FI102084B - Menetelmä muokattujen nukleiinihappojen valmistamiseksi ja menetelmä n iiden osoittamiseksi sekä reagenssipakkaus - Google Patents
Menetelmä muokattujen nukleiinihappojen valmistamiseksi ja menetelmä n iiden osoittamiseksi sekä reagenssipakkaus Download PDFInfo
- Publication number
- FI102084B FI102084B FI910238A FI910238A FI102084B FI 102084 B FI102084 B FI 102084B FI 910238 A FI910238 A FI 910238A FI 910238 A FI910238 A FI 910238A FI 102084 B FI102084 B FI 102084B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- nucleic acid
- primer
- nucleic acids
- biospecific
- group
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6846—Common amplification features
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Absorbent Articles And Supports Therefor (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
102084
Menetelmä muokattujen nukleiinihappojen valmistamiseksi ja menetelmä niiden osoittamiseksi sekä reagenssipakkaus - Förfarande för framställning av modifierade nukleinsyror och förfarande för pävisning av desamma samt rea-gensförpackning 5
Keksintö kohdistuu menetelmään muokattujen nukleiinihappojen valmistamiseksi, menetelmään mainitulla Valmistusmenetelmällä saatujen nukleiinihappojen osoittamiseksi, reagensseihin tämän menetelmän toteuttamiseksi sekä reagenssipakkauk-seen nukleiinihappojen osoittamiseksi.
10 Menetelmiä nukleiinihappojen osoittamiseksi käytetään yhä lisääntyvässä määrin kliinisessä diagnostiikassa, esimerkiksi ihmisdiagnostiikan alueella virus- ja baktee-ridiagnostiikassa, herkkänä vaihtoehtona immuunikokeelle. Tällaisia menetelmiä nukleiinihappojen osoittamiseksi voidaan kuitenkin käyttää myös elintarvikediag-nostiikassa ja histologiassa. Näissä menetelmissä osoitettavaa tai ilmaistavaa nukle-15 iinihappoa sisältävä materiaali saatetaan kosketukseen osoitettavalle nukleiinihapolle komplementaarisen nukleiinihapon kanssa. Tämän jälkeen nukleiinihappohybri-din muodostuminen voidaan todeta monella eri tavalla. Eräs tällainen menetelmä on kuvattu esimerkiksi julkaisussa DE-A-28 01 582 tai US-A-4 358 535.
Nämä menetelmät soveltuvat kuitenkin huonommin hyvin pienten nukleiinihappo-20 määrien osoittamiseen. Patenttijulkaisussa EP-A-0 200 362 on ehdotettu näiden menetelmien parantamista siten, että osoitettavaa nukleiinihappoa lisätään in vitro -järjestelmän avulla hybridisointireaktiota edeltävässä vaiheessa. Tätä tarkoitusta varten näytteeseen lisätään vähintään yhtä aluketta osoitettavaa yksijuosteista nukleiinihappoa kohden. Jokaista yksijuosteista nukleiinihappoa kohden muodostetaan yksi 25 templaatti-nukleiinihapolle komplementaarinen nukleiinihappojuoste entsymaatti-sen, mononukleotidien kanssa tapahtuvan ketjunjatkamisreaktion avulla, alukkeesta lähtien. Tämä reaktio voidaan toteuttaa useita kertoja peräkkäin siten, että myös muodostettuja uusia nukleiinihappojuosteita saadaan lisää. Samoin kuin edellä kuvattuun, tekniikan nykytason mukaiseen menetelmään, myös tähän menetelmään 30 liittyy se haitta, että lisäämisreaktion jälkeen toteutetaan hybridisointireaktio merkittyä nukleiinihappoa käyttäen.
Patenttijulkaisussa EP-A-0 324 474 on kuvattu Blotting-menetelmä, jossa ei tarvita hybridisaatiota merkityn nukleiinihappokoettimen kanssa, koska muodostettuun uuteen nukleiinihappoon sisällytetään merkitty mononukleotidi. Tämän menetelmän 2 102084 haittana on kuitenkin se, että nukleiinihapot on erotettava geelikromatografisesti. Tämä edellyttää monimutkaisia laitteita ja siihen kuluu runsaasti aikaa.
Oheisen keksinnön tehtävänä oli päästä eroon tekniikan nykytason mukaisten ratkaisujen haitoista erityisesti saamalla aikaan yksinkertaisempi ja vähemmän vaiheita 5 käsittävä, erityisen herkkä menetelmä nukleiinihappojen osoittamiseksi.
Keksinnön kohteena on menetelmä nukleiinihappojen valmistamiseksi hybridisoi-malla vähintään yksi aluke templaatti-nukleiinihappoon ja pidentämällä entsymaattisesti tämä aluke templaatti-nukleiinihapolle komplementaariseksi nukleiinihappo-juosteeksi erilaisten mononukleotidilajien kanssa toteutetulla reaktiolla, jolle mene-10 telmälle on tunnusomaista, että vähintään yksi mononukleotidilaji käsittää osoitettavan, biospesifisen ryhmän ja tämä sama mononukleotidilaji tai vähintään yksi toinen mononukleotidilaji käsittää immobilisoinnin mahdollistavan, biospesifisen ryhmän. Keksinnön kohteena ovat lisäksi menetelmä nukleiinihappojen osoittamiseksi, reagenssi nukleiinihappojen valmistamiseksi ja reagenssipakkaus nukleiinihappojen 15 osoittamiseksi.
Keksinnön puitteissa templaatti-nukleiinihapot ovat erityisesti prokariooteista tai eukariooteista saatu DNA ja RNA. Niitä ovat myös virus- ja bakteeriperäiset nukleiinihapot sekä viroidien nukleiinihapot. Ne voivat olla yksi- tai kaksijuosteisia. Kysymykseen voivat tulla myös episomaaliset nukleiinihapot kuten plasmidit tai peri-20 mästä peräisin olevat kromosomaaliset nukleiinihapot. Nämä nukleiinihapot voivat olla tunnusomaisia jollekin tietylle organismille tai organismiryhmälle. Tällaiset nukleiinihapot voivat olla myös jo esikäsiteltyjä nukleiinihappoja, esimerkiksi restriktioentsyymeillä pilkottuja nukleiinihappoja. RNA:n tapauksessa tulisi ensin valmistaa cDNA:ta. Edulliseksi on osoittautunut se, että nukleiinihapot ovat yksi-25 juosteisessa muodossa tai saatetaan yksijuosteisiksi ennen reaktion toteuttamista.
Templaatti-nukleiinihapoiksi kutsutaan seuraavassa niitä näytteessä läsnäolevia erityisiä nukleiinihappoja, joihin osoitus- tai valmistusreaktion on tarkoitus perustua.
: Templaatti-nukleiinihappo voi olla läsnä puhdistettuna tai se voi olla seoksena mui den sellaisten nukleiinihappojen kanssa, joita ei haluta osoittaa eikä käyttää.
30 Nukleiinihappoja voi olla läsnä kiinteässä tai nestemäisessä, esikäsitellyssä tai esi-käsittelemättömässä näytteessä. Näitä templaatti-nukleiinihappoja on edullisesti läsnä sellaisessa näytteessä, jota saadaan hajottamalla jotakin organismia, esimerkiksi soluja, ja joka sisältää lukuisia mitä erilaisimpia yhdisteitä, muunmuassa myös muita nukleiinihappoja.
3 102084
Keksinnön mukainen menetelmä nukleiinihappojen valmistamiseksi toteutetaan siten, että templaatti-nukleiinihappoa sisältävään näytteeseen lisätään sopivissa olosuhteissa vähintään yhtä, edullisesti yhtä aluketta nukleiinihapon yksittäistä juostetta kohden. Tämä aluke on edullisesti oligonukleotidi, jonka pituus on 12-60, erityisesti 5 15-30 nt (nukleotidiä). Tämä aluke voi hybridisoitua templaatti-nukleiinihapon tiet tyyn alueeseen. Tämä on mahdollista, mikäli alukkeen nukleotidiketju on olennaisesti komplementaarinen templaatti-nukleiinihapon jollekin alueelle.
Aluke muodostuu edullisesti deoksiribonukleotideistä tai ribonukleotideistä, jotka nukleotidit voivat olla muokattuja tai muokkaamattomia. Suurin osa alukkeen nuk-10 leotideistä on edullisesti muokkaamattomia.
Muokkaamattomia nukleotidejä ovat luonnossa esiintyvät nukleotidit, kuten esimerkiksi adenosiini, guanosiini, tymidiini, uridiini ja sytidiini. Muokattuja nukleotidejä ovat nukleotidianalogit kuten 7-deatsa-adenosiini tai 7-deatsaguanosiini tai mainittujen muokkaamattomien nukleotidien sellaiset johdannaiset, jotka sisältävät immobi-15 lisoinnin mahdollistavan (immobilisoitavan) tai osoitettavan ryhmän.
Tällaisia immobilisoinnin mahdollistavia ryhmiä ovat esimerkiksi sellaiset kemialliset ryhmät, jotka voidaan sitoa kovalenttisesti esimerkiksi kemiallisella reaktiolla tai valoreaktiolla kiinteään faasiin, tai ryhmiä tai molekyylin osia, jotka jokin toinen molekyyli tai molekyylin osa tunnistaa ja johon ne sitoutuvat ryhmäspesifisten vuo-20 rovaikutusten seurauksena. Tällaisia ryhmiä ovat näin ollen esimerkiksi hapteenit, antigeenit ja vasta-aineet, glykoproteiinit, esimerkiksi lesitiini, tai myöskin sitoutuvien proteiinien kuten biotiinin tai iminobiotiinin sitoutumiskumppanit. Edullisia ovat hapteenit ja vitamiinit, erityisen edullisia ovat biotiini tai steroidit kuten digok-sigeniini.
25 Osoitettavat ryhmät ovat esimerkiksi kovalenttisesti sitoutuneita, suoraan osoitettavia ryhmiä tai molekyylin osia kuten esimerkiksi radioisotooppeja, fluoresenssiväri-aineita tai kromoforisia aineita tai myöskin ryhmiä, jotka voidaan osoittaa epäsuo-rasti myöhemmin toteutettavalla reaktiolla. Niitä ovat erityisesti sellaiset biospesifi-set ryhmät, jotka ovat edellä immobilisoinnin mahdollistavien ryhmien yhteydessä 30 mainittujen ryhmien kaltaisia. Erityisen edullinen on digoksigeniini.
Aluke voi sisältää yhden tai useamman tällaisen, immobilisoinnin mahdollistavan tai osoitettavan ryhmän. Se voi sisältää sekä yhden tai useamman immobilisoinnin mahdollistavan ryhmän että myöskin yhden tai useamman osoitettavan ryhmän. On edullista, ettei aluke sisällä lainkaan tällaisia ryhmiä.
4 102084 Näitä alukkeita voidaan valmistaa alan asiantuntijan tuntemalla tavalla, esimerkiksi kemiallisella synteesillä analogisesti julkaisussa WO-84/03285 kuvatulla tavalla tai entsymaattisesti rakentamalla analogisesti julkaisussa EP-A-0 063 879 kuvatulla tavalla. Alukkeen muokkaus on voinut tapahtua mielivaltaisessa kohdassa, ei kuiten-5 kaanmielellään 3-päässä. Mahdollinen on esimerkiksi muokkaus 5'-päästä [esimerkiksi teoksessa "Molecular Cloning", sivu 239 (1982), toimittaja Maniatis et ai., CSH, kuvatulla tavalla] ja/tai nukleoemästen välityksellä, esimerkiksi ε-aminokapro-nihappokytkijän välityksellä ja/tai satunnaisten alukkeiden avulla julkaisun Feinberg et ai., Anal. Biochem., 132, 6(1983) mukaisesti. Periaatteessa sopivia ovat ne kaikki 10 alukkeet, jotka on kuvattu patenttijulkaisussa EP-A-0 200 362.
Olosuhteet, joissa alukkeen ja sen kanssa yhteensopivan, templaatti-nukleiinihapos-sa läsnäolevan osan välinen hybridisoiminen toteutetaan, ovat tuttuja alan asiantuntijalle esimerkiksi patenttijulkaisun EP-A-0 200 362 perusteella. Ne riippuvat alukkeen pituudesta sekä vastaavuuden täydellisyydestä.
15 Tämän alukkeen tulisi käsittää erityisesti 3-päässään vähintään yhden sellaisen nukleotidin, joka sopii yhteen tempiaatti-nukleiinihapon vastaavan nukleotidin kanssa. Lisäksi alukkeessa, erityisesti sen 5'-päässä voi olla nukleotidiketju, joka ei vastaa templaatti-nukleiinihappoa. Aluke voi myös sisältää entsyymien, esimerkiksi poly-meraasien tunnistuskohtia; siihen on myös voinut sitoutua proteiineja.
20 Alukkeen nukleotidiketju valitaan siten, että templaatti-nukleiinihapon yksijuostei-nen nukleotidiketju ulottuu hybridisoinnin jälkeen alukkeen 3'-pään yli.
Keksinnön mukaisessa menetelmässä nukleiinihappojen valmistamiseksi templaatti-nukleiinihaposta ja alukkeesta muodostuneessa hybridinukleiinihapossa alukkeen 3'-päätä pidennetään siten, että muodostetaan templaatti-nukleiinihapon edellä maini-25 tulle yksijuosteiselle alueelle komplementaarinen ja alukkeeseen rajoittuva nukleii-nihappokappale. Tätä tarkoitusta varten voidaan menetellä analogisesti patenttijulkaisussa EP-A-0 200 362 kuvatulla tavalla. Tässä julkaisussa on kuvattu ketjun pi-; dentäminen neljän mononukleosiditrifosfaatin avulla.
Keksinnön mukaisessa menetelmässä mononukleosiditrifosfaatteina käytetään 30 muokkaamattomien nukleosiditrifosfaattien ohella myös muokattuja nukleosiditri-fosfatteja. Muokattuja nukleosiditrifosfaatteja ovat edellä kuvattujen muokattujen nukleotidien trifosfaatit. Esimerkkeinä tällaisista muokatuista mononukleosiditri-fosfaateista voidaan mainita digoksigeniini-dUTP (EP-A-0 324 474) tai biotiini-dUTP. Pidentämisreaktiossa muokattuina nukleosiditrifosfaatteina voidaan käyttää 5 102084 samanaikaisesti sellaisia nukleosiditrifosfaatteja, joissa on immobilisoinnin mahdollistava ryhmä, sekä sellaisia nukleosiditrifosfaatteja, joissa on osoitettava ryhmä. Immobilisoinnin mahdollistava ryhmä ja osoitettava ryhmä ovat tässä tapauksessa edullisesti erilaisia ryhmiä. Pidennettäessä ketjua useamman kuin noin 30-40 nuk-5 leotidin verran voidaan tiettyjä koeolosuhteita noudattaen taata se, että muodostunut uusi nukleotidiketju sisältää useampia immobilisoinnin mahdollistavia ryhmiä. Edullista on se, etteivät kaikki nukleosiditrifosfaatit ole muokattuja. Erityisen edullinen on se tapaus, että neljän luonnollisen nukleosiditrifosfaattilajin ohella käytetään yhtä muokattua nukleosiditrifosfaattilajia.
10 Muokkaamattoman nukleosiditrifosfaatin, jota käytetään myös muokatussa muodossa, määrää pienennetään edullisesti käytetyn saman, mutta muokatussa muodossa olevan nukleosiditrifosfaatin määrän verran siten, että tämän nukleosiditrifosfaattilajin kokonaismäärä pysyy suunnilleen muuttumattomana. Kunkin erilaisen mono-nukleosiditrifosfaattilajin määrä on suunnilleen yhtä suuri ja tuttu alan asiantuntijal-15 le. Kun pidentäminen toteutetaan esimerkiksi analogisesti julkaisussa EP-A-0 200 362 kuvatulla tavalla, niin tämä määrä on edullisesti 100-300 μΜ, erityisen edullisesti noin 200 μΜ.
Keksinnön mukaisen menetelmän seuraavia suoritusmuotoja käyttäen voidaan valmistaa nukleiinihappoja, jotka sisältävät vähintään yhden osoitettavan ryhmän sekä 20 kaksi tai useampaa immobilisoinnin mahdollistavaa ryhmää ja jotka ovat komplementaarisia vähintään jonkin templaatti-nukleiinihapon osalle:
Suoritusmuoto, jossa käytetään vähintään yhden osoitettavan ryhmän sisältävää alu-ketta sekä yhden immobilisoitavan ryhmän sisältävää nukleosiditrifosfaattialajia. Lisäksi aluke voi sisältää vielä yhden tai useamman immobilisoitavan ryhmän ja suori-25 tusmuodossa voidaan edelleen käyttää nukleosiditrifosfaattilajia, joka sisältää osoitettavan ryhmän. Edullisia ovat kuitenkin suoritusmuodot, joissa aluke ei sisällä lisäksi osoitettavaa ryhmää.
Suoritusmuoto, jossa käytetään vähintään yhden immobilisoitavan ryhmän sisältävää * aluketta, yhden osoitettavan ryhmän sisältäviä nukleosiditrifosfaatteja, sekä yhden 30 immobilisoitavan ryhmän sisältäviä nukleosiditrifosfaatteja. Myös tässä tapauksessa aluke voi sisältää lisäksi osoitettavan ryhmän.
Suoritusmuoto, jossa käytetään useampia kuin yhden immobilisoitavan ryhmän sisältävää aluketta sekä yhden osoitettavan ryhmän sisältäviä nukleosiditrifosfaatteja.
6 102084
Lisäksi voidaan käyttää sellaisia nukleosiditrifosfaatteja, jotka sisältävät immobili-soitavan ryhmän.
Suoritusmuoto, jossa käytettävä aluke ei sisällä lainkaan immobilisoitavia eikä osoitettavia ryhmiä ja jossa käytetään yhden osoitettavan ryhmän sisältäviä mononuk-5 leosiditrifosfaatteja sekä yhden immobilisoitavan ryhmän sisältäviä mononukleosi-ditrifosfaatteja. Tämä tapaus on edullinen, koska nyt reaktio alukkeen muokkaamiseksi jää pois. Lisäksi sekä osoitettavien että immobilisoitavien mononukleotidien läsnäolo takaa sen, että muodostunut nukleiinihappo sisältää lukuisia immobilisoitavia ryhmiä ja vähintään yhden osoitettavan ryhmän. Tämän muunnoksen muuna 10 etuna on muodostuneiden nukleiinihappojen huomattavasti helpompi erottaminen reagoimatta jääneistä alukkeista.
Alukkeen jatkamiseen käyttökelpoisina entsyymeinä tulevat kysymykseen entsyymit, joilla on DNA:sta tai RNArsta riippuvaa DNA- tai RNA-polymeraasiaktiivi-suutta. Edullisia ovat lämpöstabiilit DNA-polymeraasit. Niitä ovat esimerkiksi Taq-15 DNA-polymeraasi tai E. coli DNA-polymeraasin Klenow-kappale.
Pidentämisreaktio päättyy yleensä edullisesti templaatti-nukleiinihapon 5’-päähän. Se voidaan kuitenkin toivottaessa päättää ennenaikaisesti käyttämällä pysäytysrea-gensseja, esimerkiksi pysäytysnukleotideja. Tarvittaessa muodostunut uusi nukleii-nihappokappale ligatoidaan lopuksi alukkeeseen esimerkiksi ligaasireaktiolla.
20 Aluketta pidennetään tällä entsyymikatalysoidulla reaktiolla, muokattuja ja muokkaamattomia mononukleosiditrifosfaatteja käyttäen, sellaisen nukleiinihappokappa-leen verran, joka sopii täydentäen yhteen vastaavan, templaatti-nukleiinihappoon kuuluvan vastaavan osan kanssa. Tämä uusi syntynyt nukleiinihappo sisältää kaksi tai useampia immobilisoinnin mahdollistavia ryhmiä sekä yhden tai useampia osoi-25 tettavia ryhmiä. Erittäin edulliseksi on osoittautunut se, että muodostuneen uuden nukleiinihapon yksi juoste sisältää kaksi tai useampia immobilisoinnin mahdollistavia ryhmiä. Tällaiset nukleiinihapot voidaan erityisesti immobilisoida tehokkaammin kuin ne, joissa on vain yksi tällainen ryhmä. Tämä helpottaa templaatti-nukleiinihapon lähtömäärän kvantitointia muodostuneiden uusien nukleiinihappojen täs-30 mällisen kvantitoinnin avulla.
Osoitettavien ryhmien lukumäärä jokaisessa muodostuneessa uudessa juosteessa on edullisesti suurempi kuin 1, ja erityisen edullista on se, että jokaisessa 15. - 30. nukleotidissä on osoitettava ryhmä.
7 102084
Keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan esimerkiksi valmistaa sellaisia nukleiinihappoja, joiden pituus on 100-8000 emäsparia (bp). Pituutta rajoittaa käytännöllisesti katsoen vain entsyymijäijestelmä, jota käytetään pidentämiseen.
Näiden monistettujen tuotteiden käytöstä riippuen polymeraasi voidaan poistaa esi-5 merkiksi fenolisoinnilla. Tämä ei ole välttämätöntä pelkässä Southemblot- tai Dot Blot -analyysissä eikä MTP:ssä.
Muodostuneet uudet nukleiinihapot erotetaan edullisesti kaksi- tai yksijuosteisina reagoimattomista mononukleosiditrifosfaateista ja alukkeista geelikromatografisesti, affiniteettimateriaalien avulla tai saostamalla. Tässä suhteessa erityisen edullinen on 10 se keksinnön mukainen menetelmä, jossa tullaan toimeen ilman immobilisoitavalla ryhmällä muokattua aluketta, koska tässä tapauksessa muodostuneiden uusien nukleiinihappojen erottaminen muokkaamattomista alukkeista on erityisen helppoa kiinteiden faasien, joihin immobilisoitava ryhmä sitoutuu, avulla.
Muodostuneet nukleiinihapot voidaan toivottaessa erottaa templaatti-nukleiiniha-15 posta esimerkiksi denaturoimalla kaksoisjuoste tai Replacement-reaktiolla (korvaus-reaktiolla). Nämä muodostuneet uudet nukleiinihapot voidaan alistaa muihin reaktioihin, niitä voidaan esimerkiksi pilkkoa restriktioentsyymeillä esimerkiksi julkaisun EP-A-0 300 796 mukaisesti. Niitä voidaan myös käyttää templaatti-nukleiini-happona nukleiinihappojen muodostamiseksi edellä kuvatussa, keksinnön mukai-20 sessa menetelmässä; nämä nukleiinihapot sopivat puolestaan tällöin vähintään osittain täydentävästi yhteen niiden kanssa ja ovat homologisia alkuperäisen temp-laatti-nukleiinihapon kanssa. Alukkeena täytyy tällöin käyttää templaatti-nukleiini-': hapolle komplementaarisen nukleotidiketjun sijasta sellaista aluketta, joka voi hyb- ridisoitua muodostuneeseen uuteen nukleiinihappoon. Muuten alukkeen on täytet-25 tävä edellä kuvatut vaaatimukset. Koska myöskin alkuperäistä templaatti-nukleiini-happoa voidaan jälleen käyttää matriisina uuden nukleiinihapon muodostamiseksi, niin kysymyksessä on näiden kummankin muodostuneen uuden nukleiinihappo-juosteen lähes eksponentiaalinen lisääntyminen, kun kumpaakin nukleiinihappoa :· käytetään keksinnön mukaisella tavalla. Tämä voi tapahtua erillisissä lämpötila- 30 ja/tai reagenssijaksoissa, mutta myöskin homogeenisesti. Periaatteessa reaktio voidaan pysäyttää mielivaltaisella ajanhetkellä lisäämällä pysäytysreagenssia (esimerkiksi EDTA:ta). Lisäksi keksinnön mukaista menetelmää voidaan muuntaa siten, että analogisesti julkaisussa EP-A-0 201 184 kuvatulla tavalla jonkin ajan kuluttua voidaan käyttää niin kutsuttua "sisäkkäistä" (nested) aluketta. Tästä ajanhetkestä 35 lähtien enää vain osa tähän saakka valmistetusta uudesta nukleiinihappoketjusta monistuu.
8 102084
Menetelmät voidaan toteuttaa myös siten, että ketjun muodostamiseen käytettävissä olevaa immobilisoinnin mahdollistavan nukleosiditrifosfaatin määrää rajoitetaan viimeisissä reaktiojaksoissa. Tämän etuna on se, että ketjuun liittymättömät bio-nukleotidit kuluvat suureksi osaksi reaktiossa, joten ne eivät voi enää kilpailla bio-5 logisesti merkittyjen monistustuotteiden kanssa SA-sitoutumiskohdista. Tällöin ketjuun liittymättömien nukleotidien ensin toteutettava erotus (pylväällä tai saostuksella) ei ole enää välttämätöntä.
Keksinnön mukaisessa menetelmässä templaatti-nukleiinihappona voidaan myös käyttää nukleiinihappoja tai niiden kappaleita, joita on saatu nukleiinihappojen mo-10 nistusreaktioista esimerkiksi patenttijulkaisuissa EP-A-0 310 229, EP-A-0 300 796, WO-88/10315, EP-A-0 201 184, EP-A-0 329 822, EP-A-0 272 098 tai EP-A-0 303 155 kuvatulla tavalla. Näissä tapauksissa voidaan valmistaa suuria määriä keksinnön mukaisesti muokattuja nukleiinihappoja jopa siten, että pidentämisreaktio toteutetaan vain yhden kerran keksinnön kohteena olevan menetelmän mukaisesti.
15 Menetelmän eräänä erityisen edullisena suoritusmuotona on menetelmän toteuttaminen julkaisun EP-A-0201184 mukaisesti käyttämällä kahta eri tavoin merkittyä mononukleosiditrifosfaattia, esimerkiksi biotiini-16-dUTP:ia [immobilisoitava, Leary et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 4045-49 (1983)] sekä digoksigeniini-11-dUTP:ia (osoitettava).
20 Tällöin erityisen tarkoituksenmukaisiksi koeolosuhteiksi ovat osoittautuneet:
Reaktion tilavuus: 50-100 μΐ; merkityn alukkeen pitoisuus: 200 nM - 1 μΜ; dNTP-,, lajien kokonaispitoisuus: 100-300 μΜ; Taq-DNA-polymeraasi: 1-3 U tai jokin muu lämpöstabiilipolymeraasi; puskuri: 30-100 mM KC1; 5-20 nM Tris, pH 8,2-8,7 huoneen lämpötilassa; 0,5-2 mM MgC^; mahdollisina stabilisaattoreina gelatiini tai 25 nukleaasia sisältämätön BSA (naudan seerumin albumiini); PCR-jaksot: 20-60, edullisesti 20-30; denaturointi: ennen käynnistystä 2-10', 92-95 °C (valinnainen; kun kysymyksessä on erittäin monimutkainen DNA), PCR:n aikana 1-5', 92-95 °C; ; alukkeen hybridisointi 1-5', 35-55 °C, jatkaminen 1-10', 65-75 °C, edullisesti 3'.
* Ketjuun liittymättömien dNTP-lajien ja alukemolekyylien erotus muodostuneista
30 nukleiinihapoista PCR:n päätyttyä: Sephadex G 75 tai G 100 (Pharmacia) tai Strept-avidiini-kiintofaasi (esimerkiksi julkaisun DE-A-38 17 716 mukaisesti). Muokatut dNTP-lajit voidaan lisätä 1. jaksosta lähtien, mutta ne voidaan myös lisätä vasta viimeisiin 3-5 jaksoon. Viimeksi mainittu menettelytapa on suositeltava bio-dUTP:n rajoitetun lisäyksen tapauksessa. Kummallekin erilliselle juosteelle spesifisen aluk-35 keen välinen määräsuhde edullisesti noin 1:1. Suhde dig-dUTP:bio-dUTP:dTTP
9 102084 alueella 3:3:1 -1:1:3, edullisesti alueella 1:1:2 - 1:1:1. Suhde dig-dUTP (esim. bio-dUTP):dTTP (muokattua aluketta käytettäessä): 3:1-1:3, edullisesti 1:2.
Edellä mainitut arvot ovat suuntaa antavia. Alan asiantuntijalle on selvää, milloin yksittäisissä tapauksissa voidaan käyttää myös näistä poikkeavia olosuhteita.
5 Oli yllättävää todeta, että keksinnössä kuvatulla tavalla voidaan valmistaa nukleiinihappoja, jotka voidaan immobilisoida odotettua paremmin, ja joiden etuna on se, että ne voidaan ilmaista kvantitatiivisesti yksinkertaisella tavalla.
Tätä etua voidaan käyttää erityisen hyvin hyväksi menetelmässä nukleiinihappojen osoittamiseksi. Niinpä keksinnön muuna kohteena on menetelmä nukleiinihappojen 10 osoittamiseksi muodostamalla vähintään osoitettavan nukleiinihapon juosteen osalle komplementaarinen juoste, sitomalla muodostunut nukleiinihappo kiinteään faasiin ja osoittamalla muodostunut nukleiinihappo, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että tämä komplementaarinen juoste muodostetaan hybridisoimalla vähintään yksi aluke templaatti-nukleiinihappoon ja pidentämällä entsymaattisesti tämä aluke temp-15 laatti-nukleiinihapolle olennaisesti komplementaariseksi nukleiinihappojuosteeksi erilaisten mononukleotidilajien kanssa toteutetulla reaktiolla käyttäen osoitettavaa nukleiinihappoa templaatti-nukleiinihappona, jolloin vähintään yksi mononukleoti-dilaji käsittää osoitettavan, biospesifisen ryhmän ja tämä sama mononukleotidilaji tai vähintään yksi toinen mononukleotidilaji käsittää immobilisoinnin mahdollista-20 van, biospesifisen ryhmän.
Tällöin keksinnön mukaisessa valmistusmenetelmässä templaatti-nukleiinihappona käytetään osoitettavaa nukleiinihappoa tai sen osaa, joka voi mahdollisesti olla esi-käsitelty, esimerkiksi monistettu edellä kuvatulla tavalla.
Tämän jälkeen menetelmän tuloksena muodostuneet nukleiinihappojuosteet voidaan 25 osoittaa hyvin yksinkertaisella tavalla. Tätä tarkoitusta varten kaksoisjuosteet voidaan toivottaessa pilkkoa yksinkertaisiksi juosteiksi. Muodostuneet, kaksinkertaisesti muokkautuneet nukleiinihapot voidaan osoittaa esimerkiksi geelikromatografi-: sesti. Ne saatetaan kuitenkin edullisesti kosketukseen sopivan kiinteän faasin kanssa ja immobilisoidaan siihen.
30 Kiinteän faasin tyyppi riippuu immobilisoinnin mahdollistavasta ryhmästä. Mikäli immobilisoitava ryhmä on esimerkiksi hapteeni, niin tällöin voidaan käyttää kiinteätä faasia, jonka pinnalla on tätä hapteenia vastaan vaikuttavia vasta-aineita. Jos immobilisoitava ryhmä on vitamiini, esimerkiksi biotiini, niin tällöin kiinteä faasi voi sisältää sitovia proteiineja kuten avidiinia tai streptavidiinia siihen immobilisoituna.
10 102084
Erityisen edullista on immobilisoiminen muokatussa nukleiinihapossa läsnäolevan ryhmän välityksellä, koska se voidaan toteuttaa miedoimmissa olosuhteissa kuin esimerkiksi hybridisointireaktiot.
Edullisella tavalla muodostuneiden nukleiinihappojen immobilisointia varten reak-5 tioseos, joka on saatu nukleiinihappojen valmistukseen käytetyn reaktion päättymisen jälkeen, laitetaan astiaan, jonka pinta kykenee reagoimaan immobilisoitavien ryhmien kanssa. Tämä astia voi olla esimerkiksi kyvetti tai mikrotiitterilevy. Mahdollista on kuitenkin myös se, että kiinteänä faasina käytetään huokoista materiaalia kuten membraania, kudosta tai kuitumattoa, jonka päälle reaktioseos kaadetaan. Salo moin niin kutsuttujen helmien (beads) käyttö on mahdollista.
Inkubointivaiheen aikana, immobilisointireaktion edetessä, nestemäinen faasi poistetaan tästä astiasta, huokoisesta materiaalista tai helmistä. Tämän jälkeen kiinteä faasi voidaan pestä sopivalla puskurilla, koska keksinnön mukainen nukleiinihappo sitoutuu erittäin lujasti kiinteään faasiin.
15 Kiinteään faasiin sitoutuneen muokatun nukleiinihapon määrä voidaan periaatteessa määrittää tunnetulla tavalla, toteutettavien vaiheiden riippuessa osoitettavan ryhmän luonteesta. Suoraan osoitettavien ryhmien, esimerkiksi fluoresenttileimojen tapauksessa leima-aineen määrä määritetään fluorimetrisesti. Mikäli osoitettava ryhmä on hapteeni, niin tällöin muokattu nukleiinihappo saatetaan edullisesti reagoimaan tätä 20 hapteenia vastustavan merkityn vasta-aineen kanssa analogisesti julkaisussa EP-A-0 324 474 kuvatulla tavalla. Merkitseminen on voitu toteuttaa esimerkiksi entsyymillä kuten β-galaktosidaasilla, alkalisella fosfataasilla tai peroksidaasilla. Entsyy-mimerkinnän tapauksessa nukleiinihapon määrä mitataan seuraamalla yleensä foto-metrisesti, kemoluminometrisesti tai fluorometrisesti entsyymin ja kromogeenisen, 25 kemoluminogeenisen tai fluorogeenisen substraatin välistä reaktiota.
Epäsuorasti osoitettavien ryhmien tapauksessa tarvittavat reagenssit (esimerkiksi hapteenia vastustava merkitty vasta-aine) voidaan lisätä reaktioseokseen jo ennen ; pesuvaihetta.
Nukleiinihapot voidaan osoittaa sekä kvalitatiivisesti että kvantitatiivisesti. Kvanti-30 tatiivisen määrityksen tapauksessa tarkoituksenmukaiseksi on osoittautunut vähintään yhden vertailumäärityksen toteuttaminen näytteellä, jonka nukleiinihappopi-toisuus tunnetaan. Myös kalibrointikäyrän laatiminen on mahdollista ja suositeltavaa.
11 102084
Keksinnön mukaista osoitusmenetelmää voidaan käyttää kaikilla patenttijulkaisussa EP-A-0 200 362 mainituilla aloilla. Menetelmää voidaan myös käyttää virus- ja bakteeridiagnostiikassa julkaisujen EP-A-0 229 701 ja EP-A-0 131 052 mukaisesti.
Keksinnön mukaisen osoitusmenetelmän eräs erityisen edullinen suoritusmuoto 5 käsittää valmistusmenetelmän erityisen edullisen suoritusmuodon sekä sen jälkeen muodostuneen uuden nukleiinihapon osoittamisen. Ilmaisemista ajatellen erityisen edullisiksi ovat osoittautuneet seuraavat olosuhteet: muodostuneiden nukleiinihappojen erotus streptavidiinipinnalle (DE-A-38 17 716): 1-4 tuntia 37 °C:ssa; pesu puskurilla; inkubointi liuoksen kanssa, joka sisältää digoksigeniinia vastustavaa, al-10 kalisella fosfataasilla merkittyä vasta-ainetta; pesu puskurilla; inkubointi 4-metyy-liumbelliferyylifosfaatin, 0,05-0,2 M, kanssa; mittaus fluoresenssimetrillä; vertaaminen kalibrointikäyrään.
Yksi- tai kaksijuosteisen nukleiinihapon, joka käsittää yhden tai useampia osoitettavia, biospesifisiä ryhmiä sekä kaksi tai useampia immobilisoinnin mahdollistavia, 15 biospesifisiä ryhmiä yhdessä nukleiinihappojuosteessa, etuna on esimerkiksi se, että se voidaan immobilisoida hyvin lujasti sopiviin kiinteisiin faaseihin. Se voidaan valmistaa keksinnön mukaisella tavalla käyttäen templaatti-nukleiinihappoa.
Keksinnön muina kohteina ovat reagenssipakkaukset, joiden avulla voidaan toteuttaa keksinnön mukainen menetelmä nukleiinihappojen osoittamiseksi. Eräs tällainen 20 reagenssipakkaus sisältää erillisissä astioissa: ensimmäisen mononukleosiditrifosfaatin, jossa on osoitettava, biospesifinen .. ryhmä; toisen mononukleosiditrifosfaatin, jossa on immobilisoinnin mahdollistava, biospesifinen ryhmä; sekä 25 - entsyymin, joka templaatti-nukleiinihappoa ja neljää mononukleotidiä käytet täessä kykenee muodostamaan templaatti-nukleiinihapolle komplementaarisen ; nukleiinihapon.
Lisäksi reagenssipakkaus sisältää edullisesti kaikki muutkin reagenssit, joita tarvitaan alukkeiden pidentämiseksi nukleiinihapoiksi, jotka ovat komplementaarisia 30 jollekin nukleiinihappojuosteelle. Näistä reagensseista voidaan mainita erityisesti vähintään yksi aluke, joka on spesifinen osoitettavalle nukleiinihapolle tai nukleiini-happolajille, sekä kaikki muut mononukleosiditrifosfaatit. Se voi lisäksi sisältää 12 102084 apuaineina sopivia, pH-arvoa puskuroivia aineita, denaturointiliuoksia ja pesuliuok-sia.
Se sisältää lisäksi edullisesti vertailuna yhden spesifisen nukleotidiketjun, joka voi hybiidisoitua alukkeen kanssa.
5 Reagenssipakkaus sisältää myös mahdollisesti ne reagenssit, joita tarvitaan osoitettavan ryhmän määrittämiseen. Esimerkiksi hapteeneja käytettäessä reagenssipakkaus sisältää edullisesti merkittyä vasta-ainetta erillisessä astiassa.
Kuvio 1 esittää tuloksia, jotka saatiin määritettäessä nukleiinihappoja keksinnön mukaisella menetelmällä. Näitä tuloksia voidaan myös käyttää kalibrointikäyränä.
10 Keksintöä havainnollistetaan edelleen seuraavilla esimerkeillä:
Esimerkki 1
Polymeraasiketjureaktio (Polymerase-chain-reaktion; PCR) kahta erilaista muokattua mononukleosiditrifosfaattia käyttäen PC-reaktiossa käytetään julkaisun EP-A-0 200 362 mukaisesti plasmidin 15 pSPT18neo [templaattinukleiinihappo, valmistettu julkaisun Beck et ai., Gene, 19:327-336 (1982) mukaisesti] laimennoksia 10 ng - 100 ag. pSPT18neo sisältää neomysiini(neo)-geenin ketjun pSPT 18:n Smal-Baml-kohdassa sijaitsevassa 940 emäsparin Smal-Bgll-kappaleessa. Näissä plasmidilaimennoksissa läsnäoleva, spesifisesti monistettu kappale vastaa siis alueella 2,3 ng - 23 ag olevia määriä. Reaktio 20 käynnistetään tässä plasmidissa neo-ketjuun rajoittuville T7- ja SP6-promoottoreille spesifisillä alukkeilla (Boehringer Mannheim, tilausno. 1175122 ja 902152). 50 μ1:η tilavuudessa, sisältäen 50 mM KC1; 10 mM Tris HC1, pH 8,5; 1,5 mM MgCl2; 100 pg/ml gelatiinia; 200 μΜ dATP; 200 μΜ dCTP; 200 μΜ dGTP; 100 μΜ dTTP; 50 μΜ digoksigeniini-1 l-2'-deoksiuridiini-5'-dUTP (Dig-ll-dUTP, EP-A-0 324 474); 25 50 μΜ biotiini-16-2'-deoksiuridiini-5'-trifosfaatti (Bio-16-dUTP, Boehringer Mann- heim GmbH, tilausno. 1093070) toteutetaan 30 PCR-jaksoa käyttäen 300 nM T7-promoottorille spesifistä aluketta sekä 300 nM SP6-promoottorille spesifistä aluket-ta; mainittuja pSPT18neo-laimennoksia sekä 2,5 U Thermus aauaticus (Taq)-DNA-polymeraasia.
30 Jaksot: Denaturointi: 2' 92 °C
Alukkeen hybridisointi: 2' 42 °C Jatkaminen: 2' 75 °C.
13 102084 PCR toteutetaan Thermocycler-laitteessa (DNA-Thermal Cycler Perkin Elmer Cetus). Reaktiotilavuudet on peitetty 30 piillä parafiinia haihtumisen estämiseksi.
PC-reaktion jälkeen PCR-tuotteisiin lisätään 5 μΐ 4 M LiCl-liuosta ja saostetaan 250 piillä etanolia 30 ' ajan -70 °C:ssa, kasautetaan nopeudella 15000g 5 pestään kah-5 desti 70 % etanolilla, kuivataan, lisätään 50 pliaan Tris-puskuria, pH 7,5, 10 mM ja pipetoidaan streptavidiinilla pinnoitetulle mikrotiitterilevylle. Biotiini-digoksigenii-nilla merkityt molekyylit sidotaan kiinteään streptavidiinifaasiin 37 °C:ssa 2 tunnin aikana. Reaktion, jolla molekyylit sidotaan levyn seinämään, toteuttamisen jälkeen pestään 2x SSC-liuoksella 3x 10' 37 °C:ssa ja sitten konjugaattipuskurilla (Tris-HCl, 10 pH 7,5, 100 mM; NaCl 0,9 %; BSA 1 %; Pluronic T68, 0,5 %) kertaalleen 10’ 37 °C:ssa. Sitten inkuboidaan 40 U <digoksigeniini>-alkalinen fosfataasi-kon-jugaatin kanssa 30'37 °C:ssa, minkä jälkeen pestään 5x kulloinkin 200 piillä Tris-HCl-puskuria, 100 mM; ja NaCl-liuosta, 150 mM. Lopuksi inkuboidaan 30 ' 37 °C:ssa 4-metyyliumbelliferyyli-fosfaatin (0,1 mM) kanssa ja mitataan Dynatech 15 Microfluor-Reader-laitteella.
Kuviossa 1 on esitetty kulloinkin monistetun seoksen 1/5 ilmaiseminen streptavi-diiniputkesta. Tässä kuviossa fluoresenssisignaali on esitetty templaatti-nukleiini-hapon pitoisuuden funktiona. Alueella 100-500 fg olevat signaalit voidaan mitata vaikeuksitta.
20 Esimerkki 2 PCR moninkertaisesti muokattuja alukkeita käyttäen PCR toteutetaan käyttäen samaa kohdetta samoina pitoisuuksina kuin esimerkissä I. Tässä PC-reaktiossa toteutetaan 30 jaksoa seuraavassa ympäristössä: KC1, 50 mM; Tris-HCl, pH 8,5, 10 mM; MgCl2, 1,5 mM; gelatiini 100 pg/ml; dATP, 200 pM; 25 dCTP, 200 pM; dGTP, 200 pM; dTTP, 133 pM; dig-ll-dUTP, 66 pM; käyttäen T7-promoottorille spesifisiä alukkeita, jotka on merkitty 5'-(amidokaproyyli)bio-tiinilla N-(3-(N',N'-di-isopropyyliaminometoksifosfinyylioksi)heksyyli)-2,2,2-tri-; . fluoriasetamidin (Aminolink 2 yhtiöstä Applied Biosystems, USA) välityksellä jul
kaisun EP-A-0 261 283 mukaisesti, 300 nM; sekä SP6-promoottorille spesifistä alu-30 kettä, joka on merkitty 5'-(amidokaproyyli)-biotiinilla Aminolink 2:n välityksellä, 300 nM; käyttäen esimerkissä esitettyjä pSPT18 neo-laimennoksia ja 2,5 U Taq-DNA-poIymeraasia sekä samanlaisia jaksoprofiileja. PCRin jälkeen reaktiotilavuus täytetään Tris-puskurilla, pH 8,5, 10 mM; 300 piiksi, sentrifugoidaan Sephadex G75-pylväässä nopeudella 2000 kierr./min. 5' ja eluaatti saostetaan 30 piillä 4 M
14 102084
LiCl-liuosta 750 ^:ssa etanolia 30 ' -70 °C:ssa, sentrifugoidaan ja suspendoidaan uudestaan esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Ilmaisureaktio <digoksigeniini>-alkalinen fosfataasi-konjugaatilla toteutetaan esimerkissä 1 kuvatulla tavalla.
Esimerkki 3 5 Moninkertaisesti biotiinilla merkittyjen nukleiinihappojen sitominen streptavidiiniin
Kerrostehybridisaatiokokeet toteutetaan käyttäen templaattina yhdistelmä-DNA-tek-niikalla saatua Hepatitis-B-virusta (HBV) (0, 1, 5, 10, 20, 40 ja 80 ng), osoittavana koettimena HBV-spesifistä, digoksigeniinilla merkittyä oligonukleotidia (40 nukleotidia, merkitseminen digoksigeniinilla toteutettu synteesin aikana digoksigeniini-10 molekyylillä) ja pidättävänä koettimena joko yksinkertaisesti biotiinilla merkittyä HBV-spesifistä oligonukleotidia (40 nukleotidia) tai ketjultaan samanlaista, moninkertaisesti biotiinilla merkittyä oligonukleotidia (8 biotiinimolekyyliä/oligonukleo-tidi). Templaatti-DNA:ta denaturoidaan 10 minuuttia 100 °C:ssa, minkä jälkeen se laitetaan heti jäihin. Kulloinkin 200 ng:aan pidättävää tai osoittavaa oligonukleotidia 15 hybridisoidaan seuraavassa ympäristössä: natriumfosfaatti, pH 6,8, 50 mM; 2x SSC (NaCl, 300 mM; Na3-sitraatti 30 mM); 5x Denhardtin liuos (0,1 % polyvinyyli-pyrrolidoni; 0,1 % naudan seerumin albumiinia; 0,1 % Ficoll 400) esitetty määrä yhdistelmä-DNA-tekniikalla saatua HBV-DNA:ta, kokonaistilavuuden ollessa 200 μΐ, streptavidiinilla pinnoitetussa putkessa 60 minuuttia 37 °C:ssa.
20 Sitten pestään 2x 10 min. 37 °C:ssa 200 pl:lla SSC, 2x/SDS, 0,2 % ja lx 0,9 % Na-OH:lla 10 min. 37 °C:ssa. Sitten inkuboidaan 30 min. <digoksigeniini>-piparjuuri-peroksidaasi-konjugaatin (200 μΐ; 150 U/ml) kanssa 37 °C:ssa ympäristössä: Tris-HCl-puskuri, pH 7,5, 100 mM; NaCl, 0,9 %; BSA, 1 %; Pluronic T68 0,5 % ja 5x pesu 0,9 % NaCl-liuoksella. Sitten inkuboidaan yhdessä 0,1 % 2,2-atsino-di-[3-25 etyylibentstiatsoliini-sulfonaatin (6)] (ABTS, BM No. 756407) kanssa 200 pl.ssa ABTS-puskuria (BM-No. 1112597) ja ekstinktio mitataan aallonpituudella 405 nm.
Taulukosta I nähdään, että mitattava ekstinktio (eli läsnäolevien streptavidiiniin si-; toutuneiden kerrostemolekyylien lukumäärä) on suurempi moninkertaisesti merkitty jä pidättäviä koettimia käytettäessä (muuten täysin samanlaisissa olosuhteissa). Tä-30 mä osoittaa sen, että moninkertaisesti biotiinilla merkittyjen molekyylien sitoutuminen on tehokkaampaa.
15 102084
Taulukko 1 HBV-templaatti Ekstinktio Ekstinktio ng Pidättävä oligokoetin Pidättävä oligokoetin _1 biotiiiumolekvvli 8 biotiinimolekvvliä 5 0 121 113 1 126 135 5 135 148 10 146 180 20 179 232 10 40 231 332 80 319 672
Claims (11)
1. Menetelmä nukleiinihappojen valmistamiseksi hybridisoimalla vähintään yksi aluke templaatti-nukleiinihappoon ja pidentämällä entsymaattisesti tämä aluke temp-laatti-nukleiinihapolle komplementaariseksi nukleiinihappojuosteeksi erilaisten mo- 5 nonukleotidilajien kanssa toteutetulla reaktiolla, tunnettu siitä, että vähintään yksi mononukleotidilaji käsittää osoitettavan, biospesifisen ryhmän ja tämä sama mono-nukleotidilaji tai vähintään yksi toinen mononukleotidilaji käsittää immobilisoinnin mahdollistavan, biospesifisen ryhmän.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että aluke käsittää 10 yhden tai useampia, immobilisoinnin mahdollistavia, biospesifisiä ryhmiä.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sekä valmistettua nukleiinihappoa että alkuperäistä templaatti-nukleiinihappoa käytetään templaatti-nukleiinihappoina lisänukleiinihappojen muodostamiseksi.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään vä- 15 hintään yhtä nukleosiditrifosfaattilajia, jossa biospesifisenä immobilisoitavana ryh mänä on biotiini.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään vähintään yhtä nukleosiditrifosfaattilajia, jossa biospesifisenä osoitettavana ryhmänä on digoksigeniini.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että aluke ei sisäl- • · lä osoitettavia tai immobilisoinnin mahdollistavia ryhmiä.
7. Menetelmä nukleiinihappojen osoittamiseksi muodostamalla vähintään osoitettavan nukleiinihapon juosteen osalle komplementaarinen juoste, sitomalla muodostunut nukleiinihappo kiinteään faasiin ja osoittamalla muodostunut nukleiinihap-25 po, tunnettu siitä, että tämä komplementaarinen juoste muodostetaan hybridisoimalla vähintään yksi aluke templaatti-nukleiinihappoon ja pidentämällä entsymaattisesti tämä aluke templaatti-nukleiinihapolle olennaisesti komplementaariseksi nukleiinihappojuosteeksi erilaisten mononukleotidilajien kanssa toteutetulla reaktiolla käyttäen osoitettavaa nukleiinihappoa templaatti-nukleiinihappona, jolloin vähintään 30 yksi mononukleotidilaji käsittää osoitettavan, biospesifisen ryhmän ja tämä sama mononukleotidilaji tai vähintään yksi toinen mono-nukleotidilaji käsittää immobili- • soinnin mahdollistavan, biospesifisen ryhmän. 102084
8. Reagenssi nukleiinihappojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se sisältää mononukleosiditrifosfaatin, jossa on osoitettava, biospesifmen ryhmä, sekä mono-nukleosiditrifosfaatin, jossa on immobilisoinnin mahdollistava, biospesifmen ryhmä.
9. Reagenssipakkaus nukleiinihappojen osoittamiseksi, tunnettu siitä, että se si-5 sältää erillisissä astioissa: ensimmäisen mononukleosiditrifosfaatin, jossa on osoitettava, biospesifmen ryhmä; toisen mononukleosiditrifosfaatin, jossa on immobilisoinnin mahdollistava, biospesifmen ryhmä; sekä 10. entsyymin, joka templaatti-nukleiinihappoa ja neljää mononukleotidiä käytet täessä kykenee muodostamaan templaatti-nukleiinihapolle komplementaarisen nukleiinihapon.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen reagenssipakkaus, tunnettu siitä, että se sisäl-15 tää lisäksi kontrollinukleiinihapon.
11. Menetelmä muokattujen nukleiinihappojen valmistamiseksi hybridisoimalla vähintään yksi aluke templaatti-nukleiinihappoon ja pidentämällä entsymaattisesti tämä aluke templaatti-nukleiinihapolle komplementaariseksi nukleiinihappojuos-teeksi erilaisten mononukleotidilajien kanssa toteutetulla reaktiolla, tunnettu siitä, 20 että biospesifisenä osoitettavana muokattuna mononukleosiditrifosfaattina käytetään dig-dUTP:tä, biospesifisenä, immobilisoitavana muokattuna mononukleosiditrifos-faattina bio-dUTP:tä ja muokkaamattomana mononukleosiditrifosfaattina dTTP:tä suhteessa 3:3:1 - 1:1:3, edullisesti 1:1:2- 1:1:1. 102084
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4001154 | 1990-01-17 | ||
DE4001154A DE4001154A1 (de) | 1990-01-17 | 1990-01-17 | Verfahren zur herstellung von modifizierten nukleinsaeuren |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI910238A0 FI910238A0 (fi) | 1991-01-16 |
FI910238A FI910238A (fi) | 1991-07-18 |
FI102084B1 FI102084B1 (fi) | 1998-10-15 |
FI102084B true FI102084B (fi) | 1998-10-15 |
Family
ID=6398219
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI910238A FI102084B (fi) | 1990-01-17 | 1991-01-16 | Menetelmä muokattujen nukleiinihappojen valmistamiseksi ja menetelmä n iiden osoittamiseksi sekä reagenssipakkaus |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5741637A (fi) |
EP (1) | EP0437774B1 (fi) |
JP (1) | JPH0714359B2 (fi) |
AT (1) | ATE149511T1 (fi) |
CA (1) | CA2034313A1 (fi) |
DE (2) | DE4001154A1 (fi) |
ES (1) | ES2100863T3 (fi) |
FI (1) | FI102084B (fi) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9122060D0 (en) * | 1991-10-17 | 1991-11-27 | Dynal As | Method of sequencing double stranded dna |
GB9207598D0 (en) * | 1992-04-03 | 1992-05-20 | Dynal As | Method of sequencing double stranded dna |
JPH06197798A (ja) * | 1992-08-28 | 1994-07-19 | Aisin Seiki Co Ltd | 蛍光基質によるdna塩基配列決定法 |
DE4301693A1 (de) * | 1993-01-22 | 1994-07-28 | Cytech Biomedical Inc | Verfahren zur Amplifikation und Verfahren zum Nachweis von Polynucleotidsequenzen an fester Phase |
US6037127A (en) * | 1994-03-31 | 2000-03-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for detection of non-denatured nucleic acid fragments |
US6027879A (en) * | 1995-08-09 | 2000-02-22 | The Regents Of The University Of California | Detection and isolation of nucleic acid sequences using a bifunctional hybridization probe |
DE19644302A1 (de) | 1995-11-28 | 1997-06-05 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum Nachweis von Telomerase-Aktivität |
DE19548680A1 (de) * | 1995-12-23 | 1997-06-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum quantitativen Nachweis von spezifischen Nukleinsäuresequenzen |
CA2297661A1 (en) * | 1997-07-22 | 1999-02-04 | Darwin Molecular Corp. | Amplification and other enzymatic reactions performed on nucleic acid arrays |
US6582936B1 (en) * | 1997-12-12 | 2003-06-24 | The Regents Of The University Of California | Methods for making nucleic acids |
US6893822B2 (en) | 2001-07-19 | 2005-05-17 | Nanogen Recognomics Gmbh | Enzymatic modification of a nucleic acid-synthetic binding unit conjugate |
Family Cites Families (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2422956A1 (fr) * | 1978-04-13 | 1979-11-09 | Pasteur Institut | Procede de detection et de caracterisation d'un acide nucleique ou d'une sequence de celui-ci, et reactif enzymatique pour la mise en oeuvre de ce procede |
US4358535A (en) * | 1980-12-08 | 1982-11-09 | Board Of Regents Of The University Of Washington | Specific DNA probes in diagnostic microbiology |
US4711955A (en) * | 1981-04-17 | 1987-12-08 | Yale University | Modified nucleotides and methods of preparing and using same |
CA1254525A (en) * | 1983-04-13 | 1989-05-23 | Christine L. Brakel | Kit for terminally chemically labeling dna |
CA1256005A (en) * | 1983-09-26 | 1989-06-20 | W. Peter Hansen | Sandwich hybridization method for nucleic acid detection |
US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
US4965188A (en) * | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
DK171161B1 (da) * | 1985-03-28 | 1996-07-08 | Hoffmann La Roche | Fremgangsmåde til påvisning af forekomst eller fravær af mindst én specifik nukleinsyresekvens i en prøve eller til skelnen mellem to forskellige nukleinsyresekvenser i denne prøve |
IL79112A (en) * | 1985-06-13 | 1992-01-15 | Abbott Lab | Method for the isolation of a nucleic acid sequence and kit for performing a hybridization assay |
US4851331A (en) * | 1986-05-16 | 1989-07-25 | Allied Corporation | Method and kit for polynucleotide assay including primer-dependant DNA polymerase |
CA1317535C (en) * | 1987-06-30 | 1993-05-11 | Nanibhushan Dattagupta | Assay of sequences using amplified genes |
FI80476C (fi) * | 1987-10-09 | 1990-06-11 | Orion Yhtymae Oy | Foerbaettrat hybridisationsfoerfarande, vid foerfarandet anvaent redskap och reagensfoerpackning. |
JPH0775560B2 (ja) * | 1987-12-25 | 1995-08-16 | 湧永製薬株式会社 | 検体中の目的核酸の検出法 |
DE3813278A1 (de) * | 1988-01-12 | 1989-07-20 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum nachweis von nukleinsaeuren |
WO1989009281A1 (en) * | 1988-03-25 | 1989-10-05 | Akzo N.V. | Method for amplifying and detecting nucleic acid in a test liquid |
NO165894C (no) * | 1988-05-24 | 1991-04-24 | Gunnar Paulsen | Analysemetode for gener. |
WO1990002205A1 (en) * | 1988-08-25 | 1990-03-08 | Angenics, Inc. | Detection of nucleic acid sequences using particle agglutination |
AU629845B2 (en) * | 1988-08-30 | 1992-10-15 | Abbott Laboratories | Detection and amplification of target nucleic acid sequences |
CA2002076A1 (en) * | 1988-11-21 | 1990-05-21 | Brent A. Burdick | Diagnostic kit and method using a solid phase capture means for detecting nucleic acids |
-
1990
- 1990-01-17 DE DE4001154A patent/DE4001154A1/de not_active Withdrawn
- 1990-12-19 ES ES90124754T patent/ES2100863T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-19 EP EP90124754A patent/EP0437774B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-19 DE DE59010662T patent/DE59010662D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-12-19 AT AT90124754T patent/ATE149511T1/de not_active IP Right Cessation
-
1991
- 1991-01-16 FI FI910238A patent/FI102084B/fi active IP Right Grant
- 1991-01-16 JP JP3015786A patent/JPH0714359B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-16 CA CA002034313A patent/CA2034313A1/en not_active Abandoned
-
1994
- 1994-06-06 US US08/254,422 patent/US5741637A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ES2100863T3 (es) | 1997-07-01 |
FI910238A0 (fi) | 1991-01-16 |
DE4001154A1 (de) | 1991-07-18 |
EP0437774B1 (de) | 1997-03-05 |
JPH0714359B2 (ja) | 1995-02-22 |
ATE149511T1 (de) | 1997-03-15 |
FI910238A (fi) | 1991-07-18 |
US5741637A (en) | 1998-04-21 |
JPH04211400A (ja) | 1992-08-03 |
FI102084B1 (fi) | 1998-10-15 |
CA2034313A1 (en) | 1991-07-18 |
EP0437774A1 (de) | 1991-07-24 |
DE59010662D1 (de) | 1997-04-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2846018B2 (ja) | 核酸配列の増幅および検出 | |
EP0792376B1 (en) | Continuous amplification reaction | |
JP3936798B2 (ja) | Rna標的配列の増幅方法 | |
US5112734A (en) | Target-dependent synthesis of an artificial gene for the synthesis of a replicatable rna | |
CA2135607C (en) | Chemical method for the analysis of dna sequences | |
EP1322782B1 (en) | Method of nucleic acid typing or sequencing | |
JP3045084B2 (ja) | 核酸増幅の蛍光偏光検出法 | |
JP2005511030A (ja) | 核酸の増幅方法 | |
JP2004520004A (ja) | 核酸配列のポリプライムド増幅 | |
JPH11506613A (ja) | 競合増幅を用いる核酸配列検出方法 | |
FI102084B (fi) | Menetelmä muokattujen nukleiinihappojen valmistamiseksi ja menetelmä n iiden osoittamiseksi sekä reagenssipakkaus | |
CA2078905A1 (en) | Process for the specific amplification of nucleic acid sequences | |
JP2001512301A (ja) | 核酸増幅のための内部陽性対照 | |
US6136535A (en) | Continuous amplification reaction | |
JP2644419B2 (ja) | 核酸の固定化 | |
US6066455A (en) | Method of detecting nucleic acids | |
EP1668158B1 (en) | Rna detection and quantitation | |
FI103808B (fi) | Menetelmä nukleiinihappojen herkkään osoittamiseen | |
US5753433A (en) | Method for the sensitive detection of nucleic acids | |
JP2022521772A (ja) | 核酸を検出するための係留酵素の使用 | |
EP0406280A1 (en) | Method for amplifying and detecting nucleic acid in a test liquid | |
JP3291555B2 (ja) | プローブライブラリーの製造方法、該製造方法により得られたプローブライブラリー、該プローブライブラリーから他のdnaまたはrnaとハイブリッドするプローブを精製する方法 | |
JPH0655159B2 (ja) | 核酸増幅の使用による細菌の検出方法 | |
Nicolas et al. | Phosphate Dehydrogenase by Bioluminescence |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
FG | Patent granted |
Owner name: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH |