HU221237B1 - Solution phase nucleic acid sandwich assays having reduced background noise - Google Patents

Abstract

A bejelentés tárgya olyan új technikák biztosítása, mellyel alapvetőencsökkenteni lehet a folyadék fázisú hibridizá- ciós vizsgálatok soránjelentkező háttérjeleket. A technikákról azt állítják, hogy a nemspecifikus hibridizáció és a nem specifikus kötődés jelenségétkiküszöböli vagy jelentősen csökkenti, így olyan detektálható jeleteredményez, mely csupán az érdeklődésre számot tartó cél polinukleotidjelenlétében jön létre. Bizonyos megvalósulásokban olyan módszereketbiztosítanak, melyekkel az olyan jel, ami a zajcsökkentéskövetkeztében máskülönben csökkenne, erősíthető. Biztosítanak az újvizsgálat elvégzéséhez való kiteket is. ŕ

Description

A jelen találmány általában nukleinsavkémiával és hibridizációs vizsgálatokkal kapcsolatos. Még részletesebben a jelen találmány folyadék fázisú hibridizációs vizsgálatokkal, még inkább célfuggő jel létrehozására szolgáló módszerekkel kapcsolatos a háttérzaj minimalizálásán keresztül, mely háttérzaj elsősorban a nem specifikus hibridizációból és/vagy a nem specifikus kötődésből ered. A jelen találmány továbbá olyan módszerekkel is kapcsolatos, melyekkel mialatt a háttérzaj csökken az elveszített jel kompenzálható. A jelen találmány ezenkívül kapcsolatos a leírt vizsgálatok elvégzéséhez szükséges reagenseket tartalmazó kitekkel is.

A nukleinsavhibridizációs vizsgálatokat széleskörűen alkalmazzák a genetikai kutatásokban, a bio-orvosi kutatásokban és a klinikai diagnosztika területén. Egy alapvető nukleinsavhibridizációs vizsgálatban egy egyszálú analit nukleinsavat hibridizálunk egy jelölt, egyszálú nukleinsav próbához és a kapott jelölt duplexeket detektáljuk. Ezen alapvető sémának számos variációját fejlesztették ki a pontosság növelése céljából, a detektálandó duplexek zavaró anyagokból való szeparálásának elősegítése céljából, és/vagy a detektált jel felerősítése céljából.

A jelen találmány egy olyan módszerrel kapcsolatos, mellyel folyadék fázisú szendvicshibridizációs vizsgálatokban a különböző eredetű háttérjelek csökkenthetők. Általában a jelen találmányban leírt technikák során említett háttérzaj az adott vizsgálatban használt különböző polinukleotid alkotórészekkel való nemkívánatos kölcsönhatásokból származik, például olyan kölcsönhatásból, melyek olyan jelet eredményeznek, mely nem felel meg az analit jelenlétének vagy mennyiségének. A jelen találmány hasznos tetszőleges számú vizsgálati formátummal együtt, ahol többszöri hibridizációs lépéseket végeznek az olyan detektálható jel létrehozásához, mely megfelel a polinukleotid analit jelenlétének és mennyiségének.

Egy ilyen vizsgálat került részletes leírásra az általánosan Urdea és munkatársai által leírt 4,868,105 számú US szabadalomban. Ez a vizsgálat magában foglal egy kétrészes befogó rendszert, amit a polinukleotid analit szilárd támasztékhoz való kötődésére terveztek és egy kétrészes jelölő rendszert, amit abból a célból terveztek, hogy a detektálható jelölés a detektálandó, vagy mennyiségileg meghatározandó polinukleotid analithoz kötődjön. A kétrészes befogó rendszer magában foglal egy szilárd támasztékhoz kötött befogópróbákat, valamint olyan befogóextender molekulákat, melyek a befogópróbák egy szegmentjéhez és a polinukleotid analit egy szegmentjéhez is hibridizálódnak. A kétrészes jelölő rendszer magában foglalja az olyan jelölőpróba extender molekulák használatát, melyek a polinukleotid analit egy szegmentjéhez hibridizálódnak, valamint olyan jelölőpróbákat, melyek a jelölőpróba extender molekulákhoz hibridizálódnak és tartalmaznak egy detektálható jelölést, vagy ahhoz kapcsolódnak. Egy ilyen rendszer előnye az, hogy számos hibridizációs lépés kell bekövetkezzen a detektálandó jelölés eléréséhez oly módon, hogy összefüggésben legyen az analit jelenlétével, amennyiben két egyértelmű hibridizációs reakció kell bekövetkezzen az analit „befogáshoz” és hasonlóan, két egyértelmű hibridizáció kell bekövetkezzen az analit jelöléséhez. Azonban számos lehetőség van arra, hogy a detektálható jel létrejöjjön oly módon, ami nem felel meg az analit jelenlétének vagy mennyiségének, ezeket részletesen az alábbiakban tárgyaljuk.

A jelen találmánnyal kapcsolatban hasznos vizsgálatra egy másik példa a jelfelerősítési módszer, mely részletesen az Urdea és munkatársainak tulajdonított 5,124,246 számú US szabadalomban került leírásra. Ebben a módszerben a jelet amplifikációs multimerek használatával erősítjük fel, ezek olyan polinukleotidok, melyeket úgy szerkesztenek meg, hogy tartalmazzanak egy az analit nukleinsavhoz, vagy az analithoz kötődő nukleinsav egy száljához specifikusan hibridizálódó első szegmentet, valamint számos olyan második szegmentet, mely specifikusan a jelölt próbához hibridizálódik. A felerősítés (amplifíkáció) mértéke elméletileg a második szegment ismétlés számával arányos. A multimerek lehetnek lineárisak vagy elágazók. Az elágazó multimerek lehetnek villa vagy fésű alakúak, a fésű alakot részesítjük előnyben.

Egy a hibridizációs vizsgálatokban a jel cél függőségének fokozására javasolt megközelítés az EP 70,685 számú közzétételi iratban került leírásra (a feltalálók: M. J. Heller és munkatársai). Ebben a hivatkozásban egy olyan homogén hibridizációs vizsgálat került leírásra, melyben nem radiatív energia transzfer következik be a proximális (közeli) próbák között; két egyértelmű esemény kell bekövetkezzen a cél által létrehozott jel kiváltásához, a detektálás pontosságának fokozása céljából. Az analit jelenlétéből származó jel fokozásához tervezett második megközelítés a J. E. Stefano által leírt 361,983 számú európai szabadalmi közzétételben került leírásra. Az itt leírt módszer magában foglalja két próba szekvencia hibridizációját (az egyik egy midi variáns RNS (MDV), a másik egy félribozim), melyek mindegyike komplementer az RNS célban lévő szekvenciákkal. Az így létrejött ribozim specifikusan hasítja az MDV próba farkát, így felszabadítja az MDV próbát a támasztéktól és fokozza annak replikációját. Egy harmadik, a hibridizációs vizsgálatokban való specifitás fokozására való megközelítést Distefano és munkatársai írtak le (J. Am. Chem. Soc. (1992) 114:11006-11007). Ez a módszer magában foglalja egy kettős hélix képződmény rövid régióinak felhasználását a triplex hélix DNS két rövid régiója stabilitásának fokozása céljából.

Hogan és munkatársai az EP 552,931 számú közzétételi iratban egy olyan nukleinsavhibridizációs vizsgálatot írnak le, melyben csak a cél szekvencia jelenlétében képződött kétszálú DNS régióit detektáló próba rendszer kerül felhasználásra.

A jelen találmányt, mely nem épül a kétszálú régiók jelenlétének a detektálására, szintén a hibridizációs vizsgálatokban való detektálás pontosságának fokozására, valamint a polinukleotid analit mennyiségi meghatározására tervezték. A jelen találmány az ilyen vizsgálatok érzékenységét és specifitását is növeli, azáltal, hogy csökkenti az olyan jel képződésének gyakoriságát,

HU 221 237 Bl mely a cél hiányában fordul elő, és nem jár az érvényben lévő vizsgálati konfigurációkhoz viszonyított időbeli és költségbeli jelentős növekedéssel. Bizonyos megvalósulásokban a jelen találmány hatékony a jel veszteség kompenzálásában is, mely veszteség a háttérzaj csökkentéséből adódik.

A WO 93/13221, WO 93/13227 és WO 93/13223 számú közzétételi iratok lényegében ugyanazt a vizsgálati módszert ismertetik, azonban mindegyik különböző patogénra vonatkozik, sorrendben Chlamidiae meghatározására, CMV kimutatására, illetve HÍV vizsgálatára vonatkoznak. Tehát mindhárom irodalom ugyanolyan folyékony fázisú szendvicshibridizációs módszert ismertet, melynek során egy szilárd hordozóra kötött befogópróba-analit alapkomplex keletkezik. Ennek következtében a komplex előállításához a befogópróbának szükségszerűen tartalmaznia kell az analittal komplementer régiót.

Ezzel szemben a találmány szerinti vizsgálatban „befogóextender” molekulákat alkalmazunk a nem specifikus hibridizáció csökkentésére. A befogóextenderek alkalmazása következtében viszonylag különleges komplexek keletkeznek, melyek befogópróba - befogóextender - analit elrendezésűek. Ezenkívül a befogópróbák nem rendelkeznek olyan régióval, mely a targettel komplementer, hanem olyan régiót tartalmaznak, mely a befogóextenderrel komplementer. Ezen elrendezés célja a vizsgálat háttérzajának csökkentése. Mivel a fenti három WO-hivatkozás nem ismerteti a befogóextender molekulák alkalmazását, azok találmányunk újdonsága tekintetében nem jöhetnek számításba.

A 4,894,325 számú USA szabadalmi leírás multihibrid komplexeknek genetikai anyag kimutatására történő alkalmazását ismerteti, és a fenti szabadalmi leírások egyike sem tesz említést áthidaló oligonukleotidról vagy „befogóextenderről”, mely az analithoz, valamint a hordozóhoz kötött befogópróbákhoz kötődik. A fenti hivatkozások tehet sem külön-külön, sem kombinálva nem adnak útmutatást befogóextender molekulákat alkalmazó, és csökkentett háttérzajjal rendelkező vizsgálatra.

Mintában lévő nukleinsav-analitok detektálására szolgáló módszereket és kiteket biztosít a jelen találmány. Általában, a módszerek a folyadék fázisú szendvicshibridizáció továbbfejlesztéseit képviselik. Ezen hibridizációk magukba foglalják az analit egy szilárd támasztékhoz való kötését, az analit jelölését, valamint a támasztékon a jelölt anyag jelenlétének detektálását. Az előnyben részesített módszerek magukba foglalják az amplifikációs multimerek használatát, melyek sokkal több jelölő kötődését teszik lehetővé az analitpróba komplexben, fokozva ezzel a vizsgálati érzékenységet és specifitást.

A találmány egy első aspektusában egy olyan vizsgálatot biztosítunk, melyben két vagy több egyértelmű „befogóextender” molekula kerül felhasználásra, melyek mindegyike hozzá kell, hogy kötődjön az analithoz, azért, hogy a vizsgálat során detektálható jelet kapjunk. Ahogy fent említettük, a befogóextender molekulák az analithoz és a támasztékhoz kötött „befogópróbák”-hoz kötődő áthidalópróbák. Egy megvalósulásban legalább két befogóextender molekula kell kötődjön egy egyedüli támasztékhoz kötött befogópróbához ahhoz, hogy a vizsgálatban detektálható jelet kapjunk.

A találmány egy további kapcsolódó aspektusában egy olyan vizsgálatot biztosítunk, melyben az a két vagy több egyértelmű befogóextender molekula által közvetített, az analit és a támasztékhoz kötött befogópróbák között létrejött többkomponensű komplex olvadási hőmérséklete Tm, szignifikánsan magasabb, mint a befogópróba és egy egyedüli befogóextender molekula között létrejött két-komponensű komplex olvadási hőmérséklete Tm₂. Ebben az aspektusban a vizsgálatot olyan körülmények között hajtjuk végre, mely kedvez az olyan hibrid komplexek képződésének, melyekben az analit molekula a befogópróbákhoz kötődik. Ezt a technikát úgy tekintjük, hogy fokozza a sokkomponensű komplex stabilitását a kevésbé stabil kétkomponensű komplexekhez viszonyítva. Egy az analithoz kötött hibrid komplexek előnyben részesítésének egy előnyben részesített módszere magában foglalja a vizsgálat egy vagy több lépésének Tm_t és Tm₂ hőmérsékletek közötti elvégzését.

A találmány egy másik aspektusában egy olyan vizsgálatot biztosítunk, melyben egy vagy két egyértelmű „jelölőextender” molekulát használunk, ahogy fent említettük, a jelölőextender molekulák olyan áthidalópróbák, melyek az analithoz és a jelölőpróbához is kötődnek, közvetlenül, ahogy az a 4,868,105 számú US szabadalomban leírásra került, vagy amplifikációs multimereken keresztül közvetve, az 5,124,246 számú US szabadalom szerint. A többszörös jelölőextenderek az analithoz kell kötődjenek egy pozitív jel (a mintában az analit jelenlétét mutatja) létrehozásához.

A találmány egy másik idevonatkozó aspektusában egy olyan módszert biztosítunk, melyben a két vagy több világos befogóextender molekula által közvetített az analit és egy amplifikációs multimer vagy egy jelölőpróba között létrejött többkomponensű komplex olvadási hőmérséklete Τπη szignifikánsan magasabb, mint az amplifikációs multimer vagy jelölőpróba és egy egyedüli jelölőextender molekula között létrejött kétkomponensű komplex olvadási hőmérséklete Tm₂. Ebben az aspektusban a vizsgálatot olyan körülmények között végezzük el, mely kedvez az olyan hibrid komplexek képződésének, melyben az analit molekula az amplifikációs multimerhez vagy a jelölőpróbához kötődik. Úgy tekintjük, hogy ez a technika fokozza a sok komponensű komplex stabilitását a sokkal kisebb stabilitású kétkomponensű komplexekhez viszonyítva. Az analitamplifikációs multimer hibrid komplexek elősegítéséhez az előnyben részesített módszer magában foglalja a vizsgálat egy vagy több lépésének Τπη és Tm₂ hőmérsékletek közötti elvégzését.

A találmány egy megint más aspektusában az amplifikációs (felerősítési) vizsgálatokat két különböző amplifikációs multimerrel hajtjuk végre, melyeket egy vagy több jelölőpróba hidal át. Az egyes jelölőpróbák két régiót tartalmaznak, melyek egyenként mintegy

HU 221 237 Β1

5-40 nukleotid hosszúságúak, előnyösen 10-20 nukleotid hosszúságúak, valamint komplementerek az egyes amplifikációs multimerekben lévő megfelelő régiókkal. A komplementer régiók hosszúságát úgy választjuk meg, hogy biztosítsák, hogy a jelölőpróba és az egyedüli amplifikációs multimer között létrejött komplex olvadási hőmérséklete alacsonyabb legyen, előnyösen mintegy 10 °C hőmérséklettel alacsonyabb legyen, mint a két amplifikációs multimer között egy vagy több jelölőpróba közvetítésével létrejött komplex olvadási hőmérséklete. így, mint ahogy azt már fent leírtuk, egy egyedüli multimer nem fog stabil hibridet képezni egy egyedüli jelölőpróbával; azonban a legalább egy jelölőpróbából és legalább két multimerből képződött többkomponensű hibrid komplexek stabilak. Mivel a többkomponensű komplexek sokkal nagyobb valószínűséggel képződnek akkor, ha amplifikációs multimereket helyezünk a közelükbe az analithoz való kötődésen keresztül, ez a technika egy erősebben célfüggő jelet hoz létre.

A találmány egy megint más aspektusában a korábban említett vizsgálat egy variációját biztosítjuk, melyben két különböző jelölőpróbát biztosítunk, a két különböző jelölőpróba egymáshoz kell kapcsolódjon ahhoz, hogy egy jelet hozzon létre. A korábbi vizsgálatokhoz hasonlóan, a specifitás fokozódik, a további próbakészlet és a további hibridizációs lépések következtében, amelyek be kell következzenek ahhoz, hogy detektálható jel jöjjön létre.

A találmány magában foglalja a korábban említett vizsgálatok variációit is, melyekben például oligonukleotid kompetitorok (versenytársak) vesznek részt a vizsgálatban, hogy kötődjenek a befogópróbákkal (így csökken a szilárd támasztékon való nem specifikus hibridizáció valószínűsége) és melyben rövidebb befogópróbák kerülnek felhasználásra (ismét a szilárd támasztékon való nem specifikus hibridizáció valószínűségének csökkentése végett). Oligonukleotid kompetitorok használhatók a jelölőextenderek és az amplifikációs multimerek közötti vagy a jelölőpróbák és az amplifikációs multimerek közötti kötés gátlására.

Továbbá, a találmány magában foglal olyan módszereket a jel veszteség kompenzálására, mely a találmányban biztosított és a háttérzaj csökkentésére szolgáló technikákból eredhet. Ezek a módszerek magukba foglalják az olyan preamplifikációs (előfelerősítő) molekulák használatát, melyek a jelölt extender molekulák és az amplifikációs multimerek között szolgálnak köztes egységekként, ezenkívül olyan szerkezettel rendelkeznek, hogy számos amplifikációs multimerhez kapcsolódnak. Ezzel a módszerrel a jelölőpróbák jelölőextenderenkénti száma jelentősen megnövelhető.

A találmány a továbbiakban magában foglal még egy olyan hibridizációs vizsgálat végrehajtására szolgáló módszert is, melyben az összes korábban említett technikákat együtt alkalmazzuk, például, melyben két vagy több különböző jelölőextender molekulát használunk, két vagy több különböző befogóextender molekulát használunk, az amplifikációs multimerek és a jelölőpróbák szerkezete olyan, hogy a jelölőpróbák a szomszédos multimereket összekötik.

Végül, a találmány magában foglal olyan kiteket is, melyek a leírt és az igénypontokkal meghatározott folyadék fázisú szendvicshibridizációs vizsgálatok elvégzéséhez szükséges reagenseket tartalmaznak.

Az ábrák rövid ismertetése

1. ábra az elsőbbségi szabadalom egy nukleinsav hibridizációs vizsgálatát mutatja be.

2. -7. ábra a specifikus zajkeltő hibridizációs eseményekre mutat példákat.

A 8., 9. és a 10. ábrák a jelen találmány továbbfejlesztett nukleinsav hibridizációs vizsgálatára mutatnak példákat, melyekben a befogóextender molekulák egy célt a szilárd támasztékhoz kell kössenek. A 8. és a 9. ábrák olyan különböző eljárásokat mutatnak, melyekben két befogóextender molekula egy egyedüli befogópróbához kötődik.

A 10. ábra a jelen találmány egy továbbfejlesztett nukleinsav hibridizációs vizsgálatra ad példát, melyben olyan többszörös befogóextender molekulák kerülnek felhasználásra, melyek ugyanahhoz vagy eltérő befogópróbákhoz kötődnek, próbánként egy·

All. ábra a jelen találmány egy továbbfejlesztett nukleinsav hibridizációs vizsgálatára ad példát, melyben egy kereszt alakú szerkezetet létrehozó jelölőextender molekulák kerülnek felhasználásra.

A 12. ábra a jelen találmány egy továbbfejlesztett nukleinsav hibridizációs vizsgálatára ad példát, melyben többszörös amplifikációs multimerek és összekötő jelölőpróbák kerülnek felhasználásra.

A 13. ábra a jelen találmány egy továbbfejlesztett nukleinsav hibridizációs vizsgálatára ad példát, melyben többszörös amplifikációs multimerek és többszörös összekötő jelölőpróbák kerülnek felhasználásra.

A 14. ábra kétórás ekvilibrálás után mutatja a befogóextender-jelölőcél-befogópróba és jelölt befogóextender-befogópróba olvadási görbéit.

A 15. ábra a jelen találmány egy megint más továbbfejlesztett nukleinsav hibridizációs vizsgálatára ad példát, melyben többszörös amplifikációs multimerek és többszörös összekötő jelölőpróbák kerülnek felhasználásra.

A 16. ábra a jelen találmány egy továbbfejlesztett nukleinsav hibridizációs vizsgálatára ad példát, melynek során számos a találmányban leírt egyedi elképzelést kombinálunk össze.

HU 221 237 Β1

A találmány végrehajtásának módjai

Definíciók és nómenklatúra

Mielőtt a jelen találmányt részletesen leírnánk, el kell fogadni, hogy a jelen találmány nem korlátozódik specifikus vizsgálati formákra, anyagokra vagy reagensekre, ezek természetesen változhatnak. El kell fogadni azt is, hogy a találmány során alkalmazott terminológia az adott megvalósulás leírásának céljára szolgál csupán és nem a találmányt szándékozik korlátozni.

Ebben a specifikációban és az azt követő igénypontokban számos olyan terminusra utalunk, melyek jelentését az alábbiakban határozzuk meg:

A találmány szerinti használatban A „polinukleotid” fogalma és az „oligonukleotid fogalma a (2-dezoxi-D-ribózt tartalmazó) polidezoxiribonukleotidok, a (D-ribózt tartalmazó) poliribonukleotidok, valamint bármely olyan polinukleotid gyűjtőneve, melyek egy purin vagy egy pirimidin bázis N-glikozidjai, valamint olyan más polimerek gyűjtőneve, melyek nem-nukleotidos gerincet tartalmaznak például a peptid nukleinsavak (PNS-ek) és a szintetikus szekvencia-specifikus nukleinsav polimerek, melyek a kereskedelemben beszerezhetők az Antivirals, Inc.-tői (Corvallis, Oregon mint Neugene polimerekként), vagy a nem standard kötők, biztosítva azt, hogy a polimerek tartalmazzanak bázisnukleotidokat abban a konfigurációban, mely lehetővé teszi a bázis párosodási és a bázis ragadást, mint amik a DNS-ben és az RNS-ben találhatók. Nincs szándékolt hosszúságbeli megkülönböztetés a „polinukleotid” és az „oligonukleotid” fogalmak között és ezeket felcserélhetően alkalmazzuk. Ezek a kifejezések csupán a molekula elsődleges szerkezetére utalnak. így, ezek a fogalmak magukba foglalják a kétszálú és az egyszálú DNS-t, valamint a kétszálú és az egyszálú RNS és a DNS:RNS hibrideket, valamint az ismert típusú módosulatokat, például a tudomány e területén jól ismert jelölőket, a metilációkat, a „sapkákat”, a természetesen előforduló nukleotidok egy vagy több analóggal való helyettesítését, az intemukleotid (nukleotidok közötti) módosulatokat, mint amilyen például a töltés nélküli kötések (például a metil foszfonátok, a foszfotriészterek, a foszforamidátok, a karbamátok stb.) és a töltéssel rendelkező kötések (például a foszforotioátok, a foszforoditioátok, stb.) a fiiggő egységeket tartalmazó kötéseket, mint amilyen például a proteinek (ideértve a nukleázokat, a toxinokat, az antitesteket, a jelpeptideket, a poli-L-lizint, stb.), az interkelátorokkal rendelkezőket (például az akridint, a pszoralént stb.), a kelátorokkal rendelkezőket (például a fémeket, a radioaktív fémeket, a bőrt, az oxidatív fémeket, stb.), az alkilátorokat tartalmazókat, a módosított kötésekkel rendelkezőket (például az alfa anomeres nukleinsavakat, stb.) valamint a polinukleotidok és az oligonukleotid nem módosított formáit.

Méltányoljuk, ha a találmány szerinti használatban a „nukleozid” és a „nukleotid” kifejezések azokat az egységeket foglalják magukba, melyek nem csupán az ismert purin és pirimidin bázisokat tartalmazzák, hanem más módosított heterociklusos bázisokat is. Az ilyen módosítások közé tartoznak a metilált purinok vagy pirimidinek, az acilált purinok vagy pirimidinek vagy más heterociklusos vegyületek. A módosított nukleotidok vagy nukleotidok módosításokat foglalnak magukba a cukor egységen, például ahol egy vagy több hidroxil csoportot helyettesítünk egy halogén atommal, alifás csoportokkal, vagy olyan a funkciójuk, mint az észtereké, az aminoké, vagy más hasonlók.

A „polinukleotid analit” kifejezés egy egyszálú vagy kétszálú nukleinsav molekulára vonatkozik, mely egy cél nukleotid szekvenciát tartalmaz. Az analit nukleinsav számos forrásból származhat, például biológiai folyadékokból, vagy szilárd anyagokból, élelmiszerekből, környezeti anyagokból, stb., és a hibridizációs analízishez számos eszközzel állíthatók elő, például a K/SDS proteináz, kaotróp sók, vagy más hasonló anyagok hozzáadásával, vagy fenol/kloroform extrakcióval. A „polinukleotid-analit” fogalmát felcserélhetően használjuk az „analit”, „analit-nukleinsav”, „cél”- és „célmolekula” fogalmakkal.

A találmány szerinti használatban a „célrégió”, vagy a „cél nukleotidszekvencia” a cél molekulán belüli próba kötő régióra utal. A „célszekvencia” kifejezés egy olyan szekvenciára utal, mely egy próbával stabil hibridet képez a kívánt körülmények között.

A találmány szerinti használatban a „próba” kifejezés egy a fentiek szerint meghatározott polinukleotidból álló szerkezetre utal, mely egy a cél molekulában jelen lévő nukleinsav szekvenciával komplementer nukleinsav szekvenciát tartalmaz. A próbák polinukleotid régiói állhatnak DNS-ből, és/vagy RNS-ből és/vagy szintetikus mukleotid analógokból.

Méltányoljuk, ha a kötő szekvenciák nem kell tökéletes komplementaritással rendelkezzenek ahhoz, hogy stabil hibrideket biztosítsanak. Számos esetben stabil hibridek képződnek akkor, ha a bázisok kevesebb mint körülbelül 10%-a rosszul párosodott, nem számítva a négy vagy több nukleotid által létrehozott hurkot. Ennek megfelelően, a találmány szerinti használatban a „komplementaritás” egy olyan oligonukleotidra utal, mely stabil duplexet képez „komplementjével” a vizsgálati körülmények között, általában ahol 90%-osnál nagyobb a homológia.

A „nukleinsav multimer” kifejezés vagy az „amplifikációs multimer” kifejezés a találmány szerinti használatban ugyanazon egyszálú oligonukleotid szegment vagy különböző egyszálú polinukleotid szegmentek egy lineáris vagy egy elágazó polimerére utalnak, melyek mindegyike tartalmaz egy olyan régiót, ahol a jelölőpróba képes kötődni, például a jelölőpróbán belüli nukleinsav szekvenciával komplementer nukleinsav szekvenciát tartalmaz; az oligonukleotid szegmentek állhatnak RNS-ből, DNS-ből, módosított nukleotidokból, vagy ezek kombinációiból. Legalább az egyik szegment olyan szekvenciájú, hosszúságú és összetételű, mely lehetővé teszi, hogy az specifikusan kötődjön egy cél szekvenciához a jelölőpróbában; továbbá, legalább az egyik szegment szekvenciája, hosszúsága és összetétele olyan, mely lehetővé teszi, hogy az specifikusan kötődjön egy a jelölőextenderben vagy a preamplifikálóban lévő cél szekvenciához. Tipikusan,

HU 221 237 Β1 az ilyen szegmentek megközelítően 15-50, előnyösen 15-30 nukleotidot tartalmaznak és GC tartalmuk körülbelül 20-80% határok között található. A multimerben lévő oligonukleotid szegmentek teljes száma általában körülbelül 3-1000, még tipikusabban 10-100, legtipikusabban körülbelül 50. A multimer oligonukleotid szegmentjei kötődhetnek kovalensen közvetlenül egymáshoz foszfodiészter kötéseken keresztül, vagy közbe helyezett kötő anyagokon keresztül, mint például nukleinsavon, aminosavon, szénhidráton vagy poliol hidakon keresztül, vagy más olyan kereszt-kötő anyagokon keresztül, melyek képesek kereszt kötni a nukleinsavakat vagy a módosított nukleinsav szálakat. Másik lehetőségként, a multimer állhat oligonukleotid szegmentekből, melyek nem kovalens módon kapcsolódnak, azonban valamilyen más módon kötöttek, például hibridizáción keresztül. Egy ilyen multimer kerül leírásra például az 5,175,270 számú US szabadalomban (Nilsen és munkatársai).A kötődési hely(ek) lehet(nek) a szegment végein (vagy normális vagy 3’-5’ orientációban, vagy random orientációban) és/vagy a szálban levő egy vagy több belső nukleotidnál. Lineáris multimerekben az egyedi szegmentek vég-vég kapcsolódásúak a lineáris polimer létrehozása céljából. Egy elágazó típusú multimerben három vagy több oligonukleotid szegment ágaz ki az eredési pontból egy elágazó szerkezet létrehozása céljából. Az elágazási pont lehet egy másik nukleotid szegment vagy egy többfunkciós molekula, melyhez legalább három szegment kapcsolódhat kovalens kötéssel. Egy másik típusban egy oligonukleotid szegment gerinc található egy vagy több függő oligonukleotid szegmenttel. Ezek az utóbbi típusú multimerek a „villaszerű”, „fésűszerű” vagy a „villa-” és „fésűszerű” szerkezetek kombinációi, ahol a „fésűszerű” multimerek - a jelen találmányban előnyben részesített multimerek - olyan polineukleotidok, melyek egy lineáris gerinccel rendelkeznek és a gerincből számos oldallánc áll ki. A függő szegmentek normális esetben egy módosított nukleotidtól függnek, vagy más szerves egységtől, melyek megfelelő funkciós csoporttal rendelkeznek, melyekhez az oligonukleotidok konjugálódhatnak vagy máskülönben kapcsolódhatnak. A multimer lehet teljesen lineáris, teljesen elágazó, vagy a lineáris és elágazó részek kombinációja. Tipikusan legalább két elágazási pont található a multimerben, még előnyösebben legalább három, még előnyösebben 5-30, bár néhány megvalósulásban lehet ennél még több. A multimerek magukba foglalhatják a kétszálú szekvenciák egy vagy több szegmentjét. A multimer szintézisre és specifikus multimer szerkezetekre vonatkozó további információk az 5,124,246 számú US szabadalomban (Urdea et al.) találhatók.

A WO 92/02526 számú PCT szabadalom a fésűszerűen elágazó multimereket írja le, melyek különösen előnyben részesülnek a jelen módszerekkel kapcsolatban és melyek egy lineáris gerincből és függő oldalláncokból állnak; a gerinc magában foglal egy specifikus hibridizációs helyet biztosító szegmentet az analit nukleinsav vagy az analithoz kötött nukleinsav részére, míg a függő oldalláncok egy olyan szegment ismétlődéseit foglalják magukba, melyek specifikus hibridizációs helyeket biztosítanak egy jelölt próba számára.

Az első típusú előnyben részesített fésűszerű polinukleotid multimer az 1-es általános szerkezeti képlettel jellemezhető:

¹-S_(XS')tn—(R_n)_S' ’_ A - 5' i

I

S' ¹ '

I

I

L ahol, S legalább 15 nukleotid egy első spacer szegmentje, előnyösen körülbelül 15-50 nukleotidé, X egy sokfunkciós nukleotid, mely egy elágazási helyet biztosít, S’ 0-15 nukleotid elágazási hely spacer szegmentje, előnyösen 0-10 nukleotidé, m 15-tel egyező vagy annál nagyobb egész szám, előnyösen 15-100 közötti, R egy hasítható kötő molekula, n 0 vagy 1, S ,’ körülbelül 0-10 nukleotid második spacer szegmentje, előnyösen 5-10 nukleotidé, A egy specifikusan az analit nukleinsavhoz vagy analithoz kötött nukleinsavhoz hibridizálódni képes szegment, S’” 0-10 nukleotid egy harmadik spacer szegmentje, E 5-10 nukleotid oligonukleotid extenziója és L egy olyan nukleotid szekvencia 2-10 ismétlést, előnyösen 3-6 ismétlést tartalmazó szegmentje, mely képes specifikusan egy jelölt oligonukleotid próbához hibridizálódni.

Az ezen fésű típusú polinukleotid multimerek egy második típusú előnyben részesített megvalósulása a ΙΙ-es szerkezeti képlettel jellemezhető:

3'-A_S_(S'_X'ím-S - 5' i

I (R)_n i

I

S' ' '

E i

i

L ahol, A egy specifikusan az analit nukleinsavhoz vagy analithoz kötött nukleinsavhoz hibridizálódni képes

HU 221 237 Β1 szegment, S legalább 15 nukleotid, előnyösen körülbelül 15-50 nukleotid első spacer szegmentje, X’ egy elágazási helyet biztosító monomer molekula egy sokfunkciós nukleotid, mely egy elágazási helyet biztosít, S’0-15 nukleotid, előnyösen 0-10 nukleotid elágazási hely spacer szegmentje, m 15-tel egyező vagy annál nagyobb egész szám, előnyösen 15-100 közötti, S” körülbelül 0-10 nukleotid, előnyösen 5-10 nukleotid második spacer szegmentje, R egy hasítható kötő molekula, n 0 vagy 1, S’” 0-10 nukleotid egy harmadik spacer szegmentje, E 5-10 nukleotid oligonukleotid extenziója és L egy olyan nukleotid szekvencia 2-10 ismétlést, előnyösen 3-6 ismétlést tartalmazó szegmentje, mely képes specifikusan egy jelölt oligonukleotid próbához hibridizálódni.

A multimer teljes gerince, vagy ennek S-től S”-ig terjedő része, valamint az oldallánc L-t nem tartalmazó része tipikusan kémiai szintézissel hozható létre szerves egységként hagyományos automatizált szilárd fázisú oligonukleotid szintézises kémiát és berendezéseket használva. Ebben a tekintetben, az S spacer szegment az elágazási helyet tartalmazó molekula részét a szilárd fázistól való elválasztóként szolgál (az S 3’ vége közvetlenül, vagy közvetve a szilárd fázishoz kötődik). Más megvalósulásokban a teljes gerinc és a függő oldalláncok - ideértve az L-t - szerves egységként szintetizálhatok.

A fenti képletekben X-nek vagy X’-nek jelölt módosított nukleotidok vagy elágazó monomerek többfunkciós nukleotidok lehetnek melyekben egy funkciós csoportot használunk az oldallánc extenzióhoz, a többieket a gerinc kötéshez használjuk. A többfunkciós nukleotidokra szolgáló példák a 883096976 számú EPA-ban (340,031 számú US szabadalom) kerültek leírásra, mely leírás a hivatkozás révén részét képezi a találmánynak. Ezek a módosított nukleotidok előnyösen a III-mas számú szerkezeti képlettel jellemezhetők, ahol R³ egy hidrogén atom, metil csoport, jód atom, bróm atom, vagy fluor atom, R⁴ hidrogén atom vagy egy metil csoport, Z a IV-es, V-ös, VI-os, VH-es, VIII-as, és IX-es képlettel rendelkező vegyületek közül került szelektálásra, ahol x és y ugyanaz vagy eltérő és 1-8 közötti egész szám, ezeket is beleértve. (Az „(1)” és „(2)” jelölések a Z kötésnél a Z kötő egység orientációját jelöli.) Az 1-es szerkezeti képlettel rendelkező multimerek esetében, ahogy jelöltük, az S’ spacer szegment tetszés szerinti és ha kívánatos felhasználható az egyes megelőző/egymást követő oldalsó elágazó helyek elkülönítésére, vagy szomszédos elágazási helyek sorozatának szomszédos elágazási sorozatoktól való elválasztására. Az S” második spacer szegment szintén tetszőleges és a molekula elágazó részének A szegmenttől való elválasztására használható, mely A szegmenthez az analit végül kötődik (egy vagy több köztes molekulán keresztül, mint például jelölt extendereken vagy preamplifikálókon keresztül). Az ilyen elválasztásról úgy véljük javítja az analit és a multimer közötti kötést. Hasonlóképpen, a harmadik spacer szegment az S’” szintén tetszés szerinti. Előnyösen poliT.

A Π-es szerkezeti képlettel rendelkező multimerek esetében, ahogy jelöltük, az S’ spacer szegment tetszés szerinti és ha kívánatos felhasználható az egyes megelőző/egymást követő oldalsó elágazó helyek elkülönítésére, vagy szomszédos elágazási helyek sorozatának szomszédos elágazási sorozatoktól való elválasztására, hasonlóképpen az S’” spacer szegment szintén tetszőleges. S, S’, S” és S’” nukleotid vagy nem nukleotid molekulákat tartalmazhat. Egy spacer szegmentben felhasználható nem nukleotid molekulára példa az R hasítható kötő molekula, melyet az alábbiakban írunk le.

Az A szegment olyan szekvenciával és hosszúsággal rendelkezik, mely lehetővé teszi, hogy specifikusan és stabilan egy nukleinsavhoz kötődjön, mint például egy az analithoz kötődő jelölőextenderhez vagy egy preamplifikálóhoz. Az ilyen specifitás és stabilitás eléréséhez az A szegment normálisan 15-50, előnyösen 15-30 nukleotid hosszúságú kell legyen. Ezen szkrínelés specifikus hosszúsága és szekvenciája természetesen attól a nukleinsavtól függ, melyhez hibridizálódni szándékozik.

Az E szegment egy olyan oldallánc extenzió, melyet egy automatizált szilárd fázisú oligonukleotid szintézises készüléken és technikával kémiailag szintetizáltunk. Ez tipikusan 5-10 nukleotid hosszúságú és egy olyan helyként szolgál, melyhez az L szegment enzimatikusan, vagy kémiailag ligálható.

Az L szegment egy olyan oligomer ismétlődéseit tartalmazza, mely specifikusan és stabilan képes egy jelölt oligonukleotid próbához hibridizálódni. Ezek a szegmentek tipikusan 15-150, előnyösen 15-120 nukleotid hosszúságúak. Az egyes L szegmentek normálisan a szegment 2-10 ismétlődését tartalmazzák, előnyösen 3-6 ismétlődést. Néhány oldallánc esetleg nem tartalmazza az L szegmentet. Normálisan az oldalláncok 50%-a, előnyösen legalább az oldalláncok 70%-a tartalmazza az L szegmentet.

A gerincben és/vagy az oldalláncokban a hasítható kötő molekulák (R) tetszés szerintiek, azonban előnyben részesülnek. Ezek oly módon tartalmazzák a szelektálható hasítási helyeket, hogy a nagy, fésű típusú polinukleotidok mintái analízis és jellemzés céljából hasíthatok, Ebben a tekintetben, előnyben részesül, ha az egyes oldalláncokban van hasítható hely, valamint további hasítható helyek a 5’ végnél vagy a 5’-höz legközelebbi elágazási helynél (az I képlet multimereihez), vagy ott, ahol az oldallánc a gerinchez kapcsolódik (a Il-es képlet multimereihez). A polinukleotidokba beépíthető hasítható kötő molekulákra szolgáló példák az EPA 883096976 szabadalomban kerültek leírásra.

A találmány polinukleotidjai összeépíthetők a szilárd fázisú közvetlen oligonukleotid szintézis, az enzimatikus ligálási módszerek és a folyadék fázisú kémiai szintézis kombinálásával, ahogy az részletesen a WO 92/02526 számú PCT közleményben leírásra került.

Ahogy azt korábban említettük, a „preamplifikáló” molekula szintén felhasználható, mely áthidaló egységként szolgál a jelölőextender molekulák és az amplifíkációs multimerek között. Ily módon, több amplifikáló és

HU 221 237 Β1 így több jelölő kötődik bármely adott cél-próba komplexben. A preamplifikáló molekulák lehetnek lineárisak, vagy elágazók és tipikusan körülbelül 30-3000 nukleotidot tartalmaznak. Az előnyben részesített megvalósulásban, a preamplifikáló molekula legalább két eltérő jelölőextender molekulához kötődik, oly módon, hogy a vizsgálat teljes pontossága megnövekszik (azaz, mivel a hibridizációs események többszörösére van szükség a próba-cél komplex létrejöttéhez).

A találmány szerinti használatban a „biológiai minta” egy olyan szövet vagy folyadék mintára vonatkozik, mely az ezekre való korlátozás nélkül egy egyénből kerül izolálásra, például plazmából, szérumból, gerinc folyadékból, spermából, nyiroknedvből, a bőr külső szekcióiból, a respirációs (légzőrendszeri), intestinális (bél) és húgy- és ivarszervi részekből, könnyből, nyálból, tejből, vérsejtekből, tumorokból, szervekből, és in vitro sejttenyészet alkotórészekből (ideértve az ezekre való korlátozás nélkül a tenyésztápközegben a sejtek szaporodásából származó kondicionált tápközeget, a feltételezetten vírusosán fertőzött sejteket, a rekombináns sejteket és a sejt alkotórészeket). A jelen módszer előnyben részesített alkalmazása az (a) virális nukleinsavak, mint például a hepatitis B vírus („HBV”), a hepatitis C vírus („HCV”), a hepatitis D vírus („HDV”), a humán immunodefficiencia vírus („HÍV”) és a herpes családba tartozó vírusok, ideértve a herpes zostert (bárányhimlő), a herpes simplex vírus I-et és Π-t, a citomegalovírust, az Epstein-Barr vírust, és a nemrégiben izolált Herpes VI vírust, és (b) a bakteriális nukleinsav, mint a Clamydia, Mycobacterium tuberculosis, stb. detektálása és/vagy mennyiségi meghatározása.

A találmány szerinti használatban a „nem specifikus hibridizáció” kifejezés azokra az esetekre vonatkozik, amikor az első polinukleotid egy szegmentje, mely egy szelektált második polinukleotid egy szegmentjéhez akar hibridizálódni egy harmadik polinukleotidhoz hibridizálódik téves eredményt kiváltva, azaz olyan helyzetet teremt, ahol ajelölő a cél molekula hiányában is detektálható.

A találmány szerinti használatban a „nem specifikus kötődés” kifejezést azokra az esetekre értjük, amikor a polinukleotid molekula a szilárd támasztékhoz egy olyan kölcsönhatáson keresztül kötődik - mely lehet közvetlen vagy közvetett - melybe a hibridizáció nem tartozik bele.

Az 1. ábrán bemutatott előnyben részesített megvalósulásra hivatkozva, a következő kifejezések az abban leirt hibridizációra vonatkoznak.

A „jelölőextender molekulák (LE-k)”, vagy másként „jelölőextenderek” az analit polinukleotiddal és az amplifikáló multimerrel („AMP”) szemben komplementaritást mutató régiókat tartalmaz. Ha egy preamplifikálót használunk (az ábrán nem mutatjuk) a jelölőextender molekulák ehhez a köztes fajhoz kötődnek, inkább minthogy az amplifikáló multimerhez kötődjenek közvetlenül. Ha sem preamplifikálót, sem amplifikálót nem használunk a jelölőextender molekulák közvetlenül egy a jelölőpróbában (LP) lévő szekvenciához kötődnek. így a jelölőextender molekulák olyan egyszálú polinukleotid láncok, melyek egy az analit polinukleotid szekvenciájával komplementer első L-1 nukleinsav szekvenciát, valamint egy olyan második régiót tartalmaznak, mely a jelölőpróba, az amplifikáló multimer vagy preamplifikáló egy M-l szegmentjével komplementer multimer felismerő L-2 szekvenciával rendelkezik.

A Jelölőpróbákat” („LP-k”) úgy tervezzük, hogy vagy a jelölőextenderhez, vagy ha a vizsgálatban használunk amplifikációs multimert a multimer ismétlődő oligonukleotid szegmentjeihez kötődjön. Az LP-k vagy tartalmaznak egy jelölőt, vagy úgy szerkesztjük meg, hogy egy jelölőhöz kötődjenek. így az LP-k a jelölőpróbában vagy a multimer ismétlődő oligonukleotid szegmentjeiben jelenlévő M-2 nukleinsav szekvenciával komplementer L-3 nukleinsav szekvenciát tartalmaz és kötődik, vagy úgy szerkesztettük meg, hogy kötődjön egy olyan jelölőanyaghoz, mely közvetve vagy közvetlenül egy detektálható jelet eredményez.

A „befogóextender molekulák, (CE-k)”, melyekre „befogóextenderekként” is utalunk, az analit polinukleotidhoz és a befogópróbákhoz kötődnek, melyek viszont egy szilárd támasztékot körnek. így a befogóextender molekulák olyan egyszálú polinukleotid láncok, melyek az analit szekvenciájával komplementer C -1 nukleinsav szekvenciát tartalmazó első polinukleotid szekvencia régióval, valamint egy második, a C-2 befogópróba felismerő szekvenciát tartalmazó nem komplementer régióval rendelkezik. A C-l és L-1 szekvenciák nem azonos, nem komplementer szekvenciák, melyek az analit fizikailag eltérő szekvenciáival komplementerek.

A „befogópróbák, (CP-k)” a befogóextenderekhez és egy szilárd támasztékhoz kötődnek. így, ahogy azt az 1. ábrán bemutatjuk, a befogópróbák egy CE C-2 szekvenciájával komplementer C-3 nukleinsav szekvenciával rendelkeznek és kovalensen (vagy máskülönben szorosan) kötődnek egy szilárd támasztékhoz.

Általában, az 1. ábrán bemutatott rendszert felhasználó folyadék fázisú hibridizációs vizsgálatot a következők szerint hajtjuk végre. Egyszálú analit nukleinsavat inkubálunk hibridizációs körülmények között a befogóextenderekkel és a jelölőextenderekkel. A kapott termék a befogóextenderekhez és a jelölőextenderekhez kötődő analit polinukleotid egy nukleinsav komplexe. Ez a komplex adható ezután hibridizációs körülmények között egy olyan szilárd fázishoz, melynek felszínéhez a befogópróbák kötődnek; azonban a találmány egy előnyben részesített megvalósulásában a kezdeti inkubálást a támasztékhoz kötődő befogópróba jelenlétében végzik el. A kapott termék tartalmazza a befogóextender molekulákon és a befogópróbákon keresztül a szilárd fázishoz kötött komplexet. A szilárd fázist a kötött komplexszel ezután tetszés szerint a nem kötött anyagtól szeparáljuk. Egy amplifikációs multimert, előnyösen egy fésű típusú multimert adunk a szilárd fázis analitpróba komplexhez hibridizációs körülmények között,

HU 221 237 Bl hogy lehetővé tegyük a multimer LE-k-hez való hibridizálódását; ha preamplifikáló próbákat használunk a szilárd fázis-analitpróba komplexet a preamplifikáló próbákkal inkubáljuk vagy az amplifikációs multimerrel vagy az amplifikációs multimerrel való inkubálás előtt. Ezután a kapott szilárd fázisú komplexet a nem kötött preamplifikáló és/vagy multimertől mosással szeparáljuk. Ezután a jelölőpróbákat olyan körülmények között adjuk hozzá, melyek lehetővé teszik az LE-k-hez való hibridizálódást, vagy ha amplifikációs multimert használunk a multimer ismétlődő oligonukleotid szegmentjéhez való hibridizációt. Ezután a kapott szilárd fázisú jelölt nukleinsav komplexet mossuk a nem kötött jelölt oligonukleotid eltávolítása céljából és a maradék jelölő anyagot mérjük. Meg kell említeni, hogy az 1. ábrában bemutatott alkotórészeket nem ábrázoljuk szükség szerint a skálán, valamint hogy az amplifikációs multimerek, ha használjuk ezeket, sokkal nagyobb számú ismétlődő oligonukleotid szegmentet tartalmaznak, mint ahogy mutatjuk (ahogy korábban említettük), melyek mindegyikét úgy terveztünk, hogy egy jelölőpróbához kötődjön.

Ahogy a tudomány e területén képzett szakember értékeli, a jelen találmány technikái számos egyéb vizsgálati formával együtt alkalmazhatók. Azonban az egyszerűség kedvéért a jelen technikákat az amplifikációs multimereket felhasználó korábban említett folyadék fázisú hibridizációs vizsgálattal kapcsolatban megvitatjuk, ez pedig a találmány során előnyben részesített megvalósulást képviseli. A 2-7. ábrákban számos, az ilyen vizsgálatok során keletkező háttérzaj forrás kerül illusztrálásra. Meg kell említeni, hogy ezen rajzok mindegyike egy olyan szituációt ír le, ahol a jelölést egy szilárd támasztékon detektáljuk cél hiányában. A 3., 4. és 5. ábrán sorrendben az amplifikálón molekulában, a jelölőextenderben és a jelölőpróbában jelen lévő nukleotid szekvenciák, sokkal inkább a befogópróbához kötődnek, mint a kívánt szekvenciákhoz. A 2., 6. és 7. ábrán a befogópróba megfelelően hibridizálódott a befogóextender molekulához, azonban ezután egy nem helyes molekula hibridizálódott a befogóextenderhez. A 2. ábrán az amplifikáló közvetlenül a befogóextenderhez hibridizálódott a cél molekula hiányában, míg a 6. és a 7. ábrán a jelölőpróba és a jelölőextender közvetlenül a befogóextenderhez hibridizálódott, ismét olyan helyzetet teremtve, ahol a jelölőt az analit hiányában detektáljuk. El kell fogadni, azonban hogy más ilyen hibás - azaz „nem specifikus” - hibridizáció és kötési forgatókönyv előre látható, ahol egy jel hozható létre a cél hiányában. A találmány technikái ezekkel az egyéb lehetséges háttérzaj forrásokkal is foglalkozik.

A jelen módszer elsődlegesen a számos háttérzaj forrás csökkentésére koncentrál, úgy, hogy a befogóextender és a jelölőextender próbák cél molekulával való kölcsönhatását maximálja, valamint minimalizálja a befogópróbák és a befogóextender molekulák jelölőpróbákkal, jelölőextender molekulákkal és amplifikálókkal való kölcsönhatását, megnövelve a célfüggő jel kiváltásához szükséges próbák és/vagy hibridizációs lépések számát, valamint csökkentve annak valószínűségét, hogy helytelen egységek kötődnek a támasztékhoz kötött befogópróbákhoz.

A találmány egy első megvalósulásában egy hibridizációs vizsgálatot biztosít, melyet úgy alakítunk, hogy a Tm, hőmérséklet, melyen a cél molekula „leolvad” a támasztékhoz kötött befogópróbákról (azon hőmérsékletként definiáljuk, melyen a cél molekula/befogóextender/befogópróba komplexben részt vevő egyedi befogópróbák 50%-a a cél molekulához a továbbiakban nem kötődik) jelentősen magasabb, mint az a Tm₂, melyen az egyedi befogóextender molekula „leolvad” egy egyedüli befogópróbáról. Ez az eljárás gyakorlatilag bármilyen típusú hibridizációs vizsgálatnál alkalmazható, ahol befogópróbák és befogóextender molekulák kerülnek felhasználásra, ideértve számos folyadék fázisú hibridizációs vizsgálatot, amplifikációs vizsgálatot, szűréses hibridizációs módszereket, olyan módszereket, ahol a polimeráz lánc reakció („PCR”) szerepel, és más hasonló módszereket. Egy olyan hibridizációs vizsgálatra példa, melyben a jelen technikák hasznosak, a 4,868,105 számú US szabadalmi alkalmazásban került leírásra (Urdea et al.) vagy előnyösen, mely az 1. ábrában és a fentiek szerint leírt konfigurációval kapcsolatban került leírásra. Ezt a módszert előrebocsátjuk a hibrid komplexek tervezésénél és megszerkesztésénél, hogy az olvadási hőmérséklet - Tm, - melyen az analit a befogópróbától disszociál a befogópróba-befogóextender-analithibridben legalább 5 °C fokkal magasabb, előnyösen legalább 10 °C fokkal magasabb, mint az az olvadási hőmérséklet - Tm₂ melyen a befogóextender disszociál egy befogópróbáról egy befogópróba-befogóextender hibridben.

Ezt a stabilitási különbséget használjuk ki a vizsgálatban úgy, hogy a vizsgálat során legalább egy lépést olyan szigorú körülmények között hajtunk végre, mely a Tm, komplex képződésnek kedvez, a Tm₂ komplex képződésnek azonban nem. A szigorúság úgy szabályozható, hogy a lépés termodinamikai változó paraméterét megváltoztatjuk. Az ilyen változók jól ismertek a tudomány e területén, és ezek közé tartozik a formamidkoncentráció, a sókoncentráció, a kaotróp sókoncentráció, a pH (hidrogén ionkoncentráció), a szerves oldószer tartalom, valamint a hőmérséklet. A „kaotróp só” kifejezés egy olyan sóra utal, mely hidrofób kötés törőként működik, ideértve a trihaloacetátot, az izotiocianátot és a perklorátot. Hamaguchi et al., J. Am. Chem. Soc. (1962) 84:1329-1338. Egy előnyben részesített szigorúsági szabályozó a hőmérséklet: legalább egy vizsgálati lépést a Tm, és Tm₂ hőmérsékletek közötti hőmérsékleten végzünk el; még előnyösebben a két hőmérséklet közötti középső hőmérséklet érték körül. Egy előnyben részesített lépés, melyen a szigorúságot megvalósítjuk, a vizsgálat során lévő kezdeti hibridizáció, melyben a célt a befogóextender molekulákkal és a támasztékhoz kötött befogópróbákkal inkubáljuk. így egy előnyben részesülő megvalósulásban a kezdeti hibridizációs lépést olyan hőmérsékleten valósítjuk meg, ami a Tm₂ értéknél magasabb, azonban a Tm, értéknél alacsonyabb. Mivel a nem specifikusan hibridizálódott molekulák a befogópróbán és a befogó9

HU 221 237 Β1 extender molekulákon keresztül kötődhetnek (ahogy azt a 2., 6. és 7. ábrákon bemutattuk) ez a módszer szignifikánsan csökkenti a nem specifikus hibridizáció bizonyos típusait.

A tudomány e területén jól képzett szakember számára könnyen nyilvánvaló, hogy minél nagyobb a Τηη és Tm₂ közötti hőmérséklet különbség, annál nagyobb ezen technika „hatékonysága” a háttérzaj megszüntetésében. így a tudomány e területén képzett szakember számára felismerhető, hogy a 10 °C foknál, sőt az 5 °C foknál kisebb hőmérséklet különbségek szintén lehetővé teszik a háttérzaj csökkentését, bár kisebb mértékben. Az ilyen szituációkban a hatékonyság úgy növelhető, hogy növeljük a megfelelő szigorúságú lépések számát, vagy megismételjük az egyszeri szigorú lépést.

Előnyösen, a módszert úgy hajtjuk végre, hogy legalább két különböző befogóextender molekulát használunk, melyek mindegyike az analit egy eltérő szegmentjét köti. A befogóextender molekulák tartalmaznak egy az analit egy szegmentjével komplementer első nukleotid szekvenciát és egy a befogópróbával komplementer második nukleotid szekvenciát. Ezen vizsgálatnak két fő topológiai megvalósulása van.

A vizsgálati konfiguráció első megvalósulása, melyben két különböző befogóextender molekulát használunk, a 8. és a 9. ábrán kerül bemutatásra. Ebben a megvalósulásban a két eltérő befogóextender különböző első nukleotid szekvenciával rendelkezik, melyek az analit különböző, de szomszédos szegmentjeivel komplementerek, valamint rendelkeznek eltérő második nukleotid szekvenciákkal, melyek egy egyedüli befogópróba eltérő szegmentjeivel komplementerek. A „CE1” és a „CE2” képviseli a két eltérő befogóextender molekulát, melyek keresztszerű szerkezetben helyezkednek el, oly módon, hogy az egyes extender molekulák a cél szomszédos, de eltérő szegmentjeihez hibridizálódnak valamint egy egyedüli befogópróba szomszédos, de eltérő szegmentjeihez.

A 9. ábrán bemutatottak szerint, a befogópróbát úgy szerkesztettük meg, hogy tartalmaz (1) egy az első befogóextenderben (CE1) a C-3 nukleotid szekvenciához kötődő első C-l nukleotid szekvenciát; és (2) egy eltérő C-2 nukleotid szekvenciát, mely a második CE2 befogóextender próbában a C-4 nukleotid szekvenciához kötődik. Ezután a CE1 és a CE2 az analit molekula eltérő, átfedésben nem lévő szegmentjeihez hibridizálódik. Előnyösen a C-l, C-2, C-3 és C-4 szekvenciák viszonylag rövidek, azaz kevesebb mint 30 nukleotid hosszúságúak, előnyösen körülbelül 10-15 nukleotid hosszúságúak. A C-l és C-2 lehet közvetlenül szomszédos vagy egy spacer régió által elválasztott. Továbbá, előnyben részesül, ha a befogópróba befogóextender molekulákhoz való kötődése (azaz, a C-l:C-3 és a C-2:C-4) viszonylag gyenge (T_m kisebb mint 55 °C hőmérséklet), míg a befogópróbák befogóextender molekulákon keresztüli célhoz való kötődése sokkal erősebb (T_m65 °C hőmérsékletnél nagyobb). Ez lehetővé teszi, hogy a cél molekula a szilárd támasztékhoz sokkal nagyobb stabilitással kötődjön, 100-1000-szeresen erősebben, mint a befogóextender molekulák. Ez a módszer azt is lehetővé teszi, hogy kevesebb befogópróbát használjunk, mely viszont a nem specifikus hibridizáció valószínűségét csökkenti, ahogy azt a 3., 4. és 5. ábrán bemutattuk. Ezt a vizsgálatot a kísérleti részben példaként bemutatjuk az 1. és a 2. példákban.

A tudomány e területén képzett szakemberek elfogadják, hogy a 8. ábrán bemutatott kereszt alakú forma csupán a példa célját szolgálják és a két vagy több befogóextender molekulát használó alternatív vizsgálati konfiguráció is alkalmazható. Az egyetlen követelmény az, hogy a vizsgálatot úgy szerkesszük meg, hogy a cél a szilárd támasztékhoz a befogópróbához kötődő befogóextenderek olvadási hőmérsékleténél nagyobb hőmérsékleten kötődjön. A tudomány e területén képzett szakember azt is elfogadja, hogy a 9. ábra megvalósulása hasonlóképpen jó ha C-l és C-2 a két befogóextenderben lévő C-3 és C-4 azonos szekvenciákkal komplementer azonos befogópróba szekvenciák: ebben az esetben a befogópróba a C -1 ismétlődő szekvencia két kópiáját tartalmazza.

Ezen vizsgálati konfiguráció egy második megvalósulása, melyben két eltérő befogóextender molekulát használunk, a 10. ábrán kerül bemutatásra. Ebben a megvalósulásban a két vagy több (előnyösen háromnál több) eltérő befogóextender az analit eltérő, de szomszédos szegmentjével komplementer eltérő első nukleotid szekvenciával rendelkezik, valamint rendelkezik egy második nukleotid szekvenciával, mely egy befogópróbában lévő szegmenttel komplementer. Ebben a megvalósulásban csupán egy befogóextender kötődik befogópróbánként. Ha a vizsgálatban az összes befogópróba egy olyan egyedüli szekvenciát tartalmaz, mely befogóextenderekhez kötődik, akkor a befogóextenderek mind ugyanazzal a második nukleotid szekvenciával fognak rendelkezni, mely a befogópróba kötőszegmentjével komplementer. Másik lehetőségként, a vizsgálatban a befogóextenderekhez kötődő többszörös szekvenciákat tartalmazó eltérő befogópróbák kerülnek felhasználásra, mely esetben a befogóextenderek eltérő második nukleotid szekvenciákkal rendelkeznek.

így a 10. ábrán, a „CE3”, „CE4” és a „CE5” három különböző befogóextendert képvisel, oly módon, hogy az egyes befogóextenderek eltérő, a cél különböző szegmentjeihez hibridizálódó első nukleotid szekvenciákat tartalmaznak. A CE3 és CE4 tartalmaz egy második C-6 - nukleotid szekvenciát, mely a C-5 nukleotid szekvenciához kötődik a CP1 első befogópróbában; míg a CE5 egy eltérő második nukleotid szekvenciát C-8 - tartalmaz, mely a CP2 második befogópróbában lévő C-7 nukleotid szekvenciához kötődik. Könnyen látható a két vagy több ilyen befogóextender kombinációja felhasználható ebben a vizsgálatban.

Ezen technika egy másik variációja két vagy több eltérő jelölőextender molekula használatát foglalja magában, melyek mindegyike a célhoz kell kötődjön ahhoz, hogy az amplifikáló próba kötődjön. Ezt a vizsgálatot alapjában véve a fent leírtak szerint hajtjuk végre az 1. ábrára való tekintettel; azonban, ahogy már említettük, legalább két eltérő jelölőextender molekula vesz

HU 221 237 Bl részt ebben a vizsgálatban. A jelölőextenderek tartalmaznak egy az analit egy szegmentjével komplementer első nukleotid szekvenciát és egy amplifikációs multimerrel (vagy preamplifikálóval, ahogy az alábbiakban megvitatjuk) komplementer második nukleotid szekvenciát.

Ebben a vizsgálati konfigurációban, melyben két különböző jelölőextendert használunk, ahogy azt a 11. ábrán bemutattuk. Ebben a megvalósulásban a két különböző jelölőextender az analit különböző de szomszédos szegmentjeivel komplementer eltérő első nukleotid szekvenciát tartalmaz, valamint egy egyedüli amplifikációs multimer különböző szegmentjeivel komplementer eltérő második nukleotid szekvenciákat. Az „LEI” és „LE2” képviseli a kereszt formájú szerkezetben elhelyezkedő két különböző jelölőextendert, oly módon, hogy az egyes extender molekulák a cél szomszédos, de eltérő szegmentjeihez hibridizálódnak, valamint egy egyedüli amplifikációs multimer szomszédos, de eltérő szegmentjeihez. Ezt a vizsgálatot a kísérleti részben a 2. példában mutatjuk be.

Ahogy all. ábrában is bemutatjuk, az amplifikációs multimer olyan szerkezetű, hogy tartalmazzon: (1) egy az LEI első jelölőextender C-3 nukleotid szekvenciájához kötődő C-l első nukleotid szekvenciát; és (2) egy az LE2 második jelölőextenderben a C-4 nukleotid szekvenciához kötődő eltérő C-2 nukleotid szekvenciát. Ezután az LEI és az LE2 az analit molekula eltérő, nem átfedő szegmentjeihez hibridizálódik. Előnyösen, a C-l, C-2, C-3 és C-4 szekvenciák viszonylag rövidek, azaz kevesebb, mint körülbelül 30 nukleotid hosszúságúak, előnyösen 10-15 nukleotid hosszúságúak. A C-l és C-2 lehet közvetlenül szomszédos, vagy egy spacer régió által elválasztott. Továbbá, előnyös, ha az amplifikációs multimer jelölőextender molekulákhoz való kötődése (azaz a C-l:C-3 és C-2:C-4) viszonylag gyenge (a Tm kevesebb, mint körülbelül 45 °C hőmérséklet), míg az amplifikációs multimer jelölőextender molekulákon keresztüli célhoz való kötődése sokkal erősebb (T_m nagyobb, mint körülbelül 65 °C hőmérséklet). Ez lehetővé teszi, hogy a cél molekula az amplifikációs multimerhez sokkal nagyobb stabilitással kötődjön, 100-1000-szeresen erősebben, mint s jelölőextender molekulák. Ahogy a korábbi módszerben, ahol legalább két befogóextender molekula kerül felhasználásra, a vizsgálati specifitást a további hibridizációs lépésen keresztül növeljük, mely szükséges a célfüggő jel létrehozásához.

A tudomány e területén képzett szakember elismeri, hogy all. ábrán bemutatott kereszt formájú konfiguráció csupán példaként szolgál és alternatív két vagy több jelölőextender molekulát felhasználó más vizsgálati konfigurációk is felhasználhatók. Az egyetlen követelmény az, hogy a vizsgálatot úgy kell megszerkeszteni, hogy a cél az amplifikációs multimerhez az amplifikációs multimert kötő jelölőextenderek olvadási hőmérsékleténél magasabb olvadási hőmérsékleten kötődjön. A tudomány e területén képzett szakember elfogadja azt is, hogy ez a megvalósulás egyformán jól működik ha C-l és C-2 az azonos C-3 és C-4 szekvenciákkal komplementer azonos amplifikációs multimer szekvenciák a két jelölőextenderben: ebben az esetben az amplifikációs multimer a C-1 ismétlődő szekvencia két kópiáját tartalmazza. El kell fogadni a továbbiakban azt is, hogy a korábbi leírás egy preamplifikáló esetében is alkalmazható (ahogy azt az alábbiakban bemutatjuk), ahol a jelölőextenderek a kereszt alakú szerkezetben sokkal inkább a preamplifikálóval lépnek kölcsönhatásba, mintsem közvetlenül az amplifikációs multimerrel.

A találmány egy másik megvalósulásában, a céltól független jel létrehozás jelenségét vizsgáljuk azáltal, hogy szomszédos amplifikáló molekulákat hidalunk át oly módon, hogy csökkentjük gyakorlatilag az összes elméleti vizsgálati hátteret, ideértve a jelölőextender molekulák befogópróbákhoz és befogóextender molekulákhoz való nem specifikus hibridizációját, az amplifikációs multimereket befogópróbákhoz és befogóextender molekulákhoz való nem specifikus hibridizációját valamint az amplifikáló nem specifikus kötődést. Ebben a megvalósulásban, két eltérő amplifikációs multimert használunk, melyeket AMP 1-nek és AMP2-nek jelölünk a 12. ábrán, valamint két különböző jelölőextender molekulát, melyeket LE 1-nek és LE2nek jelölünk. Sem az AMP1 sem az AMP2 nem tartja meg a jelölőt, hacsak nincsenek egymástól áthidalható távolságra, így sokkal nagyobb a valószínűsége annak, hogy az amplifikálók valójában a cél molekulához kötődnek a jelölés bekövetkezte előtt. Ezt úgy érjük el, hogy olyan jelölőpróbákat biztosítunk, melyek tartalmaznak (1) egy az AMP1 ismétlődő oligonukleotid alegyégeiben lévő régióval komplementer nukleinsav szekvenciát tartalmazó L-l első nukleinsav szekvenciát; és (2) egy az AMP2 ismétlődő alegységeiben lévő régióval komplementer nukleinsav szekvenciát tartalmazó L-2 második nukleinsav szekvenciát; és (3) a kettő között egy detektálható jelet. L-l, L-2 és az amplifikáló próbákban a megfelelő komplementer szekvenciák úgy kerülnek szelektálásra, hogy az amplifikáló próbákból és a jelölőpróbákból létrejött komplex olvadási hőmérséklete előnyösen legalább 10 °C fokkal magasabb legyen, mint a jelölőpróba és egy egyedüli amplifikációs multimer között létrejött komplex olvadási hőmérséklete. Az is érthető, hogy egy ilyen konfiguráció a korábban megvitatott olyan előnyökkel jár együtt, ami a detektálható jel létrehozásához szükséges többszörös próbák és a következő további hibridizációs lépések használatából adódik.

Ezen megvalósulás egy variációjában két vagy több különböző jelölőpróbát használhatunk, melyek vagy két különböző típusú jelölőt tartalmaznak, ahogy azt a 13. ábrán bemutatjuk, vagy egy jelölő egy inaktív szegmentjét tartalmazzák, melyet azután egy szomszédos amplifikáló molekulán lévő jelölőpróbával való konjugáció aktiválunk. Az ezen többszörös amplifikáló, többszörös jelölőpróba megvalósulásra szolgáló példák közé tartoznak azok, ahol a szomszédos jelölőpróbák tartalmaznak: (a) egyedi alegységeket, egy enzim tagjait, vagy részeit, mint például béta- galaktozidázt; (b) egy enzimet és egy megfelelő koenzimet (mint például flavoenzimet és a FADH-ot vagy egy NAD-kötő dehid11

HU 221 237 Β1 rogenázt és NADH-t); vagy (c) a csatorna rendszer vagy a levezetési rendszer egy részét képző enzimeket, ahol egy enzim terméke a második enzim szubsztrátja (mint például a zsírsav szintetáz rendszer). Minden esetben a két jelölőpróba olyan eltérő egységeket tartalmaz, melyek nem termelnek detektálható terméket, hacsak nem hozzuk ezeket egymáshoz közel egy cél jelenlétén keresztül, így az amplifikáló áthidaláson keresztül.

Az összes korábban említett megvalósulás egy változatában preamplifikáló molekulákat használunk az összes korábban említett megvalósulásban a jel fokozása céljából. Preamplifikálókat adunk a vizsgálati reakcióhoz vagy egyidejűleg, vagy az ampliftkációs multimerek hozzáadása előtt.

Ahogy korábban már utaltunk rá, a háttérzaj egy elsődleges okozója, azaz olyan jelek, melyek a cél molekulától függetlenül jönnek létre és detektálhatok, a támasztékhoz kötött befogópróbáktól származik, és az a tény, hogy a befogóextender molekuláktól eltérő polinukleotidok ezekhez kötődhetnek. A találmány további megvalósulásai ebből a felismerésből erednek. Először, a korábbiakban leírtakhoz hasonló hibridizációs vizsgálatokban használt szilárd támasztékok olyan konfigurációjúak, hogy a befogópróbák rövidebbek, tipikusan 20 nukleotidnál rövidebbek, még tipikusabban körülbelül 15 nukleotid hosszúságúak. Másodszor, az 1. ábrán bemutatott C-2 szekvenciával azonos szekvenciákat tartalmazó oligonukleotidokat felhasználjuk a vizsgálatban; az ilyen oligonukleotidok kompetitorokként funkcionálnak a befogópróbákhoz és így csökkentik az elérhető befogópróba hibridizációs helyek számát (az 1. ábrán a C-3). Ezt az 1. példában mutatjuk be.

Kísérleti rész

A jelen találmány gyakorlatában, hacsak másként nem jelezzük, hagyományos szintetikus szerves kémiát, biokémiát, molekuláris biológiát és más hasonló módszereket használva alkalmazzuk, melyek a tudomány e területén képzett szakember számára ismertek. Az ilyen technikák teljes körűen bemutatásra kerültek az irodalomban. Lásd, például Sambrook, Fritsch & Maniatis Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989); Oligonucleotid Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1984) valamint a Methods in Enzymology sorozat (Academic Press, Inc.). Az összes supra és inffa említett szabadalom, szabadalmi alkalmazás és publikáció a hivatkozás révén részét képezi a találmánynak.

El kell fogadni, hogy míg a jelen találmányt az előnyben részesített specifikus megvalósulásokkal kapcsolatban írjuk le, valamint a fenti leírás és az ezt követő példák csupán illusztratív cél szolgálnak és nem a találmány körét szándékozzák korlátozni. Más a találmány körébe tartozó aspektusok, előnyök és módosítások egyértelműek lesznek a tudomány olyan területén képzett szakember számára, melyhez a találmány tartozik.

A következő példákban a pontosság biztosítása céljából a számokat tekintve pontosságra törekedtünk (például a mennyiség, hőmérséklet stb), azonban bizonyos kísérleti hibákat és eltéréseket figyelembe kell venni. Hacsak másként nem jelezzük a hőmérsékletet °C fokban adtuk meg és a nyomás a légköri nyomás értékhez közeli.

1. példa

Különböző „kereszt”formájú befogóextendereket felhasználó amplifikációs vizsgálat

Ez a példa egy olyan hibridizációs vizsgálatot ír le, melyben két vagy több különböző befogóextender kerül felhasználásra, amint azt a 8. ábrán bemutattuk. Ezen kísérleti munka célja az, hogy csökkentsük a szilárd támasztékhoz kötődő befogóextender próba által okozott háttérjeleket. Azzal, hogy csökkentjük a befogóextender próbák támasztékhoz való kötődésének képességét, a cél polinukleotidot arra kényszerítjük, hogy többszörös befogóextender próbákon keresztül kötődjön, abból a célból, hogy stabilan kötődjön a támaszték felszínéhez, olyan vizsgálati hátteret eredményezve, mely olyan alacsony mintha a vizsgálatot a befogóextender próbák nélkül füttatnánk (azaz, ez azért van, mert alapjában véve a támasztékhoz nem kötődne befogóextender molekula). Az ezen példában összefoglalt kísérleti munka azt mutatja, hogy amikor az immobilizált befogópróbához versenyképesen kötődni képes molekulákat adunk hozzá lehetőség van a háttér még további csökkentésére, mivel annak valószínűsége, hogy a jelölőextender molekulák vagy a jelölőpróbák az immobilizált befogópróbán keresztül kötődnek a támasztékhoz jelentősen csökkent.

Egy CP2 jelölésű befogópróbát csatlakoztatunk a szilárd támasztékhoz. Két pár HCV befogóextender molekulát tervezünk.

Az egyes párok első tagja a CP2 befogópróba utolsó 16 nukleotidjával komplementer 5’ szekvenciával rendelkezik, és az egyes párok második tagja a CP2 első, 13 nukleotidjával komplementer 3’ szekvenciával rendelkezik. így az extenderek a 8. ábrán bemutatott módon tudnak a szilárd támasztékhoz kötődni. Ezek összeköthetik a szomszédos CP2 molekulákat (mint a 10. ábrán lévő cél, melyet a 3-mas, 4-es és 5-ös CE-ken keresztül fogtunk be két különböző CP molekulához) vagy egy egyedüli CP2-vel egy kereszt alakot hozhatnak létre (mint a 9. ábrán látható cél, mely az 1es és a 2-es CE-ken keresztül kötődik, ugyanahhoz a CP molekulához). Mivel a próbákat optimálisan úgy terveztük, hogy kereszt formákat hozzanak létre és mivel a befogópróba koncentrációt alacsony szinten tartjuk, a kereszt forma kinetikailag előnyben részesül a két szomszédos CP2 molekula áthidalásával szemben, a kereszt formáról pedig így véljük, hogy egyensúlyi megoszlásnál túlsúlyban van.

Egy egyedüli amplifikációs (felerősítési) folyadék fázisú nukleinsav szendvicshibridizációs vizsgálati formát alkalmazunk ebben a példában. A jel amplifikációt egy elágazó DNS multimeren (amplifikáló) keresztül hozzuk létre, mely egy a jelölőextender próbák egy szegmentjéhez hibridizáló első szegmentet tartalmaz az (F) szegment 15 ismétlésében, ahol az F három jelölt oligonukleotidhoz hibridizálódik. A cél nukleinsav a

HU 221 237 BI szilárd támasztékhoz egy immobilizált befogópróbán és egy befogóextender próbán keresztül kötődik, mely a befogópróbához és a célhoz is hibridizálódik. Az amplifikáló multimer az immobilizált célhoz egy jelölőextender próbán keresztül kötődik, mely a célhoz 5 és az amplifikáló multimerhez is hibridizálódik. A háttér csökkentéshez két versengő próbát is felhasználunk. Ezek a próbák kötődnek a befogópróbához.

Az ezen vizsgálatban alkalmazott befogóextender próbák, a jelölőextender próbák és a versengő próbák az alábbiak szerinti:

Szekvencia (5’->3’) Befogóextender próbák (az immobilizált befogópróbához kötődő szegmentet aláhúzással jelöljük):

1: (1. számú szekvencia)

TTTCAGCAATCAGGTGTTCTCGTCCTGGCAATTCCGGTGTACTCACCGGTTC

2: (2. számú szekvencia)

TTTCAGCAATCAGGTGTTCTCWTTCCGGCGATTCCGGTGTACTCACCGGTTC

3: (3. számú szekvencia)

GTATTGAGCGGGTTKMTCCAAGAAAGGACCCGGTCGGCTCTGGGAC

4: (4. számú szekvencia)

GCATAGAGTGGGTTWATCCAAGAAAGGACCCAGTCGGCTCTGGGAC

5: (5. számú szekvencia)

TTTCAGCAATCAGGTGTTCAGCAGTCTTGCGGGGGCACGCCCAAATCTCCAG

6: (6. számú szekvencia)

TTTCAGCAATCAGGTGTTCAGTGATCTTGCGGGGGCGTGCCCAAATCTCCAG

7: (7. számú szekvencia)

TTTCAGCAATCAGGTGTTCAGCAGTCTCGCGGGGGCACGCCCAAATCTCCAG

8: (8. számú szekvencia)

TTTCAGCAATCAGGTGTTCAGCAGTCTTGCGGGGGCACGCCCAAATGGCTGG

9: (9. számú szekvencia)

TTTCAGCAATCAGGTGTTCAGTGATCTCGCGGGGGCACGCCCAAATTTCTGG

10: (10. számú szekvencia)

ACAAGGCCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCTTCGGCTCTGGGAC

11: (11. számú szekvencia)

ACAAGGCCKTTCGCAACCCAACGCTACTMGGCTTCGGCTCTGGGAC

A felhasznált jelölőextender próbák (az amplifikáló multimerhez hibridizáló szekvenciát aláhúzással jelöljük):

12: (12. számú szekvencia)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTTCCTCACAGGGGAGTGATTCATGGTGGAGTGTC

13: (13. számú szekvencia)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTATGGCTAGGCGCTTTCTGCGTGAAGACAGTAGT

14: (14. számú szekvencia)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTKCCTGGAGGCTGTACGASACTSGTACTAGCGCC

15: (15. számú szekvencia)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTCGCAGACCACTATGGCTCTCCCGGGAGGGGGGG

16: (16. számú szekvencia)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACC

HU 221 237 Β1

17: (17. számú szekvencia)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTTGTGCTCATGK.TGCACGGTCTACGAGACCTCCC

Kompetitor próbák (ezek a szekvenciák hibridizalodnak az ι

18: (18. számú szekvencia)

TCGGCTCTGGGAC

19: (19. számú szekvencia)

CAGCAATCAGGTGTTC ízalt befogóprobahoz):

A vizsgálathoz a lemezeket a következők szerint burkoljuk: White Microlite 1 removawell csík (polisztirén mikrotiter lemezek, 96 üreg/lemez), melyet a Dynatech Inc.-tői vásároltunk.

Az egyes üregeket 250 pl IN HCl-dal töltjük fel és 15 szobahőmérsékleten 15-20 percig inkubáljuk. Ezután a lemezeket 1-szer mossuk lx PBS-sel majd az üregeket levegőztetéssel kiszárítjuk. A lemezeket ezután 250 pl IN NaOH-dal töltjük föl, majd szobahőmérsékleten 15-20 percig inkubáljuk. Ekkor a lemezeket há- 20 romszor ismét 1 x PBS-sel mossuk, és az üregekből a folyadékot levegőztetéssel távolítjuk el.

A poli(phe-lys)-t a Sigma Chemicals Inc.-tői vásároljuk. Ezen peptid phe: lys moláris aránya 1:1 és átlagos molekulasúlya 47900 gm/mol. Átlagos hosszúsága 25 309 aminosav és molekulánként 155 amint tartalmaz.

A polipeptidet 2 M NaCl/1 χ PBS-sel elegyítjük, így a végső koncentráció 0,1 mg/ml, a pH-érték 6,0. Ezen oldat 200 pl mennyiségét adjuk az egyes üregekhez. Ezután a lemezt műanyagba csomagoljuk a kiszáradás 30 megakadályozása céljából és 30 °C hőmérséklet egy éjszakán keresztül inkubáljuk. Ezután a lemezt háromszor mossuk lx PBS-sel, majd a folyadék eltávolítása céljából az üregeket levegőn megszárítjuk.

Az 50 mM nátrium foszfátban (pH = 7,8) lévő 35 5 ’ - XGTCCC AGAGCCG AG A AC ACCTG ATTGCT G-3’ (20. számú szekvencia) (X az 5-metilcitidin hosszú láncú amin módosított nukleotid (N⁴-(6-aminokaproil-2-aminoetil))származéka) oligonukleotid (CP2 befogópróba) 250 OD₂₆₀ egység/ml mennyiségéhez 180 mg bis-(szulfoszukcinimidil)-szubsztrátot (BS³) adunk. Az elegyet keverjük és szobahőmérsékleten 30 percig inkubáljuk. 10 mM nátrium-foszfáttal ekvilibrált Pharmacia Sephadex G-25, NAP-25 gél szűréses oszlopot használunk az aktivált oligonukleotid tisztításához. Az aktivált oligonukleotid reakció keveréket az oszlopra helyezzük, majd hagyjuk átszűrődni.

Az eluátumot összegyűjtjük és a következő lépésben való alkalmazáshoz félretesszük. Az eluátum koncentrációját 3,7xlO ² OD₂₆₀ egység/ml értékre állítjuk 50 mM nátrium foszfátot (pH=7,8) használva a hígításhoz.

Az aktivált oligonukleotidot tartalmazó eluens 100 pl mennyiségét hozzáadjuk az egyes üregekhez és ezeket 4 °C hőmérsékleten 12-18 órán keresztül inkubáljuk. A lemezt ezután kétszer mossuk 1 x PBS-sel, majd a folyadék eltávolítása céljából levegőztetéssel megszárítjuk.

0,1 súlyszázalék SDS-t tartalmazó 0,2 N NaOH 250 pl mennyiségét adjuk az egyes üregekhez. A lemezt műanyagba csomagoljuk és 65 °C hőmérsékleten 60 percig inkubáljuk. A lemezt ekkor háromszor mossuk 1 χ PBS-sel, majd az üregekből a folyadékot levegőn való szárítással eltávolítjuk.

0,4 mg/ml BS³-at tartalmazó pH 7,8 értékű 50 mM nátrium-foszfát 100 pl mennyiségét adjuk az egyes üregekhez, majd 12-18 órán keresztül inkubáljuk. Ekkor a lemezt kétszer mossuk lx PBS-sel és egyszer vízzel. A lemezt desszikánst tartalmazó műanyag tartóban tároljuk 4 °C hőmérsékleten. Az amplifíkáló multimert az alábbiak szerint állítjuk elő:

Az oligonukleotidok összes kémiai szintézisét egy automata DNS szintetizálón (Applied Biosystems, Inc. (ABI) 380 B model) állítjuk elő. A béta-cianoetil típus foszforamidit kémiáját alkalmazzuk beleértve az 5’foszforilálást, melyhez PHOSTEL reagenst [DMT-O-CH₂CH₂-(SO₂)-CH₂CH₂-O-P(N(iPr)₂) (-O-CH₂CH₂CN] használjuk, melyben a DMT dimetoxitritilt és az iPr izopropilt jelent. Standard ABI protokollokat használunk, hacsak másként nem jelezzük. Ahol jelezzük, hogy egy többszöri ciklust alkalmazunk (például 1,2 ciklust) az ABI által javasolt standard amidit mennyiség többszörösét használjuk az adott ciklusban.

A következő szerkezet fésű testét készítjük el először:

’ -TCCGTATCCTGGGC AC AGT, ₈(TTX’ )₁₄- 5 ’

I (GTCAGTp-5’)₁₅ ahol X’ egy elágazó monomer és p egy foszfát.

A fésű test részét a 14 (TTX’) ismétlésen keresztül szintetizáljuk először 33,8 mg aminopropilszármaztatott timidin szabályozott pórusos üveget (CPG) használva (2000 á, 7,4 mikromol timidin/g támaszték) 1,2 ciklusú protokollal. Az elágazó oldal nukleotid a X szerkezettel rendelkezik.

A fésű test (az oldallánc nyúlványokat, nem beleszá55 mítva) szintéziséhez a béta-ciano-etil-foszfor-amidit monomerek koncentrációja 0,1 M az A, C, G és T esetében és 0,15 M az XI elágazási oldal monomer esetében. A detritilálást metilén kloridban lévő 3% triklórecetsavval végezzük el lépcsőzetes átfolyást használva a deprotektálás időtartama alatt.

HU 221 237 Β1

A 3’-GTCAGTp képletű hatbázisos oldallánc extenziót az alábbiak szerint szintetizáljuk az egyes elágazási monomer helyeken. Az oldallánc extenziókat a terminális X’ elágazási helyre szintetizáljuk. A levulinil csoport eltávolítása céljából piridin/jégecet (1:1 v/v) elegyében lévő 0,5 M hidrazin oldatot adunk hozzá és a CPG támasztékon hagyjuk 90 percig, minden 15 percben a folyadékot felújítjuk piridin/jégecet (1:1 v/v) elegyével, majd acetonitrillel való erőteljes mosással. Deprotektálás után a hatbázisú oldallánc extenziókat hozzáadjuk 6,4 ciklust alkalmazva.

Ezekben a szintézisekben a foszforamidit koncentrációja 0,1 M (a 0,2 M Phostel foszforiláló reagenst kivéve).

A detritilálást metilén kloridban lévő 3% triklór ecetsav oldatával végezzük el folyamatos átfolyatást alkalmazva, melyet toluén/klórmetán (1:1 v/v) öblítő oldata követ. Az elágazó polinukleotid láncokat a szilárd támasztékról automatikusan a DNS szintetizálóbán választjuk le. Az ammónium-hidroxid oldatot 4 ml-es csavaros kupakú Wheaton fiolákban gyűjtjük össze, 60 °C hőmérsékleten melegítjük 12 órán keresztül az összes bázis védő csoport eltávolítása céljából. A szobahőmérsékletre való hűtés után az oldatot egy Speed-Vac evaporációs készülékben eltávolítjuk és a maradékot 100 pl vízben feloldjuk. Az oldalláncokat és az alábbi szerkezetű templát/kötőt szintén az automata szintetizáló felhasználásával állítjuk elő:

Oldallánc:

’ - G ATGCG(TTC ATGCTGTTGGTGTAG)₃ - 5 ’ (21. számú szekvencia)

A kötődő oldallánc extenziók ligációs templátja: 3’-CGCATCACTGAC-5’ (p) (22. számú szekvencia)

A nyers fésű testet egy standard poliakrilamid gél (7% 7 M karbamid és 1 xTBE futtató puffer) módszerrel tisztítjuk.

Az oldalláncokat a fésű testhez az alábbiak szerint ligáljuk. 4 pmol/μΐ fésű testet, 93,75 pmol/μΐ oldalláncot és 75 pmol/μΐ oldallánc kötő templátot vegyítünk 1 mM ATP/5 mM DTT/50 mM Tris-HCl (8,0 pH)/10 mM MgCl₂/2 mM spermidin elegyében. Az elegyet vízfürdőben 95 °C hőmérsékletre hevítjük, majd lassan 35 °C hőmérséklet alá hűtjük 1 órás időtartam alatt. A keverék alkotórészeinek koncentrációit 2 mM ATP-re, 10 mM DTT-re, 14% polietilénglikolra állítjuk, majd 0,2 egység/pl T4 DNS ligázt adunk az elegyhez. Az elegyet 16-24 órán keresztül 23 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A DNS-t NaCl/etanol elegyében kicsapatjuk és vízben újraoldjuk. A ligációs termékeket ezután poliakrilamid gél elektroforézissel tisztítjuk.

A hibridizációs vizsgálatot az alábbiak szerint végezzük el.

Célként egy szintetikus 615 nukleotidból álló transzkriptet állítunk elő a HCV J1 klón 54-668 nukleotidjait tartalmazó pGEM (Promega) vektort és az SP6 RNS polimerázt használva. A negatív kontroll nem volt cél.

A minta készítmény az egyes üregekbe való 200 pl 0,07 M Tris-HCl-ben, pH=8,0 lévő 2 mg/ml K proteináz/0,7 M LiCl/0,06 M nátrium foszfát/0,06 M EDTA, pH=7,0/0,7% SDS/50 ffnol befogóextender próba (mindegyik)/200 fmol jelölőextender próba (mindegyik)/5 000 fmol kompetitor próba (mindegyik) elegy ének hozzáadásával készül. A különböző kontroll vizsgálatok különböző koncentrációjú próbákat tartalmaz, ahogy azt az alábbiakban bemutatott eredmény táblázatban látható. A lemezeket rázzuk az üregek tartalmának összekeverése céljából, lefedjük és 16 órán keresztül 63 °C hőmérsékleten inkubáljuk.

További szobahőmérsékleten való 10 perec időtartam után az egyes üregek tartalmát a folyadék eltávolítása céljából megszárítjuk és az üregeket mosó pufferrel (0,1% SDS/0,015 M NaCl/0,0015; nátrium-citrát) mossuk kétszer. Ezután az amplifikáló multimert adjuk hozzá az egyes üregekhez (a 0,48 M NaCl/0,048 M nátrium-citrát/0,1% SDS/0,5% dietil pirokarbonáttal kezelt „blokkoló reagensben” (száraz tejpor tisztított frakciója, Boehringer Mannheim, 1096 176 katalógusszám) lévő 0,7 fmol/pl oldat 50 pl mennyiségét). A lemezek lezárása, valamint az üregek tartalmának megfelelő keverése után a lemezeket 45 °C hőmérsékleten inkubáljuk 30 percig.

Egy további szobahőmérsékleten való egyperces inkubálás után a lemezeket a fent leírt módon mossuk.

Az EP 883096976 számú szabadalomban leírt alkalikus foszfatázzal jelölt próbát hozzáadjuk az egyes üregekhez (50 pl/üreg a 2,66 fmol/ml anyagból). 45 °C hőmérsékleten való 15 perces inkubálás, valamint a szobahőmérsékleten való 1 perces inkubálás után az üregeket a fent leírt módon mossuk háromszor, majd háromszor 0,015 M NaCl/0,0015; nátrium-citrát elegyével.

A Lumigen Inc.-től beszerzett, enzim hasított dioxetánt (Schaap et al., Tét. Lett. 28:1159-1162 (1987) és az EPA No 0254051) alkalmazzuk. 50 pl Lumiphos 530 (Lumigen) adunk az egyes üregekhez. Az üregeket óvatosan megütögetjük, hogy a reagens beessen az üreg aljába, majd enyhén rázzuk, hogy a reagens egyenletesen oszoljon el az üreg alján. Az üregeket lefedjük és 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 20-40 percig.

Ezután a lemezeket egy Dynatech ML 1000 luminométeren leolvassuk. Az eredmény a 250 ms alatt mért fénykibocsátás teljes integráljaként adjuk meg.

HU 221 237 Β1

1. táblázat

Vonal	Befogó extender	Kompetitor	Ccl	Relatív fény egység (Std Dcv)
1	nincs	nincs	nincs	0,47 (0,08)
2	van	nincs	nincs	0,47 (0,10)
3	van	van	nincs	0,34 (0,01)
4	van	nincs	van	38,0 (2,2)
5	van	van	van	40,2 (7,1)

A nem kereszt formájú extenderekkel tipikusan a „nem befogóextender” kontroll körülbelül kétszer kisebb háttérrel rendelkezik mint a befogóextendert tartalmazó kontroll minta. Ez azért van így, mert a molekulák (LE-k, AMP és a jelölő) a CE-k-hez kötődik. Azonban az 1-es és a 2-es sor összehasonlítása azt mutatja, hogy a kereszt alakú befogóextenderekkel a háttér ugyanolyan mint a kereszt formájú extenderek nélküli háttér. Az 1es, 2-es és a 3-as sorok összehasonlítása azt mutatja, hogy a kompetitorral le lehet csökkenteni a hátteret a nem befogóextender kontroll szintje alá. Feltehetően ez a blokkoló jelölőextender befogópróbához való kötődésének köszönhető. A 4-es és az 5-ös sorok összehasonlítása azt mutatja, hogy a kompetitor nem pályázik a cél kötésért. A cél kötést nem befolyásolják a kompetitorok, mivel a cél sokkal szorosabban kötődik a többszörös CE-ken keresztül, ami sokkal szorosabb, mint az egyedi extender próbák, vagy az egyedi kompetitorok kötődése.

2. példa „Keresztformájú ” többszörös jelölőextendereket felhasználó amplifikációs vizsgálatok

Ez a példa két különböző jelölőextendert felhasználó hibridizációs vizsgálatot ír le, a 11. ábrán bemutatottak szerint. Ezen kísérleti munka célja az, hogy csökkentsük a jelölőextenderek szilárd támasztékhoz vagy befogóextenderhez vagy befogópróba molekulákhoz való kötődéséből eredő háttérjeleket, azaz azt a típusú hátteret, mely akkor jön létre, ha a jelölőextender kötődik a támasztékhoz, oly módon, hogy nem a cél közvetíti a kötődést. Ha a jelölőextender egyszer kötődik, a preamplifikáló, az amplifikáló multimer és a jelölőpróbák (ebben a kísérletben alkalikus foszfatáz jelölőpróbákat alkalmazunk) kötődhetnek és a cél jelenlététől független jelet hozhatnak létre. Azáltal, hogy csökkentjük a jelölőextender próbák amplifikáló multimerhez való egyenkénti kötődési képességét, a preamplifikálót arra kényszerítjük, hogy a többszörös jelölőextender próbákon keresztül kötődjön, azért, hogy stabilan kötődjön a felszínhez. A preamplifikáló nem marad egy egyedüli jelölőextenderhez kötve a vizsgálat hibridizációs körülményei között. A jelölőextendereket oly módon terveztük, hogy az aplifikáló multimer kötődésének elősegítéséhez szükséges két jelölőextender egymáshoz közel helyezkedjen el, amikor a cél szekvenciához kötődnek. Egy egyedüli hibridizált jelölőextender nem kötődik hatékonyan a preamplifikálóhoz a reakció körülmények között. Ily módon a preamplifikáló kötődése csak a cél jelenlétében kedvező.

Egy PSCP jelölésű (lásd a 41. számú szekvenciát) szintetikus oligonukleotid befogópróbát rögzítünk a lemezekre. Egy sorozat HCV jelölőextender próbát tervezünk. Az egyes jelölőextenderek tartalmaznak egy a céllal komplementer T szekvencián túl egy vagy két további olyan szekvenciát (az A, B, C vagy D szekvenciák közül választjuk ki), melyek egy preamplifikáló próbához kötődnek. Ez a preamplifikáló olyan szekvenciákat (A’ és B’ vagy C’ és D’) tartalmaz, melyek kötődnek az LE-khez és az amplifikáló multimerhez kötődő szekvencia (E’) nyolc ismétléséhez.

Egy jel amplifikációs folyadék fázisú nukleinsav szendvicshibridizációs vizsgálati formát alkalmazunk ebben a példában. A jel amplifikáció egy elágazó DNS multimeren (amplifikáló) keresztül jön létre, melyet úgy tervezünk meg, hogy rendelkezzen egy a preamplifikáló (E’) egy szegmentjéhez hibridizálódó első szegmenttel (E), valamint egy F szegment 15 ismétléséhez, ahol az F szegment három alkalikus foszfatázzal jelölt oligonukleotidhoz hibridizálódik. A cél nukleinsav a szilárd támasztékhoz a befogópróbákon és számos befogóextenderen keresztül kötődik, melyek a befogópróbákhoz és a célhoz is hibridizálódik. A vizsgálatban használt befogóextender próbák, a jelölőextender próbák és a preamplifikációs próbák a következők:

Szekvencia (5’-- >3’) Befogóextender próbák (az immobilizált befogópróbához kötődő szegmentet aláhúzással je20: (23. számú szekvencia)

TCCTCACAGGGGAGTGATTCATGGTGGAGTGTCCTCTTGGAAAGAAAGTGAAGTG

21: (24. számú szekvencia)

ATGGCTAGACGCTTTCTGCGTGAAGACAGTAGTCTCTTGGAAAGAAAGTGAAGTG

22: (25. számú szekvencia)

TCCTGGAGGCTGCACGACRCTCATACTAACGCCCTCTTGGAAAGAAAGTGAAGTG

HU 221 237 Β1

23: (26. számú szekvencia)

CGCAGACCACTATGGCTCTYCCGGGAGGGGGGGCTCTTGGAAAGAAAGTGAAGTG

24: (27. számú szekvencia)

TCRTCCYGGCAATTCCGGTGTACTCACCGGTTCCTCTTGGAAAGAAAGTGAAGTG

Az alkalmazott jelölőextender próbák (a célhoz hibridizálódó szekvenciát aláhúzással jelöljük, a fentiek szerint rövi dített szekvenciát zárójelben adjuk meg):

25: (A-T) (28. számú szekvencia)

CTGAGTTTCTGGCTCGCATTGAGCGGGTTDATCCAAGAAAGGACCCGG

26: (B-T-C) (29. számú szekvencia)

ACTGAGTCAGTCAGTCAGCAGTCTYGCGGGGGCACGCCCAARTCTCCAGGAAAGTTTGAATATG

27: (A-T-D) (30. számú szekvencia)

CTGAGTTTCTGGCTCACAAGGCCTTTCGCAACCCAACACTACTCGGCTACCTACCTACCTACCT

28: (B-T-C) (31. számú szekvencia)

AGTCAGTCAGTCAGTCGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCGAAAGTTTGAATATG

29: (A-T-D) (32. számú szekvencia)

CTGAGTTTCTGGCTCYGTGCTCATGRTGCACGGTCTACGAGACCTCCCACCTACCTACCTACCT

30: (B-T-C) (33. számú szekvencia)

AGTCAGTCAGTCAGTCGTTACGTTTGKTTYTTYTTTGRGGTTTRGGAWTGAAAGTTTGAATATG

31: (T-D) (34. számú szekvencia)

CGGGAACTTRACGTCCTGTGGGCGRCGGTTGGTACCTACCTACCTACCT

A kontrolikísérlethez használt jelölőextender próbák a következők (a célhoz hibridizálódó szekvenciát aláhúzással j löljük):

:HCV.33.13 (35. számú szekvencia)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTCARGTAAACTCCACCRACGATCTGRCCRCCRCC :HCV.33.14 (36. számú szekvencia)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTRCGCACACCCAAYCTRGGGCCCCTGCGCGGCAA :HCV.33.15 (37. számú szekvencia)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTAGGTTGCGACCGCTCGGAAGTCTTYCTRGTCGC :HCV.33.16A (38. számú szekvencia)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTRCGHRCCTTGGGGATAGGCTGACGTCWACCTCG :HCV.33.16B (39. számú szekvencia)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTRCGHRCCTTGGGGATAGGTTGTCGCCWTCCACG :HCV.33.17 (40. számú szekvencia)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTYCCRGGCTGRGCCCAGRYCCTRCCCTCGGRYYG :HCV.33.18 (41. számú szekvencia)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTBSHRCCCTCRTTRCCRTAGAGGGGCCADGGRTA :HCV.33.19 (42. számú szekvencia)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTGCCRCGGGGWGACAGGAGCCATCCYGCCCACCC :HCV.33.20 (43. számú szekvencia)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTCCGGGGGTCYGTGGGGCCCCAYCTAGGCCGRGA

HU 221 237 Β1 :HCV.33.21 (44.számú szekvencia)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTCCCCATGAGRTCGGCGAAGCCGCAYGTRAGGGT

32: (46. számú szekvencia)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTGCATTGAGCGGGTTDATCCAAGAAAGGACCCGG

33: (47. számú szekvencia)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTAGCAGTCTYGCGGGGGCACGCCCAARTCTCCAG

34: (48. számú szekvencia)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTACAAGGCCTTTCGCAACCCAACACTACTCGGCT

35: (49. számú szekvencia)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACC

36: (50. számú szekvencia)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTYGTGCTCATGRTGCACGGTCTACGAGACCTCCC

37: (51. számú szekvencia)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTGTTACGTTTGKTTYTTYTTTGRGGTTTRGGAWT

38: (52. számú szekvencia)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTCGGGAACTTRACGTCCTGTGGGCGRCGGTTGGT

A felhasznált preamplifikáló próbák (az E’ szekvenciát aláhúzással jelöljük, az A’, B’, C’ és D’ kiindulási és végpontjai t kisbetűvel, a maradék szekvenciák az elválasztáshoz valók):

39: (53. számú szekvencia)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTTTTTTAGGCATAGGACCC GTGTCCGTGGATGTTTGAGGCATAGGACCCGTGTCTTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTT TTTTAGGCATAGGACCCGTGTCGCGTAGTGACTGAGGCATAGGACCCGTGTCTTTTTTAGG CATAGGACCCGTGTCTTTTTTbC -CATATTCAAACTTTC-b ’ a ’ GAGCCAGAAACTC'AGT-a ’ : (54. számú szekvencia)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTTTTTTAGGCATAGGACCC GTGTCCGTGGATGTTTGAGGCATAGGACCCGTGTCTTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTT TTTTAGGCATAGGACCCGTGTCGCGTAGTGACTGAGGCATAGGACCCGTGTCTTTTTTAGG CATAGGACCCGTGTCTTTTTTd’-AGGTAGGTAGGTAGGT-d’ c’-GACTGACTGACTGACT-c’

A vizsgálatban használt lemezeket a fentiek szerint beburkoljuk, azzal az eltéréssel, hogy a CP2 DNS szekvencia helyett a PSCP szekvenciát kötjük a lemezhez.

PSCP:

5’-XCA CTT CAC TTT CTT TCC AAG AG-3’

Az amplifikáló multimert a fentiekben leírtak szerint állítjuk elő. A hibridizációs vizsgálatot az alábbiakban leírtak szerint végezzük el.

A HCV standard görbéjét úgy készítjük el, hogy a magas titerű hepatitis C vírus mintát HCV negatív humán szérumban felhígítjuk és a hígításokból 1 500-19 500 virális ekvivalensnek megfelelő, 50 pl mennyiségeket viszünk a fentiek szerint előkészített mikrotiter lemezek egyes üregeibe.

A minta elkészítése a következőt jelenti: 150 pl P-K puffért (58 mM Tris-HCl (pH = 8,0)/0,6 M NaCl/0,06 M nátrium-citrát/12 mM EDTA (pH=8.0)/

1,3% SDS/16 pg/ml szonikált lazac sperma DNS/7% formamid/100 fmol befogóextender próba/400 fmol jelölőextender próba) adunk az egyes üregekhez. A kontroll vizsgálatban 50 mol/üreg befogóextender próbát, 160 fmol/üreg jelölőextender próbát használunk ugyanebben a pufferben. A lemezeket rázzuk, az üreg tartalmának összekeverése céljából, lefedjük és 16 órán keresztül 63 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A kontrolikísérletben a „preamplifikációs” lépés során a lemezeket 63 °C hőmérsékleten tartjuk.

Egy szobahőmérsékleten való, 10 percig tartó további inkubálás után az egyes üregek tartalmát levegőztetéssel megszárítjuk a maradék folyadék eltávolítása céljából, és az üregeket 0,1% SDS/0,015 M NaCl/0,0015 M nátriumcitrát elegyéből álló mosó pufferrel mossuk kétszer. Ezután a kontroll üregeket kivéve, az egyes üregekhez hozzáadunk 100 fmol preamplifikáló próbát (50 pl 0,75 M NaCl/0,075 M nátrium citrát/0,1% SDS/0,5% blokkoló reagens elegyében, lásd korábban, Boehringer Mannheim,

HU 221 237 Β1

1096 176 katalógusszám). A lemezeket rázatjuk, lefedjük és 30 percig 53 °C hőmérsékleten inkubáljuk.

Ezután a lemezeket a korábban leírtak szerint hűtjük és mossuk. Ezután 85 fmol amplifikáló multimert adunk hozzá az egyes üregekhez (ugyanabban a puf- 5 ferben, mint amit a preamplifikáló próbáknál használtunk). A kontroll kísérletben 30 fmol/üreg azonos pufferben lévő amplifikáló multimert alkalmazunk. A lemezek lefedése, valamint az üregek tartalmának összekeverése miatt végzett rázása után a lemezeket 30 per- 10 cig 53 °C hőmérsékleten inkubáljuk.

percig tartó szobahőmérsékleten való további inkubálás után az üregeket a korábbiakban leírtak szerint mossuk.

Ezután az EP 883096976 szabadalomban leírt alkali- 15 kus foszfatáz jelölőpróba 125 fmol mennyiségét (50 pl 0,75 M NaCl/0,075 M nátrium citrát/0,1% SDS/0,5% blokkoló reagens (mint korábban, Boehringer Mannheim, 1096 176 katalógusszám) elegyében) adjuk az egyes üregekhez. 15 percig tartó 53 °C hőmérsékleten 20 majd pedig 10 percig tartó szobahőmérsékleten való inkubálás után az üregeket kétszer mossuk a fentiek szerint, majd háromszor 0,015; NaCl/0,0015 M nátrium citrát elegyében.

A Lumigen Inc.-tői beszerzett, enzim hasított dioxe- 25 tánt (Schaap et al., Tét. Lett. 28:1159-1162 (1987) és az EPA No 0254051) alkalmazzuk lumineszcensz szubsztrátként. 50 pl Lumiphos 530 (Lumigen) adunk az egyes üregekhez. Az üregeket lefedjük, 30 másodpercig rázzuk és 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 25 percig. 30

Ezután a lemezeket egy Dynatech ML 1000 luminométeren leolvassuk. Az eredmény a 250 ms alatt mért fénykibocsátás teljes integráljaként adjuk meg.

Az eredményeket az alábbiakban egy táblázatban mutatjuk be.

Cél koncentráció	Prcamplifikálókkal (relatív fény egység)	Preamplifikálók nélkül (relatív fény egység)
1	3,87 (±0,26)	1,58 (±0,15)
2	1,64 (±0,15)	0,80 (±0,09)
3	1,08 (±0,16)	0,61 (±0,09)
0	0,63 (±0,05)	0,43 (±0,04)

A preamplifikáló próbákkal futtatott vizsgálat magasabb értékű jel minus zajt eredményez az egyes analit koncentrációk esetében a preamplifikáló próbák nélkül futtatott vizsgálatokkal összehasonlítva.

3. példa

Multidentát befogó

Ebben a példában a T_m méréseket a xtl* befogópróbát tartalmazó mikroüregeken hajtjuk végre (lásd a WO 92/02526 számú, korábban idézett PCT publikációt, valamint a 883096976 számú EPA-t). A befogóextenderek és az xtl * befogópróba a következő: xtl-farokkal ellátott HCV befogóextenderek (5’—>3’; a próbák funkcionális doménjeit pontokkal választjuk je):

:HCV.33.1.XT1: (56. számú szekvencia)

TCCTCACAGGGGAGTGATTCATGGTGGAGTGTC.CTTCTTTGGAGAAAGTGGTG :HCV.33.2.XT1: (57. számú szekvencia)

ATGGCTAGACGCTTTCTGCGTGAAGACAGTAGT.CTTCTTTGGAGAAAGTGGTG :HCV.33.3.XT1: (58. számú szekvencia)

GCCTGGAGGCTGCACGRCACTCATACTAACGCC.CTTCTTTGGAGAAAGTGGTG : HCV.33.4.XT1: (59. számú szekvencia)

CGCAGACCACTATGGCTCTYCCGGGAGGGGGGG.CTTCTTTGGAGAAAGTGGTG . HCV.33.5.XT1: (60. számú szekvencia)

TCRTCCYGGCAATTCCGGTGTACTCACCGGTTC.CTTCTTTGGAGAAAGTGGTG xtl* befogópróba: (61. számú szekvencia)

CACCACTTTCTCCAAAGAAG

A befogóextender próbákat és a HCV cél RNS-t Ρ-32-vel jelöljük. A befogóextender-befogópróba T_m meghatározásához ajelölt befogóextendereket xtl * üregekkel ekvilibráljuk különböző hőmérsékleteken vagy a denaturáló formamid különböző szintjeinek jelenlété- 55 ben. Vagy kétórás vagy egy éjszakán át tartó ekvilibrálást végzünk. A befogóextender-cél-befogópróba T_m meghatározásához a befogóextendereket P-32 jelölésű célhoz hibridizáltatjuk. A befogóextender-cél komplexet a befogópróbás üregekkel ekvilibrál- gQ juk vagy két órán keresztül vagy egy éjszakán keresztül különböző hőmérsékleteken. A mintákat kivesszük az üregekből a meghatározott hőmérsékleten és százalékos kötődésnél. A T_m vagy a C_m értékeket a görbék középpontjaiként határozzuk meg a százalékos kötődést a hőmérséklettel szemben vagy a százalékos formamiddal szemben ábrázolva. A C_m (formamid) T_m (formamid mentes) értékké való konvertálásához azt a tényt használjuk fel, hogy az egyes formamid százalékok 0,7 fokkal csökkentik a T_m értéket.

HU 221 237 Bl

A befogóextender-jelölt cél-xtl* befogópróba és a jelölt befogóextender-xtl* befogópróba olvadási görbéit 2 óráig tartó ekvilibrálás esetén a 14. ábrán mutatjuk be. A 20% formamidban és 0,6 M LiCl-ban a befogóextender-xtl* esetében 50 °C hőmérséklet, a befogóextender-cél-xtl* esetében pedig 60 °C hőmérséklet. Ezek a számok megfelelnek a formamid jelenléte nélküli 64 és 74 °C hőmérséklet értékeknek. A 14. ábra azt mutatja, hogy a cél 36%-a és a befogóextenderek csupán 2%-a kötődik 55 °C hőmérsékleten 20% formamidban. Ez 18-szoros eltérést jelent a többszörös befogóextendereken keresztüli cél befogóra alapozva.

A tudomány e területén képzett szakember elismeri, hogy a cél-befogóextender-befogópróba komplex és a befogóextender-befogópróba komplex közötti T_m eltérés 10 °C alá növelhető. Ha a befogóextenderbefogópróba T_m értékét csökkentjük, növelhető a multident kötődés hatása.

4. példa

Két amplifikálót felhasználó hibridizációs vizsgálat

A korábbi példákból egyértelmű, hogy a próbák megtervezhetők úgy, hogy többszörös (kettő vagy több) kölcsönhatásra van szükség egy stabil komplex eléréséhez a vizsgálat körülményei között. A többszörös kölcsönhatás kifejezéssel semmilyen korlátozást nem szándékozunk tenni. Két típusú többszörös kölcsönhatást mutatunk be: kereszt formájú (négyirányú elágazás) csatlakozással rendelkező többszörös próbák valamint többszörös befogóextenderek, melyek szimultán kötődnek a szilárd támasztékon lévő többszörös befogópróbákhoz, ez azt eredményezi, hogy a cél-szilárd támaszték T_m 10-20 °C hőmérséklettel magasabb mint az egyedüli befogóextender-befogópróba hibrid T_ro értéke.

Ugyanezt a koncenpciót terjesszük ki a többszörös amplifikálókra. A feldolgozható próba megtervezése a 15. ábrán látható. Ebben az esetben a két elágazással rendelkező DNS amplifikáló kötődik a két jelölőextenderhez. Az Ampl a LEI jelölőextenderhez kötődik a stabil X hibrid szekvencián keresztül. Az Amp2 a Le2 jelölőextenderhez kötődik a stabil Y hibrid szekvencián keresztül. Az LEI és LE2 nem kell, hogy szomszédos legyen, azonban mind a kettő ugyanazon cél molekula nem átfedő régiójához kell kötődjön. Az AMP1 a B és F elágazó szekvenciákat tartalmazza és az AMP2 a D és G elágazó szekvenciákat. Ebben a példában egy enzim jelölt próba tartalmazza a Be és De szekvenciákat, míg egy aktivátor próba tartalmazza az Fc és Gc szekvenciákat. A 15. ábrán jelölőextenderek képeznek stabil hibrideket a céllal és ezek megfelelő amplifikálóival. Az összes többi bemutatott hibridet (ideértve a B, D, F, és G hibrideket) úgy tervezzük meg, hogy túl gyenge legyen ahhoz, hogy stabil hibridet képezzen a hibridizációs hőmérsékleten. A gyenge hibrideket úgy tervezzük meg, hogy olvadási hőmérsékletük körülbelül 10-20 °C hőmérséklettel alacsonyabb legyen, mint a vizsgálat hibridizációs hőmérséklete. Ha az olvadási hőmérsékletet úgy tervezzük, hogy 5 °C hőmérséklettel legyen alacsonyabb a vizsgálat hőmérsékleténél, az is elfogadható. Az előnyben részesített különbség 10-20 °C mivel ez a cél specifikus kötődést 100-1000-szeresére tudja növelni.

Ily módon, például ha az enzim-jelölt próba a B szekvenciához kötődik, az gyorsan disszociál hacsak a D szekvencia is nincs közel. Ha egyszer egy próba az AMP 1-hez és az AMP2-höz is kötődött a konformáció sokkal rögzítettebb lesz térben, és kinetikailag kedvező a következő kötődési esemény számára. Az aktivátor próba a jelölt próbától függetlenül kötődik azonban hasonló módon. Az aktivátor próba kötődését a jelölt próba AMPl-hez és AMP2-höz való kötődése kinetikailag kedvezővé teszi, azonban termodinamikailag nem és fordítva.

Az aktivátor próbák számos formát vehetnek fel. Ezek (1) aktiválhatják az enzimeket közvetlenül, vagy (2) aktiválhatják az enzimeket közvetve, a gátlás gyengítésén keresztül, vagy (3) aktiválhatják az enzimes reakció termékének detektálását. A (3) módszerre való példaként az enzim-jelölt próbában az enzim lehet alkalikus foszfatáz és az aktivátor lehet egy fluoreszceinált polimer, mely összetételében és szerkezetében hasonló a Schaap és munkatársai által leírthoz (Clinical Chemistry 35:1863-1864, 1989) hasonló. Ezen polimer jelenlétében a dioxetán fény kibocsátása 400-szorosára nő. Ideális esetben a lumineszcensz aktivátor szendvics szerkezetbe fogná az enzim-jelölt próbákat, oly módon, hogy az enzim által felszabadított dioxetán nagy valószínűséggel transzferálna energiát a fluoreszcein vagy más lumineszcensz erősítőhöz, a hatékony célfüggő fény emisszióhoz. A detektálási lépéshez választott körülmények a dioxetán nagyon rövid élettartalmának kedveznének, csökkentve az erősítő-jelölt cél hiányában a dioxetán detektálásának hatékonyságát. Ha a foszforilált dioxetán szubsztrát keverék zöméből a fluoreszcensz polimereket vagy más lumineszcensz erősítőket eltávolítanánk a jel sokkal célfüggőbbé tehető. Még egy foszforilált dioxetánt hasító, a szilárd támasztékhoz nem specifikusan kötődő alkalikus foszfatáz is valószínűleg nem detektálható hacsak nem létezik elegendő ideig ahhoz, hogy a célba diffundáljon. Ezzel a módszerrel még a háttér is a jel típusává konvertálható (azaz, a cél jelenléte lesz szükséges ahhoz, hogy lássuk a zaj többségét).

Az aktivátor próbák lehetnek enzimaktivátorok vagy enzim gátlást kiváltó egységek. Az enzim két vagy több alegységből állhat. Ideális esetben az enzimet úgy állítjuk elő, hogy az alegységek természetes affinitását csökkentjük, vagy megszüntetjük. A természetes asszociációért felelős aminosavak helyére olyan nagyon rövid oligonukleotid szekvenciák kerülnének (H szekvencia az egyik alegységen és a komplementer He szekvencia a másikon), melyek magukban nem képesek stabil hibridet képezni, de melyek képesek kapcsolódni a két inaktív alegységhez és így egy aktív komplexet képes létrehozni, ha az alegységeket szorosan egymás mellett tartjuk azon oknál fogva, hogy egy cél molekula a két különböző amplifikáló különböző elágazásainak alegységeihez kötődik, amint az a 15. ábrán látható.

HU 221 237 Β1

Az enzim gátlás gyengítésének eszközével végzett aktiválásra példa a következők szerint történik. Ajelölt oligonukleotid kovalensen kötődik az alkalikus foszfatázhoz és a teofillinhez is, vagy más nem kompetitív enzim inhibitorhoz. Az aktivátor próba tartalmazna egy az alkalikus foszfatázzal szembeni anti-teofillin antitestet - melynél a Ka sokkal magasabb, mint a teofillin 1/Ka értéke. Az anti-teofillin antitestet tartalmazó oligo próbát hozzáadnánk egy megfelelő reverzibilis denaturáns jelenlétében oly módon, hogy az aktivátor ne kötődjön az enzim inhibitorhoz. Az ilyen reverzibilis denaturánsokra példák a formamid és a karbamid, melyeket az alkalikus foszfatáz jól tolerál. A mosási lépés csökkentené a denaturálást a feleslegben lévő aktivátorral és a jelölt próbákkal együtt. Abban az időben, amikor a célkötött anti-teofillin antitest, közelsége okán, a teofillinhez kötődne, mivel a Ka >>1/Ka, és így gyengítené az alkalikus foszfatáz gátlását. A szilárd támasztékhoz kötött alkalikus foszfatáz továbbra is a jelölt próbához pányvázott teofillin gátlása alatt maradna, mivel a nem specifikusan kötött antiteofillin antitest nincs elég közel ahhoz, hogy gyengítse a gátlást.

Egy három részes rendszer szintén létrehozható, melyben a legalább három rövid szekvenciával rendelkező elágazó DNS amplifikálók szomszédságba kerülnek (melyek egymás iránti természetes affinitása csökkent vagy megszűnt) és ezek ennél fogva lumineszcensz aktivátorokkal vannak körülvéve. Továbbá, egy enzim egy alegységét hordozó elágazó DNS amplifikáló és egy másik alegységet hordozó másik elágazó DNS amplifikáló (egy másik jelölőextenderhez kötődő) vagy egy aktivátor is felhasználható. Ezen kívül ugyanilyen lehetőség van arra, hogy számos eltérő, egymást követő szekvenciát tartalmazó lineáris amplifikálók kerüljenek felhasználásra a molekulák áthidalásának elősegítésére. Az ilyen lineáris amplifikálók könnyen előállíthatok ligálással a korábban leírtak szerint.

5. példa

Az elképzeléseket kombináló hibridizációs vizsgálat

A jelen találmány célja a hibridizációs vizsgálat háttérzajának csökkentése. Ha a befogóextenderek szilárd támasztékhoz való kötődését drasztikusan csökkentjük, a befogóextenderekhez kötődő molekulák következtében bekövetkező háttér csökken. Ha két jelölőextenderen keresztül egy amplifikálót kötünk, a háttér csökken, mert ha egy jelölőextender vagy a szilárd támasztékhoz vagy bármilyen a szilárd támasztékhoz kötődő molekulához kötődik (ideértve a befogópróbát és a befogóextendereket) az nem elég hatékonyan jelölt. Hasonlóképpen, a cél jelenléte nélkül a támasztékhoz kötődő amplifikáló nem jelölődik hatékonyan, ha olyan jelölt próbával képez hibridet, melynek T_m értéke 10-20 °C hőmérséklettel a vizsgálat hőmérséklete alatt van. Hasonlóképpen, ha egy jelölt próba a szilárd támasztékhoz, vagy bármely a szilárd támasztékhoz kötődő molekulához kötődik, nem detektálható hatékonyan ha a jelölt próba kofaktora vagy más alegység a jelölt próbát nem aktiválja. A lumineszcensz aktivátorok több mint 100-szorosára növelhetik a fénykibocsátást (Schaap et al., supra). Ha az aktivátort eltávolítjuk a szubsztrát oldatból és helyette a célhoz kötjük, jelentős zaj csökkentés érhető el a hibridizációs vizsgálat során.

A jelen példa azt írja le, hogyan használhatók ezek az elképzelések egy egyedüli vizsgálatban. Bármelyik elképzelés detektálható háttér csökkentést eredményez. Az összes elképzelés használata elméletileg a hátteret detektálhatatlanná teszi, lehetővé téve erősebb jel amplifikálás használatát az érzékenység fokozása céljából. Egy használható próba tervezés, melyben ezeket az elképzeléseket egyesítjük, aló. ábrán kerül bemutatásra. A befogóextendereket és a jelölőextendereket úgy tervezhetjük, hogy egyidejűleg hibridizálódjanak a kereszt alakú célhoz. Az extenderek cél kötő régiójának T_m értékét úgy tervezzük, hogy több mint 10 °C fokkal stabilabb legyen, mint a V és W és X és Y szekvenciákat magukba foglaló hibridek. A befogópróba-cél komplex T_m értékét úgy tervezzük, hogy körülbelül 10 °C fokkal stabilabb legyen mint a befogóextenderbefogópróba komplex. A hibridizáció alatt az ,V’ és ,W’ szekvenciák nagy moláris feleslege valósítható meg a befogóextender szilárd támasztékhoz való kötődésének további csökkentésére (különösen, ha egy lehűtéses lépés következik a hibridizáció után). Ahogy azt korábban bemutattuk, a ,V’ és ,W’ szekvenciák nincsenek hatással a cél kötődésre.

Ha a befogás teljes egy tetszés szerinti mosási ciklus használható a feleslegben lévő próba eltávolítása céljából. Ekkor, ahogy azt a 16. ábrán bemutattuk, a Be és De rövid szekvenciákat tartalmazó enzim jelölésű próbákat és az Fc és Gc szekvenciákat tartalmazó tetszés szerinti aktivátor próbát adjuk hozzá, majd a hibridizációt megközelítően 20 °C hőmérséklettel magasabb hőmérsékleten végezzük el, mint a B, D, F, G szekvenciákat magában foglaló hibridek T_mS értékei. Például, a B, D, F és G szekvenciák T_mS értékei jelölhetők 35 °C hőmérséklettel, míg a hibridizációs hőmérséklet 50 °C hőmérséklet lehet és az AMP 1-gyel és az AMP2-vel képzett komplexek T_mS értékei 55-60 °C lehetnek. Másik lehetőségként, a hibridizáció elvégezhető megközelítően 37 °C hőmérsékleten megfelelő protein denaturáns jelenlétében, hogy (1) csökkentsük, vagy hatékonyan megakadályozzuk az aktivátor és az enzim kapcsolódását, és (2) csökkentsük vagy hatékonyan megakadályozzuk a jelölt próba és/vagy aktivátor csupán egyetlen amplifikálóhoz való kötődését (azaz a hatékony hibridizációs hőmérsékletet növeljük körülbelül 50 °C hőmérsékletre).

Előnyösen protein sebészetet kellene alkalmazni az anzim és az enzim aktivátorok közötti kölcsönhatások minimalizálása céljából. Végül, a szilárd támasztékot mossuk és a detektálást elvégezzük. Az előnyben részesített szubsztrát a foszforilált dioxetán lenne. Nem lenne szükséges, hogy ebben a szubsztrát keverékben enhacer (erősítő) legyen jelen, mivel ideális esetben az erősítő a célhoz kötött állapotban van. Azaz, akár a 16. ábra aktivátora maga egy lumineszcensz aktivátor, vagy lumineszcensz aktivátorok szerepelnek a hibridizációban az enzim aktivátorokkal és az enzim jelölésű oligonukleotid próbákkal.

Claims (34)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Egy mintában lévő nukleinsav-analit detektálására szolgáló szendvicshibridizációs vizsgálat, melynek során (a) az analitot közvetve egy szilárd hordozóhoz kötjük;

   (b) az analitot jelöljük; és (c) az analit-kapcsolódott jelölés jelenlétét detektáljuk, és (d) a hordozón található jel jelenlétét a mintában lévő nukleinsav-analit jelenlétéhez viszonyítjuk, azzal jellemezve, hogy a vizsgálatban egy első befogóextender molekulát és egy eltérő második befogóextender molekulát alkalmazunk, melyek mindegyikének, a vizsgálatban létrejövő észlelhető jel létrehozásához hibridizálnia kell az analithoz, az említett első és második befogóextender molekula mind magában foglal egy az analitban jelen lévő nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes analitkötő szegmentet tartalmazó polinukleotidot valamint egy szilárd hordozóhoz kötött befogópróban belül jelen lévő nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes hordozót kötőszegmentet, ahol az első befogóextender molekula analitkötőszegmentje eltér a második befogóextender molekula analitkötő szegmentjétől és továbbá, ahol a befogópróba egy, az első befogóextender molekula hordozó-kötő szegmentjéhez kötődni képes első befogóextender kötő szekvenciát tartalmaz, valamint a második befogóextender molekula hordozó-kötő szegmentjéhez hibridizálódni képes második befogóextender kötőszekvenciát, oly módon, hogy két különböző befogóextender molekula kötődhet egy egyedüli befogópróbához.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti vizsgálat, azzal jellemezve, hogy a T_ml olvadási hőmérséklet, melyen a befogópróba, a befogóextender molekulák és a nukleinsavanalit között létrejövő hibrid komplexben a nukleinsavanalit disszociál a befogópróbától legalább 5 °C hőmérséklettel magasabb, mint a befogópróba és a befogóextender molekulák között létrejött hibrid komplexek T_m2 olvadási hőmérséklete.
3. 3. A 2. igénypont szerinti vizsgálat, azzal jellemezve, hogy legalább egy lépést olyan szigorú körülmények között hajtunk végre, mely kedvez a T_m, komplex képződésnek, azonban a T_m2 komplex képződésnek nem kedvez.
4. 4. A 3. igénypont szerinti vizsgálat, azzal jellemezve, hogy a szigorúságot úgy szabályozzuk, hogy legalább egy lépés paramétereit szabályozzuk, a paraméterek a formamidkoncentrációt, a kaotróp só koncentrációját, a sókoncentrációt, a pH-értéket (hidrogénionkoncentráció), szerves oldószer tartalmat és hőmérsékletet jelent.
5. 5. A 4. igénypont szerinti vizsgálat, azzal jellemezve, hogy, legalább egy lépést a T_m2 hőmérsékletnél magasabb és a T_m2 hőmérsékletnél alacsonyabb hőmérsékleten végzünk.
6. 6. A 3. igénypont szerinti vizsgálat, azzal jellemezve, hogy legalább egy lépés az (a) lépést jelenti.
7. 7. Egy mintában lévő nukleinsav-analit jelenlétének detektálására szolgáló szendvicshibridízációs vizsgálat, azzal jellemezve, hogy:

   (a) befogópróbákat tartalmazó szilárd hordozót, az analitban egy nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes C-l első szegmentet és a befogópróbákban lévő nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes C-2 második szegmentet tartalmazó befogóextender molekulát, az analitban a nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes L-l első szegmentet és egy jelölőpróba rendszerhez hibridizálódni képes L-2 második szegmentet tartalmazó jelölőextender molekulákat, egy az L-2-höz hibridizálódni képes M-l nukleinsav szekvenciát tartalmazó jelölőpróba rendszert biztosítunk, mely közvetlenül vagy közvetve detektálható jelet eredményez;

   (b) a nukleinsav-analitot hibridizációs körülmények között inkubáljuk azonos időben vagy egymást követően a befogóextender molekulákkal melyek közül legalább kettőnek a vizsgálatban létrejövő észlelhető jel létrehozásához hibridizálnia kell az analithoz, a jelölőextender molekulákkal és a szilárd hordozón lévő befogópróbákkal, így egy hordozó-kötött hibrid komplexet létrehozva;

   (c) ezután adott esetben a szilárd hordozóhoz nem kötött anyagot elválasztjuk;

   (d) a hordozóhoz kötött hibrid komplexet a jelölőpróba rendszerrel hozzuk érintkezésbe hibridizációs körülmények között, mellyel egy jelölt, hordozó-kötött hibrid komplexet hozunk létre;

   (e) a szilárd hordozóhoz nem kötött anyagot elválasztjuk;

   (f) a jelölt hordozó-kötött hibrid komplexben lévő jelölő anyag jelenlétét detektáljuk, és (g) a hordozón található jel jelenlétét a mintában lévő nukleinsav-analit jelenlétéhez viszonyítjuk, ahol a T_ml olvadási hőmérséklet, melyen a befogópróba, a befogóextender molekulák és a nukleinsav-analit között létrejövő hibrid komplexben a nukleinsav-analit disszociál a befogópróbától legalább 5 °C hőmérséklettel magasabb, mint a befogópróba és a befogóextender molekulák között létrejött hibrid komplexek T_m2 olvadási hőmérséklete.
8. 8. A 7. igénypont szerinti vizsgálat azzal jellemezve, hogy a jelölőpróba rendszer a következőket foglalja magában:

   (i) az M-l nukleinsav szekvenciát tartalmazó amplifikációs multimert és a jelölőpróbákhoz hibridizálódni képes M-2 nukleinsav szekvenciákat tartalmazó azonos oligonukleotid alegységeket, és (ii) egy az Μ-2-höz hibridizálódni képes L-3 nukleinsav szekvenciát tartalmazó jelölőpróbákat, mely közvetlenül vagy közvetve detektálható jelet eredményez és ahol a (d) lépés a következő lépéseket foglalja magában:

   (d,) hibridizációs körülmények között a hordozó-kötött hibrid komplexet az amplifikációs multimerrel érintkeztetjük egy második hordozó-kötött hibrid komplex létrehozása céljából;

   HU 221 237 Β1 (d₂) ezután a szilárd hordozóhoz nem kötött anyagot adott esetben szeparáljuk; és (d₃) ezután a második hordozóhoz kötött hibrid komplexet egy jelölőpróbával hozzuk kapcsolatba, hogy egy jelölt hordozóhoz kötött hibrid komplexet létrehozzunk.
9. 9. Egy mintában lévő nukleinsav-analit jelenlétének detektálására szolgáló szendvicshibridizációs vizsgálat, azzal jellemezve, hogy:

   (a) befogópróbákat tartalmazó szilárd hordozót, az analitban egy nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes C-l első szegmentet és a befogópróbákban levő nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes C-2 második szegmentet tartalmazó befogóextender molekulát, az analitban a nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes L-l első szegmentet és egy a preamplifikáló próbában lévő P-l nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes L-2 második szegmentet tartalmazó jelölőextender molekulákat, egy a P-2 nukleinsav szekvenciákon keresztül számos amplifikációs multimerhez kötődni képes P-l nukleinsav szekvenciával rendelkező preamplifikáló próbát, a Ρ-2-höz és számos, a jelölőpróbákhoz hibridizálódni képes M-2 nukleinsav szekvenciákat tartalmazó, azonos oligonukieotid alegységhez hibridizálódni képes M-l nukleinsav szekvenciát tartalmazó amplifikációs multimereket, valamint az Μ-2-höz hibridizálódni képes L-3 szekvenciát tartalmazó jelölőpróbákat biztosítunk, mely közvetlenül vagy közvetve detektálható jelet eredményez;

   (b) a nukleinsav-analitot hibridizációs körülmények között inkubáljuk azonos időben vagy egymást követően a befogóextender molekulákkal, melyek közül legalább kettőnek a vizsgálatban létrejövő észlelhető jel létrehozásához hibridizálnia kell az analithoz, a jelölőextender molekulákkal és a szilárd hordozón lévő befogópróbákkal, így a hordozó-kötött első hibrid komplexet létrehozva;

   (c) ezután adott esetben a szilárd hordozóhoz nem kötött anyagot szeparáljuk;

   (d) a hordozóhoz kötött első hibrid komplexet a preamplifikáló próbával és amplifikációs multimerekkel hozzuk érintkezésbe hibridizációs körülmények között, hogy egy hordozóhoz kötött második hibrid komplexet létrehozzunk;

   (e) a szilárd hordozóhoz nem kötött anyagot ezután adott esetben szeparáljuk; és (f) ajelölt hordozóhoz kötött második hibrid komplexet hibridizációs körülmények között a jelölőpróbákkal hozzuk érintkezésbe, hogy egy jelölt, hordozóhoz kötött harmadik hibrid komplexet hozzunk létre;

   (g) ezután a szilárd hordozóhoz nem kötött anyagokat szeparáljuk;

   (h) a hordozóhoz kötött harmadik hibrid komplexben ajelölő anyag jelenlétét detektáljuk; és (i) a hordozón található harmadik hibrid komplex jel jelenlétét a mintában lévő nukleinsav-analit jelenlétéhez viszonyítjuk, ahol a T_ml olvadási hőmérséklet, melyen a befogópróba, a befogóextender molekulák és a nukleinsav-analit között létrejövő hibrid komplexben a nukleinsav-analit disszociál a befogópróbatói, legalább 5 °C hőmérséklettel magasabb, mint a befogópróba és a befogóextender molekulák között létrejött hibrid komplexek T_m2 olvadási hőmérséklete.
10. 10. A 7. igénypont szerinti vizsgálat, azzal jellemezve, hogy legalább egy lépést olyan szigorú körülmények között hajtunk végre, mely a T_ml komplex képződésének kedvez, azonban a T_m2 komplex képződésének nem kedvez.
11. 11. A 10. igénypont szerinti vizsgálat, azzal jellemezve, hogy a szigorúságot úgy szabályozzuk, hogy legalább egy lépés paramétereit szabályozzuk, a paraméterek a formamidkoncentrációt, a kaotróp só koncentrációját, a sókoncentrációt, a pH-értéket (hidrogénion-koncentráció), szerves oldószer tartalmat és hőmérsékletet jelentenek.
12. 12. A 11. igénypont szerinti vizsgálat, azzal jellemezve, hogy, legalább egy lépést a T_m2 hőmérsékletnél magasabb és a T_ml hőmérsékletnél alacsonyabb hőmérsékleten végzünk.
13. 13. A 10. igénypont szerinti vizsgálat, azzal jellemezve, hogy legalább egy lépés a (b) lépést jelenti.
14. 14. Egy mintában lévő nukleinsav-analit jelenlétének detektálására szolgáló szendvics hibridizációs vizsgálat, azzal jellemezve, hogy:

    (a) befogópróbákat tartalmazó szilárd hordozót, egy az analitban jelen lévő nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes analitkötő szegmentet és a befogópróbákon belül lévő nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes hordozóhoz kötött szegmentet tartalmazó polinukleotidot tartalmazó első befogóextender molekulát, egy az analitban lévő nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes analitkötő szegmentet, valamint a befogópróbákon belül lévő nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes hordozóhoz kötött szegmentet tartalmazó polinukleotidot tartalmazó eltérő második befogóextender molekulát, egy az analitban lévő nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes L-l első szegmentet és egy L-2 második szegmentet tartalmazó jelölőextender molekulákat, egy az L-2-höz és az M-2 nukleinsav szekvenciákat tartalmazó számos azonos oligonukleotid alegységhez hibridizálódni képes M-l nukleinsav szekvenciát tartalmazó amplifikációs multimert, valamint az Μ-2-höz hibridizálódni képes L-3 szekvenciát tartalmazó jelölőpróbákat biztosítunk, mely közvetlenül vagy közvetve detektálható jelet eredményez;

    (b) a nukleinsav-analitot hibridizációs körülmények között inkubáljuk azonos időben vagy egymást követően a befogóextender molekulákkal, a jelölőextender molekulákkal és a szilárd hordozón lévő befogópróbákkal, hogy a hordozó-kötött első hibrid komplexet létrehozzuk;

    (c) ezután adott esetben a szilárd hordozóhoz nem kötött anyagot szeparáljuk;

    HU 221 237 Β1 (d) a hordozóhoz kötött első hibrid komplexet amplifikációs multimerrel hozzuk érintkezésbe hibridizációs körülmények között, hogy egy hordozóhoz kötött második hibrid komplexet létrehozzunk;

    (e) a szilárd hordozóhoz nem kötött anyagot ezután adott esetben szeparáljuk; és (f) a hordozóhoz kötött második hibrid komplexet hibridizációs körülmények között a jelölőpróbákkal hozzuk érintkezésbe, hogy egy jelölt, hordozóhoz kötött harmadik hibrid komplexet hozzunk létre;

    (g) ezután a szilárd hordozóhoz nem kötött anyagokat szeparáljuk;

    (h) a hordozóhoz kötött harmadik hibrid komplexben a jelölő anyag jelenlétét detektáljuk; és (i) a hordozón található harmadik hibrid komplex jel jelenlétét a mintában lévő nukleinsav-analit jelenlétéhez viszonyítjuk, ahol a befogóextender molekulák konfigurációja olyan, hogy a (b) lépés hordozóhoz kötött, második hibrid komplexe csak akkor jön létre, ha a második befogóextender molekulák az analithoz kötődtek.
15. 15. Egy mintában lévő nukleinsav-analit jelenlétének detektálására szolgáló szendvicshibridizációs vizsgálat azzal jellemezve, hogy:

    (a) befogópróbákat tartalmazó szilárd hordozót, az analitban egy nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes analitkötő szegmentet és a befogópróbákban lévő nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes hordozó-kötő szegmentet tartalmazó polinukleotidból álló első befogóextender molekulát, az analitban a nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes analitkötő szegmentet és a befogópróbákban jelen lévő nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes hordozó-kötő szegmentet tartalmazó polinukleotidból álló eltérő második befogóextender molekulát, az analitban lévő nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes L-1 első szegmentet, valamint egy a preamplifikáló próbában lévő P-l nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes L-2 második szegmentet tartalmazó jelölőextender molekulákat, egy a P-2 nukleinsav szekvenciákon keresztül számos amplifikációs multimerhez kötődni képes P-l nukleinsav szekvenciával rendelkező preamplifikáló próbát, a Ρ-2-höz és számos, a jelölőpróbákhoz hibridizálódni képes M-2 nukleinsav szekvenciákat tartalmazó, azonos oligonukleotid alegységhez hibridizálódni képes M-l nukleinsav szekvenciát tartalmazó amplifikációs multimereket, valamint az Μ-2-höz hibridizálódni képes L-3 szekvenciát tartalmazó jelölőpróbákat biztosítunk, mely közvetlenül vagy közvetve detektálható jelet eredményez;

    (b) a nukleinsav-analitot hibridizációs körülmények között inkubáljuk azonos időben vagy egymást követően a befogóextender molekulákkal, a jelölőextender molekulákkal és a szilárd hordozón lévő befogópróbákkal, hogy a hordozó-kötött első hibrid komplexet létrehozzuk;

    (c) ezután adott esetben a szilárd hordozóhoz nem kötött anyagot szeparáljuk;

    (d) a hordozóhoz kötött első hibrid komplexet a preamplifikáló próbával és amplifikációs multimerekkel hozzuk érintkezésbe hibridizációs körülmények között, hogy egy hordozóhoz kötött második hibrid komplexet létrehozzunk;

    (e) a szilárd hordozóhoz nem kötött anyagot ezután adott esetben szeparáljuk; és (f) a hordozóhoz kötött második hibrid komplexet hibridizációs körülmények között a jelölőpróbákkal hozzuk érintkezésbe, hogy egy jelölt, hordozóhoz kötött harmadik hibrid komplexet hozzunk létre;

    (g) ezután a szilárd hordozóhoz nem kötött anyagokat szeparáljuk; és (h) a hordozóhoz kötött harmadik hibrid komplexben ajelölő anyag jelenlétét detektáljuk; és (i) a hordozón található harmadik hibrid komplex jel jelenlétét a mintában lévő nukleinsav-analit jelenlétéhez viszonyítjuk, ahol a befogóextender molekulák konfigurációja olyan, hogy a (b) lépés hordozóhoz kötött, második hibrid komplexe csak akkor jön létre, ha az első és a második befogóextender molekulák is az analithoz kötődtek.
16. 16. A 14. igénypont szerinti vizsgálat, azzal jellemezve, hogy a befogópróba egy, az első befogóextender molekula hordozó-kötő szegmentjéhez hibridizálódni képes első befogóextender kötő szekvenciát, valamint a második befogóextender molekula hordozó-kötő szegmentjéhez kötődni képes második befogóextender kötő szekvenciát tartalmaz oly módon, hogy egy egyedüli befogópróbához két befogóextender molekula kötődik.
17. 17. A 15. igénypont szerinti vizsgálat, azzal jellemezve, hogy a befogópróba egy az első befogóextender molekula hordozó-kötő szegmentjéhez hibridizálódni képes első befogóextender kötő szekvenciát valamint a második befogóextender molekula hordozó-kötő szegmentjéhez kötődni képes második befogóextender kötő szekvenciát tartalmaz oly módon, egy egyedüli befogópróbához két befogóextender molekula kötődik.
18. 18. Egy mintában lévő nukleinsav-analit jelenlétének detektálására szolgáló szendvicshibridizációs vizsgálat, azzal jellemezve, hogy:

    (a) befogópróbákat tartalmazó szilárd hordozót, az analitban lévő nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes analitkötő szegmentet és a befogópróbákban lévő nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes hordozó-kötő szegmentet tartalmazó polinukleotidból álló befogóextender molekulákat, az analitban a nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes analitkötő szegmentet és a befogópróbákban jelen lévő nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes első szegmentet, valamint egy a jelölőpróba rendszerhez hibridizálódni képes második szegmentet tartalmazó első jelölőextender molekulát, az analitban lévő nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes első szegmentet, valamint egy a jelölőpróba rendszerhez hibridizálódni képes második szegmentet tartalmazó eltérő második jelölőextender molekulát, valamint az első jelölőextender molekula és a második jelölőextender molekula második szegmentjeihez hibridizálódni képes nukleinsav szekvenciákat tartal24

    HU 221 237 BI mazó jelölőpróba rendszert biztosítunk, mely közvetlenül vagy közvetve detektálható jelet eredményez;

    (b) a nukleinsav-analitot hibridizációs körülmények között inkubáljuk azonos időben vagy egymást követően a befogóextender molekulákkal, a jelölőextender molekulákkal és a szilárd hordozón lévő befogópróbákkal, hogy a hordozó-kötött hibrid komplexet létrehozzuk;

    (c) ezután adott esetben a szilárd hordozóhoz nem kötött anyagot szeparáljuk;

    (d) a hordozóhoz kötött hibrid komplexet a jelölőpróba rendszerrel hozzuk érintkezésbe hibridizációs körülmények között, hogy egy jelölt, hordozóhoz kötött hibrid komplexet létrehozzunk;

    (e) a szilárd hordozóhoz nem kötött anyagot ezután adott esetben szeparáljuk;

    (f) a hordozóhoz kötött jelölt hordozóhoz kötött hibrid komplexben a jelölő anyag jelenlétét detektáljuk; és

    i) a hordozón található harmadik hibrid komplex jelenlétét a mintában lévő nukleinsav-analit jelenlétéhez viszonyítjuk, ahol a befogóextender molekulák konfigurációja olyan, hogy a (d) lépés hordozóhoz kötött hibrid komplexe csak akkor jön létre, ha az első és a második befogóextender molekulák is az analithoz kötődtek.
19. 19. A 18. igénypont szerinti vizsgálat, azzal jellemezve, hogy a jelölőpróba rendszer a következőket foglalja magában:

    (i) egy azM-1 nukleinsav szekvenciát és a jelölpróbákhoz hibridizálni képes, M-2 nukleinsav szekvenciákat tartalmazó, több azonos oligonukleotid alegységet tartalmazó amplifikációs multimert, és (ii) az Μ-2-höz hibridizálódni képes L-3 nukleinsav szekvenciát tartalmazó jelölőpróbákat, mely közvetlenül vagy közvetve detektálható jelet eredményez, és ahol a vizsgálat (d) lépése a következő lépéseket foglalja magában:

    (dj) hibridizációs körülmények között a hordozó-kötött hibrid komplexet az amplifikációs multimerrel érintkeztetjük egy második hordozó-kötött hibrid komplex létrehozása céljából;

    (d₂) ezután a szilárd hordozóhoz nem kötött anyagot adott esetben szeparáljuk; és (d₃) ezután a második hordozóhoz kötött hibrid komplexet hibridizációs körülmények között jelölőpróbákkal hozzuk kapcsolatba, hogy egy jelölt hordozóhoz kötött hibrid komplexet létrehozzunk.
20. 20. Egy mintában lévő nukleinsav-analit jelenlétének detektálására szolgáló szendvics hibridizációs vizsgálat, azzal jellemezve, hogy:

    (a) befogópróbákat tartalmazó szilárd hordozót, az analitban lévő nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes analitkötő szegmentet és a befogópróbákban lévő nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes hordozó-kötő szegmentet tartalmazó polinukleotidból álló befogóextender molekulákat, az analitban a nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes első szegmentet és a preamplifikációs próbához hibridizálódni képes második szegmentet tartalmazó első jelölőextender molekulát, az analitban lévő nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes első szegmentet, valamint egy a preamplifikáló próbához hibridizálódni képes második szegmentet tartalmazó eltérő második jelölőextender molekulát ahol a preamplifikáló próbák egy, a jelölőextender molekulához hibridizálódni képes első szegmenst és az amplifikációs multimerekhez kötődni képes második szegmenst tartalmaznak -, a jelölőextender molekulákhoz hibridizálódni képes M-l nukleinsav szekvenciát, valamint az M-2 nukleinsav szekvenciákat tartalmazó számos, azonos oligonukleotid alegységet tartalmazó amplifikációs multimereket biztosítunk, mely közvetlenül vagy közvetve detektálható jelet eredményez;

    (b) a nukleinsav-analitot hibridizációs körülmények között inkubáljuk azonos időben vagy egymást követően a befogóextender molekulákkal, a jelölőextender molekulákkal és a szilárd hordozón lévő befogópróbákkal, hogy a hordozó-kötött első hibrid komplexet létrehozzuk;

    (c) ezután adott esetben a szilárd hordozóhoz nem kötött anyagot szeparáljuk;

    (d) a hordozóhoz kötött első hibrid komplexet a preamplifikáló próbával és amplifikációs multimerrel hozzuk érintkezésbe hibridizációs körülmények között, hogy egy hordozóhoz kötött második hibrid komplexet létrehozzunk;

    (e) a szilárd hordozóhoz nem kötött anyagot ezután adott esetben szeparáljuk; és (f) a hordozóhoz kötött második hibrid komplexet hibridizációs körülmények között a jelölőpróbákkal hozzuk érintkezésbe, hogy egy jelölt, hordozóhoz kötött harmadik hibrid komplexet hozzunk létre;

    (g) ezután a szilárd hordozóhoz nem kötött anyagokat szeparáljuk;

    (h) a hordozóhoz kötött harmadik hibrid komplexben ajelölő anyag jelenlétét detektáljuk; és

    i) a hordozón található harmadik hibrid komplex jel jelenlétét a mintában lévő nukleinsav-analit jelenlétéhez viszonyítjuk, ahol a befogóextender molekulák konfigurációja olyan, hogy a (d) lépés hordozóhoz kötött, második hibrid komplexe csak akkor jön létre, ha az első és a második jelölőextender molekulák is az analithoz kötődtek.
21. 21. Egy mintában lévő nukleinsav-analit jelenlétének detektálására szolgáló szendvics hibridizációs vizsgálat, azzal jellemezve, hogy:

    (a) egy befogópróbákat tartalmazó szilárd hordozót, az analitban egy nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes C-l első szegmentet és a befogópróbákban lévő nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes C-2 második szegmentet tartalmazó befogóextender molekulákat, az analitban egy nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes L-l első szegmentet és egy első amplifikációs multimerhez hibridizálódni képes L-2 második szegmentet tartalmazó első jelölőextender molekulát,

    HU 221 237 Bl az analitban egy nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes L-la első szegmentet és egy második amplifikációs multimerhez hibridizálódni képes L-2a második szegmentet tartalmazó második jelölőextender molekulát, az L-2-höz hibridizálódni képes M-l nukleinsav szekvenciát, valamint számos a jelölő próbákhoz hibridizálódni képes M-2 nukleinsav szekvenciákat tartalmazó azonos oligonukleotid alegységet tartalmazó első amplifikációs multimert, az L - 2a-hoz hibridizálódni képes M-la nukleinsav szekvenciát, valamint számos ajelölő próbákhoz hibridizálódni képes M-2a nukleinsav szekvenciákat tartalmazó azonos oligonukleotid alegységet tartalmazó második amplifikációs multimert, valamint az amplifikációs multimerekhez hibridizálódni képes jelölő próbákat biztosítunk, mely közvetlenül vagy közvetve detektálható jelet eredményez;

    (b) a nukleinsav-analitot hibridizációs körülmények között inkubáljuk azonos időben vagy egymást követően a befogóextender molekulákkal, a jelölőextender molekulákkal és a szilárd hordozón lévő befogópróbákkal, hogy a hordozó-kötött első hibrid komplexet létrehozzuk;

    (c) ezután adott esetben a szilárd hordozóhoz nem kötött anyagot szeparáljuk;

    (d) a hordozóhoz kötött első hibrid komplexet amplifikációs multimerekkel hozzuk érintkezésbe hibridizációs körülmények között, hogy egy hordozóhoz kötött második hibrid komplexet létrehozzunk;

    (e) a szilárd hordozóhoz nem kötött anyagot ezután adott esetben szeparáljuk; és (f) a hordozóhoz kötött második hibrid komplexet hibridizációs körülmények között a jelölőpróbákkal hozzuk érintkezésbe, hogy egy jelölt, hordozóhoz kötött harmadik hibrid komplexet hozzunk létre;

    (g) ezután a szilárd hordozóhoz nem kötött anyagokat szeparáljuk;

    (h) a hordozóhoz kötött harmadik hibrid komplexben a jelölő anyag jelenlétét detektáljuk; és

    i) a hordozón található harmadik hibrid komplex jel jelenlétét a mintában lévő nukleinsav-analit jelenlétéhez viszonyítjuk, ahol a jelölőpróbák egy az első amplifikációs multimerhez hibridizálódni képes első nukleinsav szegmentet és a második amplifikációs multimerhez hibridizálódni képes második nukleinsav szegmentet tartalmaznak oly módon, hogy a hordozóhoz kötött harmadik hibrid komplex nem jön létre csak akkor, ha az első és a második amplifikációs multimer a jelölőpróbákon keresztül összekapcsolódik.
22. 22. Egy mintában lévő nukleinsav-analit jelenlétének detektálására szolgáló szendvics hibridizációs vizsgálat, azzal jellemezve, hogy:

    (a) egy befogópróbákat tartalmazó szilárd hordozót, az analitban egy nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes C-l első szegmentet és a befogópróbákban lévő nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes C-2 második szegmentet tartalmazó befogóextender molekulákat, az analitban egy nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes L-1 első szegmentet és egy első amplifikációs multimerhez hibridizálódni képes L-2 második szegmentet tartalmazó első jelölőextender molekulát, az analitban egy nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes L-la első szegmentet és egy második amplifikációs multimerhez hibridizálódni képes L-2a második szegmentet tartalmazó második jelölőextender molekulát, az L-2-höz hibridizálódni képes M-l nukleinsav szekvenciát, valamint számos a jelölőpróbákhoz hibridizálódni képes M-2 nukleinsav szekvenciákat tartalmazó azonos oligonukleotid alegységet tartalmazó első amplifikációs multimert, az L-2a-hoz hibridizálódni képes M-la nukleinsav szekvenciát, valamint a számos a második jelölőpróbákhoz hibridizálódni képes M-2a nukleinsav szekvenciákat tartalmazó azonos oligonukleotid alegységet tartalmazó második amplifikációs multimert, valamint a megfelelő amplifikációs multimerekhez hibridizálódni képes első és második jelölőpróbákat biztosítunk, melyek, ha a közeli amplifikációs multimereken találhatók, detektálható jelet eredményeznek;

    (b) a nukleinsav-analitot hibridizációs körülmények között inkubáljuk azonos időben vagy egymást követően a befogóextender molekulákkal, a jelölőextender molekulákkal és a szilárd hordozón lévő befogópróbákkal, hogy a hordozó-kötött első hibrid komplexet létrehozzuk;

    (c) ezután adott esetben a szilárd hordozóhoz nem kötött anyagot szeparáljuk;

    (d) a hordozóhoz kötött első hibrid komplexet az amplifikációs multimerrel hozzuk érintkezésbe hibridizációs körülmények között, hogy egy hordozóhoz kötött második hibrid komplexet létrehozzunk;

    (e) a szilárd hordozóhoz nem kötött anyagot ezután adott esetben szeparáljuk; és (f) a hordozóhoz kötött második hibrid komplexet hibridizációs körülmények között a jelölőpróbákkal hozzuk érintkezésbe, hogy egy jelölt, hordozóhoz kötött harmadik hibrid komplexet hozzunk létre;

    (g) ezután a szilárd hordozóhoz nem kötött anyagokat szeparáljuk; és (h) az első és a második jelölőpróba szegmentek közötti kölcsönhatás következtében létrejövő detektálható jelet a hordozóhoz kötött harmadik hibrid komplexben feljegyezzük, ahol a hordozón a jel jelenléte a mintában a nukleinsavanalit jelenlétét jelzi.
23. 23. A 22. igénypont szerinti vizsgálat, azzal jellemezve, hogy az első jelölőpróba szegment egy első enzim fragmentet tartalmaz és a második jelölőpróba szegment egy második enzim fragmentet tartalmaz, valamint az első és a második enzim fragmentek egymással komplementer enzim fragmentek melyek csak akkor aktívak ha a cél jelenlétén keresztül összekerülnek.
24. 24. A 22. igénypont szerinti vizsgálat azzal jellemezve, hogy az első jelölőpróba szegment egy enzimet tartalmaz és a második jelölőpróba szegment egy az enzimhez való kofaktort tartalmaz, valamint az enzim és a kofaktor egymással komplementer enzim fragmentek

    HU 221 237 Bl melyek csak akkor aktívak, ha a cél jelenlétén keresztül összekerülnek.
25. 25. A 22. igénypont szerinti vizsgálat, azzal jellemezve, hogy az első jelölőpróba szegment egy enzimet tartalmaz és a második jelölőpróba szegment egy lumineszcensz vagy fluoreszcensz aktivátort tartalmaz, ahol az enzim katalizálja a termék létrejöttét az aktivátor pedig a termék detektálását fokozza.
26. 26. Egy mintában egy nukleinsav-analit detektálására szolgáló szendvicshibridizációs vizsgálat, azzal jellemezve, hogy (a) az analitot a befogóextender molekulákon keresztül közvetlenül vagy közvetve szilárd hordozóhoz kötött befogópróbákhoz kötjük;

    (b) az analitot megjelöljük; és (c) a hordozón az analittal kapcsolódó jelölő anyag jelenlétét detektáljuk, ez a fejlesztés azzal jellemezhető, hogy a vizsgálat magában foglal egy a szilárd hordozóhoz kötött befogópróbákhoz hibridizálódni képes nukleinsav szekvenciát tartalmazó kompetitor oligonukleotidot, ahol a hordozón a jel jelenléte a mintában a nukleinsavanalit jelenlétét jelzi.
27. 27. Egy mintában lévő nukleinsav-analit jelenlétének detektálására szolgáló szendvics hibridizációs vizsgálat, azzal jellemezve, hogy:

    (a) egy befogópróbákat hozzá kapcsolódva tartalmazó szilárd hordozót, az analitban egy nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes C-l első szegmentet és a befogópróbákban lévő nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes C-2 második szegmentet tartalmazó befogóextender molekulákat, a befogópróbákhoz hibridizálódni képes nukleinsav szekvenciát tartalmazó kompetitor oligonukleotidokat, az analitban a nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes L-1 első szegmentet és egy jelölőpróba rendszerhez hibridizálódni képes L-2 második szegmentet tartalmazó jelölőextender molekulákat, egy az L-2-höz hibridizálódni képes M-l nukleinsav szekvenciát tartalmazó jelölőpróba rendszert biztosítunk, mely közvetlenül vagy közvetve detektálható jelet eredményez;

    (b) a nukleinsav-analitot hibridizációs körülmények között inkubáljuk azonos időben vagy egymást követően a befogóextender molekulákkal, a kompetitor oligonukleotidokkal, a jelölőextender molekulákkal és a szilárd hordozón lévő befogópróbákkal, hogy:

    (i) a befogóextenderből, a nukleinsav-analitból és a jelölőextenderből egy első hibrid komplexet hozzunk létre, és (ii) a hordozóhoz között, befogópróbákból és kompetitor oligonukleotidekből álló második hibrid komplexet létrehozzuk;

    (c) ezután adott esetben a szilárd hordozóhoz nem kötött anyagot szeparáljuk;

    (d) a hordozó-kötött első hibrid komplexet a jelölőpróba rendszerrel hozzuk érintkezésbe hibridizációs körülmények között, hogy egy jelölt, hordozó kötött harmadik hibrid komplexet létrehozzunk;

    (e) a szilárd hordozóhoz nem kötött anyagot ezután szeparáljuk; és (f) a jelölt hordozó-kötött harmadik hibrid komplexben lévő jelölő anyag jelenlétét detektáljuk;

    ahol a hordozón a jel jelenléte a mintában a nukleinsavanalit jelenlétét jelzi.
28. 28. A 27. igénypont szerinti vizsgálat, azzal jellemezve, hogy a jelölőpróba rendszer a következőket foglalja magában:

    (i) az M-l nukleinsav szekvenciát tartalmazó amplifikációs multimert és a jelölőpróbákhoz hibridizálódni képes M-2 nukleinsav szekvenciákat tartalmazó számos azonos oligonukleotid alegységeket, és (ii) egy az Μ-2-höz hibridizálódni képes L-3 nukleinsav szekvenciát tartalmazó jelölőpróbákat, mely közvetlenül vagy közvetve detektálható jelet eredményez, és ahol a (d) lépés a következő lépéseket foglalja magában:

    (dj hibridizációs körülmények között a hordozó-kötött első hibrid komplexet az amplifikációs multimerrel érintkeztetjük egy hordozó-kötött harmadik hibrid komplex létrehozása céljából;

    (d₂) ezután a szilárd hordozóhoz nem kötött anyagot adott esetben szeparáljuk; és (d₃) ezután a második hordozóhoz kötött hibrid komplexet egy jelölőpróbával hozzuk kapcsolatba, hogy egy jelölt hordozóhoz kötött negyedik hibrid komplexet létrehozzunk.
29. 29. Egy mintában lévő nukleinsav-analit jelenlétének detektálására szolgáló szendvics hibridizációs vizsgálat, azzal jellemezve, hogy:

    (a) egy befogópróbákat ahhoz kötve tartalmazó szilárd hordozót, az analitban egy nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes C-l első szegmentet és a befogópróbákban lévő nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes C-2 második szegmentet tartalmazó befogóextender molekulákat, a befogópróbákhoz hibridizálódni képes legalább egy nukleinsav szekvenciát tartalmazó verseny oligonukleotidokat, az analitban a nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes L-l első szegmentet és egy preamplifikáló próbában a P-l nukleinsav szekvenciához hibridizálódni képes L-2 második szegmentet tartalmazó jelölőextender molekulákat, P-2 nukleinsav szekvencián keresztül számos amplifikációs multimerhez kötődni képes, P-l nukleinsav szekvenciát tartalmazó preamplifikáló próbát, a P-2höz hibridizálódni képes M-l nukleinsav szekvenciát, valamint a jelölőpróbákhoz hibridizálódni képes M-2 nukleinsav szekvenciát tartalmazó számos azonos oligonukleotid alegységet tartalmazó amplifikációs multimereket és az Μ-2-höz hibridizálódni képes L-3 szekvenciát tartalmazó jelölő próbákat biztosítunk, melyek közvetlenül vagy közvetve detektálható jelet eredményeznek;

    (b) a nukleinsav-analitot hibridizációs körülmények között inkubáljuk azonos időben vagy egymást köve27

    HU 221 237 Β1 tőén a befogóextender molekulákkal, a kompetitor oligonukleotidokkal, a jelölőextender molekulákkal és a szilárd hordozón lévő befogópróbákkal, hogy:

    (i) hordozóhoz kötött, a befogópróbából, a befogóextenderből, a nukleinsav-analitból és a jelölőextenderből egy első hibrid komplexet hozzunk létre, és (ii) hordozóhoz kötött, befogópróba kompetitor oligonukleotid második hibrid komplexet létrehozzuk;

    (c) ezután adott esetben a szilárd hordozóhoz nem kötött anyagot szeparáljuk;

    (d) ezután a hordozó-kötött, első hibrid komplexet a preamplifikáló próbával és az amplifikációs multimerekkel hozzuk érintkezésbe hibridizációs körülmények között, hogy egy hordozóhoz kötött harmadik hibrid komplexet létrehozzunk;

    (e) a szilárd hordozóhoz nem kötött anyagot ezután szeparáljuk;

    (f) a hordozó-kötött harmadik hibrid komplexet hibridizációs körülmények között jelölőpróbákkal érintkeztetjük egy jelölt, hordozóhoz kötött negyedik hibrid komplex létrehozása céljából;

    (g) ezután a szilárd hordozóhoz nem kötött anyagot szeparáljuk; és (h) a hordozóhoz kötött negyedik hibrid komplexben a jelölő anyag jelenlétét detektáljuk, ahol a hordozón a jel jelenléte a mintában a nukleinsavanalit jelenlétét jelzi.
30. 30. Egy mintában lévő nukleinsav-analit detektálására szolgáló kit, azzal jellemezve, hogy tartalmaz:

    (a) egy szilárd hordozóhoz kötött befogópróbákat;

    (b) a befogópróbákhoz hibridizálódni képes első befogóextender molekulát és a nukleinsav-analit előre meghatározott szegmentjeit;

    (c) egy a befogópróbákhoz, valamint az első befogóextender molekulához kötődő szegmentektől eltérő nukleinsav-analit szegmentjeihez hibridizálódni képes eltérő második befogóextender molekulát;

    (d) az első és a második befogóextender molekulákhoz kötődőtől eltérő nukleinsav-analitok szegmentjeihez hibridizálódni képes jelölőextender molekulákat;

    (e) a jelölőextender molekulákhoz hibridizálódni képes nukleinsav szekvenciát tartalmazó jelölőpróba rendszert, és mely detektálható jelet biztosít közvetve vagy közvetlenül, ahol a befogópróbák egy az első befogóextender molekulához hibridizálódni képes első befogóextender kötő szekvenciát valamint egy második befogóextender molekulához hibridizálódni képes második befogóextender kötő szekvenciát tartalmazó próbát tartalmaz.
31. 31. A 30. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy a jelölőpróba rendszer tartalmaz (f) egy a jelölőextender molekulákhoz és számos azonos oligonukleotid alegységhez hibridizálódni képes nukleinsav szekvenciát tartalmazó amplifikációs multimert; és (g) az azonos oligonukleotid alegységekhez való hibridizációhoz tervezett jelölőpróbákat, és melyek közvetlenül vagy közvetve egy detektálható jelet biztosítanak.
32. 32. Egy mintában lévő nukleinsav-analit detektálására szolgáló kit, azzal jellemezve, hogy tartalmaz:

    (a) egy olyan szilárd hordozót, melyhez befogópróbák kötődnek;

    (b) a befogópróbákhoz és a nukleinsav-analit előre meghatározott szegmentjeihez hibridizálódni képes befogóextender molekulákat;

    (c) a nukleinsav-analit előre meghatározott szegmentjeihez hibridizálódni képes első jelölőextender molekulát;

    (d) az első jelölőextender molekulához kötődő szegmentektől eltérő nukleinsav-analit szegmentjeihez hibridizálódni képes második befogóextender molekulát;

    (e) a jelölt extender molekulákhoz és számos amplifikációs multimerhez kötődni képes adott esetbeni preamplifikáló próbát;

    (f) a jelölőextender molekulákhoz vagy a preamplifikáló próbához hibridizálódni képes nukleinsav szekvenciát valamint számos azonos oligonukleotid alegységet tartalmazó amplifikációs multimert; és (g) az azonos oligonukleotid alegységekhez való hibridizációhoz tervezett jelölőpróbákat, melyek közvetlenül vagy közvetve egy detektálható jelet biztosítanak.
33. 33. Egy mintában a nukleinsav-analit detektálására szolgáló kit azzal jellemezve, hogy tartalmaz:

    (a) egy szilárd hordozót, melyhez befogópróbák kötődnek;

    (b) a befogópróbákhoz és a nukleinsav-analit előre meghatározott szegmentjeihez hibridizálódni képes befogóextender molekulákat;

    (c) egy a nukleinsav-analit előre meghatározott szegmentjeihez hibridizálódni képes első jelölőextender molekulát;

    (d) egy a nukleinsav-analit olyan szegmentjeihez hibridizálódni képes második jelölőextender molekulát, mely eltér azoktól a szegmentektől, melyekhez az első jelölőextender molekula kötődik;

    (e) egy első amplifikációs multimert, mely (i) az első jelölőextender molekulához hibridizálódni képes nukleinsav szekvenciát és (ii) számos azonos oligonukleotid alegységet tartalmaz;

    (f) egy második amplifikációs multimert, mely (i) a második jelölőextender molekulához hibridizálódni képes nukleinsav szekvenciát és (ii) számos azonos oligonukleotid alegységet tartalmaz; és (g) egy az első amplifikációs multimerrel oligonukleotid alegységeivel hibridizálódni képes első nukleinsav szekvenciát és a második amplifikációs multimer oligonukleotid alegységeivel hibridizálódni képes második nukleinsav szekvenciát tartalmazó jelölőpróbákat, és melyek közvetlenül vagy közvetve egy detektálható jelet biztosítanak.
34. 34. Egy mintában lévő nukleinsav-analit detektálására szolgáló kit azzal jellemezve, hogy tartalmaz:

    (a) egy olyan szilárd hordozót, melyhez befogópróbák kötődnek;

    HU 221 237 Bl (b) a befogópróbákhoz és a nukleinsav-analit előre meghatározott szegmentjeihez hibridizálódni képes befogóextender molekulákat;

    (c) egy a befogópróbákhoz hibridizálódni képes nukleinsav szekvenciát tartalmazó kompetitor oligo- 5 nukleotidot;

    (d) a nukleinsav-analit olyan szegmentjeihez hibridizálódni képes jelölőextender molekulák, mely szegmentek mások, mint azok a szegmentek, melyekhez a befogóextender molekulák kötődnek; 10 (e) a jelölőextender molekulákhoz és számos amplifikációs multimerhez kötődni képes adott esetbeni preamplifikáló próbát;

    (f) a jelölőextender molekulákhoz vagy a preamplifikáló próbához hibridizálódni képes nukleinsav szekvenciát, valamint számos azonos oligonukleotid alegységet tartalmazó amplifikációs multimert; és (g) olyan jelölőpróbákat, melyeket úgy terveztünk, hogy az azonos oligonukleotid alegységekhez hibridizálódjanak, és melyek közvetlenül vagy közvetve egy detektálható jelet biztosítanak.