JPH11506613A

JPH11506613A - 競合増幅を用いる核酸配列検出方法

Info

Publication number: JPH11506613A
Application number: JP9501035A
Authority: JP
Inventors: バーケンマイヤー，ラリー; マツシヤーウオー、アイサ・ケイ
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-03
Publication date: 1999-06-15
Also published as: US5955598A; US5667974A; CA2223823A1; WO1996040996A1; EP0832281A1; EP0832281B1; ATE211771T1; DE69618460D1; DE69618460T2; ES2171679T3

Abstract

(57)【要約】本発明は、被験サンプル中に存在し得る標的核酸配列の量を定量的に検出する方法を提供する。標的配列ＸおよびＹを有する標的核酸配列を有し得る被験サンプルを、第１のセットが標的Ｘに特異的であり、第２のセットが標的Ｙに特異的である２個のプライマーセットと接触させる。被験サンプルは同時に、実質的に第１の標的配列および第２の標的配列ならびにそれの相当するオリゴヌクレオチドプライマーを組み合わせたものに由来する内部標準配列ＩＳとも接触させる。増幅標的配列生成物ＸおよびＹが、抗ハプテン捕捉試薬が付着した固相に捕捉することで検出されるような形で、オリゴヌクレオチドプライマーセットにハプテンが結合している。（Ｘ＋Ｙ）／Ｓの信号比を求めて、サンプル中に含まれる標的核酸配列の量を定量する。

Description

【発明の詳細な説明】競合増幅を用いる核酸配列検出方法発明の属する技術分野本発明は、被験サンプル中に存在し得る核酸配列の増幅および検出方法、詳細には、被験サンプル中に存在し得る核酸配列の定量的検出方法に関するものである。発明の背景現在までに、被験サンプル中に存在し得る標的核酸配列を増幅する方法が当業界において知られている。そのような方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）などがある。これらの方法は、医学診断の分野ならびに遺伝学、分子生物学および生化学の分野において広く利用されている。ＰＣＲにおいては、一対のプライマーを過剰に用いて、標的核酸の相補鎖の外側末端でハイブリッド形成させる。プライマーは標的核酸を鋳型として用いるポリメラーゼによってそれぞれ延長する。延長生成物自体が標的配列となり、元の標的鎖から解離する。次に、新たなプライマーがポリメラーゼによってハイブリッド形成および延長されて、そのサイクルが繰り返されて、標的配列分子の数が幾何級数的に増加する。ＰＣＲは米国特許４６８３１９５号および４６８３２０２号に開示されている。ＬＣＲは、もう一つの標的増幅機構である。ＬＣＲにおいては、２個のセンス（第１および第２）プローブと２個のアンチセンス（第３および第４）プローブを標的に対して過剰に用いる。第１のプローブは標的鎖の第１の断片にハイブリッド形成し、第２のプローブは標的鎖の第２の断片にハイブリッド形成し、第１の断片と第２の断片が互いに隣接していることから、一次プローブは連結して融合生成物になることができる。さらに、第３（二次）プローブは第１のプローブの一部にハイブリッド形成することができ、第４（二次）プローブは同様の連結可能な形で第２のプローブの一部にハイブリッド形成することができる。標的が最初に二本鎖であると、二次プローブも、最初の場合のように標的相補体にハイブリッド形成する。センスおよびアンチセンスのプローブの融合鎖が標的鎖から分離されると、それは第３および第４のプローブとハイブリッド形成し、それらは連結して、相補的な二次融合生成物を形成することができる。融合生成物は機能的に、標的またはその補体と等価である。ハイブリッド形成および連結のサイクルを繰り返すことによって、標的配列の増幅が達成される。この方法は、引用によって本明細書に含まれるＥＰ−Ａ −３２０３０８に記載されている。ギャップＬＣＲ（ＧＬＣＲ）などの他の形態のＬＣＲ法は、引用によって本明細書に含まれるバックマンら（K.C.Backman et al）へのＥＰ−Ａ−４３９１８２に開示されている。残念ながら、核酸増幅反応の一つの欠点は、それがほとんどの場合定性的であるという点である。増幅反応の性質から、それを利用して被験サンプル中に存在し得る標的配列の存在を定量的に検出することは困難である。従って、従来の増幅反応は被験サンプル中の微量の標的配列の存在を検出するのには有用であるが、通常は、従来の増幅反応を用いては被験サンプル中の標的配列の量を求めることはできない。従来の増幅反応が、改良を加えることで定量的な増幅反応分析を行うことができるようになったものもある。そのような定量的増幅反応の一つは、「競合増幅」と称されるものである。この方法は通常、ＰＣＲに適用される。この方法によると、増幅反応時に、標準核酸配列を標的配列と競合させる。一般に、標準配列と標的配列を含有することが疑われるサンプルを一連の連続希釈で組み合わせ、その連続希釈液のいずれにおいても標準配列は一定となるようにする。別法では、標準配列とサンプル配列を一連の連続希釈において組み合わせるが、その連続希釈液間で標準配列の量を変える。いずれの場合も、いずれの連続希釈液中でも標準配列の濃度は既知である。次にＰＣＲを一連の希釈液全てについて行い、２つの核酸種の混合物を得る。一つの核酸種は標準配列由来のものであり、一つの核酸種はサンプル配列由来のものである。特定の希釈液における各核酸種の濃度は、増幅前の希釈液中の標準配列とサンプル配列のコピー数によって決まる。増幅反応時には、検出可能基を両方の種類の配列に導入するのが普通である。増幅後、２つの核酸種を分離し、各核酸種に組み込まれた検出可能基の量を測定する。この検出方法を、一連の希釈液の各液について行う。次に競合曲線を得て、サンプル配列の量を既知量の標準配列に基づいて外挿することができる。競合増幅の方法は、米国特許５２１９７２７号,Jalava et al.，BioTechnique s 15:134-39(1993)に記載されている。これらの競合増幅法は有用であることが明らかになっているが、それらの方法はかなりの量のサンプル調製時間と技術者の関与を必要とし、サンプル汚染の危険性を伴う。さらに、一連の希釈液に対する増幅実施には、単一サンプルに対する増幅実施の場合より多くの試薬を必要とする。これらの要素はいずれも、競合増幅反応実施のコスト上昇につながる。さらに、先行技術の方法はいずれもＰＣＲ増幅が関与し、標準配列の中央部分は、検出対象の標的配列とは完全に無関係で、標準配列を標的配列と区別するのに使用される標的特異的プライマーに隣接している。そうして、２つの配列は容易に区別される。標的配列と標準配列の両方の中央部分は増幅反応の成否において非常に重要であるから、このような方法はＬＣＲ増幅には適合しない。本出願人らの発明以前には、ＬＣＲ増幅を用いて標準配列の標的配列からの区別を行う先行技術の方法はなかった。そこで、標準配列の中央部分が標的配列とかなり類似しており、各アッセイごとに一連の濃度標準を増幅して定量を行う必要がない、臨床検査場面で使用することができる、増幅反応を定量的に行う方法が必要とされている。発明の概要本発明は、被験サンプル中に存在し得る標的核酸配列の量を検出する方法において、（ａ）前記被験サンプルを、核酸増幅反応を行う手段ならびに（ｉ）標的核酸のゲノム内において第１のプライマーセット（set）が第１の標的配列を表し、第２のプライマーセットが第２の標的配列を表し、各プライマーセットが４個のオリゴヌクレオチドプライマーを有してなり、その４個のプライマー中の２個がセンスプライマーであり、他の２個がアンチセンスプライマーである２個の標的プライマーセット，（ｉｉ）実質的に、第１の標的配列および第２の標的配列の組み合わせたものに由来する内部標準（ＩＳ）配列、（ｉｉｉ）４個のオリゴヌクレオチドプライマーを有してなり、その４個のプライマーのうち２個が第１の標的配列由来であり、他の２個が第２の標的配列由来であるＩＳプライマーセット、（ｉＶ）ｄＮＴＰのセットと、前記標的配列もしくは前記ＩＳ配列の各鎖またはそれの相補鎖にハイブリッド形成する標的オリゴヌクレオチドプライマー配列もしくはＩＳオリゴヌクレオチドプライマー配列の各対について、リガーゼ反応が起こり、それによってオリゴヌクレオチドプライマー配列間のヌクレオチドギャップが標的核酸配列の存在下にｄＮＴＰによって満たされ、その場合に各リガーゼ反応がギャップを満たす上で同じｄＮＴＰセットまたはそれのサブセットを必要とするようなハイブリッド形成条件下に接触させる段階；ならびに（ｂ）標的増幅生成物の被験サンプル中に存在するＩＳ増幅生成物に対する比を求める段階とを有してなる検出方法を提供する。上記の本発明の方法を用いて、特に２個の核酸配列のうちの１個が他の核酸配列の突然変異または対立遺伝子を有している場合に、被験サンプル中に存在し得る２個の異なる核酸配列間の識別を行うこともできる。本発明はさらに、サンプル中に存在し得るＢ型肝炎ウィルスのＤＮＡを定量的に検出するための組成物において、ＨＢＶゲノム内の第１の標的配列もしくは第２の標的配列のいずれかに対して十分に相補的な配列を有する約１８〜約２５塩基対の４個のオリゴヌクレオチドプライマーを有してなる組成物をも提供する。さらに、ＨＢＶＳ遺伝子のコドン１４５および／またはＨＢＶプレコア（precore）抗原遺伝子のコドン２８を有するＢ型肝炎の野生型ＤＮＡと突然変異型ＤＮＡとの識別を行うための組成物も提供される。上述の組成物を有してなる試験キットも、本発明によって提供される。図面の簡単な説明図１は、標的配列ＸおよびＹとそれらの相当するプライマーセットならびに内部標準およびそれの相当するプライマーセットを描いた本発明の方法の模式図である。発明の詳細な説明本発明で提供される方法は、プライマーセット（以下、「プローブセット」とも称する）を用いて標的核酸配列を増幅する核酸増幅反応（以下、「増幅反応」と称する）に適用できる。すなわちこの方法では、増幅反応において、各プライマーセットが標的核酸配列のゲノム内の異なる標的配列を代表するもの、すなわち第１の標的配列と第２の標的配列である２個の標的プライマーセットを用いて、被験サンプル中に存在し得る標的配列の濃度を定量的に検出するものである。さらにこの方法では、実質的に第１の標的配列と第２の標的配列ならびにそれの相当するＩＳプライマーセットの組み合わせたもの由来の配列を有してなる内部標準（ＩＳ）配列を用いる。この方法では、２個の標的配列とＩＳ配列が、標的プライマーセットおよびＩＳプライマーセットを有してなる同じオリゴヌクレオチドプライマーについて競合する。その方法は通常は、反応混合物を生成するハイブリッド形成条件下に、標的配列を有することが疑われる被験サンプルと、ＩＳ配列およびそれの相当するＩＳプライマーセットおよびｄＮＴＰとを接触させる段階を有する。反応混合物を循環することで、リガーゼ反応を介してオリゴヌクレオチドプライマー配列をハイブリッド形成させて、相当する標的配列またはＩＳ配列およびそれの相補鎖とオリゴヌクレオチドとを増幅する。そうして、増幅された標的配列またはＩＳ配列の有無を検出することができる。標的プライマーシリーズには２個のプライマーセットを含み、各プライマーセットは、標的核酸配列のゲノム内の異なる標的配列を代表する。第１のプライマーセットは第１の標的配列を表し、第２のプライマーセットは第２の標的配列を代表する。本発明の説明において、第１の標的配列を「標的Ｘ」と称し、第２の標的配列を「標的Ｙ」と称する。各標的プライマーセットは４個のオリゴヌクレオチドプライマーを有しており、それらのプライマーのうちの２個はセンスプライマーであり、他の２個はアンチセンスプライマーである。ＩＳ配列は実質的に、標的核酸の第１の標的配列と第２の標的配列の組み合わせたものに由来するものである。本発明の方法で使用する場合、ＩＳ配列は１本鎖または２本鎖であることができる。相当するＩＳプライマーセットも４個のオリゴヌクレオチドプライマーを有してなり、そのうちの２個は第１の標的配列由来であり、他の２個は第２の標的配列由来である。別の実施態様においては、本発明の方法を用いて、検出対象の特定の標的配列、ＩＳ配列およびそれの相当するＩＳプライマーセットに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いることで、２個の標的配列ＸおよびＹのうちの一方のみを定量的に検出することができる。増幅反応において、標的配列ＸもしくはＹおよびＩＳ配列は、それぞれ標的配列ＸもしくはＹのプライマーセットおよび内部標準を有してなる同じ２個の共有オリゴヌクレオチドプライマーについて競合する。ＩＳプライマーセットの他の２個のオリゴヌクレオチドプライマーは、ＬＣＲに有効に参加するが同時に検出対象の標的配列の増幅を妨害しない配列であることができる。被験サンプルは代表的には、対象とする標的核酸配列を含み得る被験者の身体のいずれかの構成要素である。被験サンプルは、患者から検体を採取し、必要に応じてそれに含まれる細胞を破壊して核酸を放出させる等の当業界で公知の方法を用いて調製することができる。標的核酸配列は通常、一連の標的プライマーがハイブリッド形成する２個以上の標的配列を有する核酸配列（例：ＲＮＡまたはＤＮＡ）である。ＲＮＡ標的配列の場合、ＲＮＡ標的配列のｃＤＮＡコピーを合成してから増幅反応を行なうことは明らかである。本発明の好ましい実施態様においては、両方の標的配列、従ってそれらの相当するプライマーセットが標的核酸配列のゲノム内で特徴的に認められる。本発明のこの特徴は、被験サンプル中で第１もしくは第２の標的配列が欠失し又はその他変化したために、標的核酸配列が増幅反応において検出されなくなる危険性を低下させるという利点を提供するものである。さらに、両方のプライマーセットは、検出対象の標的核酸のゲノム中で高度に保存されている標的配列を代表するのが普通である。この本発明のこの特徴は、被験サンプル中の変異配列の存在のために、増幅反応において標的核酸配列が検出されなくなる危険性を低下させるという利点を提供するものである。例えば、検出対象の核酸配列が細菌もしくはウィルスのゲノム由来のものである場合、プライマー組み合わせは、それぞれ菌株間またはウィルス単離株間で高度に保存されている遺伝子生産物からの標的配列を代表するものでなければならない。例えば、標的配列はＢ型肝炎などのウィルスのゲノムを有することができ、標的配列が、表面抗原遺伝子、コア抗原遺伝子およびプレコア抗原遺伝子などのウィルスゲノムに特徴的に存在する領域を有することができる。別の形態として、両方の標的配列が上記の２つの領域のうちのいずれか一方の領域内に認められる。本発明の別の実施態様においては、異なるゲノム内に、２個の標的配列ＸおよびＹが認められる。この実施態様は、類縁生物の核酸配列の検出に特に有用である。例えば、ＨＩＶ検出のための増幅反応において、第１の標的配列がＨＩＶ− １ゲノムのある領域由来であり、第２の標的配列が同じ領域またはＨＩＶ−２の異なる領域由来のものであることができる。標的核酸配列は、個々の標的プライマーセットが具体的な標的配列をハイブリッド形成及び増幅するだけの連続性がそれの部分にある限り、１本鎖、２本鎖、連続または断片であることができる。標的核酸配列のゲノム全体の配列は未知であっても、標的プライマー組み合わせを有する標的配列が少なくとも既知である場合が一般的である。増幅反応において検出対象の標的核酸配列の必要最低限の長さというものはないが、代表的には、プライマーセットの各オリゴヌクレオチドプライマーは、約１８から約２５塩基対から構成され、それが約５０ヌクレオチドの連結プライマー対に翻訳される。ＩＳ配列とその相当するプライマーセットとともに一連の標的プライマーを増幅反応に用いて、被験サンプル中の標的配列の量を定量的に求めることができる。ＬＣＲおよびＧＬＣＲなどの増幅反応は、当業界では公知である。これらの反応は代表的には、プライマーを使用して、通常はかなり大きい核酸配列の小さい領域である標的核酸配列のコピーを繰り返し形成する。プライマー自体は標的配列の領域に対して相補的であり、好適な条件下に標的配列の相補領域にハイブリッド形成するまたは結合する核酸配列である。標的配列のコピーは通常、リガーゼ活性を有する酵素を用いて隣接するプライマー対を連結するプライマー連結のプロセスによって得られる。酵素的連結法が主流であるが、本発明による使用には、化学的連結も同様に好適である。モノマーまたは予め形成されたオリゴマーとしてプライマーまたはプローブに加えるヌクレオチドも、標的配列に対して相補的である。プライマーが十分に連結するとそれらを、通常は反応混合物を相補的核酸鎖が解離する温度である「溶融温度」まで加熱することで、標的配列から分離する。こうして、標的配列に対して相補的な配列が形成される。次に、新たな増幅サイクルが起こって、２本鎖配列を分離し、プライマーをそれぞれの標的にハイブリッド形成させ、ハイブリッドプライマーを連結し、再分離することで標的配列数をさらに増幅することができる。増幅サイクルによって形成される相補的配列は、プライマーまたはプローブの延長のための鋳型として役だって、さらに標的配列数を増幅することができる。従って、標的配列およびそれの相補配列の複数のコピーが得られる。一般に、２個が標的鎖の一部に対して相補的であり、他の２個がそれの相補体に対して相補的である４個のプライマーをＬＣＲで用いる。増幅反応実施手段と総称する増幅反応で使用される他の試薬は公知であり、それには、マグネシウムなどの酵素補因子；塩；ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（ＮＡＤ）；例えばアデニン三リン酸、グアニン三リン酸、シトシン三リン酸およびチミン三リン酸などのデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）などがある。本発明の方法では、反応混合物を好ましくは約１５から約６０回循環させ、より好ましくは約２０から約４５回循環させる。さらに、例えばその方法で使用されるヌクレオチド三リン酸、酵素および補因子の濃度が、代表的増幅反応で通常使用される濃度より高い場合があることは留意すべき点である。一連の標的プライマー、ＩＳ配列およびそれの相当するプライマーセットを増幅反応で使用した後、増幅標的配列生成物（「標的増幅生成物」とも称される）および増幅ＩＳ配列生成物（「ＩＳ増幅生成物」とも称される）を検出することができる。一つの実施態様において、増幅標的配列生成物の検出を、増幅ＩＳ配列生成物の検出と切り離して、２つの反応とする。別法として、本発明の別の実施態様では、標的増幅生成物およびＩＳ増幅生成物の検出を、標的増幅生成物とＩＳ増幅生成物をその２つの増幅生成物が識別可能な形で標識される一つの検出反応で行う。例えば、標的増幅生成物はある波長で蛍光を発する蛍光標識に付着させるが、ＩＳ増幅生成物は別の波長で蛍光を発する蛍光標識に付着させる。いずれの波長も一つの反応混合物中で読み取りできよう。２つの別個の反応が起こる本発明の実施態様では、増幅反応後、固相に固定化された特有の捕捉試薬を用いて、各捕捉試薬によって特有の増幅生成物、すなわち、標的配列Ｘ、標的配列ＹまたはＩＳ配列を固定化することで、増幅標的配列生成物と増幅ＩＳ配列生成物を検出することができる。別法として、本発明の別の実施態様では、第１の捕捉試薬によって標的増幅生成物を固定化し、第２の捕捉試薬によってＩＳ増幅生成物を固定化する。捕捉試薬は通常、直接または間接に増幅生成物と特異的結合対を形成することができる「特異的結合対要素」を有する。本明細書で使用する場合、特異的結合要素とは、結合対、すなわち例えば化学的もしくは物理的手段によって他方の分子に特異的に結合する２個の異なる分子の１個の要素を意味する。抗原および抗体の特異的結合対以外に、他の特異的結合対には、アビジンとビオチン；アダマンタンおよびカルバゾールなどのハプテン（ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／０５５３４号として公開された１９９３年４月２１日出願の米国特許出願０８／０４９８８８号およびＰＣＴ／ＵＳ９３／０６８３２として公開された１９９３年７月１日出願の米国特許出願０８／０８４４９５号に記載のもの）とハプテンに特異的な抗体；相補的ヌクレオチド配列；酵素補因子もしくは酵素基質と酵素などがあるが、これらに限定されるものではない。図１との関連で説明される実施態様によれば、標的増幅生成物の検出に使用される捕捉試薬は、ＩＳ増幅生成物の検出に使用される捕捉試薬とは異なる。固相とは、不溶性であるか、またはその後の反応によって不溶性とすることができる材料を指す。固相の選択は、結合要素を引きつけて固定化する固有の能力を考慮して行うことができる。別法として、結合要素を引きつけて固定化する固有の能力を有する別の受容体を固相に保持させることができる。その別の受容体は、結合要素または結合要素に接合した帯電物質に関して反対の電荷を持つ帯電物質などがあり得る。さらに別の代替法として、受容体分子を、固相に固定化（付着）された、特異的結合反応によって別の結合要素を固定化する能力を有する特異的結合要素であることができる。受容体分子は、アッセイ実施前またはアッセイ実施時に、結合要素を固相材料に間接的に結合させることができる。そこで、固相には例えば、ラテックス、プラスチック、誘導体化プラスチック、磁性または非磁性金属、ガラスもしくはシリコン表面、あるいは試験管、微量定量ウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップその他の当業者に公知の形状の表面などがあり得る。固相がさらに、必要に応じて接合体が接近できるだけの有孔率を有する好適な多孔性材料を有し得ることは想到されるものであり、本発明の範囲に含まれる。微孔性構造が通常は好ましいが、水和状態でゲル構造を持つ材料も使用することが可能である。ニトロセルロースの多孔性構造は、結合要素を含む非常に多様な試薬について優れた吸収性および吸着性を有する。ナイロン（登録商標）も同様の特性を有し、やはり好適である。そのような材料は、フィルム、シートまたは平板などの好適な形状で使用することができるか、あるいは紙、ガラス、プラスチックフィルムまたはファブリックなどの適切な不活性担体にコーティングまたは結合もしくは積層させることができる。増幅生成物を固相に固定化できる方法は各種ある。例えば、増幅生成物と結合対を形成するポリヌクレオチドで固相をコーティングすることができる。別法として、固相に結合した結合要素と特異的結合対を形成する間接標識で増幅生成物を標識することができる。固相に結合した特異的結合要素が、増幅反応で生成し得る全ての増幅生成物と結合対を形成することができるか、あるいは固相に結合した複数の特異的結合対が、標的配列Ｘ増幅生成物または標的配列Ｙ増幅生成物などの個々の増幅生成物に特異的であることができることは明らかである。さらに当業者であれば、標識を増幅生成物に組み入れるには各種方法があって、それらを使用できることは理解できる。標的増幅生成物とＩＳ増幅生成物を固相に固定化した後、固相でのそれらの存在を「標識」を用いて検出することができる。標識という用語は、検出可能な性質または特性を有する分子もしくは部分を指す。例えば放射性同位元素、蛍光団、化学的発光団、酵素、コロイド粒子、蛍光性微粒子を用いた場合のように、標識が直接検出可能なものであることができるか、あるいは例えば特異的結合要素を用いた場合のように、標識が間接的に検出可能なものであることができる。直接標識の場合、標識の検出を可能とするには、例えば基質、誘発試薬、光などの別の要素が必要な場合があることは明らかである。検出に間接標識を使用する場合、それらは「接合体」との組み合わせで使用するのが普通である。接合体は代表的には、直接検出可能な標識に付着または結合した特異的結合要素である。接合体合成のための結合化学は当業者には公知であり、例えば特異的結合要素の特異的結合性または標識の検出可能な性質を破壊しない化学的および／または物理的手段などがあり得る。従って、固相に固定化される増幅生成物が直接検出可能な標識を有する場合、固定化された増幅生成物を直接検出することができる。増幅生成物が間接標識を有する場合、間接標識に特異的な結合要素を有する接合体を用いて、固相における増幅生成物の存在を検出することができる。識別可能な標識で各種増幅生成物を標識することで、異なる増幅生成物を識別することができる。例えば、各増幅生成物を、異なる波長で発光する異なる蛍光団で直接または間接的に標識することができる。別法として、各増幅生成物を、それぞれが異なる発蛍光性基質の存在下に信号を放出する異なる酵素で標識することができる。さらに別の方法として、標識が信号を発生する時期に基づいて増幅生成物を識別することができる。具体的には、蛍光団および酵素からの信号の識別を、蛍光団からの一定信号を読み取り、酵素からの速度信号を読み取って、それによって一定信号から速度信号が開始する基底線を求めることで行うことができる。そのような検出方法は、譲受人が同一である引用によって本明細書に含まれる本願と同時係属中の１９９４年１２月２２日出願の米国特許出願０８／３６２０３６号に記載されている。本発明の１実施態様によれば、図１を参照すると、標的配列ＸおよびＹを有する標的核酸配列を有し得る被験サンプルを、標的Ｘに特異的であってオリゴヌクレオチドプライマー１、２、３および４を有する第１のセットと標的Ｙに特異的であってオリゴヌクレオチドプライマー５、６、７および８を有する第２のセットという２つのプライマーセットと接触させる。被験サンプルは同時に、内部標準配列ＩＳとそれの相当するオリゴヌクレオチドプライマー１、２、５および６とも接触する。ハプテンＡ、ＢおよびＣは、抗ハプテン抗体捕捉試薬が付着する微小粒子での捕捉によって増幅標的配列生成物ＸおよびＹが検出されるような形で、オリゴヌクレオチドプライマーセットと結合している。図１に示した実施態様において、増幅生成物ＸおよびＹは抗Ｂ抗体によって捕捉され、酵素アルカリホスファターゼなどの標識と接合した抗Ａ抗体および抗Ｃ抗体の混合物によって信号が発生する。同様に、ＩＳ増幅生成物は、抗Ａ抗体によって捕捉され、アルカリホスファターゼなどの標識と接合した抗Ｃ抗体によって信号を発生する。（Ｘ＋Ｙ）／Ｓの信号比を求めて、サンプル中に含まれる標的核酸配列の量を定量する。本発明の方法の基礎となる原理によれば、ＸおよびＹ標的配列が不在であるか、または存在しても低レベルである場合、ＩＳ標的増幅の程度は一定となるはずである。ＸおよびＹ標的配列の開始濃度が高くなると、ＩＳ増幅に関与する４つのオリゴヌクレオチドプライマーは、同じ４つのヌクレオチドプライマーがＸおよびＹ標的増幅に関与することから、ＸおよびＹ標的増幅の場合と同じ配列について競合する。そこで、ＸおよびＹ標的配列の開始時濃度が徐々に上昇するに連れて、ＩＳ増幅の最終レベルは徐々に低下する。増幅の途中では、標的増幅生成物とＩＳ増幅生成物の間にハイブリッド構造が生じ得る。そのようなハイブリッド内の３’ −ヒドロキシ末端を有するオリゴヌクレオチドがなおもＤＮＡポリメラーゼによって延長され得るとしても、そのようなハイブリッドは連結に参加することはできない。そこで、増幅生成物のレベルが上昇するに連れて、そのようなハイブリッドの生成が上昇するはずである。それによって次に、第１および第２の標的配列が存在しなかった場合に生成したであろうと考えられる量と比較して、生成するＩＳ増幅生成物の量が低くなるであろう。本発明の方法では、増幅反応で使用されるＩＳ配列の量が、ハイブリッド形成によって反応中にわたって生成するＸおよびＹ増幅生成物の量がほとんど低下しないようになっている。反応混合物におけるハイブリッド形成の程度は、多くのオリゴヌクレオチドおよび増幅生成物を含む大きいネットワーク構造を含むものと考えられる。ＸおよびＹ標的配列が存在すると、抗Ａ抗体によって捕捉される各ハイブリッドについて、標識接合体によって検出可能な２組のハプテン（すなわち、ＢおよびＣ）があることから、そのようなハイブリッドによって標識ＸおよびＹ検出の感度が上昇し得る。他方、ハイブリッド構造は、標的配列が不在の場合は形成できないことから、偽陽性を生じることはないはずである。ＤＮＡポリメラーゼの５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性によって、延長されるオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリッド形成しない連結した増幅生成物鎖を切断することで、上記のバイブリッド構造を開裂させることができる。鎖をＤＮＡポリメラーゼによって切断するには、その鎖は切断部位の上流で１本鎖でなければならない（すなわち５’）。適宜に、ポリメラーゼによってＤＮＡを切断するために、切断する鎖の配列を５’末端で変えることはできない。そこで、オリゴヌクレオチドプライマー４および５の５’末端にハプテンを付着させるが、オリゴヌクレオチドプライマー１および８の５’末端にはハプテンを付着させないようにすることで、増幅ＩＳ配列生成物の両方の鎖が開裂を受けやすくなるが、ＸおよびＹの増幅配列生成物はいずれも開裂から保護されると考えられる。最終的な結果として、ＩＳ増幅生成物が開裂することでＩＳ増幅生成物によって発生する信号は低下するが、ＸおよびＹ増幅生成物は開裂しないことから、標的増幅生成物によって発生する信号は維持されて、それらは以後の増幅サイクルに参加することができるものと考えられる。開裂は、ヌクレオチドプライマー２および７のＴｍまたはそれよりわずかに低い温度で最終インキュベーションを行うことで、循環時およびその後に行うことになろう。これにより、開裂可能構造を持つＩＳ増幅生成物が存在するようになると考えられる（すなわち、フォークの５’の腕が１本鎖であるフォーク状ハイブリッド構造）。使用されるポリメラーゼが５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を持たない場合にはそのような開裂は生じないことは明らかであろう。本発明の理論によれば、標的配列ＸおよびＹの信号が増幅反応中における増幅生成物の形成によって上昇し、それから安定化することから、ＩＳ信号は一定レベルで始まり、次にオリゴヌクレオチドプライマーの競合、非連結性のハイブリッドの形成および上記のようなＩＳ増幅生成物のエキソヌクレアーゼ開裂によって低下すると考えられる。被験サンプル中のＸおよびＹの量は、増幅反応における標的配列ＸおよびＹの既知開始濃度に対して（Ｘ＋Ｙ）／ＩＳをプロットすることで得られる標準曲線で、サンプルについての（Ｘ＋Ｙ）／ＩＳの信号比率の位置を決定することで求めることができる。標的増幅生成物（Ｘ＋Ｙ）によって生じる信号のＩＳ増幅生成物によって生じる信号に対する比を求めることによって、被験サンプル中のＸおよびＹ標的の元の量を求めることができる。以下の実施例は、本発明についてさらに詳細に説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。実施例実施例１ＨＢＶの定量的ＬＣＲ増幅ＧＬＣＲ増幅を用いて、ＩＳ標的配列とともに２固の標的配列を同時増幅した。実際には、一方の標的配列である標的配列Ｘ（配列番号１）（簡明を期して１本鎖として表してある）を２本鎖の形で使用した。配列番号１は、オノらの報告のように（Ono et al.，Nucleic Acids Research 11:1747-57(1983)）、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）のマップ位置１８０〜２２５に相当する。他方の標的配列である標的配列Ｙ（配列番号２）（これも１本鎖として示してある）も、二本鎖の形で用いた。配列番号２は、ＨＢＶのマップ位置６５８〜７０３に相当する。挿入物をＨＢＶサブタイプａｙからクローニングした。両方の配列を以下の表１において５’から３’方向で示してある。ベクターｐＵＣ１９からのＸおよびＹ標的配列を有する線形化２本鎖組換えＤＮＡプラスミドＹ８２−１を構築した。ＨＢＶ挿入物は、全表面抗原遺伝子（Ｓ −遺伝子）、プレーＳ遺伝子の一部およびＸ遺伝子のわずかな部分を有してなる約１４００塩基対長のＨＢＶゲノムのＢａｍＨＩ断片由来のものであった。標的特異的プローブは、ＬＣＲによって上記の標的配列を増幅及び検出するためのものである。第１のプライマーセットは、配列番号１とそれの相補鎖に特異的であった。このセットからの２つのプローブ（配列番号３および配列番号４）を、「Ｂｉｏ」で表したビオチンでハプテン化した。このセットからの残りの２個のプローブ（配列番号５および配列番号６）は「Ｆｌ」で表したフルオレセインでハプテン化した。配列番号４および配列番号５の５’末端は「ｐ」で表したリン酸基によって官能性となっており、それによって配列番号３を配列番号５に連結させ、配列番号４を配列番号６に連結させることができた。配列番号４と配列番号６は配列番号１とハイブリッド形成し、配列番号３と配列番号５は配列番号１の相補鎖とハイブリッド形成した。標的配列Ｘの増幅および検出に使用したプローブセットを表２に示してあり、個々のプローブは５’から３’方向で示してある。第２のプライマーセットは、配列番号２およびその相補鎖に特異的であった。このセットからの２個のプローブ（配列番号７および配列番号８）は、「Ａｄ」で表したアダマンタンでハプテン化した。このセットの残りの２個のプローブ（配列番号９および配列番号１０）は、フルオレセイン（Ｆｌ）でハプテン化した。配列番号８および配列番号９の５’末端はリン酸基（ｐ）で官能性となっており、それによって配列番号７の配列番号９への連結と配列番号８の配列番号１０への連結を行うことができた。配列番号８と配列番号１０は配列番号２とハイブリッド形成し、配列番号７と配列番号９は配列番号２の相補鎖とハイブリッド形成した。標的配列Ｙの増幅および検出に用いたプローブ組み合わせを表３に示してあり、個々のプローブは５’から３’方向で示してある。Ｘ配列の５’側半分とＹ配列の５’側半分の相補鎖とのキメラを有する内部標準標的配列を合成した。使用したＩＳ標的は、１本鎖であった。その配列を５’ から３’方向で以下の表４に示してある。配列番号１１およびそれの相補鎖に特異的なプライマーセットは、４個のオリゴヌクレオチドプライマーである配列番号３、配列番号４、配列番号７および配列番号８からなるものとした。上記のようなＸおよびＹ標的配列を有するプラスミドＹ８２−１について、以下の表５に記載のように、反応において８つの異なる濃度で試験を行って、ほぼＥＰ−Ａ−４３９１８２に記載の方法に従ってＧＬＣＲによって標的配列の同時増幅を行った。反応に使用した濃縮５ＸＬＣＲ緩衝液には、２５０ｍＭＥＰＰＳ緩衝液（ｐＨ７．８）、５０ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＮＨ₄Ｃｌ、４００ｍＭＫ⁺および５０μｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有させた。ＬＣＲの「マスター溶液」には、以下の成分を含有させた。酵素溶液には以下の成分を含有させた。アボット（Abbott）リガーゼは市販されている（Abbott Laboratories，Abbot t Park，IL）。アンプリタック（Amplitaq；登録商標）ポリメラーゼは市販されている(Cetus Corporation，Emeryville，CA)。Ｙ８２−１（２．５μＬ）を、ＬＣＲマスター溶液４１．５μＬに加えた。混合物を混和し、微量遠心分離機を用いて数秒間遠心して混合物を沈降させた。鉱油１滴を各反応混合物に加え、混合物を１００℃まで加熱して３分間経過させ、再度遠心した。混合物を放冷して７５℃とし、酵素溶液６μＬを加えて最終容量を５０μＬとした。各５０μＬ反応は３連で行った。温度サイクリングは、ＣＯＹテンプサイクラー(COY Tempcyc ler;Coy Laboratory Products，Inc.，Ann Arbor，MI から市販)で、８５℃で３０秒間と５４℃で６０秒間の４０サイクルで行った。温度サイクリング後、３連の反応液全てを合わせた。合わせたＬＣＲプール液を半量ずつに分け、２つの別個のＩＭｘアッセイで分析した。各ＩＭｘアッセイは２連で行った。第１のＩＭｘアッセイ（ＩＭｘ−１）はＨＢＶＸおよびＹ標的配列を検出するためのものであった。具体的には、合わせたＬＣＲプール液それぞれ３５μＬをＩＭｘ系（line）希釈液（市販品；Abbott Laboratories）３５μＬに加えた。抗フルオレセイン抗体が付着した微粒子にオリゴヌクレオチドを捕捉させ、それをアルカルホスファターゼ（ＡＰ）に接合した抗ビオチン抗体および抗アダマンタン抗体を５０／５０の比で含む接合体で検出した。第２のＩＭｘアッセイ（ＩＭｘ−２）は、ＩＳ標的配列を検出するためのものであった。合わせたＬＣＲプール液それぞれ３５μＬをＩＭｘ系希釈液に加えた。抗ビオチン抗体が付着した微粒子にオリゴヌクレオチドを捕捉させ、それをＡＰに接合した抗アダマンタン抗体を含む接合体で検出した。各ＬＣＲプール液についてのＩＭｘ結果を以下に報告する。Ｙ８２−１分子とＩＭｘ−１／ＩＭｘ−２の比との対数：対数プロットから、標的核酸配列の量が５桁にわたって線型であることが明らかになった。実施例２野生型および突然変異型のＨＢＶプレコア遺伝子および表面抗原遺伝子の検出本発明の方法を用いて、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）コドン１４５突然変異について、野生型（Ｗｔ）配列および突然変異型（Ｍｕｔ）配列を識別することができる。ＨＢｓＡｇ遺伝子のコドン１４５は、アミノ酸グリシンについてコードするものである。しかしながら、このコドン内の点突然変異によってアミノ酸がアルギニンに変わり、ワクチンエスケープ表現型が生じる。Ｗｔ配列（配列番号１２）（ただし、簡明を期して１本鎖として示してある）は２本鎖の形で使用する。突然変異配列（配列番号１３）の点突然変異は太字で示してある。標的特異的プローブは、以下の表６に示すように、ＬＣＲによってＷｔおよびＭｕｔの標的配列を増幅および検出するためのものである。配列番号１２およびそれの相補鎖に特異的なプライマーセットは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７を有する。配列番号１５および配列番号１６の５’末端は、リン酸基によって官能性となっていることから、配列番号１４を配列番号１６に連結し、配列番号１５を配列番号１７に連結させることができる。突然変異配列である配列番号１３の場合には、配列番号１４に代えて配列番号１８を用いる。同様に、本発明の方法を用いて、ＨＢＶプレコア抗原（ＨＢｅＡｇ）遺伝子のコドン２８内の点突然変異を検出することができる。コドン２８は、アミノ酸トリプトファンについてコードしている。しかしながら、そのコドン内での点突然変異によって、そのアミノ酸は終止コドンに変わり、ＨＢｅＡｇ表現型となる。それに伴って、さらに下流の３つの塩基で第２の突然変異が起こる場合が多い。Ｗｔ配列（配列番号１９）（簡明を期して１本鎖として示してある）は２本鎖の形で使用する。突然変異配列（配列番号２０）の点突然変異は太字で示してある。標的特異的プローブは、以下の表６に示したように、ＬＣＲによってＷｔおよびＭｕｔ配列を増幅および検出するためのものである。配列番号１９およびそれの相補鎖に特異的なプライマー組み合わせは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４を有する。配列番号２２および配列番号２３の５’末端はリン酸基によって官能性であることから、配列番号２１を配列番号２３に連結し、配列番号２２を配列番号２４に連結させることができる。単一の点突然変異の場合には、プライマー配列番号２１に代えてオリゴヌクレオチドプライマー配列番号２５を用いる。ＩＳ配列を、以下の表６において配列番号２６として示してある。配列番号２６およびそれの相補鎖に特異的なプライマーセットは、４つのオリゴヌクレオチドプライマー配列番号１６、配列番号１７、配列番号２３および配列番号２４を有する。ＨＢｓＡｇ遺伝子について競合ＬＣＲを行うには、検出したい標的配列、すなわちＷｔまたはＭｕｔ配列について上記で挙げたオリゴヌクレオチドを、配列番号２３および配列番号２４のオリゴヌクレオチドとともに使用する。ＨＢｅＡｇ遺伝子について競合ＬＣＲを行うには、検出したい標的配列、すなわちＷｔまたはＭｕｔ配列について上記で挙げたオリゴヌクレオチドを、配列番号１６および配列番号１７のオリゴヌクレオチドとともに使用する。別法として、ＨＢｓＡｇとＨＢｅＡｇの両方の競合ＬＣＲアッセイ、好ましくは両方のＷｔアッセイまたは両方のＭｕｔアッセイを、これらが同じヌクレオチド要件を共有することから、一緒に行うことができる。その場合、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２３および配列番号２４のオリゴヌクレオチドが常に存在することから、ＩＳは常に増幅される。他のＬＣＲアッセイで既に存在していると考えられるｄＧＴＰのみが必要であることから、ＩＳでギャップを満たすために追加のｄＮＴＰは必要ない。実施例１に記載したＩＭｘのやり方を用いて、ＷｔおよびＭｕｔのＨＢｓＡｇ増幅生成物を抗フルオレセイン微粒子に捕捉させて、抗ビオチン接合体で検出できると考えられる。ＷｔおよびＭｕｔのＨＢｅＡｇ増幅生成物を抗フルオレセイン粒子に捕捉させて、抗アダマンタン接合体で検出できると考えられる。一つの反応で、ＨＢｓＡｇ増幅生成物とＨＢｅＡｇ増幅生成物について試験を行うには、抗アダマンタン結合体と抗ビオチン接合体の混合物を使用することになろう。第２のＩＭｘ試験では、全ての反応に存在する同時増幅ＩＳ生成物を抗ビオチン微粒子に捕捉させ、抗アダマンタン接合体で検出することになる。このようにして、ＩＳ生成物を特異的に検出して、実施例１に記載の方法に従って試験対象の標的配列のＩＭｘ信号と比較することになる。以上、本発明について具体的な実施態様を参照しながら詳細に説明したが、本発明の精神および範囲を逸脱しない限りにおいて、各種の変更および修正をそのような実施態様に加えることが可能なことは当業者には明らかであろう。

Claims

【特許請求の範囲】１．被験サンプル中に存在し得る標的核酸配列の量を検出する方法において、（ａ）前記被験サンプルを、核酸増幅反応を行う手段ならびに（ｉ）標的核酸のゲノム内において第１のプライマーセットが第１の標的配列を表し、第２のプライマーセットが第２の標的配列を表し、各プライマーセットが４個のオリゴヌクレオチドプライマーを有してなり、その４個のプライマー中の２個がセンスプライマーであり、他の２個がアンチセンスプライマーである２個の標的プライマーセット、（ｉｉ）実質的に、第１の標的配列および第２の標的配列の組み合わせたものに由来する内部標準（ＩＳ）配列、（ｉｉｉ）４個のオリゴヌクレオチドプライマーを有してなり、その４個のプライマーのうち２個が第１の標的配列由来であり、他の２個が第２の標的配列由来であるＩＳプライマーセット、（ｉｖ）ｄＮＴＰのセットと、前記標的配列もしくは前記ＩＳ配列の各鎖またはそれの相補鎖にハイブリッド形成する標的オリゴヌクレオチドプライマー配列もしくはＩＳオリゴヌクレオチドプライマー配列の各対について、リガーゼ反応が起こり、それによってオリゴヌクレオチドプライマー配列間のヌクレオチドギャップが標的核酸配列の存在下にｄＮＴＰによって満たされ、その場合に各リガーゼ反応がギャップを満たす上で同じｄＮＴＰセットまたはそれのサブセットを必要とするようなハイブリッド形成条件下に接触させる段階；ならびに（ｂ）標的増幅生成物の被験サンプル中に存在するＩＳ増幅生成物に対する比を求める段階とを有してなる検出方法。２．増幅反応が約１５から約６０回の温度サイクリングを含む請求項１に記載の方法。３．前記各プライマーセットの１以上の要素が標識を有する請求項１に記載の方法。４．前記標識が間接的に検出可能である請求項３に記載の方法。５．前記測定段階が（ａ）第１の捕捉試薬が標的増幅生成物を固定化し、第２の捕捉試薬がＩＳ増幅生成物を固定化するように、捕捉試薬を用いて前記標的増幅生成物およびＩＳ増幅生成物を固相に固定化する段階；ならびに（ｂ）標的増幅生成物またはＩＳ増幅生成物の存在によって生じる信号を検出する段階を有してなる請求項１記載の方法。６．前記捕捉試薬が、結合要素が前記増幅生成物に付いている特異的結合対要素に特異的に結合する特異的結合対の１要素を有する請求項５に記載の方法。７．被験サンプル中に存在し得る２つの異なる核酸配列を識別する方法において、（ａ）前記被験サンプルを、核酸増幅反応を行う手段ならびに（ｉ）標的核酸のゲノム内において第１のプライマーセットが第１の標的配列を表し、第２のプライマーセットが第２の標的配列を表し、各プライマーセットが４個のオリゴヌクレオチドプライマーを有してなり、その４個のプライマー中の２個がセンスプライマーであり、他の２個がアンチセンスプライマーである２個の標的プライマーセット、（ｉｉ）実質的に、第１の標的配列および第２の標的配列の組み合わせたものに由来する内部標準（ＩＳ）配列、（ｉｉｉ）４個のオリゴヌクレオチドプライマーを有してなり、その４個のプライマーのうち２個が第１の標的配列由来であり、他の２個が第２の標的配列由来であるＩＳプライマーセット、（ｉｖ）ｄＮＴＰのセットと、前記標的配列もしくは前記ＩＳ配列の各鎖またはそれの相補鎖にハイブリッド形成する標的オリゴヌクレオチドプライマー配列もしくはＩＳオリゴヌクレオチドプライマー配列の各対について、リガーゼ反応が起こり、それによってオリゴヌクレオチドプライマー配列間のヌクレオチドギャップが標的核酸配列の存在下にｄＮＴＰによって満たされ、その場合に各リガーゼ反応がギャップを満たす上で同じｄＮＴＰセットまたはそれのサブセットを必要とするようなハイブリッド形成条件下に接触させる段階；ならびに（ｂ）標的増幅生成物の被験サンプル中に存在するＩＳ増幅生成物に対する比を求める段階とを有してなる検出方法。８．２個の核酸配列のうちの１個が他の核酸配列の突然変異または対立遺伝子を有する請求項７に記載の方法。９．サンプル中に存在し得るＢ型肝炎ウィルスのＤＮＡを定量的に検出するための組成物であって、該組成物がＨＢＶゲノム内の第１の標的配列もしくは第２の標的配列に対して十分に相補的な配列を有する約１８から約２５塩基対の４個のオリゴヌクレオチドプライマーを有してなり、標的配列が配列番号１および２ならびにそれらの相補鎖からなる群から選ばれる１以上の配列から選択され、プライマーがＨＢＶＤＮＡの同じ標的鎖の隣接する部分にハイブリッド形成可能である組成物。１０．オリゴヌクレオチドプライマーが配列番号３、４、５および６を有する請求項９に記載の組成物。１１．ＨＢＶＳ遺伝子のコドン１４５を有するＢ型肝炎の野生型ＤＮＡと突然変異型ＤＮＡとを識別するための組成物であって、該組成物がＨＢＶＳ遺伝子内の第１の標的配列もしくは第２の標的配列に対して十分に相補的な配列を有する約１８〜約２５塩基対の４個のオリゴヌクレオチドプライマーを有してなり、標的配列が配列番号１２および１３ならびにそれらの相補鎖からなる群から選ばれる１以上の配列から選択され、プライマーがＨＢＶＤＮＡの同じ標的鎖の隣接する部分にハイブリッド形成可能である組成物。１２．オリゴヌクレオチドプライマーが配列番号１４、１５、１６、１７および１８を有する請求項１１に記載の組成物。１３．ＨＢＶプレコア抗原遺伝子のコドン２８を有するＢ型肝炎の野生型ＤＮＡと突然変異型ＤＮＡとを識別するための組成物であって、該組成物がＨＢＶプレコア抗原遺伝子内の第１の標的配列もしくは第２の標的配列に対して十分に相補的な配列を有する約１８ないし約２５塩基対の４個のオリゴヌクレオチドプライマーを有してなり、標的配列が配列番号１９および２０ならびにそれらの相補鎖からなる群から選ばれる１以上の配列から選択され、プライマーがＨＢＶＤＮＡの同じ標的鎖の隣接する部分にハイブリッド形成可能である組成物。１４．オリゴヌクレオチドプライマーが配列番号２１、２２、２３、２４および２５を有する請求項１３に記載の組成物。１５．請求項９または１０に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットを有する組成物を有してなるＢ型肝炎ウィルスを定量的に検出するためのキット。１６．請求項１１または１２に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットを有する組成物を有してなるＨＢＶＳ遺伝子のコドン１４５を有してなるＢ型肝炎の野生型ＤＮＡと突然変異型ＤＮＡとを識別するためのキット。１７．請求項１３または１４に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットを有する組成物を有してなるＨＢＶプレコア遺伝子のコドン２８を有してなるＢ型肝炎の野生型ＤＮＡと突然変異型ＤＮＡとを識別するためのキット。１８．請求項１３または１４に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセットを有する組成物をさらに有してなる請求項１６に記載のキット。