JP2006055170A - バックグランドノイズの減少を伴う液相核酸サンドイッチアッセイ - Google Patents
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Abstract
液相ハイブリダイゼーションアッセイにおいて生じるバックグランドシグナルを、本質的に減少する新規の技術を提供すること。この技術は、目的の標的ポリヌクレオチドの存在下においてのみ生成される検出可能なシグナルを提供するように、非特異的ハイブリダイゼーションおよび非特異的結合の現象を排除するまたは有意に減少することを前提とする。新規アッセイを行うためのキットを提供すること。
【解決手段】
分析物を固体の支持体に結合する工程、分析物を標識する工程、および支持体上の標識の存在を検出する工程を包含する、液相サンドイッチハイブリダイゼーションの改良。
【選択図】なし
Description
本発明は、一般的に、核酸化学およびハイブリダイゼーションアッセイに関する。より詳細には、本発明は、液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおいて、主に非特異的ハイブリダイゼーションおよび/または非特異的結合に由来するバックグランドノイズを最小限に抑えることによって、より標的依存性のシグナルを生成する方法に関する。
核酸ハイブリダイゼーションアッセイは、一般的に、遺伝学的研究、生化学的研究および臨床診断に使用される。基礎的な核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、一本鎖分析物の核酸は標識一本鎖核酸プローブとハイブリダイズし、そして得られた標識二本鎖が検出される。この基本的構成の改変が開発され、精度が高められ、異質物質から検出しようとする二本鎖の分離が容易になり、および/または検出されるシグナルが増幅されている。
、分析物の核酸に特異的にハイブリダイズする第1のセグメントまたは分析物に結合した核酸の鎖を含むように構築されるヌクレオチド、および標識プローブに特異的にハイブリダイズする多様な第2のセグメントの使用により増幅される。増殖の程度は、理論上、第2のセグメントの反復数に比例する。マルチマーは、直鎖状または分枝状のどちらかであり得る。分枝状マルチマーはフォークまたは櫛の形状であり得、櫛型のマルチマーが好ましい。
、他方は半リボザイム(half-ribozyme))のハイブリダイゼーションを包含し、それぞれRNA標的に存在する配列に相補的である。従って、形成されるリボザイムは、特異的にMDVプローブの末尾を切断し、MDVプローブを支持体から放出し、そしてその複製を増強する。
さらに、ハイブリダイゼーションアッセイにおける特異性を増大するための第3のアプローチは、Distefanoら、J.AmChem.Soc. (1992) 114:11006-11007に記載されている。この
方法は、三重へリックスDNAの二つの短い領域の安定性を増強するために二重へリックス
構造の短い領域の使用を包含する。
ンアッセイについて記載している。
サンプル中の核酸分析物を検出するための方法およびキットが提供される。一般的に、本方法は分析物を固体の支持体に結合する工程、分析物を標識する工程、および支持体上の標識の存在を検出する工程を包含する液相サンドイッチハイブリダイゼーションの改良を示す。好ましい方法は、分析物−プローブ複合体のより有意な標識の結合を可能にする増幅マルチマーの使用を包含し、アッセイの感度および特異性を増強する。
分子との間で形成されるそれぞれの2成分複合体の融解温度Tm2よりも有意に高い。この
局面では、アッセイは、分析物分子が捕獲プローブに結合する、好ましい構造のハイブリッド複合体の条件で行われる。この技術は、複数成分複合体の安定性の増強を前提としており、相対的に2成分複合体は、より不安定である。分析物結合ハイブリッド複合体を容易にする好ましい方法は、Tm1とTm2との間の温度で1つまたはそれ以上のアッセイの工程を行うことを包含する。
米国特許第4,868,105号におけるように)または増幅マルチマーにより間接的に(米国特許
第5,124,246号におけるように)そのいずれかによって、分析物および標識プローブに結合する架橋プローブである。複数の標識伸長因子は、陽性シグナル(サンプル中の分析物の
存在を示す)が生成されるように、分析物に結合しなくてはならない。
プローブと個々の標識伸長分子との間で形成されるそれぞれの2成分複合体の融解温度Tm2よりも有意にに高い。この局面において、このアッセイは、分析物分子が増幅マルチマ
ーまたは標識プローブに結合する、好ましい構造のハイブリッド複合体の条件で行われる。この技術は、複数成分複合体の安定性の増強を前提としており、相対的には2成分複合体はそれ程安定ではない。分析物−増幅マルチマーハイブリッド複合体を容易にする好ましい方法は、Tm1とTm2との間の温度でアッセイの1つまたはそれ以上の工程を行うことを含む。
ド競合物が、捕獲プローブに結合するようにアッセイ内に組み込まれる(従って、固体支
持体上の非特異的ハイブリダイゼーションの可能性を抑える)、ここで、より短い捕獲プ
ローブが使用される(さらに、支持体上の非特異的ハイブリダイゼーションの可能性を抑
えるために)。オリゴヌクレオチド競合物も用いられ得、標識エクステンダー(extender)
と増幅マルチマーとの間の結合、または標識プローブと増幅マルチマーとの間の結合を阻害する。
が、大幅に増加し得る。
1. サンプル中の核酸分析物を検出するための液相におけるサンドイッチハイブリダ
イゼーションアッセイであって:(a)該分析物を直接的または間接的に固体支持体に結合
すること;(b)該分析物を標識すること;および(c)該分析物結合標識の存在を検出することを包含し、
改良点として、第1の捕獲エキステンダー分子および別の第2の捕獲エキステンダー分子をアッセイ内に組み込むことを包含し、該第1のおよび第2の捕獲エキステンダー分子が、それぞれ、該分析物中に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る分析物結合セグメント、および固体支持体に結合する捕獲プローブ内に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る支持体結合セグメントを含有するポリヌクレオチドを含み、
ここで、該第1の捕獲エキステンダー分子の該分析物結合セグメントが、該第2の捕獲エキステンダー分子の該分析物結合セグメントと区別され、さらにここで、2つの別の該捕獲エキステンダー分子が単一の捕獲プローブに結合し得るように、該捕獲プローブが、該第1の捕獲エキステンダー分子の該支持体結合セグメントにハイブリダイズし得る第1の捕獲エキステンダー結合配列と、該第2の捕獲エキステンダー分子の該支持体結合セグメントにハイブリダイズし得る第2の捕獲エキステンダー結合配列とを含む、アッセイ。
前記捕獲エキステンダー分子と、該核酸分析物との間で形成されるハイブリッド複合体の該捕獲プローブから解離する融解温度Tm1が、該捕獲プローブと捕獲エキステンダー分子
との間で形成されるハイブリッド複合体の融解温度Tm2よりも少なくとも約5℃高い、ア
ッセイ。
アッセイ。
、カオトロピックな塩濃度、塩濃度、pH(水素イオン濃度)、有機溶媒成分、および温度からなる群より選択される、少なくとも1つの工程のパラメーターを制御することによって制御される、アッセイ。
ョンアッセイであって:
(a)支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中の核酸配列にハイブリ
ダイズし得る第1のセグメントC-1および該捕獲プローブの核酸配列にハイブリダイズし
得る第2のセグメントC-2を有する捕獲エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列に
ハイブリダイズし得る第1のセグメントL-1および標識プローブシステムにハイブリダイ
ズし得る第2のセグメントL-2を有する標識エキステンダー分子と、L-2にハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じさせる核酸配列M-1を含
む標識プローブシステムとを提供すること;
(b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステンダー分
子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共にハイブリダイゼーション条件下で、該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合したハイブリッド複合体を形成すること;
(c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;
(d)次いで、ハイブリダイズする条件下で該支持体に結合したハイブリッド複合体と該
標識プローブシステムとを接触させて、標識され、支持体に結合したハイブリッド複合体を生成すること;および
(e)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および
(f)該標識された支持体に結合したハイブリッド複合体の標識の存在を検出すること;
を包含し、
ここで、該核酸分析物が、該捕獲プローブと、該捕獲エキステンダー分子と、該核酸分析物との間で形成される該ハイブリッド複合体の該捕獲プローブから解離する融解温度Tm1が、該捕獲プローブと捕獲エキステンダー分子との間で形成されるハイブリッド複合体
の融解温度Tm2よりも少なくとも約5℃高い、アッセイ。
得、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じさせる核酸配列L-3を含む
標識プローブを含有し、ここで、該アッセイの工程(d)は、以下の工程:
(d1)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合したハイブリッド複合体と該増幅マルチマーとを接触させて、支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を生成する工程;
(d2)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;および
(d3)次いで、ハイブリダイゼーション条件下で、該支持体に結合した第2のハイブリッド複合体と該標識プローブとを接触させ、標識され、支持体に結合したハイブリッド複合体を生成する工程;
を包含する、アッセイ。
ョンアッセイであって:
(a)支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中の核酸配列にハイブリ
ダイズし得る第1のセグメントC-1および該捕獲プローブの核酸配列にハイブリダイズし
得る第2のセグメントC-2を有する捕獲エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列に
ハイブリダイズし得る第1のセグメントL-1およびプリアンプリファイアープローブの核
酸配列P-1にハイブリダイズし得る第2のセグメントL-2を有する標識エキステンダー分子と、核酸配列P-1を有し、そして核酸配列P-2を介して多数の増幅マルチマーと結合し得るプリアンプリファイアープローブと、P-2、P-2にハイブリダイズし得る核酸配列M-1と標
識プローブにハイブリダイズし得る核酸配列M-2を含む多数の同一のオリゴヌクレオチド
サブユニットとを含む増幅マルチマーと、M-2にハイブリダイズし得、そして直接的また
は間接的に、検出可能なシグナルを生じさせる配列L-3を含む標識プローブとを提供する
こと;
(b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステンダー分
子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリダイゼーション条件下で該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合した第1のハイブリッド複合体を形成すること;
(c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;
(d)次いで、ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合した第1のハイブリッド
複合体と該プリアンプリファイアープローブおよび該増幅マルチマーとを接触させて、支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を生成すること;
(e)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;
(f)ハイブリダイゼーション条件下で、該支持体に結合した第2のハイブリッド複合体
と該標識プローブとを接触させて、標識され、支持体に結合した第3のハイブリッド複合体を生成すること;
(g) 次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および
(h)該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体の標識の存在を検出すること;を包
含し、
ここで、該核酸分析物が、該捕獲プローブと、該捕獲エキステンダー分子と、該核酸分析物との間で形成される該ハイブリッド複合体の該捕獲プローブから解離する融解温度Tm1が、該捕獲プローブと捕獲エキステンダー分子との間で形成されるハイブリッド複合体
の融解温度Tm2よりも少なくとも約5℃高い、アッセイ。
、アッセイ。
濃度、カオトロピックな塩濃度、塩濃度、pH(水素イオン濃度)、有機溶媒成分、および温度からなる群より選択される、少なくとも1つの工程のパラメーターを制御することによって制御される、アッセイ。
ションアッセイであって:
(a)支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中に存在する核酸配列に
ハイブリダイズし得る分析物結合セグメントおよび該捕獲プローブ内に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る支持体結合セグメントを含むポリヌクレオチドを含有する第1の捕獲エキステンダー分子と、該分析物中に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る分解物結合セグメントおよび該捕獲プローブ内に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る支持体結合セグメントを含むポリヌクレオチドを含有する別の第2の捕獲エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL-1および第2の
セグメントL-2を有する標識エキステンダー分子と、L-2にハイブリダイズし得る核酸配列M-1および核酸配列M-2を含む多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する増幅マルチマーと、M-2にハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、検出可能な
シグナルを生じさせる配列L-3を含む標識プローブとを提供すること;
(b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステンダー分
子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリダイゼーション条件下で該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合した第1のハイブリッド複合体を形成すること;
(c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;
(d)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合した第1のハイブリッド複合体を
該増幅マルチマーとを接触させて、支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を生成すること;
(e)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;
(f)ハイブリダイズする条件下で、該支持体に結合した第2のハイブリッド複合体と該
標識プローブとを接触させて、標識され、支持体に結合した第3のハイブリッド複合体を生成すること;および
(g)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および
(h)支持体に結合した第3のハイブリッド複合体の標識の存在を検出すること;を包含
し、
ここで、第1のおよび第2の捕獲エキステンダー分子の両方が該分析物に結合している場合にのみ、工程(b)の該支持体に結合した第2のハイブリッド複合体が形成するように
、該捕獲エキステンダー分子が設計される、アッセイ。
ションアッセイであって:
(a)固体支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中に存在する核酸配
列にハイブリダイズし得る分析物結合セグメントおよび該捕獲プローブ内に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る支持体結合セグメントを含むポリヌクレオチドを含有する第1の捕獲エキステンダー分子と、該分析物中に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る分解物結合セグメントおよび該捕獲プローブ内に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る支持体結合セグメントを含むポリヌクレオチドを含有する別の第2の捕獲エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL-1およびプ
リアンプリファイアープローブ中の核酸配列P-1にハイブリダイズし得る第2のセグメン
トL-2を有する標的エキステンダー分子と、核酸配列P-1を有し、そして核酸配列P-2を介
して多数の増幅マルチマーに結合し得るプリアンプリファイアープローブと、P-2にハイ
ブリダイズし得る核酸配列M-1および標識プローブにハイブリダイズし得る核酸配列M-2を含む多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する増幅マルチマーと、M-2に
ハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じさせる配列L-3を含む標識プローブとを提供すること;
(b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステンダー分
子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリダイゼーション条件下で、該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合した第1のハイブリッドの複合体を形成すること;
(c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;
(d)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合した第1のハイブリッド複合体と
該プリアンプリファイアープローブおよび該増幅マルチマーとを接触させて、支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を生成すること;
(e)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;
(f)ハイブリダイズする条件下で、該支持体に結合した第2のハイブリッド複合体と該
標識プローブとを接触させて、標識され、支持体に結合した第3のハイブリッド複合体を生成すること;および
(g)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および
(h)支持体に結合した第3のハイブリッド複合体の標識の存在を検出すること;を包含
し、
ここで、第1のおよび第2の捕獲エキステンダー分子の両方が該分析物に結合している場合にのみ、工程(b)の該支持体に結合した第1のハイブリッド複合体が形成するように
、該捕獲エキステンダー分子が設計される、アッセイ。
エキステンダー分子の前記支持体結合セグメントにハイブリダイズし得る第1の捕獲エキステンダー結合配列と、前記第2の捕獲エキステンダー分子の該支持体結合セグメントにハイブリダイズし得る第2の捕獲エキステンダー結合配列とを含有し、そのような2つの捕獲エキステンダー分子が単一の捕獲プローブに結合し得る、アッセイ。
ステンダー分子の前記支持体結合セグメントにハイブリダイズし得る第1の捕獲エキステンダー結合配列と、前記第2の捕獲エキステンダー分子の該支持体結合セグメントにハイブリダイズし得る第2の捕獲エキステンダー結合配列とを含有し、そのような2つの捕獲エキステンダー分子が単一の捕獲プローブに結合し得るアッセイ。
イゼーションアッセイであって:
(a)支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中の核酸配列にハイブリ
ダイズし得る分析物結合セグメントおよび該捕獲プローブ内に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る支持体結合セグメントを含有するポリヌクレオチドを含む捕獲エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントおよび標識プローブシステムにハイブリダイズし得る第2のセグメントを有する第1の標識エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントおよび標識プローブシステムにハイブリダイズし得る第2のセグメントを有する別の第2の標識エキステンダー分子と、該第1の標識エキステンダー分子および該第2の標識エキステンダー分子の該第2のセグメントにハイブリダイズし得る核酸配列を含む標識プローブシステムを提供し、そしてこのプローブシステムが直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じること;
(b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステンダー分
子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリダイゼーション条件下で、該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合したハイブリッド複合体を形成すること;
(c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;
(d)次いで、ハイブリダイズする条件下で該支持体に結合したハイブリッド複合体と標
識プローブシステムとを接触させて、標識され、支持体に結合したハイブリッド複合体を生成すること;および
(e)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および
(f)該標識され、支持体に結合したハイブリッド複合体の標識の存在を検出すること;
を包含し
ここで、第1のおよび第2の標識エキステンダー分子の両方が該分析物に結合した場合にのみ、工程(d)の該標識され、該支持体に結合したハイブリッド複合体を形成するよう
に、該捕獲エキステンダー分子が設計される、アッセイ。
サブユニット、および(ii)M-2にハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、検
出可能なシグナルを生じさせる核酸配列L-3を含有する標識プローブを含み、そしてここ
で、該アッセイの工程(d)は、以下の工程:
(d1)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合したハイブリッド複合体と、該増幅マルチマーとを接触させて、第2の支持体に結合したハイブリッド複合体を生成する工程;
(d2)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;および
(d3)次いで、ハイブリダイゼーション条件下で、第2の該支持体に結合したハイブリッド複合体と、該標識プローブとを接触させて、標識され、支持体に結合したハイブリッド複合体を生成する工程;
を包含する、アッセイ。
イゼーションアッセイであって:
(a)支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中に存在する核酸配列に
ハイブリダイズし得る分析物結合セグメントおよび該捕獲プローブ内に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る支持体結合セグメントを含有するポリヌクレオチドを含む捕獲エキステンダー分子と、分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメント、およびプリアンプリファイアープローブにハイブリダイズし得る第2のセグメント(順番に
多数の増幅マルチマーと結合し得る)を有する第1の標識エキステンダー分子と、該分析
物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントおよびプリアンプリファイアープローブにハイブリダイズし得る第2のセグメント(順番に多数の増幅マルチマーに結合
しる)を有する別の第2の標識エキステンダー分子と、該標識エキステンダー分子にハイ
ブリダイズし得る核酸配列M-1を含有し、そして核酸配列M-2を含有する多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する増幅マルチマーと、M-2にハイブリダイズし得る
配列を含有し、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じさせる標識プローブとを提供すること;
(b)該支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステンダー分子、
標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリダイズ条件下で該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合した第1のハイブリッド複合体を形成すること;
(c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;
(d)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合した第1のハイブリッド複合体と
、該プリアンプリファイアープローブおよび該増幅マルチマーとを接触させて、支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を生成すること;
(e)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;
(f)ハイブリダイズする条件下で、該支持体に結合した第2のハイブリッド複合体と該
標識プローブとを接触させ、標識され、支持体に結合した第3のハイブリッド複合体を生成すること;および
(g)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および
(h)該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体の標識の存在を検出すること;を包
含し、
ここで、第1のおよび第2の標識エキステンダー分子の両方が該分析物に結合している場合にのみ、工程(d)の支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を形成するように、
該標識エキステンダー分子が設計される、アッセイ。
ションアッセイであって:
(a)支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中の核酸配列にハイブリ
ダイズし得る第1のセグメントC-1および該捕獲プローブの核酸配列にハイブリダイズし
得る第2のセグメントC-2を有する捕獲エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列に
ハイブリダイズし得る第1のセグメントL-1および第1の増幅マルチマーにハイブリダイ
ズし得る第2のセグメントL-2を有する第1の標識エキステンダー分子と、該分析物中の
核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL-1aおよび第2の増幅マルチマーにハイブリダイズし得る第2のセグメントL-2aを有する第2の標識エキステンダー分子と、L-2にハイブリダイズし得る核酸配列M-1および標識プローブにハイブリダイズし得る核酸配列M-2を含有する多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する第1の増幅マ
ルチマーと、L-2aにハイブリダイズし得る核酸配列M-1aおよび標識プローブにハイブリダイズし得る核酸配列M-2aを含有する多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する第2の増幅マルチマーと、該増幅マルチマーにハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じさせる標識プローブとを提供すること;
(b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序にで連続して、該捕獲エキステンダー
分子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリダイズ条件下で該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合した第1のハイブリッド複合体を形成すること;
(c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;
(d)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合した第1のハイブリッド複合体と
、該増幅マルチマーとを接触させ、支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を生成すること;
(e)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;
(f)ハイブリダイズする条件下で、該支持体に結合した第2のハイブリッド複合体と標
識プローブとを接触させて、標識され、支持体に結合した第3のハイブリッド複合体を生成すること;
(g) 次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および
(h)該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体の標識の存在を検出すること;を包
含し、
ここで、標識プローブは、該第1の増幅マルチマーにハイブリダイズし得る第1の核酸セグメントと、および該第2の増幅マルチマーにハイブリダイズし得る第2の核酸セグメントを含有し、このような該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体は、該第1の増幅マルチマーおよび第2の増幅マルチマーが標識プローブを介して結合されない限り、形成されない、アッセイ。
ションアッセイであって:
(a)支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中の核酸配列にハイブリ
ダイズし得る第1のセグメントC-1および該捕獲プローブの核酸配列にハイブリダイズし
得る第2のセグメントC-2を有する捕獲エキステンダー分子と、分析物中の核酸配列にハ
イブリダイズし得る第1のセグメントL-1および第1の増幅マルチマーにハイブリダイズ
し得る第2のセグメントL-2を有する第1の標識エキステンダー分子と、該分析物中の核
酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL-1aおよび第2の増幅マルチマーにハイブリダイズし得る第2のセグメントL-2aを有する第2の標識エキステンダー分子と、L-2
にハイブリダイズし得る核酸配列M-1および第1の標識プローブセグメントにハイブリダ
イズし得る核酸配列M-2を含有する多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含有
する第1の増幅マルチマーと、L-2aにハイブリダイズし得る核酸配列M-1aおよび標識プローブセグメントにハイブリダイズし得る核酸配列M-2aを含有する多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する第2の増幅マルチマーと、該増幅マルチマーにハイブリダイズし得る第1のおよび第2の標識プローブセグメントとを提供し、そしてこれらのプローブが、増幅マルチマーの近傍に存在する場合、検出可能なシグナルを生じること;
(b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステンダー分
子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリダイゼーション条件下で該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合した第1のハイブリッド複合体を形成すること;
(c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;
(d)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合した第1のハイブリッド複合体と
該増幅マルチマーとを接触させて、支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を生成すること;
(e)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;
(f)ハイブリダイズする条件下で、該支持体に結合した第2のハイブリッド複合体と、
該標識プローブとを接触させて、標識され、支持体に結合した第3のハイブリッド複合体を生成すること;
(g) 次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および
(h)該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体における、該第1の標識プローブセ
グメントおよび第2の標識プローブセグメントとの間の相互作用により検出可能なシグナルの存在を認めること;
を包含する、アッセイ。
第1の酵素フラグメントを含み、そして前記第2の標識プローブセグメントが第2の酵素フラグメントを含み、そしてここで、該第1のおよび第2の酵素フラグメントが、標的の存在を伴わない限り不活性な相補的酵素フラグメントである、アッセイ。
酵素を含み、そして前記第2の標識プローブセグメントが該酵素の補因子を含み、そしてここで、該酵素および該補因子が、標的の存在を伴わない限り不活性である、アッセイ。
酵素を含み、そして前記第2の標識プローブセグメントが発光または蛍光活性化物質を含み、ここで該酵素が産物の形成を触媒し、そして該活性化物質が該産物の検出を増強する、アッセイ。
ダイゼーションアッセイであって:(a)該分析物を直接的または間接的に固体支持体に結
合した捕獲プローブに捕獲エキステンダー分子を介して結合すること;(b)該分析物を標
識すること;および(c)該支持体上で分析物結合標識の存在を検出することを包含し、
改良点として、該固体支持体に結合した捕獲プローブにハイブリダイズし得る核酸配列を含有する競合物オリゴヌクレオチドをアッセイ内に組み込むことを包含する、アッセイ。
イゼーションアッセイであって:
(a)支持体上の捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中の核酸配列にハイブリ
ダイズし得る第1のセグメントC-1および該捕獲プローブの核酸配列にハイブリダイズし
得る第2のセグメントC-2を有する捕獲エキステンダー分子と、該捕獲プローブにハイブ
リダイズし得る核酸配列を含有する競合物オリゴヌクレオチドと、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL-1および標識プローブシステムにハイブリダ
イズし得る第2のセグメントL-2を有する標識エキステンダー分子と、L-2にハイブリダイズし得る核酸配列M-1を含有し、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生
じる標識プローブシステムとを提供すること;
(b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステンダー分
子、競合物オリゴヌクレオチド、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリダイズ条件下で該核酸分析物をインキュベートして、(i)捕獲エキステンダー
、核酸分析物、および標識エキステンダーの第1のハイブリッド複合体、および(ii)競合物オリゴヌクレオチドと反応した被覆捕獲プローブを形成すること;
(c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;
(d)次いで、ハイブリダズする条件下で、該支持体に結合したハイブリッド複合体と該
標識プローブシステムとを接触させて、標識され、支持体に結合したハイブリッド複合体を生成すること;および
(e)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および
(f)該標識され、支持体に結合したハイブリッド複合体の標識の存在を検出すること;
を包含する、アッセイ。
配列M-2を含有する多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニット、および(ii)M-2にハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じる核酸配列L-3を含有する標識プローブを含み、ここで該アッセイの工程(d)は、以下の工程:
(d1)ハイブリダイゼーション条件下で前記支持体に結合したハイブリッド複合体と前記増幅マルチマーとを接触させて、第2の支持体に結合したハイブリッド複合体を生成する工程;
(d2)次いで、必要に応じて、前記固体支持体に結合しない物質を分離する工程;および
(d3)次いで、ハイブリドゼーション条件下で、該第2の支持体に結合したハイブリド複合体と、該標識プローブとを接触させて、標識され、支持体に結合したハイブリッド複合体を生成する工程;
を含む、アッセイ。
ションアッセイであって:
(a)支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中の核酸配列にハイブリ
ダイズし得る第1のセグメントC-1、および該捕獲プローブの核酸配列にハイブリダイズ
し得る第2のセグメントC-2を有する捕獲エキステンダー分子と、該捕獲分子にハイブリ
ダイズし得る少なくとも1つの核酸配列を含有する競合物オリゴヌクレオチドと、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL-1およびプリアンプリファイ
アープローブ中の核酸配列P-1にハイブリダイズし得る第2のセグメントL-2を有する標識エキステンダー分子と、該核酸配列P-1を有し、そして核酸配列P-2を介して多数の増幅マルチマーに結合し得るプリアンプリファイアープローブと、P-2にハイブリダイズし得る
核酸配列M-1および標識プローブにハイブリダイズし得る核酸配列M-2を含有する多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する増幅マルチマーと、M-2にハイブリダイ
ズし得る配列L-3を含有し、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じさ
せる標識プローブとを提供すること;
(b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該核酸分析物を、該捕獲
エキステンダー分子、競合物オリゴヌクレオチド、標識エキステンダー分子、および該捕
獲プローブと共に、ハイブリダイズ条件下でインキュベートして、(i)捕獲エキステンダ
ー、核酸分析物および標識エキステンダーの第1のハイブリッド複合体、および(ii)競合物オリゴヌクレオチドと反応した被覆捕獲プローブを形成すること;
(c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;
(d)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合した第1のハイブリッド複合体と
該プリアンプリファイアープローブおよび該増幅マルチマーとを接触させて、支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を生成すること;
(e)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;
(f)ハイブリダイズ条件下で、該支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を該標識
プローブと接触させて、標識され、支持体に結合した第3のハイブリッド複合体を生成すること;
(g) 次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および
(h)該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体の標識の存在を検出すること;
を包含する、アッセイ。
(a)支持体に結合する捕獲プローブを有する固体支持体;
(b)該捕獲プローブと、該核酸分析物の予め定められたセグメントとにハイブリダイズ
し得る第1の捕獲エキステンダー分子;
(c)該第1の捕獲エキステンダー分子が結合する該捕獲プローブおよび該セグメントと
は異なる該核酸分析物の該捕獲プローブおよびセグメントにハイブリダイズし得る別の第2の捕獲エキステンダー分子;
(d)該第1のおよび第2の捕獲エキステンダー分子が結合するセグメントとは異なる該
核酸分析物のセグメントにハイブリダイズし得る標識エキステンダー分子;
(e)該標識エキステンダー分子にハイブリダイズし得る核酸配列を含有し、そして、直
接的または間接的に、検出可能なシグナルを提供する、標識プローブシステムを含み、
ここで、該捕獲プローブが、該第1の捕獲エキステンダー分子にハイブリダイズし得る第1の捕獲エキステンダー結合配列と、該第2の捕獲エキステンダー分子にハイブリダイズし得る第2の捕獲エキステンダー結合配列とを有するプローブ;
を含む、キット。
(g)該同一なサブユニットにハイブリダイズすることが意図され、そして直接的または
間接的に、検出可能なシグナルを提供する標識プローブ;
を含む、キット。
(a)支持体に結合する捕獲プローブを有する固体支持体;
(b)該捕獲プローブと該核酸分析物の予め定められたセグメントとにハイブリダイズし
得る捕獲エキステンダー分子;
(c)該核酸分析物の予め定められたセグメントにハイブリダイズし得る第1の標識エキ
ステンダー分子;
(d)該第1の標識エキステンダー分子が結合するセグメントとは異なる該核酸分析物の
セグメントにハイブリダイズし得る第2の標識エキステンダー分子;
(e)該標識エキステンダー分子および多数の増幅マルチマーに結合し得る任意のプリア
ンプリファイアープローブ;
(f)該標識エキステンダー分子または該プリアンプリファイアープローブにハイブリダ
イズし得る核酸配列と、多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットとを含む増幅マル
チマー;および
(g)該同一なオリゴヌクレオチドサブユニットにハイブリダイズするように設計され、
そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを提供する標識プローブ;
を含む、キット。
(a)支持体に結合する捕獲プローブを有する固体支持体;
(b)該捕獲プローブと、該核酸分析物の予め定められたセグメントとにハイブリダイズ
し得る捕獲エキステンダー分子;
(c)該核酸分析物の予め定められたセグメントにハイブリダイズし得る第1の標識エキ
ステンダー分子;
(d)該第1の標識エキステンダー分子が結合するセグメントとは異なる該核酸分析物の
セグメントにハイブリダイズし得る第2の標識エキステンダー分子;
(e)(i)該第1の標識エキステンダー分子にハイブリダイズし得る核酸配列、および(ii)多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含む第1の増幅マルチマー;
(f)(i)該第2の標識エキステンダー分子にハイブリダイズし得る核酸配列、および(ii)多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含む第2の増幅マルチマー;および
(g)該第1の増幅マルチマーのオリゴヌクレオチドサブユニットにハイブリダイズし得
る第1の核酸配列と、該第2の増幅マルチマーのオリゴヌクレオチドサブユニットとハイブリダイズし得る第2の核酸配列を含有する標識プローブであって、該標識プローブは、直接的または間接的に、検出可能なシグナルを提供することを包含する、標識プローブ;を含む、キット。
(a)支持体に結合する捕獲プローブを有する固体支持体;
(b)該捕獲プローブと、該核酸分析物の予め定められたセグメントとにハイブリダイズ
し得る捕獲エキステンダー分子;
(c)該捕獲プローブにハイブリダイズし得る核酸配列を含む競合物オリゴヌクレオチド
;
(d)該捕獲エキステンダー分子が結合するセグメントとは異なる該核酸分析物のセグメ
ントにハイブリダイズし得る標識エキステンダー分子;
(e)該標識エキステンダー分子および多数の増幅マルチマーに結合し得る任意のプリア
ンプリファイアープローブ;
(f)該標識エキステンダー分子または該プリアンプリファイアープローブにハイブリダ
イズし得る核酸配列と、多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットとを含有する増幅マルチマー;および
(g)該同一なオリゴヌクレオチドサブユニットにハイブリダイズするように設計され、
そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを提供する標識プローブ;
を含む、キット。
(定義および術語:)
本発明を開示し、そして詳細に記載する前に、本発明が、特定のアッセイ形式、物質、または試薬に限定されず、そしてもちろん変化し得ることを理解すべきである。本明細書中で使用した用語は、特定の実施態様のみを記載することが目的であり、そして限定されることを意図しないということもまた理解すべきである。
本明細書中で使用したように、用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド
」は、ポリデオキシリボヌクレオチド(2-デオキシ-D-リボースを含有する)、ポリリボ
ヌクレオチド(D-リボースを含有する)、プリンまたはピリミジン塩基のN-グリコシドである任意の他のタイプのポリヌクレオチド、および非ヌクレオチド骨格(例えば、ペプチド核酸(PNA)およびAntivirals、Inc.(Corvallis、Oregon)からNeugeneTMポリマーとして
市販されている合成の配列特異的核酸ポリマー)または非標準的な結合(これによりDNA
およびRNAに見出されるような塩基の対合または塩基のスタッキング(stacking)が可能と
なる形状でヌクレオチドを含有するポリマーを提供する)を含有する他のポリマーを一般にいう。用語「ポリヌクレオチド」と「オリゴヌクレオチド」との間の長さの区別を意図せず、これらの用語は交換可能に使用される。これらの用語は、分子の一次構造のみに言及する。よって、これらの用語は、2本鎖および1本鎖のDNA、および2本鎖および1本
鎖のRNA、およびDNA:RNAハイブリッドを包含し、そしてまた公知のタイプの改変体(例えば、当該分野で公知の標識、メチル化、「キャップ」、1以上の天然に存在するヌクレオチドをアナログで置換)、ヌクレオチド内の改変体(例えば、非荷電結合(例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど)および荷電結合(例えば、ホスホロチオエート(phosphorothioate)、ホスホロジチオエート(phosphorodithioate)など)を有する改変体、ペンダント部分(moiety)(例えば、タンパク質(ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジンなどを包含する))
を含有する改変体、挿入物(例えば、アクリジン、ソラレンなど)を有する改変体、キレート剤(例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化力のある金属など)を含有する改変体、アルキル化剤を含有する改変体、改変した結合を有する改変体(例えば、α−アノマー核酸など)、およびポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの改変しない形態を包含する。
りハイブリダイゼーション解析のために調製され得る。用語「ポリヌクレオチド分析物」は、本明細書中では用語「分析物」、「分析物核酸」、「標的」および「標的分子」と交換可能に使用される。
レオチドのループを無視して、安定なハイブリッドが形成される。従って、本明細書中で使用したように、用語「相補的な」は、アッセイ条件下でその「相補体」と安定な2重鎖を形成する(一般に約90%以上の相同性がある)オリゴヌクレオチドをいうことを意図する。
の範囲、そして最も代表的には約50である。マルチマーのオリゴヌクレオチドセグメントは、ホスホジエステル結合を通して、または挿入した結合物質(例えば、核酸、アミノ酸、炭水化物、またはポリオール架橋)を通して、または核酸鎖または改変核酸鎖を架橋することが可能な他の架橋物質を通してお互いに直接共有結合し得る。あるいは、マルチマーは、オリゴヌクレオチドセグメントから構成され得、これは、共有結合せず、他のいくつかの様式(例えば、ハイブリダイゼーションを通して)で結合している。このようなマルチマーは、例えば、Nilsenらの米国特許第5,175,270号に記載されている。結合部位は
、セグメントの末端(通常の3’-5’方向またはランダムな方向の)、および/または鎖
の1以上の内部のヌクレオチドであり得る。直鎖のマルチマーでは、個々のセグメントは、末端と末端が結合して直鎖状ポリマーを形成する。分枝マルチマーの1つのタイプでは、3以上のオリゴヌクレオチドセグメントが、起点から発して分枝状構造を形成する。起点は、別のヌクレオチドセグメント、または少なくとも3つのセグメントが共有結合し得るような多官能分子であり得る。別のタイプでは、1以上のペンダントオリゴヌクレオチドセグメントを有するオリゴヌクレオチドセグメント骨格が存在する。これらの後者のタイプのマルチマーは、「フォーク様」、「櫛様」、または「フォーク様」と「櫛様」との組み合わせの構造であり、ここでは、「櫛様」マルチマーは、本明細書において好ましいマルチマーであるが、骨格から伸びる多数の側鎖を伴なう直鎖状の骨格を有するポリヌクレオチドである。ペンダントセグメントは、通常、オリゴヌクレオチドが結合し得るか、さもなければ付着し得るに適切な官能基を有する、改変されたヌクレオチドまたは他の有機部分から垂れ下がり得る。マルチマーは、全体が直鎖状、全体が分枝状、または直鎖状の部分と分枝状の部分との組み合わせであり得る。代表的には、マルチマーには少なくとも2つの分枝点が、より好ましくは少なくとも3つの分枝点が、より好ましくは約5〜30の範囲の分枝点が存在するが、しかし、いくつかの実施態様ではより多数であり得る。マルチマーは、2本鎖配列からなる1以上のセグメントを包含し得る。マルチマー合成および特定のマルチマーの構造に関するさらなる情報は、同一出願人が所有するUrdeaらの米
国特許第5,124,246号に見出される。
組み合わせに好ましく、そしてこれは、直鎖状の骨格およびペンダント状側鎖で構成される;骨格は、分析物に結合する分析物核酸または核酸に特異的なハイブリダイゼーション部位を提供するセグメントを含み、一方、ペンダント状側鎖は標識されたプローブに特異的なハイブリダイゼーション部位を提供するセグメントの反復を含む。
得る:
カー分子であり、nは0または1であり、S”は、約0〜10ヌクレオチド、好ましくは5〜10ヌクレオチドの第2のスペーサーセグメントであり、Aは分析物核酸または分析物に結合した核酸に特異的にハイブリダイズし得るセグメントであり、S’’’は0〜10ヌクレオチドの第3のスペーサーセグメントであり、Eは5〜10ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド伸張部であり、そしてLは標識されたオリゴヌクレオチドプローブに特異的にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列の2〜10反復、好ましくは3〜6反復を含有するセグメントである。
のスペーサーセグメントであり、Rは切断可能なリンカー分子であり、nは0または1であり、S’’’は、0〜10分子の第3のスペーサーセグメントであり、Eは、5〜10ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド伸張部であり、そしてLは標識されたオリゴヌクレオチドプローブに特異的にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列の2〜10反復、好ましくは3〜6反復を含有するセグメントである。
リゴヌクレオチド合成化学および装置を使用して化学的に合成される。この点に関して、スペーサーセグメントSは、分枝部位を含有する分子の部分と固相の間に間隔を空けるのに役立つ(Sの3’末端は直接または間接的に固相の表面に結合する)。他の実施態様で
は、骨格全体およびLを含むペンダント状側鎖は、一体型の単位として合成され得る。
マルチマーの式Iでは、示したように、スペーサーセグメントS’は任意であり、そして所望する場合には、それぞれの分枝部位と先行/後続の隣接する分枝部位の間に、または一連の近接する分枝部位と隣接する一連の分枝部位との間に間隔を空けるために使用され得る。第2のスペーサーセグメントS”もまた、任意であり、そして(標識エキステンダーまたはプリアンプリファイアーのような1以上の中間分子を通して)分子の分枝部位と、分析物が最終的に結合するセグメントAとの間に間隔を空けるために用いられ得る。このように間隔を空けることは、分析物とマルチマーとの間の結合を改善することが見出された。同様に、第3のスペーサーセグメントS’’’も任意である。これは好ましくはポリTである。
い。これらは選択可能な切断部位を提供するので、大きな櫛型ポリヌクレオチドのサンプルは、解析または特徴付けの目的で切断され得る。この観点で、それぞれの側鎖に切断部位があり、そして分枝部位のすぐ5’側、または最も5’側(式Iのマルチマーについて
は)に、または側鎖が骨格に連結する場所(式IIのマルチマーについては)に切断部位があることが好ましい。ポリヌクレオチドに組み入れ得る、切断し得るリンカー分子の例は、欧州特許出願第883096976号で開示される。
培地、おそらくウイルスに感染した細胞、組換え細胞、および細胞構成物(component)を
包含するがそれに限定されない)もまた包含するが、それに限定されない。本方法の好ましい使用は、以下の核酸の検出および/または定量に使用される:(a)ウイルスの核酸、
例えば、B型肝炎ウイルス(「HBV」)、C型肝炎ウイルス(「HCV」)、D型肝炎ウイルス(
「HDV」)、ヒト免疫不全ウイルス(「HIV」)、およびヘルペス科のウイルス(帯状ヘルペ
ス(水痘)、単純ヘルペスIおよびII型ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、および最近単離されたヘルペスVI型ウイルスを包含する)由来のウイルス核酸、および(b)細菌の核酸、例えば、クラミジア、ミコバクテリウム属結核菌などの
細菌の核酸。
分析物ポリヌクレオチドおよびアンプリファイアーマルチマー(「AMP」)に相補的な領域
を含有する。プリアンプリファイアーを使用する場合(図では示さず)、標識エキステンダー分子は、アンプリファイアーマルチマーに直接よりもむしろこの中間種に結合する。プリアンプリファイアーおよびアンプリファイアーのどちらも使用しない場合、標識エキステンダー分子は、標識プローブ(「LP」)内の配列に直接結合する。従って、標識エキステンダー分子は、分析物ポリヌクレオチドの配列に相補的な第1の核酸配列L-1と、標識
プローブ、アンプリファイアーマルチマーまたはプリアンプリファイアーのセグメントM-1に相補的なマルチマー認識配列L-2とを有する第2の領域を有する1本鎖ポリヌクレオチド鎖である。
的である)を含む第1のポリヌクレオチド配列領域と、捕獲プローブ認識配列C-2を有す
る第2の非相補的領域とを有する1本鎖ポリヌクレオチド鎖である。配列C-1およびL-1は、それぞれが分析物の物理的に区別される配列に相補的である、同一でない、非相補的な配列である。
マルチマーは(上で説明したように)図に示したよりもずっと多数の反復オリゴヌクレオチドセグメント(これらはそれぞれ標識プローブに結合するように設計される)を含有することに留意されたい。
ブリダイゼーションアッセイの1例は、Urdeaらの米国特許第4,868,105号に記載されているハイブリダイゼーションアッセイであり、または好ましくは、図1に説明され、そして上記に記載した形態と共に用いられる上記のハイブリダイゼーションアッセイである。この方法は、次のようなハイブリッド複合体の設計および構築を前提とする。つまり捕獲プローブ−捕獲エキステンダー−分析物ハイブリッドにおいて捕獲プローブから分析物が解離する融解温度Tm1が、捕獲プローブ−捕獲エキステンダーハイブリッドにおいて捕獲プローブから捕獲エキステンダーが解離する融解温度Tm2よりも、少なくとも約5℃高い、好ましくは少なくとも約10℃高いようなハイブリッド複合体である。
とにより制御し得る。これらの変数は当業者に周知であり、そしてホルムアミド濃度、塩濃度、カオトロピックな塩濃度、pH(水素イオン濃度)、有機溶媒含量、および温度を包含する。「カオトロピックな塩」は、疎水結合破壊剤として作用する塩をいい、トリハロアセテート、イソチオシアネート、およびパークロレートを包含する。Hamaguchiら、J.Am.Chem.Soc.(1962) 84:1329-1338。好ましいストリンジェンシー制御は温度である:少なくとも1つのアッセイ工程は、Tm1とTm2との間の温度で、より好ましくは、この2つの温度のほぼ中間で行われる。ストリンジェンシーを用いる好ましい工程は、アッセイの最初のハイブリダイゼーション工程であり、ここで、標的は捕獲エキステンダー分子、および支持体に結合した捕獲プローブとともにインキュベートされる。従って、好ましい実施態様では、最初のハイブリダイゼーション工程は、Tm2よりも高いがTm1よりも低い温度で行われる。非特異的にハイブリダイズする分子は捕獲プローブおよび捕獲エキステンダー分子を通して結合し得る(図2、6、および7に説明のように)ので、この方法はあるタイプの非特異的ハイブリダイゼーションを十分に減少させる。
ヌクレオチド配列C-1、これは第1の捕獲エキステンダーCE1中のヌクレオチド配列C-3に
結合する;および(2)異なるヌクレオチド配列C-2、これは第2の捕獲エキステンダーCE2
中のヌクレオチド配列C-4に結合する。次いで、CE1およびCE2を、分析物分子の別個の、
重なりのないセグメントにハイブリダイズする。好ましくは、、配列C-1、C-2、C-3、お
よびC-4は、比較的短く、すなわち、長さが約30ヌクレオチド未満であり、そして好まし
くは長さが約10〜15ヌクレオチドの範囲である。C-1およびC-2は、直接隣接するかまたはスペーサー領域によって分けられ得る。さらに、捕獲プローブと捕獲エキステンダー分子との結合(すなわち、C-1:C-3およびC-2:C-4)は比較的弱く(Tmが約55℃より小さい)、
一方、捕獲エキステンダーを通しての捕獲プローブと標的との結合はずっと強い(Tmが約65℃より大きい)ことが望ましい。このことは、捕獲エキステンダー分子よりも標的分子が固体支持体と非常に大きい(100倍〜1000倍の桁で)安定性で結合することを可能にす
る。この方法はまた、より少ない捕獲プローブの使用を可能にし、これは次には図3、4、および5に説明したように非特異的ハイブリダイゼーションの可能性を減少させる。こ
のアッセイは、本明細書中の実験の章で、実施例1および2で例示される。
びC-4に相補的な同一の捕獲プローブ配列である場合、同等に働くこともまた、当業者に
認識される:この例では、捕獲プローブは2コピーの反復配列C-1を含有する。
ンダーを表し、それぞれの捕獲エキステンダーは、標的の別個のセグメントにハイブリダイズする別個の第1のヌクレオチド配列を含有する。CE3およびCE4は、第1の捕獲プローブCP1中のヌクレオチド配列C-5に結合する第2のヌクレオチド配列C-6を含有する;一方
、CE5は、第2の捕獲プローブCP2中のヌクレオチド配列C-7に結合する異なる第2のヌク
レオチド配列C-8を含有する。2以上のこのような捕獲エキステンダーの任意の組み合わせが、このアッセイに使用され得ることは、容易に理解される。
」および「LE2」は、2つの異なる標識エキステンダーを表し、それぞれのエキステンダ
ー分子は近位だが別個の標的セグメント、および単一増幅マルチマーの近位だが別個のセグメントにハイブリダイズするように十字様構造に位置する。このアッセイは、本明細書中の実験の章の実施例2で例示される。
のヌクレオチド配列C-1、これは第1の標識エキステンダーLE1中のヌクレオチド配列C-3
に結合する;および(2)異なるヌクレオチド配列C-2、これは第2の標識エキステンダーLE2中のヌクレオチド配列C-4に結合する。次いで、LE1およびLE2を、分析物分子の別個の、
重なりのないセグメントにハイブリダイズさせる。好ましくは、、配列C-1、C-2、C-3、
およびC-4は、比較的短く、すなわち、長さが約30ヌクレオチド未満であり、そして好ま
しくは長さが約10〜15ヌクレオチドの範囲である。C-1およびC-2は、直接隣接するかまたはスペーサー領域によって分けられ得る。さらに、増幅マルチマーと標識エキステンダー分子との結合(すなわち、C-1:C-3およびC-2:C-4)は比較的弱く(Tmが約45℃より小さい
)、一方、標識エキステンダー分子を通しての増幅マルチマーと標的との結合はずっと強い(Tmが約65℃より大きい)ことが望ましい。このことは、非常に大きい(100倍〜1000
倍の桁で)安定性で標識エキステンダー分子よりも標的分子が増幅マルチマーと結合することを可能にする。さらに、少なくとも2つの捕獲エキステンダー分子を使用する先の方法と同様に、アッセイの特異性は、標的依存性のシグナルを生じさせるために必要である追加のハイブリダイゼーション工程により増加する。
ことをプリアンプリファイアーとともに利用し得ること(以下に議論するように)がさらに認識される。ここで、標識エキステンダーは、直接増幅マルチマーとよりも十字構造でプリアンプリファイアーと相互作用する。
実施態様の例は、隣接の標識プローブが以下を含有する実施態様を包含する:(a)β−ガ
ラクトシダーゼのような酵素の個々のサブユニット、メンバー、または部分;(b)酵素お
よび対応する補酵素(例えば、フラビン酵素とFADH、またはNADリンクデヒドロゲナーゼ(NAD-linkeddehydrogenase)とNADH);または(c)ある酵素の生成物が第2の酵素の基質であるチャンネリング系またはカスケード系(例えば、脂肪酸合成系)の一部を形成する酵素。それぞれの場合、2つの標識プローブは別個の部分を含有し、この部分は標的の存在による結合でなく、従ってアンプリファイアーが架橋しない場合には、検出可能な生成物を生成しない。
が、アッセイに導入される;このようなオリゴヌクレオチドは、捕獲プローブの競合物として機能し、従って、捕獲プローブのハイブリダイゼーション部位(図1のC-3)の利用
可能な数が減少する。これは実施例1で説明される。
実験
本発明の実施には、別に示す以外は、当該分野の技術範囲内である、合成有機化学、生化学、分子生物学などの従来技術を使用する。このような技術は文献に詳細に説明されている。例えば、Sambrook、FritschおよびManiatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版(1989);OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait編、1984);Nucleic Acid Hybridization(B.D.HamesおよびS.J.Higgins編、1984);およびシリーズ、Methodsin Enzymology(Academic Press,Inc.)を参照のこと。本明細書に記載される(上記および下
記の両方)すべての特許、特許出願、および刊行物は、本明細書中で参考として援用される。
この実施例は、図8に示すように、2つまたはそれ以上の異なる捕獲エキステンダーを用いるハイブリダイゼーションアッセイを記述する。この実験研究の目標は、固体支持体に結合する捕獲エキステンダープローブにより引き起こされるバックグラウンドシグナルを減少させることであった。捕獲エキステンダープローブが支持体に結合する能力を減少させることにより、標的ポリヌクレオチドを、固体表面に安定に結合させるために、複数
の捕獲エキステンダープローブを通して結合させる。このことが、捕獲エキステンダープローブなしで行われるアッセイと同じぐらい低いアッセイバックグラウンドを生じる(すなわち、なぜなら、実質的に捕獲エキステンダー分子が支持体に結合しないからである)。この実施例に要約された実験研究はまた、固定化捕獲プローブに競合的に結合し得る分子が加えられる場合、バックグラウンドをよりさらに減少させることが可能であることを示す。なぜなら、標識エキステンダー分子または標識プローブが固定化捕獲プローブを通して支持体に結合する可能性が顕著に減少するからである。
相補的な5’配列を有し、そして各々のペアの第2の部分は、CP2の最初の13ntに相補的
な3’配列を有した。エキステンダーは、それ故図8に示すように、固体支持体に結合し得た。それらは、隣接するCP2分子に架橋し得る(CE3、4および5を通して2つの異なるCP分子に捕獲される、図10の標的のように)か、またはそれらは1つのCP2と十字形を形成し
得る(CE1および2を通して同一のCP分子に結合している、図9の標的のように)。プローブは十字形を形成するように最適に設計され、そして捕獲プローブ濃度は低く保たれるので、十字形は、2つの隣接するCP2分子の架橋よりも運動論的に非常に好ましく、そして
十字形は平衡分布において優勢であると考えられる。
を通して生じ、このマルチマーは、標識エキステンダープローブのセグメントにハイブリダイズする第1のセグメント(E’)、およびセグメント(F)の15までの反復を有する。ここで、セグメントFは、3つの標識されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。標的核酸を、固定化捕獲プローブ、および捕獲プローブと標的との両方にハイブリダイズする捕獲エキステンダープローブを通して固体支持体に結合する。アンプリファイアーマルチマーを、標識とアンプリファイアーマルチマーとの両方にハイブリダイズする標識エキステンダープローブを通して固定化標的に結合させる。2つの競合物プローブもまた、バックグラウンド減少のために使用した。これらのプローブは、捕獲プローブに結合する。
配列(5’-->3’)捕獲エキステンダープローブ(固定化捕獲プローブに結合するセグメ
ントに下線を付す):
。プレートを、次いで1×PBSで1回洗浄し、そしてウェルを吸引して液体を除去した。
ウェルを、次いで250μlの1NNaOHで満たし、そして室温で15〜20分間インキュベートした。プレートを再び1×PBSで3回洗浄し、そしてウェルを吸引して液体を除去した。
を有し、そして155アミン/分子を含む。ポリペプチドを、2MNaCl/1×PBSと混合して、
最終濃度を0.1mg/mL(pH6.0)とした。200μlのこの溶液を各々のウェルに加えた。プレ
ートをプラスチックで覆い、乾燥を防ぎ、そして30℃で一晩インキュベートした。プレートを、次いで1×PBSで3回洗浄し、そしてウェルを吸引して液体を除去した。
:5’−XGTCCCAGAGCCGAGAACACCTGATTGCTG−3’(配列番号20)(Xは、長鎖アミン改変ヌクレオチド(5−メチルシチジンのN4−(6−アミノカプロイル−2−アミノエチル)誘導体))。混合物をボルテックスし、そして室温で30分間インキュベートした。10mMリン酸ナトリウムpH6.5で平衡化したゲルろ過カラム(PharmaciaSephadex G-25,NAP-25)を使用して、活性化オリゴヌクレオチドを精製した。活性化オリゴヌクレオチド反応混合物をカラムに付与し、そしてろ過した。溶出液を回収し、そして次の工程に使用するために保存した。溶出液の濃度を、50mMリン酸ナトリウムpH7.8を希釈のために用いて3.7×10-2OD260 ユニット/mlに調整した。
してウェルを吸引して液体を除去した。
回洗浄し、そしてウェルを吸引して液体を除去した。
て水で1回洗浄した。プレートを、乾燥剤を備えたプラスチック容器に4℃で保存した。アンプリファイアーマルチマーを以下のように調製した:
オリゴヌクレオチドのすべての化学合成を、自動DNA合成機(Applied Biosystems,Inc.,(ABI)モデル380 B)で行った。PHOSTELTM試薬(DMT-O-CH2CH2-(SO2)-CH2CH2-O-P(N(iPr)2)(-O-CH2CH2CN)、ここで、DMTは、ジメトキシトリチルであり、そしてiPrは、イソプロ
ピルである)を使用した5’−ホスホリル化を含むβ−シアノエチルタイプのホスホルアミダイト化学を使用した。示される以外は、標準ABIプロトコルを使用した。ある倍数の
サイクル(例えば、1.2サイクル)を使用したことが示された場合には、ABIにより推奨さ
れるアミダイトの標準量のその倍数を特定のサイクルにおいて使用した。
ジン制御細孔ガラス(CPG)(2000Å、1グラムの支持体当たり7.4マイクロモルのチミジン)を用いて1.2サイクルプロトコルで合成した。分枝部位ヌクレオチドは、以下の式で
あった:
ースルー(steppedflowthrough)を用いて塩化メチレン中、3%トリクロロ酢酸で行った。
で合成した。2つの側鎖伸長部を、末端X’分枝部位上に合成した。レブリニル基を除去するために、0.5Mヒドラジン水和物のピリジン/氷酢酸(1:1v/v)溶液を導入し、そして15分ごとに液体を更新しながら90分間CPG支持体と接触するように維持し、続いてピリジ
ン/氷酢酸(1:1 v/v)で大規模に洗浄(extensivewashing)し、そして次いでアセトニ
トリルで洗浄した。脱保護後、6塩基側鎖伸長部を6.4サイクルを用いて加えた。
オチド鎖を、DNA合成機において固体支持体から自動的に取りはずした。水酸化アンモニ
ウム溶液を、4mlのねじぶた式のWheatonバイアルに集め、そして60℃で12時間加熱して
すべての塩基保護基を除去した。室温まで冷却した後、溶媒をSpeed-Vacエバポレーター
中で除去し、そして残渣を100μlの水に溶解した。以下の構造の側鎖および結合テンプレート/リンカーもまた、自動合成機を用いて作成した:
側鎖:
3’−GATGCG(TTCATGCTGTTGGTGTAG)3−5’(p)(配列番号21)
側鎖伸長部を連結するための結合テンプレート:
3’−CGCATCACTGAC−5’(p)(配列番号22)
粗製櫛主部を標準ポリアクリルアミドゲル(7M尿素および1×TBEランニング緩衝液
を用いた7%)法により精製した。
せ、そして水に再懸濁した。結合生成物を次いでポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。
標的として、合成615ヌクレオチド転写物を、HCVJ1クローンのヌクレオチド54位〜668
位およびSP6 RNAポリメラーゼを含むpGEM(Promega)ベクターを用いて調製した。ネガティブコントロールは標的なしであった。
キステンダープローブ(各)/5000fmole競合物プローブ(各)中の2mg/mlプロテイナーゼKの200μlを、各々のウェルに供給することから成っていた。異なるコントロール実験は、下記の結果の表に示すようにプローブの様々な組み合わせを包含した。プレートを、撹拌してウェルの内容物を混合し、覆い、そして63℃で16時間インキュベートした。
た後、プレートを45℃で30分間インキュベートした。
ェルに加えた(2.66fmole/μlの50μl/ウェル)。45℃で15分間、そして室温で1分間イ
ンキュベートした後、ウェルを上記のように3回、次いで0.015MNaCl/0.0015Mクエン酸ナトリウムで3回洗浄した。
のウェルに加えた。試薬が底部に落下するようにウェルを軽くたたき、そして穏やかに回転させて試薬が底部を覆って均等に分布するようにした。ウェルを覆い、そして37℃で20〜40分間インキュベートした。
しかし、列1と列2との比較は、十字形捕獲エキステンダーを用いたバックグラウンドが、十字形捕獲エキステンダーを用いないバックグラウンドと同じであることを示す。列1、2および3の比較は、競合物を用いると、バックグラウンドを捕獲エキステンダーなしのコントロールのレベルより下に減少させることが可能であることを示す。おそらく、これは捕獲プローブに標識エキステンダーが結合することを阻止することに帰因する。列4と5との比較は、競合物が標的結合と競合しないことを示す。標的結合は、競合物に影響されない。なぜなら、標的は複数のCEを通してよりずっと堅固に結合し、これは個々のエキステンダープローブまたは個々の競合物の結合よりもずっと堅固であるからである。
本実施例は、図11に示すように、2つの異なる標識エキステンダーを用いるハイブリダイゼーションアッセイについて記載する。本実験研究の目的は、固体支持体、あるいは捕獲エキステンダーまたは捕獲プローブ分子に結合する標識エキステンダーにより引き起こされるバックグラウンドシグナル(すなわち、ある程度標識エキステンダーが支持体に結合する場合に生成されるこの種のバックグラウンドは、標的にって媒介されることはない)を減少することであった。標識エキステンダーが結合されると、プリアンプリファイアー、アンプリファイアーマルチマー、および標識プローブ(本実験では、アルカリ性ホスファターゼ標識プローブを使用した)が結合し得、そして標的の存在に依存しないシグナルを発生する。個々にアンプリファイアーマルチマーに結合するための標識エキステンダープローブの能力を低減することにより、プリアンプリファイアーは、表面に安定に結合されるために多重標識エキステンダープローブを介して結合する。プリアンプリファイアーは、アッセイのハイブリダイゼーション条件の間、単一の標識エキステンダーとの結合を存続しないようである。標識エキステンダーを、それらが標的配列に結合したとき、アンプリファイアーマルチマーの結合を容易にするのに必要な2つの標識エキステンダーが互いに近位に位置するように設計する。単一のハイブリダイズされた標識エキステンダーは、反応条件下でプリアンプリファイアーを有効的に結合しない。このように、プリアンプリファイアーの結合は、標的の存在下でのみ好ましい。
ートに取り付けた。HCV標識エキステンダープローブのセットを設計した。各々の標識エ
キステンダーは、プリアンプリファイアープローブに結合する1つまたは2つの付加配列
(配列A、B、C、またはDから選択される)に加え、標識に相補的な配列(T)を含む。このプリアンプリファイアーは、LEに結合する配列(A’、B’、C’、およびD’)と、アンプリファイアーマルチマーに結合する配列(E’)の8つの反復とを含む。
ファイアー)を介して生成される。標的核酸を、捕獲プローブおよび、捕獲プローブと標的との両方にハイブリダイズする多数の捕獲エキステンダーを介して固体支持体に結合する。このアッセイに使用した捕獲エキステンダープローブ、標識エキステンダープローブ、およびプリアンプリファイアープローブは、以下の通りであった。
配列(5’-->3’)捕獲エキステンダープローブ(固定化捕獲プローブに結合するセグメ
ントに下線を付す):
25:(A−T)(配列番号28)
HCVの標準曲線を、高力価C型肝炎ウィルスサンプルをHCV陰性ヒト血清中に希釈し、そして上記のように調製したマイクロタイターディッシュのウェルに1,500〜19,500ウィル
ス当量の範囲に相当する希釈液の50μlアリコートを送達することにより調製した。
エキステンダープローブ)を各々のウェルに送達することから成った。対照実験では、同様の緩衝液中の50fmole/ウェル捕獲エキステンダープローブ、160fmole/ウェル標識エキ
ステンダープローブを使用した。プレートを、撹拌してウェルの内容物を混合し、覆い、そして63℃で16時間インキュベートした。対照実験を「前増幅」工程の間、63℃に保った
。
、覆い、そして53℃で30分間インキュベートした。
イアーマルチマーを使用した。プレートを覆い、そして撹拌してウェルの内容物を混合した後、プレートを53℃で30分間インキュベートした。
のウェルに加えた(50μlの0.75MNaCl/0.075Mクエン酸ナトリウム/0.1% SDS/0.5%ブロ
ッキング試薬(上記、Boehringer Mannheim、カタログ番号1096176)中の125fmol)。53
℃で15分間、そして室温で10分間のインキュベーション後、ウェルを上記のように2回、次いで0.015MNaCl/0.0015Mクエン酸ナトリウムで3×洗浄した。
インキュベートした。
本実施例では、捕獲プローブxt1*(本明細書のはじめに引用されたPCT公開公報第WO 92/02526号、およびEPA883096976を参照のこと)を含むマイクロウェル上で、Tm測定を行った。捕獲エキステンダーおよびxt1*捕獲プローブは以下の通りであった:
xt1−末端化HCV捕獲エキステンダー(5’-->3’;プローブの機能性ドメインをピリオド
によって分離する):
前記実施例から、プローブを、アッセイの条件下で安定な複合体を達成するために多重(2またはそれ以上)相互作用が必要とされるように設計し得ることが明らかである。用語「多重相互作用」は、いかなる限定も意図しない。2つのタイプの多重相互作用について説明する:それらは、十字形(4方向分枝)接合を形成する多重プローブおよび固体支持体上で多重捕獲プローブに同時に結合する多重捕獲エキステンダーであり、単一の捕獲エキステンダー−捕獲プローブハイブリッドのTmよりも10℃〜20℃高い標的−固体支持体Tmを生じる。
合する。Amp1が、安定なハイブリッド配列Xを介して標識エキステンダーLE1に結合する
。Amp2が、安定なハイブリッド配列Yを介して標識エキステンダーLE2に結合する。LE1およびLE2は、接触する必要はないが、両方とも同一標的分子の非重複領域に結合されなけ
ればならない。AMP1は分枝配列BおよびFを含有し、そしてamp2は分枝配列DおよびGを含有する。この実施例において、酵素標識プローブは配列BcおよびDcを含有するが、活性化物質プローブは配列FcおよびGcを含有する。図15において、標識エキステンダーは、標的およびそれらのそれぞれのアンプリファイアーと安定なハイブリッドを形成する。示した他のすべてのハイブリッド(B、D、F、Gを含む)は、弱すぎてハイブリダイゼーションの温度で安定なハイブリッドを形成することができないように設計する。弱いハイブリッドを、アッセイハイブリダイゼーション温度より約10℃〜20℃低い融解温度を有するように設計する。アッセイ温度より5℃低い融解温度を有する設計もまた受容可能である。好ましい差は10℃〜20℃である。なぜなら、これは標的特異的結合を100倍〜1000倍に
増加し得るからである。
れるのと類似のフルオレセイン化(fluoresceinated)ポリマーであり得た。このポリマ
ーの存在下で、脱ホスホリル化したジオキセタンからの光出力は、400倍に増加した。理
想的には、酵素により放出されたジオキセタンが、有効標的依存光放射のためのフルオレセインまたは他の発光促進剤への転移エネルギーの高い確率を有するように、発光活性化物質は酵素標識プローブをサンドイッチする。検出工程のために選択される条件は、ジオキセタンの非常に短い寿命を好み、促進剤−標識標的の非存在下でジオキセタンの検出の効率を低減する。バルク(bulk)ホスホリル化ジオキセタン物質混合物からフルオレセインポリマーまたは他の発光促進剤を除去することにより、シグナルがより標的依存的となる。ホスホリル化ジオキセタンを開裂する固体支持体に非特異的に結合するアルカリ性ホスファターゼでさえ、それが標的に拡散するのに十分に長く残存しなければ、ほとんど検出されないようである。この方法により、バックグラウンドでさえ、シグナルのタイプに変換される(すなわち、大部分のノイズを見分けるために標的の存在を必要とする)。
つの短い配列を有し、そして2つの酵素サブユニット(これらのお互いに対する天然の親和性が低減または除去される)が接近し、そしてそれらが次に発光活性化物質に取り囲まれる。さらに、酵素の1つのサブユニットを伴う分枝DNAアンプリファイアーおよび他の
サブユニットまたは活性化物質を伴う他の分枝DNAアンプリファイアー(別の標識エキス
テンダーに結合した)を使用し得る。さらに、架橋分子を支持するために多数の異なる連続的な配列を含む直鎖のアンプリファイアーを使用することも同様に可能である。このような直鎖のアンプリファイアーを、前記で考察したように結合により容易に作製し得る。
本発明の目的は、ハイブリダイゼーションアッセイのバックグラウンドノイズを減少することである。固体支持体への捕獲エキステンダーの結合を徹底的に減少することにより、捕獲エキステンダーに結合する分子によるバックグラウンドを減少する。2つの標識エキステンダーを介してアンプリファイアーを結合することにより、バックグラウンドを減少する。なぜなら、固体支持体または固体支持体に結合した任意の分子に結合する標識エキステンダー(捕獲プローブおよび捕獲エキステンダーを含む)は、有効的には標識されないからである。同様に、標的の非存在下で支持体に結合するアンプリファイアーは、それがアッセイ温度よりも10℃〜20℃低いTmを有する標識されたプローブとハイブリッドを形成する場合、有効に標識されない。また、固体支持体または固体支持体に結合した任意の分子に結合する標識ざれたプローブは、その標識されたプローブがその補因子または他のサブユニットにより活性化されない場合、有効に検出されない。発光の活性化物質は、光出力を100倍より大きく増加し得る(Schaapら、上記)。活性化物質を物質の溶液か
ら除去し、そして代わりに標的に結合する場合、ハイブリダイゼーションアッセイのノイズ減少のための重要な機会がある。
生じる。これらのすべてを利用すると、原則として、バックグラウンドは検出され得ず、より強力なシグナル増幅の使用を可能にして感度を増加させる。これらの概念を組み合わせる作用し得るプローブ設計を図16に示す。捕獲エキステンダーおよび標識エキステンダーを、十字形において標的に同時にハイブリダイズするように設計し得る。エキステンダーの標的結合領域のTmを、配列VおよびWおよびXおよびYを含むハイブリッドよりも約10℃、より安定であるように設計する。捕獲−−標的複合体のTmを、捕獲エキステンダー−−捕獲プローブ複合体よりも約10℃またはそれ以上、より安定であるように設計する。ハイブリダイゼーションの間は、配列「V」および「W」の莫大なモル過剰量が含まれ得、固体支持体に結合する捕獲エキステンダーをさらに低減する(特に、冷却工程がハイブリダイゼーション後に含まれる場合)。上記のように、「V」および「W」配列は、標的結合において効果を有しない。
Claims (11)
- サンプル中の核酸分析物の存在を検出するためのサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって:
(a)固体支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る分析物結合セグメントおよび該捕獲プローブ内に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る支持体結合セグメントを含有するポリヌクレオチドを含む捕獲エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントおよび標識プローブシステムにハイブリダイズし得る第2のセグメントを有する第1の標識エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントおよび標識プローブシステムにハイブリダイズし得る第2のセグメントを有する別の第2の標識エキステンダー分子と、該第1の標識エキステンダー分子および該第2の標識エキステンダー分子の該第2のセグメントにハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じさせる核酸配列を含む標識プローブシステムを提供する、工程;
(b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステンダー分子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリダイゼーション条件下で、該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合したハイブリッド複合体を形成する工程;
(c)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;
(d)次いで、ハイブリダイズする条件下で該支持体に結合したハイブリッド複合体と該標識プローブシステムとを接触させて、標識された、支持体に結合したハイブリッド複合体を生成する工程;
(e)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;
(f)該標識された、支持体に結合したハイブリッド複合体の標識の存在を検出する工程;ならびに
(g)該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体における該標識の存在を該サンプル中の該核酸分析物の存在と相関させる工程、を包含し
ここで、第1のおよび第2の標識エキステンダー分子の両方が該分析物に結合した場合にのみ、工程(d)の該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体を形成するように、該標識エキステンダー分子が構成される、アッセイ。 - 請求項1に記載のアッセイであって、前記標識プローブシステムが、(i)前記核酸配列M−1を含有する増幅マルチマーおよび標識プローブにハイブリダイズし得る核酸配列M−2を含有する多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニット、ならびに(ii)M−2にハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じさせる核酸配列L−3を含有する標識プローブを含み、そしてここで、前記アッセイの工程(d)は、以下の工程:
(d1)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合したハイブリッド複合体と、該増幅マルチマーとを接触させて、第2の支持体に結合したハイブリッド複合体を生成する工程;
(d2)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;および
(d3)次いで、ハイブリダイゼーション条件下で、該第2の支持体に結合したハイブリッド複合体と、該標識プローブとを接触させて、標識された、支持体に結合したハイブリッド複合体を生成する工程;
を包含する、アッセイ。 - サンプル中の核酸分析物の存在を検出するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって:
(a)固体支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントC−1および該捕獲プローブの核酸配列にハイブリダイズし得る第2のセグメントC−2を有する捕獲エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL−1および第1の増幅マルチマーにハイブリダイズし得る第2のセグメントL−2を有する第1の標識エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL−1aおよび第2の増幅マルチマーにハイブリダイズし得る第2のセグメントL−2aを有する第2の標識エキステンダー分子と、L−2にハイブリダイズし得る核酸配列M−1および標識プローブにハイブリダイズし得る核酸配列M−2を含有する多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する第1の増幅マルチマーと、L−2aにハイブリダイズし得る核酸配列M−1aおよび標識プローブにハイブリダイズし得る核酸配列M−2aを含有する多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する第2の増幅マルチマーと、該増幅マルチマーにハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じさせる標識プローブとを提供する工程;
(b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステンダー分子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリダイゼーション条件下で該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合した第1のハイブリッド複合体を形成する工程;
(c)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;
(d)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合した第1のハイブリッド複合体と、該増幅マルチマーとを接触させ、支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を生成する工程;
(e)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;
(f)ハイブリダイズする条件下で、該支持体に結合した第2のハイブリッド複合体と該標識プローブとを接触させて、標識された、支持体に結合した第3のハイブリッド複合体を生成する工程;
(g)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;
(h)該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体における標識の存在を検出する工程;ならびに
(i)該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体における該標識の存在を該サンプル中の該核酸分析物の存在と相関させる工程、を包含し、
ここで、該標識プローブは、該第1の増幅マルチマーにハイブリダイズし得る第1の核酸セグメントおよび該第2の増幅マルチマーにハイブリダイズし得る第2の核酸セグメントを含有し、その結果、該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体は、該第1の増幅マルチマーおよび第2の増幅マルチマーが該標識プローブを介して結合されない限り、形成されない、アッセイ。 - サンプル中の核酸分析物の存在を検出するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって:
(a)固体支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントC−1および該捕獲プローブの核酸配列にハイブリダイズし得る第2のセグメントC−2を有する捕獲エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL−1および第1の増幅マルチマーにハイブリダイズし得る第2のセグメントL−2を有する第1の標識エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL−1aおよび第2の増幅マルチマーにハイブリダイズし得る第2のセグメントL−2aを有する第2の標識エキステンダー分子と、L−2にハイブリダイズし得る核酸配列M−1および第1の標識プローブセグメントにハイブリダイズし得る核酸配列M−2を含有する多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する第1の増幅マルチマーと、L−2aにハイブリダイズし得る核酸配列M−1aおよび第2の標識プローブセグメントにハイブリダイズし得る核酸配列M−2aを含有する多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する第2の増幅マルチマーと、該それぞれの増幅マルチマーにハイブリダイズし得る第1のおよび第2の標識プローブセグメントであって、そしてこれらのプローブセグメントが、増幅マルチマーの近傍に存在する場合、検出可能なシグナルを生じる、第1のおよび第2の標識プローブセグメントを提供する工程;
(b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステンダー分子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリダイゼーション条件下で該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合した第1のハイブリッド複合体を提供する工程;
(c)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;
(d)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合した第1のハイブリッド複合体と該増幅マルチマーとを接触させて、支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を生成する工程;
(e)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;
(f)ハイブリダイズする条件下で、該支持体に結合した第2のハイブリッド複合体と、該標識プローブとを接触させて、標識された、支持体に結合した第3のハイブリッド複合体を生成する工程;
(g)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;ならびに
(h)該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体における、該第1の標識プローブセグメントと第2の標識プローブセグメントとの間の相互作用により生じる検出可能なシグナルの存在を認める工程であって、ここで該支持体上の該標識の存在が、該サンプル中の該核酸分析物の存在を示す、工程;
を包含する、アッセイ。 - 請求項4に記載のアッセイであって、前記第1の標識プローブセグメントが第1の酵素フラグメントを含み、そして前記第2の標識プローブセグメントが第2の酵素フラグメントを含み、そしてここで、該第1のおよび第2の酵素フラグメントが、標的の存在により互いに結合しない限り不活性な相補的酵素フラグメントである、アッセイ。
- 請求項4に記載のアッセイであって、前記第1の標識プローブセグメントが酵素を含み、そして前記第2の標識プローブセグメントが該酵素の補因子を含み、そしてここで、該酵素および該補因子が、標的の存在により互いに結合しない限り不活性である、アッセイ。
- 請求項4に記載のアッセイであって、前記第1の標識プローブセグメントが酵素を含み、そして前記第2の標識プローブセグメントが発光または蛍光活性化物質を含み、ここで該酵素が産物の形成を触媒し、そして該活性化物質が該産物の検出を増強する、アッセイ。
- サンプル中の核酸分析物を検出するためのサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって:(a)該分析物を直接的または間接的に固体支持体に結合した捕獲プローブに捕獲エキステンダー分子を介して結合する工程;(b)該分析物を標識する工程;(c)該支持体上の標識の存在を検出する工程であって、ここで該支持体上の該標識の存在が、該サンプル中の該核酸分析物の存在を示す、工程を包含し、
改良点として、該固体支持体に結合した捕獲プローブにハイブリダイズし得る核酸配列を含有する競合物オリゴヌクレオチドをアッセイ内に組み込む工程を包含する、アッセイ。 - サンプル中の核酸分析物の存在を検出するためのサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって:
(a)固体支持体に結合した捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントC−1および該捕獲プローブの核酸配列にハイブリダイズし得る第2のセグメントC−2を有する捕獲エキステンダー分子と、該捕獲プローブにハイブリダイズし得る核酸配列を含有する競合物オリゴヌクレオチドと、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL−1および標識プローブシステムにハイブリダイズし得る第2のセグメントL−2を有する標識エキステンダー分子と、L−2にハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じる核酸配列M−1を含有する標識プローブシステムとを提供する工程;
(b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステンダー分子、競合物オリゴヌクレオチド、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリダイゼーション条件下で該核酸分析物をインキュベートして、(i)支持体に結合した、捕獲プローブ、捕獲エキステンダー、核酸分析物、および標識エキステンダーの第1のハイブリッド複合体、ならびに(ii)捕獲プローブおよび競合物オリゴヌクレオチドの支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を形成する工程;
(c)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;
(d)次いで、ハイブリダズする条件下で、該支持体に結合した、第1のハイブリッド複合体と該標識プローブシステムとを接触させて、標識された、支持体に結合した、第3のハイブリッド複合体を生成する工程;
(e)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;ならびに
(f)該標識された、支持体に結合した第3のハイブリッド複合体における標識の存在を検出する工程であって、該支持体上の標識の存在は、該サンプル中の該核酸分析物の存在を示す、工程;
を包含する、アッセイ。 - 請求項9に記載のアッセイであって、前記標識プローブシステムが、(i)前記核酸配列M−1を含有する増幅マルチマーおよび標識プローブにハイブリダイズし得る核酸配列M−2を含有する多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニット、ならびに(ii)M−2にハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じる核酸配列L−3を含有する標識プローブを含み、ここで前記アッセイの工程(d)は、以下の工程:
(d1)ハイブリダイゼーション条件下で前記支持体に結合した、第1のハイブリッド複合体と前記増幅マルチマーとを接触させて、支持体に結合した、第3のハイブリッド複合体を生成する工程;
(d2)次いで、前記固体支持体に結合しない物質を分離する工程;および
(d3)次いで、ハイブリダイゼーション条件下で、該支持体に結合した、第3のハイブリッド複合体と、該標識プローブとを接触させて、標識された、支持体に結合した、第4のハイブリッド複合体を生成する工程;
を包含する、アッセイ。 - サンプル中の核酸分析物を検出するためのキットであって、
(a)固体支持体に結合した捕獲プローブを有する固体支持体;
(b)該捕獲プローブと、該核酸分析物の予め定められたセグメントとにハイブリダイズし得る捕獲エキステンダー分子;
(c)該核酸分析物の予め定められたセグメントにハイブリダイズし得る第1の標識エキステンダー分子;
(d)該第1の標識エキステンダー分子が結合するセグメントとは異なる該核酸分析物のセグメントにハイブリダイズし得る第2の標識エキステンダー分子;
(e)(i)該第1の標識エキステンダー分子にハイプリダイズし得る核酸配列、および(ii)多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含む第1の増幅マルチマー;
(f)(i)該第2の標識エキステンダー分子にハイブリダイズし得る核酸配列、および(ii)多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含む第2の増幅マルチマー;ならびに
(g)該第1の増幅マルチマーのオリゴヌクレオチドサブユニットとハイブリダイズし得る第1の核酸配列と、該第2の増幅マルチマーのオリゴヌクレオチド サブユニットとハイブリダイズし得る第2の核酸配列を含有し、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを提供する、標識プローブ;
を含む、キット。
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