JP2001522585A

JP2001522585A - 二重標識プローブを用いた検体検出工程

Info

Publication number: JP2001522585A
Application number: JP2000519603A
Authority: JP
Inventors: カリーノ，ジヨン・ジエイ; エアトル，ジヨン・アール; サリトロ，ジヨン・エイ; ユング，ポール・エム
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1997-11-07
Filing date: 1998-11-05
Publication date: 2001-11-20
Also published as: US6294326B1; EP1029078A2; WO1999024611A2; WO1999024611A3; CA2308626A1

Abstract

(57)【要約】サンプル中の標的核酸配列の存在を検出するための方法が提供される。本方法は二重標識プローブと、異成分検出方法の組み合わせを用いる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の属する技術分野本発明の属する分野は、検体検出である。より詳細には、本発明は、二重標識
オリゴヌクレオチドプローブおよび異成分検出方法を用いる、試験サンプル中の
標的核酸の検出に関する。

【０００２】発明の背景サンプル中のある特定の核酸分子の存在を検出するための多くの方法が存在す
る。例えば、特定の核酸配列を検出するための手段としての、ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ギャップリガーゼ連鎖反応（Ｇ
ＬＣＲ）、Ｑβリプリカーゼ、自己維持配列複製、および連鎖置換増幅（ＳＤＡ
）からの増幅産物を検出することが、すべて記載されている（ＲｏｃｈｅＭｏ
ｌｅｃｕｌａｒＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏ
ｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４：４１−４７，１９９３を参照）。
これらの増幅工程は、たとえば、試験サンプル中の感染した組織を検出するアッ
セイを組み立てるための有用な臨床診断用のツールとなりつつある。さらに、増
幅アッセイは、たとえば遺伝子欠損を検出するために、研究や開発分野において
、また法医学分野においても、使用されてきた。

【０００３】欧州特許願書第ＥＰ−Ａ−３２０−３０８号に記載のＬＣＲ、米国特許第４，
６８３，２０２号、第４，６８３，１９５号、第５，３２２，７７０号（その開
示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載のＰＣＲおよび逆転写ＰＣＲ（
ＲＴ−ＰＣＲ）として知られているＰＣＲの変種、および米国特許第５，４２７
，９３０号（この開示も参照により本明細書に組み込まれる）に記載のＧＬＣＲ
は、標的配列、従ってこの標的配列を伴っている生物を検出するために設計され
た核酸増幅を基礎とするアッセイにおいて、広く使用されている。これらの増幅
技術は典型的に、標的核酸配列の複製物を繰り返し生成するためのプライマー、
あるいはプローブを使用し、この標的配列は、通常とても大きな核酸配列の小さ
な領域である。プライマーおよびプローブはそれ自身、標的配列の領域に相補的
な核酸配列であり、適当な条件下で、標的配列の相補的部分とハイブリッド形成
し、あるいは結合する。標的配列の複製物が典型的に、ポリメラーゼやリガーゼ
のような酵素を別々にあるいは組み合わせて利用して、ハイブリッド形成したプ
ライマーあるいはプローブにヌクレオチド（あるいはプローブ）を付加するプラ
イマーあるいはプローブ伸長によって生成される。プライマーあるいはプローブ
に付加されたヌクレオチド（あるいはプローブ）はまた、標的配列に相補的であ
る。いったんプライマーあるいはプローブが十分に伸長し、および／または連結
したら、これらは標的配列から分離され、標的配列に相補的な配列が形成される
。よって伸長の新しい繰り返しが起こり得、相補的な標的配列の数が増幅される
。さらに、標的配列に相補的な配列は、プライマーあるいはプローブ伸長のため
の鋳型として働くことができ、それによって標的配列の数を増幅する。従って、
標的配列とその相補的な配列の多数の複製物が生成される。

【０００４】溶液中での標的配列および／または標的配列に相補的な配列の存在または量は
、多くの方法で検出することができる。典型的には、増幅した配列は、増幅した
配列に組み込まれた標識プライマー、増幅産生物とハイブリッド形成する標識プ
ローブ、あるいは両方の組み合わせを用いて検出される。例えば、（異成分アッ
セイ形式として様々に参照されている）サンドイッチアッセイ形式が、溶液中の
増幅された核酸配列の存在と量を検出するために使用できる。とりわけ、増幅さ
れた配列は、捕捉部分でコートされた微粒子の懸濁液のような固相上に固定化さ
れうる。このような捕捉部分は、例えば、増幅された配列に組み込まれた捕捉ハ
プテンに結合する。従って、配列が捕捉試薬と接触すると、配列は固体支持体上
に固定化される。第二ハプテンも、また、増幅された配列内に組み込まれ、固体
支持体へ固定化された配列を検出するために使用できる。特に、支持体結合配列
は、特異的に第二ハプテンに結合するメンバーと結合している、たとえば蛍光性
部分を含んでいる共役物と接触され得る。したがって、蛍光性部分も、第２ハプ
テンを介して固相に固定化され、したがって、蛍光性部分は、固体支持体上の増
幅された配列の指標として検出できる。

【０００５】さらに最近、増幅された配列を検出するための均一成分法が記載された。参照
により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２１０，０１５号、および第５
，５３８，８４８号に記載されている、いわゆる「Ｔａｑ−Ｍａｎ」方法はその
ような方法の一つである。簡単にいえば、この方法はプライマー配列から下流部
位において（すなわちプライマーの伸長方向で）標的核酸と特異的にアニールす
る標識オリゴヌクレオチドプローブを用いる方法である。このプローブは、その
プローブ上に存在するレポーター蛍光性分子と消光剤分子を含み、消光剤分子は
プローブがそのままである場合は蛍光シグナルの検出を抑制する。増幅が（標的
の存在下でのみ）起こると、プライマーはＤＮＡポリメラーゼの作用によって伸
長し、プローブはポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によって消化される。
プローブのこのような消化により、消光剤分子は、物理的にレポーター分子から
分離され、蛍光シグナルの検出を可能にする。このように、蛍光は増幅とともに
増加し、標的配列の存在を示す。

【０００６】しかしながら、残念なことに、検出されたシグナルがすぐに標的配列の増幅と
つながるような、異成分技術を用いた増幅核酸配列の検出の方法はない。

【０００７】発明の簡単な要約本発明は、試験サンプル中の標的配列の存在を検出するための方法を提供する
。この方法は、（ａ）試験サンプル、その中に含まれるかもしれない標的配列、
増幅試薬、ならびに、プローブがプライマーの下流にあるように、標的配列の同
じ鎖にハイブリッド形成するプライマーおよびプローブを含む反応混合物を形成
する段階；（ｂ）反応混合物中のプローブを分解して、完全なプローブ上に存在
する第一標識と第二標識を分離する段階、ここで第一標識は特異的結合メンバー
である；（ｃ）反応混合物を捕捉試薬と接触させて第一特異的結合メンバー／捕
捉試薬複合体を形成する段階；および（ｄ）第一特異的結合メンバー／捕捉試薬
複合体に結合した第二標識を検出する段階を含み、ここにおいて、シグナルの損
失が、標的配列の存在を示す。反応混合物は、さらに、標的配列に相補的な配列
とハイブリッド形成するプローブおよび／またはプライマー配列を含むことがで
きる。さらに、反応混合物は、複数の標的配列の検出を可能にするために、他の
一つ以上の配列とハイブリッド形成する付加的なプローブおよび／またはプライ
マー配列を含んでよい。

【０００８】プローブ上の第二標識は直接的に検出可能な標識でありえ、それはまた、第二
特異的結合メンバーであってもよい。第二標識が特異的結合メンバーである場合
、本方法は、第一特異的結合メンバー／捕捉試薬複合体を共役物と接触させて、
第二標識を検出する段階ををさらに含むことができる。本方法は、例えば、（１
）第一特異的結合メンバー／捕捉試薬複合体の形成後であってそのようにして形
成された複合体と共役物との接触前、あるいは第二標識の検出前に、および／ま
たは（２）第一特異的結合メンバー／捕捉試薬複合体と共役物との接触後であっ
て第二シグナルの検出前に、１回あるいは複数回の洗浄の段階をさらに含むこと
ができる。

【０００９】一つの実施形態において、プローブは、ポリメラーゼと５’→３’エキソヌク
レアーゼ活性を有する酵素を反応混合物中に含むことによって、分解される。こ
の実施形態によると、標的配列は、プローブが分解されたときに、同時に増幅さ
れる。もう一つの実施形態においては、プローブは、ポリメラーゼと５’→３’
エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を反応混合物中に含むことによって、分解
されるが、プローブの分解は、伸長したプライマーと残存しているプローブが連
結能を有するような、所定の地点で止まりうる。この実施形態によると、標的は
、たとえば反応混合物中でリガーゼ活性を有する酵素を含むことにより、連結能
プライマーおよびプローブを連結することによって増幅できる。標的配列が増幅
される実施形態によると、標的配列複製物の数は、例えば反応混合物を温度循環
することにより、ハイブリッド形成と解離条件を交互に循環することにより増加
させることができる。

【００１０】（発明の詳細な説明）本明細書中で使用されている「増幅反応試薬」という用語は、核酸増幅反応で
それらの使用がよく知られている試薬を意味し、限定されないが、以下のものを
含んでよい。別々にあるいは個々に、５’→３’エキソヌクレアーゼ、逆転写酵
素、ポリメラーゼおよび／またはリガーゼ活性を有する１つかまたは複数の試薬
または酵素；マグネシウムのような補酵素因子；塩；ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（ＮＡＤ）；及びたとえば、デオキシアデノシン三リン酸、デオキ
シグアノシン三リン酸、デオキシシトジン三リン酸、チミジン三リン酸のような
デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）。

【００１１】本明細書中で使用されている「捕捉試薬」という用語は、特異的結合メンバー
に付加、あるいは結合した固相のことである。捕捉試薬を合成するための結合化
学はよく知られており、当業者にとっては選択の問題であり、特異的結合メンバ
ーの特異的結合の特性、または固相の固体性質を壊すことのない、化学的な方法
、および／または物理的な方法を含んでよい。

【００１２】本明細書中で使用されている「共役物」という用語は、直接的に検出可能な標
識に付加あるいは結合した特異的結合メンバーを意味する。共役物を合成するた
めの結合化学は、当技術分野においてよく知られており、たとえば、特異的結合
メンバーの特異的結合の特性、あるいは標識の検出可能な性質を壊すことのない
、化学的な方法、および／または物理的な方法を含んでよい。

【００１３】「変性条件」という用語は一般的に、二本鎖核酸の一本鎖の形への解離を促進
する条件として定義される。これらの条件は高温および／または低イオン強度を
含むことができる。

【００１４】「ハイブリッド形成条件」という用語は一般的に、核酸配列の重合、核酸配列
のアニーリングおよび核酸配列の増幅を促進する条件として定義される。このよ
うなアニーリングおよびハイブリッド形成が、ある程度予測できるようにして、
温度、イオン強度、配列の長さ、および配列のＣ：Ｇ含量を含む、いくつかのパ
ラメーターに依存していることは、当技術分野でよく知られている。任意の所与
の配列の一組について、融解温度、あるいはＴｍがいくつかの既知の方法によっ
て予測することができる。典型的に、ハイブリッド形成条件は、任意の核酸配列
の組の融解温度よりわずかに低い温度を含む。イオン強度あるいは「塩」濃度も
また融解温度に影響を与え、これは小さなカチオンが、ホスホジエステル骨格上
の負電荷を遮蔽することによって二本鎖の構造を安定化させる傾向があることに
よる。代表的な塩濃度は、カチオンの性質と結合価に依存し、しかしこれは当業
者には容易に理解される。同様に、Ａ：Ｔ対は２つの水素結合だけだが、Ｇ：Ｃ
対は３つの水素結合を含むので、そしてより長い配列は鎖をともに保持している
水素結合をより多く持つために、高Ｇ：Ｃ含有量と配列の長さの増加もまた、二
本鎖構造を安定化させることが知られている。従って、高Ｇ：Ｃ含有量とより長
い配列の長さは「ハイブリッド形成条件」が達成されることに影響を与える。上
記に基づき、特定の核酸配列の組に対する適当な「ハイブリッド形成条件」を決
定することは、この技術分野の通常の技術内で十分である。

【００１５】本明細書中で使用されている「標識」という用語は、検出に有用である性質あ
るいは特徴を有する分子または部分をいう。標識は、例えば、放射性同位体、蛍
光発色団、化学発光発色団、酵素、コロイド粒子、蛍光微粒子および類似のもの
と同様に直接的に検出可能ものでよく、または標識は、例えば特異的結合メンバ
ーにより、間接的に検出可能なものでよい。直接的に検出可能な標識は、たとえ
ば、基質、誘因試薬、光等の標識の検出が可能にするような、追加的な成分を必
要とされうることは理解されるであろう。検出に間接的な標識を使用する場合、
典型的には、これらは上記で定義したような共役物との組み合わせで使用する。

【００１６】「連結」という用語は、２つの適切に位置している核酸配列を共有結合的に接
着させるいくつかの方法を含む一般的な用語である。好ましい方法は、酵素的連
結である。本出願の目的のために、「連結能」という用語は連結される能力のあ
るプローブ末端のことを指す。既知の酵素的リガーゼに対して、連結能は、３’
ハイドロキシル末端が、５’リン酸化末端に隣接して配置されるような、核酸部
分を必要とする。

【００１７】本明細書中に使用されている「プライマー」という用語は、プローブ配列の上
流にハイブリッド形成する核酸配列を意味する。標的配列上でのプライマーの存
在は、同一の標的鎖にハイブリッド形成したプローブ配列の分解を促進しうる。
当技術分野で知られているように、プライマーはまた、プライマーがハイブリッ
ド形成する標的配列に相補的な配列の合成を開始し得る。プライマーはハイブリ
ッド形成するために、標的配列に対して十分に相補的でなければならないが、こ
れはプライマー配列のすべてが標的配列に相補的であることを意味するわけでは
ない。

【００１８】本明細書中に使用されている「プローブ」という用語は、プライマー配列から
下流の標的配列にハイブリッド形成する核酸配列を意味し、プローブが標的配列
にハイブリッド形成したときのみ分解されるということを意味する、標的配列依
存様式において分解される核酸配列を意味する。本発明によるプローブは、少な
くとも二つの標識で標識され、この標識の少なくとも一つは特異的結合メンバー
である。プローブは、ハイブリッド形成するために、標的配列に対して十分に相
補的でなければならないが、これはプローブ配列のすべてが標的配列に相補的で
あることを意味するわけではない。

【００１９】プローブとプライマーは核酸配列であり、典型的には、ＤＮＡあるいはＲＮＡ
である。プローブまたはプライマーの長さは重要ではないが、通常１０から約１
００ヌクレオチドの長さであり、好ましくは約１５から３５であり、望ましい標
的に対し適切な限定された塩基配列を有する。そのような配列は、天然のあるい
は合成的な源からのものでありえ、一般に有用である多様な技術を用いて慣例的
に合成することができる。たとえば、ＤＮＡの配列は、従来のヌクレオチドホス
ホルアミダイト化学と、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ／ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ，Ｄｉｖ．，（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）あるいはＰｅｒ
ｃｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，
ＭＡ）から入手できる器具を用いて合成できる。同様に、望ましければ、配列は
、すべて本明細書において参照により組み込まれている米国特許第５，４６４，
７４６号、第５，４２４，４１４号、および第４，９４８，８８２号に記載され
ているような当技術分野で良く知られている方法論を用いて標識できる。本明細
書では便宜上、標的配列へハイブリット形成するプローブとプライマー間の関係
を、場合によっては「上流」あるいは「下流」と呼ぶ。プライマーとプローブが
同一の直線標的核酸鎖の異なる領域とハイブリット形成するとき、１つのプライ
マーの３’末端がプローブの５’末端の方へ向いており、鎖がコード目的に「セ
ンス」方向を有するかどうかに関わらず、前者は「上流」プライマーと呼ばれ、
後者は「下流」プローブと呼ばれる。

【００２０】本明細書中で使用されている「固相」という用語は、不溶である、あるいは後
の反応によって不溶性とすることができる物質を表す。固相は、捕捉試薬を形成
するために結合メンバーを引きつけ固定化するその本質的な能力のために選ぶこ
とができる。あるいは、固相は捕捉試薬を形成するために結合メンバーを引きつ
け固定化する能力を有する付加的なレセプターを保持することができる。付加的
なレセプターは、結合メンバー、あるいは結合メンバーと共役している帯電物質
に関して、相対して電荷を有する帯電物質を含むことができる。さらにあるいは
、レセプター分子は、固相上に固定化され（引きつけられ）、そして、特異的結
合反応を通して他の結合メンバーを固定化する能力を有する、特異的結合メンバ
ーでありえる。レセプター分子は、アッセイの実施前あるいはアッセイの実施中
に、結合メンバーの固相物質への間接的な結合も可能にする。固相は従って、ラ
テックス、プラスチック、誘導体化プラスチック、磁気あるいは非磁気金属、ガ
ラスあるいはシリコン表面、試験管の表面、マイクロタイターウェル、シート、
ビーズ、微粒子、チップ、そして当業者に知られている他の構成物であり得る。
好ましい固相支持体は微粒子である。

【００２１】本明細書中で使用されている「特異的結合メンバー」という用語は、結合して
いる対のメンバー、すなわち、１つの分子が、例えば化学的、あるいは物理的方
法で、他の分子と特異的に結合する２つの異なる分子を意味する。抗原と抗体の
結合対に加えて、結合対の他の例は、アビジンあるいはストレプトアビジンとビ
オチン、ペプチドあるいはタンパク質配列とその配列あるいはタンパク質に特異
的な抗体、相補的な核酸配列、ハプテンとそれぞれ米国特許第５，４２４，４１
４号、第５，４６４，７４６号（これらの特許明細は参照文献にて本明細書に組
み込まれている）に記載の、カルバゾールやアダマンタンのようなハプテンに特
異的な抗体等が含まれるが、これらに限定されない。

【００２２】本明細書中で使用されている「標的配列」あるいは「標的」は、検出されるか
、または本明細書中で提供した方法によって増幅され、かつ検出される核酸配列
を意味する。加えて、標的配列という用語がときに、一本鎖として引用されるが
、当業者は、この標的配列は実際には二本鎖であってもよいことを認識するであ
ろう。従って、標的が二本鎖である場合、プローブおよび／またはプライマー配
列は、本発明による標的配列の両方の鎖にハイブリッド形成できる。

【００２３】本明細書中で使用されている「試験サンプル」という語は、標的配列を含んで
いると予想されるものを意味する。試験サンプルは、例えば、血液、目のレンズ
液、脳脊髄液、ミルク、腹水液、滑液、腹膜水、羊水、組織、発酵液、細胞培養
物等のような、いくつかの生物学的源から得、または得ることができる。試験サ
ンプルは、（１）源よりえられたものとして直接、あるいは（２）サンプルの特
性を変化させるための前処理を行った後、使用できる。従って、試験サンプルは
使用前に、例えば血液から血清を調製すること、細胞あるいはウイルス粒子を粉
砕すること、固体物質から液体を準備すること、粘性液体を希釈すること、液体
を濾過すること、液体を蒸留すること、液体を濃縮すること、干渉成分を不活性
化すること、試薬を加えること、核酸を精製すること等によって前処理すること
ができる。

【００２４】本方法は、少なくとも１つの標識が特異的結合メンバーであるような、少なく
とも２つの標識を有するプローブを用いて、試験サンプル中に存在しうる標的配
列を検出する。本方法によって検出された標的配列はまた、核酸増幅反応原理に
よって増幅することができる。標識の系を考えると、プローブそれ自身は、異成
分イムノアッセイ技術を用いて検出できる。しかしながら、標的配列と適当なプ
ライマーの存在下では、プローブは分解され、従ってもはや検出はできない。よ
ってプローブに起因するシグナルの減少は、標的配列の存在を示す。従って、本
発明は、標的の増幅が結果として生じえおよび好ましくは結果として生じるが、
標的配列とハイブリッド形成するプローブの分解に基づく検出方法である。シグ
ナルの減少を検出することは、典型的にエンドポイント型読みとりであるが、し
かしシグナルの減少は増幅と組になっていて、かくの如く、引き続く増幅サイク
ルの後の、リアルタイム形式で測定されることを指摘しておく。さらに、そのよ
うな検出計画が、検出を遂行するために、増幅反応それ自身（例えば、増幅産物
とハイブリッド形成するプローブ）からの二次的な事象に依存するために、増幅
反応からの産物が分離され検出されるような他の検出計画と比較すると、さらな
る有効な検出がエンドポイント読み取り様態において達成される。

【００２５】当技術分野でよく知られているように、反応混合物の形成は、プローブおよび
／またはプライマーが標的配列にハイブリッド形成するような適切な条件下で行
われる。好ましくは、プローブはプライマーの伸長より前か、または同時に標的
配列にハイブリッド形成する。濃度の調節は、プローブが確実にしかし好ましく
ハイブリッド形成することを確かにするために行われえ、プローブの融解温度（
Ｔｍ）は、好ましいハイブリッド形成パターンを確実にするために、プライマー
のＴｍよりも高いか、または等しい。反応混合物中でのプライマーとプローブの
正確な濃度は、重要ではない。しかしながら、好ましくは、プローブは、その濃
度がそれ自身でシグナルに影響するような濃度か、またはそれに近い。特に、あ
る濃度以上では、プローブそれ自身の濃度が異なっても、そのプローブ濃度がど
のくらい増加したかに関わらずほとんど同一のシグナルを示す（飽和点）。一方
、飽和点以下では、プローブの濃度が異なるとシグナルは増加したり減少したり
する。プローブの分解による十分なシグナルの減少が起こるために、プローブの
濃度は飽和点か、その近くであることが好ましい。しかしながら、本方法は、飽
和点に近くはないプローブ濃度でも有効であり、サイクルの回数とプライマーの
濃度が、プローブ濃度の増加あるいは減少にあわせるために調節できる。さらに
、たとえば放射性同位体のような、より感度のよい検出可能標識が、最適なプロ
ーブ濃度より少ない濃度で使用されるとき、使用できる。

【００２６】特定のプローブについて、飽和点を決定すること、または特定の系によって使
用するために、サイクル回数を調節することは、当技術分野で一般的に行われて
いるように、例えば、様々なプローブ濃度からシグナルを検出すること、（ある
いはプローブを滴定すること）、あるいは様々なプライマー濃度で反応を進める
ことによって経験的に決定できる。

【００２７】もちろん、標的配列の同一の鎖にハイブリッド形成する１つのプライマーと１
つのプローブが使用される限り、様々なプライマーとプローブ配列の組み合わせ
が使用できることは理解されるだろう。例えば、標的配列の両方の鎖に対するプ
ライマーおよびプローブを使用してもよく、あるいは、標的の１つの鎖に対する
プライマーとプローブ、および標的の他の鎖に対するプライマーのみが使用でき
る。

【００２８】反応混合物の形成と標的へのプライマーおよびプローブのハイブリッド形成に
引き続き、存在する場合、プローブが分解される。プライマーの下流に位置して
いるプローブは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素によって分解
されうる。一実施形態によると、ポリメラーゼ活性および５’→３’エキソヌク
レアーゼ活性の両方を有する酵素が、それによって標的配列の複製物を合成する
ために、そしてまた、伸長産物がハイブリッド形成したプローブに到達した時、
プローブを分解するために、プライマー配列の第一伸長に使用される。伸長産物
は、標的から分離でき、サイクルが、例えば温度循環を通して繰り返される。温
度循環は変性とハイブリッド形成条件を変化させるよく知られた手順で、通常１
０から１００サイクルで行われる。ポリメラーゼと５’→３’エキソヌクレアー
ゼ活性の両方を有する一つの好ましい酵素は、商業的に入手できるＴａｑＤＮ
Ａポリメラーゼのような温度安定性ポリメラーゼである（たとえばＰｅｒｋｉｎ
−Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣｏｎｎのＡｍｐｌｉｔａｑ（登録商標））。

【００２９】第２の実施形態において、ポリメラーゼと５’→３’エキソヌクレアーゼ活性
を有する酵素は、プライマー配列を伸長でき、少なくとも１つのヌクレオチド三
リン酸の反応混合物を取り除くことで、プローブ中の予め決められている点まで
のプローブ配列を分解できる。本様式における、５’→３’エキソヌクレアーゼ
活性を止めるための方法は、本明細書に参照文献により組み込まれている、米国
特許第５，５７３，９０７号にすでに記載されている。この方法で５’→３’エ
キソヌクレアーゼ活性を止めることで、プローブの残存している部分と、伸長し
たプライマーが、連結可能な方法によって、標的とハイブリッド形成する。ある
いは、増幅とプローブの分解は、（１）新しい５’末端が露出し、（２）それは
プライマーと連結する能力があるというようなプローブの非相補的５’末端を取
り除く、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いて行われうる。
そのような配列の連結のための多くの方法が使用できたが、しかし好ましくは、
リガーゼ活性を有する酵素が使用される。従って、標的配列の複製物が作られる
。複製物の数は、上述したように反応を繰り返すことで増加する。

【００３０】すでに議論されているように、プローブは、少なくともその１つが特異的結合
メンバーである、２つの標識を有することができる。標的の存在下で、特異的結
合メンバーは、分解工程によって、他の標識と分離される。結果として、捕捉試
薬と反応混合物が接触する際、結合メンバーは捕捉試薬とともに複合体を形し、
しかし他の標識を含むプローブの残りの部分は捕捉試薬とは結合しない。従って
、第２標識からのシグナルの減少が検出され、そのような減少は標的配列の存在
を示す。一方、もし標的配列が存在しなければ、プローブは両方の標識がついた
、そのままの状態で残る。後者の場合、第２標識の欠失によるシグナルの欠失は
ない。上述したように、共役物がこの標識を検出するために典型的に使用される
場合、第２標識はまた、特異的結合メンバーを含んでもよい。もちろん、洗浄工
程を、捕捉試薬へのプローブ（あるいはその一部分）の結合後、および／あるい
は捕捉試薬が共役物に接触した後、行うことができることが理解されるだろう。

【００３１】本方法により、２、３あるいはそれ以上の標的配列を「多重化する」、あるい
は検出することも可能である。このような場合、少なくとも１つの追加的なプラ
イマー／プローブの組は、追加的な標的配列を検出するために使用され、しかし
上で言及したように、プライマー／プローブの組の異なった構成が、それぞれの
標的配列のために使用されてもよい。たとえば、付加的な標的のそれぞれの鎖に
対するプライマーとプローブを使用してもよいし、あるいは標的配列のそれぞれ
の鎖に対するプライマーと１つのみのプローブを使用してもよい。多重化実施形
態により検出された追加的な標的配列は、異なる検体からの配列、あるいはある
場合、内部コントロール配列を表しうる。内部コントロール配列は典型的に、少
なくともプライマーやプローブ配列がハイブリッド形成する領域において、知ら
れている配列を有する核酸である。この内部コントロール配列は、検体標的配列
に対する増幅反応が十分であるかどうかを決定する目的のために、あるいは定量
増幅アッセイにおけるプライマーに対して検体標的配列と競合させる目的のため
に、使用できる。

【００３２】もちろん、多重化実施形態によると、少なくとも１つの標的配列は、本方法に
よって検出されるが、追加的な標的配列は、すでに知られている増幅と検出の方
法によって検出されてもよいことは理解されるであろう。従って、例えば、反応
混合物中のＨＩＶ標的配列は、すでに知られている方法によって検出でき、同じ
反応混合物中の内部コントロール配列は、本発明の方法によって検出できる。

【００３３】多重化実施形態によれば、プライマー配列はすべての配列に対して異なっても
よく、プライマーはすべての標的配列、またはそれらの組み合わせに対して同じ
でありうる。しかしながら、好ましくは、それぞれの標的は異なるプローブ配列
をもつ。このようなプローブ配列は、同一の、あるいは異なる標識系を有するこ
とができ、しかしまた、シグナルを区別させることを助けるための、それぞれの
プローブに対する、少なくとも１つの異なる標識を有することが好ましい。捕捉
試薬と反応する標識が異なるような事象では、さまざまな標的配列に対するプロ
ーブ配列は、異なる特異的結合メンバーを含む、捕捉試薬を用いて、それら（あ
るいはその断片）を異なる捕捉試薬へ固定化することで分離できる。あるいは、
捕捉試薬と反応する標識は、シグナルの欠失を検出するために使用できる同一の
、そして異なる第２標識であり得る。例えば、異なる励起スペクトルを有する蛍
光発色団が使用でき、または異なる基質を有する酵素が、多重シグナル欠失を検
出するために使用できるであろう。当業者によって、標的配列の存在の指標がシ
グナルの減少であるので、シグナルの損失と比較するための、少なくとも１つの
ベースライン測定を行うことが好ましいことが理解されるだろう。

【００３４】本発明の実施形態を、ここで図と関連して議論する。図１Ａは、（１）プライ
マーとプローブ配列が１つの鎖にハイブリッド形成するように、および（２）プ
ライマーが他の鎖にハイブリッド形成するように図１Ｂにおいて引き続き分離さ
れる、二本鎖標的配列を示す。図１Ｂも、伸長されているプライマーを示し、図
１Ｃでは、プライマーの伸長が分解物となる点でプローブに到達して、円と四角
で表した標識を分離する。反応混合物はそこで、捕捉試薬と接触し、図１Ｄに示
すように、特異的結合構造物／捕捉試薬複合体が形成されるが、第２標識は存在
せず、従って検出はできず、それによってシグナルの減少を示す。逆にもし標的
が存在せず、反応混合物が捕捉試薬と接触したら、図１Ｅで示すように、第２標
識の存在することによって完全なプローブが検出できよう。

【００３５】図２は、本発明のもう１つの実施形態を示し、ここでは二本鎖標的配列（図２
Ａ）は、図２Ｂに示すように、プローブとプライマーが標的配列の１つの鎖にハ
イブリッド形成できるように分離される。図２Ｂにはまた、プローブの５’末端
が標的にハイブリッド形成せず、四角で表すように標識されている、完全には相
補的でないプローブを示す。図２Ｃは、５’→３’エキソヌクレアーゼを有する
酵素が、プローブの５’非相補性領域を分解するのに作用した後の反応混合物を
説明している。この時点で、リガーゼが、プライマーとプローブ上に作用して、
近接するプライマーとプローブを連結し、それによって標的配列を増幅する。増
幅が起こるか起こらないかにかかわらず、図２Ｃに示したように分解されて、プ
ローブは四角と円によって表した２つの標識を分離する。２Ｃの段階からの反応
混合物はここで、捕捉試薬と接触し、図２Ｄに示すように特異的結合メンバー／
捕捉試薬複合体が形成されるが、第２標識は存在せず、従って検出可能はできず
、それによってシグナルの減少を示す。逆にもし、標的が存在せず、反応混合物
が捕捉試薬と接触すると、完全なプローブが図２Ｅで示すように、第２標識の存
在によって検出できよう。

【００３６】本発明をさらに説明するために、以下の実施例が提供されるが、しかしこの実
施例は、本発明を限定することを意図するものではない。

【００３７】実施例以下の実施例は、ここで提供したＤＮＡオリゴマープライマーおよびプローブ
を用いたＨＩＶ核酸の検出を示す。これらのＤＮＡプライマーおよびプローブは
、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７
、配列番号８、および配列番号９として同定され、ＨＩＶのｇａｇ遺伝子の領域
に対して特異的である。ＨＩＶ−１（サブタイプＢ、系統ＳＦ−２）からのｇａ
ｇ標的配列は、本明細書において、配列番号１として表される。

【００３８】以下の実施例において、配列番号２、配列番号３、および配列番号４はＨＩＶ
のｇａｇ領域、そして利用できる場合、内部コントロール標的に対して特異的な
増幅プライマーとして用いられる。配列番号５、配列番号６および配列番号７は
、ＨＩＶｇａｇ領域に対する内部ハイブリッド形成プローブとして用いられる
。配列番号８および配列番号９は内部コントロール標的に対する、内部コントロ
ールハイブリッド形成プローブとして用いられる。内部コントロール標的配列は
、本明細書において配列番号１０として表される。

【００３９】実施例１ＨＩＶプライマーおよびプローブの準備Ａ．ＨＩＶプライマー／内部コントロールプライマープライマーをＨＩＶｇａｇ標的配列を検出するために設計した。これらのプ
ライマーは、配列番号２、配列番号３、および配列番号４であった。プライマー
配列は、標準のオリゴヌクレオチド合成方法を用いて合成した。内部コントロー
ル標的は、ＨＩＶ／内部コントロールプライマー結合部位を含み、内部コントロ
ールプローブ結合のための異なった内部配列を含むｉｎ−ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ
であった。

【００４０】Ｂ．ＨＩＶプローブプローブを、ＨＩＶｇａｇ標的配列と、両プライマーの内部の領域において
ハイブリッド形成するように設計した。これらのプローブは、配列番号５、配列
番号６および配列番号７であった。プローブ配列は、標準オリゴヌクレオチド合
成方法を用いて合成し、（参照により本明細書に組み込まれる）米国特許第５，
４６４，７４６号に記載されたような、標準シアノエチルホスホルアミダイト結
合化学を用いて、５’末端をカルバゾールで、３’末端をアダマンタンでハプテ
ン化した。

【００４１】Ｃ．内部コントロールプローブ内部コントロールプローブを、両プライマーの内部の領域において、内部コン
トロール標的配列とハイブリッド形成するように設計した。これらのプローブは
、配列番号８および配列番号９であった。内部プローブ配列は、標準オリゴヌク
レオチド合成方法を用いて合成し、（参照により本明細書に組み込まれる）米国
特許第５，４６４，７４６号に記載されたような、標準シアノエチルホスホルア
ミダイト化結合化学を用いて、５’末端をカルバゾール、そして３’末端をビオ
チンによってハプテン化した。

【００４２】実施例２ＨＩＶおよび内部コントロールプローブの力価測定ＨＩＶプローブからのシグナルが、サンプル／標的濃度の上昇に伴って減少す
るので、標的ＤＮＡの存在に対して最も感度がよい、プローブの最適開始量を決
定する必要があった。これを、標的の不存在下で、プローブ希釈液を試験するこ
と、および試験系が、さらなるプローブが加えたときに、もはやシグナルの増加
を示さないような点を探すことにより行なった。これを、ＨＩＶプローブのみに
対して、および内部コントロールプローブとの組み合わせでＨＩＶプローブに対
して行った。

【００４３】Ａ．一つのＨＩＶプローブの力価測定ＨＩＶ逆鎖プローブ（ＨＩＶＲＰ）、配列番号６を、２．５ｍＭ酢酸マンガ
ンを含む、１×ＥＺ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔ
ｙ，ＣＡ）中に希釈し、希釈液を、ＡｂｂｏｔｔＬＣｘ（登録商標）システム
（ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＡｂｂｏｔｔＰａｒｋ，ＩＬよ
り入手可能）で二重に試験した（すべては商業的にＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ，ＡｂｂｏｔｔＰａｒｋ，ＩＬより入手可能である）。抗カルバ
ゾール抗体をコートした微粒子と抗アダマンタン抗体／アルカリフォスファター
ゼ共役物の懸濁液を、プローブを捕捉し、検出するためにＬＣｘ（登録商標）で
使用した。酵素基質は、メチル−ウンベリフェリルリン酸（ＭＵＰ）を用い、Ｍ
ＵＰのＭＵへの転換速度を、カウント数／秒／秒（ｃ／ｓ／ｓ）として測定して
記録した。

【００４４】本実験のデータを表１に示し、このデータはおよそ１７ｎＭのプローブの時、
プラトーが始まっているシグナル検出を示している。

【００４５】

【表１】

【００４６】Ｂ．ＨＩＶおよび内部コントロールプローブの個別、および同時に行う力価測定ＨＩＶプローブと内部コントロールプローブ両方が同時に存在することが、そ
れぞれのシグナルにどのような影響を与えるかを測定するため、両プローブを別
々の反応中で、および同一の反応中で一緒に、力価測定した。２つのＨＩＶプロ
ーブ、ＨＩＶ順鎖プローブ（ＨＩＶＦＰ；配列番号５）およびＨＩＶＲＰ（
配列番号６）を、内部コントロールプローブ配列番号８（ＩＣＦＰ）および
配列番号９（ＩＣＲＰ）とともに用いた。すべてのプローブを別途の反応中で
試験し、およびそれぞの内部コントロールプローブを、それぞれのＨＩＶプロー
ブと一緒に同一の反応中で試験した。すべてのプローブは、２．５ｍＭ酢酸マン
ガンを含む１×ＥＺ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔ
ｙ，ＣＡ）中、３０、２５、２０、１５、１０、５、１、０．５、０．２５およ
び０．１２５ｎＭの濃度に希釈した。試験はＨＩＶプローブを検出するために、
抗アダマンタン抗体／アルカリフォスファターゼ共役物をもちいて、あるいは内
部コントロールプローブを検出するために抗ビオチン／アルカリフォスファター
ゼ共役物を用いて実施例２ＡのようにＡｂｂｏｔｔＬＣｘ（登録商標）系で行
った。反応混合物は、一つの組が一つの共役物を用いて試験され、もう一つの組
が他の共役物を用いて試験されるよう２つに分けた。

【００４７】

【表２】

【００４８】表２の結果は、それぞれのプローブからのシグナルが、プローブ濃度が１０ｎ
Ｍ付近でプラトーとなりはじめたことを示している。内部コントロールプローブ
からのシグナルは、いずれのＨＩＶプローブの存在によっても、有意な影響を受
けているようにはみられず、しかし、ＨＩＶプローブからのシグナルは内部コン
トロールプローブの付加によって影響を受ける。ＨＩＶプローブシグナルは、内
部コントロールプローブも存在する時に、３０から５０％減少する。プローブの
濃度は、それぞれのプローブからのシグナルが、飽和点以下であったように調節
し選んだ。

【００４９】実施例３ＨＩＶの検出ＨＩＶＲＮＡをＵｌｔｒａｓｐｅｃＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎＳｙｓ
ｔｅｍ（Ｂｉｏｔｅｃｘ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を用いて、ビリオン（Ａｄｖ
ａｎｃｅｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，
ＭＤ）の既知量から単離し、クロロホルム／イソプロパノールで抽出し、エタノ
ール沈殿した。ペレットをＲＮａｓｅ不含水（５プライム３プライム，Ｂｏｕｌ
ｄｅｒ，ＣＯ）に再懸濁させた。次いでこのＨＩＶＲＮＡの１０倍希釈液を、
リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎ
ｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）２０ｎｇ／μｌを含んだ希釈液を用いて、１０^５から１０^１ＲＮＡ分子／２５μｌの濃度で準備した。

【００５０】ＨＩＶＲＮＡの希釈液を逆転写し、プローブとして別々に個別の反応で、ま
たは２つの異なる濃度にて同時に、２つの異なったＨＩＶプローブ、ＨＩＶＦ
Ｐ（配列番号７）およびＨＩＶＲＰ（配列番号６）を用いるとともに、プライ
マーとして配列番号２および３を用いて、これをＰＣＲ増幅し、検出した。ＲＴ
−ＰＣＲは、１×ＥＺ緩衝液、２．５ｍＭ酢酸マンガン、それぞれ０．１５ｍＭ
の最終濃度で存在するｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＣ
ＴＰ）、５ユニット／反応の濃度での組換え型Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓポリメラーゼを用いて行った。

【００５１】個別の反応で用いた場合、プライマーはそれぞれ２５０ｎＭの濃度で使用し、
プローブはそれぞれ１６．６ｎＭの濃度で使用し、また同時に用いたときには、
両方ともそれぞれ１６．６ｎＭ、あるいは８．３ｎＭで使用した。サンプル容量
２５μｌのＨＩＶＲＮＡ１０倍希釈液を、合計反応量０．２ｍｌとするため、
上記混合物を含む１７５μｌに加えた。陰性対照は、５００ｎｇのｒＲＮＡ／反
応との比較でおこなった。

【００５２】反応混合物をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ４８０サーマルサイクラーで逆転
写し、増幅させた。反応混合物を、ＲＮＡを逆転写するために、まず３０分間６
２℃、その後１分間９４℃でインキュベートした。ＰＣＲ増幅は、３０秒間９４
℃、続いて２分間６２℃を３５あるいは４５サイクルで行った。反応混合物を温
度循環した後、混合物を５分間９７℃に保ち、そしてＰＣＲ産物の再アニーリン
グのために２０分間以上６２℃まで温度を下げた。そして、温度を４℃まで下げ
、サンプルを反応産物の検出まで４℃で保存した。反応産物を実施例２Ａに示す
ようにＡｂｂｏｔｔＬＣｘ（登録商標）で検出した。

【００５３】本実験からのデータを表３に示し、これはＰＣＲの３５サイクルを用いたすべ
てのプローブでの、少なくとも１００分子／反応までのＨＩＶＲＮＡの検出を
示す。ＰＣＲを４５サイクルまで増加すると、ＨＩＶＲＮＡの検出感度は、す
べてのプローブで少なくとも１０分子／反応まで増加する。

【００５４】

【表３】

【００５５】実施例４内部コントロールを用いるＨＩＶの検出以下の実験で使用したＨＩＶサンプルは、ＨＩＶのｇａｇ領域からの６７５ヌ
クレオチド転写物であった。ＨＩＶｇａｇ領域配列をバクテリアプラスミドに
挿入し、バクテリアを培養した。ＨＩＶＲＮＡｇａｇ転写物を制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩを用いてプラスミドＤＮＡをまず線状化し、その後フェノール／クロロホ
ルムによってＤＮＡを抽出し、エタノール沈殿することで調製した。存在するＤ
ＮＡ量は、２６０ｎｍの吸収を用いて分光測定法的に定量した。ＤＮＡはここで
、メーカーの説明書に従って、ＡｍｂｉｏｎｍＭｅｓｓａｇｅｍＭａｃｈｉｎｅ
キット（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いて転写した。次にＲＮＡ転写物をフェノ
ール／クロロホルムを用いて抽出し、ＳｅｌｅｃｔＩサイズ排除ゲルカラム（
５プライム３プライム）に通した。ＨＩＶＲＮＡｇａｇ転写物を分光測定方
法によって定量し、５×１０^７から５×１０^１コピー／１２．５μｌまで連続的
に希釈した。

【００５６】（上記ＨＩＶ転写物と同様に準備した）内部コントロール標的配列（配列番号
１０）転写物と一緒にＨＩＶｇａｇ転写物の希釈液を逆転写し、ＨＩＶプロー
ブ、ＨＩＶＦＰ（配列番号５）とともにプライマーとして配列番号３および４
を、そして内部コントロールプローブＩＣＲＰ（配列番号８）を用いて、ＰＣ
Ｒ増幅し、検出した。１×ＥＺ緩衝液、２．５ｍＭ酢酸マンガン、それぞれ０．
１５ｍＭの最終濃度で存在するｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、お
よびｄＣＴＰ）、５ユニット／反応の濃度での組換えＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓポリメラーゼを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。プライマーはそ
れぞれ２５０ｎＭの濃度で用い、プローブはそれぞれ５ｎＭの濃度で用い、内部
コントロール転写物は５×１０^４コピー／反応液の濃度で存在した。サンプル容
量１２．５μｌの、ＨＩＶｇａｇ転写物の１０倍希釈液の二系列を、合計反応
液が０．２ｍｌになるよう上記混合物に加えた。陰性対照は、５００ｎｇのｒＲ
ＮＡ／反応液との比較でおこなった。

【００５７】反応混合物を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ４８０サーマルサイクラーで逆
転写し、増幅させた。反応混合物を、まずＲＮＡを逆転写するために、３０分間
６２℃、その後１分間９４℃でインキュベートした。ＰＣＲ増幅は、３０秒間９
４℃、続いて２分間６２℃の４５サイクルで行った。反応混合物を温度循環した
後、温度を４℃まで下げ、サンプルを反応産物の検出まで４℃に保った。

【００５８】反応産物をＡｂｂｏｔｔＬＣｘ（登録商標）システムで検出した。抗カルバ
ゾール抗体をコートした微小粒子、ストレプトアビジン／β−ガラクトシダーゼ
共役物、および抗アダマンタン抗体／アルカリフォスファターゼ共役物の懸濁液
を、プローブを捕捉し検出するためにＬＣｘ（登録商標）とともに使用した。酵
素基質は、基質の産物への転換速度を測定し、カウント数／秒／秒（ｃ／ｓ／ｓ
）として記載することで、メチルウンベリフェリル酢酸（ＭＵＰ）および４−メ
チルウンビリフェリルβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（ＭＵＧ）を用いた。ＭＵＰの
産物への転換速度は、ＨＩＶプローブからのシグナルを示し、ＭＵＧの産物への
転換速度は内部コントロールプローブからのシグナルを示す。

【００５９】本実験において、内部コントロール転写物は、プライマーの結合に関して、サ
ンプルのＨＩＶｇａｇ転写物と競合する。従って、多量のＨＩＶｇａｇ転写
物を持つサンプルにおいては、プライマーのほとんどがＨＩＶ転写物に結合し、
結果ＨＩＶプローブシグナルの減少を伴うＨＩＶプローブ消化の増加と、内部コ
ントロールプローブシグナルの増加を伴う内部コントロールプローブの消化の減
少となる。逆に少量のＨＩＶ転写物（あるいはない）サンプルにおいては、プラ
イマーの大部分は内部コントロール転写物に結合し、それによって内部コントロ
ールプローブからのシグナルが減少する内部コントロールプローブの消化の増加
となり、ＨＩＶプローブからのシグナルの増加を与えるＨＩＶプローブの消化減
少となる。

【００６０】本実験のデータを表４に示し、また上に明示した。

【００６１】

【表４】

【００６２】本発明が特異的な実施形態に関連して詳細に記載され、本発明の精神および範
囲から逸脱することなしに、様々な変更および改良がこのような実施形態に対し
て行われうることが、当業者には明らかであるだろう。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一つの実施形態を示す。

【図２】本発明のもう一つの実施形態を示す。

【手続補正書】

【提出日】平成１２年５月９日（２０００．５．９）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者エアトル，ジヨン・アールアメリカ合衆国、ウイスコンシン・53406、ラシーン、ノース・ニユーマン・ロード・ 2500 (72)発明者サリトロ，ジヨン・エイアメリカ合衆国、ウイスコンシン・53406、ラシーン、ユニツト・５、ケイムブリツジ・レイン・5617 (72)発明者ユング，ポール・エムアメリカ合衆国、イリノイ・60622、シカゴ、ノース・ウルコツト・アベニユー・ 1739 Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QA13 QQ10 QQ42 QQ52 QR14 QR20 QR42 QR56 QR62 QS11 QS12 QS25 QS34 QX02 4B064 AF27 CA21 CC24 DA13

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試験サンプル中の標的配列の存在を検出するための方法であ
って、（ａ）試験サンプル、プライマー、プローブ、および増幅試薬を含む反応混合
物を形成する段階、（１）プローブは、第１標識および第２標識を有し、第１標識は第１特異的
結合メンバーを含み、（２）プライマーとプローブは、プローブがプライマーより下流になるよう
に、標的配列とハイブリッド形成し、（ｂ）プローブを分解して第１標識および第２標識を分離する段階、（ｃ）反応混合物を、捕捉試薬と接触させて第１特異的結合メンバー／捕捉試
薬複合体を形成する段階、（ｄ）シグナルの損失が標的配列の存在を示す、第１特異的結合メンバー／捕
捉試薬複合体と結合した第２標識を検出する段階、を含む方法。
【請求項２】プライマーおよびプローブが融解点を有し、プローブの融解
温度がプライマーの融解温度より高いかまたは同じである、請求項１に記載の方
法。
【請求項３】第２標識が第２特異的結合メンバーを含む、請求項１に記載
の方法。
【請求項４】第２標識の検出の前に、第１特異的結合メンバー／捕捉試薬
複合体を共役物と接触させる段階をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】第１特異的結合メンバー／捕捉試薬複合体を形成した後であ
って共役物との接触前の洗浄段階をさらに含み、および第１特異的結合メンバー
／捕捉試薬複合体と共役物との接触後であって第２標識の検出前の洗浄段階をさ
らに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】増幅試薬が、ポリメラーゼ活性および５’→３’エキソヌク
レアーゼ活性を有する酵素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】増幅試薬が、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵
素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】増幅試薬がさらに、リガーゼ活性を有する酵素を含む、請求
項７に記載の方法。
【請求項９】段階（ｃ）および（ｄ）の前に、段階（ａ）および（ｂ）を
１０から１００回繰り返すことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】反応混合物がさらに、標的配列の第二鎖とハイブリッド形
成する第２プライマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】標的配列が内部コントロール配列であり、該方法が反応混
合物中の追加的な標的配列を検出することをさらに含む、請求項１に記載の方法
。
【請求項１２】標的配列が検体からのものであり、該方法がさらに内部コ
ントロール配列を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】反応混合物がさらに、第２標的配列ならびに第２プライマ
ーおよび第２プローブを含み、（１）第２プローブは第３標識および第４標識を有し、第４標識は第１特異的
結合メンバーを含み、（２）第２プライマーおよび第２プローブは、第２プローブが第２プライマー
より下流になるように、第２標的とハイブリット形成する請求項１に記載の方法。
【請求項１４】第２標的配列が、内部コントロール配列である、請求項１
３に記載の方法。
【請求項１５】該方法が、標的配列の量を検出するための定量方法である
、請求項１４に記載の方法。