダイゼーションが行われるように反応体を
加える。本発明は上記方法のみならず、サンプル中の特
定核酸配列の存在を診断するためのアッセイにも関し、
該アッセイは、ａ）それ自体公知の方法でサンプルから
核酸を単離する段階と、ｂ）それ自体公知の方法で検出
すべき配列の少なくとも一部を隣接（フランキング）す
る１又は複数のプライマー対を使用して検出すべき配列
の少なくとも一部を含む核酸の一部を増幅する段階と、
ｃ）ｂ）からの増幅混合物で上記本発明の方法を実施す
る段階と、ｄ）それ自体公知の方法で段階ｃ）からのオ
リゴヌクレオチド増幅産物の検出可能なマーカーを検出
する段階とを含む。このような方法は臨床実験室で常習
的に実施し、アンプリコンによる持ち越し汚染の危険を
付随することなく増幅反応後に診断試験を実施すること
ができる。
【００２２】本発明は本発明の汚染防止法又は上記アッ
セイを実施するためのキットにも係り、該キットは、
１）所望の配列の増幅のための１又は複数のプライマー
対と、２）プライマー対の間の所定の位置で増幅配列と
ハイブリダイズすることが可能な１又は２個のオリゴヌ
クレオチドからなる、プライマー対当たりの１組のオリ
ゴヌクレオチドセットとを含み、但し２個のオリゴヌク
レオチドが存在する場合には、これらのオリゴヌクレオ
チドの配列は、好ましくは相互に隣接する相互の４ヌク
レオチド内で増幅配列とハイブリダイズし、好ましくは
各オリゴヌクレオチドが少なくとも１０ヌクレオチド
長、好ましくは１１〜３０ヌクレオチド長にわたって増
幅産物と相補的となるように選択される。
セイを実施するためのキットにも係り、該キットは、
１）所望の配列の増幅のための１又は複数のプライマー
対と、２）プライマー対の間の所定の位置で増幅配列と
ハイブリダイズすることが可能な１又は２個のオリゴヌ
クレオチドからなる、プライマー対当たりの１組のオリ
ゴヌクレオチドセットとを含み、但し２個のオリゴヌク
レオチドが存在する場合には、これらのオリゴヌクレオ
チドの配列は、好ましくは相互に隣接する相互の４ヌク
レオチド内で増幅配列とハイブリダイズし、好ましくは
各オリゴヌクレオチドが少なくとも１０ヌクレオチド
長、好ましくは１１〜３０ヌクレオチド長にわたって増
幅産物と相補的となるように選択される。
【００２３】適切な態様において本発明のキットは、増
幅産物とオリゴヌクレオチドの複合体のハイブリダイズ
部分をヌクレアーゼにより分解不能にするために十分な
数のヌクレオチド上に２’−Ｏ−メチル形態の修飾を有
するオリゴヌクレオチドを含み、前記修飾は好ましくは
オリゴヌクレオチドの全ヌクレオチドに存在する。更
に、本発明を実施するために特に適切なキットは好まし
くは、核酸の部分的分解に必要な化合物、例えば増幅核
酸を分解するために十分な量のヌクレアーゼを更に含
む。キットに含まれる特定ヌクレアーゼは実施する増幅
反応に依存し、例えばＮＡＳＢＡではＤＮアーゼ及びＲ
Ｎアーゼであり、ＰＣＲではＤＮアーゼである。増幅産
物を含む容器の開放回数を最小限にする目的で、本発明
のキットは、核酸の部分的分解に必要な化合物（例えば
ヌクレアーゼ）を容器内に含み、方法はオリゴヌクレオ
チドと増幅産物とのハイブリダイゼーションが生じた後
に核酸の部分的分解に必要な化合物（例えばヌクレアー
ゼ）が反応混合物と接触するように実施する。本発明の
方法を実施するため又は本発明のキットで使用するため
に適切な容器は本発明の範囲内である。このような容器
は、核酸の部分的分解に必要な化合物例えばヌクレアー
ゼを容器の別個コンパートメントに含み、該別個コンパ
ートメントは別個コンパートメントの分解後に核酸の部
分的分解に必要な化合物（例えばヌクレアーゼ）を容器
の残余と接触させることができるように分解可能であ
る。別個コンパートメントの壁は例えば、核酸の部分的
分解に必要な化合物（例えばヌクレアーゼ）の不活性化
温度よりも低く且つハイブリダイゼーション複合体の融
点よりも低い温度で分解可能な熱分解性物質から構成さ
れ得る。このような熱分解性物質の例はろう又はアガロ
ースである。核酸の部分的分解に必要な化合物（例えば
ヌクレアーゼ）の他の等価遅延放出系も当業者に自明で
ある。本発明の骨子は、持ち越しの危険を減らすために
反応又は増幅を実施する容器の開放回数をできるだけ少
なくするという点にある。以下、非限定的な実施例によ
り本発明を更に説明する。
幅産物とオリゴヌクレオチドの複合体のハイブリダイズ
部分をヌクレアーゼにより分解不能にするために十分な
数のヌクレオチド上に２’−Ｏ−メチル形態の修飾を有
するオリゴヌクレオチドを含み、前記修飾は好ましくは
オリゴヌクレオチドの全ヌクレオチドに存在する。更
に、本発明を実施するために特に適切なキットは好まし
くは、核酸の部分的分解に必要な化合物、例えば増幅核
酸を分解するために十分な量のヌクレアーゼを更に含
む。キットに含まれる特定ヌクレアーゼは実施する増幅
反応に依存し、例えばＮＡＳＢＡではＤＮアーゼ及びＲ
Ｎアーゼであり、ＰＣＲではＤＮアーゼである。増幅産
物を含む容器の開放回数を最小限にする目的で、本発明
のキットは、核酸の部分的分解に必要な化合物（例えば
ヌクレアーゼ）を容器内に含み、方法はオリゴヌクレオ
チドと増幅産物とのハイブリダイゼーションが生じた後
に核酸の部分的分解に必要な化合物（例えばヌクレアー
ゼ）が反応混合物と接触するように実施する。本発明の
方法を実施するため又は本発明のキットで使用するため
に適切な容器は本発明の範囲内である。このような容器
は、核酸の部分的分解に必要な化合物例えばヌクレアー
ゼを容器の別個コンパートメントに含み、該別個コンパ
ートメントは別個コンパートメントの分解後に核酸の部
分的分解に必要な化合物（例えばヌクレアーゼ）を容器
の残余と接触させることができるように分解可能であ
る。別個コンパートメントの壁は例えば、核酸の部分的
分解に必要な化合物（例えばヌクレアーゼ）の不活性化
温度よりも低く且つハイブリダイゼーション複合体の融
点よりも低い温度で分解可能な熱分解性物質から構成さ
れ得る。このような熱分解性物質の例はろう又はアガロ
ースである。核酸の部分的分解に必要な化合物（例えば
ヌクレアーゼ）の他の等価遅延放出系も当業者に自明で
ある。本発明の骨子は、持ち越しの危険を減らすために
反応又は増幅を実施する容器の開放回数をできるだけ少
なくするという点にある。以下、非限定的な実施例によ
り本発明を更に説明する。
【００２４】
【実施例】実施例１ Ｋｉｅｖｉｔｓら（１９９０）及びｖａｎ Ｇｅｍｅｎ
ら（１９９３）の方法を多少変更してＮＡＳＢＡ反応を
実施した。ＨＩＶ−１ターゲット核酸（ＲＮＡ）２μｌ
に反応混合物２１μｌを加え（最終濃度：４０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ、ｐＨ８．５、４２ｍＭ ＫＣｌ、１２ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2、５ｍＭ ＤＴＴ、１５％ｖ／ｖＤＭＳＯ、ｄ
ＮＴＰ各１ｍＭ、ＮＴＰ各２ｍＭ、プライマー１ ０．
２μＭ及びプライマー２ ０．２μＭ）、６５℃で５分
間インキュベートした。４１℃に冷却後、酵素混合物
（最終濃度：０．１μｇ／μｌ ＢＳＡ，０．１Ｕ Ｒ
Ｎアーゼ Ｈ，８Ｕ ＡＭＶ−逆転写酵素及び４０Ｕ
Ｔ7ＲＮＡポリメラーゼ）を加えることにより増幅を開
始した。反応物を総容量２５μｌで７５分間４１℃でイ
ンキュベートした。ＮＡＳＢＡ反応混合物５μｌ、１×
ＮＲＧ緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ＝８．５、４
２ｍＭ ＫＣｌ、１２ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＤＴ
Ｔ、ｄＮＴＰ各１ｍＭ、ＮＴＰ各１ｍＭ）５μｌ、１０
０ｍＭ ＭｇＣｌ2１μｌ、並びに表１に示す濃度のＲ
Ｎアーゼ Ａ及びＤＮアーゼ Ｉを混合することにより
増幅ＮＡＳＢＡ産物のヌクレアーゼ処理を実施した。最
終容量は１５μｌであり、インキュベーションは４１℃
で３０分間行った。各ヌクレアーゼインキュベーション
毎に連続希釈液を調製し、ＮＡＳＢＡ再増幅反応の投入
材料として適切な希釈液２μｌを使用した。これらの再
増幅は６５℃のインキュベーションを介さずに実施し
た。
ら（１９９３）の方法を多少変更してＮＡＳＢＡ反応を
実施した。ＨＩＶ−１ターゲット核酸（ＲＮＡ）２μｌ
に反応混合物２１μｌを加え（最終濃度：４０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ、ｐＨ８．５、４２ｍＭ ＫＣｌ、１２ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2、５ｍＭ ＤＴＴ、１５％ｖ／ｖＤＭＳＯ、ｄ
ＮＴＰ各１ｍＭ、ＮＴＰ各２ｍＭ、プライマー１ ０．
２μＭ及びプライマー２ ０．２μＭ）、６５℃で５分
間インキュベートした。４１℃に冷却後、酵素混合物
（最終濃度：０．１μｇ／μｌ ＢＳＡ，０．１Ｕ Ｒ
Ｎアーゼ Ｈ，８Ｕ ＡＭＶ−逆転写酵素及び４０Ｕ
Ｔ7ＲＮＡポリメラーゼ）を加えることにより増幅を開
始した。反応物を総容量２５μｌで７５分間４１℃でイ
ンキュベートした。ＮＡＳＢＡ反応混合物５μｌ、１×
ＮＲＧ緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ＝８．５、４
２ｍＭ ＫＣｌ、１２ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＤＴ
Ｔ、ｄＮＴＰ各１ｍＭ、ＮＴＰ各１ｍＭ）５μｌ、１０
０ｍＭ ＭｇＣｌ2１μｌ、並びに表１に示す濃度のＲ
Ｎアーゼ Ａ及びＤＮアーゼ Ｉを混合することにより
増幅ＮＡＳＢＡ産物のヌクレアーゼ処理を実施した。最
終容量は１５μｌであり、インキュベーションは４１℃
で３０分間行った。各ヌクレアーゼインキュベーション
毎に連続希釈液を調製し、ＮＡＳＢＡ再増幅反応の投入
材料として適切な希釈液２μｌを使用した。これらの再
増幅は６５℃のインキュベーションを介さずに実施し
た。
【００２５】結果を表１に要約する。試験したＲＮアー
ゼ Ａ（５０ｍｇ）及びＤＮアーゼＩ（１００〜５００
Ｕ）の全組み合わせはＮＡＳＢＡ増幅産物の再増幅を阻
止した。再増幅ＮＡＳＢＡ反応における元ＮＡＳＢＡ反
応物の投入容量が＞２×１０-3μｌの場合にはいずれも
陽性であった。他方、このような高い相対容量はエアゾ
ールを形成するには大き過ぎるので、これらの大容量が
ＮＡＳＢＡを汚染する可能性は低い。
ゼ Ａ（５０ｍｇ）及びＤＮアーゼＩ（１００〜５００
Ｕ）の全組み合わせはＮＡＳＢＡ増幅産物の再増幅を阻
止した。再増幅ＮＡＳＢＡ反応における元ＮＡＳＢＡ反
応物の投入容量が＞２×１０-3μｌの場合にはいずれも
陽性であった。他方、このような高い相対容量はエアゾ
ールを形成するには大き過ぎるので、これらの大容量が
ＮＡＳＢＡを汚染する可能性は低い。
【００２６】
【表１】
【００２７】３種の供給業者のＤＮアーゼ Ｉを試験し
た。
た。
【００２８】実施例２ ６５℃のインキュベーションを介して再増幅した以外は
実施例１と同様にＮＡＳＢＡ増幅及び再増幅を実施し
た。結果を表２に要約する。
実施例１と同様にＮＡＳＢＡ増幅及び再増幅を実施し
た。結果を表２に要約する。
【００２９】
【表２】
【００３０】実施例１の場合よりもその程度は低いが、
本実施例においても再増幅はＮＡＳＢＡ増幅産物のヌク
レアーゼ処理により同様に阻止される。多少のターゲッ
ト核酸が存在する場合もあるが、ＮＡＳＢＡ反応に及ぼ
すヌクレアーゼの負の作用により２×１０-3及び２×１
０-4μｌの容量の再増幅は阻止される。しかしながら、
６５℃のインキュベーションによりヌクレアーゼ活性が
死滅し、存在する核酸は再増幅し得る。６５℃のインキ
ュベーション下で再増幅を阻止するには、１０００単位
のＤＮアーゼ Ｉ濃度と５０又は１００ｎｇのＲＮアー
ゼ Ａ濃度を組み合わせると最良であると思われる。
本実施例においても再増幅はＮＡＳＢＡ増幅産物のヌク
レアーゼ処理により同様に阻止される。多少のターゲッ
ト核酸が存在する場合もあるが、ＮＡＳＢＡ反応に及ぼ
すヌクレアーゼの負の作用により２×１０-3及び２×１
０-4μｌの容量の再増幅は阻止される。しかしながら、
６５℃のインキュベーションによりヌクレアーゼ活性が
死滅し、存在する核酸は再増幅し得る。６５℃のインキ
ュベーション下で再増幅を阻止するには、１０００単位
のＤＮアーゼ Ｉ濃度と５０又は１００ｎｇのＲＮアー
ゼ Ａ濃度を組み合わせると最良であると思われる。
【００３１】実施例３ 実施例１と同様にＮＡＳＢＡ増幅、再増幅及びヌクレア
ーゼ処理を実施した。本実施例では６５℃インキュベー
ションの有無による再増幅を比較した。結果を表３に要
約する。
ーゼ処理を実施した。本実施例では６５℃インキュベー
ションの有無による再増幅を比較した。結果を表３に要
約する。
【００３２】
【表３】
【００３３】６５℃インキュベーションの有無による再
増幅を直接比較すると、投入容量が比較的高い場合（即
ち２×１０-3μｌ）にはＮＡＳＢＡ再増幅反応を阻止す
るために十分なヌクレアーゼを含むと思われる。６５℃
インキュベーションによりヌクレアーゼ活性が死滅する
ので、存在する核酸は再増幅し得る。実際には、通常の
予防策を講じる場合にはＮＡＳＢＡ再増幅反応を阻止し
なくてもよいように持ち越し容量を十分低くするので、
６５℃インキュベーション又は他の不活性化段階は不要
である。他方、予防策として、再増幅前に核酸の部分的
分解に関与する化合物の不活性化段階を実施することが
できる。これはＮＡＳＢＡのみならず、他の全種の増幅
反応にも有効である。
増幅を直接比較すると、投入容量が比較的高い場合（即
ち２×１０-3μｌ）にはＮＡＳＢＡ再増幅反応を阻止す
るために十分なヌクレアーゼを含むと思われる。６５℃
インキュベーションによりヌクレアーゼ活性が死滅する
ので、存在する核酸は再増幅し得る。実際には、通常の
予防策を講じる場合にはＮＡＳＢＡ再増幅反応を阻止し
なくてもよいように持ち越し容量を十分低くするので、
６５℃インキュベーション又は他の不活性化段階は不要
である。他方、予防策として、再増幅前に核酸の部分的
分解に関与する化合物の不活性化段階を実施することが
できる。これはＮＡＳＢＡのみならず、他の全種の増幅
反応にも有効である。
【００３４】実施例４ 実施例１と同様にＮＡＳＢＡ増幅、再増幅及びヌクレア
ーゼ処理を実施した。比較的高容量（即ち２×１０-3μ
ｌ）を使用した場合に６５℃インキュベーションを介さ
ずに投入容量中のヌクレアーゼ活性により再増幅の抑制
効果が生じるか否かを試験するために以下の実験を実施
した。ＮＡＳＢＡ増幅物をＤＮアーゼＩ ５００単位及
びＲＮアーゼ Ａ ５０ｎｇでヌクレアーゼ処理し、再
増幅することができず且つ別のターゲットＲＮＡ配列に
対して特異的な表４に示す濃度のプライマーと共に各Ｎ
ＡＳＢＡ増幅物に２×１０-3μｌを加えた。
ーゼ処理を実施した。比較的高容量（即ち２×１０-3μ
ｌ）を使用した場合に６５℃インキュベーションを介さ
ずに投入容量中のヌクレアーゼ活性により再増幅の抑制
効果が生じるか否かを試験するために以下の実験を実施
した。ＮＡＳＢＡ増幅物をＤＮアーゼＩ ５００単位及
びＲＮアーゼ Ａ ５０ｎｇでヌクレアーゼ処理し、再
増幅することができず且つ別のターゲットＲＮＡ配列に
対して特異的な表４に示す濃度のプライマーと共に各Ｎ
ＡＳＢＡ増幅物に２×１０-3μｌを加えた。
【００３５】
【表４】
【００３６】これらの結果からも明らかなように、ヌク
レアーゼ処理したＮＡＳＢＡ反応物中には比較的高容量
で阻害性ヌクレアーゼが存在する。ヌクレアーゼ活性は
５分間の６５℃インキュベーションにより死滅し得る。
レアーゼ処理したＮＡＳＢＡ反応物中には比較的高容量
で阻害性ヌクレアーゼが存在する。ヌクレアーゼ活性は
５分間の６５℃インキュベーションにより死滅し得る。
【００３７】実施例１〜４から本発明の方法におけるヌ
クレアーゼ処理はＤＮアーゼ Ｉ１０００単位及びＲＮ
アーゼ Ａ ５０ｎｇの濃度でＮＡＳＢＡ増幅産物の再
増幅を阻止するのに好適であると結論することができ
る。このアプローチは、比較的高投入量（２×１０-3μ
ｌ）で再増幅が阻止されるが、６５℃インキュベーショ
ンの有無を問わず再増幅に有効であり、６５℃インキュ
ベーションを介さない場合にはサンプル中に残留ヌクレ
アーゼが存在するのでより有効である。６５℃インキュ
ベーションを介してヌクレアーゼ処理したＮＡＳＢＡ増
幅産物の再増幅は、増幅産物容量を２×１０-4μｌ以下
にすると首尾よく阻止することができる（実施例２参
照）。
クレアーゼ処理はＤＮアーゼ Ｉ１０００単位及びＲＮ
アーゼ Ａ ５０ｎｇの濃度でＮＡＳＢＡ増幅産物の再
増幅を阻止するのに好適であると結論することができ
る。このアプローチは、比較的高投入量（２×１０-3μ
ｌ）で再増幅が阻止されるが、６５℃インキュベーショ
ンの有無を問わず再増幅に有効であり、６５℃インキュ
ベーションを介さない場合にはサンプル中に残留ヌクレ
アーゼが存在するのでより有効である。６５℃インキュ
ベーションを介してヌクレアーゼ処理したＮＡＳＢＡ増
幅産物の再増幅は、増幅産物容量を２×１０-4μｌ以下
にすると首尾よく阻止することができる（実施例２参
照）。
【００３８】実施例５ 実施例１と同様にＮＡＳＢＡ増幅及びヌクレアーゼ処理
した。ヌクレアーゼ処理後又はヌクレアーゼ処理と同時
に、ＮＡＳＢＡ増幅産物を検出する。ＮＡＳＢＡ増幅産
物の検出は配列特異的であり、即ち１個以上のオリゴヌ
クレオチドプローブを用いて行う。以下の実験を実施し
た。ＮＡＳＢＡ増幅後、増幅産物（１μｌ）を１×ＮＲ
Ｇ緩衝液中で３０分間４５℃でオリゴヌクレオチド（１
０12分子）とハイブリダイズさせた。単一標準オリゴヌ
クレオチド、単一２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチ
ド、２つの隣接する標準オリゴヌクレオチド及び２つの
隣接する２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドとのハイ
ブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション
後にＲＮアーゼ Ａ（５０ｍｇ）及びＤＮアーゼ Ｉ
（５００単位）で処理した（実施例１参照）。ヌクレア
ーゼ処理したハイブリダイゼーションサンプルを臭化エ
チジウムで染色した２０％アクリルアミドゲル上で分析
した。結果を表５に要約する。
した。ヌクレアーゼ処理後又はヌクレアーゼ処理と同時
に、ＮＡＳＢＡ増幅産物を検出する。ＮＡＳＢＡ増幅産
物の検出は配列特異的であり、即ち１個以上のオリゴヌ
クレオチドプローブを用いて行う。以下の実験を実施し
た。ＮＡＳＢＡ増幅後、増幅産物（１μｌ）を１×ＮＲ
Ｇ緩衝液中で３０分間４５℃でオリゴヌクレオチド（１
０12分子）とハイブリダイズさせた。単一標準オリゴヌ
クレオチド、単一２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチ
ド、２つの隣接する標準オリゴヌクレオチド及び２つの
隣接する２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドとのハイ
ブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション
後にＲＮアーゼ Ａ（５０ｍｇ）及びＤＮアーゼ Ｉ
（５００単位）で処理した（実施例１参照）。ヌクレア
ーゼ処理したハイブリダイゼーションサンプルを臭化エ
チジウムで染色した２０％アクリルアミドゲル上で分析
した。結果を表５に要約する。
【００３９】
【表５】
【００４０】これらの結果から明らかなように、２’−
Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ処理に対
して耐性であり、より重要な点として２’−Ｏ−メチル
オリゴヌクレオチドと増幅ＮＡＳＢＡ産物（ＲＮＡ）と
のハイブリダイゼーション複合体はヌクレアーゼ処理に
対して耐性である。２つの隣接する２’−Ｏ−メチルオ
リゴヌクレオチドとＮＡＳＢＡ増幅産物（ＲＮＡ）のハ
イブリダイゼーション複合体も、２つの２’−Ｏ−メチ
ルオリゴヌクレオチド間の「ニック」に対向するＮＡＳ
ＢＡ増幅産物（ＲＮＡ）の切断に対して耐性である。こ
れらの結果から、ヌクレアーゼ処理に対して耐性のサン
ドイッチハイブリダイゼーションフォーマットを開発す
ることができる。
Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ処理に対
して耐性であり、より重要な点として２’−Ｏ−メチル
オリゴヌクレオチドと増幅ＮＡＳＢＡ産物（ＲＮＡ）と
のハイブリダイゼーション複合体はヌクレアーゼ処理に
対して耐性である。２つの隣接する２’−Ｏ−メチルオ
リゴヌクレオチドとＮＡＳＢＡ増幅産物（ＲＮＡ）のハ
イブリダイゼーション複合体も、２つの２’−Ｏ−メチ
ルオリゴヌクレオチド間の「ニック」に対向するＮＡＳ
ＢＡ増幅産物（ＲＮＡ）の切断に対して耐性である。こ
れらの結果から、ヌクレアーゼ処理に対して耐性のサン
ドイッチハイブリダイゼーションフォーマットを開発す
ることができる。
【００４１】実施例６ 実施例１と同様にＮＡＳＢＡ増幅及びヌクレアーゼ処理
を実施した。磁気ビーズ、ビオチン化捕獲プローブ及び
ＨＲＰ標識検出プローブと共にサンドイッチフォーマッ
トを使用してＮＡＳＢＡ増幅産物を２’−Ｏ−メチルオ
リゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた。このハイブ
リダイゼーションには１段階及び２段階プロトコルの両
者を使用した。
を実施した。磁気ビーズ、ビオチン化捕獲プローブ及び
ＨＲＰ標識検出プローブと共にサンドイッチフォーマッ
トを使用してＮＡＳＢＡ増幅産物を２’−Ｏ−メチルオ
リゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた。このハイブ
リダイゼーションには１段階及び２段階プロトコルの両
者を使用した。
【００４２】１段階法ではＮＡＳＢＡ増幅産物５μｌを
ハイブリダイゼーション混合物５５μｌ（５×ＳＳＰ
Ｅ、０．１％ＳＤＳ、０．１％粉ミルク、１０μｇ／ｍ
ｌサケ精子ＤＮＡ、３×１０6ストレプトアビジン被覆
磁気ビーズ、１５ｐｍｏｌビオチン化２’−Ｏ−Ｍｅ捕
獲プローブ、ＨＲＰ標識２’−Ｏ−Ｍｅ検出プローブ１
×１０3分子）に加え、３０分間４５℃でインキュベー
トした。ビーズを２×ＳＳＣ、０．１％ＢＳＡで２回洗
浄し、１×ＮＲＧ緩衝液＋１０ｍＭ ＭｇＣｌ2に再懸
濁した。実施例１と同様にＤＮアーゼ Ｉ及びＲＮアー
ゼ Ａ処理を実施した。次いでビーズを１×ＴＢＳで２
回洗浄し、ＴＭＢ／ペルオキシド基質（１００μｌ）を
加えることにより、ビーズ上に保持されたＨＲＰ標識
２’−Ｏ−Ｍｅ検出プローブを検出した。２５０ｍＭ蓚
酸５０μｌを加えることにより呈色反応を停止させ、４
５０ｎｍで光学密度を読み取った。
ハイブリダイゼーション混合物５５μｌ（５×ＳＳＰ
Ｅ、０．１％ＳＤＳ、０．１％粉ミルク、１０μｇ／ｍ
ｌサケ精子ＤＮＡ、３×１０6ストレプトアビジン被覆
磁気ビーズ、１５ｐｍｏｌビオチン化２’−Ｏ−Ｍｅ捕
獲プローブ、ＨＲＰ標識２’−Ｏ−Ｍｅ検出プローブ１
×１０3分子）に加え、３０分間４５℃でインキュベー
トした。ビーズを２×ＳＳＣ、０．１％ＢＳＡで２回洗
浄し、１×ＮＲＧ緩衝液＋１０ｍＭ ＭｇＣｌ2に再懸
濁した。実施例１と同様にＤＮアーゼ Ｉ及びＲＮアー
ゼ Ａ処理を実施した。次いでビーズを１×ＴＢＳで２
回洗浄し、ＴＭＢ／ペルオキシド基質（１００μｌ）を
加えることにより、ビーズ上に保持されたＨＲＰ標識
２’−Ｏ−Ｍｅ検出プローブを検出した。２５０ｍＭ蓚
酸５０μｌを加えることにより呈色反応を停止させ、４
５０ｎｍで光学密度を読み取った。
【００４３】２段階プロトコルでは２’−Ｏ−Ｍｅ Ｈ
ＲＰ標識検出プローブを含まない同一ハイブリダイゼー
ション混合物（５μｌ）にＮＡＳＢＡ反応混合物（６５
μｌ）を加えた。３０分間４５℃でインキュベーション
後、ビーズを２×ＳＳＣ、０．１％ＢＳＡで２回洗浄
し、ハイブリダイゼーション混合物（５×ＳＳＰＥ、
０．１％ＳＤＳ、０．１％粉ミルク、１０μｌ／ｍｌサ
ケ精子ＤＮＡ）に再懸濁し、ＨＲＰ標識２’−Ｏ−Ｍｅ
検出プローブ１×１０3分子を加えた。３０分間４５℃
でインキュベートした。次にビーズを２×ＳＳＣ、０．
１％ＢＳＡで２回洗浄した。実施例１と同様にＤＮアー
ゼ Ｉ及びＲＮアーゼ Ａ処理を実施した。ビーズを２
×ＴＢＳで２回洗浄し、ＴＭＢ／ペルオキシド基質（１
００μｌ）を加えることによりビーズ上に保持されたＨ
ＲＰ標識２’−Ｏ−Ｍｅ検出プローブを検出した。２５
０ｍＭ蓚酸５０μｌを加えることにより呈色反応を停止
させ、４５０ｎｍで光学密度を読み取った。結果を表６
に要約する。
ＲＰ標識検出プローブを含まない同一ハイブリダイゼー
ション混合物（５μｌ）にＮＡＳＢＡ反応混合物（６５
μｌ）を加えた。３０分間４５℃でインキュベーション
後、ビーズを２×ＳＳＣ、０．１％ＢＳＡで２回洗浄
し、ハイブリダイゼーション混合物（５×ＳＳＰＥ、
０．１％ＳＤＳ、０．１％粉ミルク、１０μｌ／ｍｌサ
ケ精子ＤＮＡ）に再懸濁し、ＨＲＰ標識２’−Ｏ−Ｍｅ
検出プローブ１×１０3分子を加えた。３０分間４５℃
でインキュベートした。次にビーズを２×ＳＳＣ、０．
１％ＢＳＡで２回洗浄した。実施例１と同様にＤＮアー
ゼ Ｉ及びＲＮアーゼ Ａ処理を実施した。ビーズを２
×ＴＢＳで２回洗浄し、ＴＭＢ／ペルオキシド基質（１
００μｌ）を加えることによりビーズ上に保持されたＨ
ＲＰ標識２’−Ｏ−Ｍｅ検出プローブを検出した。２５
０ｍＭ蓚酸５０μｌを加えることにより呈色反応を停止
させ、４５０ｎｍで光学密度を読み取った。結果を表６
に要約する。
【００４４】
【表６】
【００４５】結論として、ＲＮアーゼ Ａ／ＤＮアーゼ
Ｉ処理はオリゴヌクレオチド捕獲及び検出に２’−Ｏ
−Ｍｅを使用するサンドイッチハイブリダイゼーション
アッセイでＮＡＳＢＡ増幅産物の検出に何ら影響しな
い。
Ｉ処理はオリゴヌクレオチド捕獲及び検出に２’−Ｏ
−Ｍｅを使用するサンドイッチハイブリダイゼーション
アッセイでＮＡＳＢＡ増幅産物の検出に何ら影響しな
い。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｐ 19/34 Ａ 7432−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｐ
Claims (28)
- 【請求項１】 その後の増幅のターゲットとなることが
できない１対以上のプライマーを使用する核酸増幅反応
産物の製造方法であって、１対のプライマーのハイブリ
ダイゼーション部位間に位置するヌクレオチド長の増幅
産物とハイブリダイズすることが可能であり且つ分解か
らのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしたハイブリ
ダイゼーション複合体の２本鎖部分を保護するように修
飾されたオリゴヌクレオチドと増幅産物との間にハイブ
リダイゼーション複合体を形成し得る条件下で、増幅産
物を前記オリゴヌクレオチドと接触させる段階と、少な
くともプライマーとハイブリダイズすることが可能なハ
イブリダイゼーション複合体の部分を分解するような状
況下でハイブリダイゼーション複合体を分解処理する段
階とを含む方法。 - 【請求項２】 オリゴヌクレオチドが別のヌクレオチド
を付加して伸長することができない３’末端を含む請求
項１に記載の方法。 - 【請求項３】 増幅産物とオリゴヌクレオチドの複合体
の２本鎖部分に作用しないヌクレアーゼを使用して分解
を実施する請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 オリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチ
ドを含むヌクレオチド上の十分な２’−Ｏ−メチル修飾
の存在によりヌクレオチドにより分解不能であり、前記
修飾が好ましくはオリゴヌクレオチドを形成するヌクレ
オチドの各々に存在する請求項１から３のいずれか一項
に記載の方法。 - 【請求項５】 ヌクレアーゼの混合物で分解を実施する
請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項６】 ＤＮアーゼＩ、制限酵素、エンドヌクレ
アーゼ又はエキソヌクレアーゼ等の特異的ＤＮアーゼを
使用して分解を実施する請求項１から５のいずれか一項
に記載の方法。 - 【請求項７】 ＲＮアーゼＴ、ＲＮアーゼＵ、ＲＮアー
ゼＡ又はエキソヌクレアーゼ等の特異的ＲＮアーゼを使
用して分解を実施する請求項１から６のいずれか一項に
記載の方法。 - 【請求項８】 ＤＮＡ及びＲＮＡの両者を同時に分解す
ることが可能な非特異的ヌクレアーゼを使用して分解を
実施する請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項９】 ヌクレアーゼの使用量が、最終反応混合
物のエアゾール液滴中に検出不能な量の増幅可能な増幅
産物、即ち１０5分子／μｌ以下、好ましくは１０4分子
／μｌ以下の存在を確保するために十分である請求項１
から８のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１０】 ＲＮＡを増幅することにより増幅反応
を実施する請求項１から９のいずれか一項に記載の方
法。 - 【請求項１１】 増幅反応がＮＡＳＢＡ増幅反応である
請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１２】 オリゴヌクレオチドが酵素、蛍光基、
電気化学発光ラベル、染料又は放射性同位体を備える請
求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１３】 増幅核酸とのハイブリダイゼーション
を生じるために増幅産物のヌクレオチド長と十分相同な
第２のオリゴヌクレオチドを分解前に加え、前記ヌクレ
オチド長が増幅に使用する２個のプライマーのハイブリ
ダイゼーション部位間に位置し且つ、第１のオリゴヌク
レオチドとハイブリダイズする増幅産物長の最後のヌク
レオチドの４ヌクレオチド以内であり、好ましくは２個
のオリゴヌクレオチド間のギャップをできるだけ小さく
し、最適には隣接させ、ハイブリダイゼーションにより
２個のオリゴヌクレオチドと増幅産物とのハイブリダイ
ゼーション複合体を形成するような状況を形成する請求
項１から１２のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１４】 オリゴヌクレオチドの一方がそれ自体
公知の方法で５’又は３’末端を介して固定されてお
り、他方のオリゴヌクレオチドが５’又は３’末端に検
出可能なマーカーを備える請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１５】 オリゴヌクレオチドの一方が他方のオ
リゴヌクレオチドとハイブリダイズする増幅産物長の最
後のヌクレオチドに隣接するヌクレオチド部位にテーリ
ングを示す請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１６】 ２個のオリゴヌクレオチドが各々他方
のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする増幅産物長
の最後のヌクレオチドに隣接するヌクレオチド部位にテ
ーリングを示す請求項１４又は１５に記載の方法。 - 【請求項１７】 テールが少なくとも２ヌクレオチド
長、好ましくは５ヌクレオチド以上にわたって相補的で
ある請求項１６に記載の方法。 - 【請求項１８】 オリゴヌクレオチドが少なくとも１０
ヌクレオチド、好ましくは１１〜３０ヌクレオチド長に
わたって増幅産物とハイブリダイズする請求項１から１
７のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１９】 ３０〜８０℃、好ましくは４０〜７０
℃、より好ましくは４０〜６４℃の温度でハイブリダイ
ゼーション及び分解段階を実施する請求項１から１８の
いずれか一項に記載の方法。 - 【請求項２０】 増幅産物の分解前に増幅産物の容器の
開放回数をできるだけ少なくし、好ましくは１回だけ開
放し、より好ましくは全く開放せずに分解前にハイブリ
ダイゼーションが行われるように反応体を加える請求項
１から１９のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項２１】 ａ）それ自体公知の方法でサンプルか
ら核酸を単離する段階と、ｂ）それ自体公知の方法で検
出すべき配列の少なくとも一部をフランキングする２個
のプライマーを使用して検出すべき配列の少なくとも一
部を含む核酸の一部を増幅する段階と、ｃ）ｂ）から得
られた増幅混合物で請求項１から２０のいずれか一項に
記載の方法を実施する段階と、ｄ）それ自体公知の方法
で段階ｃ）からのオリゴヌクレオチド−増幅産物の検出
可能なマーカーを検出する段階とを含む、サンプル中の
特異的核酸配列の存在を診断するためのアッセイ。 - 【請求項２２】 １）所望の配列の増幅のための１又は
複数のプライマー対と、２）プライマー対間の所定の位
置で増幅配列とハイブリダイズすることが可能な１又は
２個のオリゴヌクレオチドからなる、プライマー対当た
り１組のオリゴヌクレオチドセットとを特に含み、但し
２個のオリゴヌクレオチドが存在する場合には、好まし
くは相互に隣接する相互の４ヌクレオチド内で増幅配列
とハイブリダイズし且つ各オリゴヌクレオチドが少なく
とも１０ヌクレオチド長、好ましくは１１〜３０ヌクレ
オチド長にわたって増幅産物と相補的となるようにその
配列を選択する、請求項１から２０のいずれか一項に記
載の方法又は請求項２１に記載のアッセイを実施するた
めのキット。 - 【請求項２３】 オリゴヌクレオチドが増幅産物とオリ
ゴヌクレオチドとの複合体のハイブリダイズ部分をヌク
レアーゼにより分解不能にするために十分な数のヌクレ
オチド上に２’−Ｏ−メチル形態の修飾を含み、該修飾
が好ましくはオリゴヌクレオチドの全ヌクレオチドに存
在する請求項２２に記載のキット。 - 【請求項２４】 更に、核酸とオリゴヌクレオチドプロ
ーブの複合体を部分的に分解するための化合物、例えば
ヌクレアーゼ、を増幅核酸の分解に十分な量で含む請求
項２３に記載のキット。 - 【請求項２５】 ヌクレアーゼが容器に収容され、オリ
ゴヌクレオチドと増幅産物とのハイブリダイゼーション
が生じた後に、核酸とオリゴヌクレオチドプローブの複
合体を部分的に分解するための化合物、例えばヌクレア
ーゼ、が反応混合物と接触できるように前記容器内で前
記方法を実施する請求項２４に記載のキット。 - 【請求項２６】 容器が請求項２７又は２８に記載の容
器である請求項２５に記載のキット。 - 【請求項２７】 核酸とオリゴヌクレオチドプローブの
複合体を部分的に分解するための化合物、例えばヌクレ
アーゼ、を容器の別個コントパーメントに含む請求項１
から２０のいずれか一項に記載の方法を実施するための
容器であって、前記別個コンパートメントが、別個コン
パートメントの分解後に核酸とオリゴヌクレオチドプロ
ーブの複合体を部分的に分解するための化合物、例えば
ヌクレアーゼ、を容器の残余と接触させることができる
ように分解可能である前記容器。 - 【請求項２８】 別個コンパートメントが、核酸とオリ
ゴヌクレオチドの複合体を部分的に分解するための化合
物、例えばヌクレアーゼ、の不活性化温度よりも低く且
つハイブリダイゼーション複合体の融点よりも低い温度
で分解可能な熱分解性物質、例えばろう又はアガロー
ス、からなる請求項２７に記載の容器。
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