JP2004301849A - バックグランドノイズの減少を伴う液相核酸サンドイッチアッセイ - Google Patents
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Abstract
液相ハイブリダイゼーションアッセイにおいて生じるバックグランドシグナルを、本質的に減少する新規の技術を提供すること。この技術は、目的の標的ポリヌクレオチドの存在下においてのみ生成される検出可能なシグナルを提供するように、非特異的ハイブリダイゼーションおよび非特異的結合の現象を排除するまたは有意に減少することを前提とする。新規アッセイを行うためのキットを提供すること。
【解決手段】
分析物を固体の支持体に結合する工程、分析物を標識する工程、および支持体上の標識の存在を検出する工程を包含する、液相サンドイッチハイブリダイゼーションの改良。
Description
本発明は、一般的に、核酸化学およびハイブリダイゼーションアッセイに関する。より詳細には、本発明は、液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおいて、主に非特異的ハイブリダイゼーションおよび/または非特異的結合に由来するバックグランドノイズを最小限に抑えることによって、より標的依存性のシグナルを生成する方法に関する。
核酸ハイブリダイゼーションアッセイは、一般的に、遺伝学的研究、生化学的研究および臨床診断に使用される。基礎的な核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、一本鎖分析物の核酸は標識一本鎖核酸プローブとハイブリダイズし、そして得られた標識二本鎖が検出される。この基本的構成の改変が開発され、精度が高められ、異質物質から検出しようとする二本鎖の分離が容易になり、および/または検出されるシグナルが増幅されている。
サンプル中の核酸分析物を検出するための方法およびキットが提供される。一般的に、本方法は分析物を固体の支持体に結合する工程、分析物を標識する工程、および支持体上の標識の存在を検出する工程を包含する液相サンドイッチハイブリダイゼーションの改良を示す。好ましい方法は、分析物−プローブ複合体のより有意な標識の結合を可能にする増幅マルチマーの使用を包含し、アッセイの感度および特異性を増強する。
1. サンプル中の核酸分析物を検出するための液相におけるサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって:(a)該分析物を直接的または間接的に固体支持体に結合すること;(b)該分析物を標識すること;および(c)該分析物結合標識の存在を検出することを包含し、
改良点として、第1の捕獲エキステンダー分子および別の第2の捕獲エキステンダー分子をアッセイ内に組み込むことを包含し、該第1のおよび第2の捕獲エキステンダー分子が、それぞれ、該分析物中に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る分析物結合セグメント、および固体支持体に結合する捕獲プローブ内に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る支持体結合セグメントを含有するポリヌクレオチドを含み、
ここで、該第1の捕獲エキステンダー分子の該分析物結合セグメントが、該第2の捕獲エキステンダー分子の該分析物結合セグメントと区別され、さらにここで、2つの別の該捕獲エキステンダー分子が単一の捕獲プローブに結合し得るように、該捕獲プローブが、該第1の捕獲エキステンダー分子の該支持体結合セグメントにハイブリダイズし得る第1の捕獲エキステンダー結合配列と、該第2の捕獲エキステンダー分子の該支持体結合セグメントにハイブリダイズし得る第2の捕獲エキステンダー結合配列とを含む、アッセイ。
(a)支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントC-1および該捕獲プローブの核酸配列にハイブリダイズし得る第2のセグメントC-2を有する捕獲エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL-1および標識プローブシステムにハイブリダイズし得る第2のセグメントL-2を有する標識エキステンダー分子と、L-2にハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じさせる核酸配列M-1を含む標識プローブシステムとを提供すること;
(b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステンダー分子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共にハイブリダイゼーション条件下で、該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合したハイブリッド複合体を形成すること;
(c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;
(d)次いで、ハイブリダイズする条件下で該支持体に結合したハイブリッド複合体と該標識プローブシステムとを接触させて、標識され、支持体に結合したハイブリッド複合体を生成すること;および
(e)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および
(f)該標識された支持体に結合したハイブリッド複合体の標識の存在を検出すること;を包含し、
ここで、該核酸分析物が、該捕獲プローブと、該捕獲エキステンダー分子と、該核酸分析物との間で形成される該ハイブリッド複合体の該捕獲プローブから解離する融解温度Tm1が、該捕獲プローブと捕獲エキステンダー分子との間で形成されるハイブリッド複合体の融解温度Tm2よりも少なくとも約5℃高い、アッセイ。
(d1)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合したハイブリッド複合体と該増幅マルチマーとを接触させて、支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を生成する工程;
(d2)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;および
(d3)次いで、ハイブリダイゼーション条件下で、該支持体に結合した第2のハイブリッド複合体と該標識プローブとを接触させ、標識され、支持体に結合したハイブリッド複合体を生成する工程;
を包含する、アッセイ。
(a)支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントC-1および該捕獲プローブの核酸配列にハイブリダイズし得る第2のセグメントC-2を有する捕獲エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL-1およびプリアンプリファイアープローブの核酸配列P-1にハイブリダイズし得る第2のセグメントL-2を有する標識エキステンダー分子と、核酸配列P-1を有し、そして核酸配列P-2を介して多数の増幅マルチマーと結合し得るプリアンプリファイアープローブと、P-2、P-2にハイブリダイズし得る核酸配列M-1と標識プローブにハイブリダイズし得る核酸配列M-2を含む多数の同一のオリゴヌクレオチドサブユニットとを含む増幅マルチマーと、M-2にハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じさせる配列L-3を含む標識プローブとを提供すること;
(b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステンダー分子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリダイゼーション条件下で該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合した第1のハイブリッド複合体を形成すること;
(c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;
(d)次いで、ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合した第1のハイブリッド複合体と該プリアンプリファイアープローブおよび該増幅マルチマーとを接触させて、支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を生成すること;
(e)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;
(f)ハイブリダイゼーション条件下で、該支持体に結合した第2のハイブリッド複合体と該標識プローブとを接触させて、標識され、支持体に結合した第3のハイブリッド複合体を生成すること;
(g) 次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および
(h)該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体の標識の存在を検出すること;を包含し、
ここで、該核酸分析物が、該捕獲プローブと、該捕獲エキステンダー分子と、該核酸分析物との間で形成される該ハイブリッド複合体の該捕獲プローブから解離する融解温度Tm1が、該捕獲プローブと捕獲エキステンダー分子との間で形成されるハイブリッド複合体の融解温度Tm2よりも少なくとも約5℃高い、アッセイ。
(a)支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る分析物結合セグメントおよび該捕獲プローブ内に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る支持体結合セグメントを含むポリヌクレオチドを含有する第1の捕獲エキステンダー分子と、該分析物中に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る分解物結合セグメントおよび該捕獲プローブ内に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る支持体結合セグメントを含むポリヌクレオチドを含有する別の第2の捕獲エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL-1および第2のセグメントL-2を有する標識エキステンダー分子と、L-2にハイブリダイズし得る核酸配列M-1および核酸配列M-2を含む多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する増幅マルチマーと、M-2にハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じさせる配列L-3を含む標識プローブとを提供すること;
(b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステンダー分子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリダイゼーション条件下で該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合した第1のハイブリッド複合体を形成すること;
(c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;
(d)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合した第1のハイブリッド複合体を該増幅マルチマーとを接触させて、支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を生成すること;
(e)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;
(f)ハイブリダイズする条件下で、該支持体に結合した第2のハイブリッド複合体と該標識プローブとを接触させて、標識され、支持体に結合した第3のハイブリッド複合体を生成すること;および
(g)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および
(h)支持体に結合した第3のハイブリッド複合体の標識の存在を検出すること;を包含し、
ここで、第1のおよび第2の捕獲エキステンダー分子の両方が該分析物に結合している場合にのみ、工程(b)の該支持体に結合した第2のハイブリッド複合体が形成するように、該捕獲エキステンダー分子が設計される、アッセイ。
(a)固体支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る分析物結合セグメントおよび該捕獲プローブ内に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る支持体結合セグメントを含むポリヌクレオチドを含有する第1の捕獲エキステンダー分子と、該分析物中に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る分解物結合セグメントおよび該捕獲プローブ内に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る支持体結合セグメントを含むポリヌクレオチドを含有する別の第2の捕獲エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL-1およびプリアンプリファイアープローブ中の核酸配列P-1にハイブリダイズし得る第2のセグメントL-2を有する標的エキステンダー分子と、核酸配列P-1を有し、そして核酸配列P-2を介して多数の増幅マルチマーに結合し得るプリアンプリファイアープローブと、P-2にハイブリダイズし得る核酸配列M-1および標識プローブにハイブリダイズし得る核酸配列M-2を含む多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する増幅マルチマーと、M-2にハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じさせる配列L-3を含む標識プローブとを提供すること;
(b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステンダー分子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリダイゼーション条件下で、該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合した第1のハイブリッドの複合体を形成すること;
(c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;
(d)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合した第1のハイブリッド複合体と該プリアンプリファイアープローブおよび該増幅マルチマーとを接触させて、支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を生成すること;
(e)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;
(f)ハイブリダイズする条件下で、該支持体に結合した第2のハイブリッド複合体と該標識プローブとを接触させて、標識され、支持体に結合した第3のハイブリッド複合体を生成すること;および
(g)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および
(h)支持体に結合した第3のハイブリッド複合体の標識の存在を検出すること;を包含し、
ここで、第1のおよび第2の捕獲エキステンダー分子の両方が該分析物に結合している場合にのみ、工程(b)の該支持体に結合した第1のハイブリッド複合体が形成するように、該捕獲エキステンダー分子が設計される、アッセイ。
(a)支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る分析物結合セグメントおよび該捕獲プローブ内に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る支持体結合セグメントを含有するポリヌクレオチドを含む捕獲エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントおよび標識プローブシステムにハイブリダイズし得る第2のセグメントを有する第1の標識エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントおよび標識プローブシステムにハイブリダイズし得る第2のセグメントを有する別の第2の標識エキステンダー分子と、該第1の標識エキステンダー分子および該第2の標識エキステンダー分子の該第2のセグメントにハイブリダイズし得る核酸配列を含む標識プローブシステムを提供し、そしてこのプローブシステムが直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じること;
(b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステンダー分子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリダイゼーション条件下で、該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合したハイブリッド複合体を形成すること;
(c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;
(d)次いで、ハイブリダイズする条件下で該支持体に結合したハイブリッド複合体と標識プローブシステムとを接触させて、標識され、支持体に結合したハイブリッド複合体を生成すること;および
(e)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および
(f)該標識され、支持体に結合したハイブリッド複合体の標識の存在を検出すること;を包含し
ここで、第1のおよび第2の標識エキステンダー分子の両方が該分析物に結合した場合にのみ、工程(d)の該標識され、該支持体に結合したハイブリッド複合体を形成するように、該捕獲エキステンダー分子が設計される、アッセイ。
(d1)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合したハイブリッド複合体と、該増幅マルチマーとを接触させて、第2の支持体に結合したハイブリッド複合体を生成する工程;
(d2)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;および
(d3)次いで、ハイブリダイゼーション条件下で、第2の該支持体に結合したハイブリッド複合体と、該標識プローブとを接触させて、標識され、支持体に結合したハイブリッド複合体を生成する工程;
を包含する、アッセイ。
(a)支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る分析物結合セグメントおよび該捕獲プローブ内に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る支持体結合セグメントを含有するポリヌクレオチドを含む捕獲エキステンダー分子と、分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメント、およびプリアンプリファイアープローブにハイブリダイズし得る第2のセグメント(順番に多数の増幅マルチマーと結合し得る)を有する第1の標識エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントおよびプリアンプリファイアープローブにハイブリダイズし得る第2のセグメント(順番に多数の増幅マルチマーに結合しる)を有する別の第2の標識エキステンダー分子と、該標識エキステンダー分子にハイブリダイズし得る核酸配列M-1を含有し、そして核酸配列M-2を含有する多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する増幅マルチマーと、M-2にハイブリダイズし得る配列を含有し、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じさせる標識プローブとを提供すること;
(b)該支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステンダー分子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリダイズ条件下で該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合した第1のハイブリッド複合体を形成すること;
(c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;
(d)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合した第1のハイブリッド複合体と、該プリアンプリファイアープローブおよび該増幅マルチマーとを接触させて、支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を生成すること;
(e)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;
(f)ハイブリダイズする条件下で、該支持体に結合した第2のハイブリッド複合体と該標識プローブとを接触させ、標識され、支持体に結合した第3のハイブリッド複合体を生成すること;および
(g)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および
(h)該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体の標識の存在を検出すること;を包含し、
ここで、第1のおよび第2の標識エキステンダー分子の両方が該分析物に結合している場合にのみ、工程(d)の支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を形成するように、該標識エキステンダー分子が設計される、アッセイ。
(a)支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントC-1および該捕獲プローブの核酸配列にハイブリダイズし得る第2のセグメントC-2を有する捕獲エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL-1および第1の増幅マルチマーにハイブリダイズし得る第2のセグメントL-2を有する第1の標識エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL-1aおよび第2の増幅マルチマーにハイブリダイズし得る第2のセグメントL-2aを有する第2の標識エキステンダー分子と、L-2にハイブリダイズし得る核酸配列M-1および標識プローブにハイブリダイズし得る核酸配列M-2を含有する多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する第1の増幅マルチマーと、L-2aにハイブリダイズし得る核酸配列M-1aおよび標識プローブにハイブリダイズし得る核酸配列M-2aを含有する多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する第2の増幅マルチマーと、該増幅マルチマーにハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じさせる標識プローブとを提供すること;
(b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序にで連続して、該捕獲エキステンダー分子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリダイズ条件下で該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合した第1のハイブリッド複合体を形成すること;
(c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;
(d)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合した第1のハイブリッド複合体と、該増幅マルチマーとを接触させ、支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を生成すること;
(e)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;
(f)ハイブリダイズする条件下で、該支持体に結合した第2のハイブリッド複合体と標識プローブとを接触させて、標識され、支持体に結合した第3のハイブリッド複合体を生成すること;
(g) 次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および
(h)該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体の標識の存在を検出すること;を包含し、
ここで、標識プローブは、該第1の増幅マルチマーにハイブリダイズし得る第1の核酸セグメントと、および該第2の増幅マルチマーにハイブリダイズし得る第2の核酸セグメントを含有し、このような該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体は、該第1の増幅マルチマーおよび第2の増幅マルチマーが標識プローブを介して結合されない限り、形成されない、アッセイ。
(a)支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントC-1および該捕獲プローブの核酸配列にハイブリダイズし得る第2のセグメントC-2を有する捕獲エキステンダー分子と、分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL-1および第1の増幅マルチマーにハイブリダイズし得る第2のセグメントL-2を有する第1の標識エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL-1aおよび第2の増幅マルチマーにハイブリダイズし得る第2のセグメントL-2aを有する第2の標識エキステンダー分子と、L-2にハイブリダイズし得る核酸配列M-1および第1の標識プローブセグメントにハイブリダイズし得る核酸配列M-2を含有する多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する第1の増幅マルチマーと、L-2aにハイブリダイズし得る核酸配列M-1aおよび標識プローブセグメントにハイブリダイズし得る核酸配列M-2aを含有する多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する第2の増幅マルチマーと、該増幅マルチマーにハイブリダイズし得る第1のおよび第2の標識プローブセグメントとを提供し、そしてこれらのプローブが、増幅マルチマーの近傍に存在する場合、検出可能なシグナルを生じること;
(b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステンダー分子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリダイゼーション条件下で該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合した第1のハイブリッド複合体を形成すること;
(c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;
(d)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合した第1のハイブリッド複合体と該増幅マルチマーとを接触させて、支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を生成すること;
(e)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;
(f)ハイブリダイズする条件下で、該支持体に結合した第2のハイブリッド複合体と、該標識プローブとを接触させて、標識され、支持体に結合した第3のハイブリッド複合体を生成すること;
(g) 次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および
(h)該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体における、該第1の標識プローブセグメントおよび第2の標識プローブセグメントとの間の相互作用により検出可能なシグナルの存在を認めること;
を包含する、アッセイ。
改良点として、該固体支持体に結合した捕獲プローブにハイブリダイズし得る核酸配列を含有する競合物オリゴヌクレオチドをアッセイ内に組み込むことを包含する、アッセイ。
(a)支持体上の捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントC-1および該捕獲プローブの核酸配列にハイブリダイズし得る第2のセグメントC-2を有する捕獲エキステンダー分子と、該捕獲プローブにハイブリダイズし得る核酸配列を含有する競合物オリゴヌクレオチドと、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL-1および標識プローブシステムにハイブリダイズし得る第2のセグメントL-2を有する標識エキステンダー分子と、L-2にハイブリダイズし得る核酸配列M-1を含有し、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じる標識プローブシステムとを提供すること;
(b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステンダー分子、競合物オリゴヌクレオチド、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリダイズ条件下で該核酸分析物をインキュベートして、(i)捕獲エキステンダー、核酸分析物、および標識エキステンダーの第1のハイブリッド複合体、および(ii)競合物オリゴヌクレオチドと反応した被覆捕獲プローブを形成すること;
(c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;
(d)次いで、ハイブリダズする条件下で、該支持体に結合したハイブリッド複合体と該標識プローブシステムとを接触させて、標識され、支持体に結合したハイブリッド複合体を生成すること;および
(e)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および
(f)該標識され、支持体に結合したハイブリッド複合体の標識の存在を検出すること;
を包含する、アッセイ。
(d1)ハイブリダイゼーション条件下で前記支持体に結合したハイブリッド複合体と前記増幅マルチマーとを接触させて、第2の支持体に結合したハイブリッド複合体を生成する工程;
(d2)次いで、必要に応じて、前記固体支持体に結合しない物質を分離する工程;および
(d3)次いで、ハイブリドゼーション条件下で、該第2の支持体に結合したハイブリド複合体と、該標識プローブとを接触させて、標識され、支持体に結合したハイブリッド複合体を生成する工程;
を含む、アッセイ。
(a)支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントC-1、および該捕獲プローブの核酸配列にハイブリダイズし得る第2のセグメントC-2を有する捕獲エキステンダー分子と、該捕獲分子にハイブリダイズし得る少なくとも1つの核酸配列を含有する競合物オリゴヌクレオチドと、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL-1およびプリアンプリファイアープローブ中の核酸配列P-1にハイブリダイズし得る第2のセグメントL-2を有する標識エキステンダー分子と、該核酸配列P-1を有し、そして核酸配列P-2を介して多数の増幅マルチマーに結合し得るプリアンプリファイアープローブと、P-2にハイブリダイズし得る核酸配列M-1および標識プローブにハイブリダイズし得る核酸配列M-2を含有する多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する増幅マルチマーと、M-2にハイブリダイズし得る配列L-3を含有し、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じさせる標識プローブとを提供すること;
(b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該核酸分析物を、該捕獲エキステンダー分子、競合物オリゴヌクレオチド、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリダイズ条件下でインキュベートして、(i)捕獲エキステンダー、核酸分析物および標識エキステンダーの第1のハイブリッド複合体、および(ii)競合物オリゴヌクレオチドと反応した被覆捕獲プローブを形成すること;
(c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;
(d)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合した第1のハイブリッド複合体と該プリアンプリファイアープローブおよび該増幅マルチマーとを接触させて、支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を生成すること;
(e)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;
(f)ハイブリダイズ条件下で、該支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を該標識プローブと接触させて、標識され、支持体に結合した第3のハイブリッド複合体を生成すること;
(g) 次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および
(h)該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体の標識の存在を検出すること;
を包含する、アッセイ。
(a)支持体に結合する捕獲プローブを有する固体支持体;
(b)該捕獲プローブと、該核酸分析物の予め定められたセグメントとにハイブリダイズし得る第1の捕獲エキステンダー分子;
(c)該第1の捕獲エキステンダー分子が結合する該捕獲プローブおよび該セグメントとは異なる該核酸分析物の該捕獲プローブおよびセグメントにハイブリダイズし得る別の第2の捕獲エキステンダー分子;
(d)該第1のおよび第2の捕獲エキステンダー分子が結合するセグメントとは異なる該核酸分析物のセグメントにハイブリダイズし得る標識エキステンダー分子;
(e)該標識エキステンダー分子にハイブリダイズし得る核酸配列を含有し、そして、直接的または間接的に、検出可能なシグナルを提供する、標識プローブシステムを含み、
ここで、該捕獲プローブが、該第1の捕獲エキステンダー分子にハイブリダイズし得る第1の捕獲エキステンダー結合配列と、該第2の捕獲エキステンダー分子にハイブリダイズし得る第2の捕獲エキステンダー結合配列とを有するプローブ;
を含む、キット。
(g)該同一なサブユニットにハイブリダイズすることが意図され、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを提供する標識プローブ;
を含む、キット。
(a)支持体に結合する捕獲プローブを有する固体支持体;
(b)該捕獲プローブと該核酸分析物の予め定められたセグメントとにハイブリダイズし得る捕獲エキステンダー分子;
(c)該核酸分析物の予め定められたセグメントにハイブリダイズし得る第1の標識エキステンダー分子;
(d)該第1の標識エキステンダー分子が結合するセグメントとは異なる該核酸分析物のセグメントにハイブリダイズし得る第2の標識エキステンダー分子;
(e)該標識エキステンダー分子および多数の増幅マルチマーに結合し得る任意のプリアンプリファイアープローブ;
(f)該標識エキステンダー分子または該プリアンプリファイアープローブにハイブリダイズし得る核酸配列と、多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットとを含む増幅マルチマー;および
(g)該同一なオリゴヌクレオチドサブユニットにハイブリダイズするように設計され、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを提供する標識プローブ;
を含む、キット。
(a)支持体に結合する捕獲プローブを有する固体支持体;
(b)該捕獲プローブと、該核酸分析物の予め定められたセグメントとにハイブリダイズし得る捕獲エキステンダー分子;
(c)該核酸分析物の予め定められたセグメントにハイブリダイズし得る第1の標識エキステンダー分子;
(d)該第1の標識エキステンダー分子が結合するセグメントとは異なる該核酸分析物のセグメントにハイブリダイズし得る第2の標識エキステンダー分子;
(e)(i)該第1の標識エキステンダー分子にハイブリダイズし得る核酸配列、および(ii)多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含む第1の増幅マルチマー;
(f)(i)該第2の標識エキステンダー分子にハイブリダイズし得る核酸配列、および(ii)多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含む第2の増幅マルチマー;および
(g)該第1の増幅マルチマーのオリゴヌクレオチドサブユニットにハイブリダイズし得る第1の核酸配列と、該第2の増幅マルチマーのオリゴヌクレオチドサブユニットとハイブリダイズし得る第2の核酸配列を含有する標識プローブであって、該標識プローブは、直接的または間接的に、検出可能なシグナルを提供することを包含する、標識プローブ;
を含む、キット。
(a)支持体に結合する捕獲プローブを有する固体支持体;
(b)該捕獲プローブと、該核酸分析物の予め定められたセグメントとにハイブリダイズし得る捕獲エキステンダー分子;
(c)該捕獲プローブにハイブリダイズし得る核酸配列を含む競合物オリゴヌクレオチド;
(d)該捕獲エキステンダー分子が結合するセグメントとは異なる該核酸分析物のセグメントにハイブリダイズし得る標識エキステンダー分子;
(e)該標識エキステンダー分子および多数の増幅マルチマーに結合し得る任意のプリアンプリファイアープローブ;
(f)該標識エキステンダー分子または該プリアンプリファイアープローブにハイブリダイズし得る核酸配列と、多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットとを含有する増幅マルチマー;および
(g)該同一なオリゴヌクレオチドサブユニットにハイブリダイズするように設計され、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを提供する標識プローブ;
を含む、キット。
(定義および術語:)
本発明を開示し、そして詳細に記載する前に、本発明が、特定のアッセイ形式、物質、または試薬に限定されず、そしてもちろん変化し得ることを理解すべきである。本明細書中で使用した用語は、特定の実施態様のみを記載することが目的であり、そして限定されることを意図しないということもまた理解すべきである。
本明細書中で使用したように、用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、ポリデオキシリボヌクレオチド(2-デオキシ-D-リボースを含有する)、ポリリボヌクレオチド(D-リボースを含有する)、プリンまたはピリミジン塩基のN-グリコシドである任意の他のタイプのポリヌクレオチド、および非ヌクレオチド骨格(例えば、ペプチド核酸(PNA)およびAntivirals、Inc.(Corvallis、Oregon)からNeugeneTMポリマーとして市販されている合成の配列特異的核酸ポリマー)または非標準的な結合(これによりDNAおよびRNAに見出されるような塩基の対合または塩基のスタッキング(stacking)が可能となる形状でヌクレオチドを含有するポリマーを提供する)を含有する他のポリマーを一般にいう。用語「ポリヌクレオチド」と「オリゴヌクレオチド」との間の長さの区別を意図せず、これらの用語は交換可能に使用される。これらの用語は、分子の一次構造のみに言及する。よって、これらの用語は、2本鎖および1本鎖のDNA、および2本鎖および1本鎖のRNA、およびDNA:RNAハイブリッドを包含し、そしてまた公知のタイプの改変体(例えば、当該分野で公知の標識、メチル化、「キャップ」、1以上の天然に存在するヌクレオチドをアナログで置換)、ヌクレオチド内の改変体(例えば、非荷電結合(例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど)および荷電結合(例えば、ホスホロチオエート(phosphorothioate)、ホスホロジチオエート(phosphorodithioate)など)を有する改変体、ペンダント部分(moiety)(例えば、タンパク質(ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジンなどを包含する))を含有する改変体、挿入物(例えば、アクリジン、ソラレンなど)を有する改変体、キレート剤(例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化力のある金属など)を含有する改変体、アルキル化剤を含有する改変体、改変した結合を有する改変体(例えば、α−アノマー核酸など)、およびポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの改変しない形態を包含する。
マルチマーの式Iでは、示したように、スペーサーセグメントS’は任意であり、そして所望する場合には、それぞれの分枝部位と先行/後続の隣接する分枝部位の間に、または一連の近接する分枝部位と隣接する一連の分枝部位との間に間隔を空けるために使用され得る。第2のスペーサーセグメントS”もまた、任意であり、そして(標識エキステンダーまたはプリアンプリファイアーのような1以上の中間分子を通して)分子の分枝部位と、分析物が最終的に結合するセグメントAとの間に間隔を空けるために用いられ得る。このように間隔を空けることは、分析物とマルチマーとの間の結合を改善することが見出された。同様に、第3のスペーサーセグメントS’’’も任意である。これは好ましくはポリTである。
実験
本発明の実施には、別に示す以外は、当該分野の技術範囲内である、合成有機化学、生化学、分子生物学などの従来技術を使用する。このような技術は文献に詳細に説明されている。例えば、Sambrook、FritschおよびManiatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版(1989);OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait編、1984);Nucleic Acid Hybridization(B.D.HamesおよびS.J.Higgins編、1984);およびシリーズ、Methodsin Enzymology(Academic Press,Inc.)を参照のこと。本明細書に記載される(上記および下記の両方)すべての特許、特許出願、および刊行物は、本明細書中で参考として援用される。
この実施例は、図8に示すように、2つまたはそれ以上の異なる捕獲エキステンダーを用いるハイブリダイゼーションアッセイを記述する。この実験研究の目標は、固体支持体に結合する捕獲エキステンダープローブにより引き起こされるバックグラウンドシグナルを減少させることであった。捕獲エキステンダープローブが支持体に結合する能力を減少させることにより、標的ポリヌクレオチドを、固体表面に安定に結合させるために、複数の捕獲エキステンダープローブを通して結合させる。このことが、捕獲エキステンダープローブなしで行われるアッセイと同じぐらい低いアッセイバックグラウンドを生じる(すなわち、なぜなら、実質的に捕獲エキステンダー分子が支持体に結合しないからである)。この実施例に要約された実験研究はまた、固定化捕獲プローブに競合的に結合し得る分子が加えられる場合、バックグラウンドをよりさらに減少させることが可能であることを示す。なぜなら、標識エキステンダー分子または標識プローブが固定化捕獲プローブを通して支持体に結合する可能性が顕著に減少するからである。
配列(5’-->3’)捕獲エキステンダープローブ(固定化捕獲プローブに結合するセグメントに下線を付す):
オリゴヌクレオチドのすべての化学合成を、自動DNA合成機(Applied Biosystems,Inc.,(ABI)モデル380 B)で行った。PHOSTELTM試薬(DMT-O-CH2CH2-(SO2)-CH2CH2-O-P(N(iPr)2)(-O-CH2CH2CN)、ここで、DMTは、ジメトキシトリチルであり、そしてiPrは、イソプロピルである)を使用した5’−ホスホリル化を含むβ−シアノエチルタイプのホスホルアミダイト化学を使用した。示される以外は、標準ABIプロトコルを使用した。ある倍数のサイクル(例えば、1.2サイクル)を使用したことが示された場合には、ABIにより推奨されるアミダイトの標準量のその倍数を特定のサイクルにおいて使用した。
側鎖:
3’−GATGCG(TTCATGCTGTTGGTGTAG)3−5’(p)(配列番号21)
側鎖伸長部を連結するための結合テンプレート:
3’−CGCATCACTGAC−5’(p)(配列番号22)
粗製櫛主部を標準ポリアクリルアミドゲル(7M尿素および1×TBEランニング緩衝液を用いた7%)法により精製した。
標的として、合成615ヌクレオチド転写物を、HCVJ1クローンのヌクレオチド54位〜668位およびSP6 RNAポリメラーゼを含むpGEM(Promega)ベクターを用いて調製した。ネガティブコントロールは標的なしであった。
本実施例は、図11に示すように、2つの異なる標識エキステンダーを用いるハイブリダイゼーションアッセイについて記載する。本実験研究の目的は、固体支持体、あるいは捕獲エキステンダーまたは捕獲プローブ分子に結合する標識エキステンダーにより引き起こされるバックグラウンドシグナル(すなわち、ある程度標識エキステンダーが支持体に結合する場合に生成されるこの種のバックグラウンドは、標的にって媒介されることはない)を減少することであった。標識エキステンダーが結合されると、プリアンプリファイアー、アンプリファイアーマルチマー、および標識プローブ(本実験では、アルカリ性ホスファターゼ標識プローブを使用した)が結合し得、そして標的の存在に依存しないシグナルを発生する。個々にアンプリファイアーマルチマーに結合するための標識エキステンダープローブの能力を低減することにより、プリアンプリファイアーは、表面に安定に結合されるために多重標識エキステンダープローブを介して結合する。プリアンプリファイアーは、アッセイのハイブリダイゼーション条件の間、単一の標識エキステンダーとの結合を存続しないようである。標識エキステンダーを、それらが標的配列に結合したとき、アンプリファイアーマルチマーの結合を容易にするのに必要な2つの標識エキステンダーが互いに近位に位置するように設計する。単一のハイブリダイズされた標識エキステンダーは、反応条件下でプリアンプリファイアーを有効的に結合しない。このように、プリアンプリファイアーの結合は、標的の存在下でのみ好ましい。
配列(5’-->3’)捕獲エキステンダープローブ(固定化捕獲プローブに結合するセグメントに下線を付す):
HCVの標準曲線を、高力価C型肝炎ウィルスサンプルをHCV陰性ヒト血清中に希釈し、そして上記のように調製したマイクロタイターディッシュのウェルに1,500〜19,500ウィルス当量の範囲に相当する希釈液の50μlアリコートを送達することにより調製した。
本実施例では、捕獲プローブxt1*(本明細書のはじめに引用されたPCT公開公報第WO 92/02526号、およびEPA883096976を参照のこと)を含むマイクロウェル上で、Tm測定を行った。捕獲エキステンダーおよびxt1*捕獲プローブは以下の通りであった:
xt1−末端化HCV捕獲エキステンダー(5’-->3’;プローブの機能性ドメインをピリオドによって分離する):
前記実施例から、プローブを、アッセイの条件下で安定な複合体を達成するために多重(2またはそれ以上)相互作用が必要とされるように設計し得ることが明らかである。用語「多重相互作用」は、いかなる限定も意図しない。2つのタイプの多重相互作用について説明する:それらは、十字形(4方向分枝)接合を形成する多重プローブおよび固体支持体上で多重捕獲プローブに同時に結合する多重捕獲エキステンダーであり、単一の捕獲エキステンダー−捕獲プローブハイブリッドのTmよりも10℃〜20℃高い標的−固体支持体Tmを生じる。
本発明の目的は、ハイブリダイゼーションアッセイのバックグラウンドノイズを減少することである。固体支持体への捕獲エキステンダーの結合を徹底的に減少することにより、捕獲エキステンダーに結合する分子によるバックグラウンドを減少する。2つの標識エキステンダーを介してアンプリファイアーを結合することにより、バックグラウンドを減少する。なぜなら、固体支持体または固体支持体に結合した任意の分子に結合する標識エキステンダー(捕獲プローブおよび捕獲エキステンダーを含む)は、有効的には標識されないからである。同様に、標的の非存在下で支持体に結合するアンプリファイアーは、それがアッセイ温度よりも10℃〜20℃低いTmを有する標識されたプローブとハイブリッドを形成する場合、有効に標識されない。また、固体支持体または固体支持体に結合した任意の分子に結合する標識ざれたプローブは、その標識されたプローブがその補因子または他のサブユニットにより活性化されない場合、有効に検出されない。発光の活性化物質は、光出力を100倍より大きく増加し得る(Schaapら、上記)。活性化物質を物質の溶液から除去し、そして代わりに標的に結合する場合、ハイブリダイゼーションアッセイのノイズ減少のための重要な機会がある。
Claims (20)
- サンプル中の核酸分析物の存在を検出するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって:
(a)固体支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントC−1および該捕獲プローブの核酸配列にハイブリダイズし得る第2のセグメントC−2を有する捕獲エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL−1およびプリアンプリファイアープローブの核酸配列P−1にハイブリダイズし得る第2のセグメントL−2を有する標識エキステンダー分子と、核酸配列P−1を有し、そして核酸配列P−2を介して多数の増幅マルチマーと結合し得るプリアンプリファイアープローブと、P−2にハイブリダイズし得る核酸配列M−1および標識プローブにハイブリダイズし得る核酸配列M−2を含む多数の同一のオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する増幅マルチマーと、M−2にハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じさせる配列L−3を含む標識プローブとを提供する工程;
(b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステンダー分子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリダイゼーション条件下で該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合した第1のハイブリッド複合体を形成する工程であって、ここで該捕獲エキステンダー分子の少なくとも2つが該アッセイのために該分析物にハイブリダイズし、検出可能なシグナルを生じなければならない、工程;
(c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;
(d)次いで、ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合した第1のハイブリッド複合体と該プリアンプリファイアープローブおよび該増幅マルチマーとを接触させて、支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を生成する工程;
(e)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;
(f)ハイブリダイゼーション条件下で、該支持体に結合した第2のハイブリッド複合体と該標識プローブとを接触させて、標識された、支持体に結合した第3のハイブリッド複合体を生成する工程;
(g)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;
(h)該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体における標識の存在を検出する工程;ならびに
(i)該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体における該標識の存在を該サンプル中の該核酸分析物の存在と相関させる工程、を包含し、
ここで、該核酸分析物が、該捕獲プローブと、捕獲エキステンダー分子と、核酸分析物との間で形成される該ハイブリッド複合体の該捕獲プローブから解離する融解温度Tm1が、該捕獲プローブと捕獲エキステンダー分子との間で形成されるハイブリッド複合体の融解温度Tm2よりも少なくとも約5℃高い、アッセイ。 - サンプル中の核酸分析物の存在を検出するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって:
(a)固体支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントC−1および該捕獲プローブの核酸配列にハイブリダイズし得る第2のセグメントC−2を有する捕獲エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL−1および標識プローブシステムにハイブリダイズし得る第2のセグメントL−2を有する標識エキステンダー分子と、L−2にハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じさせる核酸配列M−1を含む標識プローブシステムとを提供する工程;
(b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステンダー分子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共にハイブリダイゼーション条件下で、該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合したハイブリッド複合体を形成する工程であって、ここで該捕獲エキステンダー分子の少なくとも2つは、該アッセイのために該分析物にハイブリダイズし、検出可能なシグナルを生じなければならない、工程;
(c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;
(d)次いで、ハイブリダイズする条件下で該支持体に結合したハイブリッド複合体と該標識プローブシステムとを接触させて、標識された、支持体に結合したハイブリッド複合体を提供する工程;
(e)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;
(f)該支持体に結合したハイブリッド複合体における標識の存在を検出する工程;ならびに
(g)該支持体に結合したハイブリッド複合体における該標識の存在を該サンプル中の該核酸分析物の存在と相関させる工程、を包含し、
ここで、該核酸分析物が、該捕獲プローブと、捕獲エキステンダー分子と、核酸分析物との間で形成される該ハイブリッド複合体の該捕獲プローブから解離する融解温度Tm1が、該捕獲プローブと該捕獲エキステンダー分子との間で形成されるハイブリッド複合体の融解温度Tm2よりも少なくとも約5℃高く、
ここで、少なくとも1つの工程は、該Tm1複合体形成には好ましいが、該Tm2複合体形成には好ましくないストリンジェンシー条件下で行われる、アッセイ。 - 請求項2に記載のアッセイであって、ストリンジェンシーが、ホルムアミド濃度、カオトロピックな塩濃度、塩濃度、pH(水素イオン濃度)、有機溶媒含量、および温度からなる群より選択される、少なくとも1つの工程のパラメーターを制御することによって制御される、アッセイ。
- 請求項3に記載のアッセイであって、前記少なくとも1つの工程が、Tm2よりも高くかつTm1よりも低い温度で行われる、アッセイ。
- 請求項2に記載の方法であって、前記少なくとも1つの工程が、工程(b)を包含する、アッセイ。
- サンプル中の核酸分析物の存在を検出するためのサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって:
(a)固体支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る分析物結合セグメントおよび該捕獲プローブ内に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る支持体結合セグメントを含有するポリヌクレオチドを含む捕獲エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントおよび標識プローブシステムにハイブリダイズし得る第2のセグメントを有する第1の標識エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントおよび標識プローブシステムにハイブリダイズし得る第2のセグメントを有する別の第2の標識エキステンダー分子と、該第1の標識エキステンダー分子および該第2の標識エキステンダー分子の該第2のセグメントにハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じさせる核酸配列を含む標識プローブシステムを提供する、工程;
(b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステンダー分子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリダイゼーション条件下で、該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合したハイブリッド複合体を形成する工程;
(c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;
(d)次いで、ハイブリダイズする条件下で該支持体に結合したハイブリッド複合体と該標識プローブシステムとを接触させて、標識された、支持体に結合したハイブリッド複合体を生成する工程;
(e)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;
(f)該標識された、支持体に結合したハイブリッド複合体の標識の存在を検出する工程;ならびに
(g)該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体における該標識の存在を該サンプル中の該核酸分析物の存在と相関させる工程、を包含し
ここで、第1のおよび第2の標識エキステンダー分子の両方が該分析物に結合した場合にのみ、工程(d)の該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体を形成するように、該標識エキステンダー分子が構成される、アッセイ。 - 請求項6に記載のアッセイであって、前記標識プローブシステムが、(i)前記核酸配列M−1を含有する増幅マルチマーおよび標識プローブにハイブリダイズし得る核酸配列M−2を含有する多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニット、ならびに(ii)M−2にハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じさせる核酸配列L−3を含有する標識プローブを含み、そしてここで、前記アッセイの工程(d)は、以下の工程:
(d1)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合したハイブリッド複合体と、該増幅マルチマーとを接触させて、第2の支持体に結合したハイブリッド複合体を生成する工程;
(d2)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;および
(d3)次いで、ハイブリダイゼーション条件下で、該第2の支持体に結合したハイブリッド複合体と、該標識プローブとを接触させて、標識された、支持体に結合したハイブリッド複合体を生成する工程;
を包含する、アッセイ。 - サンプル中の核酸分析物の存在を検出するためのサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって:
(a)固体支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る分析物結合セグメントおよび該捕獲プローブ内に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る支持体結合セグメントを含有するポリヌクレオチドを含む捕獲エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントおよびプリアンプリファイアープローブにハイブリダイズし得る第2のセグメントを有する第1の標識エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントおよびプリアンプリファイアープローブにハイブリダイズし得る第2のセグメントを有する別の第2の標識エキステンダー分子と、標識エキステンダー分子にハイブリダイズし得る第1のセグメントおよび多数の増幅マルチマーを結合し得る第2のセグメントを有するプリアンプリファイアープローブと、該標識エキステンダー分子にハイブリダイズし得る核酸配列M−1を含有し、かつ核酸配列M−2を含有する多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する増幅マルチマーと、M−2にハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じさせる配列を含有する標識プローブとを提供する工程;
(b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステンダー分子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリダイゼーション条件下で該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合した第1のハイブリッド複合体を形成する工程;
(c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;
(d)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合した第1のハイブリッド複合体と、該プリアンプリファイアープローブおよび該増幅マルチマーとを接触させて、支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を生成する工程;
(e)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;
(f)ハイブリダイズする条件下で、該支持体に結合した第2のハイブリッド複合体と該標識プローブとを接触させ、標識された、支持体に結合した第3のハイブリッド複合体を生成する工程;
(g)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;
(h)該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体における標識の存在を検出する工程;ならびに
(i)該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体における該標識の存在を該サンプル中の該核酸分析物の存在と相関させる工程、を包含し、
ここで、第1のおよび第2の標識エキステンダー分子の両方が該分析物に結合している場合にのみ、工程(d)の該支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を形成するように、該標識エキステンダー分子が構成される、アッセイ。 - サンプル中の核酸分析物の存在を検出するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって:
(a)固体支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントC−1および該捕獲プローブの核酸配列にハイブリダイズし得る第2のセグメントC−2を有する捕獲エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL−1および第1の増幅マルチマーにハイブリダイズし得る第2のセグメントL−2を有する第1の標識エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL−1aおよび第2の増幅マルチマーにハイブリダイズし得る第2のセグメントL−2aを有する第2の標識エキステンダー分子と、L−2にハイブリダイズし得る核酸配列M−1および標識プローブにハイブリダイズし得る核酸配列M−2を含有する多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する第1の増幅マルチマーと、L−2aにハイブリダイズし得る核酸配列M−1aおよび標識プローブにハイブリダイズし得る核酸配列M−2aを含有する多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する第2の増幅マルチマーと、該増幅マルチマーにハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じさせる標識プローブとを提供する工程;
(b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステンダー分子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリダイゼーション条件下で該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合した第1のハイブリッド複合体を形成する工程;
(c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;
(d)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合した第1のハイブリッド複合体と、該増幅マルチマーとを接触させ、支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を生成する工程;
(e)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;
(f)ハイブリダイズする条件下で、該支持体に結合した第2のハイブリッド複合体と該標識プローブとを接触させて、標識された、支持体に結合した第3のハイブリッド複合体を生成する工程;
(g)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;
(h)該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体における標識の存在を検出する工程;ならびに
(i)該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体における該標識の存在を該サンプル中の該核酸分析物の存在と相関させる工程、を包含し、
ここで、該標識プローブは、該第1の増幅マルチマーにハイブリダイズし得る第1の核酸セグメントおよび該第2の増幅マルチマーにハイブリダイズし得る第2の核酸セグメントを含有し、その結果、該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体は、該第1の増幅マルチマーおよび第2の増幅マルチマーが該標識プローブを介して結合されない限り、形成されない、アッセイ。 - サンプル中の核酸分析物の存在を検出するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって:
(a)固体支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントC−1および該捕獲プローブの核酸配列にハイブリダイズし得る第2のセグメントC−2を有する捕獲エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL−1および第1の増幅マルチマーにハイブリダイズし得る第2のセグメントL−2を有する第1の標識エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL−1aおよび第2の増幅マルチマーにハイブリダイズし得る第2のセグメントL−2aを有する第2の標識エキステンダー分子と、L−2にハイブリダイズし得る核酸配列M−1および第1の標識プローブセグメントにハイブリダイズし得る核酸配列M−2を含有する多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する第1の増幅マルチマーと、L−2aにハイブリダイズし得る核酸配列M−1aおよび第2の標識プローブセグメントにハイブリダイズし得る核酸配列M−2aを含有する多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する第2の増幅マルチマーと、該それぞれの増幅マルチマーにハイブリダイズし得る第1のおよび第2の標識プローブセグメントであって、そしてこれらのプローブセグメントが、増幅マルチマーの近傍に存在する場合、検出可能なシグナルを生じる、第1のおよび第2の標識プローブセグメントを提供する工程;
(b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステンダー分子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリダイゼーション条件下で該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合した第1のハイブリッド複合体を提供する工程;
(c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;
(d)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合した第1のハイブリッド複合体と該増幅マルチマーとを接触させて、支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を生成する工程;
(e)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;
(f)ハイブリダイズする条件下で、該支持体に結合した第2のハイブリッド複合体と、該標識プローブとを接触させて、標識された、支持体に結合した第3のハイブリッド複合体を生成する工程;
(g)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;ならびに
(h)該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体における、該第1の標識プローブセグメントと第2の標識プローブセグメントとの間の相互作用により生じる検出可能なシグナルの存在を認める工程であって、ここで該支持体上の該標識の存在が、該サンプル中の該核酸分析物の存在を示す、工程;
を包含する、アッセイ。 - 請求項10に記載のアッセイであって、前記第1の標識プローブセグメントが第1の酵素フラグメントを含み、そして前記第2の標識プローブセグメントが第2の酵素フラグメントを含み、そしてここで、該第1のおよび第2の酵素フラグメントが、標的の存在により互いに結合しない限り不活性な相補的酵素フラグメントである、アッセイ。
- 請求項10に記載のアッセイであって、前記第1の標識プローブセグメントが酵素を含み、そして前記第2の標識プローブセグメントが該酵素の補因子を含み、そしてここで、該酵素および該補因子が、標的の存在により互いに結合しない限り不活性である、アッセイ。
- 請求項10に記載のアッセイであって、前記第1の標識プローブセグメントが酵素を含み、そして前記第2の標識プローブセグメントが発光または蛍光活性化物質を含み、ここで該酵素が産物の形成を触媒し、そして該活性化物質が該産物の検出を増強する、アッセイ。
- サンプル中の核酸分析物を検出するためのサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって:(a)該分析物を直接的または間接的に固体支持体に結合した捕獲プローブに捕獲エキステンダー分子を介して結合する工程;(b)該分析物を標識する工程;(c)該支持体上の標識の存在を検出する工程であって、ここで該支持体上の該標識の存在が、該サンプル中の該核酸分析物の存在を示す、工程を包含し、
改良点として、該固体支持体に結合した捕獲プローブにハイブリダイズし得る核酸配列を含有する競合物オリゴヌクレオチドをアッセイ内に組み込む工程を包含する、アッセイ。 - サンプル中の核酸分析物の存在を検出するためのサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって:
(a)固体支持体に結合した捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントC−1および該捕獲プローブの核酸配列にハイブリダイズし得る第2のセグメントC−2を有する捕獲エキステンダー分子と、該捕獲プローブにハイブリダイズし得る核酸配列を含有する競合物オリゴヌクレオチドと、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL−1および標識プローブシステムにハイブリダイズし得る第2のセグメントL−2を有する標識エキステンダー分子と、L−2にハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じる核酸配列M−1を含有する標識プローブシステムとを提供する工程;
(b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステンダー分子、競合物オリゴヌクレオチド、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリダイゼーション条件下で該核酸分析物をインキュベートして、(i)支持体に結合した、捕獲プローブ、捕獲エキステンダー、核酸分析物、および標識エキステンダーの第1のハイブリッド複合体、ならびに(ii)捕獲プローブおよび競合物オリゴヌクレオチドの支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を形成する工程;
(c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;
(d)次いで、ハイブリダズする条件下で、該支持体に結合した、第1のハイブリッド複合体と該標識プローブシステムとを接触させて、標識された、支持体に結合した、第3のハイブリッド複合体を生成する工程;
(e)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;ならびに
(f)該標識された、支持体に結合した第3のハイブリッド複合体における標識の存在を検出する工程であって、該支持体上の標識の存在は、該サンプル中の該核酸分析物の存在を示す、工程;
を包含する、アッセイ。 - 請求項15に記載のアッセイであって、前記標識プローブシステムが、(i)前記核酸配列M−1を含有する増幅マルチマーおよび標識プローブにハイブリダイズし得る核酸配列M−2を含有する多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニット、ならびに(ii)M−2にハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じる核酸配列L−3を含有する標識プローブを含み、ここで前記アッセイの工程(d)は、以下の工程:
(d1)ハイブリダイゼーション条件下で前記支持体に結合した、第1のハイブリッド複合体と前記増幅マルチマーとを接触させて、支持体に結合した、第3のハイブリッド複合体を生成する工程;
(d2)次いで、必要に応じて、前記固体支持体に結合しない物質を分離する工程;および
(d3)次いで、ハイブリダイゼーション条件下で、該支持体に結合した、第3のハイブリッド複合体と、該標識プローブとを接触させて、標識された、支持体に結合した、第4のハイブリッド複合体を生成する工程;
を包含する、アッセイ。 - サンプル中の核酸分析物の存在を検出するサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって:
(a)固体支持体に結合した捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントC−1および該捕獲プローブの核酸配列にハイブリダイズし得る第2のセグメントC−2を有する捕獲エキステンダー分子と、該捕獲プローブにハイブリダイズし得る少なくとも1つの核酸配列を含有する競合物オリゴヌクレオチドと、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL−1およびプリアンプリファイアープローブ中の核酸配列P−1にハイブリダイズし得る第2のセグメントL−2を有する標識エキステンダー分子と、該核酸配列P−1を有し、そして核酸配列P−2を介して多数の増幅マルチマーに結合し得るプリアンプリファイアープローブと、P−2にハイブリダイズし得る核酸配列M−1および標識プローブにハイブリダイズし得る核酸配列M−2を含有する多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する増幅マルチマーと、M−2にハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じさせる配列L−3を含有する標識プローブとを提供する工程;
(b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該核酸分析物を、該捕獲エキステンダー分子、競合物オリゴヌクレオチド、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリダイゼーション条件下でインキュベートして、(i)支持体に結合した、捕獲プローブ、捕獲エキステンダー、核酸分析物および標識エキステンダーの第1のハイブリッド複合体、および(ii)支持体に結合した、捕獲プローブ、競合物オリゴヌクレオチドの第2のハイブリッド複合体を形成する工程;
(c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;
(d)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合した第1のハイブリッド複合体と該プリアンプリファイアープローブおよび該増幅マルチマーとを接触させて、支持体に結合した、第3のハイブリッド複合体を生成する工程;
(e)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;
(f)ハイブリダイズする条件下で、該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体を該標識プローブと接触させて、標識された、支持体に結合した第4のハイブリッド複合体を生成する工程;
(g)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;ならびに
(h)該支持体に結合した第4のハイブリッド複合体における標識の存在を検出する工程であって、該支持体上の該標識の存在が、該サンプル中の該核酸分析物の存在を示す、工程;
を包含する、アッセイ。 - サンプル中の核酸分析物を検出するキットであって:
(a)固体支持体に結合した捕獲プローブを有する固体支持体;
(b)該捕獲プローブと該核酸分析物の予め定められたセグメントとにハイブリダイズし得る捕獲エキステンダー分子;
(c)該核酸分析物の予め定められたセグメントにハイブリダイズし得る第1の標識エキステンダー分子;
(d)該第1の標識エキステンダー分子が結合するセグメントとは異なる該核酸分析物のセグメントにハイブリダイズし得る第2の標識エキステンダー分子;
(e)該標識エキステンダー分子および多数の増幅マルチマーに結合し得る任意のプリアンプリファイアープローブ;
(f)該標識エキステンダー分子または該プリアンプリファイアープローブにハイブリダイズし得る核酸配列と、多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットとを含む増幅マルチマー;ならびに
(g)該同一なオリゴヌクレオチドサブユニットにハイブリダイズし、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを提供するように設計された標識プローブ;
を含む、キット。 - サンプル中の核酸分析物を検出するためのキットであって、
(a)固体支持体に結合した捕獲プローブを有する固体支持体;
(b)該捕獲プローブと、該核酸分析物の予め定められたセグメントとにハイブリダイズし得る捕獲エキステンダー分子;
(c)該核酸分析物の予め定められたセグメントにハイブリダイズし得る第1の標識エキステンダー分子;
(d)該第1の標識エキステンダー分子が結合するセグメントとは異なる該核酸分析物のセグメントにハイブリダイズし得る第2の標識エキステンダー分子;
(e)(i)該第1の標識エキステンダー分子にハイプリダイズし得る核酸配列、および(ii)多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含む第1の増幅マルチマー;
(f)(i)該第2の標識エキステンダー分子にハイブリダイズし得る核酸配列、および(ii)多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含む第2の増幅マルチマー;ならびに
(g)該第1の増幅マルチマーのオリゴヌクレオチドサブユニットとハイブリダイズし得る第1の核酸配列と、該第2の増幅マルチマーのオリゴヌクレオチドサブユニットとハイブリダイズし得る第2の核酸配列を含有し、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを提供する、標識プローブ;
を含む、キット。 - サンプル中の核酸分析物を検出するためのキットであって、
(a)固体支持体に結合した捕獲プローブを有する固体支持体;
(b)該捕獲プローブと、該核酸分析物の予め定められたセグメントとにハイブリダイズし得る捕獲エキステンダー分子;
(c)該捕獲プローブにハイブリダイズし得る核酸配列を含む競合物オリゴヌクレオチド;
(d)該捕獲エキステンダー分子が結合するセグメントとは異なる該核酸分析物のセグメントにハイブリダイズし得る標識エキステンダー分子;
(e)該標識エキズテンダー分子および多数の増幅マルチマーに結合し得る任意のプリアンプリファイアープローブ;
(f)該標識エキステンダー分子または該プリアンプリファイアープローブにハイブリダイズし得る核酸配列と、多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットとを含有する増幅マルチマー;ならびに
(g)該同一なオリゴヌクレオチドサブユニットにハイブリダイズし、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを提供するように設計された標識プローブ;
を含む、キット。
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