JP2001522243A - 増幅ベースの突然変異検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ここでは、突然変異核酸配列を検出するための増幅ベースの方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 増幅ベースの突然変異検出 発明の分野 本発明は核酸の突然変異に関し、特には、そのような突然変異を検出する方法 に関する。発明の背景 核酸鎖における点突然変異は、一般に、正常もしくは野生型核酸鎖と比較した ときの核酸鎖の配列における１つの塩基対の相違として特徴付けることができる 。“野生型”核酸鎖は、特定の核酸鎖について最も広く見出される塩基対の配列 、又は最も一般的な塩基配列である。特定の遺伝子における点突然変異は、例え ば、その遺伝子の産物において観察可能なものを表出しないことがある。しかし ながら、他方で、点突然変異がその遺伝子の重要な部分に生じた場合、その点突 然変異がその遺伝子の産物において観察可能なものを表出し、それにより遺伝子 障害又は疾患を生じることがある。同様に、野生型配列と数塩基対のオーダーで 異なる、より大きな突然変異も遺伝子障害を生じる可能性がある。嚢胞性線維症 、鎌状赤血球貧血、テイ− サックス病及び地中海貧血症が特定の遺伝子における突然変異から生じ得る遺伝 子障害の例である。 核酸配列における突然変異の検出に用いることができる様々な方法が存在する 。特に、競合ＰＣＲ方式が米国特許第５，５８２，９８９号に記載されており、 そこでは２種類の異なるプライマー対の組が対象の核酸配列の増幅に用いられる 。この方法によると、１組のプライマーは野生型の配列に相補的であり、他方の 組のプライマーは点突然変異を有する配列に相補的である。そのため、野生型の 配列が存在する場合、野生型の組の増幅プライマーが野生型配列と優先的にハイ ブリダイズし、したがって、それが点突然変異の組のプライマーよりも高い割合 で反応混合物から枯渇する。反対に、その配列が点突然変異を含む場合には、点 突然変異プライマーが野生型プライマーよりも高い割合で反応混合物から枯渇す る。一方のプライマーの組が他方を上回って用いられる速度の違いが、野生型配 列を点突然変異を有する配列と区別する根拠として役立つ。しかしながら、残念 なことに、ＰＣＲはプライマーが完全に相補的ではない配列を増幅することが知 られている。したがって、この競合プライマーのいずれの組もが野生型又は突然 変異配列の いずれの伸長をもプライミングする可能性がある。 別の公知の核酸増幅反応であるＬＣＲも点突然変異の検出に用いられている。 ＬＣＲは、ライゲーション点で点突然変異が生じるようにＬＣＲプローブを設計 することができるため、時には点突然変異の検出に好ましい増幅反応である。し たがって、ＬＣＲプライマーの組が、野生型配列とは完全にハイブリダイズする もののライゲーション点に不一致を含むように設計された場合、点突然変異を含 む配列とハイブリダイズしたときにライゲーションは生じない。このため、ライ ゲートしたプローブ対ライゲートしていないプローブの相違を野生型又は突然変 異配列が存在するかどうかの決定に利用することができる。しかしながら、ＬＣ Ｒプローブは平滑末端ライゲーションとして知られる現象の対象となり、ここで 標的配列が存在しない条件下でプローブが擬似的にライゲートする。その結果、 野生型配列と突然変異配列とが区別されないことがある。平滑末端ライゲーショ ンを回避する方法が考案されてはいるが、これらの方法は増幅を達成するのに複 数の酵素を必要とすることがある。 したがって、最小数の試薬を用いる、野生型配列と突然変異配列とを効率的に 識別するための増幅に基づく方法に対する要 求が存在する。発明の要約 本発明は、野生型配列をその野生型配列の突然変異バージョンと識別するため の方法を提供する。したがって、この方法は、一方で、試験試料中に含まれる核 酸配列を特徴付け、又、他方で試験試料中の突然変異核酸配列を検出するための ものである。この方法は、（ａ）少なくとも２つの可能性のある標的配列（例え ば、突然変異又は野生型配列）のうちの１つを含む試験試料を、該少なくとも２ つの可能性のある核酸配列のいずれをも増幅するためのコンセンサスプライマー の組と接触させることにより反応混合物を形成する工程；ｂ）該反応混合物を増 幅条件に処して標的配列のコピーを産生させる工程；ｃ）該標的配列のコピーを 該少なくとも２つの標的配列のいずれかに特異的であるプローブ配列に晒す工程 ；及びｄ）コピー配列／プローブハイブリッドが形成されたかどうかを、該試験 試料中の突然変異核酸配列の存在の指標として検出する工程を含む。 突然変異核酸を検出するためのキットであって、少なくとも２つの異なる標的 配列を増幅するための共通のプライマーの組、及び該少なくとも２つの異なる標 的配列のうちの一方のみと完 全にハイブリダイズするプローブ配列を含むキットも提供される。発明の詳細な説明 ここに開示される方法は、突然変異核酸配列を野生型核酸配列から識別する核 酸増幅ベースの方法を提供する。したがって、この方法は、核酸配列における突 然変異を検出するための手段を提供する。この方法は複数塩基の欠失のような大 きな突然変異の検出に用いることもできるが、点突然変異を野生型核酸配列から 識別することができる。有利なことには、この増幅反応は単一の反応バイアル内 で行うことができる。 本発明は、一般には、野生型もしくは突然変異標的核酸配列のいずれかを含む ことが疑われる試験試料を、一組の増幅プライマーを含む増幅反応試薬と接触さ せる工程を含む。次に、そのようにして形成された反応混合物を、それらの増幅 プライマーが、試験試料中にたとえそのどちらが存在しようとも、突然変異若し くは野生型の標的配列のいずれのコピーの合成をもプライミングするような増幅 条件に処す。したがって、これらの増幅プライマーは突然変異及び野生型標的配 列の両者を増幅することが可能なコンセンサス配列である。次に、ハイブリダイ ゼーションプローブを標的配列のコピーにハイブリダイズさせこのハイブリッド 産物を検出することができる。このプローブが野生型配列に特異的であるのか、 又は突然変異配列に特異的であるのかに応じて、ハイブリッド産物の検出は試料 中の野生型配列の存在の指標であるか、又は突然変異標的配列の存在の指標であ る。したがって、この方法は、プローブ配列が増幅産物とハイブリダイズするか どうか、したがって、試験試料中の野生型又は突然変異配列の存在の指標として 後に検出することが可能であるプローブ／増幅産物が形成されるかどうかに基づ いて、野生型又は突然変異配列を識別することができる。 “試験試料”という用語は、ここで用いられる場合、突然変異又は野生型標的 配列を含むことが疑われるあらゆるものを意味する。試験試料はあらゆる生物学 的源、例えば、血液、細胞、水晶体液、脳脊髄液、母乳、アスコット液（ａｓｃ ｏｔｓｆｌｕｉｄ）、滑液、腹水、羊水、組織、発酵ブロス、細胞培養物等であ り、又はこれらから誘導することができる。この試験試料は（ｉ）源から得たま まを直接、又は（ｉｉ）前処理してその試料の特徴を改変した後に用いることが できる。したがって、試験試料は、例えば血液から血清もしくは血漿を調製し、 細胞もしくはウイルス粒子を破壊し、固形材料から液体を調製し、粘性液を希釈 し、液体を濾過し、液体を蒸留し、液体を濃縮し、妨害成分を不活性化し、試薬 を添加し、核酸を精製すること等により、使用前に前処理することができる。 “野生型”及び“突然変異”配列は、ここで用いられる場合、それらの通常の 意味を有する。したがって、上述のように、野生型配列は最も一般的もしくは普 通の配列であり、これに対して突然変異配列は野生型配列から派生するものであ る。野生型配列からのこのような派生、すなわち突然変異は、１塩基対ないし５ 塩基対の範囲の欠失、挿入、又は置換の形態であり得る。好ましくは、１塩基対 の突然変異、すなわち“点突然変異”を有する突然変異配列が、ここに提供され る方法によって検出される。 “標的配列”は、ここで用いられる場合、ここで提供される方法を用いて検出 され、増幅され、又は増幅及び検出の両者がなされる核酸配列を意味する。さら に、この標的配列という用語は時として一本鎖を指すものの、当業者は標的配列 が実際には二本鎖であり得ることを理解するであろう。このため、標的が二本鎖 である場合、本発明に従って用いられるプライマー配 列はその標的配列の両鎖を増幅する。 プライマー配列は、一般には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（Ｒ ＮＡ）を含み、通常は当該技術分野において、標的配列のコピーの伸長をプライ ミングするために用いられる。プライマーの組は典型的には２つの核酸配列を含 み、その一方は標的配列の一方の鎖に、及び一方は標的の配列の他方の鎖に、そ れらのプライマーが標的配列をはさみ込むような方式でハイブリダイズする。加 えて、プライマー配列は典型的にはコンセンサスプライマーであり、したがって 、野生型配列及びそれらの突然変異バージョンの両者を増幅する。好ましくは、 これらのプライマーは、予想されるあらゆる突然変異がそのプライマーの下流に 生じ、標的配列のあらゆる突然変異部分がプライマー伸長によってコピーされる ように設計される。 プローブ配列も一般にはＤＮＡ又はＲＮＡを含み、典型的には２５塩基対未満 の長さであり、より典型的には２０塩基対未満の長さである。加えて、プローブ 配列は典型的には少なくとも１０塩基対の長さである。 プローブ配列は野生型配列又は突然変異配列のいずれかとハイブリダイズする ように設計することができる。いずれの場合 においても、プローブは、（ｉ）プライマー配列とは異なり、かつ（ｉｉ）予想 される突然変異部位全体にわたる標的配列の領域とハイブリダイズするように設 計される。加えて、この予想される突然変異はプローブの中心近くに位置する。 典型的には、突然変異は、プローブが偶数の塩基を有するのか、又は奇数の塩基 を有するのかに応じて、プローブの真ん中の塩基対又は真ん中の２塩基対の配列 のいずれかの側の５塩基対以内、より好ましくは、プローブの真ん中の塩基対又 は真ん中の２塩基対の配列から２塩基対以内に位置する。したがって、例えば点 突然変異の場合、２０塩基対のプローブを、１０及び１１番目の塩基対を真ん中 の２塩基対の配列として用いて、予想される突然変異が４番目ないし１７番目の 塩基対、好ましくは７番目ないし１４番目の塩基対間で生じるように設計するこ とができる。奇数の塩基対、例えば、１９塩基対を有するプローブの場合には、 中央の１塩基対が１０位に位置し、突然変異が典型的には４番目ないし１６番目 の塩基対間に位置し、好ましくは７番目ないし１３番目の塩基対間に位置する。 プライマー及びプローブ配列は、現在利用可能な様々な技術を用いて、定型的 に合成することができる。例えば、ＤＮＡ配列は、通 常のヌクレオチドホスホロアミダイト化学及びアプライド・バイオシステムズ社 （Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）；デュポン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ） ；又はミリジェン（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）から入手可能な機器を用いて合成す ることができる。同様に、所望であれば、これらの配列を、米国特許出願第５， ４６４，７４６号；第５，４２４，４１４号；及び第４，９４８，８８２号（こ れらは全て引用例としてここに援用する）に記載されるもののような当業者にと って公知の方法論を用いて標識することができる。 本発明に従って用いられるプライマー及びプローブ配列は、標的配列のコピー とプローブ配列との間で形成されるあらゆるハイブリッド配列の検出を補助する ために標識することができる。“標識”という用語は、ここで用いられる場合、 検出可能な特性もしくは特徴を有する分子又は部分を意味する。標識は、例えば 、放射性同位体、蛍光体、化学発光体、酵素、コロイド粒子、蛍光微粒子等を用 いるもののような直接検出可能であるものであり得；又は、例えば、特異的結合 構成要素を用いるもののような間接的に検出可能であるものであってもよい。直 接検出可能な標識は、その標識の検出可能とするのに追加成分、 例えば、基質、誘因試薬、光等を必要とすることがあり得ることは理解されるで あろう。間接的に検出可能な標識を用いる場合、典型的には、“コンジュゲート ”と組み合わせて用いられる。コンジュゲートは、典型的には、直接検出可能な 標識に結合又はカップリングしている特異的結合構成要素である。コンジュゲー トを合成するためのカップリング化学は当該技術分野において公知であり、例え ば、その特異的結合構成要素の特異的結合特性又は標識の検出可能な特性を破壊 することがない、あらゆる化学的手段及び／又は物理的手段が含まれ得る。ここ で用いられる場合、“特異的結合構成要素”は結合対の構成要素、すなわち、分 子の一方が、例えば化学的もしくは物理的手段により、他方の分子に特異的に結 合する２つの異なる分子を意味する。抗原と抗体の特異的結合対に加えて、他の 特異的結合対には、アビジンもしくはストレプトアビジンとビオチン；ハプテン とハプテンに特異的な抗体；相補的ヌクレオチド配列；酵素補因子もしくは基質 と酵素等が含まれるが、これらに限定しようとするものではない。 標識した場合、ここに提供される方法に従って用いられるプライマー及びプロ ーブは、好ましくは、異なる目的を有する標 識で区別をつけられる。例えば、プローブをある型の標識で標識し、プライマー を別の型の標識で標識することができる。したがって、例えば、ある型の標識を 、ビーズ、微粒子もしくは細片のような公知のあらゆる形状のラテックス、プラ スチック、ガラス、ナイロン、ニトロセルロース、紙、もしくは磁性金属のよう な固体支持材料を含む固相試薬、又は特異的結合構成要素に被覆もしくは結合さ れている固相試薬上に、ハイブリッドを捕獲するのに用いることができる。検出 標識は固体支持材料上のハイブリッドの存在を示すのに用いることができる。 前述のように、試験試料、プライマーの組、及び、任意的なプローブ（集合的 には反応混合物）を増幅条件に処すが、“増幅条件”は標的配列の少なくとも１ つの合成を促進する、当業者に公知の条件である。したがって、反応混合物の熱 サイクリングが増幅条件の用語に含まれ、これは標的配列の複数のコピーを産生 するための公知の手順である。加えて、熱サイクリングを用いる核酸配列を増幅 するための方法は公知であり、これには米国特許第４，６８３，１９５号及び第 ４，６８３，２０２号（これらは引用例としてここに援用する）に記載されてい るポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が含まれる。 増幅後、プローブ配列を標的配列のコピーにハイブリダイズさせることができ 、驚くべきことにここで提供される方法によると、野生型標的配列中の点突然変 異を野生型配列から区別することができる。例えば、標的配列を増幅した後、野 生型配列と完全にハイブリダイズするプローブ（“野生型プローブ”）を増幅産 物に晒す。このプローブが増幅産物に結合するかどうかは、試験試料中に最初に 存在するものが野生型配列であったのか、又は突然変異配列であったのかによる 。特に、野生型配列が試験試料中に存在していた場合、それが増幅され、プロー ブが増幅された野生型配列に結合する。したがって、プローブ／増幅された野生 型標的配列の検出は、野生型配列の存在及び突然変異配列の不在を示す。他方、 試験試料中に突然変異配列が存在していた場合には、野生型プローブはハイブリ ダイズせず、ハイブリッドは形成されず、したがって、ハイブリッドを検出する ことはできない。したがって、検出されないことに基づいて、試験試料中に存在 する配列を突然変異配列と特徴付けることができる。 反対に、プローブ配列を、突然変異配列と完全にハイブリダイズするように設 計することができる（“突然変異プローブ”）。 このようなプローブは、様々な生物の様々な遺伝子における公知の突然変異及び そのような突然変異の位置に基づいて容易に設計することができる。あらゆる場 合において、突然変異プローブと増幅産物との間のハイブリッドの検出は突然変 異配列の存在を示し、これに対して、ハイブリッドが存在せず、したがって検出 可能な信号がないことは試験試料中の野生型配列の存在を示す。 別の態様によると、増幅産物を２種類のプローブと接触させることができ、そ の一方は突然変異プローブであり、一方は野生型プローブである。これらの２種 類のプローブは、ハイブリッドが形成された際に、野生型プローブハイブリッド を突然変異プローブハイブリッドと区別することができるように、異なるように 標識することができる。例えば、一方のプローブを第１結合構成要素で標識し、 他方のプローブを第２結合構成要素で標識することができる。このようにして、 これらのプローブ及びこれらのプローブとのあらゆるハイブリッドを、これらの プローブに結合する第１及び第２結合構成要素に対して別個に特異的である、異 なる特異的結合構成要素を有する、異なる固相試薬上で分離することができる。 したがって、いずれの固相 試薬がプライマー配列に会合する標識によりシグナルを発生するかによって、い ずれのプローブが増幅産物とハイブリッドとを形成したのかを決定することがで き、それにより試験試料中に存在していたものが野生型配列であったのか、又は 突然変異配列であったのかを判断することが可能である。その代わりに、プロー ブを検出型の標識で異なるように標識し、これに基づいて区別することもできる 。例えば、１９９４年１２月２２日出願の米国特許出願連続番号第０８／３６２ ，０３６号には２種類の異なる型の信号生成基を区別するための方法が記載され ている。 この方法は一倍体生物に適用して野生型を突然変異配列から区別することがで きるが、倍数体生物に適用してホモ接合野生型、ヘテロ接合及びホモ接合突然変 異配列を区別することもできる。特に、ヘテロ接合対立遺伝子を有する生物を、 本発明を適用して、ホモ接合対立遺伝子により生ずるシグナルに比べれば減少し ているものである信号を検出することにより、ホモ接合対立遺伝子と区別するこ とができる。信号が減少しているかどうかは、ホモ接合対立遺伝子に相当する配 列を含む標準を用い、該標準と完全に相補的であるプローブ配列を使って本方法 を実施することにより、容易に立証することができる。これらの標準から誘導さ れる信号は、ヘテロ接合の可能性のある信号を比較するためのホモ接合信号の標 準ベースラインとして用いることができる。同様に、いずれのホモ接合のバリエ ーションも、この検定を行って、この標準の範囲内の信号を検出し、又は信号が ないことを検出することにより、簡単に立証することができる。 別の態様は、増幅反応及びプローブハイブリダイゼーション反応を単一の反応 容器内で行うものである。さらに、プライマー及びプローブは、そのプローブの 配列がプライマーの配列よりも低い溶融温度を有するように選択される。増幅プ ライマー、ハイブリダイゼーションプローブ及び試験試料を、標的配列のコピー （アンプリコン）がプローブ（１種類もしくは複数種類）のＴｍよりも高い温度 で産生される増幅条件下に配する。通常の場合、アンプリコンは二本鎖であり、 これはプライマーが標的配列及びその相補鎖を増幅するように供給されるためで ある。次に、この二本鎖アンプリコンを熱的にデナチュレーションさせて一本鎖 アンプリコン構成要素を産生させる。デナチュレーション後、その混合物を冷却 し、すなわち再ナチュレーション してプローブと一本鎖アンプリコン構成要素との複合体の形成を可能にし、この 場面でプローブはアンプリコンの一本鎖構成要素と完璧に又は完全にハイブリダ イズすることができる。デナチュレーション温度からプローブが一本鎖アンプリ コンに結合する温度まで下降する温度低下の速度は、好ましくは、非常に迅速な ものであり（例えば、５秒ないし１５分、好ましくは１分ないし３分）、特にポ リメラーゼ酵素がプライマーの伸長について活性である温度範囲を通過する。実施例 以下の実施例は、本発明により提供されるオリゴマーＤＮＡプライマー及びプ ローブを用いる、野生型及び突然変異ライデン第Ｖ因子（Ｌｅｉｄｅｎ Ｆａｃ ｔｏｒ Ｖ）の検出を例証する。これらのＤＮＡプライマー及びプローブは、配 列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７として同定され る。野生型ライデン第Ｖ因子のエキソン１０の代表的な配列の一部がここでは配 列番号１と命名され、突然変異ライデン第Ｖ因子のエキソン１０の類似する代表 的な部分の一部がここでは配列番号２と呼ばれている。配列番号２は配列番号１ と僅か１つの塩基で異なり、これが突然変異ライデン第Ｖ因子を 野生型から区別する点突然変異である。配列番号３及び配列番号７は野生型及び 突然変異ライデン第Ｖ因子の両者のエキソン１０内のある領域に特異的である。 配列番号４は野生型及び突然変異ライデン第Ｖ因子の両者のイントロン１０の− ６６ないし−８７番目の塩基領域に特異的である。配列番号５は野生型ライデン 第Ｖ因子のエキソン１０内の領域のみに特異的である。配列番号６は突然変異ラ イデン第Ｖ因子内の領域のみに特異的である。 以下の実施例において、配列番号３、配列番号４及び配列番号７は野生型及び 突然変異ライデン第Ｖ因子の両者に特異的な増幅プライマーとして用いられる。 配列番号５は野生型ライデン第Ｖ増幅産物の内部ハイブリダイゼーションプロー ブとして用いられる。配列番号６は突然変異ライデン第Ｖ増幅産物の内部ハイブ リダイゼーションプローブとして用いられる。 実施例１ ライデン第Ｖ因子プライマー及びプローブの調製 Ａ．野生型及び突然変異ライデン第Ｖ因子プライマー プライマーは、オリゴヌ クレオチドハイブリダイゼーションＰＣＲによって野生型及び突然変異ライデン 第Ｖ因子の両者のエキソン １０／イントロン１０標的配列を検出するように設計した。これらのプライマー は配列番号３、配列番号４及び配列番号７であった。配列番号３及び配列番号７ は野生型及び突然変異ライデン第Ｖ因子の両者のエキソン１０内の領域に特異的 である。配列番号４は野生型及び突然変異ライデン第Ｖ因子の両者のイントロン １０内の領域に特異的である。プライマー配列は標準のオリゴヌクレオチド合成 方法論を用いて合成し、米国特許第５，４２４，４１４号（これは引用例として ここに援用する）に記載されるもののような標準的なシアノエチルホスホロアミ ダイトカップリング化学を用いて、それらの５’末端をアダマンタンでハプテン 化した。 Ｂ．野生型及び突然変異ライデン第Ｖ因子プローブ プローブは、オリゴヌクレ オチドハイブリダイゼーションによって野生型若しくは突然変異ライデン第Ｖ因 子の増幅したエキソン１０／イントロン１０標的配列とハイブリダイズするよう に設計した。これらのプローブは、野生型ライデン第Ｖ因子については配列番号 ５、突然変異ライデン第Ｖ因子については配列番号６であった。プローブ配列は 標準のオリゴヌクレオチド合成方法論を用いて合成し、米国特許第５，４６４， ７４６号（これは 引用例としてここに援用する）に記載されるもののような標準的なシアノエチル ホスホロアミダイトカップリング化学を用いて３’末端を２つのカルバゾールで 、又は３’末端をビオチン、次いで６つのチミン、次いで別のビオチンでハプテ ン化した。 実施例２ ライデン第Ｖ因子検出の感度 精製した野生型及び突然変異ライデン第Ｖ因子ゲノムＤＮＡを用いて、野生型 及び突然変異ライデン第Ｖ因子プライマー／プローブの組の感度を評価した。野 生型ライデン第Ｖ因子ＤＮＡは、全血又は全血より分離したリンパ球から、ＱＩ Ａｇｅｎ核酸抽出法及び製造者（ＱＩＡｇｅｎ社、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ ）によって記載されるカラム方法論を用いて精製した。突然変異ライデン第Ｖ因 子精製ＤＮＡはベス・イスラエル・デアコネス・メディカルセンター（Ｂｅｔｈ Ｉｓｒａｅｌ Ｄｅａｃｏｎｅｓｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）、ボス トン、ＭＡから入手したものであり、そこでは、それを全血からフェノール／ク ロロホルム抽出によって精製した。精製したＤＮＡを、分光光度計を用いて２６ ０ｎｍで吸光度を読み取ることにより定量し、１０００ないし０．０５ｎｇ／試 験の範囲に希釈した。 精製した野生型又は突然変異ライデン第Ｖ因子ＤＮＡの希釈物を、配列番号３ 及び配列番号４のプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、対応するプローブとして配 列番号５（野生型）ビオチン標識プローブを用いた場合と、配列番号６（突然変 異）ビオチン標識プローブを用いた場合を別個に反応させて検出した。ＰＣＲは 、最終濃度５０ｍＭのビシン（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］グリシン ）、ｐＨ８．２５、１５０ｍＭ酢酸カリウム、８％ｗ／ｖグリセロール、０．０ ０１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．０２％ア ジ化ナトリウムを用いて行った。各々１５０μＭの最終濃度で存在するｄＮＴＰ （ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ）と共にサーマス・サーモフィル ス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の組換えポリメラーゼを ５単位／反応の濃度で用いた。プライマーは各々２５０ｎＭの濃度で、プローブ は各々５ｎＭの濃度で用いた。最終濃度２．５ｍＭの酢酸マンガンを総反応容積 ０．２ｍｌにおいて用い、試料容積は２５μｌであった。２種類の陰性対照を試 験したが、これらは水又は１０００ｎｇの逆の精製ＤＮＡのいずれかからなるも のであり、すなわち野生型プローブを用いて試験する場合には精 製した突然変異ＤＮＡが陰性対照であり、その逆も同様である。 Ｃｙｃｌｅｒ）において増幅した。反応混合物を最初に９７℃で４分間インキュ ベートし、次に９４℃で６０秒、次いで５５℃で９０秒のＰＣＲ増幅を４０サイ クル行った。反応混合物の熱サイクルを終えた後、それらの混合物を９７℃で５ 分間維持し、２分以内に温度を１５℃に低下させることによりプローブオリゴハ イブリダイゼーションを達成した。試料を５分間、そしてその後反応産物を分析 及び検出するまでの間、１５℃に維持した。 ト・ラボラトリーズ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬから入手可能）で検出した 。ストレプトアビジン被覆微粒子（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉ ｎｃ．、Ｆｉｓｈｅｒ、ＩＮ）及び抗アダマンタン抗体／アルカリホスファター ゼコンジュゲート（アボット・ラボラトリーズ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、 び検出した。用いた酵素基質はメチル−ウンベリフェリルホスフェート（ＭＵＰ ）であり、ＭＵＰのＭＵへの変換速度を測定してカウント／秒／秒（ｃ／ｓ／ｓ ）として報告した。 この実験からのデータが表１に示されており、これはプライマーを野生型プロ ーブと共に用いて少なくとも５０ｐｇの野生型ライデン第Ｖ因子精製ＤＮＡの検 出を、及びプライマーは同じであるが突然変位プローブと共に用いて少なくとも ５０ｐｇの突然変異ライデン第Ｖ因子精製ＤＮＡの検出を示す。５０ｐｇのＤＮ Ａは６．２５分子のＤＮＡと等価であり、したがって、これらの野生型及び突然 変異体検定は少なくとも６分子のＤＮＡの検出を示す。加えて、両プローブは優 れた特異性を示し、各々のプローブはそれが特異的である型のＤＮＡのみを検出 し、いずれの型のプローブも（表中、陰性対照の非特異的ＤＮＡとして示される 。）逆の型のＤＮＡは検出しない 実施例３ 突然変異対野生型ライデン第Ｖ因子の検出の特異性 Ａ．ビオチン標識プローブを用いる特異性 野生型及び突然変異プローブの特異 性を、野生型もしくは突然変異ホモ接合遺伝子型を有する試料及び突然変異ヘテ ロ接合試料を用いてさらに評価した。用いた精製野生型及び突然変異ホモ接合Ｄ ＮＡは実施例１において調製したＤＮＡであった。突然変異ヘテロ接合ＤＮＡは 、全血又は全血より分離したリンパ球から、ＱＩＡｇｅｎ核酸抽出法及び製造者 （ＱＩＡｇｅｎ社、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）によって指示されるカラム方 法論を用いて精製し、分光光度計を用いて２６０ｎｍで吸光度を読み取ることに より定量した。試料の遺伝子型は、ＰＣＲ増幅の標準的な方法論、次いで制限酵 素消化及びゲル電気泳動若しくはサザンブロット分析を用いて確認した。 突然変異ヘテロ接合並びに野生型及び突然変異ホモ接合型精製ＤＮＡを、次に 、様々な濃度に希釈して、配列番号３及び４のプライマー、配列番号５及び６の ビオチン標識プローブ及び実施例１に記載される方法論を用いてＰＣＲ増幅し、 ハイブリダイズさせ、検出した。全ての試料を２回試験した。この実験 からの結果の平均を表２に示す。 野生型プローブはホモ接合野生型及びヘテロ接合突然変異ライデン第Ｖ因子試 料の両者を検出したが、ホモ接合突然変異ライデン第Ｖ因子試料を陽性として検 出しなかった。突然変異プローブはホモ接合突然変異及びヘテロ接合突然変異ラ イデン第Ｖ因子試料の両者を検出したが、ホモ接合野生型ライデン第Ｖ試料を陽 性として検出しなかった。予想通り、両プローブは、該試料が１つの野生型対立 遺伝子及び１つの突然変異対立遺伝子を含むため、突然変異ヘテロ接合試料を検 出し、これらのプローブは用量依存的な様式で検出を行った。このように両プロ ーブは優れた特異性を示した。 （ＮＤ＝測定されない） 上記実験を、配列番号３のプライマーの代わりに配列番号７のプライマーを用 いることを除いて、繰り返した。表３にまとめられたそれらの結果は上記と同じ 結論を裏付け、野生型及び突然変異プローブの優れた特異性を示す。加えて、両 者のプライマーの組（配列番号３及び４又は配列番号７及び４）は、特異的プロ ーブによるハイブリダイゼーションのための野生型及び突然変異ライデン第Ｖ因 子の両者の増幅を可能にする。（ＮＤ＝測定されない） Ｂ．カルバゾール標識プローブを用いる特異性 野生型及び突然変異プローブの 特異性を、前記実験において用いられたビオチンの代わりに、カルバゾールを標 識として用いて試験した。試験した試料は実施例２と同様に調製した。ヘテロ接 合及び野 生型ホモ接合精製ＤＮＡを様々な濃度に希釈して、配列番号３及び４のプライマ ー、並びに実施例１に記載される配列番号５及び６のカルバゾール標識プローブ 、並びに反応産物を抗カルバゾール被覆微粒子（アボット・ラボラトリーズ、Ａ ｂｂｏｔｔ システムで検出することを除いて、実施例２と同様の方法論を用いてＰＣＲ増幅 しハイブリダイズさせ、検出した。全ての試料を２回試験した。この実験からの 結果の平均を表４に示す。 野生型プローブはホモ接合野生型及びヘテロ接合突然変異ライデン第Ｖ因子試 料の両者を陽性として検出した。突然変異プローブはヘテロ接合突然変異ライデ ン第Ｖ因子試料を検出したが、ホモ接合野生型ライデン第Ｖ因子試料を陽性とし て検出しなかった。ここでも同様に、両プローブは、該試料が１つの野 生型対立遺伝子及び１つの突然変異対立遺伝子を含むため、ヘテロ接合突然変異 試料を検出し、それは用量依存的な様式で行われた。したがって、両プローブは 、カルバゾール又はビオチンで標識されたときにも有効であることが示された。 本発明を詳細に、かつ特定の態様を参照して説明したが、本発明の精神及び範 囲から逸脱することなくそのような態様を様々に変更及び変形できることは、当 業者には明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シエフエル，クリステイー・ピー アメリカ合衆国、イリノイ・60060、マン デレイン、バンベリー・ロード・925

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 試験試料中の突然変異核酸配列を検出するための方法であって、 ａ）少なくとも２つの可能性のある標的配列のうちの１つを含むことが疑われ る試験試料を、該少なくとも２つの可能性のある核酸配列を増幅するためのコン センサスプライマーの組と接触させることにより、反応混合物を形成する工程； ｂ）該反応混合物を増幅条件に処して該標的配列のコピーを産生させる工程； ｃ）該標的配列のコピーを、該少なくとも２つの標的配列のうちの１つに特異 的であるプローブ配列に晒す工程；及び ｄ）コピー配列／プローブハイブリッドが形成されたかどうかを、該試験試料 中の突然変異核酸配列の存在の指標として検出する工程、 を含む方法。 ２． 工程ａ、ｂ及びｃを単一の反応容器内で行う、請求項１の方法。 ３． 前記プローブの溶融温度がプライマーの組の構成要素の 溶融温度を下回る、請求項２の方法。 ４． 前記突然変異核酸配列が点突然変異を含む核酸配列である、請求項１の方 法。 ５． 請求項１に記載の方法であって、該方法が該標的配列のコピーを第２のプ ローブ配列に晒すことをさらに含み、ここで、 ｉ）該プローブ配列は異なるように標識されており、 ｉｉ）一方のプローブは前記突然変異配列と完全にハイブリダイズし、かつ ｉｉｉ）他方のプローブは野生型配列と完全にハイブリダイズする、 方法。 ６． 試験試料が倍数体生物から採取される、請求項１の方法であって、該方法 がホモ接合対立遺伝子をヘテロ接合対立遺伝子と区別する方法。 ７． 突然変異核酸を検出するためのキットであって、 ａ）少なくとも２つの異なる標的配列を増幅するための共通のプライマーの組 ；及び ｂ）該少なくとも２つの異なる標的配列のうちの一方と完全にハイブリダイズ するプローブ配列、 を含むキット。 ８． 前記少なくとも２つの異なる標的配列が野生型配列及び突然変異配列を含 み、かつ該キットが第２のプローブ配列を含む請求項７のキットであって、 ａ）一方のプローブは前記突然変異配列と完全にハイブリダイズし、かつ ｂ）他方のプローブは前記野生型配列と完全にハイブリダイズする、 キット。