JP2955759B2 - 核酸配列を増幅及び検出する方法 - Google Patents

核酸配列を増幅及び検出する方法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、試験試料中に核酸配列が存在する場合、存
在しているそれらを増幅及び検出する方法に関する。よ
り特定すると、最初に存在した量に比べて総量で大きな
DNAまたはRNAの与えられた配列から特定の核酸配列を製
造する方法に関する。DNA又はRNAは一本鎖又は二本鎖
で、相対的に純粋な種であるか核酸の混合組成物であり
うる。本発明の方法は、所望する核酸配列の増幅を成し
とげるための反覆反応に有用である。
発明の背景 特に診断薬として、標的核酸配列は、スクリーンされ
る試料中の全部集められた（total pool）DNA又はRNA
のほんの微小部分で、それゆえ、非同位体で標識した、
又は末端標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いる
標的核酸配列の存在を検出するのは困難である。即ち、
DNAプローブを用いて核酸の珍しい種を検出する診断試
験は、研究実験室の外部で実用化しうるほどには感受性
ではない。
感受性の問題を克服する一つの試みは、米国特許第4,
683,195号及び第4,683,202号（「‘195及び'202特
許」）に記載されるポリメラーゼ鎖反応（PCR）方法で
ある。この方法は基本的に以下のように行う。
ａ）標的核酸配列の各ストライドに対する一つのオリゴ
ヌクレオチドプライマーに関連する標的核酸配列を含ん
でいると思われる試料を、ハイブリッド条件下、ポリメ
ラーゼ、例えばエセリシア・コリDNAポリメラーゼＩの
クレノウ断片の存在下処理して、標的核酸配列が存在す
るとき各プライマーの伸張生成物を合成し、 ｂ）ａ）段階後、試料を変性条件下に置き、一本鎖分子
を生成するために合成した鋳型から合成したプライマー
伸張生成物を分離し、 ｃ）段階（ａ）の条件下、段階（ａ）のプライマーで段
階（ｂ）から作った一本鎖分子を処理して、新規伸張生
成物を、元の標的配列と段階（ａ）で鋳型として生成さ
れたプライマー伸張生成物とを用いて合成し、かくし
て、標的核酸配列の増幅を行なうこと。
段階（ａ）−（ｃ）は、連続的に又は同時に行ないう
る。さらに、段階（ｂ）及び（ｃ）は、所望するレベル
の配列増幅が得られるまで繰り返しうる。米国特許第4,
683,195号及び第4,683,202号に記載されるように、段階
（ｃ）の生成物はプローブを用いて検出しうる。
PCR法は、感受性問題を完全には克服できないという
不利がある。PCR法を全部の４ヌクレオチド塩基に用い
てプライマー断片を伸張する。従って、伸張生成物は、
試料中に存在しうる他の、非標的核酸鋳型、例えば欠け
た（nicked）二本鎖DNAから造りうる。PCR法を用いる
と、標的配列以外に伸張DNAのかなりのバックグランド
が生ずることになる。
後で詳細に述べるように、本発明は、標的核酸配列の
各鎖に対し少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを用
い、且つ全ての４つの塩基よりも少なく用い、かくして
多くの理由によて、非特異的バックグランド増幅の問題
を減少させる。例えば、標的ヌクレオチドを用いる場
合、核酸標的配列が試料中に存在し、不適切な配列は複
写又は標識されないなら、ギャップは標識ヌクレオチド
でうめられる。
ポリメラーゼ鎖反応法は、又、自動化工程で熱安定酵
素を必要とするが、これに対し、本発明の工程は、特別
な実施態様によって熱不安定酵素を用いて、或は酵素を
用いることなく、行なうことができる。さらに、PCR法
で生成する増幅した核酸の検出には、しばしば困難な検
出法である、ゲル又は捕獲系（capturing system）を
使用しなければならない。これに対し、本発明では、増
幅配列の検出は、比較的簡単である。例えば、セファデ
ックスカラムを、標的配列が個体ヌクレオチドとは別に
存在するとき、形成した連結オリゴヌクレオチドを分離
するのに用いることができる。
PCR法以外の他の方法は、最初少量から大量に核酸を
生成するために存在する。例えば、ホストを形質変換す
るのに用いられる適当なベクターに所望の核酸が挿入さ
れる、適当なホスト系での核酸をサブクローニングする
方法である。ホストが培養されると、ベクターが増殖
し、そして所望の核酸のより多くの複写が生成する。核
酸断片をサブクローニングすることの概略の記載とし
て、マニアチス，ティー．等、モレキュラー・クローニ
グ；ア・ラボラトリィ・マニュアル，コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリィ,390−401頁（1982）を
参照されたい。又、米国特許第4,416,988号及び第4,40
3,036号に記載される技術も参照のこと。
核酸を合成する他の方法はヌクレオチド誘導体からの
核酸の有機合成、例えば米国特許第4,356,270号に記載
される方法を含む。核酸を合成する方法の他の実施例
は、米国特許第4,293,652号に提供され、それは有機合
成と分子クローニングのハイブリッドである。これらの
‘195及び'202特許の他の方法並びに上で挙げた特許を
引用して明細書記載の一部とする。
発明の要約 本発明は、試料中に存在する１又はそれ以上の特異的
な標的核酸を増幅する工程に関する。
本発明の一態様では、増幅は、オリゴヌクレオチド対
の相補の少なくとも一つの鎖が標的配列の少なくとも一
部の相補のヌクレオチド配列を有する、二又はそれ以上
のオリゴヌクレオチド補体対を用いることにより行なわ
れる。オリゴヌクレオチドは、「オリゴヌクレオチド補
体対」の相補鎖及び標的ヌクレオチドが互いにハイブリ
ッド形成するとき、少なくとも一つの塩基のギャップが
あるように選択される。オリゴヌクレオチド補体配列間
のギャップは、オリゴヌクレオチド修復生成物を生成す
るポリメラーゼとリガーゼの混合物により充される。得
られるハイブリッド形成した分子の混合物を、次いで変
性条件下に置く。
鎖が変性の間に分離後、連結したオリゴヌクレオチド
生成物は、他のオリゴヌクレオチド補体対からその相補
鎖にハイブリッド形成でき、次いでギャップは再び充さ
れる。工程は、所望量のオリゴヌクレオチド修復生成物
を生成するのに必要であるのと同様にしばしば繰り返さ
れる。本発明の一実施態様では、酵素を重合性支持体に
固定する。
本方法は、遺伝的障害を指示する配列や核酸混合物中
に存在する核酸の珍しい種を増幅するのに特に有用で、
さらにこのような核酸配列の有効な検出を可能にする。
本発明は、核酸又は核酸混合物の試料中の少なくとも一
つの特異的核酸配列を増幅する方法を提供する。各核酸
標的は一つの鎖（RNA）或は等しいか又は等しくない長
さの、二つの分離した相補鎖（DNA）から成る。
工程は以下のように行なわれる。
ａ）試料を、ハイブリダイゼーション及びギャップ充足
条件下、オリゴヌクレオチド補体対AA′及びB,B′で処
理すること。Ａはオリゴヌクレオチドで、Ａ′はＡに相
補のオリゴヌクレオチドである。Ｂはオリゴヌクレオチ
ドで、Ｂ′はＢに相補のオリゴヌクレオチドである。二
つの対A,A′及びB,B′のセットが、標的の一つの鎖にハ
イブリッド形成する核酸標的Ａ及びＢにハイブリッド形
成すると、塩基間に一又はそれ以上の塩基のギャップが
形成する。又、Ａ′及びＢ′は、その間に一つ又はそれ
以上の塩基のギャップを形成する。ギャップは標識され
た又はされない塩基で充され、Ａ及びＢは、一つ又はそ
れ以上の余分の標識された又は塩基を伴う連続的塩基配
列と一つの鎖になる、（Ａ−Ｑ−Ｂ）、ここにＱはギャ
ップを充す塩基である。Ｑは、又、ギャップを充すため
に用いたポリヌクレアーゼの エンドヌクレアーゼ活性により生ずる崩壊に抵抗性であ
るよう修飾された塩基でありうる。又、Ａ′及びＢ′
は、一又はそれ以上の余分の、標識され又はされない塩
基を伴う連続的塩基配列と新規な一つの鎖、（Ａ′−Ｑ
−Ｂ′）、ここにＱ′はギャップを充す塩基である、と
なる。同様に、Ｑ′は、又、ポリメラーゼの３′,5′エ
ンドヌクレアーゼにより生ずる崩壊に抵抗性の、修飾塩
基でありうる。どの連続的塩基配列Ａ−Ｑ−Ｂ又はＡ′
−Ｑ′−Ｂ′に関しても、Ｑ又はＱ′は、いかなる特異
的配列についての単一セットの塩基対、即ち、Ａ−T,A
−U,G−Ｃ又はこれら塩基の誘導体から成ることができ
る。Ａ−Ｑ−Ｂ及びＡ′−Ｑ′−Ｂ′は、新しく連結し
た、オリゴヌクレオチド生成物で、他のオリゴヌクレオ
チド補体対の「標的」配列として役立つことができる。
連結した、オリゴヌクレオチド生成物が、このギャップ
充足、連続工程（gap−filling,ligated process）に
より形成すると、それは「オリゴヌクレオチド修復生成
物」と名付けられる。
ｂ）核酸標的配列が存在する場合、試料を変性条件下に
処理して標的からオリゴヌクレオチド修復生成物を分離
すること。
ｃ）段階ａ）での試料を、ハイブリダイゼーション及び
ギャップ充足条件下、オリゴヌクレオチド補体対A,A′
及びB,B′で処理し、段階（ｂ）で生成した、単一鎖の
各々を用いてオリゴヌクレオチド修復生成物を得、特異
的核酸標的配列が存在するとき、その増幅を行うこと。
段階は連続的に、又は同時に行ないうる。さらに、段
階（ｂ）と（ｃ）は、所望のレベルの配列増幅が得られ
るまで、繰り返しうる。
本発明の他の態様では、感光分子、ｘ及びｙを、オリ
ゴヌクレオチド補体対の各鎖に、互いに連結すべき分子
の末端で付着させる。ｘ及びｙは、炭素−炭素＝重結合
形成し、光学活性の場合、オリゴヌクレオチド生成物と
結合して［２＋２］光学環状ダイマー形成（photocyclo
dimerization）し、さらに「オリゴヌクレオチド光学環
状形成生成物」と名付けられる、連結したオリゴヌクレ
オチド生成物を形成しうる化合物である。この実施態様
では、連続的ヌクレオチド鎖間のギャップは必要でな
い。一又は二の塩基のギャップはさしつかえない。
本発明は、又、増幅された特異的核酸配列の検出方法
及びそれに適用される診断キットに関する。
図面の簡単な説明 図１は、増幅するよう要望されるGAG部分からのHIVの
48塩基対長配列を示す。ギャップを充す塩基対は、上下
48塩基対を描く。
図２は、12％ポリアクリルアミド−7M尿素ゲルを示
し、ここで、各レーンは、光回復化合物に付着した、標
識オリゴヌクレオチドを伴うヒト免疫不全ウイルス（HI
V）プラスミド標的の混合物を煮沸すること、混合物を
速やかに37℃に冷却すること及び混合物を５分間照射す
ることを含むサイクルよりなる。
図３は、本発明の方法の一実施態様を実施するための
装置を描き、ここで、使用される酵素を重合性支持体に
固定する。
好ましい実施態様の詳細な説明 定義 本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」
は、３つ又はそれより多いデオキシリボヌクレオチド又
はリボヌクレオチド、好ましくは５より多くのものを含
む分子として定義される。
用語「平滑断端」は、互いに相補で、両者がハイブリ
ッド形成したとき少なくとも一端が等しい長さの配列を
有する二つのオリゴヌクレオチドとして定義される。
本出願で定義される「粘着性断端」は、互いに相補
で、両者がハイブリッド形成したとき、少なくとも一端
が等しい長さの配列を有する２つのオリゴヌクレオチド
に関する。平滑断端及び粘着性断端のカテゴリーを以下
に示す。
用語「２つのオリゴヌクレオチド補体対」は、少なく
とも４つの異なるオリゴヌクレオチドであり、これは例
えばA,A′及びB,B′、ここにオリゴヌクレオチドＡは
Ａ′に相補に塩基配列を有し、オリゴヌクレオチドＢは
Ｂ′に相補の塩基配列を有する。各対は以下に示すよう
に、長さが等しくても等しくなくてもよい。
各対の一端に粘着性断端を伴う２つのオリゴヌクレオ
チド補体対は、本発明の増幅されたオリゴヌクレオチド
の集合を形成するための塩基が好ましい。本発明の工程
では２より多いオリゴヌクレオチド対が用いうることが
理解される。
本明細書で用いられる用語「ギャップ」は、ＡとＢ、
ＥとＦの間、或はＡ′とＢ′、Ｅ′とＦ′の間の１又は
それより多い塩基の不在に関する。２より多い対が用い
られた場合、１より多いギャップがあるうる。ギャップ
は、対が核酸標的に対しハイブリッド形成したときに生
ずる。例えば 線１は、核酸標的の配列で、線２は、核酸標的配列にハ
イブリッド形成したオリゴヌクレオチド補体Ａ′及び
Ｂ′を表わす。標的配列が二本鎖の場合、オリゴヌクレ
オチドＡ及びＢは線１に示される標的配列に相補の配列
とハイブリッドを形成する。
A.ギャップの充足、連結反応増幅 本発明の核酸配列を増幅する工程の一実施態様で、少
なくとも２つのオリゴヌクレオチド補体対を、関心事の
標的核酸配列を含んでいると思われるか又は含んでいる
ことが知られている試料とを、ハイブリッド形成条件下
に結合させる。オリゴヌクレオチド補体対は、２つの補
体が核酸標的配列とハイブリッド形成したとき、２つの
補体間の少なくとも１つの塩基のヌクレオチド配列にギ
ャップがあるように選択される。次いでギャップは充さ
れ、２つのオリゴヌクレオチドは互いに連結し、オリゴ
ヌクレオチド修復生成物を生成する。ギャップ充足並び
に連結反応の工程は、不適当に組合せられた塩基及びDN
A増殖の間に起きる他の誤りの修復、UV障害及びインビ
ボでの他の工程の修復に類似する。核酸標的配列及びオ
リゴヌクレオチド修復生成物配列は、次いで分離し得、
工程は、所望するレベルの増幅に達するまで繰り返し反
復し得る。ギャップ充足段階の間に起こるバックグラン
ド合成の問題を避けるために、２又はそれより多いオリ
ゴヌクレオチド補体対を、それらの間のギャップが、ギ
ャップを充めるために全部で４つより少ない塩基しか要
しない、好ましくは１セットの相補塩基、即ち、Ａ−T,
A−Ｕ又はＧ−Ｃしか要しないように選択される。全て
の４つの塩基なしで、でたらめの合成は、切れ目を有し
うるか、或は複製又は転写の工程にある核酸配列によっ
ては開始し得ないであろう。
1.核酸標的配列 本発明の工程は、（ａ）少なくとも核酸標的配列の部
分は、オリゴヌクレオチド対がハイブリッド形成できる
ものを合成できるよう十分詳細に知られているか（ｂ）
標的配列が工程で使用するのに十分なオリゴヌクレオチ
ド補体対を生成するのに十分な量分離できる場合、含ま
れる反応段階の数に相対的な少なくとも１つの特異的核
酸配列の指数量を生成できる。どの起原の核酸も精製又
は非精製形で、標的核酸配列の起原として利用できる。
例えば、工程は、一本鎖又は二本鎖のDNA又はRNAに適用
しうる。さらに、いずれの一本鎖を含むDNA−RNAハイブ
リッドも利用しうる。これらのいかなる核酸の混合物も
適用しうる。増幅すべき特異的核酸配列は、より大きな
分子のフラクションのみである。それは複合体混合物の
小さい方のフラクション、例えば感染したヒトのゲノム
DNAに結合したHIV（ヒト免疫不全ウイルス）遺伝子の部
分、又は特別の生物学的試料にごく少量存在する細菌の
核酸でありうる。
標的配列の配列を決定するため、又は試験すべき試料
として、関心の持たせる核酸又は核酸類は、どのような
起原、例えばDNA又はRNAからも得られ、細菌、ウイル
ス、酵母及びより高級な生物、例えば植物又は動物か
ら、プラスミド、例えばPBR322及びM13から、本分野の
当業者に知られた種々の技術によるクローン化DNA又はR
NAから分離しうる。DNAも、例えばマニウチス等、モレ
キュラー・クローニング，ア・ラボラトリィ・マニュア
ル（ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリィ,1982）、280−281頁に記載される技術に
よる組織培養で生育した細胞から抽出しうる。
2.オリゴヌクレオチド補体対 オリゴヌクレオチド補体対は、好ましくはオリゴヌク
レオチドである。さらに、対は、核酸標的配列にハイブ
リッド形成するのに十分な長さでなければならない。補
体対の長さは、４つの塩基から数百の塩基まで変化でき
る。短いオリゴヌクレオチドは、一般に安定なハイブリ
ッド複合体を形成するのにより低温を要する。合成され
たオリゴヌクレオチド配列は、２つのオリゴヌクレオチ
ド補体対が共に標的配列にハイブリッド形成し、１又は
それ以上の塩基のギャップを残すように選択する。標的
配列が一本鎖の場合、各オリゴヌクレオチド対のわずか
に半分が標的にハイブリッド形成する。二対以上のオリ
ゴヌクレオチド補体は、増幅が核酸標的配列に特異的を
維持する限り本発明の工程に使用できる。
オリゴヌクレオチド補体対はどのような適当な方法を
用いても製造しうる。例えばホスフォラミジツ（phosph
oramidites）（アプライド・バイオシステムズ・インコ
ーポレーテッド）を出発材料として用いうるし、ビュー
ケイジ著、テトラヘドロン・レターズ，22,1859−61（1
981）に記載されるように合成し、本分野でよく知られ
た方法により５′−未満をリン酸化しうる。
3.変性 鎖分離は、物理的、化学的又は酵素的手段を含むどの
ような適当な変性方法によっても行なうことができる。
核酸の鎖を分離する一物理的方法は、核酸を完全に（99
％以上）変性するまで加熱することを含む。典型的な熱
変性は、約80℃から105℃の範囲の温度で、約１分から1
0分の範囲の時間加熱することを含む。、鎖分離は、
又、ヘリカーゼとして知られる酵素のクラス又は酵素Re
cA、これはヘリカーゼ活性を有し、riboATPの存在下、D
NAを変性することが知られている、からの酵素により誘
導しうる。ヘリカーゼで核酸の鎖を分離するのに適当な
反応条件は、コールド・スプリング・ハーバー・シンポ
ジア・オン・クアントィタティブ・バイオロジィ。XLII
I巻「DNAリプリメーション・アンド・リコンビネーショ
ン」「ニューヨーク；コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリィ,1978），ビー．クーン等、「DNAヘリカ
ーゼス」63−67頁に記載され、RecAを用いる技術は、シ
ー．ラディング．アン．レヴ，ジエネティックス、16:4
05−37（1982）に批評されている。
4.ギャップ−充足／連結反応段階 一般に、ギャップ−充足及び連結反応段階は、緩衝水
性溶液中、好ましくは７−９のpHで、最も好ましくはpH
7.5で起こる。オリゴヌクレオチド補体対は、核酸標的
配列当り約105−1015対の分子過剰で存在する。診断の
目的に用いられるべき対の正確な量は、試料中の核酸標
的の量については、不明確なために知り得ない。しかし
ながら、1015オリゴヌクレオチド補体対の平均量を用い
ることは、典型的な診断アッセー形式に適用できる。大
量の分子過剰は、本発明の工程の効率を改良するためど
の場合でも好ましい。
本発明の工程では、典型的には、わずかに２つの相補
デオキシリボヌクレオシド三リン酸をギャップ−充足段
階に用いる。dATPとTTP、又は別法としてdCTPとdGTPで
ある。粘着性断端の（stickyended）オリゴヌクレオチ
ド補体対を、デオキシリボヌクレオシド三リン酸の唯一
の型をどのギャップを充すのにも必要とするよう選択で
きる。粘着性断端の補体対は、又、２つの相補ヌクレオ
チドと他の一つのヌクレオチドをギャップを充すのに用
いるよう選択できる。
ディー．ショートル等、プロシーディングス・オブ・
ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス・エーエス
エイ、79:1588−92（1982）；ティー．エイ．クンケ
ル、同誌、78:6734−38（1981）：エフ．アール．ブラ
イアント等、バイオケミストリィ18:2825−28（1979）
に記載されるように、当分野で、ポリメラーゼのエキソ
ヌクレアーゼ活性に抵抗性であることが知られている修
復ヌクレオシド三リン酸を用いるのが好ましい。このよ
うな分子は、チミジン５′−Ｏ−（１−チオ三リン酸
の）CdATP［αＳ］）及びデオキシシチジン、デオキシ
グアニジン、デオキシウリジンのチオ誘導体、並びにシ
チジン、グアニジン、アデノシンチミジン及びウラシル
のチオ誘導体である。ヌクレアーゼ活性に抵抗性であ
る、これら塩基の他の誘導体は、例えば三リン酸塩基の
α−イミド誘導体が適当である。
適当なデオキシリボヌクレオチド三リン酸をギャップ
−充足／連結反応混合物に適切量加えて、得られる溶液
を約90℃ないし100℃で約１ないし５分間、好ましくは
１ないし３分間加熱する。次いで溶液を室温まで冷却し
てハイブリッド形成を起こさせる。冷却溶液に適当な触
媒を加えて、当分野で既知の条件下、充足と接合（seal
ing）を起こさせる。例えば、既知のDNAポリメラーゼを
ギャップ−充足に用いられることができ、既知のDNAリ
ガーゼは、ポリメラーゼがギャップを充したのち、得ら
れる生成物を結合できる。ギャップ−充足連結反応工程
は、４℃より上の温度で触媒試薬がもはや有効に作用し
ないと起りうる。温度は一般にもはや約40℃以上であ
る。即ち、例えば、T4−DNAポリメラーゼ及びT4−DNAリ
ガーゼを用いると、温度は一般に約40℃よりも大ではな
い（最も有利には、反応は室温で又は４℃でさえ起こ
る）。熱に反応しない酵素を用いると、工程はハイブリ
ット鋳型の融点で起こる。
触媒試薬は、核酸標的にハイブリッド形成した２又は
それ以上のオリゴヌクレオチドの間のギャップを充すの
に作用するいかなる化合物又は系でありうる。この目的
に適した酵素は、エセリシア・コリDNAポリメラーゼ−
１、エセリシア・コリDNAポリメラーゼ−１のクルノウ
断片、T4−DNAポリメラーゼ、ギャップを充すよう塩基
を加えるための逆転写酵素、オリゴヌクレオチドを結合
するためのT4−DNAリガーゼ、ポリメラーゼにより他の
オリゴヌクレオチド補体に加えられる、この実施態様で
オリゴヌクレオチド修復生成物と命名される、結合オリ
ゴヌクレオチド生成物を形成する、正のヌクレオチドを
含む。
核酸標的にハイブリッド形成したオリゴヌクレオチド
修復生成物は、二本鎖形である。次の段階で、二本鎖分
子の鎖は、再び上記のように分離して一本鎖分子を提供
する。
増幅のモードを作るために、結合オリゴヌクレオチド
分子は、２以上のオリゴヌクレオチド補体対にハイブリ
ッド形成できる。必要ならば、付加的酵素、適当なデオ
キシリボヌクレオチド三リン酸、及びオリゴヌクレオチ
ドを反応を進めるために加えうる。
鎖分離、ギャップ−充足及び連結反応の段階は、一本
鎖核酸標的配列の単一複写が初めに混合物中に存在した
ことを引きうけている特異的結合オリゴヌクレオチド生
成物の必要量を生成するのに必要なだけ何度も反覆でき
る。これらの段階が繰り返される限り、特異的核酸標的
配列の増幅は指数方法（exponential way）で起る。こ
の工程は、含まれている他の条件を変えることなく、異
なる特異的核酸標的配列にハイブリッド形成する。異な
るオリゴヌクレオチド補体対（又は三つ子等）を加える
ことにより、他の核酸標的配列を増幅するのに用いるこ
とができる。
本発明の特殊な実施態様は、新しい試薬を各段階後に
加える、又は同時に、全ての試薬を一度に加える段階的
方式で実施できる。試薬は、又、与えられた時期の後に
加えることもできる。熱安定酵素を用いる実施態様の各
段階は、全試薬の初期濃度を連続的に注意しなくてよ
い。熱感受性酵素を用いる場合は、各鎖分離（変性）段
階後、ギャップ−充足及び接合剤を加えることが必要で
ある。
本発明の一実施態様では、触媒試薬を重合性支持体に
固定する。ギャップ−充足及び連結反応段階後、生成物
を固定化酵素から溶出して一本鎖に変性できる。この時
点で、核酸標的配列及び結合オリゴヌクレオチド生成物
は、付加的オリゴヌクレオチド補体対でハイブリットを
形成させて利用できる。これらの新しいハイブリッド
は、次いで固定化酵素に再び転移し、結合生成物を形成
させる。反応の段階は、段階的に又は同時に実施し得、
必要なだけ繰り返しうる。より小さなオリゴヌクレオチ
ド補体、例えば６−10塩基には、この範囲の二本鎖オリ
ゴヌクレオチドの融点が約40℃であり、熱感受性酵素は
この温度で活性であるので熱感受性酵素を同時操作に適
用できる。
熱安定、ギャップ−充足及び接合剤、例えば熱安定ポ
リメラーゼ及びリガーゼを用いる場合、工程は高い温
度、好ましくは熱安定酵素に基づいて60−90℃で行なう
ことができる。温度は、又、一本及び二本鎖核酸間が平
衡状態にある温度により決定される。このような熱安定
ポリメラーゼは、エイ．ディー．ケイルディン等、ビオ
クヒミヤ、45、644−51（1980）に記載される。熱安定
ポリメラーゼとリガーゼは、テルムス・テルモヒルスか
ら抽出できる。
工程を完結するのに適した期間が経過し、必要量のオ
リゴヌクレオチド修復生成物が蓄積した後、既知の手段
で酵素を不活性化し、或はスパン又はセフィデックスカ
ラム上の反応の成分を分離して、濾過、又はこの分野で
既知のゲル電気泳動により、反応を停止しうる。
本発明の工程は、自動工程として適用しうる。これを
行なうために、反応を変性段階、試薬添加段階及び反応
段階を経て循環させる。又、自動的に試薬を加え、変性
段階後のポンプの使用により工程を連続的に実施し、他
方、加熱−冷却段階を特別に設計した、調節ヒーターブ
ロックにより実施できる。
本発明は、以下に図式的に示される。互いに一つの粘
着性断端を有する２つのオリゴヌクレオチド補体対を用
いること（カテゴリー２） Ｎは、例えばT4−DNAポリメラーゼの部分として見られ
る３′エキソヌクレアーゼによる崩壊からの鎖を保護す
るように修飾されたヌクレオチドである。オリゴヌクレ
オチド補体対E,E′及びF,F′は、完全な核酸標的配列Ｒ
のセクションに対応するよう選択又は合成される。Ｒ
は、 として示される相補鎖Ｒ及びR-を含む二本鎖DNAであ
る。［Ｒ］を、相補対E,E′及びF,F′の分子過剰オリゴ
ヌクレオチドと、二本鎖分子が変性し、次いで再びハイ
ブリッド形成する条件下に混合すると、Ｒは、Ｅ′と
Ｆ′と安定な、二本鎖ハイブリッドを形成し、一方R
-は、 により示されるように、Ｅ及びＦとハイブリッドを形成
する。Ａ＊は図式［１］、例えば［NTP′ｓ αＳ］の
修飾ヌクレオチドＮを示す。
次にTTP、dATP、エセリシア・コリクルノウ断片及びT
4−DNAリガーゼを混合物に加え、二本鎖におけるギャッ
プを充たして接合させ、 を生成させる。
この特別の実施例で、クルノウ断片はヌクレオチドを
Ｆ′の３′に加え、リガーゼは添加したヌクレオチドを
Ｅ′の５′未満に結合させる。Ｅ及びＦは同一様式で結
合する。
最初のサイクルで、新しい一本鎖DNAが生成する。次
の変性段階後、分子過剰の２つのオリゴヌクレオチド補
体対は元の核酸標的に、同様に最初のサイクルで形成す
るオリゴヌクレオチド修復生成物にハイブリッド形成で
き、かくして、４つ以上のオリゴヌクレオチド修復生成
物が二次サイクルで形成する。新しい結合オリゴヌクレ
オチド生成物の形成は指数的に進む。
この工程で、dATP及びTTPは放射活性標識、例えば
32P、35S又は125Iで標識できる。非放射活性標識も使用
できる。例えば、TTPはビオチン−dUTP（エンゾ・バイ
オケム）で置換でき、dATPは、ジー．ゲベイユー等、ヌ
クレイック・アシッド・リサーチ15、4513−34（1987）
に記載されるようにビオチン−dATPで置換できる。
溶液中に平滑断端の（blunt−ended）オリゴヌクレオ
チド対を用いた場合（カテゴリー１）に、平滑断端連結
反応は、溶液中の二つの対のセットの間で起こる。しか
しながら、ギャップを充たす塩基のみが標識されるの
で、平滑断端連結反応生成物は検出段階でカウトされな
い。
B.光化学連結反応 本発明の他の実施態様では、感光性分子、ｘ及びｙ、
これらは、炭素−炭素二重結合を形成し、［２＋２］光
環状ダイマー形成を経ることができる、を用いてオリゴ
ヌクレオチド補体を互いに結合させる。感光性分子ｘ及
びｙは、オリゴヌクレオチド補体対の各鎖に、互いに結
合すべき分子の末端で付着する。ｘ（又はｘ′）及びｙ
（又はｙ′）は、光環状ダイマー形成反応が起こる限
り、同一分子又は異なる分子であることができる。本発
明のこの実施態様は のように示される。
線３は核酸標的の配列を示し、線４は核酸標的配列に
ハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドＩ′及びＪ′
を示す。標的配列が二本鎖の場合、オリゴヌクレオチド
Ｉ及びＪは線３に示される標的配列に相補の配列とハイ
ブリットを形成する。標的配列とのハイブリッドが形成
したのち、ｘ′及びｙ′は後で詳細に記載するように光
活性化され、光ダイマーを生成し、これによりオリゴヌ
クレオチドＩ′及びＪ′は互いに結合する。
かかる結合を生ずるために、これらの感光化しうる基
は互いにごく近接しているべきであり（４Å分離）、ほ
とんど平行で、即ち、すぐれたパイ電子を重り合せる。
この近接によって、分子の一つが励起したとき、強力な
吸引相互作用を起こす。シュミット等、ピュア・アンド
・アプライド・ケミストリィ、27;647−78（1971）。ぴ
ったりと近接しないと、光活性化しうる分子は遠く離れ
すぎるか及び／又は不適当に配向して立体異性体的光ダ
イマーを造るのに必要な二重結合を形成できない。従っ
て、溶液中、オリゴヌクレオチド補体対間の光化学連結
反応は起こらないように思われる。さらに、光活性化し
うる基、ｘ及びｙは、補体が核酸標的配列又は先のサイ
クルで造られた結合したオリゴヌクレオチド標的にハイ
ブリッド形成した場合に、互いに結合するのに充分なだ
け近くにあればよい。炭素−炭素二重結合を形成でき、
［２＋２］光環状ダイマー形成を経ることができる、感
光性分子ｘ及びｙは、本発明のこの実施態様に有用であ
る。これらの感光性分子は、ケイ皮酸類、エム．ディ
ー．コーエン等、ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイ
エティ、2000−13（1964）；ティー．イシガミ等、ブ
ル，ケム．ソク．ジャパン、49:3578−83（1976）：ス
チレン誘導体、エイ．エル．エルガヴィ等、セシス、ワ
イズマン・インスチチュート・オブ・サイエンス・レホ
ヴォット、イスラエル（1974）；スチルベン類、エム．
ディー．コーエン等、ジェイ，ケム，フィズ．レト．
７:486−90（1970）；脂肪族モノ−，ジ−及びトリエン
ジカルボン酸誘導体、ティ．ジェイ．サデー・アメリカ
ン・ケミカル・ソサエティ、84:3970（1962）：エム，
ジェイ，ラハヴ．ケム．ソク．ビー.,312−17（196
7）；エム，ラハヴ，テトラヘドロン・レターズ、2957
−62（1966）、交差共役芳香族、ビー．エス．グリー
ン、テトラヘドロン・レターズ、4249−52（1970）；ベ
ンゾキノン類、ラビノヴィック等、ジェイ．ケム．ソ
ク．ビー.144−49（1967）；アレン類、ゼット．バーコ
ヴィッチ−イエリン等、ジャーナル・オブ・ケミカル・
ソサエティ・ケミカル・コミュニケーションズ、178−7
9（1982）及びプソラレン類を含むことができる。云い
換えれば、ｘ及びｙは、光を吸収し、これによりシクロ
ブタン誘導体を造ることができるいかなる分子でもよ
い。
ｘ及びｙは、好ましくはアミノプソラレン類及びクマ
リン類で、これらは、重り合い従って［２＋２］光環状
ダイマー形成を促進するπ複合体を形成する傾向を有す
る。さらに、プソラレン類は、試料中の核酸に障害を与
えない波長である320−460nmの波長で光活性である。オ
リゴヌクレオチド補体は、適当な近接及びｘ及びｙの間
で重り合う最大パイ電子に達するために、標的と安定な
ハイブリッドを形成するのに充分な長さでなければなら
ない。本明細書で用いられるように、用語「光源」は、
200nm−500nmの範囲、好ましくは300nm−400nmの範囲で
π→π＊、ｎ→π＊に励起することができる放射線照射
源で、ここでは光源はU.V.光又は紫外線レーザーパルス
に近い。光源の使用による新しい結合の創製は、緩衝水
溶液中、pH7−９、好ましくはpH8で起こる。
本発明の工程に用いるための特に好ましい光活性化し
うる分子、ｘ及びｙは、以下のものである。
式中、ＺはＨ、メトキシ、アセトキシ、C1−C5アルキ
ル、ハロゲン及びこれらの基のジ−又はトリ−誘導体で
ある。
式中、ＺはＨ、CN、アルキル又はハロゲンである。
式中、ＺはＨ、CN、アルキル、ハロゲン、CO2H又はア
ルキルエステルである。
式中、ＺはＨ、CN、−Ｏ−アルキル、ハロゲン又はカ
ルボキシである。
式中、ＺはＨ、CN、アルキル、ハロゲン又はカルボキ
シである。
光活性分子は、以下のいずれかの方法を用いて５′及
び３′末端でオリゴヌクレオチドに付着しうる。
ａ）エル・エム．スミス等、ヌクレイック・アシッド・
リサーチ、13:2399（1985）に記載されるようにアミン
類による、ビー．エス．スプロート等、ヌクレイック・
アシッド・リサーチ、15:4837（1987）に記載されるよ
うに５′−チオール類による、T4−DNAリガーゼを用い
るリン酸エステル基による、ティ．ホーン等、テトラヘ
ドロン・レターズ、27:4705（1986）に記載されるよう
に化学的にリン酸エステル化による、又は修飾の他の方
法による３′−水酸基の修飾。
ｂ）米国特許第4,128,639号に記載される、アミノ基に
よる３′−水酸基の修飾。３′−リン酸基は、ティ．ホ
ーン等により上に記載されるように、同じ化学的リン酸
化剤を用いてオリゴヌクレオチドに付着できる。
オリゴヌクレオチドの３′及び５′−末端に光活性分
子を付着させる好ましい方法は、所望の３及び５′−水
酸基にリン酸基を付着させることによるものである。例
えば３′−リン酸基は以下のように合成される。長鎖ア
ルキルアミンで修飾した、調整細孔ガラス（500Å）
（ピース）をリン酸化剤 （グレン・コーポレーション）（DMTはジメトキシトリ
チルである、iPrはイソプロピルである）と、テトラゾ
ールの存在下、外界温度で縮合させる。次いでリン酸基
を酸化剤、好ましくはヨード溶液を用いて室温で酸化す
る。緩和な酸、好ましくはジクロロメタン中ジクロロ酢
酸を用いて脱トリチル化後、水酸基を暴露して所望のオ
リゴヌクレオチドを、本分野で知られているように、こ
の水酸基に合成できる。
所望のオリゴヌクレオチドに付着した、５′−リン酸
基は、本分野で既知の条件下連結反応手段により製造で
きる。３′又は５′−末端リン酸基は、縮合剤、好まし
くは水溶性カルボジイミドを使用し、外界pH、好ましく
はpH6.0で、室温下、活性化剤、好ましくはイミダゾー
ルで活性化できる。
アミノ光活性基は、ヌクレイック・アシッド・リサー
チ、11:6513−29（1983）にビー．シー．エフ．チュー
等により記載されるように、pH7.8で活性化リン酸基と
反応させる。
ｃ）結合オリゴヌクレオチド生成物の検出 結合オリゴヌクレオチド生成物は、標識分子及び／又
は特別の長さ又は配列を有する分子を検出するかなりの
数の方法により検出できる。例えば、反応混合物をセフ
ァデックスカラムに通過して標識NTPと結合オリゴヌク
レオチドを分離しうる。個々のヌクレオチドは２又はそ
れ以上のオリゴヌクレオチド補体対の長さよりもはるか
に小さいので、増幅した材料の検出はサイズのみに基づ
くかなり簡単であるべきである。
増幅配列を検出する他の技術は結合生成物に優先的に
結合し、保持するため、十分な個々の及び全てのオリゴ
ヌクレオチド補体対で相補配列を分けるプローブの組み
立て及び分離を必要とする。このようなプローブは、適
当な支持体に固定できる。それらは、又、所望により特
異的に標識化しうる。
本発明はインビトロ診断に用いうる。核酸配列を増幅
する工程は、感染症、遺伝障害間は細胞障害、例えば癌
と関連する特異的核酸の検出を可能にする。増幅は、診
断に利用できる核酸標的の量が微小量であるとき、例え
ば、胎児からDNAを得ることが必要である、鎌状赤血球
貧血症の出生前の診断に特に有用である。さらに、オリ
ゴヌクレオチド補体の長さ及び配列が、いかなる生物か
らのゲノムDNAでの削除及び／又は変異を検出するため
に変化できることは、当分野での当業者の能力の範囲内
にある。これらの小さな変化は、例えば膵嚢胞性繊維
症、α−地中海貧血症、β−地中海貧血症などの状態の
診断に重要である。
本発明の工程は、又、ヒト免疫不全ウイルス（HI
V）、ヘルペス、Ｂ型肝炎並びにサルモネラ及びクラミ
ディアを含む細菌を含む病原性ウイルスのような種々の
因子の存在を示しうる。
フォーコウに発行された米国特許第4,358,535号は、
感染症の診断用の特異的DNAハイブリッド形成プローブ
の用途を記載している。フォーコウの手段に固有の問題
は、比較的少数の病原性生物が感染患者からの臨床試料
に存在しうるし、又、病原体から抽出されたDNAが、試
料中の全DNAの極小フラクションのみを構成しうること
である。プローブへのハイブリッド形成及びフィルター
への試料固定前の試料中の推測される配列を特異的に増
幅することは、これらの手段の感受性及び特異性を非常
に改良できる。
さらに別の実施態様では、増幅された種は以下のよう
な簡単な方法により検出できる。Ｅ及びＦに又はＥ′及
びＦ′に、或はそれらの各１個、別々に相補である核酸
配列を有する獲得オリゴヌクレオチドプローブは増幅し
た標識生成物を獲得するのに用いることができる。
他の実施態様では、工程に含まれるデオキシリポヌク
レオチド三リン酸が、たとえば32P、35S、125Iで放射活
性標識化でき又、非放射活性標識によるものでもよい。
感染症の診断用DNAプローブ臨床使用を容易にする他
の手段は、放射性標識を非放射性標識に変えることであ
る。ワードに対するヨーロッパ特許第63,879号に記載さ
れるように、ビオチン含有DNAプローブは、アビジン又
はビオチン特異性抗体に結合した色素産生酵素により検
出される。本発明の方法によるDNA増幅及びギャップを
充たす塩基を標識化するためのバイオ−dUTPの使用の組
合せにより、これらの技術をありきたりの臨床用セット
に適用すると有用な診断用キットを調製し、フォーコウ
及びワードの手段に関連する困難を克服するのに必要な
使利さと感受性を提供することができる。
フォーコウ及びワードの方法の使用、オリゴヌクレオ
チドの合成、サイクル当り増幅した配列の数の計算、核
酸配列の増幅に一般に付属する他の事項は‘195及び'20
2出願に記載され、これらの出願を引用して明細書記載
の一部とする。
本発明を実施例により示す。実施例は、本発明の範囲
を限定することを意図したものではない。上記の一般的
並びに詳細な記載と合せて、実施例は本発明をさらに理
解させ、本発明の好ましい実施態様の幾つかの様相を略
記する。
実施例１ オリゴヌクレオチドを連結するギャップ充足／連結反
応を用いる、増幅すべき望ましい配列は、GAG部分2106
−2153でHIVをコードする48塩基対配列である。この配
列は、そのＧ−Ｃ含量に選び、それは約52％で以下の配
列を有する。
以下の４つのオリゴヌクレオチドは、本発明の方法に
よる増幅に用いることができる多くの平滑断端配列の例
である。
平滑断端は各配列の３′末端で２′−デオキシアテノ
シン５′−Ｏ−（１−チオ三リン酸）（dATP［αＳ］）
の結合後、創製される。５塩基対のギャップは、オリゴ
ヌクレオチドＡ及びＢ又はＡ′及びＢ′の間に、これら
の鎖が上に示した標的配列のそれらの相補鎖にハイブリ
ッド形成する場合、存在する。
同様に、以下の４つのオリゴデオキシリボヌクレオチ
ドは、本発明の工程に利用しうる適当な粘着断端配列で
ある。
上記した全てのオリゴデオキシリボヌクレオチドは以
下の手順で合成され、精製される。
I.自動合成手順 ２−シアノエチル・ホスホルアミジツはアプライド・
バイオシステムズ・インコーポレーテッドから購入す
る。手順は、アプライド・バイオシステムズ・インコー
ポレーテッドからのDANシンセサイザー、タイプ380B−0
2を用いるヌクレオシド・ホスホルアミダイツのヌクレ
オシド−被覆、調製細孔ガラスビーズ支持体（500Å）3
0mgへの縮合を含む。サイクルは、ジクロロメタン中、
２％トリクロロ酢酸による脱トリチル化、活性化電子ド
ナーとしてテトラゾールを用いる縮合、無水酢酸及びジ
メチルアミノピリジンによるキャッピング、0.1MI2/H2O
/ルチジン／テトラヒドロフランによる亜リン酸エステ
ルのリン酸エステルへの酸化、続くジクロロメタン中、
２％トリクロロ酢酸を用いる脱トリチル化を含む。サイ
クル時間は約30分である。各段階の収量は本質的に定量
的で、脱トリチル化の間に遊離するジメトキシトリチル
アルコールの収集及び分光試験により測定された。
II.オリゴデオキシリボヌクレオチド脱保護及び精製手
順 固体支持体をカラムから分離し、閉管中、60℃で16時
間、1ml濃度の水酸化アンモニウムに暴露する。アンモ
ニアを除去し、残渣を、7M尿素を含むトリス−ホウ酸塩
緩衝液（pH8）を用いる分取12％ポリアクリルアミドゲ
ルにあてはめる。電気泳動を20ボルト/cmで５時間実施
し、その後で生成物を含むバンドを蛍光板のUVシャドー
イングにより同定する。バンドを励起し、1mlの２回蒸
留水で一晩室温で溶出する。この溶液を濾過して、上清
をｎ−ブタノールで抽出する（３×300ミクロリット
ル）。水相をセファデックスG50カラム（ファルマシ
ア）（１×10cm）上に置く。溶出を260nmでUV吸収によ
りモニターし、適当なフラクションを集め、固定容量
中、UV吸収により定量し、蒸発して室温下、真空遠心分
離で乾燥する。
III Ａ′、Ｂ、Ｅ′及びＦ配列の５′−リン酸化 Ａ′、Ｂ、Ｅ′及びＦの５′−末端をリン酸化するた
めに、ティー．ホーン等、テトラヘドロン・レターズ2
7、4705−08（1986）に記載されるように新しいリン酸
化剤を用いる。互いに結合するヌクレオチドの末端のみ
がリン酸化する。
Ａ′、Ｂ、Ｅ′及びＦの合成はＩに記載される。自動
合成手順、ただし最後のサイクル後、リン酸化剤 （クレン・コープ．インク．）（DMTはジメトキシトリ
チル基である、iPrはイソプロピルである）を、活性化
電子ドナーとしてテトラゾールを用い、配列Ａ′、Ｂ、
Ｅ′及びＦの各々に縮合し、続いて無水酢酸及びジメチ
ルアミノピリジンによるキャッピング、0.1MI2/H2O/ル
チジン／テトラヒドロフランによる亜リン酸エステルの
リン酸エステルへの酸化、次いでジクロロメタン中、２
％トリクロロ酢酸を用いる脱トリチル化を行なう。サイ
クル時間は約30分である。
５′−リン酸化Ａ′、Ｂ、Ｅ′及びＦを上記IIに記載
される手順により精製し定量する。
実施例２ 本実験は、５塩基（A,T）のギャップが対の間に存在
する、２つの平滑断端オリゴヌクレオチド補体対のセッ
トを用いることによる、実施例１の48塩基対配列の増幅
を示す。第一段階で、ポリメラーゼは、DNAポリメラー
ゼの３′−エキソヌクレアーゼ活性から補体対を保護す
るために、dATP［αＳ］を取込み、平滑断端を形成す
る。
48塩基対の増幅は段階２から始める。
段階1: 1mMMgCl2、20mM2−メルカプトエタノール、ml当り100
mgのウシ血清アルブミン、0.1mMATP及び0.1mMのdATP
［αＳ］（シグマ）を含む50ミクロリットルを50mMトリ
ス−HClを含むpH7.5の60ミクロリットル緩衝液に加え
る。
この溶液に、各100ピコモルのＡ及びＢ′並びにリン
酸化Ａ′及びＢ、そして0.1ピコモルの増幅されるべき4
8塩基対を含む５ミクロリットルの溶液を加える。得ら
れる溶液を100℃で２分間加熱し、鎖の分離並びに標的
へのＡ、Ａ′、Ｂ及びＢ′のハイブリッド形成を行な
う。次いで、エセリシア・コリDNAポリメラーゼ−Ｉの
４単位のクルノウ断片を加えて反応物を10分間、室温で
インキュベートする。
２つの対は新しい平滑断端で、ポリメラーゼのエキソ
ヌクレアーゼ活性に対し保護されている。
段階2: 結合、オリゴヌクレオチド生成物を生成し、増幅する
ために、以下のサブ段階を行なう。
a.各１ナノモルのdATP及びTTP並びにα−32P−dATP及び
α−32P−TTPの各々の100ピコモル（特異的活性1000cpm
/ピコモル）の添加。
b.2分間100℃への加熱 c.2分間室温への冷却 d.エセリシア・コリDNAポリメラーゼ−Ｉの４単位のク
ルノウ断片及び２単位のT4−DNAリガーゼの添加 e.10分間室温でのインキュベート サイクル中のサブ段階（ａ）は、十分な量のヌクレオ
チド三リン酸が初めから存在するときは省略できる。サ
イクルは22回繰り返す。サイクル２、４、７、10、13、
16、19及び22からの２ミクロリットル−定量を、0.089M
トリス−ホウ酸塩緩衝液、pH8.3を用いる12％ポリアク
リルアミドゲル、7M尿素にあてはめる。電気泳動を20ボ
ルト/cmで５時間実施する。ゲルを感受性フイルム（コ
ダック）に５時間暴露する。
得られる反応混合物をセファデックスG40:50カラム
（１×10cm）（ファルマシア）にかけて、２回蒸留した
水で溶出する。２つの明らかなピークが分離し、ガイガ
ーカウンターでモニターする。５−7mlの水の溶出後、
現れる第一のピークは、増幅48塩基対から成り、14−18
mlの水の溶出後現れる第二のピークはα−32P−dATP及
びα−32P−TTPから成る。
本実施例で、段階１及び２は別々に用いられる。しか
しながら、２つの段階を１段階に混合して段階２、サイ
クルのサブ段階（ａ）で加えることができるdATP［α
Ｓ］の混合物を用いることにより直ちに開始することも
できるし、別法として、保護された平滑断端対を別々に
分離し、精製し、定量し、所望のように用いることもで
きる。
実施例３ 本実施例は、本発明の増幅プロトコールの間の非放射
活性標識化を示す。1mMMgCl2、20mM2−メルカプトエタ
ノール、ml当り100mgのウシ血清アルブミン及び50mMト
リス−HCl（pH7.5）を含む100ミクロリットル溶液。
Ａ、Ａ′、Ｂ及びＢ′の各１ノナモル、ここでＢ及び
Ａ′はその５′−末端でリン酸化されている、及び実施
例１で調製した10ピコモルの48塩基対を含む５ミクロリ
ットルの溶液を加える。dATP及びバイオ−11−dUTP（エ
ンゾ・バイオケム）の各１ナノモル及び100ピコモルのd
ATP［αＳ］をさらに加える。番号11を11原子のリンカ
ー腕と名づけた。
得られる溶液は上記のようにサイクルを受ける。例え
ば混合物を３分間100℃まで加熱し、２分間室温まで冷
却し、それからエセリシア・コリポリメラーゼ−Ｉの４
単位のクルノウ断片及び２単位のT4−DNAリガーゼを加
える。、反応混合物を５分間室温でインキュベートす
る。サイクルを20回、先の実施例に記載されるように繰
り返す。
次いで反応混合物を100ミクロリットルの2M酢酸アン
モニウム緩衝液、pH7.5で希釈する。混合物を希釈液と
して1M酢酸アンモニウムを用いて順次に４倍希釈する。
増幅DNA溶液の一定量（50ミクロリットル）を96−ウエ
ルダイナテック・イムロンIIミクロタイタープレート
（ダイナテック）のウエルに加える。プレートを覆い、
90分間37℃でインキュベートして増幅DNAをプレートに
結合させる。インキュベーション後、ウエルを室温で0.
3MNaClと0.03Mクエン酸ナトリウム、pH7.0の200ミクロ
リットル量で２回、0.1％トリトンＸ−100を含む同一緩
衝液200ミクロリットルで１回洗浄する。ウエルを30分
間室温で10mMリン酸ナトリウム（pH7.4）、0.5MNaCl、
２％BSA、0.1％トリトンＸ−100及び5mMEDTAを含む溶液
（阻止溶液）の一定量（200ミクロリットル）で処理す
る。
ウエルから阻止溶液を除去した後、西洋ワサビペルオ
キシターゼ標識アビジン（ヴェクター・ラブズ）を含む
溶液の一定量（50ミクロリットル）を各ウエルに加え
る。ペルオキシダーゼ標識アビジンをメーカーの指示に
従ってPBS、0.1％トリトンＸ−100に希釈する。
プレートを30分間室温でインキュベートし、次いで10
mMリン酸ナトリウム（pH7.4）、0.5M塩化ナトリウム0.1
％トリトンＸ−100及び5mMEDTAの溶液で洗浄し（４×20
0ミクロリットル）、次いで1mMEDTAを含むPBSで（１×2
00ミクロリットル）洗浄する。
DNA−ビオチン結合（biotinylated）プローブ−標識
アビジン複合体を、0.05Mクエン酸溶液によりpH6.0に調
製した0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液中、1.6mg/ml ｏ−
フェニレンジアミン（シグマ）及び0.0125％過酸化水素
を含む基質反応混合物の150ミクロリットルを各ウエル
に加えることにより、検出する。プレートを暗所で30分
間室温でインキュベートし、ついで反応を4N硫酸（50ミ
クロリットル）の添加による停止する。
プレートの内容をインターメド・イムノ・リーダーNJ
−2000スペクトル光度測定プレートリーダーで、波長49
0nmで読んだ。結果は表１に示す。
表 １ 吸光度（O.D.490） ［増幅 DNA］ コントロール（ａ） 1nモル オーバー 0.019 0.5モル オーバー 0.025 0.250nモル オーバー 0.016 0.125nモル オーバー 0.012 （ａ）コントロールは、酢酸アンモニウムを用いて100
ピコモルのビオ−dUTPがウエルに固定したことを意味す
る。
実施例４ 本実施例は粘着断端のオリゴヌクレオチド補体対（記
載したようにＥ、Ｅ′、Ｆ及びＦ′）を用いる増幅を示
す。増幅すべき所望の配列は、実施例１で調製したと同
じ48塩基対配列である。この実験では、dATP［αＳ］の
取込み、ギャップ−充足及び連結反応段階は全て一度に
起こる。
1mMMgCl2、20mM2−メルカプトエタノール、ml当り100
mgのウシ血清アルブミン、dATP［αＳ］、TTP［α
Ｓ］、dATP及びdTTP各1.0ミクロモル、並びにα−32P−
dATP及びα32P−TTP各100ピコモル（特異的活性1000cpm
/ピコモル）を50mMトリス−HCl、pH7.5を含む100ミクロ
リットル緩衝液に加える。
この溶液にＥ及びＦ′並びにリン酸化Ｆ及びＥ′の各
100ピコモルそして0.1ピコモルの増幅すべき48塩基対を
含む5.0ミクロリットル溶液を加える。得られる溶液を
３分間100℃まで加熱し、２分間室温まで冷却し、鎖の
分離及び標的への２つの対のセットのハイブリッド形成
を行なう。次いでエセリシア・コリDNAポリメラーゼ−
Ｉの２単位のT4−断片及び２単位のT4−DNAリガーゼを
加えて反応物を10分間室温でインキュベートする。
工程を循環させるために、以下の段階が用いられる。
1.3分間100℃への加熱 2.2分間室温への冷却、 3.エセリシア・コリDNAポリメラーゼ−Ｉの４単位のク
ルノウ断片及び２単位のT4−DNAリガーゼの添加、 4.室温での10分間のインキュベート このサイクルを20回繰り返す。
得られる反応混合物をセファデックスＧ−40/50カラ
ム（１×10cm）（ファルマシア）にかけて、２回蒸留し
た水で溶出する。２つの明らかなピークが分離し、ガイ
ガーカウンターによりモニターする。５−7mlの水の溶
出後現れる第一のピークは増幅48塩基対より成り、14−
18mlの水の溶出後現れる第二のピークはα−32P−dATP
とα−32P−TTPから成る。
以下の実施例は感光分子に付着するオリゴヌクレオチ
ド補体対を用いる増幅を示す。
実施例５ Ｎ−（２−ブロモエチル）フタルイミドの調製 フタルイミドカルシウム（30.8g、0.17M）を1,2−ジ
ブロモエタン（63.9g、0.34M）及び乾燥DMF（374ml）と
48時間、室温で撹拌した。（DMFはジメチルホルムアミ
ドである。）沈澱したKBrを濾去し、液体を蒸留により
濾液から除去した。褐色固体残渣をシクロヘキサン−ヘ
プタン（10:1）から再結晶し、ほとんど無色の結晶（3
2.3g、72.3％、融点73−75℃）を得た。
実施例６ ８−ヒドロキシプソラレンの調製（エイ．ションバー
グ等、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサ
エティ、72:4826（1950）の手順により調製した）。
乾燥ベンゼン（100ml）中８−メチルプソラレン（4.3
g、19.90mM）の溶液を、乾燥エーテル（50ml）及び乾燥
ベンゼン（50ml）の混合物中のヨウ化マグネシウム（1
0.16gヨウドと0.97gマグネシウムから）に滴加した。溶
媒を真空下、120℃で、残渣が実質的に乾燥するまで蒸
発させ、次いでさらに160−170℃で２時間加熱した。
得られる固体残渣を希硫酸で分解し、濾取した沈澱を
水で洗浄し、希重亜硫酸ナトリウム溶液に懸濁し、濾取
し、水で洗って最後に無色結晶（融点246℃）としてジ
オキサンから結晶化した。
実施例７ １−（プソラレン−８−イルオキシ）−２−Ｎ−フタル
イミドエチルの調製 乾燥アセトン（100ml）中K2CO3（5g,35mM）の撹拌懸
濁液に、８−ヒドロキシプソラレン（1g,5mM）とＮ−
（−２−ブロモエチル）フタルイミド（1.77g,7mM）を
加えた。混合物を還流し（17時間）、冷却後濾過した。
溶媒を除去後、粗生成物をシリカゲル（ヘキサン−ジエ
チルエーテル1:1）で２回クロマトグラフにかけて、黄
色油（0.68g、39％）の生成物を得た。
NMR（DCl3）3.31（2H,t,J12Hz,CH2N）;4.75（2H,t,J12H
z,CH2O）,6.38（1H,d,J10Hz,3−Ｈ）,6.82（1H,d,J2Hz,
4−Ｈ）,7.40（1H,S,5−Ｈ）,7.68（1H,d,J2Hz,5−
Ｈ）,7.75（4HJ,d,フタル）,7.8（1H,d,J10Hz,4−
Ｈ）． マススペクトル,m/e 228,229,375（m+）． C21H13NO6:C,67.2;H,3.4;N,3.7. に対する計算値 実験値:C,67.0;H,3.4;N,3.6. 実施例８ ２−（８−プソラレンオキシ）エチルアミン塩酸塩の調
製 １−（プソラレン−８−イルオキシ）−２−Ｎ−フタル
イミドエチル（0.5g,1.3mM）、ヒドラジンヒドラート
（水中85％、0.5ml）及び95％エタノール）100ml）を４
時間還流し、次いでヒドラジンヒドラート溶液の第２の
0.5ml添加を行った。２時間還流を延長した後、薄層ク
ロマトグラフィ（ジエチルエーテル）による測定により
出発材料は残っていなかった。エタノールを蒸発させて
残渣を200mlの0.1NNaOHにとり、次いで50ml部のクロロ
ホルムで３回抽出することにより135mg（41.4％）の粗
製アミンを得た。塩酸塩を調製するため、アミンを100m
lの1.2N塩酸にとり、これを3ml部のクロロホルムで３回
抽出して不純物を除去した。酸性溶液を真空で蒸発させ
て粗製塩酸塩を得、これを十分量の無水エタノールに溶
解し、等量のジエチルエーテルを添加することにより沈
澱させた。一夜冷却（４℃）後、98mgの純生成物を収集
した。
NMR（CDCl3） アミン2.89として（2H,t,J9Hz,CH2N）,
4.75（2H,t,J9Hz,CH2O）,6.38（1H,d,J10Hz,3−Ｈ）,6.
82（1H,d,J10Hz,4−Ｈ）,7.8（1H,d,J10Hz,4−Ｈ）7.9
（2H,ワイド,S,NH2）． マススペクトルm/e 201,245（M+）． C13H12ClNO4:C,55.4;H,3.9. に対する計算値 Cl,12;N,4.9; 実験値:C,551;H,3.9;Cl,12.4;N,4.8. 実施例９ オリゴヌクレオチドに付着する光活性しうる基の調製 増幅させる所望の配列は、二本鎖DNAとして８キロベ
ースのHIVゲノムを含んでいるプラスミドpBR322に含ま
れる50塩基対配列であった。配列は以下のヌクレオチド
配列を有する。
A.リン酸化オリゴヌクレオチドの合成 以下の４つのオリゴヌクレオチドは、マチウシ等、ジ
ャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエテ
イ、103:3185（1981）のホスホルアミディト固体支持体
により調製した。
これらの２つ、ＩとＪ′は、５′末端をリン酸化し、
一方、ＪとＩ′は３′末端をリン酸化した。Ｉ、Ｉ′、
Ｊ及びＪ′の配列は以下の通りである。
配列Ｉ′及びＪを３′末端でリン酸化するために、以
下の手順を用いた。
長鎖アルキルアミン調節細孔ガラス（ピース）、細孔
径500Å、粒径125−177mm、30mgを、アプライド・バイ
オシステムズ・インコーポレーテッド、タイプ380B−02
DNAシンセライザーに合った適当なセルに入れた。
手順は、リン酸化剤（２−シアノエトキシ）−２−
（２′−Ｏ−4,4′−ジメトキシトリチルオキシエチル
スルホニル）エトキシ−N,N−ジイソプロピルアミノ−
ホスフイン（グレン・コープ．インク．）の縮合、続く
ジイソプロピルホスホルアミジト（アプライド・バイオ
システムズ・インコーポレーテッド）の配列縮合を含ん
だ。
自動合成手順 手順は、活性化電子ドナーとしてテトラゾールを用い
る長鎖アルキルアミン調製細孔がラスとリン酸化剤の縮
合、テトラヒドロフラン及びピリジン中、無水酢酸とジ
メチルアミノピリジンによるキャッピング、I2/H2O/ル
チジン／テトラヒドロフランによる亜リン酸エステルの
リン酸への酸化、続く、ジクロロメタン中２％トリクロ
ロ酢酸を用いる脱トリチル化を含んだ。サイクル時間は
約30分であった。
Ｉ′又はＪはヌクレオチドは、同じサイクルを用いて
リン酸化剤に連続的に縮合した。
５′−リン酸化オリゴヌクレオチドＩ及びＪ′を合成
するために、サイクルは、適当なヌクレオチドによる被
覆調節細孔ガラスの脱トリチル化で開始し、続いて上記
した通りのサイクル手順を行なった。最終サイクルで、
リン酸化剤を濃縮した。各段階の収量は本質的に定量的
で、脱トリチル化の間に遊離したジメトキシトリチルア
ルコールの収集と分光試料により測定した。
オリゴデオキシリボヌクレオチド脱保護及び精製手順 固体支持体をカラムから除去し、閉管中、60℃で16時
間、1ml濃縮水酸化アンモニウムに暴露した。アンモニ
アを除き、残渣を、7M尿素を含むトリス−ホウ酸塩緩衝
液（pH8）を用いる調製した12％ポリアクリルアミドゲ
ルにあてはめた。電気泳動は20ボルト/cmで５時間実施
し、その後、生成物を含むバンドを蛍光プレートのUVシ
ャードーイングにより確認した。バンドを切断し、1ml
蒸留水で１晩、室温で溶出した。この溶液を濾過して上
清をｎ−ブタノールで抽出した（３×300ミクロリット
ル）。水相をセファデックスG50カラム（ファルマシ
ア）（１×10cm）に置き、２回蒸留した水で溶出した。
溶出液を260nmでUV吸収をモニターし、適当なフラクシ
ョンを、UV吸収により固定容量に収集、定量し、室温で
真空遠心分離で蒸発させ乾燥した。
Ｉ′及びＪ断片のリン酸化 オリゴデオキシリボヌクレオチドＩ′及びＪ（各５ナ
ノモル）をそれぞれ凍結乾燥して乾燥し、50mMのHEPES
（アルドリッチ）pH7.6、10mMMgCl2、10mMジチオトレイ
トール及び［α32P］−ATP（10mM）特異的活性＝2.5×1
03CPM/Pモル（50ミクロリットル）に再び溶解した。
各管を２単位のT4−ポリヌクレオチドキナーゼで40分
間インキュベートし、37℃で５分間で酵素を不活性し、
セファデックスカラムG50に負荷し、水で溶出した。溶
出液をガイガーカウンター（ベックマン）でモニター
し、凍結乾燥した。
実施例10 光活性化しうる−オリゴデオキシリボヌクレオチドの調
製 本実施例は、３′及び５′末端で、光活性化しうる基
によりどのオリゴヌクレオチドをも標識することを示
す。本実施例で、ｘ＝ｙ＝あらゆる光活性化しうる基、
例えば本発明において上記したような２−（８−プソラ
レンオキシ）エチルアミン又はジエイ・ビー・ハンセン
等、テトラヘドロン・レターズ、22:1847−48（1981）
に記載されるような５−アミノメチル−８−メトキシプ
ソラレン、又はイサークス等、バイオケミストリイ、1
6:1058−64（1977）に記載されるような４′−アミノメ
チル−４−5;8−トリメチルプソラレン。
リン酸化オリゴデオキシリボヌクレオチド、５′PI、
３′PJ、３′PI′及び５′PJ′（10mモル）それぞれを
別々にエッペンドルフ（Eppendorf）管中で凍結乾燥し
た。0.2M1−エチル−3,3−ジメチルアミノプロピルカル
ボジイミド（シグマ）、（８−プソラレンオキシ）エチ
ルアミン塩酸塩（10mg）及び0.1Mの１−メチルイミダゾ
ール緩衝液pH6.0（1ml）の溶液を造った。この溶液から
250ミクロリットルを各々のエッペンドルフ管に加え
た。
混合物を24時間、室温でインキュベートした。管を蒸
発させて乾燥し、残渣を30ミクロリットルの８％ホルム
アミドに再び溶かして7M尿素を含むトリス−ホウ酸塩緩
衝液を用いる12％ポリアクリルアミドゲルの調製した電
気泳動により精製した。電気泳動は、20ボルト/cmで３
時間実施し、その後、生成物を含むバンドを蛍光プレー
トのUVシャドーイングにより確認した。２つのバンド
は、密接に走っており、上のバンドが長波UVランプにさ
らすと蛍光を示すことが確認された。
バンドを切断し1ml蒸留水で一晩、室温で溶出した。
混合物を濾過し、上清をｎ−ブタノールで抽出した（３
×0.5ml）。水相をセフアデックスG50カラムに負荷し、
水で溶出した。溶出液を260nm及び310nmでUV吸収により
モニターし、適当なフラクションを、UV吸収により固定
容量に収集、定量し、蒸発させて室温で真空遠心分離し
て乾燥した。光標識の収率は85％であった。
５′末端でのyI′及びyJの放射標識 各５ナノモルの凍結乾燥したyI′及びyJを5mMのHEPES
pH7.6、10mMMgCl2、10mMジチオトレイテオール及び［32
P］−ATP（10nM、特異的活性＝2.5×103CPM/Pモル）に
溶解して（50ミクロリットル）を１単位T4−ポリヌクレ
オチドキナーゼと40分間、37℃でインキュベートした。
反応混合物を５分間80℃まで加温して酵素を不活性化し
た。各管の内容をセファデックスG50カラム（１×10c
m）に負荷し、２回蒸留した水で溶出した。
溶出液をガイガーカウンターでモニター愛し、適当な
フラクションを、放射活性計算により固定容量に収集、
定量して、室温で真空遠心分離で蒸発させて乾燥した。
実施例11 本実施例は、本発明の本実施態様による光化学工程を
用いるプラスミドpBR322に含まれるHIVゲノムの51塩基
対配列の増幅を示す。
プラスミドは、８キロベースのヒト免疫不全ウイルス
HIVゲノム配列を含み、その中の51塩基をPOL部分から増
幅すべく選択した。
10ピコモルのプラスミドの総計をEcoRIで線状にし
た。以下の光活性化しうるオリゴデオキシリボヌクレオ
チドの各１ナノモルを、ＩとＪ又はＩ′とＪ′が互いに
結合したとき、長さ51塩基の光生成物付加体を生成する
よう設計した。
ここにｘ＝ｙ＝２−（８−プソラレンオキシ）エチル
アミノ、又、Ｐ＊に放射活性標識リンである。
配列yI′及びyJを上記したように５′末端でリン酸し
た。放射活性標識配列は、工程を用いる場合、増幅効率
の分析に用いられ、100mlの1Mグアニンチオシアナート
（GuSCN）溶液に溶解した。
混合物をシリコン処理した1.5mlポリプロピレン遠心
分離管（サーステッズ）に置き、混合物を窒素で５分間
泡立てることにより気体を流した。混合物を100℃水浴
中に２分間浸漬し、続いて、37℃に急速に冷却し、５分
の放射線照射した。加熱、冷却及び放射線照射のサイク
ルは７回繰り返した。
放射線照射段階は、二重壁試料室の両側に、中心間の
距離が9cmに設けた２つの400−Ｗジエネラル・エレクト
リック水銀蒸気ランプ（H400A33−1/T16）を含む装置中
で行なった。試料支持器は、サーモスタットにより37℃
に維持し、Co（NO3）2/NaCl/H2O混合物（38:2:60重量
比）により、及び0.6cmパイヤース・フィルター（pyres
pilter）で被覆した。コバルト溶液は紫外線フィルタ
ーとして役立ち、これは365nm光の最大透過度とほぼ340
−380nmからの窓を認めた。内部試料の表面の光の強度
は、約100mW/cm2であった。
各放射線照射後、5mlの一定量を取り、分析用に保持
した。
第７サイクル後、一定量を、7M尿素を含むトリス−ホ
ウ酸塩緩衝液pH8を用いる12％ポリアクリルアミドゲル
に負荷した。電気泳動を20ボルト/cmで３時間実施し
た。ゲルをフイルムに４時間暴露して図２のように現れ
た。レーン１はゼロ時の反応混合物を示す。
実施例12 本実施例は、重合性支持体へのT4−DNAリガーゼ及び
ポリメラーゼ−Ｉのカップリングを示す。
I.「リンカー腕」の合成 1.O−（ジ−ｐ−メトキシトリチル）ヘキサエチレング
リコール ヘキサエチレングリコール（アルドリッチ）（28.23
g、100mモル）を乾燥ピリジン（200ml）に溶解して、乾
燥ピリジン（100ml）中ジメトキシトリチルクロリド（1
6.95g、50mモル）の溶液をアルゴン中で滴加する。混合
物を室温で４時間撹拌して、溶媒を減圧下（2mmHg）に
除去する。油状の黄色残渣を酢酸エチル（300ml）で抽
出し、水（200ml）及び食塩水（２×200ml）で洗浄す
る。有機相を無水硫酸ナトリウムの上で乾燥し、濾過す
る。溶媒を除去して残渣を幾らかのピリジン（0.5ml）
を含むジクロロメタン（30ml）に溶解する。この混合物
をシリカゲル（5.5×45cm）のカラムクロマトグラフィ
ーによりさらに精製し、ジクロロメタン−メタノール−
ピリジン（95:4:1:Vol/Vol）の混合物で溶出する。生成
物（23.3g,黄色油）は上記溶媒中、RF＝0.42を有する。
収率は（80％）である。
NMR＝7.46−7.20（m,9H,芳香族 Hs）,6.80（d,J＝9.0H
z,4H,芳香族 Hs）,3.77（s,6H,メトキシHs）,3.66,3.6
3（2 s,22H,CH2−CH2）3.56（t,J＝5 Hz,sH,CH2−CH）,
3.21（t,J＝6.0 Hz,2H,CH2−DMT）,2.49（wide s,1H,O
H）． マススペクトル:m/e 584（モルイオン）,553,507,477,3
03（DMT 基）． 2.O′−DMT−ヘキサエチレングリコールＯ−メチルN,
N′−ジイソプロピルホスホルアミジト Ｏ′−DMT−ヘキサエチレングリコール（１）（5.84
g,10mモル）をアルゴン中で乾燥ジクロロメタン（30m
l）に溶解する。乾燥N,N−ジイソプロピルアミン（5.16
g,40mモル）を加え、続いてN,N−ジイソプロピルＯ−メ
チルクロロホスホルアミジト（アプライド・バイオシス
テムズ）（1.97g,10mモル）を滴加する。溶液を室温で3
0分間撹拌し、酢酸エチル（30ml）で希釈し、炭酸水素
ナトリウムの飽和溶液（300ml）及び食塩水（100ml）で
洗浄する。有機層を無水硫酸ナトリウムの上で乾燥し、
溶媒を減圧下（15mmHg）に除去する。トルエンとの共蒸
発（２×100ml）及び乾燥ベンゼン中の凍結乾燥により
さらに乾燥を達成する。生成物（7.21g,黄色油）はジク
ロロメタン−メタノール（95:5）中RF−0.63を有する。
収率は（95％）である。
NMR＝7.47−7.23（m,9H,芳香族 Hs）,6.83（d,J＝9.0
Hz,4H,芳香族 Hs）,3.77（s,6H,メトキシ）,3.77−
3.59（wide s,22H,O−CH2CH2−Ｏ）、3.55（d,J−12 H
z,3H,CH3−Ｏ−Ｐ）,3.21（t,J＝6.0 Hz,2H,CH2−Ｏ−D
MT）,1.62（d,2H,マススペクトル 744（モルイオ
ン）． II.調節、細孔ガラスへのリンカー腕の付着 長鎖アルキルアミン調節、細孔ガラス（CPG）、（ピ
ース）、（500Å）、（1g）を焼結ガラス（メディウ
ム）（50ml）に置き、アルゴン中、乾燥アセトニトリル
（３×10ml）で洗浄する。乾燥ゲルに、乾燥アセトニト
リル（12ml）中1H−テトラゾール（アルトリッチ）、
（0.5g）の溶液を加え、次いでアルゴン中、乾燥アセト
ニトリル（13ml）中Ｏ′−DMT−ヘキサエチレングリコ
ールＯ−メチルN,N−ジイソプロピルホスホルアミジト
（2g）の溶液を添加する。反応混合物を10分間撹拌し、
次いでテトラヒドロフラン（３×25ml）で洗浄する。得
られるゲルに、無水酢酸：テトラヒドロフラン（1:1Vol
/Vol）（10ml）を含むキャッピング溶液とテトラヒドロ
フラン（10ml）中N,N−ジメチルアミノピリジン（0.5
g）の溶液を加え、混合物を６分間振盪し、次いでテト
ラヒドロフラン（３×20ml）で洗浄する。得られる溶液
に、テトラヒドロフラン：水:2,6−ルチジン（1:0.4:
1）、（10ml）中I2（0.1モル）を含む酸化溶液を加え、
混合物を５分間振盪し、次いでアセトニトリル（３×20
ml）で洗浄する。調節細孔ガラス上のリンカー腕の負荷
の測定は、10ミリグラムの被覆支持体に、アセトニトリ
ル（0.1モル）中パラトルエンスルホン酸の溶液（1ml）
を加え、次いで498nmで吸収を測定することにより行
う。負荷は1gの支持体当り185ミクロモルのリンカー腕
である。ジクロロメタン中トリクロロ酢酸の溶液（３
％）により、支持体からジメトキシトリチル基を除く。
新しいリンカー腕を、所望のようにより長いリンカー
腕を得るために、予め非保護としたリンカー腕に縮合さ
せる。
III.トレシルクロリドによるCPG−リンカー腕の活性化 乾燥支持体−リンカー腕（1g）を上記のように焼結ガ
ラスに置き、乾燥アセトン（３×50ml）で洗浄し、次い
で乾燥アセトン（5ml）及び260ミクロリットルの乾燥ピ
リジンを添加する。トレシルクロリド（フルカ）、（18
0ミクロリットル）を懸濁液に振盪下、１分間に添加す
る。０℃で15分間反応後、ゲルを、以下の、30:70、50:
50及び70:30の5mMHCl:アセトン（Vol/Vol）の（20ml）
で２回、最後に水、50:50水：アセトン及びアセトン、
（各20ml）で洗浄し、乾燥して、必要とするまでデシケ
ーター中で蓄える。
IV.トレシル化CPG−リンカー腕へのT4−DNAリガーゼの
カップリング 40単位のT4−DNAリガーゼ（BRL）を、1mMEDTA、50ミ
クロモルATP、10％グリセロールを含んで200ミクロリッ
トルの最終容量とし、40℃に保った、0.1MNaH2PO4、pH
7.5に溶解する。100ミリグラムの乾燥トレシル化CPG−
リンカー腕を酵素溶液に移す。得られるゲルスラリーを
４℃で16時間、「回転しながら」混合する。リンカー腕
上の残留反応性トレシル基を0.1Mジチオトレイトールを
加えることにより（２時間、４℃）除去する。カップリ
ング後、ゲルを、0.1MNaH2PO4、pH7.5、1mMEDTA、10mM
ジチオトレイトール（DTT）、0.5MNaClで４回洗浄し、
次いで0.1MNaAc,pH5.0で２回洗浄することにより、未カ
ップリング酵素が残らなくなるまで洗浄する。最後にゲ
ルを66mMトリス−HCl,pH7.6、6.6mMMgCl2、10mMDDT、10
％グリセロール中で平衡化し、４℃で蓄える。
V.ステシル化CPG−リンカー腕へのエセリシア・コリDNA
ポリメラーゼ−Ｉのクルノウ断片のカップリング 40単位のエセリシア・コリDNAポリメラーゼ−Ｉのク
ルノウ断片（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ）
を、1.5mMATP、30mMトリス酢酸塩緩衝液pH7.9から成る2
00ミクロリットルの緩衝液に溶解し、80ミクログラムポ
リ（dA）−20ミクログラムオリゴ（dT）の凍結乾燥混合
物に加える。この混合物に、100ミリグラムの乾燥トレ
シル化CPG−リンカー腕を加える。得られるゲルスラリ
ーを４℃で10時間「回転しながら」混合する。リンカー
腕に残留するトレシル基を0.1mMジチオトリイトール（D
TT）を添加することにより除去する。カップリング後、
ゲルを、60mM酢酸ナトリウム、30mmトリス−酢酸塩、10
mM酢酸マグネシウムpH8.0及び0.25mMジチオトレイトー
ルからなる緩衝液中で洗浄する（４×0.5ml）ことによ
り未カップル酵素が残らなくなるまで洗浄する。最後
に、ゲルを66mMトリス−HClpH7.6;6.6mM塩化マグネシウ
ム;10mMDDT;10％クリセロール中で平衡化し、４℃で蓄
える。
以下の実施例は、これらの固定化酵素の応用の方法で
の用途を示す。
実施例13 段階1:クラミジア配列の合成 オリゴヌクレオチドを結合するギャップ−充足／連結
反応系を用いて増幅すべき所望の配列は、クラミジア・
トラコマチス潜在プラスミドをコードする88塩基対であ
る。この特異的配列は、PUC18プラスミドのユニークなB
amH1/sstl部位に挿入されたクラミジア・トラコマチス
（抗原型Ｌ）から誘導された6.5キロベースプラスミド
のシークエンシンダにより得られた22塩基対の４回繰り
返し配列である。6.5Kbは、サンガー等、プロシーデイ
ングス・オブ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエ
ンスズ（P.N.A.S.）83,1911（1986）のジデオキシ鎖停
止法を用いて配列を決める。
22の繰り返される塩基対は以下の配列である。
２つの対の構造は以下の通りである。
Ｙは、この場合、オリゴヌクレオチド補体対中のオリ
ゴヌクレオチドＡ及びＢを示す。
Ｚは、この場合、オリゴヌクレオチド補体対中のオリ
ゴヌクレオチドＡ′及びＢ′を示す。標的配列にハイブ
リット形成すると、Ｙ及びＺは２つの相補塩基対、Ａ−
Ｔのギャップを形成する。
上記した２つのオリゴデオキシリボヌクレオチドは、
以下の手順により合成され、精製される。
I.自動合成手順（マッチウシ等、ジャーナル・オブ・ア
メリカン・ケミカル・ソサイエテイ、103、31−５（198
1）に従う。
２−シアノエチルホスホルアミジトはアプライド・バ
イオシステムズ・インコーポレーテッドから購入する。
手順は、アプライド・バイオシステム・インコーポレー
テッドからのDNAシンセサイザー、タイプ380B−02を用
い、ヌクレオシド−被覆、調節細孔ガラスビーズ支持体
（500Å）30mgへのヌクレオシドホスホルアミジトの縮
合を含む。サイクルは、ジクロロメタン中、２％トリク
ロロ酢酸による脱トリチル化、活性化電子ドナーとして
テトラゾールを用いる場合、無水酢酸及びジメチルアミ
ノピリジンによるキャッピング、0.1M12/H2O/ルチジン
／テトラヒドロフランによる亜リン酸エステルからリン
酸エステルへの酸化、続くジクロロメタン中、２％トリ
クロロ酢酸を用いる脱トリチル化を含む。サイクル時間
は約30分である。各段階での収率は本質的に定量的で、
脱トリチル化の間に遊離するジメトキシトリチルアルコ
ールの収集及び分光試験による決定する。
II.オリゴデオキシリボヌクレオチド脱保護及び精製手
順 固体支持体をカラムから除き、閉管中、60℃で16時間
1ml濃縮水酸化アンモニウムに暴露する。アンモニアを
除去し、残渣を、7M尿素を含むトリス−ホウ酸塩緩衝液
（pH8）を用いる調製した12％ポリアクリルアミドゲル
にあてはめる。電気泳動を20ボルト/cmで５時間実施
し、その後、生成物を含むバンドを、蛍光プレートのUV
シャドーインクにより確認する。バンドを切断し、1ml
の２回蒸留水で一晩室温で溶出する。溶液を濾過し、上
清をｎ−ブタノールで抽出する（３×300ミクロリット
ル）。水相をセファデックスＧ−50カラム（ファルマシ
ア）（１×10cm）に置く。溶出液を260nmでUV吸収によ
りモニターし、UV吸収により適当なフラクションを一定
量収集、定量し、室温で真空遠心分離で蒸発させ乾燥す
る。
III.A,B,A′及びＢ′の５′−リン酸化 オリゴデオキシリボヌクレオチドＹ及びＺ（各５＋１
モル）を別々に凍結乾燥し、（50ミクロリットル）の50
nM HEPES（アルトリッチ）pH7.6、10nM MgCl2、10mMジ
チオトレイトール及び［32P］−ATP（10nM）に再び溶解
する。
特異的活性＝2.5×103cpm/pモル 各管を２単位のT4−ポリヌクレオチドキナーゼと40分
間インキュベートし、37℃、５分間で酵素を不活性化
し、セファデックスカラムG50に負荷し、水で溶出す
る。溶出液をガンマカウンター（ベックマン）でモニタ
ーし、凍結乾燥する。
実施例14 I.クラミジアDNAの精製 クラミジア・トラコマチスLGV2株をマツコイ・細胞
（McCoy Cell）中、１ミクログラム・シクロヘキシミド
/mlの存在下、細胞当り約1.0FU（封入体形成単位）まで
生育する。細胞を３日間生育し、この時点で、80−90％
のものが可視封入体を示し、集めて、試験まで−70℃で
蓄える。
対照微生物株を決まりきった分譲機関（デパートメン
ト・オブ・マイクロバイオロジィ、ベン−グリオン・ユ
ニバーシティ）から得て、標準的手段（レンネット等、
マニュアル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジ
ィ、第３判、ワシントン（1980））により確認する。株
は、エセリシア・コリ及びストレプトコッカス・アカラ
クチアの分離培養株を含む。
微生物株を平板上又は液体培地で生育する。試験用
に、各微生物の懸濁液をアルカリpH（0.3M NaOH）で煮
沸し、氷上で冷凍し、HClで中和する。
クラミジア細胞培養収穫物の100mlをガラス−テフロ
ンホモシナイザーで分裂させ、1,400×ｇで５分間遠心
分離して細胞残骸を除去する。上清を20mMトリス−150m
M HCl（THCl）（pH7.5）で希釈した30％（vol/vol）レ
ノグラフィン−76（イー．・アール，スクイブ、プリン
ストン米国）上に層とする。レノグラフィン−76（クエ
ン酸緩衝液中、ジアトリゾアート（diatrizoate）・メ
クルミン及びナトリウムジアトリゾアートの溶液）。5
0,000×ｇで45分間遠心分離後、ペレットを10mlのTHCl
に再び懸濁し、THCl中の30ないし60％（vol/vol）レノ
グラフィン−76勾配上に層とし、50,000×ｇで２時間遠
心分離する。２つの拡散バンドは勾配の中央部分で可視
性で、これらのフラクションを集め、THClで希釈し、5
0,000×ｇで45分間遠心分離する。ペレットを0.5mlのTH
Clに再び懸濁する。
II.DNA抽出 以上の手順は（ウェルマン等、ネイチャー296:68−70
（1982）に記載された方法を基礎とする。
クラミジア懸濁液をホモジネートし、20mM Na2EDTA、
20％（wt/vol）ショ糖、0.7％（wt/vol）Ｎ−ラウロイ
ルザルコシン及び200ミクログラムのプロテナーゼＫを
含む50mMトリスを加える。この混合物を55℃で15分間、
次いで37℃で45分間インキュベートする。等定量のフェ
ノールクロロホルムを加えて、混合物を曲げて2,000×
ｇで10分間遠心分離する。1/20容量の5N NaCl及び２容
量のエタノールを添加することにより、水性相から核酸
を沈澱させる。遠心分離と沈澱のサイクルをさらに２回
したのち、DNAをスペクトル光度測定法で測定し、もう
一度沈澱させ、1mM EDTA（pH7.0）を含む10mMトリスに2
00ミクログラム/mlの濃度に再び溶解する。
DNAは、製造者の推薦する条件下、２ないし３時間、
ミクログラムのDNA当り４単位のBAM−HI（BI）を伴う、
80ミクログラム/mlの濃度で４ないし10ミクログラム量
に分解する。
実施例15 この実施例は、図３に示す装置を利用する固定下酵素
を用いるギャップ充足−連結反応増幅段階を示す。
重合性ビーズ１、実施例12、IVからの（10mgビース）
のCPG−T4−DNAリガーゼ及び実施例12、Ｖからの（10mg
ビーズ）のエセリシア・コリのCPG−クルノウ断片の混
合物をプラスチックシリンダー２（内容量〜0.5ml）内
に置く、ここでシリンダー２の端は、プラスチック配管
6,7に連結する入口４と出口５を有するプラスチックカ
バー3a,3bを有する。シリンダー２の底は、ビーズ１を
保持するシリコン被覆グラスウールで充たす。
入口４と出口５は、プラスチック配管6,7に結合し、
配管は0.5mmの直径を有する。プラスチック配管７は、
ステンレススチールコイル９に結合し、コイルは、90℃
のシリコン油を含む熱油浴10中に沈んでいる。ステンレ
ススチールコイル９は、第二のステンレスコイル12への
管11と結合する。コイル12は、室温に保持される水浴13
に沈んでいる。コイル９及び12も又、直径0.5mmであ
る。コイル12は、0.5mmの直径を有するプラスチック管1
4に結合する。管14は、ぜん動性ポンプ15及びその後入
口４を経てセル２につながる。ポンプは分当り２滴の速
さで系に溶液を押し出す。
段階1.DNAポリメラーゼ１の３′−５′エキソヌクレア
ーゼ活性からのＹ及びＺオリゴヌクレオチドの保護並び
に平滑断端形成100ピコモルの各５′−リン酸化Ｙ及び
Ｚを互いに混合し、１ミリメーターの、1mM MgCl2、20m
M2−メルプトエタノール、ml当り100mgのウシ血清アル
ブミン及び50mMトリス−HCl（pH7.5）並びに0.1mMのdAT
P［dATPαＳ］及びTTP［αＳ］（シグマ）に溶解する。
得られる溶液を２分間、100℃に加熱し、鎖の分離並
びに標的へのＹ及びＺのハイブリッド形成を行なう。次
いで５単位の、エセリシア・コリDNAポリメラーゼ−１
のクルノウ断片を加えて、反応物を室温で10分間インキ
ュベートする。対は新しい平滑断端でポリメラーゼのエ
キソヌクレアーゼ活性に対し保護されている。
段階2.上記実施例14、IIからの１ミクログラムのBamH I
分解DNAを段階１から得られる緩衝液に溶解する。この
緩衝液に、１ナノモルのdATP及びTTP並びに100pモルの
各α−32P［dATP］及びα−32P［TTP］を加える。特異
的活性1000cpm/ピコモル。
この溶液を装置の入口を経て注入し、ぜん動性ポンプ
15を作動させることによりサイクルを開始する。
溶液を固定化酵素を含むセル２を経てサイクルさせて
２時間後、溶液をセファデックスカラムＧ−40/50（１
×10cm）に負荷し、二回蒸留した水で溶出する。1mlの
フラクションをガイガーカウンターにより収集し、モニ
ターする。
２つの明らかなバンドを検出し、第１のものは、ギャ
ップ充足／連結反応工程により、標識、増幅、結合オリ
ゴヌクレオチド生成物を含む４−7mlの部分に溶出し、
これをプールしたものは約115000cpmを有し、一部第二
の、14−17mlに溶出したもののプールは80,000cpmを有
する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭63−22197（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−281（ＪＰ，Ａ) 米国特許4710465（ＵＳ，Ａ) 欧州公開236069（ＥＰ，Ａ１) 欧州公開185494（ＥＰ，Ａ２) ＤＮＡ，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．３, （1988）ｐ．211−217 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/09 C12Q 1/68 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (31)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】試料中の特異的核酸標的分子を増幅するこ
    とにより、該特異的核酸標的分子を検出する方法であっ
    て、 （ａ）試料を、標的分子の各鎖に関し過剰の少なくとも
    ２つのオリゴヌクレオチドで、ハイブリッド形成条件下
    に処理すること、 ｉ）ここでオリゴヌクレオチドは、標的分子の各鎖に対
    して十分に相補的となるように選択して、それとハイブ
    リッド形成条件下でハイブリッド形成し、 ii）２つのオリゴヌクレオチドが標的分子の１の鎖にハ
    イブリッド形成する場合において、１またはそれ以上の
    塩基のギャップが２つのオリゴヌクレオチド間に存在
    し、 iii）オリゴヌクレオチドは、その間のギャップが、そ
    のギャップを充たすために４種より少ない種類の塩基を
    必要とするように選択され、 （ｂ）段階（ａ）で形成されたギャップを、ギャップ中
    の塩基に相補的な１またはそれ以上の塩基で充たし、ギ
    ャップを充たす塩基を互いに及び２つの隣接するハイブ
    リッド形成したオリゴヌクレオチドと結合して結合オリ
    ゴヌクレオチド生成物を生成させ、 （ｃ）段階（ｂ）のハイブリッド形成した結合オリゴヌ
    クレオチド生成物を変性条件下処理して、結合オリゴヌ
    クレオチド生成物を標的分子から分離し、１本鎖分子を
    生成すること、 （ｄ）段階（ｃ）で生成した１本鎖分子を、過剰の少な
    くとも２つのオリゴヌクレオチド補体対でハイブリッド
    形成条件下に処理し、 ｉ）ここで各オリゴヌクレオチド補体対は、互いに、標
    的分子の各鎖に、及び結合オリゴヌクレオチド生成物に
    十分に相補的となるように選択して、それらとハイブリ
    ッド形成条件下でハイブリッド形成する２つのオリゴヌ
    クレオチドからなり、 ii）２つのオリゴヌクレオチドが標的分子の各鎖にハイ
    ブリッド形成する場合において、１またはそれ以上の塩
    基のギャップが２つのオリゴヌクレオチド間に存在し、 iii）オリゴヌクレオチドは、その間のギャップが、そ
    のギャップを充たすために４種より少ない種類の塩基を
    必要とするように選択され、 （ｅ）段階（ｄ）で形成されたギャップを、ギャップ中
    の塩基に相補的な１またはそれ以上の塩基で充たし、ギ
    ャップを充たす塩基を互いに及び隣接するハイブリッド
    形成したオリゴヌクレオチドと結合させ、これにより付
    加的結合オリゴヌクレオチド生成物を生成させ、標的分
    子を増幅させること、及び（ｆ）結合オリゴヌクレオチ
    ド生成物を検出すること、 の段階を含む。
  2. 【請求項２】さらに 段階（ｅ）のハイブリッド形成オリゴヌクレオチドを変
    性条件下処理し、ハイブリッド形成オリゴヌクレオチド
    を分離し、一本鎖分子を生成させる段階（ｅ′）を含
    み、段階（ｄ）、（ｅ）及び（ｅ′）は所望の回数繰り
    返す、請求項１の方法。
  3. 【請求項３】核酸標的分子が２本鎖DNAであり、その鎖
    が段階（ａ）の前又は間に分離される、請求項１の方
    法。
  4. 【請求項４】核酸標的分子が一本鎖DNAである、請求項
    １の方法。
  5. 【請求項５】核酸標的分子が一本鎖RNAである、請求項
    １の方法。
  6. 【請求項６】オリゴヌクレオチドがオリゴデオキシリボ
    ヌクレオチドである、請求項１の方法。
  7. 【請求項７】オリゴヌクレオチド補体対が、核酸標的分
    子当り105ないし1015対の範囲でモル過剰として存在す
    る、請求項１の方法。
  8. 【請求項８】ギャップがDNAポリメラーゼ及びDNAリガー
    ゼによって充たされるものである、請求項１の方法。
  9. 【請求項９】DNAポリメラーゼ及びDNAリガーゼを重合性
    支持体に固定する、請求項８の方法。
  10. 【請求項１０】DNAポリメラーゼが、エセリシア・コリD
    NAポリメラーゼ−Ｉ、エセリシア・コリDNAポリメラー
    ゼ−Ｉのクルノウ断片、T4DNAポリメラーゼ、逆転写酵
    素からなる群から選択され、DNAリガーゼがエセリシア
    ・コリDNAリガーゼ又はT4DNAリガーゼからなる群から選
    択される、請求項８の方法。
  11. 【請求項１１】DNAポリメラーゼが熱安定性である、請
    求項８の方法。
  12. 【請求項１２】DNAリガーゼが熱安定性である、請求項
    ８の方法。
  13. 【請求項１３】熱安定性ポリメラーゼ及びリガーゼは好
    熱性細菌から分離される、請求項８の方法。
  14. 【請求項１４】オリゴヌクレオチド及び／又はデオキシ
    リボヌクレオチド三リン酸を エキソヌクレアーゼ活性に対し耐性であるように修飾す
    る、請求項１の方法。
  15. 【請求項１５】試料中の特異的核酸標的分子を増幅する
    ことにより、該特異的核酸標的分子を検出する方法であ
    って、 （ａ）試料を、標的分子の各鎖に関し過剰の少なくとも
    ２つのオリゴヌクレオチドで、ハイブリッド形成条件下
    に処理すること、 ｉ）ここでオリゴヌクレオチドは、標的分子の各鎖に十
    分に相補的となるように選択して、それとハイブリッド
    形成条件下でハイブリッド形成し、 ii）２つのオリゴヌクレオチドが標的分子の１の鎖にハ
    イブリッド形成する場合において、１より多い塩基のギ
    ャップが２つのオリゴヌクレオチド間に存在し、 iii）オリゴヌクレオチドは、その間のギャップが、そ
    のギャップを充たすために４種より少ない種類の塩基を
    必要とするように選択され、 （ｂ）段階（ａ）で形成されたギャップを、ギャップ中
    の塩基に相補的な塩基で充たし、ギャップを充たす塩基
    を互いに及び２つの隣接するハイブリッド形成したオリ
    ゴヌクレオチドと結合して結合オリゴヌクレオチド生成
    物を生成させ、 （ｃ）段階（ｂ）のハイブリッド形成した結合オリゴヌ
    クレオチド生成物を変性条件下処理して、結合オリゴヌ
    クレオチド生成物を標的分子から分離し、１本鎖分子を
    生成すること、 （ｄ）段階（ｃ）で生成した１本鎖分子を、過剰の少な
    くとも２つのオリゴヌクレオチド補体対でハイブリッド
    形成条件下に処理し、 ｉ）ここで各オリゴヌクレオチド補体対は、互いに、標
    的分子の各鎖に、及び結合オリゴヌクレオチド生成物に
    十分に相補的となるように選択し、それらとハイブリッ
    ド形成条件下でハイブリッド形成する２つのオリゴヌク
    レオチドからなり、 ii）２つのオリゴヌクレオチドが標的分子の各鎖にハイ
    ブリッド形成する場合において、１より多い塩基のギャ
    ップが２つのオリゴヌクレオチド間に存在し、 iii）オリゴヌクレオチドは、その間のギャップが、そ
    のギャップを充たすために４種より少ない種類の塩基を
    必要とするように選択され、 （ｅ）段階（ｄ）で形成されたギャップを、ギャップ中
    の塩基に相補的な塩基で充たし、ギャップを充たす塩基
    を互いに及び隣接するハイブリッド形成したオリゴヌク
    レオチドと結合させ、これにより付加的結合オリゴヌク
    レオチド生成物を生成させ、標的分子を増幅させるこ
    と、及び （ｆ）結合オリゴヌクレオチド生成物を検出すること、 の段階を含む。
  16. 【請求項１６】核酸又は核酸混合物を含む試料中の核酸
    標的又はその一部を増幅し、或いは試料中の少なくとも
    ２つの異なる核酸配列間を区別することにより、少なく
    とも１つの特異的核酸標的の存在又は不存在を検出する
    工程であって、試料は標的配列を含んでいると推測さ
    れ、 （ａ）試料を、少なくとも２つのオリゴヌクレオチド
    で、ハイブリッド形成条件下、標的配列の各鎖に関して
    処理し（ここでオリゴヌクレオチドは標的配列又はその
    一部の各鎖に対し十分相補であるように選択される）、
    それとハイブリッド形成させ、ここでオリゴヌクレオチ
    ドは、オリゴヌクレオチドの少なくとも一端で光活性化
    しうる基に付着し、両方のオリゴヌクレオチドが標的配
    列又はその一部にハイブリッド形成するとき、オリゴヌ
    クレオチドの一端における光活性化しうる基は、他のオ
    リゴヌクレオチドの末端における光活性化しうる基に付
    着する、 （ｂ）段階（ａ）後、標的配列又はその一部の鎖にハイ
    ブリッド形成したオリゴヌクレオチドを、光活性化しう
    る基を活性下することにより互いに結合させて隣接した
    光活性化しうる基と結合を形成させ、これにより結合オ
    リゴヌクレオチド生成物を形成させる、 （ｃ）標的配列又はその一部が試料中に存在する場合、
    試料を変性条件下処理して、結合オリゴヌクレオチド生
    成物を標的配列又はその一部から分離する、 （ｄ）試料を少なくとも２つのオリゴヌクレオチド補体
    対で処理し（ここに各オリゴヌクレオチド補体対は、互
    いに、標的配列又はその一部の各鎖に、及び結合オリゴ
    ヌクレオチド生成物に十分相補であるように選択された
    ２つのオリゴヌクレオチドを含む）、それとハイブリッ
    ド形成させ、各オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオ
    チドの少なくとも一端における光活性化しうる基に付着
    し、両方のオリゴヌクレオチドが標的配列又はその一部
    にハイブリッド形成するとき、１つのオリゴヌクレオチ
    ドの末端における光活性化しうる基は他のオリゴヌクレ
    オチドの末端における光活性化しうる基と結合する、 （ｅ）標的配列又はその一部の鎖にハイブリッド形成し
    た、及び段階（ｂ）で形成した結合オリゴヌクレオチド
    生成物にハイブリッド形成したオリゴヌクレオチドを、
    光活性化しうる基を活性化させることにより互いに結合
    させて隣接した光活性化しうる基と結合を形成させ、こ
    れにより付加的結合オリゴヌクレオチド生成物を形成さ
    せて、標的配列又はその一部を増幅させ、そして （ｆ）結合オリゴヌクレオチド生成物を検出する 段階を含む。
  17. 【請求項１７】段階（ｅ）のハイブリッド形成オリゴヌ
    クレオチドを変性条件下で処理してハイブリッド形成オ
    リゴヌクレオチドを分離し、そして一本鎖分子を生成さ
    せる段階（ｅ′）を含み、段階（ｄ）、（ｅ）及び
    （ｅ′）を所望回数繰り返す、請求項16の方法。
  18. 【請求項１８】オリゴヌクレオチド補体対が、核酸標的
    配列又はその一部当り105ないし1015対の範囲でモル過
    剰として存在する、請求項16の方法。
  19. 【請求項１９】光活性化しうる基が、プロラレン類、 （式中、ＺはＨ、メトキシ、アセトキシ、C1−C5アルキ
    ル、ハロゲン及びこれらの基のジ又はトリ誘導体であ
    る） （式中、ＺはＨ、CN、アルキル又はハロゲンである） （式中、ＺはＨ、CN、アルキル、ハロゲン、CO2H又はア
    ルキルエステルである） （式中、ＺはＨ、CN、−Ｏ−アルキル、ハロゲン又はカ
    ルボキシである）及び （式中、ＺはＨ、CN、アルキル、ハロゲン又はカルボキ
    シである） からなる基から選択される、請求項16の方法。
  20. 【請求項２０】核酸又は核酸の混合物を含む試料中の、
    少なくとも１つの特異的核酸標的分子又はその一部の存
    在又は非存在を決定し、又は試料中の少なくとも２つの
    異なる核酸分子の間を区別するキットであって、試料は
    標的分子を含有すると推測され、 少なくとも２つのオリゴヌクレオチド補体対を含む少な
    くとも１つの容器、 ｉ）ここで各オリゴヌクレオチド補体対は、互いに、標
    的分子の各鎖に、及び結合オリゴヌクレオチド生成物に
    十分に相補的となるように選択し、それらとハイブリッ
    ド形成条件下でハイブリッド形成する２つのオリゴヌク
    レオチドからなり、 ii）２つのオリゴヌクレオチドが標的分子の各鎖にハイ
    ブリッド形成する場合において、１またはそれ以上の塩
    基のギャップが２つのオリゴヌクレオチド間に存在し、 iii）オリゴヌクレオチドは、その間のギャップが、そ
    のギャップを充たすために４種より少ない種類の塩基を
    必要とするように選択され、 試料を、ハイブリッド形成条件下、オリゴヌクレオチド
    補体対と混合する手段 試料とオリゴヌクレオチド補体対を混合後、両方のオリ
    ゴヌクレオチドが核酸の同一鎖にハイブリッド形成する
    と、結合オリゴヌクレオチド生成物を形成するため、第
    １のオリゴヌクレオチド補体対からのオリゴヌクレオチ
    ドを、第２のオリゴヌクレオチド補体対からのオリゴヌ
    クレオチドに結合する手段 及び結合オリゴヌクレオチド生成物を検出する手段 を含む。
  21. 【請求項２１】オリゴヌクレオチドがオリゴデオキシリ
    ポヌクレオチドであり、請求項20のキット。
  22. 【請求項２２】第１のオリゴヌクレオチド補体対からの
    オリゴヌクレオチドを、第２の補体対からのオリゴヌク
    レオチドに結合する手段が、DNAポリメラーゼ、DNAリガ
    ーゼ及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸を含む、請
    求項21のキット。
  23. 【請求項２３】DNAポリメラーゼが、エセリシア・コリD
    NAポリメラーゼ−Ｉ、エセリシア・コリDNAポリメラー
    ゼ−Ｉのクルノウ断片、T4 DNAポリメラーゼ、逆転写
    酵素からなる群から選択され、リガーゼがエセリシア・
    コリリガーゼ又はT4 DNAリガーゼからなる群から選択
    される、請求項22のキット。
  24. 【請求項２４】DNAポリメラーゼ及びDNAリガーゼが熱安
    定性である、請求項22のキット。
  25. 【請求項２５】DNAポリメラーゼ及びDNAリガーゼが重合
    性支持体に固定される、請求項22のキット。
  26. 【請求項２６】デオキシリボヌクレオチド三リン酸が標
    識されている、請求項22のキット。
  27. 【請求項２７】結合オリゴヌクレオチド生成物を検出す
    る手段が標識デオキシリボヌクレオチド三リン酸を検出
    する、請求項26のキット。
  28. 【請求項２８】各オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレ
    オチドが標的配列又はその一部にハイブリッド形成する
    場合、他のオリゴヌクレオチドの末端における他の光活
    性化しうる基に付着するオリゴヌクレオチドの末端にお
    ける光活性化しうる基に付着する、請求項20のキット。
  29. 【請求項２９】第１のオリゴヌクレオチド補体対からの
    オリゴヌクレオチドを第２の補体対からのオリゴヌクレ
    オチドに結合する手段が、200nmないし500nm波長の範囲
    で に励起できる照射線照射源を含む、請求項28のキット。
  30. 【請求項３０】照射線照射源が300nmないし400nm波長の
    範囲で に励起できる、請求項29のキット。
  31. 【請求項３１】放射線照射源が近U.V.光又は紫外レーザ
    ーパルスである、請求項29のキット。
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