JP4235283B2 - 小三本鎖形成ｐｎａオリゴ - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、決定対象の核酸および２以上のプローブ分子間の三本鎖複合体を形成することによる核酸の決定方法、かかる方法により形成された三本鎖結合複合体ならびにプローブとしての小さい三本鎖形成核酸結合分子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸分子の検出および定量は、ある種の診断技術において必須の要素を構成する。かかる技術の基本的な特徴は、相補的な核酸配列に特異的にハイブリダイズするプローブ（核酸または核酸アナログ）の能力である。ハイブリダイゼーションを起こすために、幾つかの標準的な条件としては、例えば、塩濃度および温度などに関して合わさなければならないが、主要な決定因子は、２つのハイブリダイズしている鎖のハイブリッドにおける完全にマッチしたヌクレオ塩基の数である。１つの塩基対のミスマッチ（または欠失／挿入）により引き起こされる安定性の相対的な低下がハイブリッドの長さが増加するにつれて、ますます減少するが、相対的に短い長さ、例えば、６〜１０塩基対のハイブリッドにおいて、１つの塩基対のミスマッチは、熱安定性の劇的な減少を生じる。
【０００３】
診断の目的のために、特定の遺伝子または生物にのみ存在するが、試料中に存在するいかなるバックグラウンドの核酸においても存在しないヌクレオ塩基の配列を同定することが、しばしば望まれる。例えば、ヒトゲノムなどのような典型的な試料に統計学的に独特であるヌクレオ塩基の特定の配列のために、配列の長さは、他方、熱安定性の劇的な損失なしにミスマッチに適応させる能力を増強するであろう、少なくとも１８〜２０塩基のオーダーでなければならない。
【０００４】
核酸の認識は、一般的に二本鎖または三本鎖形成の使用により可能であるが、現在では、ワトソン−クリック型（ＷＣ）塩基対合を介して一本鎖分析対象物核酸に結合している初期の二本鎖形成プローブが、診断目的のために使用される。ＷＣおよびフーグスティーン結合（Ｈ）の両方が関与する三本鎖構造は、二本鎖に比べて、非常に熱安定であり、２つの相容れない性質は、診断目的のためのそれらの活用への障害が存在するように思われた：プリン塩基の連続した鎖は通常標的配列と三本鎖を形成することを要求するため、特定の配列が特異的であるためにある程度の長さを有さなければならないので、ある核酸配列内に属または種に特異的な標的を見つける機会は極めて小さい。したがって、長い場合でさえ、統計学的に独特のプリン配列が存在し、いかなる相補的な三本鎖を形成するプローブのハイブリダイゼーション特性（塩基対あたり高い結合能）も、６または７塩基長を下回る全部の部分配列に非特異的に結合することを引き起こし、したがってそれらの特異性を失うであろう。
【０００５】
国際公開第９２／２０７０２号パンフレットにおいては、ある種のペプチド核酸が二本鎖ＤＮＡ中に鎖侵入し、ＤＮＡと高い親和性で結合可能であることを開示する。国際公開第９２／２０７０３号パンフレットにおいては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）の調製および診断プローブとしての使用を開示する。国際公開第９５／０１３７０号パンフレットにおいては、２つの同一のホモピリミジン配列分子が、２つのＰＮＡ分子および１つの一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含む安定な三本鎖構造を形成すること開示する。これらの構造は治療法的および診断的使用の両方の目的について開示されている。
【０００６】
国際公開第９６／０２５５８号パンフレットにおいては、同一の配列であるが、反平行方向であり架橋部分により連結した２つのセグメントを含む分子を開示する。かかる分子は、各々１つのセグメントの配列を有する独立のＰＮＡから形成された複合体に比べ、小さいが顕著なＴｍ値の増加を呈することを開示する。これは、共有結合的に結合したＰＮＡ鎖の高い局所的な集中に帰する。開示されたセグメントは、一般的に６塩基長以上である。この開示された結合ペプチド核酸は十分な配列特異性のために、相補的な、分析対象物核酸中のプリンのストレッチに対応する、相対的に大きいピリミジンのストレッチを必要とするという本質の問題をもっており、それは、非常に高レベルの非特異的結合を導くであろう。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、鎖の一方は、短い三本鎖を形成するプローブ分子であり、三本鎖形成により結合した３つの独立した鎖を含む配列特異的な複合体を提供することを目的とある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕 核酸Ａ、第１核酸Ａ結合分子Ｂ、および該分子Ｂの配列と異なる塩基配列を有する少なくとも１つのさらなる核酸Ａ結合分子Ｃ間の三本鎖結合複合体を形成する工程、ならびに前記核酸の存在または量の尺度としての前記結合複合体の存在または量を決定する工程を含む、核酸Ａを決定する方法であって、該三本鎖複合体は、該核酸Ａ、該分子Ｂおよび１以上の該分子Ｃ間の三本鎖複合体が該核酸Ａの１分子と、該分子Ｂの２分子または該分子Ｃの２つの同一分子とにより形成された三本鎖複合体よりも温度安定な条件下で形成されることを特徴とする決定方法、
〔２〕 該三本鎖複合体が、該核酸Ａ、該分子Ｂおよび該分子Ｃのそれぞれが少なくとも１であるが１１未満、好ましくは１より大きく８未満の塩基で寄与する三重らせん結合領域を含むことを特徴とする、前記〔１〕記載の決定方法、
〔３〕 該複合体が三本鎖領域に結合している単一の分子Ｃを含むことを特徴とする、前記〔１〕記載の決定方法、
〔４〕 該分子Ｂが３塩基を超えるが１１塩基未満、好ましくは４塩基を超えるが８塩基未満の、三重らせん結合領域における結合に関与する塩基配列を有することを特徴とする、前記〔３〕記載の決定方法、
〔５〕 該分子Ｂの三重らせん結合配列が該分子Ｃにより結合した配列よりも長さが短いことを特徴とする、前記〔１〕〜〔４〕いずれか記載の決定方法、
〔６〕 該分子Ｃが少なくとも６塩基長を有することを特徴とする、前記〔１〕〜〔５〕いずれか記載の決定方法、
〔７〕 形成された複合体が三本鎖領域に結合する２つの異なる分子Ｃを含むことを特徴とする、前記〔１〕記載の決定方法、
〔８〕 該分子Ｃが該核酸Ａに隣接して結合することを特徴とする、前記〔７〕記載の決定方法、
〔９〕 分子Ｂおよび／またはＣが化学的に修飾されて、２つの分子Ｂまたは２つの同一の分子Ｃと１つの分子Ａとの三重らせん形成を脱安定化させることを特徴とする、前記〔１〕〜〔８〕いずれか記載の決定方法、
〔１０〕 分子Ｂの結合領域が非対称な塩基配列を有することを特徴とする、前記〔１〕〜〔９〕いずれか記載の決定方法、
〔１１〕 分子Ｂの結合領域が対称な塩基配列を有することを特徴とする、前記〔１〕〜〔９〕いずれか記載の決定方法、
〔１２〕 分子Ｂがフーグスティーン型塩基対形成を介して核酸に結合し、分子Ｃがワトソン−クリック型塩基対形成を介して結合していることを特徴とする、前記〔１〕〜〔１１〕いずれか記載の決定方法、
〔１３〕 分子Ｂおよび／またはＣが標識され、結合複合体中の前記１つまたは複数の標識の存在を核酸の決定のために使用することを特徴とする、前記〔１〕〜〔１２〕いずれか記載の決定方法、
〔１４〕 分子ＢおよびＣの１つまたは全部が核酸類似体であることを特徴とする、前記〔１〕〜〔１３〕いずれか記載の決定方法、
〔１５〕 核酸類似体がＰＮＡであることを特徴とする、前記〔１４〕記載の決定方法、
〔１６〕 該核酸Ａに結合する該分子Ｂの領域における塩基がピリミジンからなることを特徴とする、前記〔１〕〜〔１５〕いずれか記載の決定方法、
〔１７〕 該核酸が、該核酸に対する分子Ｂの結合領域内に位置する塩基配列における相違により決定されないように、他の核酸から区別されることを特徴とする、前記〔１〕〜〔１２〕いずれか記載の決定方法、
〔１８〕 該核酸が、該核酸に対する分子Ｃの結合領域内であるが、該核酸に対する分子Ｂの結合領域内ではない位置に存在する塩基配列における相違により決定されないように、他の核酸から区別されることを特徴とする、前記〔１〕〜〔１７〕いずれか記載の決定方法、
〔１９〕 分子Ｃが該核酸に対する分子Ｂの結合領域に完全に及ぶことを特徴とする、前記〔１〕〜〔１８〕いずれか記載の決定方法、
〔２０〕 分子Ｂの結合領域内の該核酸の排他的な部分にそれぞれ結合する、少なくとも２つの分子Ｃが使用されることを特徴とする、前記〔１〕〜〔１９〕いずれか記載の決定方法、
〔２１〕 三本鎖結合複合体を形成させるための反応混合物が、該Ａへの結合において少なくとも１つの分子Ｃと競合することができるが、三本鎖複合体において関与することができない競合プローブ分子Ｄをさらに含むことを特徴とする、前記〔１〕〜〔２０〕いずれか記載の決定方法、
〔２２〕 核酸Ａ、第１核酸結合分子Ｂ、および該分子Ｂと比べて異なる塩基配列を有する少なくとも１つのさらなる核酸結合分子Ｃ間の三本鎖結合複合体であって、該核酸Ａの１分子と該分子Ｂの２分子または該分子Ｃの２つの同一分子とから形成された三本鎖複合体よりも温度安定であることを特徴とする複合体、
〔２３〕 分子Ｂが１つまたは複数の分子Ｃの結合領域全体よりも長さが短く、分子Ｂが３塩基を超えるが１１塩基未満の塩基配列を有し、かつ分子Ｂの配列が非対称であることを特徴とする、前記〔２２〕記載の複合体、
〔２４〕 分子Ｂが１つまたは複数の分子Ｃの結合領域全体よりも長さが短く、分子Ｂが３塩基を超えるが１１塩基未満の塩基配列を有し、かつ分子Ｂの配列が対称であることを特徴とする、前記〔２２〕記載の複合体、
〔２５〕 前記核酸Ａ、第１核酸結合分子Ｂ、および少なくとも１つのさらなる核酸結合分子Ｃ間で、前記〔２２〕〜〔２４〕いずれか記載の三本鎖結合複合体を形成する方法、ならびに
〔２６〕 核酸を特異的に決定するためのプローブとして、４〜１０塩基、好ましくは５〜８塩基の長さを有する核酸結合分子を使用する方法、
に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の主題は、核酸Ａ、第１核酸Ａ結合分子Ｂ、および該分子Ｂの配列と異なる塩基配列を有する少なくとも１つのさらなる核酸Ａ結合分子Ｃ間の三本鎖結合複合体を形成する工程、ならびに前記核酸の存在または量の尺度としての前記結合複合体の存在または量を決定する工程を含む、核酸Ａを決定する方法であって、該三本鎖複合体は、該核酸Ａ、該分子Ｂおよび１以上の該分子Ｃ間の三本鎖複合体が該核酸Ａの１分子と、該分子Ｂの２分子または該分子Ｃの２つの同一分子とにより形成された三本鎖複合体よりも温度安定な条件下で形成されることを特徴とする決定方法である。
【００１０】
本発明のさらなる主題は、より長いワトソン−クリック型（ＷＣ）結合オリゴマーにより、短いフーグスティーン（Ｈ）結合オリゴマーを安定化させることによって、該目的を達成する知見である。これは、特異的な標的配列に長いホモプリン域を要求することをバイパスすると同時に、特異性を失うことなく、短いフーグスティーン結合プローブの高い識別力を開発することを可能にする。
【００１１】
本発明のさらなる主題は、核酸Ａ、第１核酸結合分子Ｂ、および該分子Ｂと比べて異なる塩基配列を有する少なくとも１つのさらなる核酸結合分子Ｃ間の三本鎖結合複合体であって、該核酸Ａの１分子と該分子Ｂの２分子または該分子Ｃの２つの同一分子とから形成された三本鎖複合体よりも温度安定であることを特徴とする複合体である。
【００１２】
本発明のさらなる主題は、核酸を特異的に決定するためのプローブとして、４〜１０塩基、好ましくは５〜８塩基の長さを有する核酸結合分子を使用する方法である。
【００１３】
本発明のさらなる主題は、それ自身で核酸（Ａ）との安定なハイブリッドを形成しないであろう条件下での、１種以上の二本鎖形成、混合配列オリゴマー（Ｃ）の制御された結合を通した、短い三本鎖形成オリゴマー（Ｂ）の制御された結合である。
【００１４】
本発明のさらなる主題は、従属請求項に開示される。
【００１５】
決定対象の核酸Ａは、本発明において、分析対象物核酸またはそれから派生した核酸であると理解される。分析対象物核酸としては、例えば、植物、動物、ヒト、ウイルス、細菌、または非天然由来の起源などのいかなる起源の核酸をも含む。これらは、溶液、懸濁液の状態で存在してもよく、固体状担体に固定、または細胞を含む培地、細胞塗沫標本、固定した細胞、組織、または固定した生物体に含んでいてもよい。それらから得られた核酸は分析対象物核酸から調製された核酸またはその一部であり、例えば、前記記載の核酸のコピーまたはその一部である。これらのコピーとしては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応などのいかなる複製および／または転写／逆転写反応をも含む増幅により元の分析対象物核酸から生じた核酸を含む。
【００１６】
分析対象物をハイブリダイゼーションしやすくさせるために、しばしば決定対象の核酸を含む試料を前処理する。かかる前処理は、細胞溶解、ｐＨをアルカリ性域に変えることによる二本鎖核酸の変性、極端な温度変化の繰り返し（凍結／融解）、生理学的生育条件の変化（浸透圧）、界面活性剤、カオトロピック塩もしくは酵素（例えば、プロテアーゼ、リパーゼなど）の使用を含む。利用しやすい形の核酸を放出するために単独でまたは組み合わせてのいずれで、これらの工程を使用してもよい。ある例では、蛋白質、細胞、細胞断片だけでなく、さらに検出対象でない核酸などの試料の他の構成物から分析対象物核酸を分離することが有利であろう。さらに分析対象物核酸を一本鎖にし、二次構造を解離させるために該分析対象物核酸を変性させることが有利である。
【００１７】
本発明の核酸結合分子は、ＡおよびＴまたはＵの塩基間ならびにＣおよびＧの塩基間などの二本鎖核酸におけるヌクレオ塩基の天然の認識から一般的に公知の水素結合を介して、核酸Ａのヌクレオ塩基の配列を認識する分子である。該認識は、例えば、天然のヌクレオ塩基の間だけでなく、さらに天然の塩基と非天然の塩基との間、および非天然の塩基と非天然の塩基との間に起こりうる。非天然塩基は、例えば、国際公開第９６／０２５５８号パンフレットに概説された塩基、特にイソピリミジンヘテロ環塩基である。これらの水素結合部分は連続様式で、結合が生じうるように骨格に付着される。好適な骨格は、天然の糖リン酸骨格（ＤＮＡおよびＲＮＡの核酸など）およびあらゆる非天然の骨格（ペプチド核酸（ＰＮＡ））である。
【００１８】
好ましくは、核酸結合分子は天然の糖リン酸骨格と異なる多量体化した骨格を有する。かかるプローブ分子の例示は、現在、当該分野において良く知られている。これらのプローブは、繰り返し様式で結合するモノマーのサブユニットに基づく。プローブ分子は、ペプチド結合により他のモノマーのサブユニットに結合するモノマーのサブユニットであることが好ましい。該ペプチド結合は、１級または２級アミンとカルボン酸残基とを連結する結合であると解される。モノマーまたは骨格中の連結している１種以上のモノマー内の結合の他の型が可能であり、例えば、エーテル結合またはアミノ結合などである。かかるプローブ分子の例示は、アザ−窒素原子に結合したリガンドを有するプローブ分子を含む国際公開第９２／２０７０２号パンフレット、国際公開第９４／２５４７７号パンフレットおよび国際公開第９６／２０２１２号パンフレットに記載されている。モノマーの間に混合した異なる結合を有するプローブ分子が欧州特許出願公開０ ６７２ ６７７号明細書に記載されている。「プローブ分子」という用語は、さらに前記非天然の骨格のストレッチおよび天然の糖リン酸骨格の付加的なストレッチを有する分子を含む。かかるキメラは、相補的な核酸に対していくらかの低い親和性を有するが、それでもなお本発明においては有用である。
【００１９】
本発明において「骨格」という用語は、ヘテロ環塩基部分が異なる付着点で連続様式で結合される多量体部分を意味し、ここで、骨格上の塩基部分の付着に使用される原子間の距離が４〜８原子のストレッチ、好ましくは６原子、最も好ましくはペプチド基（ＣＯＮＨ）を含むことにより互いに離れる。
【００２０】
好ましいプローブ分子は、一般式（Ｉ）の化合物である：
【００２１】
【化１】
【００２２】
〔式中、ｎは、少なくとも３以上の整数であり、
ｘは、２〜ｎ−１の整数であり、
Ｌ1 〜Ｌn は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル基、炭素数１〜４のアルカノイル基、天然のヌクレオ塩基、非天然のヌクレオ塩基、芳香環基、ＤＮＡインターカーレーター、ヌクレオ塩基結合基、複素環基、レポーターリガンドおよびキレート基からなる群より選択されたリガンドであり、ここで、少なくとも１つのＬ1 〜Ｌn 、好ましくは少なくとも１つのＬ2 〜Ｌn-1 は、非ヌクレオ塩基電子受容体または供与体基であり、少なくとも２つのＬ1 〜Ｌn は、ヌクレオ塩基結合基または天然もしくは非天然のヌクレオ塩基であり、
Ｃ1 〜Ｃn は、それぞれ、（ＣＲ6 Ｒ7 ）y （ＣＲ6 Ｒ7 、ＣＨＲ6 ＣＨＲ7 またはＣＲ6 Ｒ7 ＣＨ2 が好ましい）であり、ここで、Ｒ6 は水素、Ｒ7 は天然のαアミノ酸の側鎖からなる群より選択されるか、Ｒ6 とＲ7 は、独立に、水素、炭素数１〜６のアルキル基、アリール基、アラルキル基、ヘテロアリール基、ヒドロキシル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、炭素数１〜６のアルキルチオ基、ＮＲ3 Ｒ4 およびＳＲ5 からなる群より選択され、ここで、Ｒ3 とＲ4 は以下のように定義され、Ｒ5 は、水素、炭素数１〜６のアルキル基、ヒドロキシル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、または炭素数１〜６のアルキルチオ置換された炭素数１〜６のアルキル基であるか、Ｒ6 とＲ7 は、一緒になって脂環系もしくは複素環系を形成し；またはＣ1 〜Ｃn は、ＣＯ、ＣＳ、ＣＮＲ3 である；
Ｄ1 〜Ｄn は、それぞれ、（ＣＲ6 Ｒ7 ）z （ＣＲ6 Ｒ7 、ＣＨＲ6 ＣＨＲ7 またはＣＨ2 ＣＲ6 Ｒ7 が好ましい）であり、ここで、Ｒ6 とＲ7 は、前記定義するとおりであり、
ｙおよびｚは、それぞれ、０または１〜１０の整数であり、ｙ＋ｚの合計は少なくとも２であり、好ましくは、２を越えるが１０以下であり、
Ｇ1 〜Ｇn-1 は、それぞれ、−ＮＲ3 ＣＯ−、−ＮＲ3 ＣＳ−、−ＮＲ3 ＳＯ−または−ＮＲ3 ＳＯ2-のいずれの向きでもよく、ここで、Ｒ3 は、以下に定義するとおりであり；
Ａ1 〜Ａn とＢ1 〜Ｂn は、それぞれ、下記：
（ａ）Ａ1 〜Ａn は、式（II／Ａ）、（II／Ｂ）、（II／Ｃ）もしくは（II／Ｄ）の基で、Ｂ1 〜Ｂn は、ＮもしくはＲ3 Ｎ＋である、または
（ｂ）Ａ1 〜Ａn は、式（II／Ｄ）の基で、Ｂ1 〜Ｂn は、ＣＨである；
ように選択され、
【００２３】
【化２】
【００２４】
（式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ3 、ＣＨ2 またはＣ（ＣＨ3 ）2 であり；
Ｙは、単結合、Ｏ、ＳまたはＮＲ4 であり、
ｐおよびｑは、それぞれ、０または１〜５の整数であり（ｐ＋ｑの合計は、５以下であることが好ましい）、
ｒおよびｓは、それぞれ、０または１〜５の整数であり（ｒ＋ｓの合計は、５以下であることが好ましい）、
Ｒ1 およびＲ2 は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ−もしくは炭素数１〜４のアルコキシ−もしくは炭素数１〜４のアルキルチオ−置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基、ヒドロキシル基、炭素数１〜４のアルコキシ基、炭素数１〜４のアルキルチオ基、アミノ基およびハロゲンからなる群より選択され、
Ｒ3 およびＲ4 は、それぞれ独立して、水素、炭素数１〜４のアルキル基、ヒドロキシ−もしくはアルコキシ−もしくはアルキルチオ−置換された炭素数１〜４のアルキル基、ヒドロキシル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、炭素数１〜６のアルキルチオ基およびアミノ基からなる群より選択され、
ＱおよびＩは、独立して、−ＣＯ2 Ｈ、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＳＯ3 Ｈもしくは−ＳＯ2 ＮＲ’Ｒ”または−ＣＯ2 Ｈ、−ＳＯ3 Ｈおよび−ＮＲ’Ｒ''' の活性化誘導体から選択され、
ここで、Ｒ’、Ｒ”およびＲ''' は、独立して、水素、アルキル、アミノ保護基、レポーターリガンド、インターカーレーター、キレート化剤、ペプチド、蛋白質、炭水化物、脂質、ステロイド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオチドジホスフェート、ヌクレオチドトリホスフェート、オリゴリボヌクレオチドとオリゴデオキシリボヌクレオチドの両方を含むオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび可溶性および非可溶性ポリマーならびに核酸結合基からなる群より選択され、そして
ｘ１およびｙ１は、それぞれ、０〜１０の整数である）〕
【００２５】
好ましいプローブは少なくとも１種の一般式（ＩＩＩ）：
【００２６】
【化３】
【００２７】
（式中、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＧおよびＬは、それぞれ前記ＡX 、ＢX 、ＣX 、ＤX 、ＧX およびＬX を適用する）の単量体サブユニットを含む。
【００２８】
アルコキシ基およびアルキルチオ基は好ましくは１〜４個の炭素原子を含む。
【００２９】
融合した芳香環部分としては、例えば、ナフトールなどがある。ヘテロ環部分としては、例えば、ピリジンなどがある。レポーター基は、例えば、フルオレセインなどの蛍光化合物などの検出しうる部分、またはハプテンなどの、このハプテンに対する抗体により認識されうる、他の分子本体により認識されうる部分である。
【００３０】
前記構造においてＱまたはＩは、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドであり、かかる構造がＰＮＡ化合物とオリゴヌクレオチドとまたはオリゴヌクレオシドとの間のキメラ構造であると考えられうる。
【００３１】
結合受容体部分のリンカーＡ1 〜Ａn は、一般的に１〜１０原子間の長さであることが好ましく、２〜６原子であることが最も好ましく、供与体部分のリンカーＡ1 〜Ａn は１〜１０原子の長さであり、２〜８原子であることが最も好ましい。
【００３２】
一般式（Ｉ）に基づくサブグループ（Ｉａ）〜（Ｉｂ）の化合物であり、
（Ｉａ）：Ｂl 〜Ｂn はＮであり、Ａl 〜Ａn は−ＣＯ−（ＣＨ2 ）6 −であり、
（Ｉｂ）：Ｂl 〜Ｂn はＮであり、Ａl 〜Ａn は−ＣＯ−ＮＲ3 （ＣＨ2 ）2 −であり、
（Ｉｃ）：Ｂl 〜Ｂn はＣＨであり、Ａl 〜Ａn は−ＮＲ3 −ＣＯ−（ＣＨ2 ）2 −である、
化合物がより好ましい。
【００３３】
好ましいＲＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡへの結合に影響することおよび三本鎖になる構造を形成することに有用なＰＮＡ含有化合物は、一般式（ＩＶａ）：
【００３４】
【化４】
【００３５】
一般式（ＩＶｂ）：
【００３６】
【化５】
【００３７】
および一般式（ＩＶｃ）：
【００３８】
【化６】
【００３９】
（式中、各々Ｌは、一般式（Ｉ）のＬl 〜Ｌn の定義から独立して選ばれ、各々Ｒ7 は、水素および天然αアミノ酸の側鎖からなる群より独立して選ばれ、ｎは１より大きい整数であり、各々ｋ、ｌおよびｍは、独立して０または１〜５の整数であり、各々ｐは０または１であり、Ｒh およびＲi は、Ｒ' 、Ｒ''およびＲ''' として定義される）で表される化合物である。
【００４０】
標識は、それ自身、固定化可能な又は検出可能であるか、あるいは付加部分により共役することによって固定化／検出することができる部分として、一般的に知られている。標識としては、例えば、蛍光部分（例えば、フルオレセインまたはローダミンなど）、酵素（例えば、ペルオキシダーゼまたはホスファターゼなど）、ハプテンなどの免疫学的に活性な物質（例えば、ジゴキシゲニンなど）あるいは蛋白質結合タグ（例えば、ビオチンなど）などがある。
【００４１】
最も好ましい核酸結合化合物は、一般式（Ｖ）：
【００４２】
【化７】
【００４３】
（式中、Ｌは、Ｌ1 〜Ｌn に対して前記定義されたリガンドであり、
ｋ、ｌおよびｍは、独立に０または１〜５までの整数であり、
ｐは、０または１であり、ならびに
Ｒ7 は、水素および天然のαアミノ酸の側鎖からなる群より選択される）
で表されるモノマーサブユニットの少なくとも１つを含むものである。
【００４４】
これらの化合物は、国際公開第９２／２０７０２号パンフレット、国際公開第９４／２５４７７号パンフレット、国際公開第９６／２０２１２号パンフレット、ＥＰ−０ ６７２ ６７７号明細書およびＥＰ−０ ７００ ９２８号明細書に記載の合成に類似の方法で調製することができる。一般式Ｉの化合物を製造するための好ましい方法は、国際公開第９２／２０７０２号パンフレットによるステップワイズ化学合成であり、一般式（VIa ）〜（VIｃ）の化合物をモノマーとして取り込む：
【００４５】
【化８】
【００４６】
（式中、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、それぞれ、その中のいかなるアミノ基もアミノ保護基により保護されてもよい条件で、式（Ｉ）のＡ1 〜Ａn 、Ｂ1 〜Ｂn 、Ｃ1 〜Ｃn およびＤ1 〜Ｄn の定義から選択され；
Ｅは、ＣＯＯＨ、ＣＳＯＨ、ＳＯＯＨ、ＳＯ2 ＯＨまたはそれらの活性化誘導体であり；
Ｆは、ＮＨＲ3 またはＮＰｇａＲ3 であり、ここで、Ｒ3 は前記定義された通りであり、Ｐｇａはアミノ保護基であり、Ｌは、前記定義された通りであるか、その保護誘導体である）
【００４７】
好ましいモノマーは、一般式（ＶＩＩ）：
【００４８】
【化９】
【００４９】
（式中、Ｘは、カルボン酸保護基または水素であり、Ｒ7 は、独立に水素および天然のαアミノ酸の側鎖またはアミノ保護および／またはそれらの酸末端活性化誘導体からなる群より選択される）を有するアミノ酸である。
【００５０】
該核酸分子ＢおよびＣの配列は、好ましくは、それらの少なくとも１種が、分析対象物核酸に対して選択的であるように選ばれる。好ましくは、分子Ｂは非選択的であり、分子Ｃは選択的であり、分子Ｂにより結合した配列は、分子Ｃにより結合した配列よりも短いことが推論される。
【００５１】
さらに、相補体が試料中に存在する場合、複合体ＡＢＣは、核酸Ａとその相補体Ａ’との二重らせん（例えば、天然のｄｓＤＮＡにおける）よりも安定であることが好ましい。
【００５２】
核酸結合分子ＢおよびＣの分子構造（配列要求性から離れて）は、一般的に同一でも異なってもよい。しかしながら、分子ＢおよびＣの少なくとも１種が、非天然骨格を含有する核酸結合化合物であることが大変好ましい。最も好ましくは、分子ＢおよびＣの両方が非天然骨格を有する核酸結合化合物である。以下、分子ＢおよびＣをプローブと称する。本発明の複合体の形成の一般的な要求は、分子Ａ、ＢおよびＣが、以下、三本鎖化領域という領域内で三重らせん構造を形成することができることである。したがって、本発明においては、この領域内に結合するプローブは、いかなる糖リン酸骨格をも含まないことが好ましい。
【００５３】
本発明の核心は、少なくとも核酸鎖Ａ、１つの結合分子ＢおよびＢの配列と異なる塩基配列を有する少なくとも１種のさらなる核酸結合分子Ｃを含む複合体を形成することである。
【００５４】
これらの少なくとも３分子は、これらの全ての分子を含む三本鎖化複合体を形成する条件下にインキュベートされる。核酸Ａおよび分子Ｂを含む他のいかなる複合体もが検出できるまたは妨害する程度に形成されないであろう。これは、いくつかの方法で達成可能であり、そのうちのいくつかは、分子Ｃの構築に関する。
【００５５】
第１の態様においては、三本鎖複合体は三本鎖領域に核酸Ａと１つの分子Ｂと１つの分子Ｃを含む。好ましい態様においては、ＡＢＣの三本鎖領域は３塩基を超えて１１塩基未満、好ましくは４塩基を超えて９塩基未満の長さを有する。したがって、分子Ｂはこの領域をカバーする長さを有するはずであるが、分子Ｂは三本鎖構造に関与する能力を阻害しない他の部分が付着しうる。そのような部分としては、たとえば２次プローブ結合のための特異的認識可能配列として使用されるものなど、標識、または三本鎖構造に関与しない核酸結合分子のような、標識、またはさらに別の認識部分などが挙げられる。三重らせん形成に関与するＢの部分はピリミジン以外の塩基を含まないことが好ましい。
【００５６】
実際には、分子Ｃは、ＷＣモードで核酸Ａに結合することによって三本鎖形成に関与する領域Ｃｙを含んでいる。また、分子Ｃは、好ましくは核酸Ａとの二重らせん形成によって、セグメントＣｙの一端または両端に１つ以上のさらに別のセグメント結合核酸Ａを有する。これらのセグメントは１〜２０塩基、より好ましくは２〜８塩基、最も好ましくは２〜４塩基の長さを有することが好ましい。以下、これらのセグメントをＣｘおよびＣｚと呼ぶ。ＣがセグメントＣｘとセグメントＣｚを有する場合、これらのセグメントは同じ長さのものであってもよいし、異なる長さのものであってもよい。したがって、本態様における分子Ｃの結合領域は、三重らせん形成領域と１または２つの二重らせん形成領域を含む。分子Ｃの長さは、当該分野に熟練せる者にとって公知の方法によって選択すべきものである。このことは、分子Ｃの長さは選択的なものであるべきことを意味する。このことは、言うまでもなく、試料に核酸が含まれていて、核酸Ａと類似の配列を有することが前提となる。特殊な場合では、Ｃの長さは６〜９塩基を超える必要はないが、一般に、類似配列を十分に識別するためには、Ｃの結合配列は１０〜４０塩基対合単位の範囲に入るべきである。本発明の好ましい態様における分子Ｃは、核酸Ａと決定対象でない核酸を識別する塩基情報を含ませるために使用されるため、分子Ｃの核酸Ａ結合全長としては少なくとも１２塩基以上が好ましい。
【００５７】
本発明の本態様を図１に例示する。ハイブリダイゼーションの条件により、短いＰＮＡオリゴ（Ｂ）は別のオリゴによる安定化を受けた場合に限り、フーグスティーン塩基対合を介して分析対象（Ａ）に結合し、より長いＰＮＡオリゴ（Ｃ）は、ワトソン−クリック型塩基対合によって分析対象（Ａ）に結合する（１ａを参照のこと）。同様のハイブリダイゼーション条件下では、２つの短いＰＮＡオリゴ（Ｂ）が分析対象（Ａ）とともに安定な三重らせん構造を形成することができず（１ｂ参照）、Ｂ１個だけでＡとともに安定な二重らせんを形成することもない。
【００５８】
Ａに対するＣの選択性はいかなるＣのセグメント内にも存在しうる。ところが、本発明によれば、またプリンのストレッチに基づいて識別できる核酸は非常に少数しかないという事実に鑑みると、セグメントＣｘおよびＣｚのうちの少なくとも１つにおいて決定対象の核酸配列に対して特異的であるように分子C を設計してもよい。選択性を達成するために、これらのセグメントは、セグメントＣｘまたはＣｚが核酸Ａと決定対象でない核酸の間の配列差を含むような分子Ｂとの結合のためのプリンのストレッチから、伸長している（すなわち決定対象でない核酸とのミスマッチを作り出している）。
【００５９】
本態様を図２に例示した。分析対象（Ａ）と短いフーグスティーン結合ＰＮＡオリゴ（Ｂ）とワトソン−クリック型結合ＰＮＡオリゴの間で形成された三重らせん構造（２ａを参照のこと）は、ミスマッチが導入されると、やはり（Ｂ）によって区画される三重らせん領域の外側で脱安定化され、三重らせん構造（２ｂ参照）は形成されない。
【００６０】
第２の態様においては、分子Ｃと決定対象でない核酸の間のミスマッチは、セグメントＣｙを含む他のセグメント内に存在していてもよい。これも、Ｃと決定対象でない核酸および分子Ｂとの三本鎖複合体の形成が脱安定化される。
【００６１】
本発明の第２の主な態様においては、三本鎖領域は、三本鎖複合体が分析対象核酸Ａと分子Ｂと２個の独立した分子Ｃ（以下Ｃ１およびＣ２という）を含むような別の分子Ｃをさらに含んでいる。これらの分子Ｃはそれぞれが５〜４０塩基の長さを有してもよい。この複合体を構築するためには、分子Ｃのそれぞれが分析対象核酸（Ａ）の結合領域と１個の分子Ｂとともに三本鎖構造を形成しうるセグメントＣｙ（それぞれＣｙ１およびＣｙ２）から成る。各セグメント（Ｃｙ）の配列は、分析対象核酸への排除的結合が行われるように選択される。ここで「排除的」とは、Ａ上のセグメントＣｙ１およびＣｙ２の結合領域が重複しないことをいう。これらの結合領域は、結合したときにＣ１とＣ２がセグメントＣｙ１およびＣｙ２の末端の間に非常に小さなギャップ、好ましくは２〜１ヌクレオチドの長さのギャップ、最も好ましくはニック（ヌクレオチドなし）を形成するように、互いに隣接していることが好ましい。Ｃ１とＣ２は独立的に、分析対象核酸に対するプローブＣ１およびＣ２の二本鎖結合のために設計されたセグメントＣｘまたはＣｚを含むことができる。これらのセグメントＣｘおよびＣｚは、互いに逆方向を向くこれらのセグメントの末端部でセグメントＣｙ１およびＣｙ２と結合することが好ましい。Ｃ１とＣ２は互いに対向するＣｙ１およびＣｙ２の末端部にセグメントを含まないことが好ましい。
【００６２】
本態様を示した図面を図３に示した。ハイブリダイゼーションの条件により、短いＰＮＡオリゴ（Ｂ）は、ワトソン−クリック型塩基対合によって分析対象（Ａ）に結合した２個の隣接結合ＰＮＡオリゴ（Ｃ１およびＣ２）によって安定化されたときに、フーグスティーン塩基対合を介して分析対象（Ａ）に結合しうる（３ａを参照のこと）。またＢによって区画される三重らせん領域の外側でＣ１またはＣ２にミスマッチが導入されると、三重らせん構造全体（３ｂを参照のこと）が脱安定化され、もはや形成されなくなる。２つの分子Ｃ１とＣ２を用いる態様においては、方法の特異性が実質的に強化される。完全な三本鎖複合体の形成が分析対象核酸と対象でない核酸の識別因子であるという事実ゆえに、本発明は、欠失または挿入によって測定することができない核酸とは異なる分析対象核酸の測定に非常に適している。そのような例を図４に示した。ワトソン−クリック型塩基対合によってハイブリダイズしている２個のＰＮＡオリゴ（Ｃ１およびＣ２）が分析対象（Ａ）上で互いに隣接して結合すると、フーグスティーン塩基対合によって（Ａ）にハイブリダイズする短いＰＮＡオリゴ（Ｂ）の結合を促進する共同作用を示し、三重らせん構造ができる（４ａを参照のこと）。１個以上の塩基が２個のワトソン−クリック型結合ＰＮＡオリゴのターゲット部位の間で（Ａ）に導入されると、短いＰＮＡオリゴ（Ｂ）を安定化させることができなくなり、したがってオリゴ（Ｂ）は分析対象（Ａ）に結合しなくなる。
【００６３】
２つの独立したプローブＣ１およびＣ２を用いる態様においては、Ｂの三本鎖結合領域が分子Ｃより小さいものでなければならないという厳密な要件は存在しない。その代わり、Ｂの三本鎖結合領域は分子Ｃ１およびＣ２の結合領域の合計長さより小さいものである必要がある。分子Ｃ１およびＣ２のそれぞれの三本鎖結合領域は、一般にＢの三本鎖結合領域より小さい。
【００６４】
たとえば対立遺伝子間や細菌の種や亜種間、さらには特定の株間などで非常によく似た塩基配列の核酸同士を識別するのに非常に有用なさらに別の態様においては、プローブＢおよびＣに加えて、さらにプローブＤも使用する。プローブＤは、２つのプローブＣの一方の代わりに核酸Ａに結合しうるものであって、該プローブＣとは長さおよび/ または結合位置および/ または配列およびまたは/ ヌクレオ塩基の修飾が異なる競合プローブである。
【００６５】
図１０に図示した好ましい態様においては、標的核酸Ａ、プローブ分子Ｂ、２個のプローブ分子Ｃ１およびＣ２、ならびに競合プローブ分子Ｄを含む反応混合物を用意する。この場合、競合プローブは識別可能なプローブ（すなわちプローブＤの結合領域内に、測定対象の核酸の配列と測定対象でない核酸の配列の違いが存在する）であることが好ましい。競合プローブは標的Ａの一部に対して完全に相補的である配列を有するが、１つ以上の遠位ヌクレオチドを欠いていて、ＤとＣ１の間にギャップを生じている。プローブＣ２が測定対象の核酸（Ａ）に対して完全に相補的である配列を有している場合、競合プローブ（Ｄ）ではなくＣ２がＡにハイブリダイズし、三重らせん形成が可能になる。プローブＣ２が標的Ａに関してミスマッチを有している場合、競合プローブ（適当な組成と濃度がある場合）はＣ２の代わりにＡとハイブリダイズし、三重らせん形成を不可能にするギャップができる。
【００６６】
Mycobacterium interjectum 由来の配列に対応する標的Ａを特異的に測定する場合、この標的配列の一部に対して相補的である競合分子Ｄを、プローブＢ、Ｃ１、およびＣ２とともに試料に添加する。M. interjectumに対して完全に相補的であってＤよりも高い親和性を有する分子Ｃ２を用いる場合、この分子（Ｃ１とともに）はＢを含む三重らせん形成を可能にする。完全にはマッチしていない他のＣ２分子を用いると、これらの分子は競合プローブＤとの競合に敗れ、ギャップができて三重らせん形成が不可能になる。このようにして、ミスマッチＣ２プローブの交差ハイブリダイゼーションの結果として起きる「にせの」三重らせん形成が防止された。すなわち、上記競合プローブを使用すると、近縁核酸の識別の可能性がはるかに高くなる。
【００６７】
上記核酸または核酸結合分子のいずれにおいても三本鎖結合領域は、該核酸または分子の領域が核酸または分子の他の２つの鎖と塩基対合したもの、またはそれ自体が核酸または分子の２つの鎖と塩基対合している塩基と塩基対合したものであると定義する。二重らせん形成領域は、別の核酸または分子の１本のらせんの塩基と塩基対合している分子の領域または配列であるものと定義する（たとえば分析対象核酸Ａ上の三本鎖領域に隣接して結合しているセグメントＣｘおよびＣｚ）。この場合にはワトソン−クリック型塩基対合が起き、三本鎖結合においてはワトソン−クリック型塩基対合とフーグスティーン塩基対合の両方が起きていることが好ましい。この二重らせん形成領域は１塩基対という小ささである場合もあれば、１００塩基対という長さになることもある。
【００６８】
本発明の核心は、分子ＢおよびＣが互いに連結しないことである。このことは、両分子の一方が相手の分子の濃度を人工的に局所的に上昇させることによって、相手を三重らせん複合体に組み込ませないという点で重要である。本発明の背景として、１個または２個の分子Ｃが結合しただけで三重らせんモードにおける分子Ｂの結合が可能になるということがある。しかし、ＡとＢとＣの間の三本鎖複合体の形成は、２個の分子Ｂまたは２個の同一の分子Ｃが１個の分子Ａとともに形成した三本鎖複合体よりも熱安定性が高い場合に限って起きるものである。
【００６９】
正しい三本鎖複合体（ＡとＢとＣから形成されたもの、以下ＡＢＣという）の熱安定性を向上させる手段としては少なくとも３つある。第２の分子Ｂに有利なかたちでの分子Ｃの三本鎖領域への組み込みは、分子Ｃの核酸Ａ結合領域がＢの核酸Ａ結合領域よりも長いために、容易にこれを達成することができる。したがって、Ｃの長さ（および場合によってはＢの長さも）を変えて、最適なＡＢＣ三重らせん形成を行うことができる。
【００７０】
別の態様においては、分子Ｂおよび/ またはＣが少なくとも１つの位置において化学的に修飾されていて、２個の分子Ｂと１個の分子Ａによる三重らせん形成（図９参照）および２個の同じ分子Ｃと１個の分子Ａによる三重らせん形成が脱安定化されている。上記修飾はたとえばカルボキシル基やアミノ基のような荷電基や、アシル基やベンゾイル基のような有機化学基などの化学基が、分子Ｂおよび/ またはＣの原子と結合したものである。これらの基の配置としては、分析対象の核酸に結合したときに、２個の同一分子（ＢまたはＣ）の化学基が近接状態となって三重らせん複合体全体の脱安定化を引き起こすように、プローブの配列が選ばれる場合が好ましい。上記化学基のサイズと性質を利用すれば、結合特性を細かく調節することができるが、正しい三本鎖複合体（ＡとＢとＣを含む）の形成に影響が及ばないようなやり方で選ぶべきである。本発明の第３の態様においては、好ましい結合モードでＡＢ2 およびＡＣ2 における三本鎖結合領域が非常に小さくなるような非対称の塩基配列を、三本鎖結合領域が有する。もちろん、三本鎖複合体における好ましい結合モードは、選ばれた分子の化学構造によって決まる。たとえば、ペプチド核酸の場合、好ましい三本鎖結合モードは互いに逆平行的、すなわち、該２個の分子のアミノ末端の一方は分析対象核酸の３’末端側に向き、他方は分析対象核酸の５’末端側に向いて、互いに逆方向を向いている場合である。したがって、分析対象核酸Ａの非対称結合領域（非対称塩基配列）を選ぶとともに、互いに逆平行モードで結合するような逆方向になるようにＣとＢを合成することが好ましい。
【００７１】
ペプチド核酸オリゴに関しては、核酸による三重らせん形成は、２個の分子が同じ方向を向いている場合も可能である。これらの複合体は２個のＰＮＡ分子が逆方向に結合している場合よりも安定性が低いが、２個の分子Ｂまたは２個の同一の分子Ｃが分析対象核酸Ａとともに三本鎖を形成して、正しい複合体ＡＢＣの形成を阻害する可能性がある。ＡＢ2 とＡＣ2 の両者の脱安定化については上記のとおりである。また、ＡＣ2 の形成は、たとえば分子Ｃではなく分子Ｂ中にシュードイソシトシンのような修飾塩基を含ませて、アルカリ性条件下で結合反応を行うことによって、これを防止することができる。アルカリ性条件下ではシトシンはプロトン化されないため、フーグスティーン結合には関与できないのに対して、シュードイソシトシンは反応溶液のｐＨに依存しない。シュードイソシトシンおよびその他の修飾塩基が国際公開第９６/ ０２５５８号パンフレットに開示されている。
【００７２】
測定対象の核酸（Ａ）を含む試料を、プローブ分子ＢおよびＣと混合して、これらのプローブ分子と測定対象の核酸の間に複合体ＡＢＣを形成させる。この複合体は塩基介在水素結合によってできる。核酸へのプローブ分子の結合は、当該分野に熟練せる者にとって公知の三重らせん形成条件に従って起きる。ペプチド核酸の場合の該条件は、たとえば国際公開第９５/ ０１３７０号パンフレットやウィットゥングら（Wittung, P. et al.）〔Biochemistry 36(26):7973-7979 (1997)〕に詳細に記載されているが、これらの文献の開示内容は引例により本願に含まれるものとする。多くの場合、試料中の核酸の量は未知または不明であるため、試料中の核酸Ａの最大予想量を超えるように各プローブ分子の量を選択することが好ましいが、低レベルのバックグランドシグナルを維持するためには、予想される核酸の量と同程度になるようにプローブ分子の量を選ぶのがよい。
【００７３】
国際公開第９５/ １５９７１号パンフレットに開示されているように、核酸の存在を判定する方法にはいくつかの種類がある。本発明においては、少なくとも１個のプローブ分子が標識されることが好ましい。分子Ｂは標識を付着されたものであることが最も好ましい。核酸Ａまたは単数または複数の分子Ｃのいずれかが固定可能な標識を有するか、すでに固定されていることがさらに好ましい。決定対象の核酸とプローブ分子を含む複合体内では、少なくとも１つのリポーター部分および/ または少なくとも１つの固定可能部分が存在するということが基本原理である。
【００７４】
本発明の方法の具体的態様の実施例を図５に示した。分析対象の核酸（長鎖）を、一方がたとえば５’- リン酸末端にビオチン部分を有することによって固定的に標識されている１対のプライマーと接触させる。ＰＣＲによる増殖の後、ビオチン化プライマーを含む鎖が固定的に標識されている。本発明の方法に従う検出においては、これらの鎖を分析対象核酸Ａとして使用する。次いで、試料を、ワトソン−クリック型塩基対合によって互いに隣接して標識鎖に結合しうるように設計した２個のプローブ分子Ｃと混合する。さらに、試料を、分子Ｃの全体結合配列より短く、フーグスティーン塩基対合により上記概要を示したように三本鎖領域を形成しうるプローブ分子Ｂと混合する。この分子Ｂは検出可能な標識を含んでいる。図５の左側の矢印は、ＰＣＲで生じた単位複製配列（amplicon）が実際に決定対象の核酸である場合を示している。そこで、プローブ分子ＢおよびＣは正しい三本鎖複合体を形成することができる。この複合体は、ストレプトアビジン被覆固相支持体上で固定化させ、過剰なプローブ分子と標識を洗浄により除去し、該固相支持体上の検出可能標識の存在または量を検出した後で、これを決定することができる。もちろん、検出方法は使用する標識によって決まり、たとえば電気化学蛍光法により標識したプローブの場合には、電気化学蛍光を発生させて、これを検出する。図５の右矢印の下に示したように、検出対象外の核酸単位複製配列（分子Ｃへの隣接的結合のための正しい二本鎖結合領域を含まない）は検出されない。このことは、両方のプローブ分子Ｃ１およびＣ２が偶然に核酸Ａに結合できる確率が低い場合でも、正確に相互隣接的に結合しない限り検出されないことを示している。この場合、プローブ分子Ｂは熱安定複合体ＡＢＣ１Ｃ２には関与できないため、分析対象Ａは検出可能的には標識されず、固相に固定化されたとしても、測定されることはない。
【００７５】
本発明者らは、ワトソン−クリック型結合分子（Ｃ）の長さを増大させることによって、所望の三本鎖構造であるＡＢＣの全体的安定性を増大させることができることを示した。プローブＢとＣはどちらも、三本鎖形成のための標的として機能する、短い三本鎖領域に対して相補的な塩基の配列（たとえばホモプリン域（tract ））を有する。このため、プローブＢの２個の分子またはＣの２個の同一分子は理論上は標的配列内で競合的三本鎖構造を形成する可能性があるが、修飾塩基および/ または骨格を使用するとともに、ハイブリダイゼーション条件をコントロールすることによって、正しい三本鎖構造ＡＢＣを確実に形成させることができる。
【００７６】
本発明者らはまた、それぞれが三本鎖領域の一部をカバーする２個の隣接結合しているワトソン−クリック型対合オリゴ（Ｃ）が、小型オリゴＢを含む三本鎖形成が起きるのに十分な程度にフーグスティーン結合を安定化しうることも明らかにした。このオリゴは一度結合すると、三本鎖をさらに安定化させるが、特定のフーグスティーンオリゴが結合したままでいるかどうかは、主に単数または複数のワトソン−クリック型オリゴのオフ率（off-rate）によって決まる。したがって、本発明者らの研究の結果から、三本鎖形成は限定的ステップであるところのワトソン−クリック型結合によって開始されること、および融解はいうまでもなくフーグスティーン結合の瞬間的解離につながるワトソン−クリック型塩基対合の解離によって開始されることがわかる。
【００７７】
これらの知見は、いくつかの意味合いを持つ。まず、実際に三本鎖構造の結合と安定化に関与する認識部位の塩基数は、三本鎖領域そのものの中にある塩基数には限定されないため、隣接位置におけるミスマッチ区別も可能になる。次に、様々な測定条件下で熱安定性をコントロールするために適用できるパラメーター群とともに三本鎖構造の熱安定性を調節することができる範囲が広がる。第３に、２個のワトソン−クリック型対合プローブＣの２個のハーフ標的部位への協同的結合を利用して、三本鎖構造のミスマッチ識別能力をさらに強化することができる。第４に、所望の三本鎖構造の形成を、２個のワトソン−クリック型対合プローブＣが実際に標的核酸らせん上で互いに直接隣接するように結合していることを確認する目安とすることができる。最後に、短い標識フーグスティーン結合プローブが関与する三本鎖形成は、正しい標的配列が同定されたことを二重に確認する目安とすることができる。これは、三本鎖形成の第２のステップ（フーグスティーン結合）は第１のステップ（ワトソン−クリック型結合）に決定的に依存しているためである。上記スキームにおいては、標識プローブは、単数または複数の第１のプローブ（Ｃ）がその標的配列に対して正しくハイブリダイズされている場合を除き、どの核酸にも結合しない。
【００７８】
三重らせんはワトソン−クリック型鎖のみの長さを増大させることによって安定化できるという知見は新規かつ予想外のものである。ハイブリダイゼーション条件をモニターし、短いプローブが長いワトソン−クリック型結合プローブによって安定化される場合のみ、フーグスティーン結合によって結合可能となるようにすることができる。
【００７９】
三本鎖構造形成のための完全な標的部位における、三本鎖モチーフに隣接する混合配列を含ませるというオプションを選べば、フーグスティーン鎖によって区画される実際の三重らせん領域の外側の塩基配列に三重らせん形成を依存させることによって、全体安定性を調節するさらに別の手段が提供される。
【００８０】
協同的に結合したワトソン−クリック型プローブ（分離プローブ）を用いてフーグスティーン鎖を安定化させることによって、三重らせん領域そのものからさらに遠い位置にあるヌクレオ塩基が三重らせん構造全体の安定性に影響を及ぼすことができる。また、協同的に結合したワトソン−クリック型オリゴの使用により、複合体全体の特異性も強化される。これは、たとえば分離プローブはハイブリダイゼーションのための標的領域においてより低縮重に耐えるので、単一塩基の突然変異に対する２個の独立したワトソン−クリック型プローブは同様の長さの単一プローブよりも識別力が高いためである。
【００８１】
ＰＮＡを形成する短い三重らせんはワトソン−クリック型結合ＰＮＡによる安定化を必要とするということを利用すれば、２個の独立プローブ（split probes）の間にギャップがすでに存在している場合やギャップを導入した場合、それらのプローブは三重らせんを十分には安定化させないことから、それらのプローブが実際に標的分子上で相互隣接的にハイブリダイズされることを確認することができる。
【００８２】
本発明はユニバーサルプローブＢを利用する可能性を提供する。Ｂは比較的短いため、選択的なＣは、異なる分析対象の測定に使用可能なように連続的にこれを選択することができるため、異なる測定においてプローブ合成の必要性が低くなる。また、同じ標識オリゴを用いて、異なる標的核酸を同時に検出することができる。
【００８３】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明する。
【００８４】
ＰＮＡオリゴおよび単量体を、国際公開第９６／０２５５８号パンフレットにしたがって合成し、ＡＢＩ４３３シンセサイザーで自動化合成（コッホ，Ｔ．ら、（１９９７）、Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．４９：８０−８８）に記載されたように合成した。全ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、一本鎖および直鎖状である。
【００８５】
ＮＨ2 はＰＮＡのＣＯＮＨ2 末端（化学合成の間、固相に付着した末端）を示し、ＨはＰＮＡのアミノ末端を意味する。
【００８６】
実施例１ 決定対象の核酸ならびに分子ＢおよびＣ由来の複合体の形成
ハイブリダイゼーションの適切な条件を与えたとき、他のより長いＰＮＡオリゴのワトソン−クリック型塩基対合による分析対象物への結合により安定化した場合のみ、短いＰＮＡオリゴ（Ｂ）はフーグスティーン塩基対合を介して、分析対象物（Ａ）に結合する（図１ａに描く）。同様のハイブリダイゼーション条件下、短いＰＮＡオリゴ（Ｂ）単独では、分析対象物（Ａ）と安定な三本鎖構造を形成することができない（図１ｂに描く）。これを実験的に示し、結果を図６に示した。
【００８７】
使用した分子は下記のものである：
Ａ： ＤＮＡ １２マー ５’−ＴＣＣＡＧＡＡＧＡＴＡＣ−３’（配列番号：１）
Ｂ： ＰＮＡ ６マー Ｈ−ＴＣＴＴＣＴ−ＮＨ2
Ｃ： ＰＮＡ １２マー Ｈ−ＧＴＡＴＣＴＴＣＴＧＧＡ−ＮＨ2
【００８８】
三本鎖形成の条件は下記のとおりである：１ｐｍｏｌ放射性標識ＤＮＡオリゴ（Ａ）をＰＮＡオリゴ（下記の表に記載の量）と全容量８μｌの緩衝液（組成：１００ｍＭ ＮａＣｌ；０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；１０ｍＭ ＮａＨ2 ＰＯ4 ，ｐＨ5 ）中で混合した。反応は、２分間、９５℃で、熱変性し、２時間インキュベートした。産物を１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ついでオートラジオグラフィーにより解析した。
【００８９】
数字１）〜９）は、図６に示したオートラジオグラムのレーンをいう。
図６ａ）レーン：
１）Ａ（１ｐｍｏｌ）
２）Ａ（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（１ｐｍｏｌ）
３）Ａ（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）
４）Ａ（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（４ｐｍｏｌ）
５）Ａ（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（１０ｐｍｏｌ）
６）Ａ（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）＋Ｃ（１ｐｍｏｌ）
７）Ａ（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）＋Ｃ（２ｐｍｏｌ）
８）Ａ（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）＋Ｃ（４ｐｍｏｌ）
９）Ａ（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）＋Ｃ（１０ｐｍｏｌ）
【００９０】
図６ｂ）レーン：
１）Ａ（１ｐｍｏｌ）
２）Ａ（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ（１ｐｍｏｌ）
３）Ａ（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ（２ｐｍｏｌ）
４）Ａ（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ（４ｐｍｏｌ）
５）Ａ（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ（１０ｐｍｏｌ）
６）Ａ（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ（２ｐｍｏｌ）＋Ｂ（１ｐｍｏｌ）
７）Ａ（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ（２ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）
８）Ａ（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ（２ｐｍｏｌ）＋Ｂ（４ｐｍｏｌ）
９）Ａ（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ（２ｐｍｏｌ）＋Ｂ（１０ｐｍｏｌ）
【００９１】
ゲルは、１ｐｍｏｌのＡを伴って、Ｂの量を増加するインキュベーションがいかなる検出可能なハイブリッドをも生じず、ＤＮＡオリゴ（Ａ）のみがゲル中に見られることを示す（図６ａ，レーン１〜５）。ＡおよびＢの量を一定に保ち、Ｃの量を増加させて混合した場合、Ａ、ＢおよびＣの間に三本鎖産物を形成し（図６ａ、レーン６および７）、過剰量のＣの添加後、Ａおよび２つの分子Ｃの間に付加的な三本鎖産物を形成する（図６ａ、レーン８および９）。よりかすかなバンドが、レーン６〜９に見られ、それはＡおよびＣの間の少量の二本鎖の形成を示す。図６ｂにおいて、ＤＮＡオリゴ単独がゲルの下部に見られたが、Ｃの量を増加させて添加した後、二本鎖および好ましい産物である三本鎖形成が見られる（レーン２〜５）。ＡおよびＣの量を一定に保ち、Ｂを増加させて添加すると、Ａおよび２つの分子Ｃの間の三本鎖は全く競合外であるが、Ａ、ＢおよびＣが関与する三本鎖の形成を生じる。これらの結果は、これらのハイブリダイゼーションの条件下では、短いＰＮＡオリゴ（Ｂ）がＡとの安定な産物を形成できないが、ＡおよびＣの両方と共に存在する場合には、ＡＢＣ三本鎖の形成に関係し、ＡＣ2 三本鎖の形成も競合外であることを示す。
【００９２】
実施例２ ２つの分子Ｃ１およびＣ２ならびにプローブＢを用いる三重らせん複合体の形成による、１つの塩基の相違を有する核酸間の区別化
本実験は、２つの分断プローブを用いた本発明の好ましいモードを規定する。結果を図７におけるオートラジオグラムとして示す。下記の化合物を実験に用いた（三重らせん形成に関与する配列は下線を付した対称性の場合）：
Ａ１： ＤＮＡ １６マー：５’−ＣＧＴＣＣＡＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧ−３’
（決定対象の核酸）（配列番号：２）
Ａ２： ＤＮＡ １６マー：５’−ＣＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧ−３’
（決定対象でない核酸）（配列番号：３）
Ｂ ： ＰＮＡ ６マー：Ｈ−ＴＣＴＴＣＴ−ＮＨ2
Ｃ１： ＰＮＡ ８マー：Ｈ−ＣＧＧＴＡＴＣＴ−ＮＨ2
Ｃ２： ＰＮＡ ８マー：Ｈ−ＴＣＴＧＧＡＣＧ−ＮＨ2
【００９３】
実験条件は下記のとおりである：１ｐｍｏｌの放射性標識したＤＮＡオリゴ（Ａ１またはＡ２）をＰＮＡオリゴ（下記表に記載の量）と全容量８μｌの緩衝液（組成：１００ｍＭ ＮａＣｌ；０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；１０ｍＭ ＮａＨ2 ＰＯ4 ，ｐＨ5 ）中で混合した。反応は、２分間、９５℃で、熱変性し、２時間インキュベートした。産物を１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ついでオートラジオグラフィーにより解析した。
【００９４】
数字１）〜１０）は、図７に示したオートラジオグラムのレーンをいう。
【００９５】
図７ａ）レーン：
１）Ａ１（１ｐｍｏｌ）
２）Ａ１（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）
３）Ａ１（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ１（２ｐｍｏｌ）
４）Ａ１（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ２（２ｐｍｏｌ）
５）Ａ１（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）＋Ｃ１（２ｐｍｏｌ）
６）Ａ１（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）＋Ｃ２（２ｐｍｏｌ）
７）Ａ１（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）＋Ｃ１／Ｃ２（１／１ｐｍｏｌ）
８）Ａ１（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）＋Ｃ１／Ｃ２（２／２ｐｍｏｌ）
９）Ａ１（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）＋Ｃ１／Ｃ２（４／４ｐｍｏｌ）
１０）Ａ１（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）＋Ｃ１／Ｃ２（１０／１０ｐｍｏｌ）
【００９６】
図７ｂ）レーン：
１）Ａ２（１ｐｍｏｌ）
２）Ａ２（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）
３）Ａ２（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ１（２ｐｍｏｌ）
４）Ａ２（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ２（２ｐｍｏｌ）
５）Ａ２（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）＋Ｃ１（２ｐｍｏｌ）
６）Ａ２（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）＋Ｃ２（２ｐｍｏｌ）
７）Ａ２（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）＋Ｃ１／Ｃ２（１／１ｐｍｏｌ）
８）Ａ２（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）＋Ｃ１／Ｃ２（２／２ｐｍｏｌ）
９）Ａ２（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）＋Ｃ１／Ｃ２（４／４ｐｍｏｌ）
１０）Ａ２（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）＋Ｃ１／Ｃ２（１０／１０ｐｍｏｌ）
【００９７】
図７ａに見ることができるように、Ｂ、Ｃ１またはＣ２のいずれもが、分析対象物Ａ１単独との安定なハイブリッドを形成できず（レーン２〜６）、Ａ、Ｂ、Ｃ１およびＣ２の全ての構成成分が存在した場合、安定な三本鎖構造が形成されるであろう（レーン７〜１０）。ミスマッチが分析対象物（Ａ２）と１つのＷＣ結合プローブ（Ｃ２）間に導入される場合、三本鎖形成は強く阻害される（図７ｂ、レーン７〜１０）。
【００９８】
実施例３ １つの塩基の挿入により異なる核酸の間の区別化
この決定において、実施例２のように２つの分断プローブが用いられた。決定対象の核酸は、後者への１つの塩基の挿入による、決定対象でない核酸とは異なる。プローブＣ１およびＣ２を、決定対象でない核酸に、それらの間の１塩基のギャップで結合するが、決定対象の核酸に結合した場合、複合体中にニックのみで結合するように選択する（三重ヘリックス形成に関与する配列はアンダーラインを付し、非対称の場合である）。
【００９９】
使用した分子は下記のものである：
Ａ１： ＤＮＡ ４０マー（決定対象の核酸）：
５’−ＧＣＴＴＧＴＡＧＴＣＣＴＧＣＴＴＧＡＧＡＧＡＡＣＧＴＧＣＧＧＧＣＧＡＴＴＴＧＣＣ−３’（配列番号：４）
Ａ２： ＤＮＡ ４０マー（決定対象でない核酸）：
５’−ＧＣＴＴＧＴＡＧＴＣＣＴＧＣＴＴＧＡＧＡＴＧＡＡＣＧＴＧＣＧＧＧＣＧＡＴＴＴＧＣ−３’（配列番号：５）
Ｂ ： ＰＮＡ ６マー： Ｈ−ＴＣＴＣＴＴ−ＮＨ2
Ｃ１： ＰＮＡ １５マー： Ｈ−ＡＴＣＧＣＣＣＧＣＡＣＧＴＴＣ−ＮＨ2
Ｃ２： ＰＮＡ １５マー： Ｈ−ＴＣＴＣＡＡＧＣＡＧＧＡＣＴＡ−ＮＨ2
【０１００】
実験条件は下記のとおりである：１ｐｍｏｌの放射性標識したＤＮＡオリゴ（Ａ１またはＡ２）をＰＮＡオリゴ（下記表に記載の量）と全容量８μｌの緩衝液：１００ｍＭ ＮａＣｌ；０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；１０ｍＭ ＮａＨ2 ＰＯ4 ，ｐＨ5 中で混合した。反応は、２分間、９５℃で、熱変性し、２時間インキュベートした。産物を１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ついでオートラジオグラフィーにより解析した。
【０１０１】
数字１）〜１２）は、図８に示したオートラジオグラムのレーンをいう。
【０１０２】
図８）レーン：
１）Ａ１（１ｐｍｏｌ）
２）Ａ１（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ１（１０ｐｍｏｌ）
３）Ａ１（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ２（１０ｐｍｏｌ）
４）Ａ１（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ１／Ｃ２（１０／１０ｐｍｏｌ）
５）Ａ１（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（１０ｐｍｏｌ）＋Ｃ１／Ｃ２（１０／１０ｐｍｏｌ）
６）Ａ１（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（１０ｐｍｏｌ）
７）Ａ２（１ｐｍｏｌ）
８）Ａ２（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ１（１０ｐｍｏｌ）
９）Ａ２（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ２（１０ｐｍｏｌ）
１０）Ａ２（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ１／Ｃ２（１０／１０ｐｍｏｌ）
１１）Ａ２（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（１０ｐｍｏｌ）＋Ｃ１／Ｃ２（１０／１０ｐｍｏｌ）
１２）Ａ２（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（１０ｐｍｏｌ）
【０１０３】
各々のＰＮＡプローブＣ１およびＣ２は分析対象物（Ａ１またはＡ２）単独（レーン２〜３、８〜９）または共に（レーン４および１０）と二本鎖を形成することができる。２つの二本鎖形成ＰＮＡオリゴＣ１およびＣ２がお互いに隣接して結合した場合、短い三本鎖形成ＰＮＡオリゴＢが、フーグスティーン塩基形成を介して三本鎖構造を形成する（レーン５）。Ｃ１およびＣ２がわずか１塩基離れる場合、三本鎖形成オリゴＢは結合せず（レーン１１）、分析対象物およびＣ１／Ｃ２の間の複合体のみが見られる。
【０１０４】
実施例４ 競合プローブＤを用いた区別化
本実験は、Ｃ１およびＣ２の２分子、フーグスティーン結合により三本鎖の形成が可能な標識分子Ｂ、ならびに標的Ａにハイブリダイズ可能な分子Ｄを用いた検出の改良された特異性の実施例である（図１０に描く）。実験の結果を図１１に示す。下記化合物を用いた：
Ａ ： ＤＮＡ ２２マー： ５’−ＣＴＴＧＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧＣＴＴＴＴＧＣＧ−３’（配列番号：６）
Ａ１： ＤＮＡ ２２マー： ５’−ＣＣＴＧＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧＣＴＴＴＴＧＣＧ−３’（配列番号：７）
Ａ２： ＤＮＡ ２２マー： ５’−ＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧＣＴＴＴＴＧＣＧ−３’（配列番号：８）
Ａ３： ＤＮＡ ２２マー： ５’−ＣＴＴＴＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧＣＴＴＴＴＧＣＧ−３’（配列番号：９）
Ｂ ： ＰＮＡ ６マー： ケンプチド（Ｋｅｍｐｔｉｄｅ）−ＪＪＴＴＴＪ−ｇｌｙ−ＮＨ2 （Ｊはシュードイソシトシンを示す）
Ｃ１： ＰＮＡ １１マー： Ｈ−ＣＧＣＡＡＡＡＧＣＴＴ−ＮＨ2
Ｃ２−１： ＰＮＡ １１マー： Ｈ−ＴＣＣＡＣＣＡＣＡＧＧ−ＮＨ2
Ｃ２−２： ＰＮＡ １１マー： Ｈ−ＴＣＣＡＣＣＡＣＡＣＡ−ＮＨ2
Ｃ２−３： ＰＮＡ １１マー： Ｈ−ＴＣＣＡＣＣＡＡＡＡＧ−ＮＨ2
Ｄ ： ＰＮＡ １０マー： Ｈ−ＣＣＡＣＣＡＣＡＡＧ−ＮＨ2
【０１０５】
ＰＮＡ Ｂをケンプチド−モチーフ（コッホ，Ｔら．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．（１９９５）３６：６９９３−３６）を介して放射標識し、１ｐｍｏｌを１ｐｍｏｌの標的（Ａ、Ａ１、Ａ２またはＡ３）および種々の量のＰＮＡプローブＣおよびＤを、全量１０μｌの緩衝液（組成：１００ｍＭ ＮａＣｌ；０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；１０ｍＭ ＮａＨ2 ＰＯ4 ，ｐＨ５．０）中で混合した。１０分、室温でハイブリダイズする前、混合液を９５℃で２分間熱変性した。２μｌのローディング緩衝液を添加し、反応物の半分（レーン１および２）または反応物の１／３（レーン３〜８）を５％アクリルアミドゲル電気泳動で泳動し、オートラジオグラフィーで可視化した。
【０１０６】
３つの異なる組み合わせのＰＮＡ検出プローブ（図１１ａ、ｂおよびｃ）を、それらの対応する標的ＤＮＡオリゴ（それぞれ、Ａ１、Ａ２およびＡ３）に結合する能力ならびに標的ＤＮＡオリゴに関して異なる１塩基置換を含む関連する対照ＤＮＡオリゴへのクロスハイブリダイゼーションを試験した。ハイブリダイゼーションを対照オリゴＡに相補的であるが、検出プローブ（Ｃ２−１、Ｃ２−２およびＣ２−３）よりも１ヌクレオ塩基短い競合ＰＮＡ（Ｄ）の量を増加なしにまたは増加させてアッセイした。ＤＮＡ標的領域の他の半分を網羅するプローブＣ１は、全ての標的に対して共通であり、したがって全てのアッセイに使用した。
【０１０７】
図１１ａのレーン１〜８に対応する反応は下記のとおりである：
１） Ａ（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−１（１０ｐｍｏｌ） Ｂ（１ｐｍｏｌ）
２） Ａ１（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−１（１０ｐｍｏｌ）Ｂ（１ｐｍｏｌ）
３） Ａ（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−１（１０ｐｍｏｌ） Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（１０ｐｍｏｌ）
４） Ａ１（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−１（１０ｐｍｏｌ）Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（１０ｐｍｏｌ）
５） Ａ（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−１（１０ｐｍｏｌ） Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（１５ｐｍｏｌ）
６） Ａ１（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−１（１０ｐｍｏｌ）Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（１５ｐｍｏｌ）
７） Ａ（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−１（１０ｐｍｏｌ） Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（２０ｐｍｏｌ）
８） Ａ１（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−１（１０ｐｍｏｌ）Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（２０ｐｍｏｌ）
【０１０８】
図１１ｂのレーン１〜８に対応する反応は下記のとおりである：
１） Ａ（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−２（１０ｐｍｏｌ） Ｂ（１ｐｍｏｌ）
２） Ａ２（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−２（１０ｐｍｏｌ）Ｂ（１ｐｍｏｌ）
３） Ａ（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−２（１０ｐｍｏｌ） Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（１０ｐｍｏｌ）
４） Ａ２（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−２（１０ｐｍｏｌ）Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（１０ｐｍｏｌ）
５） Ａ（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−２（１０ｐｍｏｌ） Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（１５ｐｍｏｌ）
６） Ａ２（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−２（１０ｐｍｏｌ）Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（１５ｐｍｏｌ）
７） Ａ（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−２（１０ｐｍｏｌ） Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（２０ｐｍｏｌ）
８） Ａ２（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−２（１０ｐｍｏｌ）Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（２０ｐｍｏｌ）
【０１０９】
図１１ｃのレーン１〜８に対応する反応は下記のとおりである：
１） Ａ（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−３（１０ｐｍｏｌ） Ｂ（１ｐｍｏｌ）
２） Ａ３（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−３（１０ｐｍｏｌ）Ｂ（１ｐｍｏｌ）
３） Ａ（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−３（１０ｐｍｏｌ） Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（１０ｐｍｏｌ）
４） Ａ３（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−３（１０ｐｍｏｌ）Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（１０ｐｍｏｌ）
５） Ａ（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−３（１０ｐｍｏｌ） Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（１５ｐｍｏｌ）
６） Ａ３（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−３（１０ｐｍｏｌ）Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（１５ｐｍｏｌ）
７） Ａ（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−３（１０ｐｍｏｌ） Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（２０ｐｍｏｌ）
８） Ａ３（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−３（１０ｐｍｏｌ）Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（２０ｐｍｏｌ）
【０１１０】
ＰＮＡ競合分子Ｄの非存在下、ＰＮＡプローブ分子Ｃ１、Ｃ２およびＢの組み合わせは結合すること、ならびに１つのミスマッチを有する対照標的（レーン１）および完全に相補的な標的（レーン２）と三本鎖構造を形成することができる。１０ｐｍｏｌの競合剤（レーン３）の含有は、さらに１セットの検出プローブとのいくつかのクロスハイブリダイゼーションをおこすが（図１１ｃ）、対照標的への全てのクロスハイブリダイゼーションを、反応物へのより高い量のＰＮＡ競合剤Ｄを添加することにより妨げることができる（レーン５、７および８）。相補的な標的との三本鎖形成は、競合剤の存在下でさえも見られた（レーン４、６および８）。
【０１１１】
【発明の効果】
本発明により、特定の遺伝子または生物にのみ存在するが、試料中に存在するいかなるバックグラウンドの核酸においても存在しないヌクレオ塩基の配列を同定することができるという優れた効果を奏する。
【０１１２】
【配列表】
【０１１３】
【０１１４】
【０１１５】
【０１１６】
【０１１７】
【０１１８】
【０１１９】
【０１２０】
【０１２１】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、理論的に可能な、分析対象物核酸Ａ、より短いプローブＢおよびより長いプローブＣを含む混合物中で形成した三本鎖複合体を示す。ハイブリダイゼーションの適切な条件で、複合体１ａの形成は、特異的な分析対象物核酸Ａのための複合体１ｂの形成よりも優先させる。
【図２】図２は、三重らせん結合領域の外側にミスマッチを有するプローブＣを含む複合体２ｂは、完全にマッチしたプローブＣを含む複合体２ａに比べて複合体の形成を好まないことを示す。
【図３】図３は、図２と同じ配置を示すが、１つのより長いプローブＣのかわりに２つのより小さいプローブＣ１およびＣ２を使用することを特徴とする。
【図４】図４は、図３の配置において、２つのプローブＣ１およびＣ２が安定な三本鎖形成を生じるために三重らせん結合領域内に隣接し結合しなけらばならないことを示す。系を改良するために、このセットアップにおいて区別可能なプローブである、すなわち、ミスマッチがこのプローブにより覆われる領域に見いだされる、Ｃ２の競合剤として作用する追加のＰＮＡ化合物（Ｄ）が含まれる。該競合剤は、Ａに完全に相補的な配列を有するが、Ｃ１およびＣ２間のギャップに生じる遠位のヌクレオチドを欠く。プローブＣ２が標的Ａに関わるミスマッチを有する場合、競合剤（適切な長さと濃度を与えられた）がかわりにＡにハイブリダイズし、ギャップを形成するであろう。かかるギャップは、顕著に三本鎖形成を減少される（図４）。これらの２つの特徴（図３および４）の組み合わせにより、系の特異性を増強される。
【図５】図５は、核酸が増幅の間に標識され、正しいアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）が、異なる標識がされたプローブＢの使用により決定される、本発明の好ましい態様を示す。
【図６】図６は、実施例１で行なった実験結果のオートラジオグラムを示す電気泳動の写真である。
【図７】図７は、実施例２で行なった実験結果のオートラジオグラムを示す電気泳動写真である。
【図８】図８は、実施例３で行なった実験結果のオートラジオグラムを示す電気泳動の写真である。
【図９】図９は、ＡＢ2 を脱安定化した第１の様式を示す。
【図１０】図１０は、実施例４の概略を示し、ａは、決定対象の核酸（Ａ）が完全にプローブＣ２およびプローブＤの両方にマッチしているが、プローブＣ２が決定対象の核酸により高い親和性をもつ場合を示す。この場合において、結合後のＣ１とＣ２はニックにより分離しているのみなので、三重らせん構造が形成されうる。またｂは、標的核酸（Ａ）がＣ２に関してミスマッチを有するが、競合プローブＤとはミスマッチを持たない場合を示す。この状況は、三重らせんの形成をさまたげるＤとＣ１との間のギャップを生じる該標的へのＤの結合を好む。したがって、決定対象でない核酸は、決定対象の核酸から識別することができる。
【図１１】図１１は、実施例４で行なった実験結果のオートラジオグラムを示す電気泳動の写真である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、決定対象の核酸および２以上のプローブ分子間の三本鎖複合体を形成することによる核酸の決定方法、かかる方法により形成された三本鎖結合複合体ならびにプローブとしての小さい三本鎖形成核酸結合分子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸分子の検出および定量は、ある種の診断技術において必須の要素を構成する。かかる技術の基本的な特徴は、相補的な核酸配列に特異的にハイブリダイズするプローブ（核酸または核酸アナログ）の能力である。ハイブリダイゼーションを起こすために、幾つかの標準的な条件としては、例えば、塩濃度および温度などに関して合わさなければならないが、主要な決定因子は、２つのハイブリダイズしている鎖のハイブリッドにおける完全にマッチしたヌクレオ塩基の数である。１つの塩基対のミスマッチ（または欠失／挿入）により引き起こされる安定性の相対的な低下がハイブリッドの長さが増加するにつれて、ますます減少するが、相対的に短い長さ、例えば、６〜１０塩基対のハイブリッドにおいて、１つの塩基対のミスマッチは、熱安定性の劇的な減少を生じる。
【０００３】
診断の目的のために、特定の遺伝子または生物にのみ存在するが、試料中に存在するいかなるバックグラウンドの核酸においても存在しないヌクレオ塩基の配列を同定することが、しばしば望まれる。例えば、ヒトゲノムなどのような典型的な試料に統計学的に独特であるヌクレオ塩基の特定の配列のために、配列の長さは、他方、熱安定性の劇的な損失なしにミスマッチに適応させる能力を増強するであろう、少なくとも１８〜２０塩基のオーダーでなければならない。
【０００４】
核酸の認識は、一般的に二本鎖または三本鎖形成の使用により可能であるが、現在では、ワトソン−クリック型（ＷＣ）塩基対合を介して一本鎖分析対象物核酸に結合している初期の二本鎖形成プローブが、診断目的のために使用される。ＷＣおよびフーグスティーン結合（Ｈ）の両方が関与する三本鎖構造は、二本鎖に比べて、非常に熱安定であり、２つの相容れない性質は、診断目的のためのそれらの活用への障害が存在するように思われた：プリン塩基の連続した鎖は通常標的配列と三本鎖を形成することを要求するため、特定の配列が特異的であるためにある程度の長さを有さなければならないので、ある核酸配列内に属または種に特異的な標的を見つける機会は極めて小さい。したがって、長い場合でさえ、統計学的に独特のプリン配列が存在し、いかなる相補的な三本鎖を形成するプローブのハイブリダイゼーション特性（塩基対あたり高い結合能）も、６または７塩基長を下回る全部の部分配列に非特異的に結合することを引き起こし、したがってそれらの特異性を失うであろう。
【０００５】
国際公開第９２／２０７０２号パンフレットにおいては、ある種のペプチド核酸が二本鎖ＤＮＡ中に鎖侵入し、ＤＮＡと高い親和性で結合可能であることを開示する。国際公開第９２／２０７０３号パンフレットにおいては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）の調製および診断プローブとしての使用を開示する。国際公開第９５／０１３７０号パンフレットにおいては、２つの同一のホモピリミジン配列分子が、２つのＰＮＡ分子および１つの一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含む安定な三本鎖構造を形成すること開示する。これらの構造は治療法的および診断的使用の両方の目的について開示されている。
【０００６】
国際公開第９６／０２５５８号パンフレットにおいては、同一の配列であるが、反平行方向であり架橋部分により連結した２つのセグメントを含む分子を開示する。かかる分子は、各々１つのセグメントの配列を有する独立のＰＮＡから形成された複合体に比べ、小さいが顕著なＴｍ値の増加を呈することを開示する。これは、共有結合的に結合したＰＮＡ鎖の高い局所的な集中に帰する。開示されたセグメントは、一般的に６塩基長以上である。この開示された結合ペプチド核酸は十分な配列特異性のために、相補的な、分析対象物核酸中のプリンのストレッチに対応する、相対的に大きいピリミジンのストレッチを必要とするという本質の問題をもっており、それは、非常に高レベルの非特異的結合を導くであろう。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、鎖の一方は、短い三本鎖を形成するプローブ分子であり、三本鎖形成により結合した３つの独立した鎖を含む配列特異的な複合体を提供することを目的とある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕 核酸Ａ、第１核酸Ａ結合分子Ｂ、および該分子Ｂの配列と異なる塩基配列を有する少なくとも１つのさらなる核酸Ａ結合分子Ｃ間の三本鎖結合複合体を形成する工程、ならびに前記核酸の存在または量の尺度としての前記結合複合体の存在または量を決定する工程を含む、核酸Ａを決定する方法であって、該三本鎖複合体は、該核酸Ａ、該分子Ｂおよび１以上の該分子Ｃ間の三本鎖複合体が該核酸Ａの１分子と、該分子Ｂの２分子または該分子Ｃの２つの同一分子とにより形成された三本鎖複合体よりも温度安定な条件下で形成されることを特徴とする決定方法、
〔２〕 該三本鎖複合体が、該核酸Ａ、該分子Ｂおよび該分子Ｃのそれぞれが少なくとも１であるが１１未満、好ましくは１より大きく８未満の塩基で寄与する三重らせん結合領域を含むことを特徴とする、前記〔１〕記載の決定方法、
〔３〕 該複合体が三本鎖領域に結合している単一の分子Ｃを含むことを特徴とする、前記〔１〕記載の決定方法、
〔４〕 該分子Ｂが３塩基を超えるが１１塩基未満、好ましくは４塩基を超えるが８塩基未満の、三重らせん結合領域における結合に関与する塩基配列を有することを特徴とする、前記〔３〕記載の決定方法、
〔５〕 該分子Ｂの三重らせん結合配列が該分子Ｃにより結合した配列よりも長さが短いことを特徴とする、前記〔１〕〜〔４〕いずれか記載の決定方法、
〔６〕 該分子Ｃが少なくとも６塩基長を有することを特徴とする、前記〔１〕〜〔５〕いずれか記載の決定方法、
〔７〕 形成された複合体が三本鎖領域に結合する２つの異なる分子Ｃを含むことを特徴とする、前記〔１〕記載の決定方法、
〔８〕 該分子Ｃが該核酸Ａに隣接して結合することを特徴とする、前記〔７〕記載の決定方法、
〔９〕 分子Ｂおよび／またはＣが化学的に修飾されて、２つの分子Ｂまたは２つの同一の分子Ｃと１つの分子Ａとの三重らせん形成を脱安定化させることを特徴とする、前記〔１〕〜〔８〕いずれか記載の決定方法、
〔１０〕 分子Ｂの結合領域が非対称な塩基配列を有することを特徴とする、前記〔１〕〜〔９〕いずれか記載の決定方法、
〔１１〕 分子Ｂの結合領域が対称な塩基配列を有することを特徴とする、前記〔１〕〜〔９〕いずれか記載の決定方法、
〔１２〕 分子Ｂがフーグスティーン型塩基対形成を介して核酸に結合し、分子Ｃがワトソン−クリック型塩基対形成を介して結合していることを特徴とする、前記〔１〕〜〔１１〕いずれか記載の決定方法、
〔１３〕 分子Ｂおよび／またはＣが標識され、結合複合体中の前記１つまたは複数の標識の存在を核酸の決定のために使用することを特徴とする、前記〔１〕〜〔１２〕いずれか記載の決定方法、
〔１４〕 分子ＢおよびＣの１つまたは全部が核酸類似体であることを特徴とする、前記〔１〕〜〔１３〕いずれか記載の決定方法、
〔１５〕 核酸類似体がＰＮＡであることを特徴とする、前記〔１４〕記載の決定方法、
〔１６〕 該核酸Ａに結合する該分子Ｂの領域における塩基がピリミジンからなることを特徴とする、前記〔１〕〜〔１５〕いずれか記載の決定方法、
〔１７〕 該核酸が、該核酸に対する分子Ｂの結合領域内に位置する塩基配列における相違により決定されないように、他の核酸から区別されることを特徴とする、前記〔１〕〜〔１２〕いずれか記載の決定方法、
〔１８〕 該核酸が、該核酸に対する分子Ｃの結合領域内であるが、該核酸に対する分子Ｂの結合領域内ではない位置に存在する塩基配列における相違により決定されないように、他の核酸から区別されることを特徴とする、前記〔１〕〜〔１７〕いずれか記載の決定方法、
〔１９〕 分子Ｃが該核酸に対する分子Ｂの結合領域に完全に及ぶことを特徴とする、前記〔１〕〜〔１８〕いずれか記載の決定方法、
〔２０〕 分子Ｂの結合領域内の該核酸の排他的な部分にそれぞれ結合する、少なくとも２つの分子Ｃが使用されることを特徴とする、前記〔１〕〜〔１９〕いずれか記載の決定方法、
〔２１〕 三本鎖結合複合体を形成させるための反応混合物が、該Ａへの結合において少なくとも１つの分子Ｃと競合することができるが、三本鎖複合体において関与することができない競合プローブ分子Ｄをさらに含むことを特徴とする、前記〔１〕〜〔２０〕いずれか記載の決定方法、
〔２２〕 核酸Ａ、第１核酸結合分子Ｂ、および該分子Ｂと比べて異なる塩基配列を有する少なくとも１つのさらなる核酸結合分子Ｃ間の三本鎖結合複合体であって、該核酸Ａの１分子と該分子Ｂの２分子または該分子Ｃの２つの同一分子とから形成された三本鎖複合体よりも温度安定であることを特徴とする複合体、
〔２３〕 分子Ｂが１つまたは複数の分子Ｃの結合領域全体よりも長さが短く、分子Ｂが３塩基を超えるが１１塩基未満の塩基配列を有し、かつ分子Ｂの配列が非対称であることを特徴とする、前記〔２２〕記載の複合体、
〔２４〕 分子Ｂが１つまたは複数の分子Ｃの結合領域全体よりも長さが短く、分子Ｂが３塩基を超えるが１１塩基未満の塩基配列を有し、かつ分子Ｂの配列が対称であることを特徴とする、前記〔２２〕記載の複合体、
〔２５〕 前記核酸Ａ、第１核酸結合分子Ｂ、および少なくとも１つのさらなる核酸結合分子Ｃ間で、前記〔２２〕〜〔２４〕いずれか記載の三本鎖結合複合体を形成する方法、ならびに
〔２６〕 核酸を特異的に決定するためのプローブとして、４〜１０塩基、好ましくは５〜８塩基の長さを有する核酸結合分子を使用する方法、
に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の主題は、核酸Ａ、第１核酸Ａ結合分子Ｂ、および該分子Ｂの配列と異なる塩基配列を有する少なくとも１つのさらなる核酸Ａ結合分子Ｃ間の三本鎖結合複合体を形成する工程、ならびに前記核酸の存在または量の尺度としての前記結合複合体の存在または量を決定する工程を含む、核酸Ａを決定する方法であって、該三本鎖複合体は、該核酸Ａ、該分子Ｂおよび１以上の該分子Ｃ間の三本鎖複合体が該核酸Ａの１分子と、該分子Ｂの２分子または該分子Ｃの２つの同一分子とにより形成された三本鎖複合体よりも温度安定な条件下で形成されることを特徴とする決定方法である。
【００１０】
本発明のさらなる主題は、より長いワトソン−クリック型（ＷＣ）結合オリゴマーにより、短いフーグスティーン（Ｈ）結合オリゴマーを安定化させることによって、該目的を達成する知見である。これは、特異的な標的配列に長いホモプリン域を要求することをバイパスすると同時に、特異性を失うことなく、短いフーグスティーン結合プローブの高い識別力を開発することを可能にする。
【００１１】
本発明のさらなる主題は、核酸Ａ、第１核酸結合分子Ｂ、および該分子Ｂと比べて異なる塩基配列を有する少なくとも１つのさらなる核酸結合分子Ｃ間の三本鎖結合複合体であって、該核酸Ａの１分子と該分子Ｂの２分子または該分子Ｃの２つの同一分子とから形成された三本鎖複合体よりも温度安定であることを特徴とする複合体である。
【００１２】
本発明のさらなる主題は、核酸を特異的に決定するためのプローブとして、４〜１０塩基、好ましくは５〜８塩基の長さを有する核酸結合分子を使用する方法である。
【００１３】
本発明のさらなる主題は、それ自身で核酸（Ａ）との安定なハイブリッドを形成しないであろう条件下での、１種以上の二本鎖形成、混合配列オリゴマー（Ｃ）の制御された結合を通した、短い三本鎖形成オリゴマー（Ｂ）の制御された結合である。
【００１４】
本発明のさらなる主題は、従属請求項に開示される。
【００１５】
決定対象の核酸Ａは、本発明において、分析対象物核酸またはそれから派生した核酸であると理解される。分析対象物核酸としては、例えば、植物、動物、ヒト、ウイルス、細菌、または非天然由来の起源などのいかなる起源の核酸をも含む。これらは、溶液、懸濁液の状態で存在してもよく、固体状担体に固定、または細胞を含む培地、細胞塗沫標本、固定した細胞、組織、または固定した生物体に含んでいてもよい。それらから得られた核酸は分析対象物核酸から調製された核酸またはその一部であり、例えば、前記記載の核酸のコピーまたはその一部である。これらのコピーとしては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応などのいかなる複製および／または転写／逆転写反応をも含む増幅により元の分析対象物核酸から生じた核酸を含む。
【００１６】
分析対象物をハイブリダイゼーションしやすくさせるために、しばしば決定対象の核酸を含む試料を前処理する。かかる前処理は、細胞溶解、ｐＨをアルカリ性域に変えることによる二本鎖核酸の変性、極端な温度変化の繰り返し（凍結／融解）、生理学的生育条件の変化（浸透圧）、界面活性剤、カオトロピック塩もしくは酵素（例えば、プロテアーゼ、リパーゼなど）の使用を含む。利用しやすい形の核酸を放出するために単独でまたは組み合わせてのいずれで、これらの工程を使用してもよい。ある例では、蛋白質、細胞、細胞断片だけでなく、さらに検出対象でない核酸などの試料の他の構成物から分析対象物核酸を分離することが有利であろう。さらに分析対象物核酸を一本鎖にし、二次構造を解離させるために該分析対象物核酸を変性させることが有利である。
【００１７】
本発明の核酸結合分子は、ＡおよびＴまたはＵの塩基間ならびにＣおよびＧの塩基間などの二本鎖核酸におけるヌクレオ塩基の天然の認識から一般的に公知の水素結合を介して、核酸Ａのヌクレオ塩基の配列を認識する分子である。該認識は、例えば、天然のヌクレオ塩基の間だけでなく、さらに天然の塩基と非天然の塩基との間、および非天然の塩基と非天然の塩基との間に起こりうる。非天然塩基は、例えば、国際公開第９６／０２５５８号パンフレットに概説された塩基、特にイソピリミジンヘテロ環塩基である。これらの水素結合部分は連続様式で、結合が生じうるように骨格に付着される。好適な骨格は、天然の糖リン酸骨格（ＤＮＡおよびＲＮＡの核酸など）およびあらゆる非天然の骨格（ペプチド核酸（ＰＮＡ））である。
【００１８】
好ましくは、核酸結合分子は天然の糖リン酸骨格と異なる多量体化した骨格を有する。かかるプローブ分子の例示は、現在、当該分野において良く知られている。これらのプローブは、繰り返し様式で結合するモノマーのサブユニットに基づく。プローブ分子は、ペプチド結合により他のモノマーのサブユニットに結合するモノマーのサブユニットであることが好ましい。該ペプチド結合は、１級または２級アミンとカルボン酸残基とを連結する結合であると解される。モノマーまたは骨格中の連結している１種以上のモノマー内の結合の他の型が可能であり、例えば、エーテル結合またはアミノ結合などである。かかるプローブ分子の例示は、アザ−窒素原子に結合したリガンドを有するプローブ分子を含む国際公開第９２／２０７０２号パンフレット、国際公開第９４／２５４７７号パンフレットおよび国際公開第９６／２０２１２号パンフレットに記載されている。モノマーの間に混合した異なる結合を有するプローブ分子が欧州特許出願公開０ ６７２ ６７７号明細書に記載されている。「プローブ分子」という用語は、さらに前記非天然の骨格のストレッチおよび天然の糖リン酸骨格の付加的なストレッチを有する分子を含む。かかるキメラは、相補的な核酸に対していくらかの低い親和性を有するが、それでもなお本発明においては有用である。
【００１９】
本発明において「骨格」という用語は、ヘテロ環塩基部分が異なる付着点で連続様式で結合される多量体部分を意味し、ここで、骨格上の塩基部分の付着に使用される原子間の距離が４〜８原子のストレッチ、好ましくは６原子、最も好ましくはペプチド基（ＣＯＮＨ）を含むことにより互いに離れる。
【００２０】
好ましいプローブ分子は、一般式（Ｉ）の化合物である：
【００２１】
【化１】
〔式中、ｎは、少なくとも３以上の整数であり、
ｘは、２〜ｎ−１の整数であり、
Ｌ1 〜Ｌn は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル基、炭素数１〜４のアルカノイル基、天然のヌクレオ塩基、非天然のヌクレオ塩基、芳香環基、ＤＮＡインターカーレーター、ヌクレオ塩基結合基、複素環基、レポーターリガンドおよびキレート基からなる群より選択されたリガンドであり、ここで、少なくとも１つのＬ1 〜Ｌn 、好ましくは少なくとも１つのＬ2 〜Ｌn-1 は、非ヌクレオ塩基電子受容体または供与体基であり、少なくとも２つのＬ1 〜Ｌn は、ヌクレオ塩基結合基または天然もしくは非天然のヌクレオ塩基であり、
Ｃ1 〜Ｃn は、それぞれ、（ＣＲ6 Ｒ7 ）y （ＣＲ6 Ｒ7 、ＣＨＲ6 ＣＨＲ7 またはＣＲ6 Ｒ7 ＣＨ2 が好ましい）であり、ここで、Ｒ6 は水素、Ｒ7 は天然のαアミノ酸の側鎖からなる群より選択されるか、Ｒ6 とＲ7 は、独立に、水素、炭素数１〜６のアルキル基、アリール基、アラルキル基、ヘテロアリール基、ヒドロキシル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、炭素数１〜６のアルキルチオ基、ＮＲ3 Ｒ4 およびＳＲ5 からなる群より選択され、ここで、Ｒ3 とＲ4 は以下のように定義され、Ｒ5 は、水素、炭素数１〜６のアルキル基、ヒドロキシル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、または炭素数１〜６のアルキルチオ置換された炭素数１〜６のアルキル基であるか、Ｒ6 とＲ7 は、一緒になって脂環系もしくは複素環系を形成し；またはＣ1 〜Ｃn は、ＣＯ、ＣＳ、ＣＮＲ3 である；
Ｄ1 〜Ｄn は、それぞれ、（ＣＲ6 Ｒ7 ）z （ＣＲ6 Ｒ7 、ＣＨＲ6 ＣＨＲ7 またはＣＨ2 ＣＲ6 Ｒ7 が好ましい）であり、ここで、Ｒ6 とＲ7 は、前記定義するとおりであり、
ｙおよびｚは、それぞれ、０または１〜１０の整数であり、ｙ＋ｚの合計は少なくとも２であり、好ましくは、２を越えるが１０以下であり、
Ｇ1 〜Ｇn-1 は、それぞれ、−ＮＲ3 ＣＯ−、−ＮＲ3 ＣＳ−、−ＮＲ3 ＳＯ−または−ＮＲ3 ＳＯ2-のいずれの向きでもよく、ここで、Ｒ3 は、以下に定義するとおりであり；
Ａ1 〜Ａn とＢ1 〜Ｂn は、それぞれ、下記：
（ａ）Ａ1 〜Ａn は、式（II／Ａ）、（II／Ｂ）、（II／Ｃ）もしくは（II／Ｄ）の基で、Ｂ1 〜Ｂn は、ＮもしくはＲ3 Ｎ＋である、または
（ｂ）Ａ1 〜Ａn は、式（II／Ｄ）の基で、Ｂ1 〜Ｂn は、ＣＨである；
ように選択され、
【００２３】
【化２】
（式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ3 、ＣＨ2 またはＣ（ＣＨ3 ）2 であり；
Ｙは、単結合、Ｏ、ＳまたはＮＲ4 であり、
ｐおよびｑは、それぞれ、０または１〜５の整数であり（ｐ＋ｑの合計は、５以下であることが好ましい）、
ｒおよびｓは、それぞれ、０または１〜５の整数であり（ｒ＋ｓの合計は、５以下であることが好ましい）、
Ｒ1 およびＲ2 は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ−もしくは炭素数１〜４のアルコキシ−もしくは炭素数１〜４のアルキルチオ−置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基、ヒドロキシル基、炭素数１〜４のアルコキシ基、炭素数１〜４のアルキルチオ基、アミノ基およびハロゲンからなる群より選択され、
Ｒ3 およびＲ4 は、それぞれ独立して、水素、炭素数１〜４のアルキル基、ヒドロキシ−もしくはアルコキシ−もしくはアルキルチオ−置換された炭素数１〜４のアルキル基、ヒドロキシル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、炭素数１〜６のアルキルチオ基およびアミノ基からなる群より選択され、
ＱおよびＩは、独立して、−ＣＯ2 Ｈ、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＳＯ3 Ｈもしくは−ＳＯ2 ＮＲ’Ｒ”または−ＣＯ2 Ｈ、−ＳＯ3 Ｈおよび−ＮＲ’Ｒ''' の活性化誘導体から選択され、
ここで、Ｒ’、Ｒ”およびＲ''' は、独立して、水素、アルキル、アミノ保護基、レポーターリガンド、インターカーレーター、キレート化剤、ペプチド、蛋白質、炭水化物、脂質、ステロイド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオチドジホスフェート、ヌクレオチドトリホスフェート、オリゴリボヌクレオチドとオリゴデオキシリボヌクレオチドの両方を含むオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび可溶性および非可溶性ポリマーならびに核酸結合基からなる群より選択され、そして
ｘ１およびｙ１は、それぞれ、０〜１０の整数である）〕
【００２５】
好ましいプローブは少なくとも１種の一般式（ＩＩＩ）：
【００２６】
【化３】
（式中、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＧおよびＬは、それぞれ前記ＡX 、ＢX 、ＣX 、ＤX 、ＧX およびＬX を適用する）の単量体サブユニットを含む。
【００２８】
アルコキシ基およびアルキルチオ基は好ましくは１〜４個の炭素原子を含む。
【００２９】
融合した芳香環部分としては、例えば、ナフトールなどがある。ヘテロ環部分としては、例えば、ピリジンなどがある。レポーター基は、例えば、フルオレセインなどの蛍光化合物などの検出しうる部分、またはハプテンなどの、このハプテンに対する抗体により認識されうる、他の分子本体により認識されうる部分である。
【００３０】
前記構造においてＱまたはＩは、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドであり、かかる構造がＰＮＡ化合物とオリゴヌクレオチドとまたはオリゴヌクレオシドとの間のキメラ構造であると考えられうる。
【００３１】
結合受容体部分のリンカーＡ1 〜Ａn は、一般的に１〜１０原子間の長さであることが好ましく、２〜６原子であることが最も好ましく、供与体部分のリンカーＡ1 〜Ａn は１〜１０原子の長さであり、２〜８原子であることが最も好ましい。
【００３２】
一般式（Ｉ）に基づくサブグループ（Ｉａ）〜（Ｉｂ）の化合物であり、
（Ｉａ）：Ｂl 〜Ｂn はＮであり、Ａl 〜Ａn は−ＣＯ−（ＣＨ2 ）6 −であり、
（Ｉｂ）：Ｂl 〜Ｂn はＮであり、Ａl 〜Ａn は−ＣＯ−ＮＲ3 （ＣＨ2 ）2 −であり、
（Ｉｃ）：Ｂl 〜Ｂn はＣＨであり、Ａl 〜Ａn は−ＮＲ3 −ＣＯ−（ＣＨ2 ）2 −である、
化合物がより好ましい。
【００３３】
好ましいＲＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡへの結合に影響することおよび三本鎖になる構造を形成することに有用なＰＮＡ含有化合物は、一般式（ＩＶａ）：
【００３４】
【化４】
一般式（ＩＶｂ）：
【００３６】
【化５】
および一般式（ＩＶｃ）：
【００３８】
【化６】
（式中、各々Ｌは、一般式（Ｉ）のＬl 〜Ｌn の定義から独立して選ばれ、各々Ｒ7 は、水素および天然αアミノ酸の側鎖からなる群より独立して選ばれ、ｎは１より大きい整数であり、各々ｋ、ｌおよびｍは、独立して０または１〜５の整数であり、各々ｐは０または１であり、Ｒh およびＲi は、Ｒ' 、Ｒ''およびＲ''' として定義される）で表される化合物である。
【００４０】
標識は、それ自身、固定化可能な又は検出可能であるか、あるいは付加部分により共役することによって固定化／検出することができる部分として、一般的に知られている。標識としては、例えば、蛍光部分（例えば、フルオレセインまたはローダミンなど）、酵素（例えば、ペルオキシダーゼまたはホスファターゼなど）、ハプテンなどの免疫学的に活性な物質（例えば、ジゴキシゲニンなど）あるいは蛋白質結合タグ（例えば、ビオチンなど）などがある。
【００４１】
最も好ましい核酸結合化合物は、一般式（Ｖ）：
【００４２】
【化７】
（式中、Ｌは、Ｌ1 〜Ｌn に対して前記定義されたリガンドであり、
ｋ、ｌおよびｍは、独立に０または１〜５までの整数であり、
ｐは、０または１であり、ならびに
Ｒ7 は、水素および天然のαアミノ酸の側鎖からなる群より選択される）
で表されるモノマーサブユニットの少なくとも１つを含むものである。
【００４４】
これらの化合物は、国際公開第９２／２０７０２号パンフレット、国際公開第９４／２５４７７号パンフレット、国際公開第９６／２０２１２号パンフレット、ＥＰ−０ ６７２ ６７７号明細書およびＥＰ−０ ７００ ９２８号明細書に記載の合成に類似の方法で調製することができる。一般式Ｉの化合物を製造するための好ましい方法は、国際公開第９２／２０７０２号パンフレットによるステップワイズ化学合成であり、一般式（VIa ）〜（VIｃ）の化合物をモノマーとして取り込む：
【００４５】
【化８】
（式中、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、それぞれ、その中のいかなるアミノ基もアミノ保護基により保護されてもよい条件で、式（Ｉ）のＡ1 〜Ａn 、Ｂ1 〜Ｂn 、Ｃ1 〜Ｃn およびＤ1 〜Ｄn の定義から選択され；
Ｅは、ＣＯＯＨ、ＣＳＯＨ、ＳＯＯＨ、ＳＯ2 ＯＨまたはそれらの活性化誘導体であり；
Ｆは、ＮＨＲ3 またはＮＰｇａＲ3 であり、ここで、Ｒ3 は前記定義された通りであり、Ｐｇａはアミノ保護基であり、Ｌは、前記定義された通りであるか、その保護誘導体である）
【００４７】
好ましいモノマーは、一般式（ＶＩＩ）：
【００４８】
【化９】
（式中、Ｘは、カルボン酸保護基または水素であり、Ｒ7 は、独立に水素および天然のαアミノ酸の側鎖またはアミノ保護および／またはそれらの酸末端活性化誘導体からなる群より選択される）を有するアミノ酸である。
【００５０】
該核酸分子ＢおよびＣの配列は、好ましくは、それらの少なくとも１種が、分析対象物核酸に対して選択的であるように選ばれる。好ましくは、分子Ｂは非選択的であり、分子Ｃは選択的であり、分子Ｂにより結合した配列は、分子Ｃにより結合した配列よりも短いことが推論される。
【００５１】
さらに、相補体が試料中に存在する場合、複合体ＡＢＣは、核酸Ａとその相補体Ａ’との二重らせん（例えば、天然のｄｓＤＮＡにおける）よりも安定であることが好ましい。
【００５２】
核酸結合分子ＢおよびＣの分子構造（配列要求性から離れて）は、一般的に同一でも異なってもよい。しかしながら、分子ＢおよびＣの少なくとも１種が、非天然骨格を含有する核酸結合化合物であることが大変好ましい。最も好ましくは、分子ＢおよびＣの両方が非天然骨格を有する核酸結合化合物である。以下、分子ＢおよびＣをプローブと称する。本発明の複合体の形成の一般的な要求は、分子Ａ、ＢおよびＣが、以下、三本鎖化領域という領域内で三重らせん構造を形成することができることである。したがって、本発明においては、この領域内に結合するプローブは、いかなる糖リン酸骨格をも含まないことが好ましい。
【００５３】
本発明の核心は、少なくとも核酸鎖Ａ、１つの結合分子ＢおよびＢの配列と異なる塩基配列を有する少なくとも１種のさらなる核酸結合分子Ｃを含む複合体を形成することである。
【００５４】
これらの少なくとも３分子は、これらの全ての分子を含む三本鎖化複合体を形成する条件下にインキュベートされる。核酸Ａおよび分子Ｂを含む他のいかなる複合体もが検出できるまたは妨害する程度に形成されないであろう。これは、いくつかの方法で達成可能であり、そのうちのいくつかは、分子Ｃの構築に関する。
【００５５】
第１の態様においては、三本鎖複合体は三本鎖領域に核酸Ａと１つの分子Ｂと１つの分子Ｃを含む。好ましい態様においては、ＡＢＣの三本鎖領域は３塩基を超えて１１塩基未満、好ましくは４塩基を超えて９塩基未満の長さを有する。したがって、分子Ｂはこの領域をカバーする長さを有するはずであるが、分子Ｂは三本鎖構造に関与する能力を阻害しない他の部分が付着しうる。そのような部分としては、たとえば２次プローブ結合のための特異的認識可能配列として使用されるものなど、標識、または三本鎖構造に関与しない核酸結合分子のような、標識、またはさらに別の認識部分などが挙げられる。三重らせん形成に関与するＢの部分はピリミジン以外の塩基を含まないことが好ましい。
【００５６】
実際には、分子Ｃは、ＷＣモードで核酸Ａに結合することによって三本鎖形成に関与する領域Ｃｙを含んでいる。また、分子Ｃは、好ましくは核酸Ａとの二重らせん形成によって、セグメントＣｙの一端または両端に１つ以上のさらに別のセグメント結合核酸Ａを有する。これらのセグメントは１〜２０塩基、より好ましくは２〜８塩基、最も好ましくは２〜４塩基の長さを有することが好ましい。以下、これらのセグメントをＣｘおよびＣｚと呼ぶ。ＣがセグメントＣｘとセグメントＣｚを有する場合、これらのセグメントは同じ長さのものであってもよいし、異なる長さのものであってもよい。したがって、本態様における分子Ｃの結合領域は、三重らせん形成領域と１または２つの二重らせん形成領域を含む。分子Ｃの長さは、当該分野に熟練せる者にとって公知の方法によって選択すべきものである。このことは、分子Ｃの長さは選択的なものであるべきことを意味する。このことは、言うまでもなく、試料に核酸が含まれていて、核酸Ａと類似の配列を有することが前提となる。特殊な場合では、Ｃの長さは６〜９塩基を超える必要はないが、一般に、類似配列を十分に識別するためには、Ｃの結合配列は１０〜４０塩基対合単位の範囲に入るべきである。本発明の好ましい態様における分子Ｃは、核酸Ａと決定対象でない核酸を識別する塩基情報を含ませるために使用されるため、分子Ｃの核酸Ａ結合全長としては少なくとも１２塩基以上が好ましい。
【００５７】
本発明の本態様を図１に例示する。ハイブリダイゼーションの条件により、短いＰＮＡオリゴ（Ｂ）は別のオリゴによる安定化を受けた場合に限り、フーグスティーン塩基対合を介して分析対象（Ａ）に結合し、より長いＰＮＡオリゴ（Ｃ）は、ワトソン−クリック型塩基対合によって分析対象（Ａ）に結合する（１ａを参照のこと）。同様のハイブリダイゼーション条件下では、２つの短いＰＮＡオリゴ（Ｂ）が分析対象（Ａ）とともに安定な三重らせん構造を形成することができず（１ｂ参照）、Ｂ１個だけでＡとともに安定な二重らせんを形成することもない。
【００５８】
Ａに対するＣの選択性はいかなるＣのセグメント内にも存在しうる。ところが、本発明によれば、またプリンのストレッチに基づいて識別できる核酸は非常に少数しかないという事実に鑑みると、セグメントＣｘおよびＣｚのうちの少なくとも１つにおいて決定対象の核酸配列に対して特異的であるように分子C を設計してもよい。選択性を達成するために、これらのセグメントは、セグメントＣｘまたはＣｚが核酸Ａと決定対象でない核酸の間の配列差を含むような分子Ｂとの結合のためのプリンのストレッチから、伸長している（すなわち決定対象でない核酸とのミスマッチを作り出している）。
【００５９】
本態様を図２に例示した。分析対象（Ａ）と短いフーグスティーン結合ＰＮＡオリゴ（Ｂ）とワトソン−クリック型結合ＰＮＡオリゴの間で形成された三重らせん構造（２ａを参照のこと）は、ミスマッチが導入されると、やはり（Ｂ）によって区画される三重らせん領域の外側で脱安定化され、三重らせん構造（２ｂ参照）は形成されない。
【００６０】
第２の態様においては、分子Ｃと決定対象でない核酸の間のミスマッチは、セグメントＣｙを含む他のセグメント内に存在していてもよい。これも、Ｃと決定対象でない核酸および分子Ｂとの三本鎖複合体の形成が脱安定化される。
【００６１】
本発明の第２の主な態様においては、三本鎖領域は、三本鎖複合体が分析対象核酸Ａと分子Ｂと２個の独立した分子Ｃ（以下Ｃ１およびＣ２という）を含むような別の分子Ｃをさらに含んでいる。これらの分子Ｃはそれぞれが５〜４０塩基の長さを有してもよい。この複合体を構築するためには、分子Ｃのそれぞれが分析対象核酸（Ａ）の結合領域と１個の分子Ｂとともに三本鎖構造を形成しうるセグメントＣｙ（それぞれＣｙ１およびＣｙ２）から成る。各セグメント（Ｃｙ）の配列は、分析対象核酸への排除的結合が行われるように選択される。ここで「排除的」とは、Ａ上のセグメントＣｙ１およびＣｙ２の結合領域が重複しないことをいう。これらの結合領域は、結合したときにＣ１とＣ２がセグメントＣｙ１およびＣｙ２の末端の間に非常に小さなギャップ、好ましくは２〜１ヌクレオチドの長さのギャップ、最も好ましくはニック（ヌクレオチドなし）を形成するように、互いに隣接していることが好ましい。Ｃ１とＣ２は独立的に、分析対象核酸に対するプローブＣ１およびＣ２の二本鎖結合のために設計されたセグメントＣｘまたはＣｚを含むことができる。これらのセグメントＣｘおよびＣｚは、互いに逆方向を向くこれらのセグメントの末端部でセグメントＣｙ１およびＣｙ２と結合することが好ましい。Ｃ１とＣ２は互いに対向するＣｙ１およびＣｙ２の末端部にセグメントを含まないことが好ましい。
【００６２】
本態様を示した図面を図３に示した。ハイブリダイゼーションの条件により、短いＰＮＡオリゴ（Ｂ）は、ワトソン−クリック型塩基対合によって分析対象（Ａ）に結合した２個の隣接結合ＰＮＡオリゴ（Ｃ１およびＣ２）によって安定化されたときに、フーグスティーン塩基対合を介して分析対象（Ａ）に結合しうる（３ａを参照のこと）。またＢによって区画される三重らせん領域の外側でＣ１またはＣ２にミスマッチが導入されると、三重らせん構造全体（３ｂを参照のこと）が脱安定化され、もはや形成されなくなる。２つの分子Ｃ１とＣ２を用いる態様においては、方法の特異性が実質的に強化される。完全な三本鎖複合体の形成が分析対象核酸と対象でない核酸の識別因子であるという事実ゆえに、本発明は、欠失または挿入によって測定することができない核酸とは異なる分析対象核酸の測定に非常に適している。そのような例を図４に示した。ワトソン−クリック型塩基対合によってハイブリダイズしている２個のＰＮＡオリゴ（Ｃ１およびＣ２）が分析対象（Ａ）上で互いに隣接して結合すると、フーグスティーン塩基対合によって（Ａ）にハイブリダイズする短いＰＮＡオリゴ（Ｂ）の結合を促進する共同作用を示し、三重らせん構造ができる（４ａを参照のこと）。１個以上の塩基が２個のワトソン−クリック型結合ＰＮＡオリゴのターゲット部位の間で（Ａ）に導入されると、短いＰＮＡオリゴ（Ｂ）を安定化させることができなくなり、したがってオリゴ（Ｂ）は分析対象（Ａ）に結合しなくなる。
【００６３】
２つの独立したプローブＣ１およびＣ２を用いる態様においては、Ｂの三本鎖結合領域が分子Ｃより小さいものでなければならないという厳密な要件は存在しない。その代わり、Ｂの三本鎖結合領域は分子Ｃ１およびＣ２の結合領域の合計長さより小さいものである必要がある。分子Ｃ１およびＣ２のそれぞれの三本鎖結合領域は、一般にＢの三本鎖結合領域より小さい。
【００６４】
たとえば対立遺伝子間や細菌の種や亜種間、さらには特定の株間などで非常によく似た塩基配列の核酸同士を識別するのに非常に有用なさらに別の態様においては、プローブＢおよびＣに加えて、さらにプローブＤも使用する。プローブＤは、２つのプローブＣの一方の代わりに核酸Ａに結合しうるものであって、該プローブＣとは長さおよび/ または結合位置および/ または配列およびまたは/ ヌクレオ塩基の修飾が異なる競合プローブである。
【００６５】
図１０に図示した好ましい態様においては、標的核酸Ａ、プローブ分子Ｂ、２個のプローブ分子Ｃ１およびＣ２、ならびに競合プローブ分子Ｄを含む反応混合物を用意する。この場合、競合プローブは識別可能なプローブ（すなわちプローブＤの結合領域内に、測定対象の核酸の配列と測定対象でない核酸の配列の違いが存在する）であることが好ましい。競合プローブは標的Ａの一部に対して完全に相補的である配列を有するが、１つ以上の遠位ヌクレオチドを欠いていて、ＤとＣ１の間にギャップを生じている。プローブＣ２が測定対象の核酸（Ａ）に対して完全に相補的である配列を有している場合、競合プローブ（Ｄ）ではなくＣ２がＡにハイブリダイズし、三重らせん形成が可能になる。プローブＣ２が標的Ａに関してミスマッチを有している場合、競合プローブ（適当な組成と濃度がある場合）はＣ２の代わりにＡとハイブリダイズし、三重らせん形成を不可能にするギャップができる。
【００６６】
Mycobacterium interjectum 由来の配列に対応する標的Ａを特異的に測定する場合、この標的配列の一部に対して相補的である競合分子Ｄを、プローブＢ、Ｃ１、およびＣ２とともに試料に添加する。M. interjectumに対して完全に相補的であってＤよりも高い親和性を有する分子Ｃ２を用いる場合、この分子（Ｃ１とともに）はＢを含む三重らせん形成を可能にする。完全にはマッチしていない他のＣ２分子を用いると、これらの分子は競合プローブＤとの競合に敗れ、ギャップができて三重らせん形成が不可能になる。このようにして、ミスマッチＣ２プローブの交差ハイブリダイゼーションの結果として起きる「にせの」三重らせん形成が防止された。すなわち、上記競合プローブを使用すると、近縁核酸の識別の可能性がはるかに高くなる。
【００６７】
上記核酸または核酸結合分子のいずれにおいても三本鎖結合領域は、該核酸または分子の領域が核酸または分子の他の２つの鎖と塩基対合したもの、またはそれ自体が核酸または分子の２つの鎖と塩基対合している塩基と塩基対合したものであると定義する。二重らせん形成領域は、別の核酸または分子の１本のらせんの塩基と塩基対合している分子の領域または配列であるものと定義する（たとえば分析対象核酸Ａ上の三本鎖領域に隣接して結合しているセグメントＣｘおよびＣｚ）。この場合にはワトソン−クリック型塩基対合が起き、三本鎖結合においてはワトソン−クリック型塩基対合とフーグスティーン塩基対合の両方が起きていることが好ましい。この二重らせん形成領域は１塩基対という小ささである場合もあれば、１００塩基対という長さになることもある。
【００６８】
本発明の核心は、分子ＢおよびＣが互いに連結しないことである。このことは、両分子の一方が相手の分子の濃度を人工的に局所的に上昇させることによって、相手を三重らせん複合体に組み込ませないという点で重要である。本発明の背景として、１個または２個の分子Ｃが結合しただけで三重らせんモードにおける分子Ｂの結合が可能になるということがある。しかし、ＡとＢとＣの間の三本鎖複合体の形成は、２個の分子Ｂまたは２個の同一の分子Ｃが１個の分子Ａとともに形成した三本鎖複合体よりも熱安定性が高い場合に限って起きるものである。
【００６９】
正しい三本鎖複合体（ＡとＢとＣから形成されたもの、以下ＡＢＣという）の熱安定性を向上させる手段としては少なくとも３つある。第２の分子Ｂに有利なかたちでの分子Ｃの三本鎖領域への組み込みは、分子Ｃの核酸Ａ結合領域がＢの核酸Ａ結合領域よりも長いために、容易にこれを達成することができる。したがって、Ｃの長さ（および場合によってはＢの長さも）を変えて、最適なＡＢＣ三重らせん形成を行うことができる。
【００７０】
別の態様においては、分子Ｂおよび/ またはＣが少なくとも１つの位置において化学的に修飾されていて、２個の分子Ｂと１個の分子Ａによる三重らせん形成（図９参照）および２個の同じ分子Ｃと１個の分子Ａによる三重らせん形成が脱安定化されている。上記修飾はたとえばカルボキシル基やアミノ基のような荷電基や、アシル基やベンゾイル基のような有機化学基などの化学基が、分子Ｂおよび/ またはＣの原子と結合したものである。これらの基の配置としては、分析対象の核酸に結合したときに、２個の同一分子（ＢまたはＣ）の化学基が近接状態となって三重らせん複合体全体の脱安定化を引き起こすように、プローブの配列が選ばれる場合が好ましい。上記化学基のサイズと性質を利用すれば、結合特性を細かく調節することができるが、正しい三本鎖複合体（ＡとＢとＣを含む）の形成に影響が及ばないようなやり方で選ぶべきである。本発明の第３の態様においては、好ましい結合モードでＡＢ2 およびＡＣ2 における三本鎖結合領域が非常に小さくなるような非対称の塩基配列を、三本鎖結合領域が有する。もちろん、三本鎖複合体における好ましい結合モードは、選ばれた分子の化学構造によって決まる。たとえば、ペプチド核酸の場合、好ましい三本鎖結合モードは互いに逆平行的、すなわち、該２個の分子のアミノ末端の一方は分析対象核酸の３’末端側に向き、他方は分析対象核酸の５’末端側に向いて、互いに逆方向を向いている場合である。したがって、分析対象核酸Ａの非対称結合領域（非対称塩基配列）を選ぶとともに、互いに逆平行モードで結合するような逆方向になるようにＣとＢを合成することが好ましい。
【００７１】
ペプチド核酸オリゴに関しては、核酸による三重らせん形成は、２個の分子が同じ方向を向いている場合も可能である。これらの複合体は２個のＰＮＡ分子が逆方向に結合している場合よりも安定性が低いが、２個の分子Ｂまたは２個の同一の分子Ｃが分析対象核酸Ａとともに三本鎖を形成して、正しい複合体ＡＢＣの形成を阻害する可能性がある。ＡＢ2 とＡＣ2 の両者の脱安定化については上記のとおりである。また、ＡＣ2 の形成は、たとえば分子Ｃではなく分子Ｂ中にシュードイソシトシンのような修飾塩基を含ませて、アルカリ性条件下で結合反応を行うことによって、これを防止することができる。アルカリ性条件下ではシトシンはプロトン化されないため、フーグスティーン結合には関与できないのに対して、シュードイソシトシンは反応溶液のｐＨに依存しない。シュードイソシトシンおよびその他の修飾塩基が国際公開第９６/ ０２５５８号パンフレットに開示されている。
【００７２】
測定対象の核酸（Ａ）を含む試料を、プローブ分子ＢおよびＣと混合して、これらのプローブ分子と測定対象の核酸の間に複合体ＡＢＣを形成させる。この複合体は塩基介在水素結合によってできる。核酸へのプローブ分子の結合は、当該分野に熟練せる者にとって公知の三重らせん形成条件に従って起きる。ペプチド核酸の場合の該条件は、たとえば国際公開第９５/ ０１３７０号パンフレットやウィットゥングら（Wittung, P. et al.）〔Biochemistry 36(26):7973-7979 (1997)〕に詳細に記載されているが、これらの文献の開示内容は引例により本願に含まれるものとする。多くの場合、試料中の核酸の量は未知または不明であるため、試料中の核酸Ａの最大予想量を超えるように各プローブ分子の量を選択することが好ましいが、低レベルのバックグランドシグナルを維持するためには、予想される核酸の量と同程度になるようにプローブ分子の量を選ぶのがよい。
【００７３】
国際公開第９５/ １５９７１号パンフレットに開示されているように、核酸の存在を判定する方法にはいくつかの種類がある。本発明においては、少なくとも１個のプローブ分子が標識されることが好ましい。分子Ｂは標識を付着されたものであることが最も好ましい。核酸Ａまたは単数または複数の分子Ｃのいずれかが固定可能な標識を有するか、すでに固定されていることがさらに好ましい。決定対象の核酸とプローブ分子を含む複合体内では、少なくとも１つのリポーター部分および/ または少なくとも１つの固定可能部分が存在するということが基本原理である。
【００７４】
本発明の方法の具体的態様の実施例を図５に示した。分析対象の核酸（長鎖）を、一方がたとえば５’- リン酸末端にビオチン部分を有することによって固定的に標識されている１対のプライマーと接触させる。ＰＣＲによる増殖の後、ビオチン化プライマーを含む鎖が固定的に標識されている。本発明の方法に従う検出においては、これらの鎖を分析対象核酸Ａとして使用する。次いで、試料を、ワトソン−クリック型塩基対合によって互いに隣接して標識鎖に結合しうるように設計した２個のプローブ分子Ｃと混合する。さらに、試料を、分子Ｃの全体結合配列より短く、フーグスティーン塩基対合により上記概要を示したように三本鎖領域を形成しうるプローブ分子Ｂと混合する。この分子Ｂは検出可能な標識を含んでいる。図５の左側の矢印は、ＰＣＲで生じた単位複製配列（amplicon）が実際に決定対象の核酸である場合を示している。そこで、プローブ分子ＢおよびＣは正しい三本鎖複合体を形成することができる。この複合体は、ストレプトアビジン被覆固相支持体上で固定化させ、過剰なプローブ分子と標識を洗浄により除去し、該固相支持体上の検出可能標識の存在または量を検出した後で、これを決定することができる。もちろん、検出方法は使用する標識によって決まり、たとえば電気化学蛍光法により標識したプローブの場合には、電気化学蛍光を発生させて、これを検出する。図５の右矢印の下に示したように、検出対象外の核酸単位複製配列（分子Ｃへの隣接的結合のための正しい二本鎖結合領域を含まない）は検出されない。このことは、両方のプローブ分子Ｃ１およびＣ２が偶然に核酸Ａに結合できる確率が低い場合でも、正確に相互隣接的に結合しない限り検出されないことを示している。この場合、プローブ分子Ｂは熱安定複合体ＡＢＣ１Ｃ２には関与できないため、分析対象Ａは検出可能的には標識されず、固相に固定化されたとしても、測定されることはない。
【００７５】
本発明者らは、ワトソン−クリック型結合分子（Ｃ）の長さを増大させることによって、所望の三本鎖構造であるＡＢＣの全体的安定性を増大させることができることを示した。プローブＢとＣはどちらも、三本鎖形成のための標的として機能する、短い三本鎖領域に対して相補的な塩基の配列（たとえばホモプリン域（tract ））を有する。このため、プローブＢの２個の分子またはＣの２個の同一分子は理論上は標的配列内で競合的三本鎖構造を形成する可能性があるが、修飾塩基および/ または骨格を使用するとともに、ハイブリダイゼーション条件をコントロールすることによって、正しい三本鎖構造ＡＢＣを確実に形成させることができる。
【００７６】
本発明者らはまた、それぞれが三本鎖領域の一部をカバーする２個の隣接結合しているワトソン−クリック型対合オリゴ（Ｃ）が、小型オリゴＢを含む三本鎖形成が起きるのに十分な程度にフーグスティーン結合を安定化しうることも明らかにした。このオリゴは一度結合すると、三本鎖をさらに安定化させるが、特定のフーグスティーンオリゴが結合したままでいるかどうかは、主に単数または複数のワトソン−クリック型オリゴのオフ率（off-rate）によって決まる。したがって、本発明者らの研究の結果から、三本鎖形成は限定的ステップであるところのワトソン−クリック型結合によって開始されること、および融解はいうまでもなくフーグスティーン結合の瞬間的解離につながるワトソン−クリック型塩基対合の解離によって開始されることがわかる。
【００７７】
これらの知見は、いくつかの意味合いを持つ。まず、実際に三本鎖構造の結合と安定化に関与する認識部位の塩基数は、三本鎖領域そのものの中にある塩基数には限定されないため、隣接位置におけるミスマッチ区別も可能になる。次に、様々な測定条件下で熱安定性をコントロールするために適用できるパラメーター群とともに三本鎖構造の熱安定性を調節することができる範囲が広がる。第３に、２個のワトソン−クリック型対合プローブＣの２個のハーフ標的部位への協同的結合を利用して、三本鎖構造のミスマッチ識別能力をさらに強化することができる。第４に、所望の三本鎖構造の形成を、２個のワトソン−クリック型対合プローブＣが実際に標的核酸らせん上で互いに直接隣接するように結合していることを確認する目安とすることができる。最後に、短い標識フーグスティーン結合プローブが関与する三本鎖形成は、正しい標的配列が同定されたことを二重に確認する目安とすることができる。これは、三本鎖形成の第２のステップ（フーグスティーン結合）は第１のステップ（ワトソン−クリック型結合）に決定的に依存しているためである。上記スキームにおいては、標識プローブは、単数または複数の第１のプローブ（Ｃ）がその標的配列に対して正しくハイブリダイズされている場合を除き、どの核酸にも結合しない。
【００７８】
三重らせんはワトソン−クリック型鎖のみの長さを増大させることによって安定化できるという知見は新規かつ予想外のものである。ハイブリダイゼーション条件をモニターし、短いプローブが長いワトソン−クリック型結合プローブによって安定化される場合のみ、フーグスティーン結合によって結合可能となるようにすることができる。
【００７９】
三本鎖構造形成のための完全な標的部位における、三本鎖モチーフに隣接する混合配列を含ませるというオプションを選べば、フーグスティーン鎖によって区画される実際の三重らせん領域の外側の塩基配列に三重らせん形成を依存させることによって、全体安定性を調節するさらに別の手段が提供される。
【００８０】
協同的に結合したワトソン−クリック型プローブ（分離プローブ）を用いてフーグスティーン鎖を安定化させることによって、三重らせん領域そのものからさらに遠い位置にあるヌクレオ塩基が三重らせん構造全体の安定性に影響を及ぼすことができる。また、協同的に結合したワトソン−クリック型オリゴの使用により、複合体全体の特異性も強化される。これは、たとえば分離プローブはハイブリダイゼーションのための標的領域においてより低縮重に耐えるので、単一塩基の突然変異に対する２個の独立したワトソン−クリック型プローブは同様の長さの単一プローブよりも識別力が高いためである。
【００８１】
ＰＮＡを形成する短い三重らせんはワトソン−クリック型結合ＰＮＡによる安定化を必要とするということを利用すれば、２個の独立プローブ（split probes）の間にギャップがすでに存在している場合やギャップを導入した場合、それらのプローブは三重らせんを十分には安定化させないことから、それらのプローブが実際に標的分子上で相互隣接的にハイブリダイズされることを確認することができる。
【００８２】
本発明はユニバーサルプローブＢを利用する可能性を提供する。Ｂは比較的短いため、選択的なＣは、異なる分析対象の測定に使用可能なように連続的にこれを選択することができるため、異なる測定においてプローブ合成の必要性が低くなる。また、同じ標識オリゴを用いて、異なる標的核酸を同時に検出することができる。
【００８３】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明する。
【００８４】
ＰＮＡオリゴおよび単量体を、国際公開第９６／０２５５８号パンフレットにしたがって合成し、ＡＢＩ４３３シンセサイザーで自動化合成（コッホ，Ｔ．ら、（１９９７）、Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．４９：８０−８８）に記載されたように合成した。全ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、一本鎖および直鎖状である。
【００８５】
ＮＨ2 はＰＮＡのＣＯＮＨ2 末端（化学合成の間、固相に付着した末端）を示し、ＨはＰＮＡのアミノ末端を意味する。
【００８６】
実施例１ 決定対象の核酸ならびに分子ＢおよびＣ由来の複合体の形成
ハイブリダイゼーションの適切な条件を与えたとき、他のより長いＰＮＡオリゴのワトソン−クリック型塩基対合による分析対象物への結合により安定化した場合のみ、短いＰＮＡオリゴ（Ｂ）はフーグスティーン塩基対合を介して、分析対象物（Ａ）に結合する（図１ａに描く）。同様のハイブリダイゼーション条件下、短いＰＮＡオリゴ（Ｂ）単独では、分析対象物（Ａ）と安定な三本鎖構造を形成することができない（図１ｂに描く）。これを実験的に示し、結果を図６に示した。
【００８７】
使用した分子は下記のものである：
Ａ： ＤＮＡ １２マー ５’−ＴＣＣＡＧＡＡＧＡＴＡＣ−３’（配列番号：１）
Ｂ： ＰＮＡ ６マー Ｈ−ＴＣＴＴＣＴ−ＮＨ2
Ｃ： ＰＮＡ １２マー Ｈ−ＧＴＡＴＣＴＴＣＴＧＧＡ−ＮＨ2
【００８８】
三本鎖形成の条件は下記のとおりである：１ｐｍｏｌ放射性標識ＤＮＡオリゴ（Ａ）をＰＮＡオリゴ（下記の表に記載の量）と全容量８μｌの緩衝液（組成：１００ｍＭ ＮａＣｌ；０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；１０ｍＭ ＮａＨ2 ＰＯ4 ，ｐＨ5 ）中で混合した。反応は、２分間、９５℃で、熱変性し、２時間インキュベートした。産物を１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ついでオートラジオグラフィーにより解析した。
【００８９】
数字１）〜９）は、図６に示したオートラジオグラムのレーンをいう。
図６ａ）レーン：
１）Ａ（１ｐｍｏｌ）
２）Ａ（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（１ｐｍｏｌ）
３）Ａ（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）
４）Ａ（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（４ｐｍｏｌ）
５）Ａ（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（１０ｐｍｏｌ）
６）Ａ（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）＋Ｃ（１ｐｍｏｌ）
７）Ａ（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）＋Ｃ（２ｐｍｏｌ）
８）Ａ（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）＋Ｃ（４ｐｍｏｌ）
９）Ａ（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）＋Ｃ（１０ｐｍｏｌ）
【００９０】
図６ｂ）レーン：
１）Ａ（１ｐｍｏｌ）
２）Ａ（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ（１ｐｍｏｌ）
３）Ａ（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ（２ｐｍｏｌ）
４）Ａ（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ（４ｐｍｏｌ）
５）Ａ（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ（１０ｐｍｏｌ）
６）Ａ（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ（２ｐｍｏｌ）＋Ｂ（１ｐｍｏｌ）
７）Ａ（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ（２ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）
８）Ａ（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ（２ｐｍｏｌ）＋Ｂ（４ｐｍｏｌ）
９）Ａ（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ（２ｐｍｏｌ）＋Ｂ（１０ｐｍｏｌ）
【００９１】
ゲルは、１ｐｍｏｌのＡを伴って、Ｂの量を増加するインキュベーションがいかなる検出可能なハイブリッドをも生じず、ＤＮＡオリゴ（Ａ）のみがゲル中に見られることを示す（図６ａ，レーン１〜５）。ＡおよびＢの量を一定に保ち、Ｃの量を増加させて混合した場合、Ａ、ＢおよびＣの間に三本鎖産物を形成し（図６ａ、レーン６および７）、過剰量のＣの添加後、Ａおよび２つの分子Ｃの間に付加的な三本鎖産物を形成する（図６ａ、レーン８および９）。よりかすかなバンドが、レーン６〜９に見られ、それはＡおよびＣの間の少量の二本鎖の形成を示す。図６ｂにおいて、ＤＮＡオリゴ単独がゲルの下部に見られたが、Ｃの量を増加させて添加した後、二本鎖および好ましい産物である三本鎖形成が見られる（レーン２〜５）。ＡおよびＣの量を一定に保ち、Ｂを増加させて添加すると、Ａおよび２つの分子Ｃの間の三本鎖は全く競合外であるが、Ａ、ＢおよびＣが関与する三本鎖の形成を生じる。これらの結果は、これらのハイブリダイゼーションの条件下では、短いＰＮＡオリゴ（Ｂ）がＡとの安定な産物を形成できないが、ＡおよびＣの両方と共に存在する場合には、ＡＢＣ三本鎖の形成に関係し、ＡＣ2 三本鎖の形成も競合外であることを示す。
【００９２】
実施例２ ２つの分子Ｃ１およびＣ２ならびにプローブＢを用いる三重らせん複合体の形成による、１つの塩基の相違を有する核酸間の区別化
本実験は、２つの分断プローブを用いた本発明の好ましいモードを規定する。結果を図７におけるオートラジオグラムとして示す。下記の化合物を実験に用いた（三重らせん形成に関与する配列は下線を付した対称性の場合）：
Ａ１： ＤＮＡ １６マー：５’−ＣＧＴＣＣＡＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧ−３’
（決定対象の核酸）（配列番号：２）
Ａ２： ＤＮＡ １６マー：５’−ＣＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＴＡＣＣＧ−３’
（決定対象でない核酸）（配列番号：３）
Ｂ ： ＰＮＡ ６マー：Ｈ−ＴＣＴＴＣＴ−ＮＨ2
Ｃ１： ＰＮＡ ８マー：Ｈ−ＣＧＧＴＡＴＣＴ−ＮＨ2
Ｃ２： ＰＮＡ ８マー：Ｈ−ＴＣＴＧＧＡＣＧ−ＮＨ2
【００９３】
実験条件は下記のとおりである：１ｐｍｏｌの放射性標識したＤＮＡオリゴ（Ａ１またはＡ２）をＰＮＡオリゴ（下記表に記載の量）と全容量８μｌの緩衝液（組成：１００ｍＭ ＮａＣｌ；０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；１０ｍＭ ＮａＨ2 ＰＯ4 ，ｐＨ5 ）中で混合した。反応は、２分間、９５℃で、熱変性し、２時間インキュベートした。産物を１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ついでオートラジオグラフィーにより解析した。
【００９４】
数字１）〜１０）は、図７に示したオートラジオグラムのレーンをいう。
【００９５】
図７ａ）レーン：
１）Ａ１（１ｐｍｏｌ）
２）Ａ１（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）
３）Ａ１（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ１（２ｐｍｏｌ）
４）Ａ１（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ２（２ｐｍｏｌ）
５）Ａ１（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）＋Ｃ１（２ｐｍｏｌ）
６）Ａ１（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）＋Ｃ２（２ｐｍｏｌ）
７）Ａ１（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）＋Ｃ１／Ｃ２（１／１ｐｍｏｌ）
８）Ａ１（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）＋Ｃ１／Ｃ２（２／２ｐｍｏｌ）
９）Ａ１（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）＋Ｃ１／Ｃ２（４／４ｐｍｏｌ）
１０）Ａ１（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）＋Ｃ１／Ｃ２（１０／１０ｐｍｏｌ）
【００９６】
図７ｂ）レーン：
１）Ａ２（１ｐｍｏｌ）
２）Ａ２（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）
３）Ａ２（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ１（２ｐｍｏｌ）
４）Ａ２（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ２（２ｐｍｏｌ）
５）Ａ２（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）＋Ｃ１（２ｐｍｏｌ）
６）Ａ２（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）＋Ｃ２（２ｐｍｏｌ）
７）Ａ２（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）＋Ｃ１／Ｃ２（１／１ｐｍｏｌ）
８）Ａ２（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）＋Ｃ１／Ｃ２（２／２ｐｍｏｌ）
９）Ａ２（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）＋Ｃ１／Ｃ２（４／４ｐｍｏｌ）
１０）Ａ２（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（２ｐｍｏｌ）＋Ｃ１／Ｃ２（１０／１０ｐｍｏｌ）
【００９７】
図７ａに見ることができるように、Ｂ、Ｃ１またはＣ２のいずれもが、分析対象物Ａ１単独との安定なハイブリッドを形成できず（レーン２〜６）、Ａ、Ｂ、Ｃ１およびＣ２の全ての構成成分が存在した場合、安定な三本鎖構造が形成されるであろう（レーン７〜１０）。ミスマッチが分析対象物（Ａ２）と１つのＷＣ結合プローブ（Ｃ２）間に導入される場合、三本鎖形成は強く阻害される（図７ｂ、レーン７〜１０）。
【００９８】
実施例３ １つの塩基の挿入により異なる核酸の間の区別化
この決定において、実施例２のように２つの分断プローブが用いられた。決定対象の核酸は、後者への１つの塩基の挿入による、決定対象でない核酸とは異なる。プローブＣ１およびＣ２を、決定対象でない核酸に、それらの間の１塩基のギャップで結合するが、決定対象の核酸に結合した場合、複合体中にニックのみで結合するように選択する（三重ヘリックス形成に関与する配列はアンダーラインを付し、非対称の場合である）。
【００９９】
使用した分子は下記のものである：
Ａ１： ＤＮＡ ４０マー（決定対象の核酸）：
５’−ＧＣＴＴＧＴＡＧＴＣＣＴＧＣＴＴＧＡＧＡＧＡＡＣＧＴＧＣＧＧＧＣＧＡＴＴＴＧＣＣ−３’（配列番号：４）
Ａ２： ＤＮＡ ４０マー（決定対象でない核酸）：
５’−ＧＣＴＴＧＴＡＧＴＣＣＴＧＣＴＴＧＡＧＡＴＧＡＡＣＧＴＧＣＧＧＧＣＧＡＴＴＴＧＣ−３’（配列番号：５）
Ｂ ： ＰＮＡ ６マー： Ｈ−ＴＣＴＣＴＴ−ＮＨ2
Ｃ１： ＰＮＡ １５マー： Ｈ−ＡＴＣＧＣＣＣＧＣＡＣＧＴＴＣ−ＮＨ2
Ｃ２： ＰＮＡ １５マー： Ｈ−ＴＣＴＣＡＡＧＣＡＧＧＡＣＴＡ−ＮＨ2
【０１００】
実験条件は下記のとおりである：１ｐｍｏｌの放射性標識したＤＮＡオリゴ（Ａ１またはＡ２）をＰＮＡオリゴ（下記表に記載の量）と全容量８μｌの緩衝液：１００ｍＭ ＮａＣｌ；０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；１０ｍＭ ＮａＨ2 ＰＯ4 ，ｐＨ5 中で混合した。反応は、２分間、９５℃で、熱変性し、２時間インキュベートした。産物を１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ついでオートラジオグラフィーにより解析した。
【０１０１】
数字１）〜１２）は、図８に示したオートラジオグラムのレーンをいう。
【０１０２】
図８）レーン：
１）Ａ１（１ｐｍｏｌ）
２）Ａ１（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ１（１０ｐｍｏｌ）
３）Ａ１（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ２（１０ｐｍｏｌ）
４）Ａ１（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ１／Ｃ２（１０／１０ｐｍｏｌ）
５）Ａ１（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（１０ｐｍｏｌ）＋Ｃ１／Ｃ２（１０／１０ｐｍｏｌ）
６）Ａ１（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（１０ｐｍｏｌ）
７）Ａ２（１ｐｍｏｌ）
８）Ａ２（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ１（１０ｐｍｏｌ）
９）Ａ２（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ２（１０ｐｍｏｌ）
１０）Ａ２（１ｐｍｏｌ）＋Ｃ１／Ｃ２（１０／１０ｐｍｏｌ）
１１）Ａ２（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（１０ｐｍｏｌ）＋Ｃ１／Ｃ２（１０／１０ｐｍｏｌ）
１２）Ａ２（１ｐｍｏｌ）＋Ｂ（１０ｐｍｏｌ）
【０１０３】
各々のＰＮＡプローブＣ１およびＣ２は分析対象物（Ａ１またはＡ２）単独（レーン２〜３、８〜９）または共に（レーン４および１０）と二本鎖を形成することができる。２つの二本鎖形成ＰＮＡオリゴＣ１およびＣ２がお互いに隣接して結合した場合、短い三本鎖形成ＰＮＡオリゴＢが、フーグスティーン塩基形成を介して三本鎖構造を形成する（レーン５）。Ｃ１およびＣ２がわずか１塩基離れる場合、三本鎖形成オリゴＢは結合せず（レーン１１）、分析対象物およびＣ１／Ｃ２の間の複合体のみが見られる。
【０１０４】
実施例４ 競合プローブＤを用いた区別化
本実験は、Ｃ１およびＣ２の２分子、フーグスティーン結合により三本鎖の形成が可能な標識分子Ｂ、ならびに標的Ａにハイブリダイズ可能な分子Ｄを用いた検出の改良された特異性の実施例である（図１０に描く）。実験の結果を図１１に示す。下記化合物を用いた：
Ａ ： ＤＮＡ ２２マー： ５’−ＣＴＴＧＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧＣＴＴＴＴＧＣＧ−３’（配列番号：６）
Ａ１： ＤＮＡ ２２マー： ５’−ＣＣＴＧＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧＣＴＴＴＴＧＣＧ−３’（配列番号：７）
Ａ２： ＤＮＡ ２２マー： ５’−ＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧＣＴＴＴＴＧＣＧ−３’（配列番号：８）
Ａ３： ＤＮＡ ２２マー： ５’−ＣＴＴＴＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧＣＴＴＴＴＧＣＧ−３’（配列番号：９）
Ｂ ： ＰＮＡ ６マー： ケンプチド（Ｋｅｍｐｔｉｄｅ）−ＪＪＴＴＴＪ−ｇｌｙ−ＮＨ2 （Ｊはシュードイソシトシンを示す）
Ｃ１： ＰＮＡ １１マー： Ｈ−ＣＧＣＡＡＡＡＧＣＴＴ−ＮＨ2
Ｃ２−１： ＰＮＡ １１マー： Ｈ−ＴＣＣＡＣＣＡＣＡＧＧ−ＮＨ2
Ｃ２−２： ＰＮＡ １１マー： Ｈ−ＴＣＣＡＣＣＡＣＡＣＡ−ＮＨ2
Ｃ２−３： ＰＮＡ １１マー： Ｈ−ＴＣＣＡＣＣＡＡＡＡＧ−ＮＨ2
Ｄ ： ＰＮＡ １０マー： Ｈ−ＣＣＡＣＣＡＣＡＡＧ−ＮＨ2
【０１０５】
ＰＮＡ Ｂをケンプチド−モチーフ（コッホ，Ｔら．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．（１９９５）３６：６９９３−３６）を介して放射標識し、１ｐｍｏｌを１ｐｍｏｌの標的（Ａ、Ａ１、Ａ２またはＡ３）および種々の量のＰＮＡプローブＣおよびＤを、全量１０μｌの緩衝液（組成：１００ｍＭ ＮａＣｌ；０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；１０ｍＭ ＮａＨ2 ＰＯ4 ，ｐＨ５．０）中で混合した。１０分、室温でハイブリダイズする前、混合液を９５℃で２分間熱変性した。２μｌのローディング緩衝液を添加し、反応物の半分（レーン１および２）または反応物の１／３（レーン３〜８）を５％アクリルアミドゲル電気泳動で泳動し、オートラジオグラフィーで可視化した。
【０１０６】
３つの異なる組み合わせのＰＮＡ検出プローブ（図１１ａ、ｂおよびｃ）を、それらの対応する標的ＤＮＡオリゴ（それぞれ、Ａ１、Ａ２およびＡ３）に結合する能力ならびに標的ＤＮＡオリゴに関して異なる１塩基置換を含む関連する対照ＤＮＡオリゴへのクロスハイブリダイゼーションを試験した。ハイブリダイゼーションを対照オリゴＡに相補的であるが、検出プローブ（Ｃ２−１、Ｃ２−２およびＣ２−３）よりも１ヌクレオ塩基短い競合ＰＮＡ（Ｄ）の量を増加なしにまたは増加させてアッセイした。ＤＮＡ標的領域の他の半分を網羅するプローブＣ１は、全ての標的に対して共通であり、したがって全てのアッセイに使用した。
【０１０７】
図１１ａのレーン１〜８に対応する反応は下記のとおりである：
１） Ａ（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−１（１０ｐｍｏｌ） Ｂ（１ｐｍｏｌ）
２） Ａ１（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−１（１０ｐｍｏｌ）Ｂ（１ｐｍｏｌ）
３） Ａ（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−１（１０ｐｍｏｌ） Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（１０ｐｍｏｌ）
４） Ａ１（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−１（１０ｐｍｏｌ）Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（１０ｐｍｏｌ）
５） Ａ（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−１（１０ｐｍｏｌ） Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（１５ｐｍｏｌ）
６） Ａ１（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−１（１０ｐｍｏｌ）Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（１５ｐｍｏｌ）
７） Ａ（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−１（１０ｐｍｏｌ） Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（２０ｐｍｏｌ）
８） Ａ１（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−１（１０ｐｍｏｌ）Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（２０ｐｍｏｌ）
【０１０８】
図１１ｂのレーン１〜８に対応する反応は下記のとおりである：
１） Ａ（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−２（１０ｐｍｏｌ） Ｂ（１ｐｍｏｌ）
２） Ａ２（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−２（１０ｐｍｏｌ）Ｂ（１ｐｍｏｌ）
３） Ａ（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−２（１０ｐｍｏｌ） Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（１０ｐｍｏｌ）
４） Ａ２（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−２（１０ｐｍｏｌ）Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（１０ｐｍｏｌ）
５） Ａ（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−２（１０ｐｍｏｌ） Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（１５ｐｍｏｌ）
６） Ａ２（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−２（１０ｐｍｏｌ）Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（１５ｐｍｏｌ）
７） Ａ（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−２（１０ｐｍｏｌ） Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（２０ｐｍｏｌ）
８） Ａ２（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−２（１０ｐｍｏｌ）Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（２０ｐｍｏｌ）
【０１０９】
図１１ｃのレーン１〜８に対応する反応は下記のとおりである：
１） Ａ（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−３（１０ｐｍｏｌ） Ｂ（１ｐｍｏｌ）
２） Ａ３（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−３（１０ｐｍｏｌ）Ｂ（１ｐｍｏｌ）
３） Ａ（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−３（１０ｐｍｏｌ） Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（１０ｐｍｏｌ）
４） Ａ３（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−３（１０ｐｍｏｌ）Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（１０ｐｍｏｌ）
５） Ａ（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−３（１０ｐｍｏｌ） Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（１５ｐｍｏｌ）
６） Ａ３（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−３（１０ｐｍｏｌ）Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（１５ｐｍｏｌ）
７） Ａ（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−３（１０ｐｍｏｌ） Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（２０ｐｍｏｌ）
８） Ａ３（１ｐｍｏｌ） Ｃ１（１０ｐｍｏｌ） Ｃ２−３（１０ｐｍｏｌ）Ｂ（１ｐｍｏｌ） Ｄ（２０ｐｍｏｌ）
【０１１０】
ＰＮＡ競合分子Ｄの非存在下、ＰＮＡプローブ分子Ｃ１、Ｃ２およびＢの組み合わせは結合すること、ならびに１つのミスマッチを有する対照標的（レーン１）および完全に相補的な標的（レーン２）と三本鎖構造を形成することができる。１０ｐｍｏｌの競合剤（レーン３）の含有は、さらに１セットの検出プローブとのいくつかのクロスハイブリダイゼーションをおこすが（図１１ｃ）、対照標的への全てのクロスハイブリダイゼーションを、反応物へのより高い量のＰＮＡ競合剤Ｄを添加することにより妨げることができる（レーン５、７および８）。相補的な標的との三本鎖形成は、競合剤の存在下でさえも見られた（レーン４、６および８）。
【０１１１】
【発明の効果】
本発明により、特定の遺伝子または生物にのみ存在するが、試料中に存在するいかなるバックグラウンドの核酸においても存在しないヌクレオ塩基の配列を同定することができるという優れた効果を奏する。
【０１１２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、理論的に可能な、分析対象物核酸Ａ、より短いプローブＢおよびより長いプローブＣを含む混合物中で形成した三本鎖複合体を示す。ハイブリダイゼーションの適切な条件で、複合体１ａの形成は、特異的な分析対象物核酸Ａのための複合体１ｂの形成よりも優先させる。
【図２】図２は、三重らせん結合領域の外側にミスマッチを有するプローブＣを含む複合体２ｂは、完全にマッチしたプローブＣを含む複合体２ａに比べて複合体の形成を好まないことを示す。
【図３】図３は、図２と同じ配置を示すが、１つのより長いプローブＣのかわりに２つのより小さいプローブＣ１およびＣ２を使用することを特徴とする。
【図４】図４は、図３の配置において、２つのプローブＣ１およびＣ２が安定な三本鎖形成を生じるために三重らせん結合領域内に隣接し結合しなけらばならないことを示す。系を改良するために、このセットアップにおいて区別可能なプローブである、すなわち、ミスマッチがこのプローブにより覆われる領域に見いだされる、Ｃ２の競合剤として作用する追加のＰＮＡ化合物（Ｄ）が含まれる。該競合剤は、Ａに完全に相補的な配列を有するが、Ｃ１およびＣ２間のギャップに生じる遠位のヌクレオチドを欠く。プローブＣ２が標的Ａに関わるミスマッチを有する場合、競合剤（適切な長さと濃度を与えられた）がかわりにＡにハイブリダイズし、ギャップを形成するであろう。かかるギャップは、顕著に三本鎖形成を減少される（図４）。これらの２つの特徴（図３および４）の組み合わせにより、系の特異性を増強される。
【図５】図５は、核酸が増幅の間に標識され、正しいアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）が、異なる標識がされたプローブＢの使用により決定される、本発明の好ましい態様を示す。
【図６】図６は、実施例１で行なった実験結果のオートラジオグラムを示す電気泳動の写真である。
【図７】図７は、実施例２で行なった実験結果のオートラジオグラムを示す電気泳動写真である。
【図８】図８は、実施例３で行なった実験結果のオートラジオグラムを示す電気泳動の写真である。
【図９】図９は、ＡＢ2 を脱安定化した第１の様式を示す。
【図１０】図１０は、実施例４の概略を示し、ａは、決定対象の核酸（Ａ）が完全にプローブＣ２およびプローブＤの両方にマッチしているが、プローブＣ２が決定対象の核酸により高い親和性をもつ場合を示す。この場合において、結合後のＣ１とＣ２はニックにより分離しているのみなので、三重らせん構造が形成されうる。またｂは、標的核酸（Ａ）がＣ２に関してミスマッチを有するが、競合プローブＤとはミスマッチを持たない場合を示す。この状況は、三重らせんの形成をさまたげるＤとＣ１との間のギャップを生じる該標的へのＤの結合を好む。したがって、決定対象でない核酸は、決定対象の核酸から識別することができる。
【図１１】図１１は、実施例４で行なった実験結果のオートラジオグラムを示す電気泳動の写真である。
Claims (23)
- 核酸Ａ、第１核酸Ａ結合ＰＮＡ分子Ｂ、および該分子Ｂの配列と異なる塩基配列を有する少なくとも１つのさらなる核酸Ａ結合ＰＮＡ分子Ｃ間の三本鎖結合複合体を形成する工程、ならびに前記核酸の存在または量の尺度としての前記結合複合体の存在または量を決定する工程を含み、ここで、該分子Ｂは、該分子Ｃの全結合領域より長さが短く、該分子Ｂは、３塩基を超えるが１１塩基未満の、三重らせん結合領域における結合に関与する塩基配列を有し、該分子Ｃは、５〜４０塩基の長さを有する、核酸Ａを決定する方法であって、該三本鎖複合体は、該核酸Ａ、該分子Ｂおよび１以上の該分子Ｃ間の三本鎖複合体が該核酸Ａの１分子と、該分子Ｂの２分子または該分子Ｃの２つの同一分子とにより形成された三本鎖複合体よりも温度安定である条件下で形成されることを特徴とする決定方法。
- 該三本鎖複合体が、該核酸Ａ、該分子Ｂおよび該分子Ｃのそれぞれが少なくとも１であるが１１未満の塩基で寄与する三重らせん結合領域を含むことを特徴とする、請求項１記載の決定方法。
- 該三本鎖複合体が、該核酸Ａ、該分子Ｂおよび該分子Ｃのそれぞれが１より大きく８未満の塩基で寄与する三重らせん結合領域を含むことを特徴とする、請求項１記載の決定方法。
- 該複合体が三本鎖領域に結合しているＰＮＡ分子Ｃを１つ含むことを特徴とする、請求項１記載の決定方法。
- 該分子Ｂが４塩基を超えるが８塩基未満の、三重らせん結合領域における結合に関与する塩基配列を有することを特徴とする、請求項１記載の決定方法。
- 該分子Ｃが少なくとも６塩基長を有することを特徴とする、請求項１〜５いずれか記載の決定方法。
- 形成された複合体が三本鎖領域に結合する２つの異なるＰＮＡ分子Ｃを含むことを特徴とする、請求項１記載の決定方法。
- 該分子Ｃが該核酸Ａに隣接して結合することを特徴とする、請求項７記載の決定方法。
- 該分子Ｂおよび／またはＣが化学的に修飾されて、２つのＰＮＡ分子Ｂまたは２つの同一のＰＮＡ分子Ｃと１つの核酸Ａとの三重らせん形成を脱安定化させることを特徴とする、請求項１〜８いずれか記載の決定方法。
- 該分子Ｂの結合領域が非対称な塩基配列を有することを特徴とする、請求項１〜９いずれか記載の決定方法。
- 該分子Ｂの結合領域が対称な塩基配列を有することを特徴とする、請求項１〜９いずれか記載の決定方法。
- 該分子Ｂがフーグスティーン型塩基対形成を介して核酸に結合し、該分子Ｃがワトソン−クリック型塩基対形成を介して結合していることを特徴とする、請求項１〜１１いずれか記載の決定方法。
- 該分子Ｂおよび／またはＣが標識され、結合複合体中の前記１つまたは複数の標識の存在を核酸の決定のために使用することを特徴とする、請求項１〜１２いずれか記載の決定方法。
- 該核酸Ａに結合する該分子Ｂの領域における塩基がピリミジンからなることを特徴とする、請求項１〜１３いずれか記載の決定方法。
- 該核酸が、該核酸に対する該分子Ｂの結合領域内に位置する塩基配列における相違により決定されないように、他の核酸から区別されることを特徴とする、請求項１〜１４いずれか記載の決定方法。
- 該核酸が、該核酸に対する該分子Ｃの結合領域内であるが、該核酸に対する該分子Ｂの結合領域内ではない位置に存在する塩基配列における相違により決定されないように、他の核酸から区別されることを特徴とする、請求項１〜１５いずれか記載の決定方法。
- 該分子Ｃが該核酸に対する該分子Ｂの結合領域に完全に及ぶことを特徴とする、請求項１〜１６いずれか記載の決定方法。
- 該核酸の該分子Ｂの結合領域内における部分にそれぞれ結合する、少なくとも２つのＰＮＡ分子Ｃが使用されることを特徴とする、請求項１〜１７いずれか記載の決定方法。
- 三本鎖結合複合体を形成させるための反応混合物が、該Ａへの結合において少なくとも１つのＰＮＡ分子Ｃと競合することができるが、三本鎖複合体において関与することができない競合プローブ分子Ｄをさらに含むことを特徴とする、請求項１〜１８いずれか記載の決定方法。
- 核酸Ａ、第１核酸結合ＰＮＡ分子Ｂ、および該分子Ｂと比べて異なる塩基配列を有する少なくとも１つのさらなる核酸結合ＰＮＡ分子Ｃ間の三本鎖結合複合体であって、該核酸Ａの１分子と該分子Ｂの２分子または該分子Ｃの２つの同一分子とから形成された三本鎖複合体よりも温度安定であり、該分子Ｂは、該分子Ｃの全結合領域より長さが短く、該分子Ｂは、３塩基を超えるが１１塩基未満の塩基配列を有し、該分子Ｃは、５〜４０塩基の長さを有することを特徴とする複合体。
- 該分子Ｂの配列が非対称である、請求項２０記載の複合体。
- 該分子Ｂの配列が対称である、請求項２０記載の複合体。
- 前記核酸Ａ、第１核酸結合ＰＮＡ分子Ｂ、および少なくとも１つのさらなる核酸結合ＰＮＡ分子Ｃを混合する工程を含む、請求項２０〜２２いずれか記載の三本鎖結合複合体を形成する方法。
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