ES2640522T3 - Ácidos nucleicos de control para múltiples parámetros - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para aislar y simultáneamente amplificar un primer y un segundo ácido nucleico diana que pueden estar presentes en una o más muestras fluidas, comprendiendo dicho procedimiento las etapas automatizadas de: a. añadir un ácido nucleico patrón cuantitativo a cada una de dichas muestras fluidas, en el que la secuencia del ácido nucleico patrón cuantitativo se deriva de una fuente diferente del origen de las muestras fluidas, es diferente de las otras secuencias de ácido nucleico de las muestras fluidas, se deriva de un genoma vegetal y presenta mutaciones "scramble", en el que dicho ácido nucleico patrón cuantitativo tiene una concentración de entre 20 x LDD y 5000 x LDD b. combinar un material de soporte sólido y dicha una o más muestras fluidas en uno o más recipientes durante un período de tiempo y en condiciones suficientes para permitir que los ácidos nucleicos que comprenden los ácidos nucleicos diana y el ácido nucleico patrón cuantitativo queden inmovilizados sobre el material de soporte sólido c. aislar el material de soporte sólido del otro material presente en las muestras fluidas en una estación de separación d. purificar los ácidos nucleicos en dicha estación de separación y lavar el material de soporte sólido una o más veces con un tampón de lavado e. poner en contacto los ácidos nucleicos diana purificados y el ácido nucleico patrón cuantitativo purificado con reactivos de amplificación que comprenden al menos un conjunto distinto de cebadores para cada uno de dichos ácidos nucleicos diana y para dicho ácido nucleico patrón cuantitativo en al menos dos recipientes de reacción para la amplificación del al menos el primer y segundo ácidos nucleicos diana y del ácido nucleico patrón cuantitativo en los al menos dos recipientes de reacción f. incubar en dichos recipientes de reacción dichos ácidos nucleicos diana purificados y dicho ácido nucleico patrón cuantitativo purificado con dichos reactivos de amplificación durante un período de tiempo y en condiciones suficientes para que se produzca una reacción de amplificación indicativa de la presencia o ausencia de dichos ácidos nucleicos diana mientras se amplifica el primer pero no el segundo ácido nucleico diana en el primer recipiente de reacción y se amplifica el segundo pero no el primer ácido nucleico diana en el segundo recipiente de reacción g. detectar y medir las señales generadas por los productos de amplificación de dichos ácidos nucleicos diana y que son proporcionales a la concentración de dichos ácidos nucleicos diana, y detectar y medir una señal generada por dicho ácido nucleico patrón cuantitativo h. determinar la cantidad de uno o más de dichos ácidos nucleicos diana usando el ácido nucleico patrón cuantitativo como referencia en el que las condiciones para la amplificación y detección en las etapas e. a g. son idénticas para dichos primer y segundo ácidos nucleicos diana purificados y dicho ácido nucleico patrón cuantitativo.

Description

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• adsorción en partículas de vidrio magnéticas (MGP) o partículas de organosilanos en condiciones caotrópicas.

Particularmente interesante para propósitos de purificación es la adsorción de ácidos nucleicos en una superficie de vidrio aunque son posibles otras superficies. En los últimos años se han propuesto muchos procedimientos para 5 aislar los ácidos nucleicos de su entorno natural mediante el uso de su comportamiento de unión a superficies de vidrio. Si la diana son ácidos nucleicos no modificados, es preferente una unión directa de los ácidos nucleicos a un material con una superficie de sílice porque, entre otras razones, no es necesario modificar los ácidos nucleicos, e incluso se pueden unir ácidos nucleicos nativos. Estos procedimientos se describen en detalle en varios documentos. En Vogelstein B. et al., Proc. Natl. Acad. USA 76 (1979) 615-9, por ejemplo, se propone un procedimiento para la unión de ácidos nucleicos de geles de agarosa en presencia de yoduro de sodio a vidrio de sílex molido. La purificación de ADN plasmídico de bacterias sobre polvo de vidrio en presencia de perclorato de sodio se describe en Marko MA et al., Anal. Biochem. 121 (1982) 382-387. En el documento DE-A 37 34 442 se describe el aislamiento de ADN de fago M13 monocatenario en filtros de fibra de vidrio mediante precipitación de las partículas de fago usando ácido acético y lisis de las partículas de fago con perclorato. Los ácidos nucleicos unidos 15 a los filtros de fibra de vidrio se lavan y luego se eluyen con un tampón Tris/EDTA que contiene metanol. Un procedimiento similar para purificar ADN a partir de fagos lambda se describe en Jakobi R. et al., Anal. Biochem. 175 (1988) 196-201. El procedimiento implica la unión selectiva de ácidos nucleicos a superficies de vidrio en soluciones de sales caotrópicas y la separación de los ácidos nucleicos de contaminantes tales como agarosa, proteínas o residuo celular. Para separar las partículas de vidrio de los contaminantes, se pueden centrifugar las partículas o se pueden extraer los fluidos a través de filtros de fibra de vidrio. Este es, sin embargo, un paso limitante que impide que el procedimiento se utilice para procesar grandes cantidades de muestras. El uso de partículas magnéticas para inmovilizar ácidos nucleicos después de la precipitación mediante la adición de sal y etanol es más ventajoso y se describe, por ejemplo, en Alderton R.P. et al., S., Anal. Biochem. 201 (1992) 166-169 y WO9112079. En este procedimiento, los ácidos nucleicos se aglutinan junto con las partículas magnéticas. El aglutinado se separa del 25 disolvente original aplicando un campo magnético y realizando una etapa de lavado. Después de una etapa de lavado, los ácidos nucleicos se disuelven en un tampón Tris. Sin embargo, este procedimiento tiene la desventaja de que la precipitación no es selectiva para los ácidos nucleicos. En su lugar, también se aglutinan una variedad de sustancias sólidas y disueltas. Como resultado, este procedimiento no se puede usar para eliminar cantidades significativas de cualquier inhibidor de reacciones enzimáticas específicas que pueda estar presente. También está disponible en el mercado un vidrio magnético poroso que contiene partículas magnéticas en una matriz de vidrio porosa particular y que está cubierto con una capa que contiene estreptavidina. Este producto se puede utilizar para aislar materiales biológicos, por ejemplo, proteínas o ácidos nucleicos, si se modifican en una etapa de preparación compleja para que se unan covalentemente a biotina. Adsorbentes particulados magnetizables resultaron ser muy eficaces y adecuados para la preparación automática de muestras. Para este fin se utilizan pigmentos

35 ferrimagnéticos y ferromagnéticos, así como superparamagnéticos. Las partículas de vidrio magnéticas y los procedimientos que las utilizan más preferentes son los descritos en el documento WO 01/37291. Particularmente útil para el aislamiento de ácidos nucleicos en el contexto de la invención es el procedimiento de acuerdo con R. Boom et al. (J Clin Microbiol. 28 (1990), 495-503).

El término "material de soporte sólido" comprende cualquiera de los materiales sólidos mencionados anteriormente en relación con la inmovilización de ácidos nucleicos, por ejemplo, partículas de vidrio magnéticas, fibras de vidrio, filtros de fibra de vidrio, papel de filtro, etc., aunque el material de soporte sólido no se limita a estos materiales.

Por lo tanto, un aspecto preferente de la invención es el procedimiento descrito anteriormente, en el que el material

45 de soporte sólido comprende uno o más de los materiales seleccionados entre sílice, metal, óxidos metálicos, plástico, polímeros y ácidos nucleicos. En un modo de realización muy preferente de la invención, el material de soporte sólido son partículas de vidrio magnéticas.

"Inmovilizar", en el contexto de la invención, significa capturar objetos tales como, por ejemplo, ácidos nucleicos de una manera reversible o irreversible. Particularmente, "inmovilizado sobre el material de soporte sólido" significa que el objeto u objetos se asocian al material de soporte sólido con el fin de conseguir su separación de cualquier medio circundante, y se pueden recuperar, por ejemplo, separándolos del material de soporte sólido posteriormente. En este contexto, "inmovilización" puede comprender, por ejemplo, la adsorción de ácidos nucleicos en vidrio u otras superficies adecuadas de materiales sólidos como se ha descrito supra. Además, los ácidos nucleicos se pueden

55 "inmovilizar" específicamente uniéndose a sondas de captura, en las que los ácidos nucleicos están unidos a ácidos nucleicos esencialmente complementarios unidos a un soporte sólido mediante apareamiento de bases. En este último caso, dicha inmovilización específica conduce a la unión predominante de los ácidos nucleicos diana.

Después de la purificación o aislamiento de los ácidos nucleicos que incluyen los ácidos nucleicos diana de su entorno natural, el análisis se puede realizar, por ejemplo, mediante la amplificación simultánea descrita supra.

"Simultáneamente", en el sentido de la invención, significa que dos acciones, tales como la amplificación de un primer y un segundo o más ácidos nucleicos, se realizan al mismo tiempo y en las mismas condiciones físicas. En un modo de realización, la amplificación simultánea de al menos el primer y el segundo ácidos nucleicos diana se 65 realiza en un recipiente. En otro modo de realización, la amplificación simultánea se lleva a cabo con al menos un ácido nucleico en un recipiente y al menos un segundo ácido nucleico en un segundo recipiente, al mismo tiempo y

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redondeada. La combinación de fondo esférico (112), forma interior redondeada (114), parte cónica (111) y superficie refinada de los recipientes (103) conduce a una mecánica de fluidos favorable que facilita una separación y purificación efectivas de analitos en la placa de procesamiento (101). El fondo esférico (112) permite un uso esencialmente completo del eluato separado y una reducción del volumen muerto que reduce la transferencia de

5 reactivos o la contaminación cruzada de la muestra.

El reborde en la base (129) de la placa de procesamiento (101) comprende rebajes (107) para acoplamiento con clips de retención (124) en la estación de procesamiento (201) o dispositivo de calentamiento (128) o instrumento analítico (126) (Fig. 5, Fig. 9). El acoplamiento de los clips de retención (124) con los rebajes (107) permite posicionar y fijar la placa de procesamiento (101) en la estación de procesamiento (201). La presencia de los rebajes

(107) permite que la fuerza de retención actúe sobre la placa de procesamiento (101) casi verticalmente a la base (129). Por lo tanto, sólo pueden existir pequeñas fuerzas que actúan lateralmente. Esto reduce la aparición de tensiones y, por tanto, la deformación de la placa de procesamiento (101). Las fuerzas de retención verticales también pueden neutralizar cualquier deformación de la placa de procesamiento (101) conduciendo a un

15 posicionamiento más preciso de los fondos esféricos (111) en la estación de procesamiento (201). En general, la interfaz precisa entre la placa de procesamiento (101) y la estación de procesamiento (201) o dispositivo de calentamiento (128) dentro de un analizador reduce los volúmenes muertos y también reduce el riesgo de contaminación cruzada de la muestra.

Una "estación de separación" es un dispositivo o un componente de un sistema analítico que permite el aislamiento del material de soporte sólido del otro material presente en la muestra fluida. Dicha estación de separación puede comprender, por ejemplo, pero sin limitación, una centrífuga, una gradilla con tubos de filtro, un imán u otros componentes adecuados. En un modo de realización preferente de la invención, la estación de separación comprende uno o más imanes. Preferentemente, se utilizan uno o más imanes para la separación de partículas

25 magnéticas, preferentemente partículas de vidrio magnéticas, como soporte sólido. Si, por ejemplo, la muestra fluida y el material de soporte sólido se combinan entre sí en los pocillos de una placa multipocillo, entonces uno o más imanes comprendidos por la estación de separación pueden, por ejemplo, entrar en contacto con la propia muestra fluida introduciendo los imanes en los pocillos, o dichos uno o más imanes pueden ser llevados cerca de las paredes exteriores de los pocillos con el fin de atraer las partículas magnéticas y posteriormente separarlas del líquido circundante.

En un modo de realización preferente, la estación de separación es un dispositivo que comprende una placa multipocillo que comprende recipientes con una abertura en la superficie superior de la placa multipocillo y un fondo cerrado. Los recipientes comprenden una parte superior, una parte central y una parte inferior, en el que la parte 35 superior está unida a la superficie superior de la placa multipocillo y preferentemente comprende dos lados más largos y dos más cortos. La parte central tiene una sección transversal sustancialmente rectangular con dos lados más largos, en el que dichos recipientes están alineados en filas. Un espacio continuo está situado entre dos filas adyacentes para poner en contacto selectivamente al menos un imán montado en un accesorio con las paredes laterales en al menos dos posiciones Z. El dispositivo comprende además una estación de separación magnética que comprende al menos un accesorio. El accesorio comprende al menos un imán que genera un campo magnético. Está presente un mecanismo móvil que mueve verticalmente dicho al menos un accesorio que comprende al menos un imán al menos entre una primera y una segunda posición con respecto a los recipientes de la placa multipocillo. Preferentemente, dichas al menos dos posiciones Z de los recipientes comprenden las paredes laterales y la parte inferior de dichos recipientes. El campo magnético de dicho al menos un imán atrae preferentemente las partículas

45 magnéticas hacia una superficie interna del recipiente adyacente a dicho al menos un imán cuando dicho al menos un imán está en dicha primera posición. El efecto de dicho campo magnético es menor cuando dicho al menos un imán está en dicha segunda posición que cuando dicho al menos un imán está en dicha primera posición. Preferentemente, el accesorio que comprende dicho al menos un imán comprende un bastidor. Los recipientes tienen características preferentes como se ha descrito anteriormente en el contexto de la placa multipocillo / placa de procesamiento. Una de dichas características preferentes es que al menos una parte de dichos recipientes tiene una sección transversal sustancialmente rectangular ortogonal al eje de dichos recipientes.

En dicha primera posición, dicho al menos un imán está adyacente a dicha parte de dichos recipientes. Se entiende que adyacente significa en estrecha proximidad, tal como para ejercer un campo magnético sobre el contenido del

55 recipiente, o en contacto físico con el recipiente.

La estación de separación comprende un bastidor para recibir la placa multipocillo, y clips de retención para fijar la placa multipocillo. Preferentemente, la estación de separación comprende dos tipos de imanes. Este modo de realización preferente se describe adicionalmente a continuación.

Un segundo modo de realización preferente se describe a continuación, que comprende un muelle que ejerce una presión sobre el bastidor que comprende los imanes de modo que los imanes son presionados contra los recipientes de la placa multipocillo.

65 Preferentemente, los primeros imanes están construidos y dispuestos para interactuar con recipientes de una placa multipocillo para ejercer un campo magnético sobre un gran volumen de líquido que comprende partículas

magnéticas retenidas en dichos recipientes. Dichos segundos imanes están construidos y dispuestos preferentemente para interactuar con recipientes de una placa multipocillo para ejercer un campo magnético sobre un pequeño volumen de líquido que comprende partículas magnéticas retenidas en dichos recipientes. Dichos primeros y segundos imanes se pueden mover a diferentes posiciones Z.

5 Útil en el contexto de la presente invención y de dicha estación de separación es además un procedimiento de aislamiento y purificación de un ácido nucleico. El procedimiento comprende las etapas de unir un ácido nucleico a partículas magnéticas en un recipiente de una placa multipocillo. El recipiente comprende una abertura superior, una parte central y una parte inferior. El material unido se separa entonces del material no unido contenido en un líquido cuando la mayor parte del líquido está situada por encima de la sección en la que la parte cónica del recipiente da paso a la parte central con forma rectangular, moviendo un imán desde una segunda posición hasta una primera posición y, en dicha primera posición, aplicando un campo magnético a la parte central y, opcionalmente, aplicando adicionalmente un campo magnético a la parte inferior de dicho recipiente. Las partículas magnéticas se pueden lavar opcionalmente con una solución de lavado. Un pequeño volumen de líquido, en el que la mayor parte del

15 líquido está situado por debajo de la sección donde la parte cónica del recipiente da paso a la parte central con forma rectangular, se separa de dichas partículas magnéticas aplicando selectivamente un campo magnético a la parte inferior de dicho recipiente.

Útil en el contexto de la presente invención es también una estación de separación magnética para separar un ácido nucleico unido a partículas magnéticas, comprendiendo dicha estación de separación unos primeros imanes que están construidos y dispuestos para interactuar con recipientes de una placa multipocillo para ejercer un campo magnético sobre un gran volumen de líquido que comprende partículas magnéticas retenidas en dichos recipientes, y unos segundos imanes construidos y dispuestos para interactuar con recipientes de una placa multipocillo para ejercer un campo magnético sobre un pequeño volumen de líquido que comprende partículas magnéticas retenidas

25 en dichos recipientes, y en el que dichos primeros y segundos imanes se pueden mover a diferentes posiciones Z. En el presente documento se describen modos de realización preferentes de la estación de separación magnética.

A continuación se describe un primer modo de realización preferente de una estación de separación (201) útil para la presente invención. El primer modo de realización preferente de dicha estación de separación (201) comprende al menos dos tipos de imanes (202, 203). El primer tipo de imán largo (202) está construido y dispuesto para encajar en el espacio (121) de la placa de procesamiento (101). De este modo, el imán (202) ejerce un campo magnético sobre el líquido (215) del recipiente (103) para secuestrar partículas magnéticas (216) en el interior de la pared del recipiente. Esto permite separar las partículas magnéticas (216) y cualquier material unido a ellas y el líquido (215) del interior del recipiente (103) cuando está presente un gran volumen de líquido (215). El imán (202) tiene una 35 estructura alargada y está construido y dispuesto para interactuar con la parte central esencialmente rectangular

(120) del recipiente. Por lo tanto, el imán (202) se usa cuando la mayor parte del líquido (215) está situada por encima de la sección donde la parte cónica (111) del recipiente (103) da paso a la parte central (120) con forma rectangular. Como se muestra en la Fig. 40, la construcción preferente de los imanes (202) comprende accesorios (204, 204a) que comprenden imanes (202) que encajan en el espacio (121) entre las filas de recipientes (103) en la placa de procesamiento (101). Otro modo de realización preferente de imanes (202) comprende imanes (202) dispuestos en accesorios (204, 204a). Los imanes (203) de la estación de separación preferente (201) son más pequeños y pueden interactuar con la parte cónica (111) del recipiente (103). Esto se muestra en la Fig. 10. Los imanes (203) están dispuestos preferentemente sobre una base (205) que se puede mover dentro del espacio (121) de la placa de procesamiento (101). Cada imán (202, 203) está construido preferentemente para interactuar con dos

45 recipientes (103) en dos filas adyacentes. En un modo de realización preferente, la placa de procesamiento (101) tiene 6 filas de 8 recipientes (103). Una estación de separación (201) que puede interactuar con la placa de procesamiento preferente (101) tiene tres accesorios (204, 204a) que comprenden imanes (202) y cuatro bases

(205)

que comprenden imanes (203). También se incluye un modo de realización en el que la estación de separación tiene cuatro accesorios magnéticos (204, 204a) que comprenden imanes (202) y tres bases magnéticas

(205)

que comprenden imanes (203).

Los imanes (202, 203) son móviles. La estación de separación (201) comprende un mecanismo para mover los accesorios (204, 204a) y las bases (205). Todos los accesorios (204, 204a) están interconectados por una base

(217) y, por lo tanto, se mueven de forma coordinada. Todos los imanes (203) están unidos a una base (218) y, de

55 este modo, se mueven de forma coordinada. El mecanismo para mover las placas magnéticas (202) y (203) está construido y dispuesto para mover los dos tipos de placas magnéticas (202, 203) a un total de cuatro posiciones finales:

en la Fig. 40 a-c, los imanes (203) están situados próximos a la parte cónica de los recipientes (103) de la placa de procesamiento (101). Esta es la posición más alta de los imanes (203), y es la posición de separación. En esta figura, los imanes (202) están situados en la posición más baja. No participan en la separación cuando están en esta posición.

En el modo de realización preferente mostrado en la Fig. 10, la base (217) de imanes (202) está conectada a una

65 rueda de posicionamiento (206). La base (217) comprende un extremo inferior (207) que está flexiblemente en contacto con un elemento de conexión (208) mediante un elemento móvil (209). Dicho elemento móvil está

construido y dispuesto para mover el elemento de conexión (208) a lo largo de un carril (212) de un lado al otro. Dicho elemento móvil (209) está fijado al elemento de conexión (208) con un pasador (220). Dicho elemento de conexión (208) está fijado a la rueda de posicionamiento (206) mediante un tornillo (210). El elemento de conexión

(208) está también conectado al eje (211). Dicho elemento de conexión (208) es preferentemente una placa

5 rectangular. Cuando la rueda de posicionamiento (206) se desplaza excéntricamente, alrededor de un eje (211), de tal manera que el tornillo (210) se desplaza desde un punto situado por encima del eje excéntrico hasta un punto situado por debajo del eje excéntrico, el elemento móvil (209) y el extremo inferior 207) de la base (204) con los imanes (202) fijados a la misma se mueven desde la posición más alta hasta la posición más baja. La base (218) está montada sobre una parte inferior (219) y está conectada, en su extremo inferior, con el pasador (213) a un elemento móvil (214), que es preferentemente una rueda, que interactúa con la rueda de posicionamiento (206). Cuando la rueda de posicionamiento (206) gira alrededor del eje (211), la rueda (214) se desplaza a lo largo de la rueda de posicionamiento (206). Si la rueda (214) está situada en una sección de la rueda de posicionamiento (206) donde la distancia desde el eje (211) es corta, los imanes (203) están en su posición más baja. Cuando la rueda

(214) está situada en una sección de la rueda de posicionamiento (206) donde la distancia desde el eje (211) es

15 máxima, los imanes (203) están en su posición más alta. Así, en el modo de realización preferente del primer modo de realización de la estación de separación, la posición de los imanes (203) está controlada por la forma de la rueda de posicionamiento (206). Cuando el elemento móvil (209) se mueve a lo largo de la parte central, superior redondeada o inferior (212a) del carril (212), el tipo pequeño de imanes (203) se mueve hacia arriba y hacia abajo. Cuando el elemento móvil (209) está situado en el lado (212b) del extremo inferior (207) y se mueve hacia arriba o hacia abajo, los imanes (202) se mueven hacia arriba o hacia abajo. La rueda de posicionamiento puede ser girada por cualquier motor (224).

En un modo de realización preferente, un muelle (225) está unido a la base (222) de la estación de separación y a la base (218) de imanes (203) para garantizar que los imanes (203) se muevan hasta la posición más baja cuando se

25 mueven hacia abajo.

El término "pasador", tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier elemento de fijación, incluyendo tornillos o clavijas.

En un segundo modo de realización preferente, la estación de separación (230) comprende al menos un accesorio

(231) que comprende al menos un imán (232), preferentemente un número de imanes igual a un número de recipientes (103) de una fila (123). Preferentemente, la estación de separación (230) comprende un número de accesorios (231) igual al número de filas (123) de la placa multipocillo (101) descrita anteriormente en el presente documento. Más preferentemente, seis accesorios (231) están montados en la estación de separación (230). Al

35 menos un imán (232) está montado en un accesorio (231). Preferentemente, el número de imanes (232) es igual al número de recipientes (103) de una fila (123). Lo más preferentemente, ocho imanes (232) están montados en un accesorio (231). Preferentemente, un tipo de imán (232) está comprendido en dicho accesorio (231). Más preferentemente, el imán (232) está montado en un lado orientado hacia los recipientes con los que interactúa el imán.

El accesorio (231) está montado sobre una base (233). Preferentemente, dicho montaje es flexible. La base (233) comprende muelles (234) montados sobre la misma. El número de muelles (234) es al menos un muelle por accesorio (231) montado sobre dicha base (233). La base comprende además un chaflán (236) que limita el movimiento del muelle y, en consecuencia, del accesorio (231) que comprende los imanes (232). Preferentemente,

45 uno cualquiera de dichos muelles (234) está construido y dispuesto para interactuar con un accesorio (231). Más preferentemente, dicho muelle (234) es un muelle de báscula. Dicha interacción controla el movimiento horizontal de los accesorios (231). Además, la estación de separación (230) comprende un bastidor (235). La base (233) con accesorios (231) está conectada al bastidor (235) mediante un mecanismo móvil como se ha descrito anteriormente para los imanes (232) del primer modo de realización.

Preferentemente, dicha base (233) y accesorio (231) están construidos y dispuestos para moverse verticalmente (en la dirección Z).

La placa multipocillo (101) descrita anteriormente en el presente documento se inserta en la estación de separación 55 (230). El accesorio (231) que comprende los imanes (232) se mueve verticalmente. Por lo tanto, cualquier accesorio

(232) se mueve dentro de un espacio (121) entre dos filas (123) de recipientes (103). El movimiento vertical hace que los imanes (232) montados sobre un accesorio (231) entren en contacto con los recipientes (103). La posición Z se elige dependiendo del volumen de líquido (215) dentro de los recipientes (103). Para grandes volúmenes, los imanes (232) entran en contacto con los recipientes (103) en una posición central (120) donde los recipientes (103) tienen una forma casi rectangular. Para pequeños volúmenes de líquido (215) donde la mayor parte del líquido (215) está situada por debajo de la parte central (120) de los recipientes (103), los imanes (232) entran preferentemente en contacto con la parte cónica (111) de los recipientes (103).

Un muelle está unido a la base (233) de cualquier marco (231) (Fig. 9a), b)). El muelle presiona los imanes (232)

65 contra los recipientes (103). Esto garantiza un contacto entre los imanes (232) y los recipientes (103) durante la separación magnética. Preferentemente, el imán (232) entra en contacto con el recipiente (103) en la pared lateral

(109) situada por debajo de la entrada (105). Esto tiene la ventaja de que el líquido que se añade mediante pipeteado fluye sobre las partículas magnéticas secuestradas y garantiza que las partículas se resuspenden y que todas las muestras de todos los recipientes se tratan de forma idéntica.

5 Este modo de realización es particularmente adecuado para separar un líquido (215) comprendido en una placa multipocillo (101) como se ha descrito anteriormente en el presente documento, de partículas magnéticas (216) cuando los recipientes (103) de dicha placa multipocillo (101) contienen diferentes niveles de líquido (215).

Un "tampón de lavado" es un fluido que está diseñado para eliminar componentes no deseados, especialmente en

10 un procedimiento de purificación. Dichos tampones se conocen bien en la técnica. En el contexto de la purificación de ácidos nucleicos, el tampón de lavado es adecuado para lavar el material de soporte sólido con el fin de separar el ácido nucleico inmovilizado de cualquier componente no deseado. El tampón de lavado puede contener, por ejemplo, etanol y/o agentes caotrópicos en una solución tamponada o soluciones con un pH ácido sin etanol y/o agentes caotrópicos como se ha descrito anteriormente. A menudo, la solución de lavado u otras soluciones se

15 proporcionan como soluciones madre que tienen que ser diluidas antes de su uso.

El lavado en el procedimiento de acuerdo con la invención requiere un contacto más o menos intensivo del material de soporte sólido y los ácidos nucleicos inmovilizados sobre el mismo con el tampón de lavado. Diferentes procedimientos son posibles para conseguir esto, por ejemplo, agitando el tampón de lavado con el material de

20 soporte sólido en o junto con el recipiente o recipientes respectivos. Otro procedimiento ventajoso es aspirar y dispensar la suspensión que comprende tampón de lavado y material de soporte sólido una o más veces. Este procedimiento se lleva a cabo preferentemente usando una pipeta, en el que dicha pipeta preferentemente comprende una punta de pipeta desechable en la que se aspira dicha suspensión y a partir de la cual se dispensa de nuevo. Dicha punta de pipeta se puede usar varias veces antes de ser desechada y reemplazada. Las puntas de

25 pipeta desechables útiles para la invención tienen preferentemente un volumen de al menos 10 µl, más preferentemente de al menos 15 µl, más preferentemente de al menos 100 µl, más preferentemente de al menos 500 µl, más preferentemente de al menos 1 ml, incluso más preferentemente de aproximadamente 1 ml. Las pipetas utilizadas en el contexto de la invención también pueden ser agujas de pipeteado.

30 Así, un aspecto preferente de la invención es el procedimiento descrito anteriormente, en el que dicho lavado en la etapa d. comprende aspirar y dispensar el tampón de lavado que comprende el material de soporte sólido.

Para el tratamiento posterior de los ácidos nucleicos aislados, puede ser ventajoso separarlos del material de soporte sólido antes de someterlos a amplificación.

35 Por lo tanto, un aspecto preferente de la invención es el procedimiento descrito anteriormente, en el que dicho procedimiento comprende además en la etapa d. la etapa de elución de los ácidos nucleicos purificados del material de soporte sólido con un tampón de elución después del lavado de dicho material de soporte sólido.

40 Un "tampón de elución" en el contexto de la invención es un líquido adecuado para separar los ácidos nucleicos del soporte sólido. Dicho líquido puede ser, por ejemplo, agua destilada o soluciones salinas acuosas, tales como, por ejemplo, tampones Tris como Tris HCl, o HEPES, u otros tampones adecuados conocidos por el experto en la técnica. El valor de pH de dicho tampón de elución es preferentemente alcalino o neutro. Dicho tampón de elución puede contener componentes adicionales tales como, por ejemplo, quelantes como EDTA, que estabiliza los ácidos

45 nucleicos aislados por inactivación de enzimas degradantes.

La elución se lleva a cabo preferentemente a temperaturas elevadas, de modo que un modo de realización preferente de la invención es el procedimiento descrito anteriormente, en donde la etapa d. se lleva a cabo a una temperatura entre 70 °C y 90 °C, más preferentemente a una temperatura de 80 °C.

50 Los "reactivos de amplificación", en el contexto de la invención, son componentes químicos o bioquímicos que permiten la amplificación de ácidos nucleicos. Dichos reactivos comprenden, pero no se limitan a, polimerasas de ácidos nucleicos, tampones, mononucleótidos tales como nucleósidos trifosfato, oligonucleótidos, por ejemplo, como cebadores de oligonucleótidos, sales y sus respectivas soluciones, sondas de detección, tintes y más.

55 Como se conoce en la técnica, un "nucleósido" es una combinación base-azúcar. La porción de base del nucleósido es, normalmente, una base heterocíclica. Las dos clases más comunes de tales bases heterocíclicas son purinas y pirimidinas.

60 Los "nucleótidos" son nucleósidos que incluyen además un grupo fosfato unido covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosilo, el grupo fosfato puede estar unido al resto hidroxilo 2', 3' o 5' del azúcar. Un nucleótido es la unidad monomérica de un "oligonucleótido", que se puede designar más generalmente como un "compuesto oligomérico", o un "polinucleótido", designado más generalmente como un "compuesto polimérico". Otra expresión general de lo anteriormente mencionado es ácido

65 desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN).

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desoxinucleósidos trifosfato y se libera pirofosfato.

Una "sonda" también designa un oligonucleótido natural o modificado. Como se conoce en la técnica, una sonda sirve para detectar un analito o un amplificado. En el caso del procedimiento descrito anteriormente, se pueden usar 5 sondas para detectar los amplificados de los ácidos nucleicos diana. Para este propósito, las sondas suelen llevar marcadores.

Los "marcadores", a menudo denominados "grupos indicadores", son en general grupos que hacen que un ácido nucleico, en particular oligonucleótidos u oligonucleótidos modificados, así como cualquier ácido nucleico unido a ellos, resulte distinguible del resto de la muestra (los ácidos nucleicos que tienen unido un marcador también se pueden denominar compuestos de unión a ácidos nucleicos marcados, sondas marcadas o, simplemente, sondas). Los marcadores preferentes de acuerdo con la invención son marcadores fluorescentes, que son, por ejemplo, tintes fluorescentes tales como un tinte de fluoresceína, un tinte de rodamina, un tinte de cianina y un tinte de cumarina. Los tintes fluorescentes preferentes de acuerdo con la invención son FAM, HEX, JA270, CAL635, Coumarin343,

15 Quasar705, Cyan500, CY5.5, LC-Red 640, LC-Red 705.

En el contexto de la invención, cualquier cebador y/o sonda se puede modificar químicamente, es decir, el cebador y/o la sonda comprenden un nucleótido modificado o un compuesto no nucleotídico. La sonda o el cebador es entonces un oligonucleótido modificado.

Un procedimiento preferente de amplificación de ácidos nucleicos es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que se divulga, entre otras referencias, en las Patentes de EE. UU. n.º 4.683.202, 4.683.195, 4.800.159 y 4.965.188. La PCR emplea típicamente dos o más cebadores oligonucleotídicos que se unen a un molde de ácido nucleico seleccionado (por ejemplo, ADN o ARN). Los cebadores útiles para el análisis de ácidos nucleicos incluyen 25 oligonucleótidos capaces de actuar como un punto de iniciación de la síntesis de ácido nucleico dentro de las secuencias de ácido nucleico de los ácidos nucleicos diana. Un cebador se puede purificar a partir de un hidrolizado de restricción por procedimientos convencionales, o se puede producir sintéticamente. El cebador es preferentemente monocatenario para una máxima eficacia en la amplificación, pero el cebador puede ser bicatenario. Los cebadores bicatenarios se desnaturalizan primero, es decir, se tratan para separar las hebras. Un procedimiento para desnaturalizar ácidos nucleicos bicatenarios es la aplicación de calor. Una "polimerasa termoestable" es una enzima polimerasa que es estable frente al calor, es decir, es una enzima que cataliza la formación de productos de extensión de cebadores complementarios a un molde y no se desnaturaliza irreversiblemente cuando se somete a las temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para efectuar la desnaturalización de ácidos nucleicos molde bicatenarios. En general, la síntesis se inicia en el extremo 3' de cada

35 cebador y continúa en la dirección 5' a 3' a lo largo de la cadena del molde. Las polimerasas termoestables se han aislado, por ejemplo, de Thermus flavus, T. ruber, T. thermophilus, T. aquaticus, T. lacteus, T. rubens, Bacillus stearothermophilus y Methanothermus fervidus. Sin embargo, las polimerasas que no son termoestables también se pueden emplear en ensayos de PCR siempre que se reponga la enzima.

Si el ácido nucleico molde es bicatenario, es necesario separar las dos cadenas antes de que se pueda usar como molde en la PCR. La separación de cadenas se puede realizar mediante cualquier procedimiento de desnaturalización adecuado como medios físicos, químicos o enzimáticos. Un procedimiento para separar las cadenas de ácido nucleico implica calentar el ácido nucleico hasta que se desnaturaliza predominantemente (por ejemplo, se desnaturaliza más de un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 %). Las condiciones de calentamiento

45 necesarias para desnaturalizar el ácido nucleico molde dependerán, por ejemplo, de la concentración de sal de tampón y de la longitud y composición de nucleótidos de los ácidos nucleicos que se van a desnaturalizar, pero típicamente oscilan entre aproximadamente 90 ºC y aproximadamente 105 ºC durante un tiempo que depende de características de la reacción tales como la temperatura y la longitud del ácido nucleico. La desnaturalización se realiza típicamente durante aproximadamente 5 segundos a 9 minutos. Con el fin de no exponer la polimerasa respectiva como, por ejemplo, la polimerasa de ADN Z05, a dichas altas temperaturas durante demasiado tiempo y de arriesgar así una pérdida de enzima funcional, es preferente el uso de etapas de desnaturalización cortas.

En un modo de realización preferente de la invención, la etapa de desnaturalización es de hasta 30 segundos, más preferentemente hasta 20 segundos, más preferentemente hasta 10 segundos, más preferentemente hasta

55 5 segundos, lo más preferentemente de aproximadamente 5 segundos.

Si el ácido nucleico molde bicatenario se desnaturaliza por calor, la mezcla de reacción se deja enfriar hasta una temperatura que promueva la hibridación de cada cebador con su secuencia diana en los ácidos nucleicos diana.

La temperatura para la hibridación es preferentemente de aproximadamente 35 ºC a aproximadamente 70 ºC, más preferentemente de aproximadamente 45 ºC a aproximadamente 65 ºC; más preferentemente de aproximadamente 50 ºC a aproximadamente 60 ºC, más preferentemente de aproximadamente 55 ºC a aproximadamente 58 ºC. Los tiempos de hibridación pueden ser de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 1 minuto (por ejemplo, de aproximadamente 20 segundos a aproximadamente 50 segundos, de aproximadamente 30 segundos a 65 aproximadamente 40 segundos). En este contexto, puede ser ventajoso utilizar diferentes temperaturas de hibridación para aumentar la inclusividad del ensayo respectivo. En resumen, esto significa que a temperaturas de

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imagen10

presencia de al menos los cuatro desoxirribonucleósidos trifosfato naturales o modificados, en un tampón apropiado que comprende un tampón de iones metálicos que, en un modo de realización preferente, tampona tanto el pH como la concentración de iones metálicos. Esta incubación se realiza a una temperatura suficiente para que dicho cebador se hibride con dicho molde de ARN y dicha ADN polimerasa para catalizar la polimerización de dichos

5 desoxirribonucleósidos trifosfato para formar una secuencia de ADNc complementaria a la secuencia de dicho molde de ARN.

Como se usa en el presente documento, el término "ADNc" se refiere a una molécula de ADN complementaria sintetizada usando una cadena de ácido ribonucleico (ARN) como molde. El ARN puede ser, por ejemplo, ARNm, ARNt, ARNr u otra forma de ARN, tal como ARN vírico. El ADNc puede ser monocatenario, bicatenario o puede estar unido mediante enlaces de hidrógeno a una molécula de ARN complementaria como en un híbrido ARN/ADNc.

Un cebador adecuado para la hibridación a un molde de ARN también puede ser adecuado para la amplificación por PCR. Para PCR, un segundo cebador, complementario a la cadena de ADNc transcrita inversamente, proporciona

15 un sitio de iniciación para la síntesis de un producto de extensión.

En la amplificación de una molécula de ARN por una ADN polimerasa, la primera reacción de extensión es la transcripción inversa usando un molde de ARN, y se produce una cadena de ADN. La segunda reacción de extensión, usando el molde de ADN, produce una molécula de ADN bicatenario. De este modo, la síntesis de una cadena de ADN complementaria a partir de un molde de ARN mediante una ADN polimerasa proporciona el material de partida para la amplificación.

Las ADN polimerasas termoestables se pueden usar en una reacción combinada de transcripción inversa y amplificación con una sola enzima. El término "homogéneo", en este contexto, se refiere a una reacción de adición 25 única de dos etapas para la transcripción inversa y la amplificación de una diana de ARN. Por homogéneo se entiende que, después de la etapa de transcripción inversa (RT), no hay necesidad de abrir el recipiente de reacción

o de ajustar de otro modo los componentes de reacción antes de realizar la etapa de amplificación. En una reacción RT/PCR no homogénea, después de la transcripción inversa y antes de la amplificación, uno o más de los componentes de la reacción tales como los reactivos de amplificación se ajustan, añaden o diluyen, por ejemplo, para lo cual es necesario abrir el recipiente de reacción o, al menos, manipular su contenido. Aunque tanto los modos de realización homogéneos como los no homogéneos están comprendidos en el alcance de la invención, es preferente el formato homogéneo para RT/PCR.

La transcripción inversa es un paso importante en una RT/PCR. Por ejemplo, es conocido en la técnica que los

35 moldes de ARN muestran una tendencia hacia la formación de estructuras secundarias que puede obstaculizar la unión del cebador y/o el alargamiento de la cadena de ADNc por la respectiva transcriptasa inversa. Por lo tanto, las temperaturas relativamente altas para una reacción de RT son ventajosas con respecto a la eficiencia de la transcripción. Por otra parte, el aumento de la temperatura de incubación también implica una mayor especificidad, es decir, los cebadores de la RT no se hibridarán a secuencias que presentan errores de apareamiento con la secuencia o secuencias esperadas. Particularmente en el caso de múltiples ARN diana diferentes, puede ser deseable también transcribir y posteriormente amplificar y detectar secuencias con errores de apareamiento únicos, por ejemplo, en el caso de la posible presencia de subcepas o subespecies desconocidas o raras de organismos en la muestra fluida.

45 Con el fin de beneficiarse de ambas ventajas descritas anteriormente, es decir, la reducción de estructuras secundarias y la transcripción inversa de moldes con errores de apareamiento, es preferente llevar a cabo la incubación de RT a más de una temperatura diferente.

Por lo tanto, un aspecto preferente de la invención es el procedimiento descrito anteriormente, en el que dicha incubación de la polimerasa con actividad de transcriptasa inversa se lleva a cabo a diferentes temperaturas de 30 ºC a 75 ºC, preferentemente de 45 ºC a 70 ºC, más preferentemente de 55 °C a 65 °C.

Como un aspecto importante adicional de la transcripción inversa, las etapas de RT prolongadas pueden dañar las moldes de ADN que pueden estar presentes en la muestra fluida. Si la muestra fluida contiene tanto especies de

55 ARN como de ADN, es favorable mantener la duración de las etapas de RT lo más cortas posible, pero al mismo tiempo garantizar la síntesis de cantidades de ADNc suficientes para la posterior amplificación y detección opcional de amplificados.

Por lo tanto, un aspecto preferente de la invención es el procedimiento descrito anteriormente, en el que el período de tiempo para la incubación de la polimerasa con actividad de transcriptasa inversa es de hasta 30 minutos, 20 minutos, 15 minutos, 12,5 minutos, 10 minutos, 5 minutos o 1 minuto.

Un aspecto preferente adicional de la invención es el procedimiento descrito anteriormente, en el que la polimerasa con actividad de transcriptasa inversa y que comprende una mutación se selecciona del grupo que consiste en

65 a) una ADN polimerasa CS5

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fluida no tiene que ser manipulada entre la etapa de RT y la etapa de amplificación.

Por lo tanto, en un modo de realización preferente, en el procedimiento descrito anteriormente, la misma polimerasa con actividad de transcriptasa inversa se utiliza para la transcripción inversa y para la amplificación en la etapa f. 5 Preferentemente, la enzima es la ADN polimerasa Z05 mutante descrita supra.

Con el fin de no exponer la polimerasa u otros componentes de la mezcla de reacción utilizados en el contexto de la invención a temperaturas elevadas durante tiempos más largos de lo necesario, en un modo de realización preferente, las etapas que se realizan por encima de 90 ºC son de hasta 20 segundos, preferentemente de hasta 15 segundos, más preferentemente de hasta 10 segundos, más preferentemente de hasta 5 segundos y lo más preferentemente de 5 segundos de duración. Esto también reduce el tiempo hasta el resultado y reduce el tiempo total requerido del ensayo.

En dicha configuración homogénea, puede ser considerablemente ventajoso sellar los recipientes de reacción antes

15 de iniciar la RT y la amplificación, reduciendo así el riesgo de contaminación. El sellado se puede lograr, por ejemplo, aplicando una lámina que sea preferentemente transparente, una tapa o añadiendo aceite a los recipientes de reacción y formando una fase lipófila como capa de sellado en la parte superior del fluido.

Así, un aspecto preferente de la invención es el procedimiento descrito anteriormente, que comprende además, después de la etapa e., la etapa de sellado de los al menos dos recipientes de reacción.

Para facilitar la manipulación y la automatización, es preferente combinar los al menos dos recipientes de reacción en una disposición integral, de modo que se puedan manipular juntos.

25 Por consiguiente, un aspecto preferente de la invención es el procedimiento descrito anteriormente, en el que los al menos dos recipientes de reacción se combinan en la misma disposición integral.

Las disposiciones integrales pueden ser, por ejemplo, viales o tubos unidos de manera reversible o irreversible entre sí o dispuestos en una gradilla. Preferentemente, la disposición integral es una placa multipocillo.

El objetivo de la etapa de amplificación puede ser una molécula híbrida de ARN/ADN. El objetivo puede ser un ácido nucleico monocatenario o bicatenario. Aunque el procedimiento de PCR más ampliamente utilizado utiliza una diana bicatenaria, esto no es una necesidad. Después del primer ciclo de amplificación de una diana de ADN monocatenario, la mezcla de reacción contiene una molécula de ADN bicatenario constituida por la diana

35 monocatenaria y una cadena complementaria recién sintetizada. De forma similar, tras el primer ciclo de amplificación de una diana de ARN/ADNc, la mezcla de reacción contiene una molécula de ADNc bicatenario. En este punto, los ciclos de amplificación sucesivos proceden como se ha descrito anteriormente.

Dado que la amplificación de ácidos nucleicos, especialmente pero no sólo en el caso de la PCR, es muy eficaz si se lleva a cabo como una reacción de ciclación, un aspecto preferente de la invención es el procedimiento descrito anteriormente, en el que la reacción de amplificación en la etapa f. consiste en múltiples etapas de ciclación.

Los procedimientos de detección de ácidos nucleicos adecuados son conocidos por el experto en la materia y se describen en libros de texto estándar como Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring

45 Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989 y Ausubel F. et al.: Current Protocols in Molecular Biology 1987, J. Wiley and Sons, NY. Pueden existir también etapas de purificación adicionales antes de que se lleve a cabo la etapa de detección de ácido nucleico como, por ejemplo, una etapa de precipitación. Los procedimientos de detección pueden incluir, pero no se limitan a, la unión o intercalación de tintes específicos como bromuro de etidio, que se intercalan en el ADN bicatenario y luego cambian su fluorescencia. El ácido nucleico purificado también se puede separar por procedimientos electroforéticos opcionalmente después de una hidrolización de restricción y visualizarse a continuación. También hay ensayos basados en sondas que aprovechan la hibridación de oligonucleótidos a secuencias específicas y posterior detección del híbrido.

Es preferente detectar los ácidos nucleicos diana amplificados durante o después de la reacción de amplificación

55 para evaluar el resultado del análisis. Particularmente para la detección en tiempo real, es ventajoso utilizar sondas de ácido nucleico.

Por lo tanto, un aspecto preferente de la invención es el procedimiento descrito anteriormente, en el que una etapa de ciclación comprende una etapa de amplificación y una etapa de hibridación, comprendiendo dicha etapa de hibridación la hibridación de los ácidos nucleicos amplificados con sondas.

Puede ser favorable monitorizar la reacción de amplificación en tiempo real, es decir, detectar los ácidos nucleicos diana y/o sus amplificados durante la propia amplificación.

65 Por lo tanto, un aspecto preferente de la invención es el procedimiento descrito anteriormente, en el que las sondas están marcadas con un resto fluorescente donante y un resto fluorescente aceptor correspondiente.

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Reactivo R1

Conc./50 µl -PCR [µM]

Agua (calidad PCR)

Mn(Ac)2 * 4H2O (pH 6,1 ajustado con ácido acético)

3000

NaN3/Ri, tamponado con Tris 10 mM a pH 7 [%]

0,018

Reactivo R2

Conc./50 µl -PCR [µM]

DMSO [%]

5,000 %

NaN3/Ri, tamponado con Tris 10 mM a pH 7 [%]

0,027 %

Acetato de potasio pH 7,0

110 000

Glicerol [%]

3,000 %

Tricina pH 8.0

50 000

Igepal [%]

0,024 %

dGTP

337,5

dATP

337,5

dCTP

337,5

dUTP

675

Cebadores/sondas seleccionadas de SEQ ID NO. 1-35

0,1-0,15

SEQ ID NO. 42

0,1

SEQ ID NO. 43

0,1

SEQ ID NO. 44

0,1

Uracil-N-glicosilasa

10 (U/reacción)

Polimerasa Z05-D

40 (U/reacción)

Aptámero NTQ21-46A

0,222

Agua

Para VHB:

Reactivo R2

Conc. en 50 µl -PCR

H2O

100 %

Tricina 7,7

40 mM

Tween 20

0,03 % (v/v)

Glicerol

5 % (v/v)

KOH

25,2 mM

KOAc

121,8 mM

NTQ21-46A (Aptámero)

0,2625 µM

dGTP

0,42 µM

dATP

0,42 µM

dCTP

0,42 µM

dUTP

0,84 µM

SEQ ID NO. 36

1,2 µM

SEQ ID NO. 37

0,1 µM

SEQ ID NO. 38

1,2 µM

SEQ ID NO. 42

0,6 µM

SEQ ID NO. 43

0,6 µM

SEQ ID NO. 44

0,15 µM

Polimerasa Z05D

35 (U/reacción)

Uracil-N-glicosilasa

2 (U/reacción)

Azida de sodio

0,027 % (m/v)

Reactivo R1

Conc./50 µl -PCR

H2O

100 %

MgOAc

2,5 mM

MnOAc pH 6,1

2,5 mM

Azida de sodio

0,018 % (m/v)

Para CT:

Reactivo R1

Conc. en 50 µl -PCR

Agua (calidad PCR)

Mn(Ac)2 (pH 6,5 en ácido acético glacial 0,002 % (v/v)

2,7 mM

NaN3

0,0135 % (p/v)

Reactivo R2

Conc./50 µl -PCR

NaN3/Ri, tamponado con Tris 10 mM a pH 7 [%]

0,0315%

Acetato de potasio

112,4 mM

Glicerol [%]

3,5%

Tricina

61 mM

Hidróxido de potasio

28,4 mM

dGTP

525 µM

dATP

525 µM

dCTP

525 µM

dUTP

1,05 mM

SEQ ID NO. 39

750 nM

SEQ ID NO. 40

600 nM

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El procedimiento de amplificación genérico descrito anteriormente en el presente documento se llevó a cabo en una variedad de diferentes ácidos nucleicos diana en experimentos separados pero en condiciones idénticas. El aislamiento del ácido nucleico respectivo se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1.

5 El ácido nucleico de control interno genérico respectivo se seleccionó de SEQ ID NO. 45-49 y fue ARN encapsulado para dianas de ARN y ADN empaquetado en lambda para dianas de ADN. Para ensayos de ARN cualitativos se añadieron 300 partículas por muestra, para ensayos de ARN cuantitativos se añadieron 3000 y para todos los ensayos de ADN 500.

10 Se utilizó el siguiente perfil de PCR para todas las dianas:

Objetivo [°C]

Modo de adquisición Mantenimiento [hh:mm:ss] Medición [hh:mm:ss] Rampa de temperatura [°C/s]

Pre-PCR

Etapa UNG 50 ninguno 00:02:00 0:00:00 2,2

Desnaturalización de molde/UNG

94 ninguno 0:00:05 0:00:00 4,4

Etapa de RT

55 ninguno 00:02:00 0:00:00 2,2

60

ninguno 0:06:00 0:00:00 4,4

65

ninguno 0:04:00 0:00:00 4,4

1ª medición

95 ninguno 0:00:05 0:00:00 4,4

55

único 0:00:30 0:00:08 2,2

2ª medición

91 ninguno 0:00:05 0:00:00 4,4

58

único 0:00:25 0:00:08 2,2

Enfriamiento

40 ninguno 00:02:00 0:00:00 2,2

Denominación

Ciclos

Pre-PCR

1

1ª medición

5

2ª medición

45

Enfriamiento

1

En detalle, se realizaron los siguientes experimentos:

15

1. Análisis cualitativo múltiple de VHB, VHC y VIH

a. Mezcla maestra

20 R1:

Conc. en 50 µl -PCR (µM)

Mn(Ac)2 * 4H2O (pH 6,1 ajustado con ácido acético)

3300

NaN3/Ri, tamponado con Tris 10 mM a pH 7

0,018

pH: 6,41

R2:

Reactivo

Conc. en 50 µl -PCR (µM)

DMSO (%)

5,4

NaN3/Ri, tamponado con Tris 10 mM a pH 7

0,027

KOAc (pH 7,0)

120 000

Glicerol (%)

3

Tween 20 (%)

0,015

Tricina pH 8.0

60 000

Aptámero NTQ21-46A

0,2222

Uracil-N-glicosilasa (U/µl)

0,2

dGTP

400,0

dATP

400,0

dCTP

400,0

dUTP

800,0

Polimerasa Z05-D (U/µl)*

0,9

Cebadores/sondas seleccionadas de SEQ ID NO. 1-35

0,125-0,3

SEQ ID NO. 36

0,100

SEQ ID NO. 37

0,100

SEQ ID NO. 38

0,150

Cebadores/sondas seleccionadas de SEQ ID NO. 60-76

0,050-0,250

SEQ ID NO. 42

0,200

SEQ ID NO. 43

0,200

SEQ ID NO. 44

0,100

Sensibilidad analítica / LDD

Para cada virus detectado (VIH-1 grupo M, VIH-1 grupo O, VIH-2, VHB y VHC), a varias concentraciones/niveles en 5 y alrededor del LDD previsto para el plasma con EDTA. Se ensayó un panel por virus y concentración con al menos 20 réplicas válidas por concentración. El LDD se determinó mediante el análisis PROBIT (véase la Tabla 1-5).

VIH

10 Tabla 1: VIH-1 grupo M. Tasas de éxito y LDD Probit de un panel individual

Concentración

Número de réplicas Número de positivos Tasa de éxito

32 cp/ml

21 21 100 %

16 cp/ml

21 21 100 %

8 cp/ml

21 21 100 %

4 cp/ml

21 20 95 %

2 cp/ml

21 15 71 %

1 cp/ml

21 9 43 %

0 cp/ml (control negativo)

12 0 0 %

LDD por análisis PROBIT (95 % de tasa de éxito)

4,06 cp/ml

Intervalo de confianza del 95 % para LDD mediante análisis PROBIT

2,85-9,24 cp/ml

El título de la norma de la OMS para el VIH-1 grupo M se convirtió a UI/ml.

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imagen24

Acetato de potasio pH 7,0

120 000

Glicerol (%)

3

Tween 20 (%)

0,015

Tricina pH 8.0

60 000

Aptámero NTQ21-46A

0,2222

Uracil-N-glicosilasa (U/µl)

0,2

dGTP

400,0

dATP

400,0

dCTP

400,0

dUTP

800,0

Polimerasa Z05-D (U/µl)*

0,9

Cebadores/sondas seleccionadas de SEQ ID NO. 53-59

0,08-0,4

SEQ ID NO. 42

0,150

SEQ ID NO. 43

0,150

SEQ ID NO. 44

0,100

Sensibilidad analítica / LDD

Para los virus (VNO, VESL y VEJ) se preparó un panel independiente como una dilución en serie del patrón

5 respectivo incluyendo varias concentraciones/niveles en y alrededor del LDD previsto. Se ensayó un panel por virus y concentración con al menos 20 réplicas válidas por concentración. El LDD se determinó mediante el análisis PROBIT.

Tabla 6: VNO. Tasas de éxito y LDD Probit de un panel individual 10

Concentración

Número de réplicas Número de positivos Tasa de éxito

20 cp/ml

21 21 100 %

12 cp/ml

21 21 100 %

8 cp/ml

21 21 100 %

5 cp/ml

21 17 81 %

2,5 cp/ml

21 15 71,4 %

0,5 cp/ml

21 1 4,8 %

0 cp/ml (control negativo)

12 0 0 %

LDD por análisis PROBIT (95 % de tasa de éxito)

6,57 cp/ml

Intervalo de confianza del 95 % para LDD mediante análisis PROBIT

4,74 -11,03 cp/ml

Tabla 7: VESL. Tasas de éxito y LDD Probit de un panel individual

Concentración

Número de réplicas Número de positivos Tasa de éxito

140 cp/ml

21 21 100 %

100 cp/ml

21 20 95,2 %

70 cp/ml

21 20 95,2 %

40 cp/ml

21 17 81,0 %

20 cp/ml

21 11 52,4 %

10 cp/ml

21 6 28,6 %

0 cp/ml (control negativo)

12 0 0 %

Concentración

Número de réplicas Número de positivos Tasa de éxito

LDD por análisis PROBIT (95 % de tasa de éxito)

78,9 cp/ml

Intervalo de confianza del 95 % para LDD mediante análisis PROBIT

55,4 -145,7 cp/ml

Tabla 8: VEJ. Tasas de éxito y LDD Probit de un panel individual

Concentración

Número de réplicas Número de positivos Tasa de éxito

20 cp/ml

21 20 95,2 %

12 cp/ml

21 20 95,2 %

8 cp/ml

21 18 85,7 %

5 cp/ml

21 17 81,0%

2,5 cp/ml

21 14 66,7 %

0,5 cp/ml

21 2 9,52 %

0 cp/ml (control negativo)

12 0 0 %

LDD por análisis PROBIT (95 % de tasa de éxito)

13,55 cp/ml

Intervalo de confianza del 95 % para LDD mediante análisis PROBIT

8,78-27,7 cp/ml

5

3. Análisis cuantitativo de VHB

Mezcla maestra

10

R1:

Reactivo

Conc. final en 50 µl -PCR (µM)

Mn(Ac)2 * 4H2O (pH 6,1 ajustado con ácido acético)

3300

NaN3/Ri, tamponado con Tris 10 mM a pH 7

0,018

pH: 6,41

R2:

Reactivo

Conc. final en 50 µl -PCR (µM)

Glicerol (p/v, %)

3 %

Tricina

60 mM

DMSO (%, v/v)

5,4 %

KOAc

120 mM

Tween 20 (v/v)

0,015 %

Aptámero NTQ21-46A

0,222 µM

Polimerasa Z05D

0,9 U/µl (45 U/rxn)

Uracil-N-glicosilasa

0,2 U/µl (10 U/rxn)

Azida de sodio (p/v)

0,027 %

dCTP

400 µM

dGTP

400 µM

dATP

400 µM

dUTP

800 µM

SEQ ID NO. 36

1,2 µM

SEQ ID NO. 37

1,2 µM

imagen25

imagen26

imagen27

Título nominal (UI/ml)

Título asignado (UI/ml) Título asignado (log10) Título medio observado (log10) Réplicas

1,00E+06

8,30E+05 5,92 5,75 21

1,00E+07

8,30E+06 6,92 6,73 21

1,00E+08

8,30E+07 7,92 7,78 21

1,00E+09

8,30E+08 8,92 8,92 21

2,00E+09

1,70E+09 9,22 9,22 21

Una representación gráfica de este resultado se muestra en la Fig. 14.

Resumen de linealidad:

5 El intervalo lineal, definido como el intervalo de concentración para el cual la desviación logarítmica de los títulos medios logarítmicos observados está dentro de ±0,3 del título nominal logarítmico, se determinó como: 3,5E+00 UI/ml -1,7E+09 UI/ml para el plasma con EDTA y 3,3E+00 UI/ml -1,7E+09 UI/ml para el suero. Se encontró que el límite inferior de cuantificación era: 4,0E+00 UI/ml para plasma con EDTA y suero.

10

4. Análisis cuantitativo del VHC

Mezcla maestra 15 R1:

Reactivo

Conc. final en 50 µl -PCR (µM)

Mn(Ac)2 * 4H2O (pH 6,1 ajustado con ácido acético)

3300

NaN3/Ri, tamponado con Tris 10 mM a pH 7

0,018

pH: 6,41

R2:

Reactivo

Conc. final en 50 µl -PCR

Glicerol (p/v, %)

3 %

Tricina

60 mM

DMSO (%, v/v)

5,4 %

KOAc

120 mM

Tween 20 (v/v)

0,015 %

NTQ21-46A

0,222 µM

Z05D

0,9 U/µl (45 U/rxn)

UNG

0,2 U/µl (10 U/rxn)

Azida de sodio (p/v)

0,027

dCTP

400 µM

dGTP

400 µM

dATP

400 µM

dUTP

800 µM

Cebadores/sondas seleccionadas de SEQ ID NO. 60-76

0,1 µM

SEQ ID NO. 42

0,3 µM

SEQ ID NO. 43

0,3 µM

SEQ ID NO. 44

µM

Sensibilidad analítica / LDD

Se preparó un panel de dilución con el patrón secundario de VHC de Roche en plasma con EDTA y suero negativos para VHC utilizando volúmenes de entrada de muestra de 200 µl y 500 µl. Cada nivel de concentración se sometió a

imagen28

imagen29

imagen30

Reactivo

Conc. final en 50 µl -PCR

Glicerol (p/v, %)

3 %

Tricina

60 mM

DMSO (%, v/v)

5,4 %

KOAc

120 mM

Tween 20 (v/v)

0,02 %

Aptámero NTQ21-46A

0,222 µM

Polimerasa Z05D

0,9 U/µl (45 U/rxn)

UNG

0,2 U/µl (10 U/rxn)

Azida de sodio (p/v)

0,027

dCTP

400 µM

dGTP

400 µM

dATP

400 µM

dUTP

800 µM

Cebadores/sondas seleccionadas de SEQ ID NO. 1-35

0,1 µM -0,3 µM

SEQ ID NO. 50

0,3 µM

SEQ ID NO. 51

0,3 µM

SEQ ID NO. 52

µM

Sensibilidad analítica / LDD

Se preparó un panel de dilución con el patrón secundario de VIH-1M en plasma con EDTA negativo para VIH-1

5 utilizando volúmenes de entrada de muestra de 200 µl y 500 µl. Cada nivel de concentración se sometió a ensayo con 21 réplicas. Al menos 20 réplicas necesitaban ser válidas. El LDD se determinó mediante el análisis PROBIT a una tasa de éxito del 95 % y mediante un análisis de la tasa de éxito ≥ 95 %.

Tabla 21: Análisis de LDD para un volumen de entrada de 200 µl en plasma con EDTA 10

Concentración

Número de réplicas Número de positivos Tasa de éxito

200 cp/ml

21 21 100 %

100 cp/ml

21 21 100 %

80 cp/ml

21 21 100 %

50 cp/ml

21 20 95,2 %

30 cp/ml

21 18 85,7 %

20 cp/ml

21 17 81,0 %

10 cp/ml

21 8 38,1 %

0 cp/ml (control negativo)

21 0 0 %

LDD por análisis PROBIT (95 % de tasa de éxito)

41,8 cp/ml

Intervalo de confianza del 95 % para LDD mediante análisis PROBIT

30,9 -74,9 cp/ml

Tabla 22: Análisis de LDD para un volumen de entrada de 500 µl

Concentración

Número de réplicas Número de positivos Tasa de éxito

30 cp/ml

21 21 100 %

25 cp/ml

21 20 95,2 %

20 cp/ml

21 21 100 %

13,5 cp/ml

21 18 85,7 %

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Claims (1)

1. imagen1