JP3021036B2 - 核酸配列又はその中の変化の検出 - Google Patents
核酸配列又はその中の変化の検出Info
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- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、物質中の特定のポリヌクレオチド配列の検
出方法、複数もしくは多数の異なるポリヌクレオチド配
列を有する物質中の、少なくとも２つの異なる特定のポ
リヌクレオチド配列の検出方法、特定のヌクレオチド又
は塩基が、特定のポリヌクレオチド配列中の特定の位置
にあるか否かの検出方法、同一又は異なる特定のヌクレ
オチド又は塩基が、複数もしくは多数の異なるポリヌク
レオチド配列を有する物質中の、少なくとも２つの異な
る特定のポリヌクレオチド配列中の特定の位置に存在す
るか否かの検出方法、複数もしくは多数の異なるポリヌ
クレオチド配列を有する物質中の、少なくとも２つの異
なる特定のポリヌクレオチド配列の存在を検出するため
のスクリーニング方法、及び特定のヌクレオチド又は塩
基が、複数もしくは多数の異なるポリヌクレオチド配列
を有する物質中の少なくとも２つの異なる特定のポリヌ
クレオチド配列中の特定の位置に存在するか否かを検出
するためのスクリーニング方法に関する。
出方法、複数もしくは多数の異なるポリヌクレオチド配
列を有する物質中の、少なくとも２つの異なる特定のポ
リヌクレオチド配列の検出方法、特定のヌクレオチド又
は塩基が、特定のポリヌクレオチド配列中の特定の位置
にあるか否かの検出方法、同一又は異なる特定のヌクレ
オチド又は塩基が、複数もしくは多数の異なるポリヌク
レオチド配列を有する物質中の、少なくとも２つの異な
る特定のポリヌクレオチド配列中の特定の位置に存在す
るか否かの検出方法、複数もしくは多数の異なるポリヌ
クレオチド配列を有する物質中の、少なくとも２つの異
なる特定のポリヌクレオチド配列の存在を検出するため
のスクリーニング方法、及び特定のヌクレオチド又は塩
基が、複数もしくは多数の異なるポリヌクレオチド配列
を有する物質中の少なくとも２つの異なる特定のポリヌ
クレオチド配列中の特定の位置に存在するか否かを検出
するためのスクリーニング方法に関する。
背景技術 現在、ポリヌクレオチド配列の最も一般的な検出方法
は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドプローブ
を用いるハイブリダイゼーション（ハイブリッド形成）
である。この技法では、標的となる核酸を、通常、セル
ロース又はナイロンのような固体支持体と不可逆的に結
合させる。次に、標識化プローブをハイブリダイジング
（ハイブリッド形成）条件下で溶液中に付加し、プロー
ブと標的核酸との間に塩基配列のホモロジーが認められ
る場合には、プローブは標的となるポリヌクレオチドと
のハイブリッド分子を生成する。このハイブリッドは種
々の方法で、例えば放射能標識又はビオチン標識によっ
て検出される。この方法の欠点は、第一に、オペレータ
ーのかなりの専門技術を要することであり、第二に、そ
の技術が冗長で、時間がかかり、第三に容易に自動化で
きないことである。全操作にはしばしば48時間以上を要
する。
は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドプローブ
を用いるハイブリダイゼーション（ハイブリッド形成）
である。この技法では、標的となる核酸を、通常、セル
ロース又はナイロンのような固体支持体と不可逆的に結
合させる。次に、標識化プローブをハイブリダイジング
（ハイブリッド形成）条件下で溶液中に付加し、プロー
ブと標的核酸との間に塩基配列のホモロジーが認められ
る場合には、プローブは標的となるポリヌクレオチドと
のハイブリッド分子を生成する。このハイブリッドは種
々の方法で、例えば放射能標識又はビオチン標識によっ
て検出される。この方法の欠点は、第一に、オペレータ
ーのかなりの専門技術を要することであり、第二に、そ
の技術が冗長で、時間がかかり、第三に容易に自動化で
きないことである。全操作にはしばしば48時間以上を要
する。
試料中の特定の核酸を検出するために一般に用いられ
る液体−固体法としては、サザンブロット、ノーザンブ
ロット、及びドットブロットハイブリダイゼーションが
挙げられる。これらの方法は、時間がかかり、非能率的
で、技術的に多くを要し、そして容易に自動化できな
い。サザン及びノーザンブロットの操作法は、ゲルから
ペーパーへの核酸のトランスファーが非能率的であると
いうさらなる欠点を有する。その他の群は液体−固体ハ
イブリダイゼーションを用いたが、その場合、捕獲プロ
ーブは固体支持体と結合し、試料中の問題のDNA配列は
捕獲プローブと結合するようになる。この例は、オース
トラリア国特許第AU−70152/87号に記載されていて、こ
の場合は少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプローブ
を用い、これは標的のプローブをアニールするための液
体ハイブリダイゼーションフォーマット中の、同一標的
核酸の相互排他的領域と相補的であって、それが存在す
る場合、並びにプローブの１つにより２つのプローブ標
的のサンドイッチの固定化により標的の存在を検出し、
その後その他のプローブを検出する。しかしながらこの
方法は、問題のDNA配列にハイブリダイズするための第
二のディテクタープローブを必要とする。この工程は検
定の特異性を低減し、その結果としてバックグラウンド
を増大する。本発明は、捕獲プローブとして及びディテ
クタープローブとして作用するプローブを１つだけ包含
することによりこの問題を克服する。
る液体−固体法としては、サザンブロット、ノーザンブ
ロット、及びドットブロットハイブリダイゼーションが
挙げられる。これらの方法は、時間がかかり、非能率的
で、技術的に多くを要し、そして容易に自動化できな
い。サザン及びノーザンブロットの操作法は、ゲルから
ペーパーへの核酸のトランスファーが非能率的であると
いうさらなる欠点を有する。その他の群は液体−固体ハ
イブリダイゼーションを用いたが、その場合、捕獲プロ
ーブは固体支持体と結合し、試料中の問題のDNA配列は
捕獲プローブと結合するようになる。この例は、オース
トラリア国特許第AU−70152/87号に記載されていて、こ
の場合は少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプローブ
を用い、これは標的のプローブをアニールするための液
体ハイブリダイゼーションフォーマット中の、同一標的
核酸の相互排他的領域と相補的であって、それが存在す
る場合、並びにプローブの１つにより２つのプローブ標
的のサンドイッチの固定化により標的の存在を検出し、
その後その他のプローブを検出する。しかしながらこの
方法は、問題のDNA配列にハイブリダイズするための第
二のディテクタープローブを必要とする。この工程は検
定の特異性を低減し、その結果としてバックグラウンド
を増大する。本発明は、捕獲プローブとして及びディテ
クタープローブとして作用するプローブを１つだけ包含
することによりこの問題を克服する。
液体−固体ハイブリダイゼーションに対比して、液体
−液体ハイブリダイゼーションは、標的配列に対するプ
ローブの接触がより大きいために、非常に迅速な反応速
度を有し、感度を改良する。例えば、Gene−Probe Inc
は、DNA配列を検出するために液体ハイブリダイゼーシ
ョンヒドロキシアパタイト法を用いる。このシステムの
主な欠点は、余分のプローブからのハイブリッドの配列
特異的分離というよりむしろ、１本鎖DNA配列からの２
本鎖DNAの吸着的識別による。本発明は、核酸ハイブリ
ダイゼーションを溶液中で起こし、その後、固体支持マ
トリックス上へ“ハイブリッド”分子を除去することに
よって、これらの欠点を克服する。液体ハイブリダイゼ
ーションの別の利点としては、支持体−結合プローブが
同一の捕獲分子で標識化される場合は、一般の固体支持
体が多数の標的に対して働くことが考えられる。
−液体ハイブリダイゼーションは、標的配列に対するプ
ローブの接触がより大きいために、非常に迅速な反応速
度を有し、感度を改良する。例えば、Gene−Probe Inc
は、DNA配列を検出するために液体ハイブリダイゼーシ
ョンヒドロキシアパタイト法を用いる。このシステムの
主な欠点は、余分のプローブからのハイブリッドの配列
特異的分離というよりむしろ、１本鎖DNA配列からの２
本鎖DNAの吸着的識別による。本発明は、核酸ハイブリ
ダイゼーションを溶液中で起こし、その後、固体支持マ
トリックス上へ“ハイブリッド”分子を除去することに
よって、これらの欠点を克服する。液体ハイブリダイゼ
ーションの別の利点としては、支持体−結合プローブが
同一の捕獲分子で標識化される場合は、一般の固体支持
体が多数の標的に対して働くことが考えられる。
試料中の特定の核酸を検出するために、２つのオリゴ
ヌクレオチドの組み合わせを用いる場合がいくつかある
（オーストラリア国特許第AU−Ａ−70152/87号、AU−Ａ
−26755/88号、AU−Ａ−53105/86号、AU−Ｂ−89575/82
号、及びAU−Ａ−80097/87号）。これらは全て、標的上
のDNAの２つの短い配列を用いる必要がある。これらの
配列は両者とも、全ての考え得る標的中に含まれねばな
らず、相互に排他的且つ非重複でなければならず、そし
て同一条件下で両プローブをそれらの相補的配列にハイ
ブリダイズし得るよう、同様なＧ＋Ｃ比を持たねばなら
ない。
ヌクレオチドの組み合わせを用いる場合がいくつかある
（オーストラリア国特許第AU−Ａ−70152/87号、AU−Ａ
−26755/88号、AU−Ａ−53105/86号、AU−Ｂ−89575/82
号、及びAU−Ａ−80097/87号）。これらは全て、標的上
のDNAの２つの短い配列を用いる必要がある。これらの
配列は両者とも、全ての考え得る標的中に含まれねばな
らず、相互に排他的且つ非重複でなければならず、そし
て同一条件下で両プローブをそれらの相補的配列にハイ
ブリダイズし得るよう、同様なＧ＋Ｃ比を持たねばなら
ない。
問題の核酸配列を検出し、ハイブリッドを固体支持マ
トリックスと結合させることによって、溶液からそれを
除去するための捕獲プローブの使用に関して、関連のあ
る従来技術が存在する（オーストラリア国特許第AU−Ａ
−70152/87号、AU−Ａ−53105/86号、AU−Ａ−21781/88
号、AU−Ａ−69724/87号、AU−Ａ−14005/88号）。しか
しながら、これらの技法は、別々の捕獲及びディテクタ
ープローブを用い、上記に詳述したような多数の欠点を
生じる。本発明は、単一の捕獲／ディテクタープローブ
系を用いることによりこれらの問題を克服する。
トリックスと結合させることによって、溶液からそれを
除去するための捕獲プローブの使用に関して、関連のあ
る従来技術が存在する（オーストラリア国特許第AU−Ａ
−70152/87号、AU−Ａ−53105/86号、AU−Ａ−21781/88
号、AU−Ａ−69724/87号、AU−Ａ−14005/88号）。しか
しながら、これらの技法は、別々の捕獲及びディテクタ
ープローブを用い、上記に詳述したような多数の欠点を
生じる。本発明は、単一の捕獲／ディテクタープローブ
系を用いることによりこれらの問題を克服する。
非放射性リポーター分子をDNAに結合する、有用な多
数の例があり、特定のハイブリッドの検出が可能となっ
ている。しかしながら、検出のためにビオチンをDNA分
子中に包含させる場合は、標的分子当たり数個のビオチ
ン分子を包含可能である（それにより検出の感度を増大
する）としても、包含ビオチンを可視化する機序は複雑
で時間がかかる。
数の例があり、特定のハイブリッドの検出が可能となっ
ている。しかしながら、検出のためにビオチンをDNA分
子中に包含させる場合は、標的分子当たり数個のビオチ
ン分子を包含可能である（それにより検出の感度を増大
する）としても、包含ビオチンを可視化する機序は複雑
で時間がかかる。
対照してみると、その他の非放射性リポーターの分子
（例えば蛍光、発光、化学発光分子）を包含すると、標
的配列を迅速且つ簡単に検出できる。しかしながら本技
術は、単一リポーター分子を各標的配列に結合させるだ
けである。この事実は、最終検定の全体的感度を低減す
る。本発明は、簡単、迅速な検出のために化学発光検出
系を用いることにより、そしてさらに、各標的中にいく
つかのディテクター分子を導入し、検定感度を有意に増
大することによって、一度にこれらの問題を克服する。
（例えば蛍光、発光、化学発光分子）を包含すると、標
的配列を迅速且つ簡単に検出できる。しかしながら本技
術は、単一リポーター分子を各標的配列に結合させるだ
けである。この事実は、最終検定の全体的感度を低減す
る。本発明は、簡単、迅速な検出のために化学発光検出
系を用いることにより、そしてさらに、各標的中にいく
つかのディテクター分子を導入し、検定感度を有意に増
大することによって、一度にこれらの問題を克服する。
したがって、液体ハイブリダイゼーションの迅速な反
応を利用し、分析のため単一のプローブを必要とするだ
けで、そして安定したハイブリッドを生じ、検出される
配列から非ハイブリッド化物質を容易に除去する簡単な
方法が求められる。したがって本発明は、単一プローブ
が問題の配列にハイブリダイズし、次に共有結合により
伸長して安定したハイブリッドを生成する、液体ハイブ
リダイゼーション系を提供する。このハイブリッドを支
持マトリックスで捕獲し、次いで洗浄して、非ハイブリ
ッド化物質を除去する。本発明に記載の系は、簡単、迅
速、高感度で、肉眼で又は簡単なプレートリーダーで読
み取れ、そして容易に自動化できる。
応を利用し、分析のため単一のプローブを必要とするだ
けで、そして安定したハイブリッドを生じ、検出される
配列から非ハイブリッド化物質を容易に除去する簡単な
方法が求められる。したがって本発明は、単一プローブ
が問題の配列にハイブリダイズし、次に共有結合により
伸長して安定したハイブリッドを生成する、液体ハイブ
リダイゼーション系を提供する。このハイブリッドを支
持マトリックスで捕獲し、次いで洗浄して、非ハイブリ
ッド化物質を除去する。本発明に記載の系は、簡単、迅
速、高感度で、肉眼で又は簡単なプレートリーダーで読
み取れ、そして容易に自動化できる。
核酸ハイブリダイゼーションのこの領域では、２つの
広範な種類の：即ち感染性及び遺伝的な疾患を検出する
必要がある。感染性疾患に関しては、サルモネラ菌、ナ
イセリア菌のような細菌、クラミジア及びリケッチアの
ような寄生性微生物、Ｂ型肝炎のようなウイルス、マラ
リア原虫のような原生動物によって引き起こされる疾患
を検出するために、多数のDNAに基づく系が記載されて
いる。しかしながら、これらは全て、一つ又はそれ以上
の上記の欠点を蒙る。
広範な種類の：即ち感染性及び遺伝的な疾患を検出する
必要がある。感染性疾患に関しては、サルモネラ菌、ナ
イセリア菌のような細菌、クラミジア及びリケッチアの
ような寄生性微生物、Ｂ型肝炎のようなウイルス、マラ
リア原虫のような原生動物によって引き起こされる疾患
を検出するために、多数のDNAに基づく系が記載されて
いる。しかしながら、これらは全て、一つ又はそれ以上
の上記の欠点を蒙る。
突然変異（欠失、挿入、点突然変異又は転位）を特徴
とする遺伝的疾患に関しては、その技術は余り十分に開
発されてはいない。これらの種類の疾患は、制限酵素断
片多型（RFLP）分析を用いることにより、又は短いオリ
ゴヌクレオチドプローブの正確なハイブリダイゼーショ
ンによって、一般に診断される。RFLP検出は、制限酵素
部位が突然変異によって変えられることが必要である
が、これは常にそうであるわけではない。さらにRFLP分
析は検出のために、サザンブロットハイブリダイゼーシ
ョンを用いる必要がある。点突然変異を検出する短いオ
リゴヌクレオチドプローブの使用も、いくつかの重大な
欠点を有する。特に、単一の塩基対不適合がハイブリダ
イゼーションを結果的に生じないことを確実にするため
に、ハイブリダイゼーション条件は正確でなければなら
ない。実際、塩濃度及び温度はハイブリダイゼーション
条件の特異性を決定し、これらは要求される正確さに容
易に制御されない。本発明は、サザンハイブリダイゼー
ション分析、及びハイブリダイゼーション条件の正確な
制御の必要を克服する。本発明は、突然変異に隣接する
遺伝子の一定の切片にハイブリダイズし、酵素即ちDNA
ポリメラーゼがDNA鎖をヌクレオチド又は塩基突然変異
を含めてそこまで延長させる、特定のプライマープロー
ブによって、これを達成する。ポリメラーゼ反応に付加
される、ジデオキシヌクレオチドの操作により、考え得
るヌクレオチド変化の全てを検出できる。
とする遺伝的疾患に関しては、その技術は余り十分に開
発されてはいない。これらの種類の疾患は、制限酵素断
片多型（RFLP）分析を用いることにより、又は短いオリ
ゴヌクレオチドプローブの正確なハイブリダイゼーショ
ンによって、一般に診断される。RFLP検出は、制限酵素
部位が突然変異によって変えられることが必要である
が、これは常にそうであるわけではない。さらにRFLP分
析は検出のために、サザンブロットハイブリダイゼーシ
ョンを用いる必要がある。点突然変異を検出する短いオ
リゴヌクレオチドプローブの使用も、いくつかの重大な
欠点を有する。特に、単一の塩基対不適合がハイブリダ
イゼーションを結果的に生じないことを確実にするため
に、ハイブリダイゼーション条件は正確でなければなら
ない。実際、塩濃度及び温度はハイブリダイゼーション
条件の特異性を決定し、これらは要求される正確さに容
易に制御されない。本発明は、サザンハイブリダイゼー
ション分析、及びハイブリダイゼーション条件の正確な
制御の必要を克服する。本発明は、突然変異に隣接する
遺伝子の一定の切片にハイブリダイズし、酵素即ちDNA
ポリメラーゼがDNA鎖をヌクレオチド又は塩基突然変異
を含めてそこまで延長させる、特定のプライマープロー
ブによって、これを達成する。ポリメラーゼ反応に付加
される、ジデオキシヌクレオチドの操作により、考え得
るヌクレオチド変化の全てを検出できる。
感染性及び遺伝性疾患の検出には、いくつかの種類の
標識化分子を本系に組み入れる必要がある。種々の放射
性アイソトープ又は放射能標識化化合物が、標識として
用い得る。しかしながら、放射性標識には、（ｉ）危険
である、（ii）高価である、（iii）貯蔵期間が限られ
ている、（iv）生じたシグナルを測定するのに高価な装
置を要するといったことを含めていくつかの欠点があ
る。近年、一連の非放射性物質が、DNA分子を検出する
ために用いられている。非放射性標識の例としては、蛍
光、発光、化学発光、酵素又は免疫性化合物が挙げられ
る。ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン、ラン
タニドキレート化合物、レクチン、及び蛋白質の親和性
に基づく標識を用いてもよい。好ましい検出手段は、分
光器又は光化学による、又は標識部分と、酵素、例えば
アルカリホスファターゼ又はホースラディシュペルオキ
シダーゼを含む、検出可能な変化を生じ得る存在に結合
するポリペプチド、レクチン又は抗体との間の検出可能
な複合体の生成によるものである。
標識化分子を本系に組み入れる必要がある。種々の放射
性アイソトープ又は放射能標識化化合物が、標識として
用い得る。しかしながら、放射性標識には、（ｉ）危険
である、（ii）高価である、（iii）貯蔵期間が限られ
ている、（iv）生じたシグナルを測定するのに高価な装
置を要するといったことを含めていくつかの欠点があ
る。近年、一連の非放射性物質が、DNA分子を検出する
ために用いられている。非放射性標識の例としては、蛍
光、発光、化学発光、酵素又は免疫性化合物が挙げられ
る。ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン、ラン
タニドキレート化合物、レクチン、及び蛋白質の親和性
に基づく標識を用いてもよい。好ましい検出手段は、分
光器又は光化学による、又は標識部分と、酵素、例えば
アルカリホスファターゼ又はホースラディシュペルオキ
シダーゼを含む、検出可能な変化を生じ得る存在に結合
するポリペプチド、レクチン又は抗体との間の検出可能
な複合体の生成によるものである。
しかしながら、目下の技術に欠けているものは、次
の：（ｉ）ポリヌクレオチド配列を検出する迅速な方法
を包含し、（ii）試料中の小さい数の標的配列を検出す
るのに十分な感度を有し、そして（iii）非放射性であ
る、単一系である。現在、これらの用件を満たす単一系
はない。
の：（ｉ）ポリヌクレオチド配列を検出する迅速な方法
を包含し、（ii）試料中の小さい数の標的配列を検出す
るのに十分な感度を有し、そして（iii）非放射性であ
る、単一系である。現在、これらの用件を満たす単一系
はない。
最終的態様としては、試料中の特定のポリヌクレオチ
ド配列を検出する必要性は、（ｉ）簡単なキットフォー
マット中への、又は（ii）自動装置中への全工程の組織
化を要する。キット及び自動化機械がともに抗体による
蛋白質の検出に有用である一方、試料中の特定のポリヌ
クレオチド配列を簡単に、迅速に且つ安価に検出するの
に有用な系はまだない。
ド配列を検出する必要性は、（ｉ）簡単なキットフォー
マット中への、又は（ii）自動装置中への全工程の組織
化を要する。キット及び自動化機械がともに抗体による
蛋白質の検出に有用である一方、試料中の特定のポリヌ
クレオチド配列を簡単に、迅速に且つ安価に検出するの
に有用な系はまだない。
発明の目的 物質中の特定のポリヌクレオチド配列を検出する方法
を提供することが本発明の目的である。
を提供することが本発明の目的である。
別の目的は、多数（複数）の異なるポリヌクレオチド
配列を有する物質中の、少なくとも２つの異なる特定の
ポリヌクレオチド配列を検出する方法を提供することで
ある。
配列を有する物質中の、少なくとも２つの異なる特定の
ポリヌクレオチド配列を検出する方法を提供することで
ある。
さらなる目的は、特定のヌクレオチド又は塩基が、特
定のポリヌクレオチド配列中の特定の位置に存在するか
否かを検出する方法を提供することである。
定のポリヌクレオチド配列中の特定の位置に存在するか
否かを検出する方法を提供することである。
さらに別の目的は、同一又は異なる特定のヌクレオチ
ド又は塩基が、多数（複数）の異なるポリヌクレオチド
配列を有する物質の、少なくとも２つの異なる特定のポ
リヌクレオチド配列中の特定の位置に存在するか否かを
検出する方法を提供することである。
ド又は塩基が、多数（複数）の異なるポリヌクレオチド
配列を有する物質の、少なくとも２つの異なる特定のポ
リヌクレオチド配列中の特定の位置に存在するか否かを
検出する方法を提供することである。
さらに本発明の目的は、多数（複数）の異なるポリヌ
クレオチド配列を有する物質の、少なくとも２つの異な
る特定のポリヌクレオチド配列の存在を検出するための
スクリーニング法を提供することである。
クレオチド配列を有する物質の、少なくとも２つの異な
る特定のポリヌクレオチド配列の存在を検出するための
スクリーニング法を提供することである。
別の目的は、同一又は異なる特定のヌクレオチド又は
塩基が、多数（複数）の異なるポリヌクレオチド配列を
有する物質の少なくとも２つの異なる特定のポリヌクレ
オチド配列中の特定の位置に存在するか否かを検出する
ためのスクリーニング法を提供することである。
塩基が、多数（複数）の異なるポリヌクレオチド配列を
有する物質の少なくとも２つの異なる特定のポリヌクレ
オチド配列中の特定の位置に存在するか否かを検出する
ためのスクリーニング法を提供することである。
発明の開示 以下の略語及び定義は本明細書及び請求の範囲を通じ
て適用される： SP−特異的プライマー：標的となる配列の部分と相補
的なヌクレオチド配列。
て適用される： SP−特異的プライマー：標的となる配列の部分と相補
的なヌクレオチド配列。
標的−試料中の検出すべきヌクレオチド配列：例え
ば、任意のウイルス、カビ、細菌、マイコプラズマ、線
虫、原生動物等を含む任意の感染性又は寄生性生物から
得られる。
ば、任意のウイルス、カビ、細菌、マイコプラズマ、線
虫、原生動物等を含む任意の感染性又は寄生性生物から
得られる。
ポリメラーゼ酵素−任意のDNA依存DNAポリメラーゼ又
はRNA依存DNAポリメラーゼ。
はRNA依存DNAポリメラーゼ。
dNTP−dATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、並びにdITP及び
dUTPである全４つのデオキシリボヌクレオチド。
dUTPである全４つのデオキシリボヌクレオチド。
ddNTP−ddATP、ddCTP、ddGTP、及びddTTP、並びにddI
TPである全４つのジデオキシリボヌクレオチド。
TPである全４つのジデオキシリボヌクレオチド。
Ｄ−ディテクター分子：ヌクレオチド又はヌクレオチ
ド配列と共有的に結合し得る、そして次に直接又は間接
的に検定し得る分子。例えば、ビオチン；炭素、水素、
ヨウ素、燐及び硫黄のラジオアイソトープ；任意の抗
原；ハプテン；フルオレセイン、ローダミン及びエオシ
ンを含む蛍光分子；アルカリホスファターゼ、ペルオキ
シダーゼ及びルシフェラーゼを含む酵素；任意のモノク
ローナル抗体。
ド配列と共有的に結合し得る、そして次に直接又は間接
的に検定し得る分子。例えば、ビオチン；炭素、水素、
ヨウ素、燐及び硫黄のラジオアイソトープ；任意の抗
原；ハプテン；フルオレセイン、ローダミン及びエオシ
ンを含む蛍光分子；アルカリホスファターゼ、ペルオキ
シダーゼ及びルシフェラーゼを含む酵素；任意のモノク
ローナル抗体。
dNTP−Ｄ−４つのデオキシリボヌクレオチドの１つと
共有結合しているディテクター分子。
共有結合しているディテクター分子。
Ｃ−捕獲分子：ヌクレオチド又はヌクレオチド配列と
共有的に結合し得る、そして次に特異的に親和性分子と
結合する分子。例えば、ビオチン（アビジン又はストレ
プトアジビジンと結合する）；抗体（抗原と結合す
る）；抗原（抗体と結合する）。
共有的に結合し得る、そして次に特異的に親和性分子と
結合する分子。例えば、ビオチン（アビジン又はストレ
プトアジビジンと結合する）；抗体（抗原と結合す
る）；抗原（抗体と結合する）。
SAM−特異的親和性分子：特定の捕獲分子と特異的に
結合する分子。例えば、アビジン又はストレプトアビジ
ン；抗体；抗原。
結合する分子。例えば、アビジン又はストレプトアビジ
ン；抗体；抗原。
SS−固体支持体:SAMが結合する任意の固体マトリック
ス。例えば、アガロース；ポリアクリルアミド；磁気ビ
ーズ；ポリスチレン；マイクロタイタープレート；ナイ
ロン；ニトロセルロース。
ス。例えば、アガロース；ポリアクリルアミド；磁気ビ
ーズ；ポリスチレン；マイクロタイタープレート；ナイ
ロン；ニトロセルロース。
洗浄−未反応分子を除去するための溶液の付加及び除
去。
去。
ストリンジェンシー−２つの核酸分子間の水素結合の
安定性に作用する塩及び温度の条件。例えば、水素結合
は、高温又は低温又はその両方を反映する高ストリンジ
ェンシーで最も不安定である。
安定性に作用する塩及び温度の条件。例えば、水素結合
は、高温又は低温又はその両方を反映する高ストリンジ
ェンシーで最も不安定である。
検定−ディテクター分子の検出に特異的であって、定
性的及び定量的に測定可能な任意の操作。
性的及び定量的に測定可能な任意の操作。
Ｘ−４つのデオキシリボヌクレオチドのうちの任意の
１つ。
１つ。
Ｙ−４つのリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレ
オチドのうちの任意の１つ；例えば、ＹはＸと水素結合
する、即ち９つのＹ′のヌクレオチド配列は9X′のヌク
レオチド配列と相補的である。
オチドのうちの任意の１つ；例えば、ＹはＸと水素結合
する、即ち９つのＹ′のヌクレオチド配列は9X′のヌク
レオチド配列と相補的である。
Ｚ−その配列と相補的でない配列を形成する４つのヌ
クレオチドのうちの任意の１つ。
クレオチドのうちの任意の１つ。
ddT−ジデオキシチミジン−５′−トリホスフェート:
ddTは、標的配列中のＡと塩基対を生じる場合の例とし
て用いた。検出すべき塩基がＣである場合には、ddGが
用いられ、Ｇである場合にはddCが、Ｔである場合にはd
dAが用いられる。
ddTは、標的配列中のＡと塩基対を生じる場合の例とし
て用いた。検出すべき塩基がＣである場合には、ddGが
用いられ、Ｇである場合にはddCが、Ｔである場合にはd
dAが用いられる。
ddT−Ｃ−ジデオキシチミジン−５′−トリホスフェ
ート／捕獲分子複合体:ddTは、標的配列中のＡと塩基対
を生じる場合の例として用いた。検出すべき塩基がＣで
ある場合には、ddGが用いられ、Ｇである場合にはddC
が、Ｔである場合にはddAが用いられる。捕獲分子はddT
と共有結合し、そして上記の捕獲分子の任意の１つを示
す。
ート／捕獲分子複合体:ddTは、標的配列中のＡと塩基対
を生じる場合の例として用いた。検出すべき塩基がＣで
ある場合には、ddGが用いられ、Ｇである場合にはddC
が、Ｔである場合にはddAが用いられる。捕獲分子はddT
と共有結合し、そして上記の捕獲分子の任意の１つを示
す。
直接隣接−特定のポリヌクレオチド配列の一部と結合
するプライマーと、検出すべき特定のヌクレオチド又は
塩基との間にヌクレオチド又は塩基がないことを意味す
る。
するプライマーと、検出すべき特定のヌクレオチド又は
塩基との間にヌクレオチド又は塩基がないことを意味す
る。
画分−オリゴヌクレオチドプライマーの反応に起因す
る混合物の少なくとも一部、伸長試薬、特異的ポリヌク
レオチド配列、検出可能要素、及び／又は分離成分を意
味する。
る混合物の少なくとも一部、伸長試薬、特異的ポリヌク
レオチド配列、検出可能要素、及び／又は分離成分を意
味する。
介在配列−特定のポリヌクレオチド配列の一部と結合
するプライマーと、検出すべき特定のヌクレオチド又は
塩基との間の、少なくとも１つのヌクレオチド又は塩基
を意味する。
するプライマーと、検出すべき特定のヌクレオチド又は
塩基との間の、少なくとも１つのヌクレオチド又は塩基
を意味する。
オリゴヌクレオチドプライマー−５〜60ヌクレオチド
の一般長を有するが、しかし検出すべきポリヌクレオチ
ドの一部と相補的な配列を有する200又はそれ以上のヌ
クレオチドであり得る１本鎖核酸分子。
の一般長を有するが、しかし検出すべきポリヌクレオチ
ドの一部と相補的な配列を有する200又はそれ以上のヌ
クレオチドであり得る１本鎖核酸分子。
特定のポリヌクレオチド配列−一部又は全部公知の配
列のヌクレオチド。
列のヌクレオチド。
ハイブリダイゼーション−２本鎖ハイブリッド核酸分
子を生成するためのオリゴヌクレオチドプライマーと標
的ポリヌクレオチド配列の相補的領域との物理的会合。
子を生成するためのオリゴヌクレオチドプライマーと標
的ポリヌクレオチド配列の相補的領域との物理的会合。
干渉検出可能（interfering detectable）及び／又は
分離要素は、例えば、検出すべき特定のヌクレオチド又
は塩基と相補的な位置に組み入れられるものと同一のも
のである。その例を以下に挙げる： （Ａ）特定のポリヌクレオチド配列S1中の検出すべき単
一のヌクレオチド又は塩基N1を考える。S1の一部と相補
的な配列を有し、S1と結合する結合オリゴヌクレオチド
プライマーP1があると仮定する。P1及びN1間に介在ヌク
レオチドNA、NB、及びNCを仮定する。NA、NB、NC及びN1
に相補的な配列、即ちそれぞれND、NE、NF、N2-S1（S1
は分離要素に相当する）でP1をN1を含めてそこまで伸長
する；その場合、以下の条件を要する： （Ｂ）２つの異なる特定のポリヌクレオチド配列S1及び
S2中の検出すべき２つのヌクレオチド又は塩基N1及びN2
を考える。S1及びS2の一部と相補的な配列を有する２つ
の異なるオリゴヌクレオチドプライマーP1及びP2（それ
ぞれS1及びS2に結合する）を仮定する。
分離要素は、例えば、検出すべき特定のヌクレオチド又
は塩基と相補的な位置に組み入れられるものと同一のも
のである。その例を以下に挙げる： （Ａ）特定のポリヌクレオチド配列S1中の検出すべき単
一のヌクレオチド又は塩基N1を考える。S1の一部と相補
的な配列を有し、S1と結合する結合オリゴヌクレオチド
プライマーP1があると仮定する。P1及びN1間に介在ヌク
レオチドNA、NB、及びNCを仮定する。NA、NB、NC及びN1
に相補的な配列、即ちそれぞれND、NE、NF、N2-S1（S1
は分離要素に相当する）でP1をN1を含めてそこまで伸長
する；その場合、以下の条件を要する： （Ｂ）２つの異なる特定のポリヌクレオチド配列S1及び
S2中の検出すべき２つのヌクレオチド又は塩基N1及びN2
を考える。S1及びS2の一部と相補的な配列を有する２つ
の異なるオリゴヌクレオチドプライマーP1及びP2（それ
ぞれS1及びS2に結合する）を仮定する。
P1及びN1間の介在ヌクレオチドNA、NB及びNC、並びに
P2及びN2間の介在ヌクレオチドNX、NY及びNZを仮定す
る。（ａ）NA、NB、NC及びN1に相補的な配列、即ちそれ
ぞれND、NE、NF及びN3-D1（D1は検出可能要素に相当す
る）でP1をN1を含めてそこまで伸長し、（ｂ）NX、NY、
NZ及びN2に相補的な配列即ちそれぞれNO、NP、NQ及びN
4-D2（D2は別の検出可能要素に相当する）でP2をN2を含
めてそこまで伸長する；その場合、以下の条件を要す
る： N1がN2と等しくなく、D1＝D2である場合には、 N1がN2と等しくなく、D1がD2と等しくない場合には、 本発明の第一の態様によれば、以下の： ａ）物質を、特定のポリヌクレオチド配列の一部と相補
的な配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー（ここ
で、このプライマーは、上記のポリヌクレオチド配列の
上記物質中に存在する場合の一部と結合する）にさら
し； ｂ）ポリヌクレオチド配列と結合したプライマーを伸長
し（ここでいかなる伸長プライマーも検出可能要素及び
／又は分離要素を含有する）； ｃ）上記の伸長プライマーに含有されない検出可能要素
を有しない画分に、伸長プライマーを分け；そして ｄ）上記の伸長プライマーの存在が上記の物質中の特定
のポリヌクレオチド配列の存在を示し、上記の画分中の
上記の伸長プライマーの非存在が上記の物質中の特定の
ポリヌクレオチド配列の非存在を示す、上記の伸長プラ
イマーに関する上記の画分の検定により、伸長プライマ
ーが上記の画分中に存在するか否かを測定する ことから成る、物質中の特定のポリヌクレオチド配列の
検出方法が提供される。
P2及びN2間の介在ヌクレオチドNX、NY及びNZを仮定す
る。（ａ）NA、NB、NC及びN1に相補的な配列、即ちそれ
ぞれND、NE、NF及びN3-D1（D1は検出可能要素に相当す
る）でP1をN1を含めてそこまで伸長し、（ｂ）NX、NY、
NZ及びN2に相補的な配列即ちそれぞれNO、NP、NQ及びN
4-D2（D2は別の検出可能要素に相当する）でP2をN2を含
めてそこまで伸長する；その場合、以下の条件を要す
る： N1がN2と等しくなく、D1＝D2である場合には、 N1がN2と等しくなく、D1がD2と等しくない場合には、 本発明の第一の態様によれば、以下の： ａ）物質を、特定のポリヌクレオチド配列の一部と相補
的な配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー（ここ
で、このプライマーは、上記のポリヌクレオチド配列の
上記物質中に存在する場合の一部と結合する）にさら
し； ｂ）ポリヌクレオチド配列と結合したプライマーを伸長
し（ここでいかなる伸長プライマーも検出可能要素及び
／又は分離要素を含有する）； ｃ）上記の伸長プライマーに含有されない検出可能要素
を有しない画分に、伸長プライマーを分け；そして ｄ）上記の伸長プライマーの存在が上記の物質中の特定
のポリヌクレオチド配列の存在を示し、上記の画分中の
上記の伸長プライマーの非存在が上記の物質中の特定の
ポリヌクレオチド配列の非存在を示す、上記の伸長プラ
イマーに関する上記の画分の検定により、伸長プライマ
ーが上記の画分中に存在するか否かを測定する ことから成る、物質中の特定のポリヌクレオチド配列の
検出方法が提供される。
本発明の第二の態様によれば、以下の： ａ）上記の物質を、各々が、上記の異なる特定のポリヌ
クレオチド配列の一部と相補的な配列を有する、少なく
とも２つの異なる特定のポリヌクレオチドプライマー
（ここで、上記のプライマーは各々、上記の物質中に存
在する場合、上記の異なる特定のポリヌクレオチド配列
の一方の一部分と結合し、上記のオリゴヌクレオチドプ
ライマーは各々、上記のオリゴヌクレオチドプライマー
の他方に対して異なる特定のポリヌクレオチド配列の一
部分と結合する）にさらし； ｂ）各々異なる特定のポリヌクレオチド配列と結合する
上記の異なるオリゴヌクレオチドプライマーを伸長し
（ここで伸長プライマーは検出可能要素及び／又は分離
要素を含有する）； ｃ）上記の伸長プライマーに含有されない検出可能要素
を有しない少なくとも一つの画分に、伸長プライマーを
分け；そして ｄ）上記の伸長プライマーの存在が上記の物質中の少な
くとも一つの異なる特定のポリヌクレオチド配列の存在
を示し、上記画分中の上記伸長プライマーの非存在が上
記の物質中の少なくとも一つの異なる特定のポリヌクレ
オチド配列の非存在を示す、少なくとも一つの上記の伸
長プライマーについての上記画分の検定により、伸長プ
ライマーが上記画分中に存在するか否かを測定する ことから成る、複数もしくは多数の異なるポリヌクレオ
チド配列を有する物質中の、少なくとも２つの異なる特
定のポリヌクレオチド配列の検出方法が提供される。
クレオチド配列の一部と相補的な配列を有する、少なく
とも２つの異なる特定のポリヌクレオチドプライマー
（ここで、上記のプライマーは各々、上記の物質中に存
在する場合、上記の異なる特定のポリヌクレオチド配列
の一方の一部分と結合し、上記のオリゴヌクレオチドプ
ライマーは各々、上記のオリゴヌクレオチドプライマー
の他方に対して異なる特定のポリヌクレオチド配列の一
部分と結合する）にさらし； ｂ）各々異なる特定のポリヌクレオチド配列と結合する
上記の異なるオリゴヌクレオチドプライマーを伸長し
（ここで伸長プライマーは検出可能要素及び／又は分離
要素を含有する）； ｃ）上記の伸長プライマーに含有されない検出可能要素
を有しない少なくとも一つの画分に、伸長プライマーを
分け；そして ｄ）上記の伸長プライマーの存在が上記の物質中の少な
くとも一つの異なる特定のポリヌクレオチド配列の存在
を示し、上記画分中の上記伸長プライマーの非存在が上
記の物質中の少なくとも一つの異なる特定のポリヌクレ
オチド配列の非存在を示す、少なくとも一つの上記の伸
長プライマーについての上記画分の検定により、伸長プ
ライマーが上記画分中に存在するか否かを測定する ことから成る、複数もしくは多数の異なるポリヌクレオ
チド配列を有する物質中の、少なくとも２つの異なる特
定のポリヌクレオチド配列の検出方法が提供される。
本発明の第三の態様によれば、以下の： ａ）上記の物質を、特定のポリヌクレオチド配列の一部
と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー
（ここで、特定の位置に直接隣接する、上記の物質中の
上記の特定のポリヌクレオチド配列の一部と結合する）
にさらし； ｂ）特定のポリヌクレオチド配列と結合するプライマー
を伸長し（但し、上記の特定のヌクレオチド又は塩基が
特定のポリヌクレオチド配列中の特定の位置にある場
合、結合プライマーは上記の特定のヌクレオチド又は塩
基を含めてそこまで伸長されるだけである。この場合、
伸長プライマーは、上記の特定のヌクレオチド又は塩基
と相補的な位置に検出可能要素及び／又は分離要素を有
する）； ｃ）上記の伸長プライマーに含有されない検出可能要素
を有しない画分に、伸長プライマーを分け；そして ｄ）上記の伸長プライマーの存在が、特定のヌクレオチ
ド又は塩基が特定のポリヌクレオチド配列中の特定の位
置にあることを示し、上記の伸長プライマーの非存在
が、特定のヌクレオチド又は塩基が特定のポリヌクレオ
チド配列の特定の位置に存在しないことを示す、上記の
伸長プライマーについての上記画分の検定により、伸長
プライマーが上記画分中に存在するか否かを測定する ことから成る、特定のヌクレオチド又は塩基が、物質中
の特定のポリヌクレオチド配列の特定の位置に存在する
か否かを検出する方法が提供される。
と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー
（ここで、特定の位置に直接隣接する、上記の物質中の
上記の特定のポリヌクレオチド配列の一部と結合する）
にさらし； ｂ）特定のポリヌクレオチド配列と結合するプライマー
を伸長し（但し、上記の特定のヌクレオチド又は塩基が
特定のポリヌクレオチド配列中の特定の位置にある場
合、結合プライマーは上記の特定のヌクレオチド又は塩
基を含めてそこまで伸長されるだけである。この場合、
伸長プライマーは、上記の特定のヌクレオチド又は塩基
と相補的な位置に検出可能要素及び／又は分離要素を有
する）； ｃ）上記の伸長プライマーに含有されない検出可能要素
を有しない画分に、伸長プライマーを分け；そして ｄ）上記の伸長プライマーの存在が、特定のヌクレオチ
ド又は塩基が特定のポリヌクレオチド配列中の特定の位
置にあることを示し、上記の伸長プライマーの非存在
が、特定のヌクレオチド又は塩基が特定のポリヌクレオ
チド配列の特定の位置に存在しないことを示す、上記の
伸長プライマーについての上記画分の検定により、伸長
プライマーが上記画分中に存在するか否かを測定する ことから成る、特定のヌクレオチド又は塩基が、物質中
の特定のポリヌクレオチド配列の特定の位置に存在する
か否かを検出する方法が提供される。
本発明の第四の態様によれば、以下の： ａ）上記の物質を少なくとも２つの異なったオリゴヌク
レオチドプライマーにさらし、該異なったオリゴヌクレ
オチドプライマーの各々は、上記の異なった特定のポリ
ヌクレオチド配列の１つの一部と相補的な配列を有し
（ここで、上記のプライマーの各々は、上記物質中に存
在する場合、その相補的ポリヌクレオチド配列と結合
し、上記のオリゴヌクレオチドプライマーの各々は、他
方のプライマーとは異なる特定のポリヌクレオチド配列
の一部分に結合する。さらに上記のプライマーは各々、
特定の位置に直接隣接する上記の物質中のその相補的な
特定のポリヌクレオチド配列と結合する） ｂ）その相補的ポリヌクレオチド配列と結合する上記の
異なるプライマーを伸長し（但し、上記の特定のヌクレ
オチド又は塩基が特定のポリヌクレオチド配列中の特定
の位置にある場合、結合プライマーは各々、特定の位置
を含めてそこまで伸長されるだけである。この場合、上
記の伸長プライマーは各々、上記の特定のヌクレオチド
又は塩基と相補的な地位に検出可能要素及び／又は分離
要素を有する）； ｃ）上記の伸長プライマーに含有されない検出可能要素
を有しない少なくとも一つの画分中の特定の位置の特定
のヌクレオチド又は塩基まで伸長するだけである伸長プ
ライマーを分離し；そして ｄ）伸長プライマーの存在が、特定のヌクレオチド又は
塩基が特定のポリヌクレオチド配列中の特定の位置にあ
ることを示し、画分中の上記の伸長プライマーの非存在
が、少なくとも１つの特定のヌクレオチド又は塩基が少
なくとも１つの異なる特定のポリヌクレオチド配列の特
定の位置に存在しないことを示す、上記の伸長プライマ
ーについての上記画分の検定により、少なくとも１つの
伸長プライマーが上記の画分中に存在するか否かを測定
する ことから成る、同一又は異なる特定のヌクレオチド又は
塩基が、多数（複数）の異なるポリヌクレオチド配列を
有する物質中の少なくとも２つの異なる特定のポリヌク
レオチド配列の特定の位置に存在するか否かを検出する
方法が提供される。
レオチドプライマーにさらし、該異なったオリゴヌクレ
オチドプライマーの各々は、上記の異なった特定のポリ
ヌクレオチド配列の１つの一部と相補的な配列を有し
（ここで、上記のプライマーの各々は、上記物質中に存
在する場合、その相補的ポリヌクレオチド配列と結合
し、上記のオリゴヌクレオチドプライマーの各々は、他
方のプライマーとは異なる特定のポリヌクレオチド配列
の一部分に結合する。さらに上記のプライマーは各々、
特定の位置に直接隣接する上記の物質中のその相補的な
特定のポリヌクレオチド配列と結合する） ｂ）その相補的ポリヌクレオチド配列と結合する上記の
異なるプライマーを伸長し（但し、上記の特定のヌクレ
オチド又は塩基が特定のポリヌクレオチド配列中の特定
の位置にある場合、結合プライマーは各々、特定の位置
を含めてそこまで伸長されるだけである。この場合、上
記の伸長プライマーは各々、上記の特定のヌクレオチド
又は塩基と相補的な地位に検出可能要素及び／又は分離
要素を有する）； ｃ）上記の伸長プライマーに含有されない検出可能要素
を有しない少なくとも一つの画分中の特定の位置の特定
のヌクレオチド又は塩基まで伸長するだけである伸長プ
ライマーを分離し；そして ｄ）伸長プライマーの存在が、特定のヌクレオチド又は
塩基が特定のポリヌクレオチド配列中の特定の位置にあ
ることを示し、画分中の上記の伸長プライマーの非存在
が、少なくとも１つの特定のヌクレオチド又は塩基が少
なくとも１つの異なる特定のポリヌクレオチド配列の特
定の位置に存在しないことを示す、上記の伸長プライマ
ーについての上記画分の検定により、少なくとも１つの
伸長プライマーが上記の画分中に存在するか否かを測定
する ことから成る、同一又は異なる特定のヌクレオチド又は
塩基が、多数（複数）の異なるポリヌクレオチド配列を
有する物質中の少なくとも２つの異なる特定のポリヌク
レオチド配列の特定の位置に存在するか否かを検出する
方法が提供される。
本発明の第五の態様によれば、以下の： ａ）上記の物質を、特定のポリヌクレオチド配列の一部
と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー
（ここで、特定の位置に直接隣接しない上記の物質中の
上記の特定のポリヌクレオチド配列の一部と結合し、そ
れによって特定の位置と、特定のポリヌクレオチド配列
に結合するプライマーとの間に介在配列が存在する）に
さらし； ｂ）結合プライマーを伸長し（但し、上記の特定のヌク
レオチド又は塩基が特定のポリヌクレオチド配列中の特
定の位置にある場合、結合プライマーは上記の特定のヌ
クレオチド又は塩基を含めてそこまで伸長されるだけで
ある。この場合、伸長プライマーは、上記の特定のヌク
レオチド又は塩基と相補的な位置に検出可能要素及び／
又は分離要素を有する。但し介在配列は、介在配列と相
補的であって伸長プライマーに組み込まれるヌクレオチ
ド又は塩基が干渉検出可能及び／又は分離要素の組込み
を引き起こす場合のものではあり得ない）； ｃ）上記の伸長プライマーに含有されない検出可能要素
を有しない画分中の特定の位置の特定のヌクレオチド又
は塩基まで伸長しただけの伸長プライマーを分離し；そ
して ｄ）伸長プライマーの存在が、特定のヌクレオチド又は
塩基が特定のポリヌクレオチド配列中の特定の位置にあ
ることを示し、画分中の上記の伸長プライマーの非存在
が、特定のヌクレオチド又は塩基が特定のポリヌクレオ
チド配列の特定の位置に存在しないことを示す、上記伸
長プライマーについての上記画分の検定により、伸長プ
ライマーが上記画分中に存在するか否かを測定する ことから成る、特定のヌクレオチド又は塩基が、物質中
の特定のポリヌクレオチド配列の特定の位置に存在する
か否かを検出する方法が提供される。
と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー
（ここで、特定の位置に直接隣接しない上記の物質中の
上記の特定のポリヌクレオチド配列の一部と結合し、そ
れによって特定の位置と、特定のポリヌクレオチド配列
に結合するプライマーとの間に介在配列が存在する）に
さらし； ｂ）結合プライマーを伸長し（但し、上記の特定のヌク
レオチド又は塩基が特定のポリヌクレオチド配列中の特
定の位置にある場合、結合プライマーは上記の特定のヌ
クレオチド又は塩基を含めてそこまで伸長されるだけで
ある。この場合、伸長プライマーは、上記の特定のヌク
レオチド又は塩基と相補的な位置に検出可能要素及び／
又は分離要素を有する。但し介在配列は、介在配列と相
補的であって伸長プライマーに組み込まれるヌクレオチ
ド又は塩基が干渉検出可能及び／又は分離要素の組込み
を引き起こす場合のものではあり得ない）； ｃ）上記の伸長プライマーに含有されない検出可能要素
を有しない画分中の特定の位置の特定のヌクレオチド又
は塩基まで伸長しただけの伸長プライマーを分離し；そ
して ｄ）伸長プライマーの存在が、特定のヌクレオチド又は
塩基が特定のポリヌクレオチド配列中の特定の位置にあ
ることを示し、画分中の上記の伸長プライマーの非存在
が、特定のヌクレオチド又は塩基が特定のポリヌクレオ
チド配列の特定の位置に存在しないことを示す、上記伸
長プライマーについての上記画分の検定により、伸長プ
ライマーが上記画分中に存在するか否かを測定する ことから成る、特定のヌクレオチド又は塩基が、物質中
の特定のポリヌクレオチド配列の特定の位置に存在する
か否かを検出する方法が提供される。
本発明の第六の態様によれば、以下の： ａ）上記の物質を、上記の異なる特定のポリヌクレオチ
ド配列の１つの一部と相補的な配列を有する少なくとも
２つの異なるオリゴヌクレオチドプライマー（ここで、
上記のプライマーは特定の位置に直接隣接しないその相
補的ポリヌクレオチド配列と結合し、それによって特定
の位置と、特定のポリヌクレオチド配列に結合するプラ
イマーとの間に介在配列が存在する。上記の物質中に存
在する場合、上記のオリゴヌクレオチドプライマーは各
々、他方のプライマーのものに対して異なる特定のポリ
ヌクレオチド配列の一部と結合する）にさらし； ｂ）その相補的ポリヌクレオチド配列に結合する上記の
異なるオリゴヌクレオチドプライマーを伸長し（ここ
で、上記の特定のヌクレオチド又は塩基が特定のポリヌ
クレオチド配列中の特定の位置にある場合、結合プライ
マーは各々、特定の位置を含めてそこまで伸長されるだ
けである。この場合、上記の伸長プライマーは各々、上
記の特定のヌクレオチド又は塩基と相補的な位置に検出
可能要素及び／又は分離要素を有する。但し介在配列
は、介在配列と相補的であって伸長プライマーに組み込
まれたヌクレオチド又は塩基が干渉検出可能及び／又は
分離要素の組込みを引き起こす場合のものではあり得な
い）； ｃ）上記の伸長プライマーに含有されない検出可能要素
を有しない少なくとも１つの画分に特定の位置の特定の
ヌクレオチド又は塩基まで伸長しただけの任意の伸長プ
ライマーを分け；そして ｄ）伸長プライマーの存在が、少なくとも１つの特定の
ヌクレオチド又は塩基が特定のポリヌクレオチド配列中
の特定の位置にあることを示し、画分中の上記伸長プラ
イマーの非存在が、少なくとも１つの特定のヌクレオチ
ド又は塩基が特定のポリヌクレオチド配列の特定の位置
に存在しないことを示す、上記の伸長プライマーに関す
る上記画分の検定により、伸長プライマーが上記画分中
に存在するか否かを測定する ことから成る、同一又は異なる特定のヌクレオチド又は
塩基が、多数の異なるポリヌクレオチド配列を有する物
質中の少なくとも２つの異なる特定のポリヌクレオチド
配列の特定の位置に存在するか否かを検出する方法が提
供される。
ド配列の１つの一部と相補的な配列を有する少なくとも
２つの異なるオリゴヌクレオチドプライマー（ここで、
上記のプライマーは特定の位置に直接隣接しないその相
補的ポリヌクレオチド配列と結合し、それによって特定
の位置と、特定のポリヌクレオチド配列に結合するプラ
イマーとの間に介在配列が存在する。上記の物質中に存
在する場合、上記のオリゴヌクレオチドプライマーは各
々、他方のプライマーのものに対して異なる特定のポリ
ヌクレオチド配列の一部と結合する）にさらし； ｂ）その相補的ポリヌクレオチド配列に結合する上記の
異なるオリゴヌクレオチドプライマーを伸長し（ここ
で、上記の特定のヌクレオチド又は塩基が特定のポリヌ
クレオチド配列中の特定の位置にある場合、結合プライ
マーは各々、特定の位置を含めてそこまで伸長されるだ
けである。この場合、上記の伸長プライマーは各々、上
記の特定のヌクレオチド又は塩基と相補的な位置に検出
可能要素及び／又は分離要素を有する。但し介在配列
は、介在配列と相補的であって伸長プライマーに組み込
まれたヌクレオチド又は塩基が干渉検出可能及び／又は
分離要素の組込みを引き起こす場合のものではあり得な
い）； ｃ）上記の伸長プライマーに含有されない検出可能要素
を有しない少なくとも１つの画分に特定の位置の特定の
ヌクレオチド又は塩基まで伸長しただけの任意の伸長プ
ライマーを分け；そして ｄ）伸長プライマーの存在が、少なくとも１つの特定の
ヌクレオチド又は塩基が特定のポリヌクレオチド配列中
の特定の位置にあることを示し、画分中の上記伸長プラ
イマーの非存在が、少なくとも１つの特定のヌクレオチ
ド又は塩基が特定のポリヌクレオチド配列の特定の位置
に存在しないことを示す、上記の伸長プライマーに関す
る上記画分の検定により、伸長プライマーが上記画分中
に存在するか否かを測定する ことから成る、同一又は異なる特定のヌクレオチド又は
塩基が、多数の異なるポリヌクレオチド配列を有する物
質中の少なくとも２つの異なる特定のポリヌクレオチド
配列の特定の位置に存在するか否かを検出する方法が提
供される。
本発明の第七の態様によれば、以下の： ａ）上記の特定のポリヌクレオチド配列の一部と相補的
な配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー； ｂ）オリゴヌクレオチドプライマーを伸長するためのポ
リメラーゼ酵素； ｃ）dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、dITP、ddATP、ddC
TP、ddGTP、ddITP及びddTTPから成る群から選択される
少なくとも１つのヌクレオチド；並びに ｄ）オリゴヌクレオチドプライマーあるいは１つ又はそ
れ以上のヌクレオチドと任意に結合する、検出可能要素
及び／又は分離成分 を包含する、物質中の特定のポリヌクレオチド配列を検
出するためのキットが提供される。
な配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー； ｂ）オリゴヌクレオチドプライマーを伸長するためのポ
リメラーゼ酵素； ｃ）dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、dITP、ddATP、ddC
TP、ddGTP、ddITP及びddTTPから成る群から選択される
少なくとも１つのヌクレオチド；並びに ｄ）オリゴヌクレオチドプライマーあるいは１つ又はそ
れ以上のヌクレオチドと任意に結合する、検出可能要素
及び／又は分離成分 を包含する、物質中の特定のポリヌクレオチド配列を検
出するためのキットが提供される。
本発明の第八の態様によれば、以下の： ａ）各々が上記の特定のポリヌクレオチド配列の１つの
一部と相補的な配列を有する少なくとも２つの異なるオ
リゴヌクレオチドプライマー； ｂ）異なるオリゴヌクレオチドプライマーを伸長するた
めのポリメラーゼ酵素； ｃ）dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、dITP、ddATP、ddC
TP、ddGTP、ddITP及びddTTPから成る群から選択される
少なくとも１つのヌクレオチド；並びに ｄ）オリゴヌクレオチドプライマーあるいは１つ又はそ
れ以上のヌクレオチドと任意に結合する、検出可能要素
及び／又は分離成分 を包含する、多数の異なるポリヌクレオチド配列を有す
る物質中の少なくとも２つの異なる特定のポリヌクレオ
チド配列を検出するためのキットが提供される。
一部と相補的な配列を有する少なくとも２つの異なるオ
リゴヌクレオチドプライマー； ｂ）異なるオリゴヌクレオチドプライマーを伸長するた
めのポリメラーゼ酵素； ｃ）dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、dITP、ddATP、ddC
TP、ddGTP、ddITP及びddTTPから成る群から選択される
少なくとも１つのヌクレオチド；並びに ｄ）オリゴヌクレオチドプライマーあるいは１つ又はそ
れ以上のヌクレオチドと任意に結合する、検出可能要素
及び／又は分離成分 を包含する、多数の異なるポリヌクレオチド配列を有す
る物質中の少なくとも２つの異なる特定のポリヌクレオ
チド配列を検出するためのキットが提供される。
本発明の第九の態様によれば、以下の： ａ）特定のポリヌクレオチド配列の一部と相補的な配列
を有するオリゴヌクレオチドプライマー（ここで、上記
のプライマーは特定の位置に直接隣接する上記の特定の
ポリヌクレオチド配列の一部と結合する）； ｂ）オリゴヌクレオチドプライマーを伸長するためのポ
リメラーゼ酵素； ｃ）dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、dITP、ddATP、ddC
TP、ddGTP、ddITP及びddTTPから成る群から選択される
１つのヌクレオチド（但し、上記の特定のヌクレオチド
又は塩基が特定のポリヌクレオチド配列の特定の位置に
ある場合、上記のヌクレオチドが選択され、それによっ
て結合プライマーが上記の特定のヌクレオチド又は塩基
を含めてそこまで伸長されるだけである）；並びに ｄ）伸長プライマーが上記の特定のヌクレオチド又は塩
基と相補的な位置に検出可能要素及び／又は分離成分を
有し、検出可能要素及び／又は分離成分がオリゴヌクレ
オチドプライマーと任意に結合する検出可能要素及び／
又は分離成分 を包含する、物質中の特定のポリヌクレオチド配列中の
特定の位置に特定のヌクレオチド又は塩基が存在するか
否かを検出するためのキットが提供される。
を有するオリゴヌクレオチドプライマー（ここで、上記
のプライマーは特定の位置に直接隣接する上記の特定の
ポリヌクレオチド配列の一部と結合する）； ｂ）オリゴヌクレオチドプライマーを伸長するためのポ
リメラーゼ酵素； ｃ）dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、dITP、ddATP、ddC
TP、ddGTP、ddITP及びddTTPから成る群から選択される
１つのヌクレオチド（但し、上記の特定のヌクレオチド
又は塩基が特定のポリヌクレオチド配列の特定の位置に
ある場合、上記のヌクレオチドが選択され、それによっ
て結合プライマーが上記の特定のヌクレオチド又は塩基
を含めてそこまで伸長されるだけである）；並びに ｄ）伸長プライマーが上記の特定のヌクレオチド又は塩
基と相補的な位置に検出可能要素及び／又は分離成分を
有し、検出可能要素及び／又は分離成分がオリゴヌクレ
オチドプライマーと任意に結合する検出可能要素及び／
又は分離成分 を包含する、物質中の特定のポリヌクレオチド配列中の
特定の位置に特定のヌクレオチド又は塩基が存在するか
否かを検出するためのキットが提供される。
本発明の第十の態様によれば、以下の： ａ）各々が上記の特定のポリヌクレオチド配列の１つの
一部と相補的な配列を有する少なくとも２つの異なるオ
リゴヌクレオチドプライマー（ここで、上記のプライマ
ーは各々、上記の物質中に存在する場合、その相補的ポ
リヌクレオチド配列と結合し、上記のオリゴヌクレオチ
ドプライマーは各々、他方のプライマーとは異なる特定
のポリヌクレオチド配列の一部に結合する。さらに上記
のプライマーは各々、特定の位置に直接隣接する上記の
物質中のその相補的な特定のポリヌクレオチド配列と結
合する）； ｂ）異なるオリゴヌクレオチドプライマーを伸長するた
めのポリメラーゼ酵素； ｃ）dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、dITP、ddATP、ddC
TP、ddGTP、ddITP及びddTTPから成る群から選択される
少なくとも１つのヌクレオチド（但し、上記の特定のヌ
クレオチド又は塩基が特定のポリヌクレオチド配列の特
定の位置にある場合、上記のヌクレオチドが選択され、
それによって結合プライマーが上記の特定のヌクレオチ
ド又は塩基を含めてそこまで伸長されるだけである）；
並びに ｄ）伸長プライマーが上記の特定のヌクレオチド又は塩
基と相補的な位置に検出可能要素及び／又は分離成分を
有し、検出可能要素及び／又は分離成分がオリゴヌクレ
オチドプライマーと任意に結合する少なくとも１つの検
出可能要素及び／又は分離成分 を包含する、多数の異なるポリヌクレオチド配列を有す
る物質中の少なくとも２つの異なる特定のポリヌクレオ
チド配列の特定の位置に同一又は異なる特定のヌクレオ
チド又は塩基が存在するか否かを検出するためのキット
が提供される。
一部と相補的な配列を有する少なくとも２つの異なるオ
リゴヌクレオチドプライマー（ここで、上記のプライマ
ーは各々、上記の物質中に存在する場合、その相補的ポ
リヌクレオチド配列と結合し、上記のオリゴヌクレオチ
ドプライマーは各々、他方のプライマーとは異なる特定
のポリヌクレオチド配列の一部に結合する。さらに上記
のプライマーは各々、特定の位置に直接隣接する上記の
物質中のその相補的な特定のポリヌクレオチド配列と結
合する）； ｂ）異なるオリゴヌクレオチドプライマーを伸長するた
めのポリメラーゼ酵素； ｃ）dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、dITP、ddATP、ddC
TP、ddGTP、ddITP及びddTTPから成る群から選択される
少なくとも１つのヌクレオチド（但し、上記の特定のヌ
クレオチド又は塩基が特定のポリヌクレオチド配列の特
定の位置にある場合、上記のヌクレオチドが選択され、
それによって結合プライマーが上記の特定のヌクレオチ
ド又は塩基を含めてそこまで伸長されるだけである）；
並びに ｄ）伸長プライマーが上記の特定のヌクレオチド又は塩
基と相補的な位置に検出可能要素及び／又は分離成分を
有し、検出可能要素及び／又は分離成分がオリゴヌクレ
オチドプライマーと任意に結合する少なくとも１つの検
出可能要素及び／又は分離成分 を包含する、多数の異なるポリヌクレオチド配列を有す
る物質中の少なくとも２つの異なる特定のポリヌクレオ
チド配列の特定の位置に同一又は異なる特定のヌクレオ
チド又は塩基が存在するか否かを検出するためのキット
が提供される。
本発明の第十一の態様によれば、以下の： ａ）特定のポリヌクレオチド配列の一部と相補的な配列
を有するオリゴヌクレオチドプライマー（ここで、特定
の位置に直接隣接しない上記の特定のポリヌクレオチド
配列の一部と結合し、それによって特定の位置と、特定
のポリヌクレオチド配列に結合するプライマーとの間に
介在配列が存在する）； ｂ）オリゴヌクレオチドプライマーを伸長するためのポ
リメラーゼ酵素； ｃ）dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、dITP、ddATP、ddC
TP、ddGTP、ddITP及びddTTPから成る群から選択される
１つのヌクレオチド（但し、上記の特定のヌクレオチド
又は塩基が特定のポリヌクレオチド配列の特定の位置に
ある場合、上記のヌクレオチドが選択され、それによっ
て結合プライマーが上記の特定のヌクレオチド又は塩基
を含めてそこまで伸長されるだけである。但し、介在配
列は、その介在配列と相補的であって、伸長プライマー
中に組み込まれる塩基又はヌクレオチドが干渉検出可能
及び／又は分離成分の組込みを引き起こす場合のもので
はあり得ない）；並びに ｄ）伸長プライマーが上記の特定のヌクレオチド又は塩
基と相補的な位置に検出可能要素及び／又は分離成分を
有し、検出可能要素及び／又は分離成分がオリゴヌクレ
オチドプライマーと任意に結合する検出可能要素及び／
又は分離成分 を包含する、物質中の特定のポリヌクレオチド配列中の
特定の位置に特定のヌクレオチド又は塩基が存在するか
否かを検出するためのキットが提供される。
を有するオリゴヌクレオチドプライマー（ここで、特定
の位置に直接隣接しない上記の特定のポリヌクレオチド
配列の一部と結合し、それによって特定の位置と、特定
のポリヌクレオチド配列に結合するプライマーとの間に
介在配列が存在する）； ｂ）オリゴヌクレオチドプライマーを伸長するためのポ
リメラーゼ酵素； ｃ）dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、dITP、ddATP、ddC
TP、ddGTP、ddITP及びddTTPから成る群から選択される
１つのヌクレオチド（但し、上記の特定のヌクレオチド
又は塩基が特定のポリヌクレオチド配列の特定の位置に
ある場合、上記のヌクレオチドが選択され、それによっ
て結合プライマーが上記の特定のヌクレオチド又は塩基
を含めてそこまで伸長されるだけである。但し、介在配
列は、その介在配列と相補的であって、伸長プライマー
中に組み込まれる塩基又はヌクレオチドが干渉検出可能
及び／又は分離成分の組込みを引き起こす場合のもので
はあり得ない）；並びに ｄ）伸長プライマーが上記の特定のヌクレオチド又は塩
基と相補的な位置に検出可能要素及び／又は分離成分を
有し、検出可能要素及び／又は分離成分がオリゴヌクレ
オチドプライマーと任意に結合する検出可能要素及び／
又は分離成分 を包含する、物質中の特定のポリヌクレオチド配列中の
特定の位置に特定のヌクレオチド又は塩基が存在するか
否かを検出するためのキットが提供される。
本発明の第十二の態様によれば、以下の： ａ）各々が上記の特定のポリヌクレオチド配列の１つの
一部と相補的な配列を有する、少なくとも２つの異なる
オリゴヌクレオチドプライマー（ここで、上記のプライ
マーは各々、上記の物質中に存在する場合、その相補的
ポリヌクレオチド配列と結合し、上記のオリゴヌクレオ
チドプライマーは各々、他方のプライマーとは異なる特
定のポリヌクレオチド配列の一部に結合する。さらに上
記のプライマーは各々、特定の位置に直接隣接しない上
記の物質中のその相補的な特定のポリヌクレオチド配列
と結合し、それによって特定の位置と特定のポリヌクレ
オチド配列と結合するプライマーとの間に介在配列が存
在する）； ｂ）異なるオリゴヌクレオチドプライマーを伸長するた
めのポリメラーゼ酵素； ｃ）dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、dITP、ddATP、ddC
TP、ddGTP、ddITP及びddTTPから成る群から選択される
少なくとも１つのヌクレオチド（但し、上記の特定のヌ
クレオチド又は塩基が特定のポリヌクレオチド配列の特
定の位置にある場合、上記のヌクレオチドが選択され、
それによって結合プライマーが上記の特定のヌクレオチ
ド又は塩基を含めてそこまで伸長されるだけである。但
し、介在配列は、その介在配列と相補的であって、伸長
プライマー中に組み込まれる塩基又はヌクレオチドが干
渉検出可能及び／又は分離要素の組込みを引き起こす場
合のものではあり得ない）；並びに ｄ）伸長プライマーが上記の特定のヌクレオチド又は塩
基と相補的な位置に検出可能要素及び／又は分離要素を
有し、検出可能要素及び／又は分離要素がオリゴヌクレ
オチドプライマーと任意に結合する検出可能要素及び／
又は分離要素 を包含する、多数の異なるポリヌクレオチド配列を有す
る物質中の少なくとも２つの異なる特定のポリヌクレオ
チド配列の特定の位置に同一又は異なる特定のヌクレオ
チド又は塩基が存在するか否かを検出するためのキット
が提供される。
一部と相補的な配列を有する、少なくとも２つの異なる
オリゴヌクレオチドプライマー（ここで、上記のプライ
マーは各々、上記の物質中に存在する場合、その相補的
ポリヌクレオチド配列と結合し、上記のオリゴヌクレオ
チドプライマーは各々、他方のプライマーとは異なる特
定のポリヌクレオチド配列の一部に結合する。さらに上
記のプライマーは各々、特定の位置に直接隣接しない上
記の物質中のその相補的な特定のポリヌクレオチド配列
と結合し、それによって特定の位置と特定のポリヌクレ
オチド配列と結合するプライマーとの間に介在配列が存
在する）； ｂ）異なるオリゴヌクレオチドプライマーを伸長するた
めのポリメラーゼ酵素； ｃ）dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、dITP、ddATP、ddC
TP、ddGTP、ddITP及びddTTPから成る群から選択される
少なくとも１つのヌクレオチド（但し、上記の特定のヌ
クレオチド又は塩基が特定のポリヌクレオチド配列の特
定の位置にある場合、上記のヌクレオチドが選択され、
それによって結合プライマーが上記の特定のヌクレオチ
ド又は塩基を含めてそこまで伸長されるだけである。但
し、介在配列は、その介在配列と相補的であって、伸長
プライマー中に組み込まれる塩基又はヌクレオチドが干
渉検出可能及び／又は分離要素の組込みを引き起こす場
合のものではあり得ない）；並びに ｄ）伸長プライマーが上記の特定のヌクレオチド又は塩
基と相補的な位置に検出可能要素及び／又は分離要素を
有し、検出可能要素及び／又は分離要素がオリゴヌクレ
オチドプライマーと任意に結合する検出可能要素及び／
又は分離要素 を包含する、多数の異なるポリヌクレオチド配列を有す
る物質中の少なくとも２つの異なる特定のポリヌクレオ
チド配列の特定の位置に同一又は異なる特定のヌクレオ
チド又は塩基が存在するか否かを検出するためのキット
が提供される。
本発明の第十三の態様によれば、以下の： 反応器； 上記の反応器に上記のプライマーを伸長するためにオ
リゴヌクレオチドプライマー及び試薬を付加するための
手段（付加のための上記の手段は操作上、反応器と関連
する）； 伸長プライマーを少なくとも１つの画分中に分離する
ための、そして上記の画分を保持するための手段（分離
のための上記の手段は操作上反応器と関連する）；そし
て 上記の画分の任意の伸長プライマーの存在を検出する
ための検出器（上記の検出器は、分離のための上記の手
段と操作上関連する） を包含する、本発明の態様のいずれか一の方法を実施す
るための装置が提供される。
リゴヌクレオチドプライマー及び試薬を付加するための
手段（付加のための上記の手段は操作上、反応器と関連
する）； 伸長プライマーを少なくとも１つの画分中に分離する
ための、そして上記の画分を保持するための手段（分離
のための上記の手段は操作上反応器と関連する）；そし
て 上記の画分の任意の伸長プライマーの存在を検出する
ための検出器（上記の検出器は、分離のための上記の手
段と操作上関連する） を包含する、本発明の態様のいずれか一の方法を実施す
るための装置が提供される。
本発明の第十四の態様によれば、以下の： ａ）上記の物質を、上記の異なる特定のポリヌクレオチ
ド配列の一部と相補的な配列を有する少なくとも２つの
異なる特定のポリヌクレオチドプライマーに暴露し（こ
こで、上記の物質中に存在する場合、上記のプライマー
は各々、上記の異なる特定のポリヌクレオチド配列の一
方の一部と結合し、上記のオリゴヌクレオチドプライマ
ーは各々、上記のオリゴヌクレオチドプライマーの他方
に対して異なる特定のポリヌクレオチド配列の一部と結
合する）； ｂ）異なる特定のポリヌクレオチド配列と結合する上記
の異なるオリゴヌクレオチドプライマーを伸長し（ここ
で任意の伸長プライマーは検出可能要素及び／又は分離
要素を含有する）； ｃ）上記の伸長プライマーに含有されない検出可能要素
を有しない少なくとも一つの画分に伸長プライマーを分
け；そして ｄ）上記の伸長プライマーの一つの存在が上記の物質中
の異なる特定のポリヌクレオチド配列の少なくとも１つ
の存在を示し、上記の画分中の上記の伸長プライマーの
非存在が上記の物質中の異なる特定のポリヌクレオチド
配列の全ての非存在を示す上記の全ての伸長プライマー
に関する上記の画分の検定により、伸長プライマーが上
記画分中に存在するか否かを測定する ことから成る、多数（複数）の異なるポリヌクレオチド
配列を有する物質中の少なくとも２つの異なる特定のポ
リヌクレオチド配列の存在を検出するためのスクリーニ
ング方法が提供される。
ド配列の一部と相補的な配列を有する少なくとも２つの
異なる特定のポリヌクレオチドプライマーに暴露し（こ
こで、上記の物質中に存在する場合、上記のプライマー
は各々、上記の異なる特定のポリヌクレオチド配列の一
方の一部と結合し、上記のオリゴヌクレオチドプライマ
ーは各々、上記のオリゴヌクレオチドプライマーの他方
に対して異なる特定のポリヌクレオチド配列の一部と結
合する）； ｂ）異なる特定のポリヌクレオチド配列と結合する上記
の異なるオリゴヌクレオチドプライマーを伸長し（ここ
で任意の伸長プライマーは検出可能要素及び／又は分離
要素を含有する）； ｃ）上記の伸長プライマーに含有されない検出可能要素
を有しない少なくとも一つの画分に伸長プライマーを分
け；そして ｄ）上記の伸長プライマーの一つの存在が上記の物質中
の異なる特定のポリヌクレオチド配列の少なくとも１つ
の存在を示し、上記の画分中の上記の伸長プライマーの
非存在が上記の物質中の異なる特定のポリヌクレオチド
配列の全ての非存在を示す上記の全ての伸長プライマー
に関する上記の画分の検定により、伸長プライマーが上
記画分中に存在するか否かを測定する ことから成る、多数（複数）の異なるポリヌクレオチド
配列を有する物質中の少なくとも２つの異なる特定のポ
リヌクレオチド配列の存在を検出するためのスクリーニ
ング方法が提供される。
本発明の第十五の態様によれば、以下の： ａ）上記の物質を、異なる特定のポリヌクレオチド配列
の１つの一部と相補的な配列を有する少なくとも２つの
異なるオリゴヌクレオチドプライマー（ここで、上記の
プライマーは各々、上記の物質中に存在する場合、その
相補的ポリヌクレオチド配列と結合し、上記のオリゴヌ
クレオチドプライマーは各々、他方のプライマーとは異
なる特定のポリヌクレオチド配列の一部に結合する。さ
らに上記のプライマーは各々、特定の位置に直接隣接す
る上記の物質中のその相補的な特定のポリヌクレオチド
配列と結合する）にさらし； ｂ）その相補的ポリヌクレオチド配列と結合する上記の
異なるオリゴヌクレオチドプライマーを伸長し（但し、
上記の特定のヌクレオチド又は塩基が特定のポリヌクレ
オチド配列中の特定の位置にある場合、結合プライマー
は各々、特定の位置を含めてそこまで伸長されるだけで
ある。この場合、上記の伸長プライマーは各々、上記の
特定のヌクレオチド又は塩基と相補的な位置に検出可能
要素及び／又は分離要素を有する）； ｃ）上記の伸長プライマーに含有されない検出可能要素
を有しない画分中の特定の位置の特定のヌクレオチド又
は塩基まで伸長するだけである伸長プライマーを分離
し；そして ｄ）伸長プライマーの存在が、少なくとも１つの特定の
ヌクレオチド又は塩基が特定のポリヌクレオチド配列中
の特定の位置にあることを示し、画分中のすべての上記
の伸長プライマーの非存在が、少なくとも１つの特定の
ヌクレオチド又は塩基が少なくとも１つの異なる特定の
ポリヌクレオチド配列の特定の位置に存在しないことを
示す、上記の伸長プライマーについての上記画分の検定
により、少なくとも１つのの伸長プライマーが上記画分
中に存在するか否かを測定する ことから成る、同一又は異なる特定のヌクレオチド又は
塩基が、多数（複数）の異なるポリヌクレオチド配列を
有する物質中の少なくとも２つの異なる特定のポリヌク
レオチド配列の特定の位置に存在するか否かを検出する
ためのスクリーニング方法が提供される。
の１つの一部と相補的な配列を有する少なくとも２つの
異なるオリゴヌクレオチドプライマー（ここで、上記の
プライマーは各々、上記の物質中に存在する場合、その
相補的ポリヌクレオチド配列と結合し、上記のオリゴヌ
クレオチドプライマーは各々、他方のプライマーとは異
なる特定のポリヌクレオチド配列の一部に結合する。さ
らに上記のプライマーは各々、特定の位置に直接隣接す
る上記の物質中のその相補的な特定のポリヌクレオチド
配列と結合する）にさらし； ｂ）その相補的ポリヌクレオチド配列と結合する上記の
異なるオリゴヌクレオチドプライマーを伸長し（但し、
上記の特定のヌクレオチド又は塩基が特定のポリヌクレ
オチド配列中の特定の位置にある場合、結合プライマー
は各々、特定の位置を含めてそこまで伸長されるだけで
ある。この場合、上記の伸長プライマーは各々、上記の
特定のヌクレオチド又は塩基と相補的な位置に検出可能
要素及び／又は分離要素を有する）； ｃ）上記の伸長プライマーに含有されない検出可能要素
を有しない画分中の特定の位置の特定のヌクレオチド又
は塩基まで伸長するだけである伸長プライマーを分離
し；そして ｄ）伸長プライマーの存在が、少なくとも１つの特定の
ヌクレオチド又は塩基が特定のポリヌクレオチド配列中
の特定の位置にあることを示し、画分中のすべての上記
の伸長プライマーの非存在が、少なくとも１つの特定の
ヌクレオチド又は塩基が少なくとも１つの異なる特定の
ポリヌクレオチド配列の特定の位置に存在しないことを
示す、上記の伸長プライマーについての上記画分の検定
により、少なくとも１つのの伸長プライマーが上記画分
中に存在するか否かを測定する ことから成る、同一又は異なる特定のヌクレオチド又は
塩基が、多数（複数）の異なるポリヌクレオチド配列を
有する物質中の少なくとも２つの異なる特定のポリヌク
レオチド配列の特定の位置に存在するか否かを検出する
ためのスクリーニング方法が提供される。
本発明の第十六の態様によれば、以下の： ａ）上記の物質を、各々が上記の異なる特定のポリヌク
レオチド配列の１つの一部と相補的な配列を有する少な
くとも２つの異なるオリゴヌクレオチドプライマー（こ
こで、上記のプライマーは特定の位置に直接隣接しない
その相補的ポリヌクレオチド配列と結合し、それによっ
て特定の位置と、特定のポリヌクレオチド配列に結合す
るプライマーとの間に介在配列が存在する。上記のオリ
ゴヌクレオチドプライマーは各々、上記の物質中に存在
する場合、他方のプライマーのものに対して異なる特定
のポリヌクレオチド配列の一部と結合する）にさらし； ｂ）その相補的ポリヌクレオチド配列に結合する上記の
異なるオリゴヌクレオチドプライマーを伸長し（ここ
で、上記の特定のヌクレオチド又は塩基が特定のヌクレ
オチド配列中の特定の位置にある場合、結合プライマー
は各々、特定の位置を含めてそこまで伸長されるだけで
ある。この場合、上記の伸長プライマーは各々、上記の
特定のヌクレオチド又は塩基と相補的な位置に検出可能
要素及び／又は分離要素を有する。但し介在配列は、介
在配列と相補的であって伸長プライマーに組み込まれる
ヌクレオチド又は塩基が干渉検出可能及び／又は分離要
素の組込みを引き起こす場合のものではあり得ない）； ｃ）上記の伸長プライマーに含有されない検出可能要素
を有しない画分中の特定の位置の特定のヌクレオチド又
は塩基まで伸長しただけの伸長プライマーを分離し；そ
して ｄ）伸長プライマーの存在が、少なくとも１つの特定の
ヌクレオチド又は塩基が特定のポリヌクレオチド配列中
の特定の位置にあることを示し、伸長プライマーの非存
在が、特定のヌクレオチド又は塩基が任意の異なる特定
のポリヌクレオチド配列の特定の位置に存在しないこと
を示す、上記の全ての伸長プライマーに関する上記の画
分の検定により、任意の伸長プライマーが上記の画分中
に存在するか否かを測定する ことから成る、同一又は異なる特定のヌクレオチド又は
塩基が、多数（複数）の異なるポリヌクレオチド配列を
有する物質中の少なくとも２つの異なる特定のポリヌク
レオチド配列の特定の位置に存在するか否かを検出する
ためのスクリーニング方法が提供される。
レオチド配列の１つの一部と相補的な配列を有する少な
くとも２つの異なるオリゴヌクレオチドプライマー（こ
こで、上記のプライマーは特定の位置に直接隣接しない
その相補的ポリヌクレオチド配列と結合し、それによっ
て特定の位置と、特定のポリヌクレオチド配列に結合す
るプライマーとの間に介在配列が存在する。上記のオリ
ゴヌクレオチドプライマーは各々、上記の物質中に存在
する場合、他方のプライマーのものに対して異なる特定
のポリヌクレオチド配列の一部と結合する）にさらし； ｂ）その相補的ポリヌクレオチド配列に結合する上記の
異なるオリゴヌクレオチドプライマーを伸長し（ここ
で、上記の特定のヌクレオチド又は塩基が特定のヌクレ
オチド配列中の特定の位置にある場合、結合プライマー
は各々、特定の位置を含めてそこまで伸長されるだけで
ある。この場合、上記の伸長プライマーは各々、上記の
特定のヌクレオチド又は塩基と相補的な位置に検出可能
要素及び／又は分離要素を有する。但し介在配列は、介
在配列と相補的であって伸長プライマーに組み込まれる
ヌクレオチド又は塩基が干渉検出可能及び／又は分離要
素の組込みを引き起こす場合のものではあり得ない）； ｃ）上記の伸長プライマーに含有されない検出可能要素
を有しない画分中の特定の位置の特定のヌクレオチド又
は塩基まで伸長しただけの伸長プライマーを分離し；そ
して ｄ）伸長プライマーの存在が、少なくとも１つの特定の
ヌクレオチド又は塩基が特定のポリヌクレオチド配列中
の特定の位置にあることを示し、伸長プライマーの非存
在が、特定のヌクレオチド又は塩基が任意の異なる特定
のポリヌクレオチド配列の特定の位置に存在しないこと
を示す、上記の全ての伸長プライマーに関する上記の画
分の検定により、任意の伸長プライマーが上記の画分中
に存在するか否かを測定する ことから成る、同一又は異なる特定のヌクレオチド又は
塩基が、多数（複数）の異なるポリヌクレオチド配列を
有する物質中の少なくとも２つの異なる特定のポリヌク
レオチド配列の特定の位置に存在するか否かを検出する
ためのスクリーニング方法が提供される。
一般に、ヌクレオチド配列又はヌクレオチド配列中の
ヌクレオチド変化の検出方法は、以下の： 一部又は全部公知の検出すべきヌクレオチド配列の一
部に特異的な、あるいは検出すべきヌクレオチド又は塩
基変化に直接隣接する一部又は全部公知のヌクレオチド
配列の一部に特異的な、あるいは検出すべきヌクレオチ
ド又は塩基変化に直接隣接しないがしかし結合プライマ
ーと検出すべきヌクレオチド又は塩基変化との間に介在
配列を有する一部又は全部公知のヌクレオチド配列の一
部に特異的な核酸プライマー； 核酸ポリメラーゼ酵素により触媒されるプライマーの
伸長、（ｉ）特異的プライマーの５′末端での捕獲分子
の結合、ハイブリダイゼーション条件下での標的となる
配列の付加、及び酵素触媒された伸長プライマーにおけ
るディテクター分子の組入れ、あるいは（ii）特異的プ
ライマーの５′末端でのディテクター分子の結合、ハイ
ブリダイゼーション条件下での標的となる配列の付加、
及び酵素触媒伸長プライマーにおける捕獲分子の組入
れ； 固体支持体と結合する特異的親和性分子を用いる伸長
プライマーの捕獲； ディテクター分子の検定 を用いる。
ヌクレオチド変化の検出方法は、以下の： 一部又は全部公知の検出すべきヌクレオチド配列の一
部に特異的な、あるいは検出すべきヌクレオチド又は塩
基変化に直接隣接する一部又は全部公知のヌクレオチド
配列の一部に特異的な、あるいは検出すべきヌクレオチ
ド又は塩基変化に直接隣接しないがしかし結合プライマ
ーと検出すべきヌクレオチド又は塩基変化との間に介在
配列を有する一部又は全部公知のヌクレオチド配列の一
部に特異的な核酸プライマー； 核酸ポリメラーゼ酵素により触媒されるプライマーの
伸長、（ｉ）特異的プライマーの５′末端での捕獲分子
の結合、ハイブリダイゼーション条件下での標的となる
配列の付加、及び酵素触媒された伸長プライマーにおけ
るディテクター分子の組入れ、あるいは（ii）特異的プ
ライマーの５′末端でのディテクター分子の結合、ハイ
ブリダイゼーション条件下での標的となる配列の付加、
及び酵素触媒伸長プライマーにおける捕獲分子の組入
れ； 固体支持体と結合する特異的親和性分子を用いる伸長
プライマーの捕獲； ディテクター分子の検定 を用いる。
第一、第二、第七、及び第八の態様に関しては、プラ
イマーの伸長は、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、dIT
P、ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP及びddTTPから成る群か
ら選択される少なくとも１つのヌクレオチドの使用を包
含すると有益である。一般に、２〜４つの異なるヌクレ
オチド、特に４つの異なるヌクレオチドを用いる。
イマーの伸長は、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、dIT
P、ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP及びddTTPから成る群か
ら選択される少なくとも１つのヌクレオチドの使用を包
含すると有益である。一般に、２〜４つの異なるヌクレ
オチド、特に４つの異なるヌクレオチドを用いる。
一般に、第三、第五、第九、及び第十一の態様に関し
ては、プライマーの伸長は、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、
dUTP、dITP、ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP及びddTTPか
ら成る群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド
の使用を包含する。一般に、ddATP、ddCTP、ddGTP、ddI
TP及びddTTPから成る群から選択される１つのヌクレオ
チドを用いる。
ては、プライマーの伸長は、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、
dUTP、dITP、ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP及びddTTPか
ら成る群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド
の使用を包含する。一般に、ddATP、ddCTP、ddGTP、ddI
TP及びddTTPから成る群から選択される１つのヌクレオ
チドを用いる。
一般に、第四、第六、第十及び第十二の態様に関して
は、プライマーの伸長は、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dU
TP、dITP、ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP及びddTTPから
成る群から選択される少なくとも１つのヌクレオチドの
使用を包含する。全般的に、ddATP、ddCTP、ddGTP、ddI
TP及びddTTPから成る群から選択される少なくとも１つ
のヌクレオチドを用いる。
は、プライマーの伸長は、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dU
TP、dITP、ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP及びddTTPから
成る群から選択される少なくとも１つのヌクレオチドの
使用を包含する。全般的に、ddATP、ddCTP、ddGTP、ddI
TP及びddTTPから成る群から選択される少なくとも１つ
のヌクレオチドを用いる。
プライマーを伸長する場合に一般に用いられるヌクレ
オチドに加えて、少なくとも１つの適切なポリメラーゼ
酵素及び適切な緩衝剤がある。
オチドに加えて、少なくとも１つの適切なポリメラーゼ
酵素及び適切な緩衝剤がある。
ポリメラーゼ酵素の例は、大腸菌E.coli DNAポリメ
ラーゼ、E.coli DNAポリメラーゼ（クレノウ断片）、
バクテリオファージT7 DNAポリメラーゼ、バクテリオ
ファージT4 DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラー
ゼ、及びAMV逆転写酵素である。
ラーゼ、E.coli DNAポリメラーゼ（クレノウ断片）、
バクテリオファージT7 DNAポリメラーゼ、バクテリオ
ファージT4 DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラー
ゼ、及びAMV逆転写酵素である。
水性溶液をpH6〜8.5に緩衝する緩衝剤は、一般に、プ
ライマーを伸長するためにポリメラーゼ酵素とともに用
いるのに適している。一般に、マグネシウム塩（例えば
MgCl2又はMgSO4）が、緩衝剤とともに含有される。50〜
300mMの総塩濃度が一般に許容される。
ライマーを伸長するためにポリメラーゼ酵素とともに用
いるのに適している。一般に、マグネシウム塩（例えば
MgCl2又はMgSO4）が、緩衝剤とともに含有される。50〜
300mMの総塩濃度が一般に許容される。
伸長反応の温度は使用するポリメラーゼ酵素によって
選択され、一般に25〜80℃、さらに一般的には30〜70℃
である。
選択され、一般に25〜80℃、さらに一般的には30〜70℃
である。
少なくとも１つのヌクレオチドが検出可能要素を有す
るのが好ましい。
るのが好ましい。
あるいは、又はさらに、検出可能要素はオリゴヌクレ
オチドプライマーに結合する。
オチドプライマーに結合する。
一般に、検出可能要素は、3H、125I、131I、14C、
35S、及び32Pから成る群から選択される放射性標識であ
る。
35S、及び32Pから成る群から選択される放射性標識であ
る。
検出可能要素は非放射性であってもよく、一般に、酵
素性群、免疫性群、及び分光器で検出可能な群から成る
群から選択される。分光器で検出可能な群は、発光群、
化学発光群、NMR検出可能群、蛍光群、又はIR検出可能
群である。
素性群、免疫性群、及び分光器で検出可能な群から成る
群から選択される。分光器で検出可能な群は、発光群、
化学発光群、NMR検出可能群、蛍光群、又はIR検出可能
群である。
伸長プライマーは、伸長プライマーの一次画分中での
分離を促す分離要素を含有するのが好ましい。
分離を促す分離要素を含有するのが好ましい。
一般に、特定のポリヌクレオチド配列は、DNA配列又
はRNA配列である。
はRNA配列である。
特定のポリヌクレオチド配列は、生存もしくは死滅し
ているウイルス、細菌、カビ又は原生動物であり得る感
染性又は発病性生物体からであってもよい。
ているウイルス、細菌、カビ又は原生動物であり得る感
染性又は発病性生物体からであってもよい。
伸長は、以下の： 上記のプライマーを伸長するために、複数のヌクレオ
チドタイプをポリヌクレオチド配列に結合する上記のプ
ライマーに付加し、あるいは 上記のプライマーを伸長するために、単一のヌクレオ
チドタイプをポリヌクレオチド配列に結合する上記のプ
ライマーに付加し（第三、五、九及び十一の態様）、あ
るいは 上記のプライマーを伸長するために、少なくとも１つ
の単一のヌクレオチドタイプをポリヌクレオチド配列に
結合する上記のプライマーに付加することを包含し得
る。
チドタイプをポリヌクレオチド配列に結合する上記のプ
ライマーに付加し、あるいは 上記のプライマーを伸長するために、単一のヌクレオ
チドタイプをポリヌクレオチド配列に結合する上記のプ
ライマーに付加し（第三、五、九及び十一の態様）、あ
るいは 上記のプライマーを伸長するために、少なくとも１つ
の単一のヌクレオチドタイプをポリヌクレオチド配列に
結合する上記のプライマーに付加することを包含し得
る。
本発明の特定の一方法においては、暴露及びプライマ
ー伸長工程は分離工程の前に生じる。
ー伸長工程は分離工程の前に生じる。
本発明の一形態においては、分離要素はオリゴヌクレ
オチドプライマーと結合する。あるいは伸長プライマー
は、一次画分中への混合物からの伸長プライマーの分離
を促す分離要素を含有する。この場合、少なくとも１つ
の上記ヌクレオチドが分離要素を有する。
オチドプライマーと結合する。あるいは伸長プライマー
は、一次画分中への混合物からの伸長プライマーの分離
を促す分離要素を含有する。この場合、少なくとも１つ
の上記ヌクレオチドが分離要素を有する。
本発明の一形態においては、分離工程は： 任意の伸長プライマーを、分離要素に対する親和性を
有する分子と接触し、この分子を分離を促す支持体に結
合させ、そして接触した伸長プライマーを分離して画分
を提供する。
有する分子と接触し、この分子を分離を促す支持体に結
合させ、そして接触した伸長プライマーを分離して画分
を提供する。
分離要素及び分子は、以下に記載の群から選択するの
が有益である： 一般に、分離要素及び分子は、下記の群から選択され
る： 有用な受容体が存在するリガンドの一般例は： ビオチンのようなビタミン、グルコース又はマンノー
スのような糖分子、アドレナリン又はコルチゾンのよう
なホルモン、及びプロゲステロン又はテストステロンの
ようなステロイドである。有用な受容体を有する多くの
種類のリガンドが存在する。前記の一覧表は例示に過ぎ
ない。
が有益である： 一般に、分離要素及び分子は、下記の群から選択され
る： 有用な受容体が存在するリガンドの一般例は： ビオチンのようなビタミン、グルコース又はマンノー
スのような糖分子、アドレナリン又はコルチゾンのよう
なホルモン、及びプロゲステロン又はテストステロンの
ようなステロイドである。有用な受容体を有する多くの
種類のリガンドが存在する。前記の一覧表は例示に過ぎ
ない。
分離は、一般に、ラテックス、磁気ビーズ、ニトロセ
ルロース、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミ
ド、ナイロン、ガラス及びポリスチレンから成る群から
一般に選択される固体支持体を含む。
ルロース、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミ
ド、ナイロン、ガラス及びポリスチレンから成る群から
一般に選択される固体支持体を含む。
利点 1.全般的利点 本発明の方法の特定の利点は、本システムが、プライ
マー伸長後に１つのオリゴヌクレオチド上で分離及び検
出成分を結合することである。ほとんどの他のシステム
が、捕獲プローブ及びディテクタープローブの使用を必
要とする。
マー伸長後に１つのオリゴヌクレオチド上で分離及び検
出成分を結合することである。ほとんどの他のシステム
が、捕獲プローブ及びディテクタープローブの使用を必
要とする。
さらなる利点は、本システムが、単数又は複数の（立
体配置による）分離又は検出要素を組み入れるためのプ
ライマーの酵素によって促進される伸長に依っており、
したがって、単数又は複数の成分は特異的プライマーと
共有的に結合する、ということである。この共有結合の
ために、洗浄工程は、バッククラウンドを低減し、特異
性を増大する非常に高いストリンジェンシーで実施し得
る。
体配置による）分離又は検出要素を組み入れるためのプ
ライマーの酵素によって促進される伸長に依っており、
したがって、単数又は複数の成分は特異的プライマーと
共有的に結合する、ということである。この共有結合の
ために、洗浄工程は、バッククラウンドを低減し、特異
性を増大する非常に高いストリンジェンシーで実施し得
る。
別の利点は、本発明の方法が容易に自動化される事で
ある。
ある。
本発明の方法では、工程は簡単なキットフォーマット
に組み込まれる。
に組み込まれる。
さらなる利点は、問題の生物体のゲノムの不変又は可
変領域と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプラ
イマーを用い得るし、したがって高又は低特異性（即ち
属特異的、種特異的、又は系統特異的な）に関して、単
一プローブを用いて特定のポリヌクレオチド配列中の特
定のポリヌクレオチド配列又はヌクレオチド変化の検出
のための迅速且つ高感度の方法を意図し得ることであ
る。
変領域と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプラ
イマーを用い得るし、したがって高又は低特異性（即ち
属特異的、種特異的、又は系統特異的な）に関して、単
一プローブを用いて特定のポリヌクレオチド配列中の特
定のポリヌクレオチド配列又はヌクレオチド変化の検出
のための迅速且つ高感度の方法を意図し得ることであ
る。
一般に、本発明の方法では、非包含検出可能要素を洗
い流し得る固体マトリックスにより検出可能ハイブリッ
ドを捕獲する。これは難かしい工程ではないけれども、
処理に時間を要する。この工程は、検出可能要素を選択
することによって克服し得るし、それによって任意の非
包含検出可能要素は、容易に不活性化され、物理的に除
去されるというより反応混合物中に残される。
い流し得る固体マトリックスにより検出可能ハイブリッ
ドを捕獲する。これは難かしい工程ではないけれども、
処理に時間を要する。この工程は、検出可能要素を選択
することによって克服し得るし、それによって任意の非
包含検出可能要素は、容易に不活性化され、物理的に除
去されるというより反応混合物中に残される。
一般に、103〜104ゲノムコピーのオーダーの検出感度
が、そのそれぞれの疾患状態において通常、中等度〜多
数存在する広範囲のウイルス、細菌及び寄生性生物を検
出するのに非常に適している。感染体が少数でしか存在
しない（例えばHIV）疾患を検出するためには、本発明
の方法は、感度を増大する有効な増幅工程である重合鎖
反応（PCR）の技術を用い得る。
が、そのそれぞれの疾患状態において通常、中等度〜多
数存在する広範囲のウイルス、細菌及び寄生性生物を検
出するのに非常に適している。感染体が少数でしか存在
しない（例えばHIV）疾患を検出するためには、本発明
の方法は、感度を増大する有効な増幅工程である重合鎖
反応（PCR）の技術を用い得る。
2.感染性疾患診断の利点 本発明の方法は、生物物質、特に感染体の試料中の特
定のポリヌクレオチド配列の迅速、簡単且つ非危険的検
出を可能にする。検出可能配列は、ウイルス、細菌、原
生動物又はカビのような感染性生物の一部、あるいはそ
の異常が遺伝的疾患、例えば鎌状赤血球貧血、嚢胞性繊
維症、α−地中海貧血又はβ−地中海貧血を引き起こす
遺伝子の一部であり得る。
定のポリヌクレオチド配列の迅速、簡単且つ非危険的検
出を可能にする。検出可能配列は、ウイルス、細菌、原
生動物又はカビのような感染性生物の一部、あるいはそ
の異常が遺伝的疾患、例えば鎌状赤血球貧血、嚢胞性繊
維症、α−地中海貧血又はβ−地中海貧血を引き起こす
遺伝子の一部であり得る。
成育不可生物は、本発明の方法を用いて検出し得る。
さらなる利点は、広範な疾患状態（例えば、肺炎；マ
イコプラズマ、クラミジア、連鎖球菌、レジュネラ、RS
V）を引き起こすと考えられる一群の体の検出のために
オリゴヌクレオチドプライマーの混合物を用い得ること
である。
イコプラズマ、クラミジア、連鎖球菌、レジュネラ、RS
V）を引き起こすと考えられる一群の体の検出のために
オリゴヌクレオチドプライマーの混合物を用い得ること
である。
3.遺伝性疾患診断の利点 本方法は、ヌクレオチド塩基の変化（点突然変異）の
迅速な検出のために、そしてポリヌクレオチド配列中の
１つ又はそれ以上の挿入又は欠失の検出のために用い得
る。この場合、遺伝的変化は公知で、そしてDNA配列レ
ベルで特徴化されねばならない。
迅速な検出のために、そしてポリヌクレオチド配列中の
１つ又はそれ以上の挿入又は欠失の検出のために用い得
る。この場合、遺伝的変化は公知で、そしてDNA配列レ
ベルで特徴化されねばならない。
単一又はそれ以上の塩基変化の検出は、自動化でき
る。
る。
本方法は、単一（又はそれ以上）のヌクレオチド変化
に対する大規模スクリーニングに適応できる。これは、
嚢胞性繊維症のような遺伝性疾患に対するスクリーニン
グ時に特に重要であるが、しかしDNAプロフィリングに
用いるといったような遺伝子発現に必ずしも関与しない
対立遺伝子の識別にも適応し得る。
に対する大規模スクリーニングに適応できる。これは、
嚢胞性繊維症のような遺伝性疾患に対するスクリーニン
グ時に特に重要であるが、しかしDNAプロフィリングに
用いるといったような遺伝子発現に必ずしも関与しない
対立遺伝子の識別にも適応し得る。
この特定の方法は、固体−液体ハイブリダイゼーショ
ンを包含せず、正確な液体ハイブリダイゼーション条件
は技術的に要求されない。他の系、例えばサザンブロッ
トハイブリダイゼーションは、標的となるポリヌクレオ
チド配列が固体支持体と結合する（技術的に要求され
る）ことを必要とし、及び／又は正確なハイブリダイゼ
ーション条件を要するオリゴヌクレオチドプローブの使
用を必要とする。これらの系は、自動化できず、大規模
スクリーニングに容易に適応し得ない。
ンを包含せず、正確な液体ハイブリダイゼーション条件
は技術的に要求されない。他の系、例えばサザンブロッ
トハイブリダイゼーションは、標的となるポリヌクレオ
チド配列が固体支持体と結合する（技術的に要求され
る）ことを必要とし、及び／又は正確なハイブリダイゼ
ーション条件を要するオリゴヌクレオチドプローブの使
用を必要とする。これらの系は、自動化できず、大規模
スクリーニングに容易に適応し得ない。
図面の簡単な説明 本発明の好ましい態様を、以下の図面を参照して説明
する： 図１は、特定のポリヌクレオチド配列の検出方法の模
式図であり、 図2aは、伸長プライマーのオリゴヌクレオチドプライ
マー部分と結合する分離要素を用いる特定のポリヌクレ
オチド配列の検出方法の模式図であり、 図2bは、伸長プライマーの伸長部分と結合する分離要
素を用いる特定のポリヌクレオチド配列の検出方法の模
式図であり、 図3aは、伸長プライマーのオリゴヌクレオチドプライ
マー部分と結合する分離要素を用いるヌクレオチド又は
塩基変化の検出方法の模式図であり、 図3bは、伸長プライマーの伸長部分と結合する分離要
素を用いるヌクレオチド又は塩基変化の検出方法の模式
図であり、 図3cは、伸長プライマーの伸長部分と結合する検出成
分を用いるヌクレオチド又は塩基変化の検出方法の模式
図であり、 図４は、本発明の第三例で生成される伸長オリゴヌク
レオチドのサイズを実証するために用いるオートラジオ
グラフを示し、 図５は、本発明のいずれか一の方法を実施するための
装置の模式的説明である。
する： 図１は、特定のポリヌクレオチド配列の検出方法の模
式図であり、 図2aは、伸長プライマーのオリゴヌクレオチドプライ
マー部分と結合する分離要素を用いる特定のポリヌクレ
オチド配列の検出方法の模式図であり、 図2bは、伸長プライマーの伸長部分と結合する分離要
素を用いる特定のポリヌクレオチド配列の検出方法の模
式図であり、 図3aは、伸長プライマーのオリゴヌクレオチドプライ
マー部分と結合する分離要素を用いるヌクレオチド又は
塩基変化の検出方法の模式図であり、 図3bは、伸長プライマーの伸長部分と結合する分離要
素を用いるヌクレオチド又は塩基変化の検出方法の模式
図であり、 図3cは、伸長プライマーの伸長部分と結合する検出成
分を用いるヌクレオチド又は塩基変化の検出方法の模式
図であり、 図４は、本発明の第三例で生成される伸長オリゴヌク
レオチドのサイズを実証するために用いるオートラジオ
グラフを示し、 図５は、本発明のいずれか一の方法を実施するための
装置の模式的説明である。
本発明の実施の最良のモード及びその他のモード 本発明の方法の特に好ましい適用は４つある。即ち、
（ｉ）特定のヌクレオチド配列の検出（主要適用：感染
性疾患）、（ii）ヌクレオチド又は塩基変化の検出（主
要適用：遺伝性疾患及びDNAフィンガープリンティン
グ）、（iii）異なる捕獲分子を用いる多数の特定のヌ
クレオチド配列の検出（主要適用：多発性感染症）、及
び（iv）異なるポリヌクレオチド配列における多数のヌ
クレオチド又は塩基変化の検出（主要適用：多発性遺伝
性疾患及びDNAフィンガープリンティング）である。全
適用を伴う使用には、単一装置（最小度の修正を有す
る）が適している。
（ｉ）特定のヌクレオチド配列の検出（主要適用：感染
性疾患）、（ii）ヌクレオチド又は塩基変化の検出（主
要適用：遺伝性疾患及びDNAフィンガープリンティン
グ）、（iii）異なる捕獲分子を用いる多数の特定のヌ
クレオチド配列の検出（主要適用：多発性感染症）、及
び（iv）異なるポリヌクレオチド配列における多数のヌ
クレオチド又は塩基変化の検出（主要適用：多発性遺伝
性疾患及びDNAフィンガープリンティング）である。全
適用を伴う使用には、単一装置（最小度の修正を有す
る）が適している。
1.特定のヌクレオチド配列の検出 図１を参照すると、特定のポリヌクレオチド配列の検
出方法は、先ず、標的となるポリヌクレオチド配列と相
補的なオリゴヌクレオチドプライマーの合成を包含す
る。プライマーの最適長は、最大長30ヌクレオチドまで
の、検出すべきポリヌクレオチド配列の大半の保存配列
の長さに依っている。
出方法は、先ず、標的となるポリヌクレオチド配列と相
補的なオリゴヌクレオチドプライマーの合成を包含す
る。プライマーの最適長は、最大長30ヌクレオチドまで
の、検出すべきポリヌクレオチド配列の大半の保存配列
の長さに依っている。
特異的プライマーは、好ましくは、アシュレーとマク
ドナルド（1984）の方法を用いる不活性固体支持体と結
合する。小型DNA分子が結合し得る任意の不活性支持粒
子、例えばセルロース又はナイロンを用い得る。検出す
べきポリヌクレオチド配列を、特異的プライマーとポリ
ヌクレオチド配列間の迅速なハイブリダイゼーションを
促進する溶液の存在下で、支持体−特異的プライマー抱
合体に付加する。ある適切な溶液は、0.15M 塩化ナト
リウム、0.015M クエン酸ナトリウム、及び４％ポリエ
チレングリコール6000を含有する。次に支持体を洗浄す
る。
ドナルド（1984）の方法を用いる不活性固体支持体と結
合する。小型DNA分子が結合し得る任意の不活性支持粒
子、例えばセルロース又はナイロンを用い得る。検出す
べきポリヌクレオチド配列を、特異的プライマーとポリ
ヌクレオチド配列間の迅速なハイブリダイゼーションを
促進する溶液の存在下で、支持体−特異的プライマー抱
合体に付加する。ある適切な溶液は、0.15M 塩化ナト
リウム、0.015M クエン酸ナトリウム、及び４％ポリエ
チレングリコール6000を含有する。次に支持体を洗浄す
る。
洗浄緩衝液の選択は、ストリンジェンシー条件を確定
する。標準緩衝液は、140mM塩化ナトリウム、15mMクエ
ン酸ナトリウム、及び20mM燐酸ナトリウム,pH7.0であ
る。
する。標準緩衝液は、140mM塩化ナトリウム、15mMクエ
ン酸ナトリウム、及び20mM燐酸ナトリウム,pH7.0であ
る。
４つのデオキシリボヌクレオチド（そのうちの１つを
放射能、ビオチン又は蛍光標識する）の存在下で、DNA
ポリメラーゼＩ（クレノウ断片）又は逆転写酵素を用い
て、特異的プライマーを伸長する。伸長の長さは、全化
学物質が非限定濃度である場合は、伸長反応の時間及び
温度に依る。
放射能、ビオチン又は蛍光標識する）の存在下で、DNA
ポリメラーゼＩ（クレノウ断片）又は逆転写酵素を用い
て、特異的プライマーを伸長する。伸長の長さは、全化
学物質が非限定濃度である場合は、伸長反応の時間及び
温度に依る。
一般に、反応は37℃で30分実施し、標識は32Pであ
る。標識化ヌクレオチドの伸長プライマーへの組み込み
レベルは、標識が32Pである場合、液体シンチレーショ
ンにより測定する。
る。標識化ヌクレオチドの伸長プライマーへの組み込み
レベルは、標識が32Pである場合、液体シンチレーショ
ンにより測定する。
あるいは、標識は蛍光標識であってもよい。
プライマー伸長後、混合物を洗浄し、標識の存在に関
して検定する。
して検定する。
最終洗浄後の標識の存在は、プライマーが伸長され、
したがって存在が検定される核酸が存在することを示
す。特異的プライマーは、鋳型として相補的な核酸を用
いて伸長し得るだけである。
したがって存在が検定される核酸が存在することを示
す。特異的プライマーは、鋳型として相補的な核酸を用
いて伸長し得るだけである。
要するに、本方法は、以下の工程を包含する： 公知の又は一部公知の核酸配列、即ち標的の部分と相
補的な特異的プライマーの合成。
補的な特異的プライマーの合成。
捕獲（立体配置Ａ−図2a）又はディテクター（立体配
置Ｂ−図2b）分子の特異的プライマーの５′末端への結
合。
置Ｂ−図2b）分子の特異的プライマーの５′末端への結
合。
溶液中での、この特異的プライマーの標的核酸配列と
のハイブリダイゼーション。
のハイブリダイゼーション。
特異的プライマーの酵素性伸長に適した条件下での４
つのデオキシリボヌクレオチド、及びDNA依存DNAポリメ
ラーゼ（標的がDNAである場合）又はRNA依存DNAポリメ
ラーゼ（標的がRNAである場合）の溶液の付加。１つ又
はそれ以上のデオキシリボヌクレオチドは、ディテクタ
ー分子（立体配置Ａ）又は捕獲分子（立体配置Ｂ）をそ
れに共有結合した、 ポリメラーゼ酵素は、鋳型として標的となる核酸を用
いてプライマーを伸長し、同時にディテクター又は捕獲
分子を伸長プライマー中に組み込む。
つのデオキシリボヌクレオチド、及びDNA依存DNAポリメ
ラーゼ（標的がDNAである場合）又はRNA依存DNAポリメ
ラーゼ（標的がRNAである場合）の溶液の付加。１つ又
はそれ以上のデオキシリボヌクレオチドは、ディテクタ
ー分子（立体配置Ａ）又は捕獲分子（立体配置Ｂ）をそ
れに共有結合した、 ポリメラーゼ酵素は、鋳型として標的となる核酸を用
いてプライマーを伸長し、同時にディテクター又は捕獲
分子を伸長プライマー中に組み込む。
その反応液を加熱変性し、そのサイクルを繰り返して
伸長特異的プライマーの量を増幅する。
伸長特異的プライマーの量を増幅する。
立体配置Ａに関しては、特異的親和性分子（固体支持
体に結合）を、捕獲分子と特異的親和性分子との結合を
実施し得る条件下で溶液に付加する。
体に結合）を、捕獲分子と特異的親和性分子との結合を
実施し得る条件下で溶液に付加する。
立体配置Ｂに関しては、伸長特異的プライマーをエタ
ノールで沈殿し、洗浄して未包含デオキシリボヌクレオ
チド捕獲分子複合体を除去する。洗浄後、伸長特異的プ
ライマーを、捕獲分子と特異的親和性分子とを結合する
ための溶液中に再懸濁する。次に、特異的親和性分子
（固体支持体に結合）を付加し、伸長特異的プライマー
が捕獲分子を介して特異的親和性分子−固体支持体複合
体に結合したら直に、高ストリンジェンシー条件下でそ
の混合液を洗浄し、洗浄工程終了時に、ディテクター分
子を検出するのに適した手法を用いてその混合液を検定
する。
ノールで沈殿し、洗浄して未包含デオキシリボヌクレオ
チド捕獲分子複合体を除去する。洗浄後、伸長特異的プ
ライマーを、捕獲分子と特異的親和性分子とを結合する
ための溶液中に再懸濁する。次に、特異的親和性分子
（固体支持体に結合）を付加し、伸長特異的プライマー
が捕獲分子を介して特異的親和性分子−固体支持体複合
体に結合したら直に、高ストリンジェンシー条件下でそ
の混合液を洗浄し、洗浄工程終了時に、ディテクター分
子を検出するのに適した手法を用いてその混合液を検定
する。
2.ヌクレオチド又は塩基変化の検出 本方法は以下の工程を包含する： 公知の又は一部公知の核酸配列、即ち標的の部分と相
補的な特異的プライマーの合成。特異的プライマー配列
は、検出すべき単一ヌクレオチド又は塩基に直接隣接す
るがしかしそれを含まないか、あるいは検出すべきヌク
レオチド又は塩基に直接隣接しないがしかし結合プライ
マー及び検出すべきヌクレオチド又は塩基間に介在配列
を有する標的配列と相補的である。
補的な特異的プライマーの合成。特異的プライマー配列
は、検出すべき単一ヌクレオチド又は塩基に直接隣接す
るがしかしそれを含まないか、あるいは検出すべきヌク
レオチド又は塩基に直接隣接しないがしかし結合プライ
マー及び検出すべきヌクレオチド又は塩基間に介在配列
を有する標的配列と相補的である。
捕獲（立体配置Ａ−図3a）又はディテクター（立体配
置Ｂ−図3b）分子と特異的プライマーの５′末端との結
合。立体配置Ｃ（図3c）に関しては、捕獲又はディテク
ター分子はいずれも５′末端で特異的プライマーに結合
しない。
置Ｂ−図3b）分子と特異的プライマーの５′末端との結
合。立体配置Ｃ（図3c）に関しては、捕獲又はディテク
ター分子はいずれも５′末端で特異的プライマーに結合
しない。
溶液中での、この特異的プライマーの標的核酸配列と
のハイブリダイゼーション。
のハイブリダイゼーション。
ジデオキシリボヌクレオチド（又はデオキシリボヌク
レオチド）の１つの種類のみ、即ち標的配列中の検出す
べき塩基又はヌクレオチドと対合又は水素結合するも
の、及び特異的プライマーの酵素性伸長に適した条件下
でのDNA依存DNAポリメラーゼ（標的がDNAである場合）
又はRNA依存DNAポリメラーゼ（標的がRNAである場合）
の溶液への付加。ジデオキシリボヌクレオチド（又はデ
オキシリボヌクレオチド）は、ディテクター分子（立体
配置Ａ及びＣ）又は捕獲分子（立体配置Ｂ）をそれに共
有結合した。
レオチド）の１つの種類のみ、即ち標的配列中の検出す
べき塩基又はヌクレオチドと対合又は水素結合するも
の、及び特異的プライマーの酵素性伸長に適した条件下
でのDNA依存DNAポリメラーゼ（標的がDNAである場合）
又はRNA依存DNAポリメラーゼ（標的がRNAである場合）
の溶液への付加。ジデオキシリボヌクレオチド（又はデ
オキシリボヌクレオチド）は、ディテクター分子（立体
配置Ａ及びＣ）又は捕獲分子（立体配置Ｂ）をそれに共
有結合した。
ポリメラーゼ酵素は、鋳型として標的核酸を用いてプ
ライマーを伸長し、塩基対が可能な場合には、ジデオキ
シリボヌクレオチド（又はデオキシリボヌクレオチド）
の１分子のみを付加する。ジデオキシリボヌクレオチド
（又はデオキシリボヌクレオチド）及び標的配列間の塩
基対が考えられない場合は、特異的プライマーは伸長さ
れない。ディテクター（立体配置Ａ及びＣ）又は捕獲
（立体配置Ｂ）分子。
ライマーを伸長し、塩基対が可能な場合には、ジデオキ
シリボヌクレオチド（又はデオキシリボヌクレオチド）
の１分子のみを付加する。ジデオキシリボヌクレオチド
（又はデオキシリボヌクレオチド）及び標的配列間の塩
基対が考えられない場合は、特異的プライマーは伸長さ
れない。ディテクター（立体配置Ａ及びＣ）又は捕獲
（立体配置Ｂ）分子。
その反応液を加熱変性し、そのサイクルを繰り返して
伸長特異的プライマーの量を増幅する。
伸長特異的プライマーの量を増幅する。
立体配置Ａに関しては、特異的親和性分子（固体支持
体に結合）を、捕獲分子と特異的親和性分子との結合を
実施し得る条件下で溶液に付加する。
体に結合）を、捕獲分子と特異的親和性分子との結合を
実施し得る条件下で溶液に付加する。
立体配置Ｂに関しては、伸長特異的プライマーをエタ
ノールで沈殿し、洗浄して未包含ジデオキシリボヌクレ
オチド−捕獲分子複合体（又はデオキシリボヌクレオチ
ド−捕獲分子複合体）を除去する。洗浄後、伸長特異的
プライマーを、捕獲分子と特異的親和性分子とを結合す
るための溶液中に再懸濁する。次に、特異的親和性分子
（固体支持体に結合）を付加する。
ノールで沈殿し、洗浄して未包含ジデオキシリボヌクレ
オチド−捕獲分子複合体（又はデオキシリボヌクレオチ
ド−捕獲分子複合体）を除去する。洗浄後、伸長特異的
プライマーを、捕獲分子と特異的親和性分子とを結合す
るための溶液中に再懸濁する。次に、特異的親和性分子
（固体支持体に結合）を付加する。
立体配置Ａ及びＢに関しては、伸長特異的プライマー
が捕獲分子を介して特異的親和性分子−固体支持体複合
体に結合したら直に、高ストリンジェンシー条件下でそ
の混合液を洗浄する。
が捕獲分子を介して特異的親和性分子−固体支持体複合
体に結合したら直に、高ストリンジェンシー条件下でそ
の混合液を洗浄する。
立体配置Ａ及びＢに関しては、洗浄工程終了後に、デ
ィテクター分子を検出するのに適した手法を用いてその
混合液を検定する。
ィテクター分子を検出するのに適した手法を用いてその
混合液を検定する。
立体配置Ｃに関しては、反応混合液を好適な組成物の
アガロース又はポリアクリルアミドゲルのレーン上に置
き、電気泳動処理して、伸長特異的プライマー−ディテ
クター分子複合体を分解し、ディテクター分子の検出に
適した手法を用いて最終的に検定する。標識化サイズ基
準は、一般に別のレーンのゲル中に含まれる。
アガロース又はポリアクリルアミドゲルのレーン上に置
き、電気泳動処理して、伸長特異的プライマー−ディテ
クター分子複合体を分解し、ディテクター分子の検出に
適した手法を用いて最終的に検定する。標識化サイズ基
準は、一般に別のレーンのゲル中に含まれる。
3.異なる捕獲分子を用いる多発性特異的ヌクレオチド配
列、即ち多発性感染性疾患の検出 本方法は、以下の工程を包含する： 異なる公知の核酸配列、即ち標的と相補的な多数の異
なる特異的プライマーの合成。
列、即ち多発性感染性疾患の検出 本方法は、以下の工程を包含する： 異なる公知の核酸配列、即ち標的と相補的な多数の異
なる特異的プライマーの合成。
異なる捕獲分子と、異なる特異的プライマーの５′末
端との結合。
端との結合。
溶液中での、これらの異なる特異的プライマー（異な
る捕獲分子との結合を伴う）の、異なる特異的プライマ
ーが相補的である異なる標的核酸配列とのハイブリダイ
ゼーション。
る捕獲分子との結合を伴う）の、異なる特異的プライマ
ーが相補的である異なる標的核酸配列とのハイブリダイ
ゼーション。
これらの得意的プライマーが、相補的な標的となる核
酸配列である場合、特異的プライマーの酵素性伸長に適
した条件下での４つのデオキシリボヌクレオチド、及び
DNA依存DNAポリメラーゼ（標的がすべてのDNAである場
合）又はRNA依存DNAポリメラーゼ（標的がすべてのRNA
である場合）の、又は両方のポリメラーゼ（標的がDNA
とRNAの混合物である場合）の溶液の付加。１つ又はそ
れ以上のデオキシリボヌクレオチドは、ディテクター分
子をそれに共有結合した、 ポリメラーゼ酵素は、鋳型として異なる標的となる核
酸配列を用いて異なる特異的プライマーを伸長し、同時
にディテクター分子を伸長プライマー中に組み込む。
酸配列である場合、特異的プライマーの酵素性伸長に適
した条件下での４つのデオキシリボヌクレオチド、及び
DNA依存DNAポリメラーゼ（標的がすべてのDNAである場
合）又はRNA依存DNAポリメラーゼ（標的がすべてのRNA
である場合）の、又は両方のポリメラーゼ（標的がDNA
とRNAの混合物である場合）の溶液の付加。１つ又はそ
れ以上のデオキシリボヌクレオチドは、ディテクター分
子をそれに共有結合した、 ポリメラーゼ酵素は、鋳型として異なる標的となる核
酸配列を用いて異なる特異的プライマーを伸長し、同時
にディテクター分子を伸長プライマー中に組み込む。
その反応物を加熱変性し、そのサイクルを繰り返して
異なる伸長特異的プライマーの量を増幅する。
異なる伸長特異的プライマーの量を増幅する。
異なる特異的親和性分子（異なるそれぞれの捕獲分子
に対する特異的親和性を有し、“試験ストリップ”のよ
うな固体支持体に結合する）を、異なる捕獲分子とそれ
らの異なる特異的親和性分子との結合を実施させる条件
下で溶液中に付加する。
に対する特異的親和性を有し、“試験ストリップ”のよ
うな固体支持体に結合する）を、異なる捕獲分子とそれ
らの異なる特異的親和性分子との結合を実施させる条件
下で溶液中に付加する。
一旦、異なる伸長特異的プライマーが異なる捕獲分子
を介してそれらの特異的親和性分子−固体支持体複合体
と結合すれば、各々の異なる複合体を適切な試験ストリ
ップで個別に除去し、次いでこれを高ストリンジェンシ
ー条件下で広範に洗浄する。
を介してそれらの特異的親和性分子−固体支持体複合体
と結合すれば、各々の異なる複合体を適切な試験ストリ
ップで個別に除去し、次いでこれを高ストリンジェンシ
ー条件下で広範に洗浄する。
洗浄工程終了時に、特定のディテクター分子に適した
手法を用いて、ディテクター分子の存在に関して試験ス
トリップの１つを検定する。検定が、ディテクター分子
が試験ストリップ上に存在することを示す場合には、こ
れはその特定の検出可能分子を有するプライマーにより
標的される特異的ヌクレオチド配列が試験試料中に存在
することを示す。検定がディテクター分子が試験ストリ
ップ上に存在しないことを示す場合には、これはその特
定の検出可能分子を有するプライマーにより標的される
特異的ヌクレオチド配列が試験試料中に存在しないこと
を示す。
手法を用いて、ディテクター分子の存在に関して試験ス
トリップの１つを検定する。検定が、ディテクター分子
が試験ストリップ上に存在することを示す場合には、こ
れはその特定の検出可能分子を有するプライマーにより
標的される特異的ヌクレオチド配列が試験試料中に存在
することを示す。検定がディテクター分子が試験ストリ
ップ上に存在しないことを示す場合には、これはその特
定の検出可能分子を有するプライマーにより標的される
特異的ヌクレオチド配列が試験試料中に存在しないこと
を示す。
各試験ストリップに関して、最終工程の操作を繰り返
す。
す。
4.異なるポリヌクレオチド配列中の多発性ヌクレオチド
又は塩基変化、即ち多発性遺伝子欠損又は遺伝子病、又
は遺伝子フィンガープリンティングの検出 本方法は、以下の工程を包含する： 異なる公知の核酸配列、即ち標的と相補的な多数の異
なる特異的プライマーの合成。異なる特異的プライマー
は、検出すべき単一塩基に直接隣接するそれらのそれぞ
れの異なる標的配列と相補的である 異なる捕獲分子と異なる特異的プライマーの５′末端
との結合。
又は塩基変化、即ち多発性遺伝子欠損又は遺伝子病、又
は遺伝子フィンガープリンティングの検出 本方法は、以下の工程を包含する： 異なる公知の核酸配列、即ち標的と相補的な多数の異
なる特異的プライマーの合成。異なる特異的プライマー
は、検出すべき単一塩基に直接隣接するそれらのそれぞ
れの異なる標的配列と相補的である 異なる捕獲分子と異なる特異的プライマーの５′末端
との結合。
溶液中での、これらの異なる特異的プライマーの、そ
れらの異なるそれぞれの標的核酸配列とのハイブリダイ
ゼーション。
れらの異なるそれぞれの標的核酸配列とのハイブリダイ
ゼーション。
異なる特異的プライマーの酵素性伸長に適した条件下
での４つの種類全てのジデオキシリボヌクレオチド（例
えば、ddATP、ddCTP、ddGTP、及びddTTP）、及びDNA依
存DNAポリメラーゼ（標的がDNAである場合）又はRNA依
存のDNAポリメラーゼ（標的がRNAである場合）、あるい
は両方（標的がDNA及びRNAの混合物である場合）の溶液
の付加。各ジデオキシリボヌクレオチドは、異なるディ
テクター分子をそれに共有結合した、 ポリメラーゼ酵素は、鋳型として異なる標的核酸配列
を用いて異なる特異的プライマーを伸長し、１つのジデ
オキシリボヌクレオチドの１分子のみを付加する。
での４つの種類全てのジデオキシリボヌクレオチド（例
えば、ddATP、ddCTP、ddGTP、及びddTTP）、及びDNA依
存DNAポリメラーゼ（標的がDNAである場合）又はRNA依
存のDNAポリメラーゼ（標的がRNAである場合）、あるい
は両方（標的がDNA及びRNAの混合物である場合）の溶液
の付加。各ジデオキシリボヌクレオチドは、異なるディ
テクター分子をそれに共有結合した、 ポリメラーゼ酵素は、鋳型として異なる標的核酸配列
を用いて異なる特異的プライマーを伸長し、１つのジデ
オキシリボヌクレオチドの１分子のみを付加する。
その反応物を加熱変性し、そのサイクルを繰り返して
異なる伸長特異的プライマーの量を増幅する。
異なる伸長特異的プライマーの量を増幅する。
特異的親和性分子（異なるそれぞれの捕獲分子に対す
る特異的親和性を有し、“試験ストリップ”のような固
体支持体に結合する）を、異なる捕獲分子とそれらの異
なる特異的親和性分子との結合を実施させる条件下で溶
液中に付加する。
る特異的親和性を有し、“試験ストリップ”のような固
体支持体に結合する）を、異なる捕獲分子とそれらの異
なる特異的親和性分子との結合を実施させる条件下で溶
液中に付加する。
一旦、異なる伸長特異的プライマーが異なる捕獲分子
を介してそれらの特異的親和性分子−固体支持体複合体
と結合すれば、各々の異なる複合体を適切な試験ストリ
ップで個別に除去し、次いでこれを高ストリンジェンシ
ー条件下で広範に洗浄する。
を介してそれらの特異的親和性分子−固体支持体複合体
と結合すれば、各々の異なる複合体を適切な試験ストリ
ップで個別に除去し、次いでこれを高ストリンジェンシ
ー条件下で広範に洗浄する。
洗浄工程終了時に、特定のディテクター分子に適した
手法を用いて、ディテクター分子の存在に関して試験ス
トリップの１つを検定する。検定が、ディテクター分子
が試験ストリップ上に存在することを示す場合には、こ
れはその特定の検出可能分子を有するプライマーにより
標的される特異的ヌクレオチド配列が試験試料中に存在
することを示す。検定がディテクター分子が試験ストリ
ップ上に存在しないことを示す場合には、これはその特
定の検出可能分子を有するプライマーにより標的される
特異的ヌクレオチド配列が試験試料中に存在しないこと
を示す。
手法を用いて、ディテクター分子の存在に関して試験ス
トリップの１つを検定する。検定が、ディテクター分子
が試験ストリップ上に存在することを示す場合には、こ
れはその特定の検出可能分子を有するプライマーにより
標的される特異的ヌクレオチド配列が試験試料中に存在
することを示す。検定がディテクター分子が試験ストリ
ップ上に存在しないことを示す場合には、これはその特
定の検出可能分子を有するプライマーにより標的される
特異的ヌクレオチド配列が試験試料中に存在しないこと
を示す。
各試験ストリップに関して、最終工程の操作を繰り返
す。
す。
5.本発明の方法を実施するための装置 図５を参照すると、装置100は、一般に、非自動又は
自動操作により本発明の方法を実施するのに適してい
る。伸長及び分離操作は、支持容器11内に配置される着
脱可能な反応器10内で行う。容器11は温度制御ジャケッ
ト12によって制御される温度である。反応器10の内容物
を、振盪器13を用いて容器11を振盪することによって混
合する。反応器10の底面は、膜支持体15に支持される特
異的多孔性膜14を有する。反応器10は、着脱可能反応器
21に対する支持により容器11中に支持される。
自動操作により本発明の方法を実施するのに適してい
る。伸長及び分離操作は、支持容器11内に配置される着
脱可能な反応器10内で行う。容器11は温度制御ジャケッ
ト12によって制御される温度である。反応器10の内容物
を、振盪器13を用いて容器11を振盪することによって混
合する。反応器10の底面は、膜支持体15に支持される特
異的多孔性膜14を有する。反応器10は、着脱可能反応器
21に対する支持により容器11中に支持される。
試料物質、プライマー、及び伸長試薬を、それぞれの
容器16、17、及び18から反応器10に供給する。一定温度
で静かに混合しながら、適切な期間、プライマーアニー
リング及び伸長が起こる。この反応は、プライマーが特
異的ポリヌクレオチド配列の一部と相補的な配列を有す
る特異的ポリヌクレオチド配列を試料が有する場合、検
出可能な成分及び分離成分を有する伸長プライマーを生
成する。
容器16、17、及び18から反応器10に供給する。一定温度
で静かに混合しながら、適切な期間、プライマーアニー
リング及び伸長が起こる。この反応は、プライマーが特
異的ポリヌクレオチド配列の一部と相補的な配列を有す
る特異的ポリヌクレオチド配列を試料が有する場合、検
出可能な成分及び分離成分を有する伸長プライマーを生
成する。
次いで、分離成分に対する不活性支持体と結合する特
異的親和性分子（SAM（Ｓ））をSAM供給容器19から反応
器10に付加し、適切な期間、伸長プライマーと反応させ
る。次に、未反応試薬、緩衝液、及び未伸長プライマー
を、真空ポンプ24を有し、支持容器11の底面に結合する
真空ライン25を介して廃棄容器25に除去する一方、SAM
（Ｓ）と結合している伸長プライマーは、膜14により反
応器10内に保持される。保持プライマー−SAM複合体
を、容器22から供給される洗浄試薬で洗浄してバックグ
ラウンドを除去し、それによって反応器10内に一次画分
を生成する。次に、一次画分をディテクター23で、検出
可能要素の存在に関して調べる。一般に、検出可能要素
は32Pのような放射性成分であって、ディテクター23は
シンチレーション計数器である。
異的親和性分子（SAM（Ｓ））をSAM供給容器19から反応
器10に付加し、適切な期間、伸長プライマーと反応させ
る。次に、未反応試薬、緩衝液、及び未伸長プライマー
を、真空ポンプ24を有し、支持容器11の底面に結合する
真空ライン25を介して廃棄容器25に除去する一方、SAM
（Ｓ）と結合している伸長プライマーは、膜14により反
応器10内に保持される。保持プライマー−SAM複合体
を、容器22から供給される洗浄試薬で洗浄してバックグ
ラウンドを除去し、それによって反応器10内に一次画分
を生成する。次に、一次画分をディテクター23で、検出
可能要素の存在に関して調べる。一般に、検出可能要素
は32Pのような放射性成分であって、ディテクター23は
シンチレーション計数器である。
ディテクター分子が存在することを検定が示す場合に
は、これは特異的ヌクレオチド配列が試験試料中に存在
することを示す。ディテクター分子が存在しないことを
検定が示す場合には、これは特異的ヌクレオチド配列が
試験試料中に存在しないことを示す。
は、これは特異的ヌクレオチド配列が試験試料中に存在
することを示す。ディテクター分子が存在しないことを
検定が示す場合には、これは特異的ヌクレオチド配列が
試験試料中に存在しないことを示す。
実施例 実施例１ 特定のポリヌクレオチド配列の検出についてのこの実
施例では、バクテリオファージM13の１本鎖ゲノムDNAの
検出のために、図１に示した方法を用いた。
施例では、バクテリオファージM13の１本鎖ゲノムDNAの
検出のために、図１に示した方法を用いた。
1.合成プライマーの合成 M13 ssDNAと相補的な17−mer DNAを、Applied Bio
systems DNA Synthesizerで合成した。
systems DNA Synthesizerで合成した。
17−merは、以下のヌクレオチド配列を有した： このプライマーはM13 １本鎖DNAと相補的であるだけ
でなく、細菌２本鎖DNAプラスミドpUC1とも相補的であ
った。
でなく、細菌２本鎖DNAプラスミドpUC1とも相補的であ
った。
2.プライマーのセルロースとの結合 プライマーをABM−セルロースに結合するために、ア
シュレーとマクドナルド（1984）の方法を用いた。ABM
−セルロース上のアミノベンジルオキシメチル（ABM）
基をジアゾ化してジアゾベンジルオキシメチル−セルロ
ース（DBM−セルロース）を生成した。特異的プライマ
ーをDBM−セルロースと結合した。約40μｇの特異的プ
ライマーを20mgのセルロースと結合した。
シュレーとマクドナルド（1984）の方法を用いた。ABM
−セルロース上のアミノベンジルオキシメチル（ABM）
基をジアゾ化してジアゾベンジルオキシメチル−セルロ
ース（DBM−セルロース）を生成した。特異的プライマ
ーをDBM−セルロースと結合した。約40μｇの特異的プ
ライマーを20mgのセルロースと結合した。
3.標的核酸による特異的プライマー−セルロース（SP−
セルロース）のハイブリダイゼーション SP−セルロースを標的核酸 M13 ssDNA又はpUC12、
及び水を含有する溶液に懸濁した。これを混合し、５分
間煮沸して、氷上で冷やした。次に、140mM 塩化ナト
リウム、15mMクエン酸ナトリウム、及び20mM燐酸ナトリ
ウム,pH7.0を含有する洗浄緩衝液を用いて遠心分離で、
その混合物を洗浄して、SP−セルロースとハイブリダイ
ズしなかった核酸を除去した。
セルロース）のハイブリダイゼーション SP−セルロースを標的核酸 M13 ssDNA又はpUC12、
及び水を含有する溶液に懸濁した。これを混合し、５分
間煮沸して、氷上で冷やした。次に、140mM 塩化ナト
リウム、15mMクエン酸ナトリウム、及び20mM燐酸ナトリ
ウム,pH7.0を含有する洗浄緩衝液を用いて遠心分離で、
その混合物を洗浄して、SP−セルロースとハイブリダイ
ズしなかった核酸を除去した。
4.プライマー伸長 DNAポリメラーゼＩ（クレノウ断片）を標識化及び非
標識化ヌクレオチドとともに用いて、特異的プライマー
を伸長した。
標識化ヌクレオチドとともに用いて、特異的プライマー
を伸長した。
反応条件を以下に示す： 20:1 反応混合液 50mM トリス−HCl,pH8.3 8mM 塩化マグネシウム 4mM ジチオトレイトール 4mM ピロ燐酸ナトリウム 1mM 各々dATP、dGTP、及びdTTP 1Ci 32p dCTP ７単位 DNAポリメラーゼＩ、クレノウ断片 ポリエチレングリコール6000を付加して最終濃度を４
％にすると、放射能の取り込みが３倍まで増大すること
が判明した。
％にすると、放射能の取り込みが３倍まで増大すること
が判明した。
反応混合液を20℃で２時間インキュベートした。
インキュベーション終了時に、遠心分離によって４回
SP−セルロースを洗浄することにより、非包含ヌクレオ
チドを除去した。洗浄緩衝液は140mM塩化ナトリウム、1
5mMクエン酸ナトリウム、及び20mM燐酸ナトリウム,pH7.
0であった。試料を室温で１分間掻き回し、次いで12,00
0gで５分間遠心分離した。これを４回繰り返した。
SP−セルロースを洗浄することにより、非包含ヌクレオ
チドを除去した。洗浄緩衝液は140mM塩化ナトリウム、1
5mMクエン酸ナトリウム、及び20mM燐酸ナトリウム,pH7.
0であった。試料を室温で１分間掻き回し、次いで12,00
0gで５分間遠心分離した。これを４回繰り返した。
最後に、SP−セルロースを、シンチレーション溶液を
含有するバイアルに付加して、液体シンチレーション計
数器を用いて取り込みを測定した。
含有するバイアルに付加して、液体シンチレーション計
数器を用いて取り込みを測定した。
実施例２ 本発明の第二の態様による、特定のポリヌクレオチド
配列の検出についてのこの実施例では、以下のオリゴヌ
クレオチドプライマーを用いて、バクテリオファージM1
3 mp18からの１本鎖ゲノムDNAを検出した： 本実施例に用いた立体配置を図2bに示す； 本実施例におけるディテクター分子は32pであって、
特異的プライマーの５′末端と結合する；捕獲分子はビ
オチンであって、ビオチン−16−dUTP（dTTPの類似化合
物）として伸長プライマー中に取り込まれる；特異的親
和性分子はストレプトアビジンであり、固体支持体はア
ガロースである。
配列の検出についてのこの実施例では、以下のオリゴヌ
クレオチドプライマーを用いて、バクテリオファージM1
3 mp18からの１本鎖ゲノムDNAを検出した： 本実施例に用いた立体配置を図2bに示す； 本実施例におけるディテクター分子は32pであって、
特異的プライマーの５′末端と結合する；捕獲分子はビ
オチンであって、ビオチン−16−dUTP（dTTPの類似化合
物）として伸長プライマー中に取り込まれる；特異的親
和性分子はストレプトアビジンであり、固体支持体はア
ガロースである。
オリゴヌクレオチド合成器を用いて特異的プライマー
を合成し、以下のように、ポリヌクレオチドキナーゼを
用いて32pで５′末端標識化した： 反応混合物： 特異的プライマー（50pモル５′OH末端） １μｌ 100mM ジチオトレイトール ５μｌ 10xTM緩衝液（600mMトリス、pH7.6;90mM MgCl2） ５μｌ γ−32P−dATP（3000Ci/mmole） 15μｌ T4ポリヌクレオチドキナーゼ ２μｌ ddH2O 22μｌ 反応混合液を37℃で20分、インキュベートした。標識
化プライマーを、DEAEセルロースカラムを用いて非包含
32Pから分離した。
を合成し、以下のように、ポリヌクレオチドキナーゼを
用いて32pで５′末端標識化した： 反応混合物： 特異的プライマー（50pモル５′OH末端） １μｌ 100mM ジチオトレイトール ５μｌ 10xTM緩衝液（600mMトリス、pH7.6;90mM MgCl2） ５μｌ γ−32P−dATP（3000Ci/mmole） 15μｌ T4ポリヌクレオチドキナーゼ ２μｌ ddH2O 22μｌ 反応混合液を37℃で20分、インキュベートした。標識
化プライマーを、DEAEセルロースカラムを用いて非包含
32Pから分離した。
M13 mp18又はラムダバクテリオファージ（非相同対
照として）で、以下の反応混合物を用いて、プライマー
伸長反応を実施した。
照として）で、以下の反応混合物を用いて、プライマー
伸長反応を実施した。
反応混合物を37℃で60分インキュベートした。インキ
ュベーション完了時に、伸長プライマーをエタノールで
沈殿させて、非包含ビオチン−16−dUTPを除去した。反
応混合物に１容積（50μｌ）の5M酢酸アンモニウム及び
250μｌのエタノールを加え、その後短時間混合して、
−20℃で１時間インキュベートした。遠心分離で沈殿物
を集め、短時間乾燥して、50μｌのddH2Oに再懸濁し、
予め結合緩衝液（10mMトリス塩酸,pH7.5;200mM NaCl;1
mM EDTA）で平衡させた200μｌストレプトアビジン／
アガロースカラム（0.12mgストレプトアビジン含有）に
用いた。カラムを約500μｌの結合緩衝液で５回洗浄し
た。ストレプトアビジン／アガロースを1ml結合緩衝液
に懸濁して、これに6mlのシンチレーション液を付加
し、混合液を液体シンチレーションカウンターで計数し
た。
ュベーション完了時に、伸長プライマーをエタノールで
沈殿させて、非包含ビオチン−16−dUTPを除去した。反
応混合物に１容積（50μｌ）の5M酢酸アンモニウム及び
250μｌのエタノールを加え、その後短時間混合して、
−20℃で１時間インキュベートした。遠心分離で沈殿物
を集め、短時間乾燥して、50μｌのddH2Oに再懸濁し、
予め結合緩衝液（10mMトリス塩酸,pH7.5;200mM NaCl;1
mM EDTA）で平衡させた200μｌストレプトアビジン／
アガロースカラム（0.12mgストレプトアビジン含有）に
用いた。カラムを約500μｌの結合緩衝液で５回洗浄し
た。ストレプトアビジン／アガロースを1ml結合緩衝液
に懸濁して、これに6mlのシンチレーション液を付加
し、混合液を液体シンチレーションカウンターで計数し
た。
M13及びラムダ系に関する結果を以下に示す： 鋳型 cpm M13 29,055 ラムダ 1,043 結果は、相同性鋳型、M13の存在下でのみプライマー
は特異的に伸長されるが、しかし非相同鋳型、ラムダの
存在下では伸長されないことが実証された。さらに、ビ
オチンは伸長プライマー中に取り込まれた。
は特異的に伸長されるが、しかし非相同鋳型、ラムダの
存在下では伸長されないことが実証された。さらに、ビ
オチンは伸長プライマー中に取り込まれた。
実施例３ ヌクレオチド塩基変化の検出に関する本発明の使用に
ついてのこの実施例では、図3cに示す立体配置を用い
た。検出されたM13配列及び用いたオリゴヌクレオチド
プライマーを以下に示す： オリゴヌクレオチド合成器を用いて特異的プライマー
を合成した。
ついてのこの実施例では、図3cに示す立体配置を用い
た。検出されたM13配列及び用いたオリゴヌクレオチド
プライマーを以下に示す： オリゴヌクレオチド合成器を用いて特異的プライマー
を合成した。
反応混合物は、以下のように設定した： 500ngM13mp18ssDNA 2.5μｌ 0.8pモル特異的プライマー 2.0μｌ 10x反応緩衝液 1.5μｌ ddH2O 1.0μｌ この反応混合液を、55℃で10分間インキュベートし、
その時点で以下を付加した：32 P dATP（3000Ci/mmole,10mCi/ml） 0.5μｌ32 P ddATP（3000Ci/mmole,10mCi/ml） 1.5μｌ DNAポリメラーゼ（クレノウ）（１単位／μｌ）1.0μｌ この反応混合液を25℃でさらに15分インキュベートし
た。４μｌのホルムアミド色素（95％ホルムアミド、0.
1％キシレンシアノール、0.1％ブロモフェノールブル
ー）を付加して、反応を停止した。反応混合液を100℃
で３分加熱して、その後20％ポリアクリルアミドゲル上
に置き、30ミリアンペアで30分間電気泳動処理した。次
にゲルを10％酢酸中に固定し、ddH2Oで洗浄して、−80
℃で12時間、Ｘ線フィルムに露出した。
その時点で以下を付加した：32 P dATP（3000Ci/mmole,10mCi/ml） 0.5μｌ32 P ddATP（3000Ci/mmole,10mCi/ml） 1.5μｌ DNAポリメラーゼ（クレノウ）（１単位／μｌ）1.0μｌ この反応混合液を25℃でさらに15分インキュベートし
た。４μｌのホルムアミド色素（95％ホルムアミド、0.
1％キシレンシアノール、0.1％ブロモフェノールブル
ー）を付加して、反応を停止した。反応混合液を100℃
で３分加熱して、その後20％ポリアクリルアミドゲル上
に置き、30ミリアンペアで30分間電気泳動処理した。次
にゲルを10％酢酸中に固定し、ddH2Oで洗浄して、−80
℃で12時間、Ｘ線フィルムに露出した。
その結果生じたオートラジオグラフ（図４）は、18ヌ
クレオチド長のバンドを１つだけ示した。したがって、
プライマーは、標識化アデニン残基の取り込みによる１
ヌクレオチドのみによって伸長され、したがって核酸配
列中の特異的単一ヌクレオチドを検出した。
クレオチド長のバンドを１つだけ示した。したがって、
プライマーは、標識化アデニン残基の取り込みによる１
ヌクレオチドのみによって伸長され、したがって核酸配
列中の特異的単一ヌクレオチドを検出した。
実施例４ 特定のポリヌクレオチド配列の検出についての本実施
例では、バクテリオファージM13の１本鎖ゲノムDNAの検
出のために、図2aの方法を用いた。
例では、バクテリオファージM13の１本鎖ゲノムDNAの検
出のために、図2aの方法を用いた。
1.合成プライマーの合成 MIS ssDNAと相補的な25−mer DNAを、Clontec（US
A）で合成した。
A）で合成した。
25−merは、以下のヌクレオチド配列を有した （ここで、Ｘは修飾ヌクレオチドと共有結合するビオチ
ンである）。
ンである）。
2.ハイブリダイゼーション及びプライマー伸長 プライマーを、M13 DNA（標識）又はニシン精子DNA
（対照）を含有する緩衝液と混合し、DNAポリメラーゼ
Ｉ（クレノウ断片）を用いて伸長した。
（対照）を含有する緩衝液と混合し、DNAポリメラーゼ
Ｉ（クレノウ断片）を用いて伸長した。
反応条件を以下に示す： 50mMトリス pH7.5 10mM MgCl2 4mM DTT 100mM NaCl 50μg/ml ウシ血清アルブミン 各々0.02mMのdATP、dGTP、dTTP 1Ci 32p dCTP 742.5ng/50μｌ M13又はニシン精子DNA 25.8ng/50μｌ ビオチン−プライマー 0.5単位DNAポリメラーゼI,クレノウ断片 反応混合液を37℃で60分インキュベートし、沈殿させ
て終了させ、洗浄した。
て終了させ、洗浄した。
沈殿は、5M酢酸アンモニウム、担体としてコウシ胸腺
DNA、及びエタノールを付加して実施した。遠心分離で
集めたペレットを洗浄液が500cpm未満を含有するまで、
70％エタノールで洗浄した。
DNA、及びエタノールを付加して実施した。遠心分離で
集めたペレットを洗浄液が500cpm未満を含有するまで、
70％エタノールで洗浄した。
次に、洗浄ペレットを、200mM NaCl、10mMトリス p
H7.5、1mM EDTAから成る結合緩衝液中に溶解し、スト
レプトアビジン−アガロースのカラムに入れた。カラム
を数容積の緩衝液で洗浄し、ストレプトアビジン−アガ
ロース（SA）に結合した数を測定して、以下の結果を得
た： 標的 SAに結合したcpm M13 11,939 ニシン精子 83 結果は、標的M13 DNAの存在下で伸長されたプライマ
ーのみがカラムに結合される有意の放射能を生じること
を立証する。
H7.5、1mM EDTAから成る結合緩衝液中に溶解し、スト
レプトアビジン−アガロースのカラムに入れた。カラム
を数容積の緩衝液で洗浄し、ストレプトアビジン−アガ
ロース（SA）に結合した数を測定して、以下の結果を得
た： 標的 SAに結合したcpm M13 11,939 ニシン精子 83 結果は、標的M13 DNAの存在下で伸長されたプライマ
ーのみがカラムに結合される有意の放射能を生じること
を立証する。
産業的利用可能性 本発明の方法は、以下の適用において、容易に用い得
る： ａ）ヒト、動物、及び植物の感染性疾患の、簡単、迅
速、高感度、且つ自動可能検出； ｂ）核酸配列における塩基変化、特に遺伝子欠損及びDN
Aフィンガープリンティングの特異的、迅速且つ大規模
な検出； ｃ）上記の適用による使用のためのキット；及び ｄ）上記の適用による使用のための自動化装置。
る： ａ）ヒト、動物、及び植物の感染性疾患の、簡単、迅
速、高感度、且つ自動可能検出； ｂ）核酸配列における塩基変化、特に遺伝子欠損及びDN
Aフィンガープリンティングの特異的、迅速且つ大規模
な検出； ｃ）上記の適用による使用のためのキット；及び ｄ）上記の適用による使用のための自動化装置。
フロントページの続き (72)発明者 ウォールシュ，テレンス・パトリック オーストラリア国、クィーンズランド 4110、アカシア・リッジ、ステイツマ ン・クレサント 27 (56)参考文献 特開 平１−98499（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 G01N 33/53
Claims (31)
- 【請求項１】特定のヌクレオチドまたは塩基が、物質中
の特定のポリヌクレオチド配列内の特定の位置にあるか
否かを検出する方法であって、 ａ）ハイブリダイゼーション条件下で、該物質を、特定
のポリヌクレオチド配列の一部分と相補的な配列を有す
るオリゴヌクレオチドプライマーに曝露すること、ここ
で、該プライマーは分離要素または検出可能要素を該プ
ライマーの５′末端に取り込み、そして該プライマーは
（ｉ）特定の位置に直接隣接しているか、または（ii）
特定の位置に直接隣接していない該物質中の該特定のポ
リヌクレオチド配列の一部分に結合し、それにより特定
の位置と特定のポリヌクレオチド配列に結合したプライ
マーとの間に介在配列が存在する； ｂ）特定のポリヌクレオチド配列に結合したプライマー
を伸長すること、但し、該特定のヌクレオチドまたは塩
基が、特定のポリヌクレオチド配列内の特定の位置にあ
る場合には、結合したプライマーは該特定のヌクレオチ
ドまたは塩基を含めてそこまでのみ伸長され、ここで、
この伸長プライマーは検出可能要素および／または分離
要素を該特定のヌクレオチドまたは塩基と相補的な位置
に有するが、但し、該伸長プライマーは少なくとも１つ
の分離要素と少なくとも１つの検出可能要素を有し、特
定の位置と特定のポリヌクレオチド配列に結合したプラ
イマーとの間に介在配列がある場合には、更なる条件と
して、介在配列は、介在配列と相補的であって、伸長プ
ライマーに取り込まれている塩基またはヌクレオチドが
干渉検出可能要素および／または分離要素の取り込みを
引き起こす場合のものではあり得ない； ｃ）いずれの伸長プライマーをも画分に分離すること、
ここで、該画分は該伸長プライマーには含まれない検出
可能要素を有していないが、但し、該分離は、それに結
合した該伸長プライマーを有する特定のポリヌクレオチ
ド配列を消化する工程は含まない；および ｄ）該伸長プライマーが該画分中に存在するか否かを、
該画分を該伸長プライマーについてアッセイすることに
よって決定すること、ここで、該伸長プライマーの存在
は、特定のヌクレオチドまたは塩基が特定のポリヌクレ
オチド配列内の特定の位置にあることを示し、そして該
伸長プライマーの非存在は特定のヌクレオチドまたは塩
基が特定のポリヌクレオチド配列内の特定の位置にない
ことを示し、 ここで、該伸長は少なくとも１つのジデオキシヌクレオ
チドを用い、該ジデオキシヌクレオチドは該特定のヌク
レオチドまたは塩基と相補的である： を含む方法。 - 【請求項２】同じまたは異なる特定のヌクレオチドまた
は塩基が、複数の異なるポリヌクレオチド配列を有する
物質中の少なくとも２つの異なる特定のポリヌクレオチ
ド配列内の特定の位置にあるか否かを検出する方法であ
って： ａ）ハイブリダイゼーション条件下で、該物質を、少な
くとも２つの異なるオリゴヌクレオチドプライマーであ
って、該異なるオリゴヌクレオチドプライマーの各々は
該異なる特定のポリヌクレオチド配列の一方の一部分と
相補的な配列を有するプライマーに曝露すること、ここ
で： 該プライマーの各々は、該物質中に存在する場合、その
相補的ポリヌクレオチド配列に結合し、該オリゴヌクレ
オチドプライマーの各々は、他方のプライマーのものに
対する異なる特定のポリヌクレオチド配列の一部分に結
合し、 該プライマーの各々は（ｉ）特定の位置に直接隣接して
いるか、または（ii）特定の位置には直接隣接していな
い該物質中のその相補的な特定のポリヌクレオチド配列
に結合し、それにより該物質中に存在する場合には、特
定の位置と特定のポリヌクレオチド配列に結合したプラ
イマーとの間に介在配列が存在し、そして、 該プライマーの各々は分離要素または検出可能要素を該
プライマーの５′末端に取り込んでいる； ｂ）それらの相補的ポリヌクレオチド配列に結合した該
異なるオリゴヌクレオチドプライマーを伸長すること、
但し、結合したプライマーの各々は、該特定のヌクレオ
チドまたは塩基が特定のヌクレオチド配列内の特定の位
置にある場合には、特定の位置を含めてそこまでのみ伸
長し、ここで、該伸長プライマーの各々は、検出可能な
要素および／または分離要素を、該特定のヌクレオチド
または塩基と相補的な位置に有し、更なる条件として、
該伸長プライマーの各々は少なくとも１つの分離要素お
よび少なくとも１つの検出可能な要素を有し、そして介
在配列が特定の位置と特定のポリヌクレオチド配列に結
合したプライマーとの間にある場合には、更なる条件と
して、介在配列が、介在配列と相補的であって、伸長プ
ライマーに取り込まれている塩基またはヌクレオチドが
干渉検出可能要素および／または分離要素の取り込みを
引き起こす場合のものではあり得ない； ｃ）特定の位置の特定のヌクレオチドまたは塩基までの
み伸長したいずれの伸長プライマーをも少なくとも１つ
の画分に分離すること、ここで、該画分は該伸長プライ
マーに含まれない検出可能要素を有さないが、但し、該
分離はそれに結合した該伸長プライマーを有する特定の
ポリヌクレオチド配列を消化する工程を含まない；およ
び ｄ）該伸長プライマーのいずれかが該画分中に存在する
か否かを、該画分を該伸長プライマーについてアッセイ
することによって決定すること、ここで、伸長プライマ
ーの存在は、特定のヌクレオチドまたは塩基が特定のポ
リヌクレオチド配列内の特定の位置にあることを示し、
そして該伸長プライマーの非存在は少なくとも１つの特
定のヌクレオチドまたは塩基が、少なくとも１つの異な
る特定のポリヌクレオチド配列内の特定の位置にないこ
とを示し、 ここで、該伸長は少なくとも１つのジデオキシヌクレオ
チドを用い、該ジデオキシヌクレオチドは該特定のヌク
レオチドまたは塩基と相補的である： を含む方法。 - 【請求項３】同じまたは異なる特定のヌクレオチドまた
は塩基が、複数の異なるポリヌクレオチド配列を有する
物質中の少なくとも２つの異なる特定のポリヌクレオチ
ド配列内の特定の位置にあるか否かを検出するためのス
クリーニング方法であって： ａ）ハイブリダイゼーション条件下で、該物質を、少な
くとも２つの異なるオリゴヌクレオチドプライマーであ
って、該異なるオリゴヌクレオチドプライマーの各々は
該異なる特定のポリヌクレオチド配列の一つの一部分と
相補的な配列を有するプライマーに曝露すること、ここ
で： 該プライマーの各々は、該物質中に存在する場合、その
相補的ポリヌクレオチド配列に結合し、該オリゴヌクレ
オチドプライマーの各々は、他方のプライマーのものに
対する異なる特定のポリヌクレオチド配列の一部分に結
合し、 該プライマーの各々は（ｉ）特定の位置に直接隣接して
いるか、または（ii）特定の位置に直接隣接していない
該物質中のその相補的な特定のポリヌクレオチド配列に
結合し、それにより該物質中に存在する場合には、特定
の位置と特定のポリヌクレオチド配列に結合したプライ
マーとの間に介在配列が存在し、そして、 該プライマーの各々は分離要素または検出可能要素を該
プライマーの５′末端に取り込んでいる； ｂ）それらの相補的ポリヌクレオチド配列に結合した該
異なるオリゴヌクレオチドプライマーを伸長すること、
但し、結合したプライマーの各々は、該特定のヌクレオ
チドまたは塩基が特定のヌクレオチド配列内の特定の位
置にある場合には、特定の位置を含めてそこまでのみ伸
長し、ここで、該伸長プライマーの各々は、検出可能な
要素および／または分離要素を、該特定のヌクレオチド
または塩基と相補的な位置に有し、更なる条件として、
該伸長プライマーの各々は少なくとも１つの分離要素お
よび少なくとも１つの検出可能な要素を有し、介在配列
が特定の位置と特定のポリヌクレオチド配列に結合した
プライマーとの間にある場合には、更なる条件として、
介在配列が、介在配列と相補的であって、伸長プライマ
ーに取り込まれている塩基またはヌクレオチドが干渉検
出可能要素および／または分離要素の取り込みを引き起
こす場合のものではあり得ない； ｃ）特定の位置の特定のヌクレオチドまたは塩基までの
み伸長したいずれの伸長プライマーをも画分に分離する
こと、ここで、該画分は該伸長プライマーに含まれない
検出可能要素を有さないが、但し、該分離はそれに結合
した該伸長プライマーを有する特定のポリヌクレオチド
配列を消化する工程を含まない；および ｄ）該伸長プライマーの少なくとも１つが該画分中に存
在するか否かを、該画分を該伸長プライマーの全てにつ
いてアッセイすることによって決定すること、ここで、
該伸長プライマーの存在は、少なくとも１つの特定のヌ
クレオチドまたは塩基が特定のポリヌクレオチド配列内
の特定の位置にあることを示し、そして該伸長プライマ
ー全ての該画分中での非存在は、少なくとも１つの特定
のヌクレオチドまたは塩基が、いずれの異なる特定のポ
リヌクレオチド配列内においても特定の位置にないこと
を示し、 ここで、該伸長は少なくとも１つのジデオキシヌクレオ
チドを用い、該ジデオキシヌクレオチドは該特定のヌク
レオチドまたは塩基と相補的である： を含む方法。 - 【請求項４】該プライマーが、特定の位置に直接隣接す
る該物質中の該特定のポリヌクレオチド配列の一部分に
結合する、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項５】該プライマーが、特定の位置に直接隣接し
ない該物質中の該特定のポリヌクレオチド配列の一部分
に結合し、それにより特定の位置と特定のポリヌクレオ
チド配列に結合したプライマーとの間に介在配列が存在
する、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項６】該プライマーの各々が異なる分離要素を取
り込む、請求項２または３記載の方法。 - 【請求項７】分離要素が不活性支持体を含む、請求項１
〜３のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項８】分離要素が不活性固体支持体を含む、請求
項１〜３のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項９】該伸長が、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUT
P、dITP、ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP、およびddTTPか
らなる群から選択される４つの異なるヌクレオチドであ
って、該ヌクレオチドの少なくとも１つが、ddATP、ddC
TP、ddGTP、ddITP、およびddTTPからなる群から選択さ
れ、該ヌクレオチドは検出可能な要素および／または分
離要素を取り込んでいる、ヌクレオチドを用いることを
含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１０】該伸長が、ddITP、ddATP、ddCTP、ddGTP
およびddTTPからなる群から選択される１つのヌクレオ
チドであって、該ヌクレオチドが検出可能な要素および
／または分離要素を取り込んでいる、ヌクレオチドを用
いることを含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の方
法。 - 【請求項１１】該ヌクレオチドの少なくとも１つが検出
可能な要素を含む、請求項９記載の方法。 - 【請求項１２】該ヌクレオチドの少なくとも１つが分離
要素を含む、請求項９記載の方法。 - 【請求項１３】該ヌクレオチドの少なくとも１つが分離
要素および検出可能な要素を含む、請求項９記載の方
法。 - 【請求項１４】該ヌクレオチドの少なくとも１つが検出
可能な要素を含む、請求項10記載の方法。 - 【請求項１５】該ヌクレオチドの少なくとも１つが分離
要素を含む、請求項10記載の方法。 - 【請求項１６】該ヌクレオチドの少なくとも１つが分離
要素および検出可能な要素を含む、請求項10記載の方
法。 - 【請求項１７】該分離工程が：いずれの伸長プライマー
をも、該分離要素に親和性を有する分子に接触させるこ
と；および該接触させた伸長プライマーを分離して該画
分を提供すること、ここで、該分離要素および該分子は
以下に列挙する群から選択される： を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１８】該分離工程が、いずれの伸長プライマー
をも分離要素に親和性を有する分子に接触させること、
該分子は該分離を容易にする支持体に結合している；お
よび該接触させた伸長プライマーを分離して該画分を提
供することを含む、請求項１記載の方法。 - 【請求項１９】該分離工程が、いずれの伸長プライマー
をも分離要素に親和性を有する分子に接触させること、
該分子は該分離を容易にする支持体に結合している；お
よび該接触させた伸長プライマーを分離して該画分を提
供することを含む、請求項２記載の方法。 - 【請求項２０】該分離工程が、いずれの伸長プライマー
をも分離要素に親和性を有する分子に接触させること、
該分子は該分離を容易にする支持体に結合している；お
よび該接触させた伸長プライマーを分離して該画分を提
供することを含む、請求項３記載の方法。 - 【請求項２１】該分離要素および該分子が以下に列挙さ
れる群： から選択される、請求項18〜20のいずれか１項記載の方
法。 - 【請求項２２】該支持体が試験ストリップである、請求
項18記載の方法。 - 【請求項２３】該支持体が試験ストリップである、請求
項19または20記載の方法。 - 【請求項２４】特定のポリヌクレオチド配列がDNA配列
である請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項２５】特定のポリヌクレオチド配列がRNA配列
である請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項２６】特定のポリヌクレオチド配列が感染性ま
たは疾患を引き起こす生物由来である請求項１〜３のい
ずれか１項記載の方法。 - 【請求項２７】オリゴヌクレオチドプライマーがその
５′末端に検出可能な要素を取り込んでいる、請求項１
〜３のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項２８】該分離が、いずれの伸長プライマーをも
沈殿させ、そして該伸長プライマーを該分離要素の該分
離要素への親和性を有する分子への結合を助ける溶液で
再懸濁することを含む、請求項27記載の方法。 - 【請求項２９】工程ｄ）が： ｄ）それに結合した該伸長プライマーを有する該特定の
ポリヌクレオチド配列が該画分中に存在するか否かを、
該画分を該伸長プライマーについてアッセイすることに
よって決定すること、ここで、該伸長プライマーの存在
は、特定のヌクレオチドまたは塩基が特定のポリヌクレ
オチド配列内の特定の位置にあることを示し、そして該
伸長プライマーの非存在は特定のヌクレオチドまたは塩
基が特定のポリヌクレオチド配列内の特定の位置にない
ことを示す、 を含む請求項１記載の方法。 - 【請求項３０】工程ｄ）が： ｄ）それに結合した該伸長プライマーを有する特定のポ
リヌクレオチド配列のいずれかが該画分中に存在するか
否かを、該画分を該伸長プライマーについてアッセイす
ることによって決定すること、ここで、伸長プライマー
の存在は、特定のヌクレオチドまたは塩基が特定のポリ
ヌクレオチド配列内の特定の位置にあることを示し、そ
して該伸長プライマーの画分中の非存在は、少なくとも
１つの特定のヌクレオチドまたは塩基が少なくとも１つ
の異なる特定のポリヌクレオチド配列内の特定の位置に
ないことを示す、 を含む請求項２記載の方法。 - 【請求項３１】工程ｄ）が： ｄ）それに結合した該伸長プライマーの１つを有する少
なくとも１つの特定のポリヌクレオチド配列が該画分中
に存在するか否かを、該画分を該伸長プライマー全てに
ついてアッセイすることによって決定すること、ここ
で、伸長プライマーの存在は、少なくとも１つの特定の
ヌクレオチドまたは塩基が特定のポリヌクレオチド配列
内の特定の位置にあることを示し、そして該伸長プライ
マー全ての該画分中の非存在は、少なくとも１つの特定
のヌクレオチドまたは塩基がいずれの異なる特定のポリ
ヌクレオチド配列内においても特定の位置にないことを
示す、 を含む請求項３記載の方法。
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