JPH09507024A - バックグランドノイズの減少を伴う液相核酸サンドイッチアッセイ - Google Patents
バックグランドノイズの減少を伴う液相核酸サンドイッチアッセイInfo
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Abstract
Description
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1. サンプル中の核酸分析物を検出するための液相におけるサンドイッチハイ ブリダイゼーションアッセイであって:(a)該分析物を直接的または間接的に固 体支持体に結合すること;(b)該分析物を標識すること;および(c)該分析物結合 標識の存在を検出することを包含し、 改良点として、第1の捕獲エキステンダー分子および別の第2の捕獲エキステ ンダー分子をアッセイ内に組み込むことを包含し、該第1のおよび第2の捕獲エ キステンダー分子が、それぞれ、該分析物中に存在する核酸配列にハイブリダイ ズし得る分析物結合セグメント、および固体支持体に結合する捕獲プローブ内に 存在する核酸配列にハイブリダイズし得る支持体結合セグメントを含有するポリ ヌクレオチドを含み、 ここで、該第1の捕獲エキステンダー分子の該分析物結合セグメントが、該第 2の捕獲エキステンダー分子の該分析物結合セグメントと区別され、さらにここ で、2つの別の該捕獲エキステンダー分子が単一の捕獲プローブに結合し得るよ うに、該捕獲プローブが、該第1の捕獲エキステンダー分子の該支持体結合セグ メントにハイブリダイズし得る第1の捕獲エキステンダー結合配列と、該第2の 捕獲エキステンダー分子の該支持体結合セグメントにハイブリダイズし得る第2 の捕獲エキステンダー結合配列とを含む、アッセイ。 2. 請求項1に記載のアッセイであって、前記核酸分析物が、前記捕獲プロー ブと、前記捕獲エキステンダー分子と、該核酸分析物との間で形成されるハイブ リッド複合体の該捕獲プローブから解離する融解温度Tm1が、該捕獲プローブと 捕獲エキステンダー分子との間で形成されるハイブリッド複合体の融解温度Tm2 よりも少なくとも約5℃高い、アッセイ。 3. 請求項2に記載のアッセイであって、少なくとも1つの工程が、Tm1複合体 形成には好ましいが、Tm2複合体形成には好ましくないストリンジェンシー条件 下で行われる、アッセイ。 4. 請求項3に記載のアッセイであって、ストリンジェンシーが、ホルムアミ ド濃度、カオトロピックな塩濃度、塩濃度、pH(水素イオン濃度)、有機溶媒成分 、および温度からなる群より選択される、少なくとも1つの工程のパラメーター を制御することによって制御される、アッセイ。 5. 請求項4に記載のアッセイであって、少なくとも1つの前記工程がTm2より も高くおよびTm1よりも低い温度で行われる、アッセイ。 6. 請求項3に記載のアッセイであって、少なくとも1つの前記工程が工程(a) を包含する、アッセイ。 7. サンプル中の核酸分析物の存在を検出する液相サンドイッチハイブリダイ ゼーションアッセイであって: (a)支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中の核酸配列に ハイブリダイズし得る第1のセグメントC-1および該捕獲プローブの核酸配列に ハイブリダイズし得る第2のセグメントC-2を有する捕獲エキステンダー分子と 、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL-1および標 識プローブシステムにハイブリダイズし得る第2のセグメントL-2を有する標識 エキステンダー分子と、L-2にハイブリダイズし得、そして直接的または間接的 に、検出可能なシグナルを生じさせる核酸配列M-1を含む標識プローブシステム とを提供すること; (b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステ ンダー分子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共にハイブリダ イゼーション条件下で、該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合した ハイブリッド複合体を形成すること; (c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること; (d)次いで、ハイブリダイズする条件下で該支持体に結合したハイブリッド複 合体と該標識プローブシステムとを接触させて、標識され、支持体に結合したハ イブリッド複合体を生成すること;および (e)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および (f)該標識された支持体に結合したハイブリッド複合体の標識の存在を検出す ること;を包含し、 ここで、該核酸分析物が、該捕獲プローブと、該捕獲エキステンダー分子と、 該核酸分析物との間で形成される該ハイブリッド複合体の該捕獲プローブから解 離する融解温度Tm1が、該捕獲プローブと捕獲エキステンダー分子との間で形成 されるハイブリッド複合体の融解温度Tm2よりも少なくとも約5℃高い、アッセ イ。 8. 請求項7に記載のアッセイであって、前記標識プローブシステムが、(i)核 酸配列M-1と、標識プローブにハイブリダイズし得る核酸配列M-2を含む多数の同 一のオリゴヌクレオチドサブユニットとを含有する増幅マルチマー、および(ii) M-2にハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナル を生じさせる核酸配列L-3を含む標識プローブを含有し、ここで、該アッセイの 工程(d)は、以下の工程: (d1)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合したハイブリッド複合体 と該増幅マルチマーとを接触させて、支持体に結合した第2のハイブリッド複合 体を生成する工程; (d2)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程; および (d3)次いで、ハイブリダイゼーション条件下で、該支持体に結合した第2のハ イブリッド複合体と該標識プローブとを接触させ、標識され、支持体に結合した ハイブリッド複合体を生成する工程; を包含する、アッセイ。 9. サンプル中の核酸分析物の存在を検出する液相サンドイッチハイブリダイ ゼーションアッセイであって: (a)支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中の核酸配列に ハイブリダイズし得る第1のセグメントC-1および該捕獲プローブの核酸配列に ハイブリダイズし得る第2のセグメントC-2を有する捕獲エキステンダー分子と 、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL-1およびプ リアンプリファイアープローブの核酸配列P-1にハイブリダイズし得る第2のセ グメントL-2を有する標識エキステンダー分子と、核酸配列P-1を有し、そして核 酸配列P-2を介して多数の増幅マルチマーと結合し得るプリアンプリファイアー プローブと、P-2、P-2にハイブリダイズし得る核酸配列M-1と標識プローブにハ イブリダイズし得る核酸配列M-2を含む多数の同一のオリゴヌクレオチドサブユ ニットとを含む増幅マルチマーと、M-2にハイブリダイズし得、そして直接的ま たは間接的に、検出可能なシグナルを生じさせる配列L-3を含む標識プローブと を提供すること; (b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステ ンダー分子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリ ダイゼーション条件下で該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合した 第1のハイブリッド複合体を形成すること; (c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること; (d)次いで、ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合した第1のハイ ブリッド複合体と該プリアンプリファイアープローブおよび該増幅マルチマーと を接触させて、支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を生成すること; (e)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること; (f)ハイブリダイゼーション条件下で、該支持体に結合した第2のハイブリッ ド複合体と該標識プローブとを接触させて、標識され、支持体に結合した第3の ハイブリッド複合体を生成すること; (g)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および (h)該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体の標識の存在を検出するこ と;を包含し、 ここで、該核酸分析物が、該捕獲プローブと、該捕獲エキステンダー分子と、 該核酸分析物との間で形成される該ハイブリッド複合体の該捕獲プローブから解 離する融解温度Tm1が、該捕獲プローブと捕獲エキステンダー分子との間で形成 されるハイブリッド複合体の融解温度Tm2よりも少なくとも約5℃高い、アッセ イ。 10. 請求項7に記載のアッセイであって、少なくとも1つの工程が、Tm1複合 体形成には好ましいが、Tm2複合体形成には好ましくないストリンジェンシー条 件下で行われる、アッセイ。 11. 請求項10に記載のアッセイであって、ストリンジェンシーが、ホルム アミド濃度、カオトロピックな塩濃度、塩濃度、pH(水素イオン濃度)、有機溶媒 成分、および温度からなる群より選択される、少なくとも1つの工程のパラメー ターを制御することによって制御される、アッセイ。 12. 請求項11に記載のアッセイであって、少なくとも1つの前記工程がTm2 よりも高く、そしてTm1よりも低い温度で行われる、アッセイ。 13. 請求項10に記載の方法であって、少なくとも1つの前記工程が工程(b) を包含する、アッセイ。 14. サンプル中の核酸分析物の存在を検出する液相サンドイッチハイブリダ イゼーションアッセイであって: (a)支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中に存在する核 酸配列にハイブリダイズし得る分析物結合セグメントおよび該捕獲プローブ内に 存在する核酸配列にハイブリダイズし得る支持体結合セグメントを含むポリヌク レオチドを含有する第1の捕獲エキステンダー分子と、該分析物中に存在する核 酸配列にハイブリダイズし得る分解物結合セグメントおよび該捕獲プローブ内に 存在する核酸配列にハイブリダイズし得る支持体結合セグメントを含むポリヌク レオチドを含有する別の第2の捕獲エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配 列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL-1および第2のセグメントL-2を有 する標識エキステンダー分子と、L-2にハイブリダイズし得る核酸配列M-1および 核酸配列M-2を含む多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する増 幅マルチマーと、M-2にハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、検 出可能なシグナルを生じさせる配列L-3を含む標識プローブとを提供すること; (b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステ ンダー分子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリ ダイゼーション条件下で該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合した 第1のハイブリッド複合体を形成すること; (c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること; (d)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合した第1のハイブリッド 複合体を該増幅マルチマーとを接触させて、支持体に結合した第2のハイブリッ ド複合体を生成すること; (e)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること; (f)ハイブリダイズする条件下で、該支持体に結合した第2のハイブリッド複 合体と該標識プローブとを接触させて、標識され、支持体に結合した第3のハイ ブリッド複合体を生成すること;および (g)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および (h)支持体に結合した第3のハイブリッド複合体の標識の存在を検出すること ;を包含し、 ここで、第1のおよび第2の捕獲エキステンダー分子の両方が該分析物に結合 している場合にのみ、工程(b)の該支持体に結合した第2のハイブリッド複合体 が形成するように、該捕獲エキステンダー分子が設計される、アッセイ。 15. サンプル中の核酸分析物の存在を検出する液相サンドイッチハイブリダ イゼーションアッセイであって: (a)固体支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中に存在す る核酸配列にハイブリダイズし得る分析物結合セグメントおよび該捕獲プローブ 内に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る支持体結合セグメントを含むポリ ヌクレオチドを含有する第1の捕獲エキステンダー分子と、該分析物中に存在す る核酸配列にハイブリダイズし得る分解物結合セグメントおよび該捕獲プローブ 内に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る支持体結合セグメントを含むポリ ヌクレオチドを含有する別の第2の捕獲エキステンダー分子と、該分析物中の核 酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL-1およびプリアンプリファイ アープローブ中の核酸配列P-1にハイブリダイズし得る第2のセグメントL-2を有 する標的エキステンダー分子と、核酸配列P-1を有し、そして核酸配列P-2を介し て多数の増幅マルチマーに結合し得るプリアンプリファイアープローブと、P-2 にハイブリダイズし得る核酸配列M-1および標識プローブにハイブリダイズし得 る核酸配列M-2を含む多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する 増幅マルチマーと、M-2にハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、 検出可能なシグナルを生じさせる配列L-3を含む標識プローブとを提供すること ; (b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステ ンダー分子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリ ダイゼーション条件下で、該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合し た第1のハイブリッドの複合体を形成すること; (c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること; (d)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合した第1のハイブリッド 複合体と該プリアンプリファイアープローブおよび該増幅マルチマーとを接触さ せて、支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を生成すること; (e)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること; (f)ハイブリダイズする条件下で、該支持体に結合した第2のハイブリッド複 合体と該標識プローブとを接触させて、標識され、支持体に結合した第3のハイ ブリッド複合体を生成すること;および (g)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および (h)支持体に結合した第3のハイブリッド複合体の標識の存在を検出すること ;を包含し、 ここで、第1のおよび第2の捕獲エキステンダー分子の両方が該分析物に結合 している場合にのみ、工程(b)の該支持体に結合した第1のハイブリッド複合体 が形成するように、該捕獲エキステンダー分子が設計される、アッセイ。 16. 請求項14に記載のアッセイであって、前記捕獲プローブが、前記第1 の捕獲エキステンダー分子の前記支持体結合セグメントにハイブリダイズし得る 第1の捕獲エキステンダー結合配列と、前記第2の捕獲エキステンダー分子の該 支持体結合セグメントにハイブリダイズし得る第2の捕獲エキステンダー結合配 列とを含有し、そのような2つの捕獲エキステンダー分子が単一の捕獲プローブ に結合し得る、アッセイ。 17. 請求項15に記載の方法であって、前記捕獲プローブが、前記第1の捕 獲エキステンダー分子の前記支持体結合セグメントにハイブリダイズし得る第1 の捕獲エキステンダー結合配列と、前記第2の捕獲エキステンダー分子の該支持 体結合セグメントにハイブリダイズし得る第2の捕獲エキステンダー結合配列と を含有し、そのような2つの捕獲エキステンダー分子が単一の捕獲プローブに結 合し得るアッセイ。 18. サンプル中の核酸分析物の存在を検出するための液相サンドイッチハイ ブリダイゼーションアッセイであって: (a)支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中の核酸配列に ハイブリダイズし得る分析物結合セグメントおよび該捕獲プローブ内に存在する 核酸配列にハイブリダイズし得る支持体結合セグメントを含有するポリヌクレオ チドを含む捕獲エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズ し得る第1のセグメントおよび標識プローブシステムにハイブリダイズし得る第 2のセグメントを有する第1の標識エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配 列にハイブリダイズし得る第1のセグメントおよび標識プローブシステムにハイ ブリダイズし得る第2のセグメントを有する別の第2の標識エキステンダー分子 と、該第1の標識エキステンダー分子および該第2の標識エキステンダー分子の 該第2のセグメントにハイブリダイズし得る核酸配列を含む標識プローブシステ ムを提供し、そしてこのプローブシステムが直接的または間接的に、検出可能な シグナルを生じること; (b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステ ンダー分子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリ ダイゼーション条件下で、該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合し たハイブリッド複合体を形成すること; (c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること; (d)次いで、ハイブリダイズする条件下で該支持体に結合したハイブリッド複 合体と標識プローブシステムとを接触させて、標識され、支持体に結合したハイ ブリッド複合体を生成すること;および (e)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および (f)該標識され、支持体に結合したハイブリッド複合体の標識の存在を検出す ること;を包含し ここで、第1のおよび第2の標識エキステンダー分子の両方が該分析物に結合 した場合にのみ、工程(d)の該標識され、該支持体に結合したハイブリッド複合 体を形成するように、該捕獲エキステンダー分子が設計される、アッセイ。 19. 請求項18に記載のアッセイであって、前記標識プローブシステムが、( i)前記第1の標識エキステンダー分子および前記第2の標識エキステンダー分子 の前記第2のセグメントにハイブリダイズし得る前記核酸配列を含有する増幅マ ルチマー、および標識プローブにハイブリダイズし得る核酸配列M-2を含有する 多くの同一なオリゴヌクレオチドサブユニット、および(ii)M-2にハイブリダイ ズし得、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じさせる核酸配 列L-3を含有する標識プローブを含み、そしてここで、該アッセイの工程(d)は、 以下の工程: (d1)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合したハイブリッド複合体 と、該増幅マルチマーとを接触させて、第2の支持体に結合したハイブリッド複 合体を生成する工程; (d2)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程; および (d3)次いで、ハイブリダイゼーション条件下で、第2の該支持体に結合したハ イブリッド複合体と、該標識プローブとを接触させて、標識され、支持体に結合 したハイブリッド複合体を生成する工程; を包含する、アッセイ。 20. サンプル中の核酸分析物の存在を検出するための液相サンドイッチハイ ブリダイゼーションアッセイであって: (a)支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中に存在する核 酸配列にハイブリダイズし得る分析物結合セグメントおよび該捕獲プローブ内に 存在する核酸配列にハイブリダイズし得る支持体結合セグメントを含有するポリ ヌクレオチドを含む捕獲エキステンダー分子と、分析物中の核酸配列にハイブリ ダイズし得る第1のセグメント、およびプリアンプリファイアープローブにハイ ブリダイズし得る第2のセグメント(順番に多数の増幅マルチマーと結合し得る) を有する第1の標識エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダ イズし得る第1のセグメントおよびプリアンプリファイアープローブにハイブリ ダイズし得る第2のセグメント(順番に多数の増幅マルチマーに結合しる)を有す る別の第2の標識エキステンダー分子と、該標識エキステンダー分子にハイブリ ダイズし得る核酸配列M-1を含有し、そして核酸配列M-2を含有する多数の同一な オリゴヌクレオチドサブユニットを含有する増幅マルチマーと、M-2にハイブリ ダイズし得る配列を含有し、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナル を生じさせる標識プローブとを提供すること; (b)該支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステンダ ー分子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリダイ ズ条件下で該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合した第1のハイブ リッド複合体を形成すること; (c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること; (d)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合した第1のハイブリッド 複合体と、該プリアンプリファイアープローブおよび該増幅マルチマーとを接触 させて、支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を生成すること; (e)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること; (f)ハイブリダイズする条件下で、該支持体に結合した第2のハイブリッド複 合体と該標識プローブとを接触させ、標識され、支持体に結合した第3のハイブ リッド複合体を生成すること;および (g)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および (h)該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体の標識の存在を検出するこ と;を包含し、 ここで、第1のおよび第2の標識エキステンダー分子の両方が該分析物に結合 している場合にのみ、工程(d)の支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を 形成するように、該標識エキステンダー分子が設計される、アッセイ。 21. サンプル中の核酸分析物の存在を検出する液相サンドイッチハイブリダ イゼーションアッセイであって: (a)支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中の核酸配列に ハイブリダイズし得る第1のセグメントC-1および該捕獲プローブの核酸配列に ハイブリダイズし得る第2のセグメントC-2を有する捕獲エキステンダー分子と 、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL-1および第 1の増幅マルチマーにハイブリダイズし得る第2のセグメントL-2を有する第1 の標識エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第 1のセグメントL-1aおよび第2の増幅マルチマーにハイブリダイズし得る第2の セグメントL-2aを有する第2の標識エキステンダー分子と、L-2にハイブリダイ ズし得る核酸配列M-1および標識プローブにハイブリダイズし得る核酸配列M-2を 含有する多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する第1の増幅マ ルチマーと、L-2aにハイブリダイズし得る核酸配列M-1aおよび標識プローブにハ イブリダイズし得る核酸配列M-2aを含有する多数の同一なオリゴヌクレオチドサ ブユニットを含有する第2の増幅マルチマーと、該増幅マルチマーにハイブリダ イズし得、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じさせる標識 プローブとを提供すること; (b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序にで連続して、該捕獲エキス テンダー分子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブ リダイズ条件下で該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合した第1の ハイブリッド複合体を形成すること; (c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること; (d)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合した第1のハイブリッド 複合体と、該増幅マルチマーとを接触させ、支持体に結合した第2のハイブリッ ド複合体を生成すること; (e)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること; (f)ハイブリダイズする条件下で、該支持体に結合した第2のハイブリッド複 合体と標識プローブとを接触させて、標識され、支持体に結合した第3のハイブ リッド複合体を生成すること; (g)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および (h)該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体の標識の存在を検出するこ と;を包含し、 ここで、標識プローブは、該第1の増幅マルチマーにハイブリダイズし得る第 1の核酸セグメントと、および該第2の増幅マルチマーにハイブリダイズし得る 第2の核酸セグメントを含有し、このような該支持体に結合した第3のハイブリ ッド複合体は、該第1の増幅マルチマーおよび第2の増幅マルチマーが標識プロ ーブを介して結合されない限り、形成されない、アッセイ。 22. サンプル中の核酸分析物の存在を検出する液相サンドイッチハイブリダ イゼーションアッセイであって: (a)支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中の核酸配列に ハイブリダイズし得る第1のセグメントC-1および該捕獲プローブの核酸配列に ハイブリダイズし得る第2のセグメントC-2を有する捕獲エキステンダー分子と 、分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL-1および第1 の増幅マルチマーにハイブリダイズし得る第2のセグメントL-2を有する第1の 標識エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1 のセグメントL-1aおよび第2の増幅マルチマーにハイブリダイズし得る第2のセ グメントL-2aを有する第2の標識エキステンダー分子と、L-2にハイブリダイズ し得る核酸配列M-1および第1の標識プローブセグメントにハイブリダイズし得 る 核酸配列M-2を含有する多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含有す る第1の増幅マルチマーと、L-2aにハイブリダイズし得る核酸配列M-1aおよび標 識プローブセグメントにハイブリダイズし得る核酸配列M-2aを含有する多数の同 一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する第2の増幅マルチマーと、該増 幅マルチマーにハイブリダイズし得る第1のおよび第2の標識プローブセグメン トとを提供し、そしてこれらのプローブが、増幅マルチマーの近傍に存在する場 合、検出可能なシグナルを生じること; (b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステ ンダー分子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリ ダイゼーション条件下で該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合した 第1のハイブリッド複合体を形成すること; (c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること; (d)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合した第1のハイブリッド 複合体と該増幅マルチマーとを接触させて、支持体に結合した第2のハイブリッ ド複合体を生成すること; (e)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること; (f)ハイブリダイズする条件下で、該支持体に結合した第2のハイブリッド複 合体と、該標識プローブとを接触させて、標識され、支持体に結合した第3のハ イブリッド複合体を生成すること; (g)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および (h)該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体における、該第1の標識プ ローブセグメントおよび第2の標識プローブセグメントとの間の相互作用により 検出可能なシグナルの存在を認めること; を包含する、アッセイ。 23. 請求項22に記載のアッセイであって、前記第1の標識プローブセグメ ントが第1の酵素フラグメントを含み、そして前記第2の標識プローブセグメン トが第2の酵素フラグメントを含み、そしてここで、該第1のおよび第2の酵素 フラグメントが、標的の存在を伴わない限り不活性な相補的酵素フラグメントで ある、アッセイ。 24. 請求項22に記載のアッセイであって、前記第1の標識プローブセグメ ントが酵素を含み、そして前記第2の標識プローブセグメントが該酵素の補因子 を含み、そしてここで、該酵素および該補因子が、標的の存在を伴わない限り不 活性である、アッセイ。 25. 請求項22に記載のアッセイであって、前記第1の標識プローブセグメ ントが酵素を含み、そして前記第2の標識プローブセグメントが発光または蛍光 活性化物質を含み、ここで該酵素が産物の形成を触媒し、そして該活性化物質が 該産物の検出を増強する、アッセイ。 26. サンプル中の核酸分析物を検出するための液相におけるサンドイッチハ イブリダイゼーションアッセイであって:(a)該分析物を直接的または間接的に 固体支持体に結合した捕獲プローブに捕獲エキステンダー分子を介して結合する こと;(b)該分析物を標識すること;および(c)該支持体上で分析物結合標識の存 在を検出することを包含し、 改良点として、該固体支持体に結合した捕獲プローブにハイブリダイズし得る 核酸配列を含有する競合物オリゴヌクレオチドをアッセイ内に組み込むことを包 含する、アッセイ。 27. サンプル中の核酸分析物の存在を検出するための液相サンドイッチハイ ブリダイゼーションアッセイであって: (a)支持体上の捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中の核酸配列に ハイブリダイズし得る第1のセグメントC-1および該捕獲プローブの核酸配列に ハイブリダイズし得る第2のセグメントC-2を有する捕獲エキステンダー分子と 、該捕獲プローブにハイブリダイズし得る核酸配列を含有する競合物オリゴヌク レオチドと、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL- 1および標識プローブシステムにハイブリダイズし得る第2のセグメントL-2を有 する標識エキステンダー分子と、L-2にハイブリダイズし得る核酸配列M-1を含有 し、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じる標識プローブシ ステムとを提供すること; (b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステ ンダー分子、競合物オリゴヌクレオチド、標識エキステンダー分子、および該捕 獲プローブと共に、ハイブリダイズ条件下で該核酸分析物をインキュベートして 、(i)捕獲エキステンダー、核酸分析物、および標識エキステンダーの第1のハ イブリッド複合体、および(ii)競合物オリゴヌクレオチドと反応した被覆捕獲プ ローブを形成すること; (c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること; (d)次いで、ハイブリダズする条件下で、該支持体に結合したハイブリッド複 合体と該標識プローブシステムとを接触させて、標識され、支持体に結合したハ イブリッド複合体を生成すること;および (e)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および (f)該標識され、支持体に結合したハイブリッド複合体の標識の存在を検出す ること; を包含する、アッセイ。 28. 請求項27に記載のアッセイであって、前記標識プローブシステムが、( i)前記核酸配列M-1を含有する増幅マルチマーおよび標識プローブにハイブリダ イズし得る核酸配列M-2を含有する多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニッ ト、および(ii)M-2にハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、検出 可能なシグナルを生じる核酸配列L-3を含有する標識プローブを含み、ここで該 アッセイの工程(d)は、以下の工程: (d1)ハイブリダイゼーション条件下で前記支持体に結合したハイブリッド複合 体と前記増幅マルチマーとを接触させて、第2の支持体に結合したハイブリッド 複合体を生成する工程; (d2)次いで、必要に応じて、前記固体支持体に結合しない物質を分離する工程 ;および (d3)次いで、ハイブリドゼーション条件下で、該第2の支持体に結合したハイ ブリド複合体と、該標識プローブとを接触させて、標識され、支持体に結合した ハイブリッド複合体を生成する工程; を含む、アッセイ。 29. サンプル中の核酸分析物の存在を検出する液相サンドイッチハイブリダ イゼーションアッセイであって: (a)支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中の核酸配列に ハイブリダイズし得る第1のセグメントC-1、および該捕獲プローブの核酸配列 にハイブリダイズし得る第2のセグメントC-2を有する捕獲エキステンダー分子 と、該捕獲分子にハイブリダイズし得る少なくとも1つの核酸配列を含有する競 合物オリゴヌクレオチドと、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1 のセグメントL-1およびプリアンプリファイアープローブ中の核酸配列P-1にハイ ブリダイズし得る第2のセグメントL-2を有する標識エキステンダー分子と、該 核酸配列P-1を有し、そして核酸配列P-2を介して多数の増幅マルチマーに結合し 得るプリアンプリファイアープローブと、P-2にハイブリダイズし得る核酸配列M -1および標識プローブにハイブリダイズし得る核酸配列M-2を含有する多数の同 一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する増幅マルチマーと、M-2にハイ ブリダイズし得る配列L-3を含有し、そして直接的または間接的に、検出可能な シグナルを生じさせる標識プローブとを提供すること; (b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該核酸分析物を 、該捕獲エキステンダー分子、競合物オリゴヌクレオチド、標識エキステンダー 分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリダイズ条件下でインキュベートし て、(i)捕獲エキステンダー、核酸分析物および標識エキステンダーの第1のハ イブリッド複合体、および(ii)競合物オリゴヌクレオチドと反応した被覆捕獲プ ローブを形成すること; (c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること; (d)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合した第1のハイブリッド 複合体と該プリアンプリファイアープローブおよび該増幅マルチマーとを接触さ せて、支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を生成すること; (e)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること; (f)ハイブリダイズ条件下で、該支持体に結合した第2のハイブリッド複合体 を該標識プローブと接触させて、標識され、支持体に結合した第3のハイブリッ ド複合体を生成すること; (g)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および (h)該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体の標識の存在を検出するこ と; を包含する、アッセイ。 30. サンプル中の核酸分析物を検出するためのキットであって: (a)支持体に結合する捕獲プローブを有する固体支持体; (b)該捕獲プローブと、該核酸分析物の予め定められたセグメントとにハイブ リダイズし得る第1の捕獲エキステンダー分子; (c)該第1の捕獲エキステンダー分子が結合する該捕獲プローブおよび該セグ メントとは異なる該核酸分析物の該捕獲プローブおよびセグメントにハイブリダ イズし得る別の第2の捕獲エキステンダー分子; (d)該第1のおよび第2の捕獲エキステンダー分子が結合するセグメントとは 異なる該核酸分析物のセグメントにハイブリダイズし得る標識エキステンダー分 子; (e)該標識エキステンダー分子にハイブリダイズし得る核酸配列を含有し、そ して、直接的または間接的に、検出可能なシグナルを提供する、標識プローブシ ステムを含み、 ここで、該捕獲プローブが、該第1の捕獲エキステンダー分子にハイブリダイ ズし得る第1の捕獲エキステンダー結合配列と、該第2の捕獲エキステンダー分 子にハイブリダイズし得る第2の捕獲エキステンダー結合配列とを有するプロー ブ; を含む、キット。 31. 請求項30に記載のキットであって、前記標識プローブシステムが、(f) 前記標識エキステンダー分子および多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニッ トにハイブリダイズし得る核酸配列を含む増幅マルチマー;および (g)該同一なサブユニットにハイブリダイズすることが意図され、そして直接 的または間接的に、検出可能なシグナルを提供する標識プローブ; を含む、キット。 32. サンプル中の核酸分析物を検出するキットであって: (a)支持体に結合する捕獲プローブを有する固体支持体; (b)該捕獲プローブと該核酸分析物の予め定められたセグメントとにハイブリ ダイズし得る捕獲エキステンダー分子; (c)該核酸分析物の予め定められたセグメントにハイブリダイズし得る第1の 標識エキステンダー分子; (d)該第1の標識エキステンダー分子が結合するセグメントとは異なる該核酸 分析物のセグメントにハイブリダイズし得る第2の標識エキステンダー分子; (e)該標識エキステンダー分子および多数の増幅マルチマーに結合し得る任意 のプリアンプリファイアープローブ; (f)該標識エキステンダー分子または該プリアンプリファイアープローブにハ イブリダイズし得る核酸配列と、多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニット とを含む増幅マルチマー;および (g)該同一なオリゴヌクレオチドサブユニットにハイブリダイズするように設 計され、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを提供する標識プロ ーブ; を含む、キット。 33. サンプル中の核酸分析物を検出するためのキットであって、 (a)支持体に結合する捕獲プローブを有する固体支持体; (b)該捕獲プローブと、該核酸分析物の予め定められたセグメントとにハイブ リダイズし得る捕獲エキステンダー分子; (c)該核酸分析物の予め定められたセグメントにハイブリダイズし得る第1の 標識エキステンダー分子; (d)該第1の標識エキステンダー分子が結合するセグメントとは異なる該核酸 分析物のセグメントにハイブリダイズし得る第2の標識エキステンダー分子; (e)(i)該第1の標識エキステンダー分子にハイブリダイズし得る核酸配列、お よび(ii)多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含む第1の増幅マルチ マー; (f)(i)該第2の標識エキステンダー分子にハイブリダイズし得る核酸配列、お よび(ii)多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含む第2の増幅マルチ マー;および (g)該第1の増幅マルチマーのオリゴヌクレオチドサブユニットにハイブリダ イズし得る第1の核酸配列と、該第2の増幅マルチマーのオリゴヌクレオチドサ ブユニットとハイブリダイズし得る第2の核酸配列を含有する標識プローブであ って、該標識プローブは、直接的または間接的に、検出可能なシグナルを提供す ることを包含する、標識プローブ; を含む、キット。 34. サンプル中の核酸分析物を検出するためのキットであって、 (a)支持体に結合する捕獲プローブを有する固体支持体; (b)該捕獲プローブと、該核酸分析物の予め定められたセグメントとにハイブ リダイズし得る捕獲エキステンダー分子; (c)該捕獲プローブにハイブリダイズし得る核酸配列を含む競合物オリゴヌク レオチド; (d)該捕獲エキステンダー分子が結合するセグメントとは異なる該核酸分析物 のセグメントにハイブリダイズし得る標識エキステンダー分子; (e)該標識エキステンダー分子および多数の増幅マルチマーに結合し得る任意 のプリアンプリファイアープローブ; (f)該標識エキステンダー分子または該プリアンプリファイアープローブにハ イブリダイズし得る核酸配列と、多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニット とを含有する増幅マルチマー;および (g)該同一なオリゴヌクレオチドサブユニットにハイブリダイズするように設 計され、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを提供する標識プロ ーブ; を含む、キット。
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