FI110694B - Nukleiinihappoanalogien käyttö nukleiinihappoamplifikaation inhibiitiossa - Google Patents
Nukleiinihappoanalogien käyttö nukleiinihappoamplifikaation inhibiitiossa Download PDFInfo
- Publication number
- FI110694B FI110694B FI945725A FI945725A FI110694B FI 110694 B FI110694 B FI 110694B FI 945725 A FI945725 A FI 945725A FI 945725 A FI945725 A FI 945725A FI 110694 B FI110694 B FI 110694B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- nucleic acid
- att
- amplification
- primer
- som
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
110694
Nukleiinihappoanalogien käyttö nukleiinihappoamplifikaation inhibiitiossa -Användning av nukleinsyraanaloger vid inhibering av nukleinsyraamplifikati-on 5 Tämä keksintö koskee nukleiinihappoanalogien käyttöä blokkaamaan nukleiinihap-poamplifikaatiomenetelmissä ja siihen perustuvia diagnostisia/analyyttisiä tekniikoita.
Nukleiinihappoamplifikaatiotekniikat ovat nyt laajalle levinneessä käytössä. Näihin kuuluvat "PCR"- (polymerase chain reaction) menetelmät, joita kuvataan julkaisuis-10 sa EP-A-0200362, EP-A-0201184 ja WO-A-9112342, mikä on tekniikka, joka on laajalle levinneimmässä käytössä, mutta myös "LCR" (ligase chain reaction), jota kuvataan EP-A-0320308:ssa ja niin kutsuttu "NASBA"- tai "3SR"-tekniikka, jota kuvataan "Proc. Natl. Acad. Sei. USA" voi 87. s 1874-1878, maaliskuu 1990 ja "Nature" voi 350, nro 6313. s 91-92, 7. maaliskuuta 1991.
15 Näiden menetelmien käytössä diagnostiikassa pääasiallisena ongelmana on väärien positiivisten tuotto siirtämällä amplifioituja nukleiinihapposekvenssejä edeltävistä reaktioista. Koska nämä menetelmät kykenevät tuottamaan positiivisen tuloksen, jos läsnä on yksikin molekyyli, jossa on kohdesekvenssi, tapahtuu tietenkin hyvin helposti tällainen väärä positiivinen reaktio. Tällä hetkellä on tarpeellista tällaisten me- » _ : · 20 netelmien reaktiotuotteen työstäminen ennen kuin amplifikaatiomenetelmän onnis- tuminen tai epäonnistuminen voidaan päätellä. Tähän sisältyy reaktiotuotteen ja ' ‘ , useiden laboratoriovarustekappaleiden välinen kosketus, kuten pipetit, samoin kuin : .·. henkilökunnan kanssa, mikä voi johtaa saatavilla oleviin pienien määrien amplifi- .; kaatiotuotetta kontaminoimaan tulevia ajoja.
»1 · : 25 Tällä hetkellä yritetään kovasti kehittää niin kutsuttuja "sisäisiä" menetelmiä, joissa amplifikaatioreaktion onnistumista voidaan tarkkailla käsittelemättä amplifikaatio-: tuotetta ja avaamattomassa reaktioastiassa.
7' Nukleiinihappoanalogin uusia muotoja kuvataan patentin yhteistyösopimushake- :.: : muksessa nro PCT/EP92/01220, joka on jätetty 22. toukokuuta 1992, mikä selektii- '·,./· 30 visesti sitoo komplementaarisen sekvenssin tavanomaiset nukleiinihapot muodos- tamaan hybridejä, jotka ovat stabiilimpia lämmön aiheuttamaa dehybridisaatiota • t . vastaan kuin ovat samanlaiset hybridit tavanomaisten nukleiinihappojen välillä.
‘ ‘ Olemme nyt havainneet, että on mahdollista käyttää hyväkseen tätä suurempaa hyb- ridistabiiliutta blokkaamaan selektiivisesti nukleiinihappoamplifikaatiomenetelmiä.
2 110694 Tätä tekniikkaa voidaan käyttää estämään vääriä positiivisia sellaisissa amplifikaa-tiomenetelmissä. Sitä voidaan myös käyttää hyväkseen olennaisena osana tiettyjä diagnostisia/analyyttisiä lähestymistapoja.
Ensimmäisessä näkökohdassa keksintö tarjoaa menetelmän inhiboida nukleiinihap-5 poamplifikaatiomenetelmää, mihin sisältyy että tarjotaan mainitussa menetelmässä tehokas määrä nukleiinihappoanalogia, joka on riittävän komplementaarinen nukleiinihapon sekvenssin kanssa, joka ottaa osaa olennaisella tavalla mainittuun amp-lifikaatiomenetelmään hybridisoitumaan mainittuun sekvenssiin riittävän voimakkaasti estämään mainitun sekvenssin tehokasta osallistumista amplifikaatiomenetel-10 mään. Täten tähän keksinnön näkökohtaan sisältyy menetelmä inhiboida nukleiini-happoamplifikaatiomenetelmä, jossa menetelmässä kaksoisjuosteisen kohdenukleii-nihapon kummallakin juosteella on alue, jota on käytetty mallisäikeenä yhdelle tai useammalle alukkeelle, jo(t)ka on tai ovat pidennetyt tai liitetyt yhteen muodostamaan toisen mallisäikeen, joka on komplementaarinen mainitun mallisäikeen kans-15 sa, jolloin tuotetaan nukleiinihappoanalogi, joka on riittävästi komplementaarinen mainitun mallisäikeen tai mainitun alukkeen sekvenssin kanssa hybridisoitumaan sen kanssa, ja jolloin mainittu nukleiinihappoanalogi hybridisoituu riittävän voimakkaasti vastaavaan mallisäikeeseen tai alukkeeseen blokkaamaan aluke-malli-säie-hybridisaation tai blokkaamaan alukkeen pidentymistä tai alukkeen yhteenliit-20 tyrnistä menetelmän olosuhteissa.
• · -: : Mainittu menetelmä on edullisesti PCR tai LCR tai 3 SR menetelmä. "Ankkuroidut" » · . ’ i tai "käänteiset" PCR-menetelmät ovat mukaanluetut.
: "Kaksijuosteinen kohdenukleiinihappo", jossa on jokaisessa juosteessa alue, joka toimii mallisäikeenä, ei ole välttämättä lähtömateriaali, eikä tarvitse välttämättä olla E! 25 toivotun amplifikaation suora kohde menetelmässä.
• PCR:ssä "kaksijuosteinen kohdenukleiinihappo" liitetään tavallisesti lähtömateriaa-: \: liin ja yleensä on ainakin yhden sen toivotun juosteen amplifikaatio. PCR-reaktio ·*'*: voidaan kuitenkin aloittaa vain yhdellä DNA-juosteella, komplementaarinen juoste . tuotetaan alukkeen pidentämisen ensimmäisellä kierroksella. Myöhemmissä kier- 30 roksissa "kaksijuosteinen kohdenukleiinihappo" koostuu pääasiallisesti aikaisempi-' ·; · * en kierrosten tuotteista.
• · . . LCR:ssä "kaksijuosteinen kohdenukleiinihappo" liitetään samalla lailla aluksi taval- * ‘ lisesti lähtömateriaaliin ja on myöhemmissä kierroissa pääasiallisesti amplifikaatio- tuote.
3 110694 Välttämättä ei ole niin, että alukkeet hybridisoidaan jokaiseen juosteeseen amplifi-kaatiokierron samassa osassa tai todellakin vasta sen jälkeen, kun kaksijuosteinen kohdenukleiinihappo on muodostunut. Täten 3SR-tekniikassa lähtö RNA-juoste hybridisoidaan ensimmäiseen alukkeeseen, jota pidennetään komplementaarisena 5 DNA-juosteena käänteistranskriptaasilla muodostamaan viitattu "kaksijuosteinen kohdenukleiinihappo". Sen jälkeen kun hybridisoitu RNA-juoste on tuhottu RNaasi H:lla, hybridisoidaan toinen aluke DNA-juosteeseen ja pidennetään käänteistranskriptaasilla muodostamaan kaksijuosteinen DNA-molekyyli. Täten tällä vaiheella molemmat juosteet, jotka ovat DNA/RNA:ssa, on ajallaan hybridisoitu alukkeeseen, 10 jota on sitten pidennetty.
Ensimmäinen aluke on siten rakennettu, että DNA/DNA-tuotteeseen sisältyy promoottori RNA-polymeraasille, kuten T7 RNA-polymeraasi, joka käyttämällä DNA/DNA-tuotetta mallisäikeenä tuottaa moninkertaisia RNA-kopioita vastaten RNA-lähtömateriaalia, joista jokaisesta vuorollaan tulee lähtömateriaalit ensimmäi-15 selle alukkeelle ja käänteistranskriptaasille toimia.
Mainittu amplifikaatiomenetelmä voidaan suorittaa mainitun nukleiinihappoanalo-gin puuttuessa keräämään toivottu amplifikaatiotuotteen taso ja mainittu nukleiini-happoanalogi voidaan sitten lisätä.
Mainittu nukleiinihappoanalogi hybridisoituu edullisesti mainittuun amplifikaatio-: 20 tuotteeseen. Tämä lopettaa amplifikaation ja voi jättää tuotteet stabiiliin nukleiini- *·· happomuotoon - nukleiinihappoanalogihybridejä, jotka eivät kykene toimimaan mallisäikeenä, jos ne kontaminoivat seuraavan reaktion. "Avoimet" mieluummin • :1: kuin "sisäiset" menetelmät tulkitaan turvallisiksi kontaminaation siirtämistä vastaan.
< I I · * · · ;;; Mainitun tyyppisessä amplifikaatiomenetelmässä käytettävää laitetta voidaan vaih- ·’ ’ 25 toehtoisesti tai lisäksi käsitellä liuoksella, jossa on mainittu nukleiinihappoanalogi hybridioimaan mainitut analogi mihin tahansa amplifikaatiotuotteeseen, jota voi oi- • 1 la läsnä kontaminaationa, ja laite voidaan sen jälkeen pestä ja käyttää mainitussa amplifikaatiomenetelmässä, minkä tahansa amplifikaatiotuotteen, joka on läsnä : 1·. alunperin kontaminanttina mainitussa laitteessa, amplifikaatio mainitussa menetel- ‘ 30 mässä estetään mainitulla hybridisaatiolla mainittuun analogiin.
* ·
Keksintöön sisältyy sen vuoksi menetelmä estää nukleiinihappoamplifikaatiotuo-: tetta toimimasta alukkeena sitä seuraavassa amplifikaatiomenetelmässä, jolloin me netelmään sisältyy hybridisoida siihen nukeliinihappoanalogi, joka muodostaa sen 4 110694 kanssa hybridin, joka on stabiili sitä seuraavan amplifikaatiomenetelmän olosuhteissa.
Keksintöön sisältyy myös menetelmä estää minkä tahansa nukleiinihappoamplifi-kaatiotuotteen, jota saattaa olla ympäristössä, toimimasta kontaminoivana alukkeena 5 sitä seuraavassa nukleiinihapon amplifikaatiomenetelmässä, johon menetelmään sisältyy käsitellä ympäristöä nukleiinihappoanalogilla, joka muodostaa mainitun amp-lifikaatiotuotteen kanssa hybridin, joka on stabiili sitä seuraavan amplifikaatiomenetelmän olosuhteissa.
Käytännössä voidaan pestä kaikki tai jotkut välineet, joita on tarkoitus käyttää me-10 netelmässä, liuoksella, jossa on nukleiinihappoanalogi, esim. hybridisaatiopuskuris-sa, siten että muodostuu stabiili hybridi analogin ja läsnä olevan nukleiinihapon, jossa on kohdesekvenssi amplifikaatiota varten, välille. Nukleiinihappoanalogin kanssa muodostunut hybridi on riittävän stabiili sietämään seuraavan amplifikaatiomenetelmän olosuhteet ja kontaminanttikohdesekvenssiä estetään täten ottamasta 15 osaa sellaiseen menetelmään väärien positiivisten tuottamiseksi.
Keksinnön tässä ja muissa näkökohdissa käytettävässä nukleiinihappoanalogissa on edullisesti 5-20 nukleoemästä sitovaa ligandia, esim. 10-15 ligandia.
Voidaan antaa nukleiinihappoanalogi, jota on räätälöity pysäyttämään spesifisen nukleiinihapposekvenssin amplifikaatio tai voidaan antaa reagenssi, jossa on nukle-. : 20 iinihappoanalogisekvenssien seos, joka pysäyttää lukuisia erilaisia amplifikaatioita.
Tähän jälkimmäiseen tarkoitukseen olevassa reagenssissa on edullisesti sekvenssien • # moninaisuus tai suuri määrä. Äärimmäisesti voidaan syntetisoida nukleiinihappo- Y analogeja käyttämällä monomeerisyntonien seosta (mukaanluettuna ligandit, jotka ;;; ovat komplementaarisia jokaisen neljän DNA-emäksen kanssa) jokaisessa vaiheessa 25 siten, että rakennetaan molekyylejä, joissa jokaisessa on ligandien satunnainen sekvenssi. Sellaisen reagenssin riittävässä määrässä pitäisi olla riittävä lukumäärä mo- » · .’·· lekyylejä, jotka ovat komplementaarisia minkä tahansa amplifikaatiotuotteen kans- '. Y sa, joka kykenee inhiboimaan minkä tahansa amplifikaatiotuotteen.
: Yleisesti on edullista nukleiinihappoanalogin jokaiselle molekyylille sellaisessa rea- 30 genssissa olla ainakin 10-meeri, edullisemmin ainakin 12-meeri, esim. 15-20-meeri. 1 ’ Amplifikaatiotuotteiden selektiivinen blokkaus voidaan laittaa työskentelemään ak- ' · ‘: tiivisemmin osana diagnostista menetelmää.
5 110694 Tällä hetkellä, kun käytetään menetelmiä kuten PCR, amplifioimaan sekvenssi tarkoituksena määrittää, onko tietty sekvenssi läsnä, kuten yksittäinen emäsmuutos vaihtoehtoisesta sekvenssistä (esim. yhden emäksen mutaatio "normaalista" sekvenssistä geenissä), menetelmät määrittää sekvenssiä amplifikaatiotuotteessa ovat 5 työläitä. Näihin sisältyy sekvensoida koko tuote varmistamaan muuttuneen emäksen läsnäolo. Niihin sisältyy myös määrittää muuttunut pilkkomistuotteiden malli, joka on tuotettu yhdellä tai useammalla restriktioentsyymillä, jos muutos tai muutokset geenisekvenssissä vaikuttavat restriktiokohtaan. Niihin sisältyy myös leimatun, mu-tatoidun sekvenssin nukleiinihappokoettimen hybridisointi tuotteeseen olosuhteissa, 10 jotka ovat riittävän ankarat tekemään eron mahdollisten sekvenssien välillä.
Suunnittelemalla nukleiinihappoanalogi, joka kykene muodostamaan stabiilin hybridin PCR kohdesekvenssin kanssa vain, jos mutaatio on läsnä ja antamalla mainittu analogi näytenukleiinihapolle hybridisaatio-olosuhteissa, voidaan selektiivisesti inhiboida PCR-reaktio siten, että eksponenttiamplifikaatiota ei tapahdu mutaatiossa, 15 jossa on sekvenssi. Tätä periaatetta voidaan laajentaa myös muihin amplifikaatio-menetelmiin.
Täten, keksintöön sisältyy menetelmä määrittää kohdenukleiinihapposekvenssin läsnäolo tai puuttuminen koostuen amplifikaatiomenetelmän suorittamisesta, jossa jokainen kaksijuosteisen nukleiinihapon juoste, jossa on mallisäikeenä käytetty 20 alue, mukaanluettuna mainitun nukleiinihapon se osa, jossa mainittu kohdesekvens- ' ; si sijaitsee, jos läsnä, amplifioidaan hybridisoimalla yksi tai useampi aluke mainit- ’· tuun mallisäikeeseen ja mainittujen alukkeiden pidentäminen tai yhteenliittäminen “ muodostamaan toinen mallisäie, joka on komplementaarinen mainitun mallisäikeen : : kanssa, jolloin tuotetaan nukleiinihappoanalogi, joka on komplementaarinen maini- i · ’ 25 tun kohdesekvenssin kanssa ja hybridisoituu mainitun mallisäikeen kanssa riittävän : : voimakkaasti blokkaamaan mainittu ampilfikaatiomenetelmä, kun mainittu kohde- sekvenssi on läsnä, mutta ei muuten.
;.*· Jos nukleiinihappoanalogi on läsnä läpi koko amplifikaatioreaktion, kohdesekvens- *; · ‘ sin toisen juosteen amplifikaatio on lineaarinen mieluummin kuin eksponentiaalinen : : ‘: 30 siten, että merkittäviä määriä amplifikaatiotuotetta ei tuoteta.
» * T Kohdesekvenssin läsnäolo voidaan siksi päätellä amplifikaatioreaktion epäonnitu- ':‘: misesta, joka voi olla PCR tai LCR tai 3SR, tuottamaan merkittävä tuotetaso. Reak- : ’.: tion tuote voidaan esimerkiksi ajaa geelissä ja juovan tuottamisen puuttuminen mer kitsee sekvenssin läsnäoloa.
6 110694
On toivottavaa liittää mukaan sisäinen kontrolli varjelemaan reaktiota vastaan, joka on epäonnistunut jostain syystä. Täten, edullisesti kontrollina, liitetään toinen nukle-iinihapposubstraatti, joka kykenee amplifioimaan mainitulla amplifikaatiomenetel-mällä käyttämällä samoja alukkeita, joka läpikäy amplifikaation tuottamaan tuot-5 teen, joka on erilainen kuin kohdesekvenssin amplifikaatiotuote.
Menetelmä voidaan suorittaa tällä tavalla määrittämään erityisen emäksen läsnäolo tarkoin määritetyssä sijainnissa, esim. osoittamaan tarkoin määritetyn yhden emäksen mutaation läsnäolo. Sarja sellaisia analyysejä voidaan suorittaa rinnakkain tai peräkkäin tunnistamaan, mitkä, jos yhtään, mahdollisten mutaatioiden sarjasta on 10 läsnä geenialueessa käyttämällä jokaisessa analyysissä nukleiinihappoanalogia, joka on räätälöity vastaavalle mutaatiolle.
Mutaation tapauksessa, joka on tavallisemmasta sekvenssistä, voidaan mutaatiota tai "normaalia" sekvenssiä tarkastella "kohde nukleiinihapposekvenssinä". Täten jos nukleiinihappoanalogi on komplementaarinen mutatoidun sekvenssin kanssa, osoit-15 taa amplifikaation puuttuminen mutaation epäonnistumisen. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää nukleiinihappoanalogia, joka on komplementaarinen "normaalin" sekvenssin kanssa, jonka jälkeen amplifikaation epäonnistuminen osoittaa "normaalin" sekvenssin ja onnistunut amplifikaatio osoittaa lähemmin määräämättömän mutaation läsnäolon, so. "normaalin" sekvenssin puuttuminen.
: : 20 Vaikka on havaittu, että nukleiinihappoanalogit, kuten PNA voivat blokata PCR- ,'·· amplifikaatioreaktion, onpa PNA ohjattu hybridoitumaan PCR-alukkeen sitomis- kohtaan tai nukleotidisekvenssiin mallisäikeessä, joka pääasiallisesti poistetaan ; :": alukkeen sitomiskohdasta, kysymys ei ole, että PNA/DNA-hybridisaatiokohdan va- ··· linta on merkityksetön. Yleisesti affiniteettitaso, joka vaaditaan PNA- ja DNA-mal- I » ·
25 lisäikeen välillä lopettamaan PCR-reaktio, on jonkinverran vähemmän kun PNA
hybridisoituu alukkeen sitomiskohtaan tai sen lähelle. Affiniteettiä voidaan hieno- . . säätää PNA-sekvenssin pituuden sopivalla valinnalla ottamalla huomioon erityinen ;.. ‘ mukana oleva emässekvenssi, homopyrimidiinialueiden sitoessa voimakkaimmin.
• Täten on mahdollista valita olosuhteet siten, että kaksi PCR-reaktiota voidaan suo-«·.[ 30 rittaa yksinkertaiseen mallisäikeeseen samanaikaisesti, toisen ollessa käytetty kont- rollina ja ollessa läpäisemätön sopivan PNA:n läsnäololle, mikä inhiboi toista. Tä-·“· ten jos käytetään yksinkertaista eteenpäin suunnattua aluketta kahden erilaisen käänteisalukkeen yhdistelmänä, toisen tuottaessa pidemmän ja toisen lyhyemmän amplifikaatiotuotteen, PNA voidaan ohjata lyhyemmän tuotealukkeen sitomiskoh-35 taan tai sen lähelle ja estää sen vastaava PCR-reaktio ilman, että samanaikaisesti in- 7 110694 hiboidaan pidemmän tuotteen PCR-reaktio, jos valitaan PNA-affiniteetti viisaasti. Jos PNA-hybridisaatiokohta on sellainen, jossa on yhden emäsparin mutaatio, joka toivotaan havaittavan, voidaan järjestää asiat siten, että jos mutaatio on läsnä, PNA sitoo ja tuotetaan vain yksi PCR-tuote, kun taas jos mutaatiota ei ole, PNA ei sido 5 DNA:ta tarpeeksi voimakkaasti inhiboimaan lyhyempää tuote-PCR:ää ja sekä pidempi että lyhyempi tuote tuotetaan. Täten ei-tehokkaasti blokattu pidempi tuote-PCR toimii sisäisenä kontrollina varmistamaan oikeiden olosuhteiden käytön määritettäessä mutaation läsnäoloa tai puuttumista.
Keksintöön sisältyy menetelmä, jossa määritetään jokaisen lukuisien sekvenssien 10 puuttumisen läsnäolo kohdenukleiinihapposekvenssissä vuorollaan, suorittamalla sarja PCR-amplifikaatiomenetelmiä käyttämällä samaa aluketta tai alukkeita ja antamalla vastaava nukleiinihappoanalogi jokaisessa mainitussa menetelmässä, joka on komplementaarinen mainittujen lukuisten sekvenssien vastaavan kanssa hybridi-soitumaan sen kanssa blokkaamaan mainittu amplifikaatiomenetelmä, kun mainittu 15 vastaava sekvenssi on läsnä, mutta ei muulla tavalla.
Täten annettuna kohdesekvenssi, jossa on uloke-PCR-alukkeen sitomiskohtien pari, yksi kussakin juosteessa, voidaan määrittää, onko noiden kohtien välillä yhdessä juosteessa erityisen spesifinen sekvenssi antamalla nukleiinihappoanalogi, joka kykenee sitoutumaan spesifiseen sekvenssiin muodostamaan sen kanssa hybridin, joka 20 on stabiili PCR-olosuhteissa ja täten blokkaa eksponentiaalisen amplifikaation.
Il· · :Tätä periaatetta voidaan hyödyllisesti soveltaa määrittämään, mitkä lukuisista mah- . dollisista sekvensseistä ovat läsnä peräkkäin nukleiinihapon alueella geenissä tai : :': suuremmalla alueella, kuten geeniryhmä. Esimerkin vuoksi E. colissa on ryhmitty- ··· nyt 30:een asti geenejä lyhyelle geneettiselle alueelle, joka määrää antibioottiresis- - * * * . 25 tenssin. Jotta määritetään, mitkä antibioottiresistenssigeenit ovat läsnä erityisessä organismissa, sisältyisi normaalisti PCR-alukkeiden kehittämisen jokaiselle kiin-. . nostuksen kohteena olevalle geenille.
Käyttämällä nukleiinihappoanalogeja selektiiviseen PCR-blokkaukseen voidaan . ·. määrittää geenit, jotka ovat läsnä, käyttämällä alukkeiden yksittäistä paria, joka reu- ···. 30 nustaa koko aluetta. Tarkoin määritetyt sekvenssinukleiinihappoanalogit on tehty ‘! ‘ komplementaariseksi kumpaankin juosteeseen jokaisen geenisekvenssin tunnistami- seksi ja PCR-reaktiota kokeillaan jokaisen läsnäolevan nukleiinihappoanalogin ;· kanssa vuorollaan. Kun nukleiinihapossa on läsnä sekvenssi, jonka kanssa testattava analogi hybridisoituu, PCR-reaktio Mokataan. Käyttämällä tavanomaista PCR:ää, 35 tarvittaisiin alukkeiden paria, joka on tarkoin määritetty tutkittavalle sekvenssille.
8 110694
Jokainen alukepari tarvitsisi uudet olosuhteet optimoitavaksi amplifikaatiossa vaihtelemalla parametrien määrää. Koska edellä mainitussa PCT-hakemuksessa kuvatun kaltaiset nukleiinihappoanalogit syntetisoidaan helposti toivottuina sekvensseinä, ongelmat saada suuri määrä erilaisia PCR-alukkeita ja amplifikaatiomenetelmien 5 kehittäminen sopiviksi jokaiselle alukepariyhdistelmälle, voitetaan.
Keksintöön kuuluu menetelmä inhiboida polymeraasin välittämää alukkeen, joka on hybridisoitu nukleiinihappomallisäikeeseen, pidentymistä, mihin sisältyy että annetaan hybridisaatio-olosuhteissa nukleiinihappoanalogi, joka muodostaa stabiilin hybridin alukkeen tai mallisäikeen kanssa alukkeen kohdassa tai myötävirtaan alu-10 kekohdasta.
Kun amplifikaatiomenetelmän tuote on tarkoitus sekvenssoida tai määrittää ja tunnistaa koettamalla leimatun oligonukleotidin kanssa, se tarvitsee saada normaalisti yksijuosteisessa muodossa. Komplementaarinen juoste on normaalisti läsnä yhtä suurina määrinä ja juosteet ovat taipuvaisia rekombinoitumaan. Siksi on toivottavaa 15 suorittaa PCR-reaktiot sellaisella tavalla, että tuotetaan pääasiallisesti yksi kahdesta tuotejuosteesta (asymmetrinen PCR). Tällä hetkellä tätä yritetään käyttämällä enemmän yhtä kuin toista aluketta. Ihanteellisesti, toivotun sekvenssin eksponentiaalinen tuottaminen tapahtuu, kunnes yksi aluke on kulutettu loppuun ja sitten seuraa lineaarinen amplifikaatio. Johtuen epätasaisista alukepitoisuuksista, jotka kos-20 kettavat reaktion aikaisia vaiheita, usein on ongelma siinä, että PCR-menetelmä ei ! ala kunnolla.
. Siksi tähän keksintöön sisältyy menetelmä suorittaa asymmetrinen nukleiinihap- : poamplifikaatiomenetelmä, jossa menetelmässä jokaisessa kaksijuosteisessa kohde- ··· nukleiinihapon juosteessa on alue, jota käytetään mallisäikeenä alukkeelle, jota pi- » »* · 25 dennetään muodostamaan toinen mallisäie, joka on komplementaarinen mainitun mallisäikeen kanssa, johon lukuisten amplifikaatiokierrosten jälkeen lisätään nukle-. . iinihappoanalogi, joka hybridisoituu yhteen alukkeista riittävän voimakkaasti inhi- boimaan mainitun alukkeen hybridisaatiota sen kohteeseen reaktio-olosuhteissa ja •; ' mainittua menetelmää jatketaan sitten lukuisten lisäkierrosten läpi.
30 Amplifikaatiomenetelmä on edullisesti PCR.
I I · •; · · · Keksintöön sisältyy suorittaa asymmetrinen amplifikaatio tällä tavalla ja sitten mää- •. : ritetään tai sekvensoidaan amplifikaatiotuote.
9 110694 PNA-konsentraatio yritetyn PCR:n tai muun amplifikaatioreaktion aikana on edullisesti suurempi kuin 0,5 μΜ, edullisesti suurempi kuin 2,0 μΜ, edullisimmin enemmän kuin 3 μΜ, esim. 3-15 μΜ.
Nukleiinihappoanalogi, jota on käytetty kaikissa edellä, on edullisesti peptidinukle-5 iinihappo (PNA), jossa on polyamidirunko sisältäen runsaasti ligandeja sitomisosis-sa, esim. ei enempää kuin 10-15 %.
Tyypillisissä ligandeissa on joko 4 luonnollisesti esiintyvää pääasiallista DNA-emästä (so. tyrniini, sytosiini, adeniini tai guaniini) tai muita luonnollisesti esiintyviä nukleoemäksiä (esim. inosiini, urasiili, 5-metyylisytosiini tai tiourasiili) tai kei-10 notekoisia emäksiä (esim. bromourasiili, atsa-adeniinit tai atsaguaniinit, jne.) kiinnittyneenä peptidirunkoon sopivan linkkerin välityksellä.
Edullisissa suoritusmuodoissa keksinnöissä käytetyillä nukleiinihappoanalogeilla on yleinen kaava (I): 1 ,n A1 A2 An
O r>l oi G2-* Rn T
: : C1 Dr C2 D2 '--(T D” •\! 15 ® ; : : jossa » » · » '!! l n on ainakin 2, jokainen L -L valitaan itsenäisesti ryhmästä, joka koostuu vedystä, hydroksista, : (Ci-C4)-alkanoyylistä, luonnollisesti esiintyvistä nukleoemäksistä, ei-luonnollisesti • ” ’: 20 esiintyvistä nukleoemäksistä, aromaattisista osista, DNA-väliinsovittajista, nukleo-
emästä sitovista ryhmistä ja reportteriligandeista, ainakin yhden L’-Ln:n ollessa ;/ luonnollisesti esiintyvä nukleoemäs, ei-luonnollisesti esiintyvä nukleoemäs, DNA
• ·' väliinsovittaja tai nukleoemästä sitova ryhmä; * In . . jokamen A -A on yksinkertainen sidos, metyleeniryhmä tai kaavan (Ha) tai (Ilb) ' 25 mukainen ryhmä: 10 11069-- r'1 Γ r1 Ί Tr1! Γ^1 i x I n --C--Y--c--tai--C--Y--c--c- _ R2_ p _ R2 q R2 r _ R2 s (Ha) (Hb) jossa X on O, S, Se, NR3, CH2 tai C(CH3)2; 5 Y on yksinkertainen sidos, O, S tai NR4; jokainen p ja q on kokonaisluku 1-5, summan p+q ollessa alle 10; jokainen r ja s on 0 tai kokonaisluku 1-5, summan r+s ollessa alle 10; jokainen R ja R valitaan itsenäisesti ryhmästä, joka koostuu vedystä, (Ci-C4)-alkyylistä, joka voi olla hydroksi- tai alkoksi- tai alkyylitiosubstituoitu, hydroksi, 10 alkoksi, alkyylitio, amino ja halogeeni; ja jokainen R3 ja R4 valitaan itsenäisesti ryhmästä, joka koostuu vedystä, (CrC4)-' ' ! alkyylistä, hydroksi- tai alkoksi- tai alkyylitiosubstituoidusta (Ci-C4)-alkyylistä, hydroksista, alkoksista, alkyylitiosta ja aminosta; ; : ’: jokainen B*-Bn on N tai R3N+, jossa R3 on kuten edellä on kuvattu; I t · 15 jokainen C'-c" on CR6R7, CHR6CHR7 tai CR6R7CH2, jossa R6 on vetyjä R7 valitaan ryhmästä, joka koostuu luonnollisesti esiintyvien alfa-aminohappojen sivuketjuista, tai R ja R valitaan itsenäisesti ryhmästä, joka koostuu vedystä, (C2-C6)-alkyylistä, ’ί aryylistä, aralkyylistä, heteroaryylistä, hydroksista, (Ci-C6)-alkoksista, (Ci-C6)-al- kyylitiosta, NR3R4:sta ja SR5:stä, jossa R3 ja R4 ovat kuten edellä kuvattiin ja R5 on 20 vety, (Ci-Cöj-alkyyli, hydroksi-, alkoksi- tai alkyylitio-substituoitu (Ci-C6)-alkyyli
* * f% H
tai R ja R yhdessä täydentävät alisyklisen tai heterosyklisen systeemin; :·· jokainen D*-Dn on CR6R7, CH2CR6R7 tai CHR6CHR7, jossa R6 ja R7 ovat kuten ’. : edellä kuvattiin; jokainen G1-G11'1 on 11 1106:94 o s o o
-N- C-, -N- C-, -N-S-, tai -N-S-R3 R3 R3 R3 O
kummassakin suunnassa, jossa R3 on kuten edellä kuvattiin; 5 Q on -C02H, -CONR’R", -S03H tai -S02NR'R" tai -C02H:n tai -S03H:n aktivoitu johdannainen; ja I on -NHR"'R"" tai -NR,MC(0)R"", jossa R', R", R'" ja R"" valitaan itsenäisesti ryhmästä, joka koostuu vedystä, alkyy-listä, amino-suojaavista ryhmistä, reportteriligandeista, väliinsovittajista, kelaatto-10 reistä, peptideistä, proteiineista, hiilihydraateista, lipideistä, steroideista, oligonuk-leotideistä ja liukoisista ja ei-liukoisista polymeereistä. Vaihtoehtoisesti, C ja D voivat olla CHR6(CH2)SCHR7, jossa S voi olla 0-2.
Edullisilla peptidinukleiinihapoilla on yleinen kaava (III): I 1 ' oycH„ o,/™,), '' ; R". ,(CH2)t .N^JCH2)m Jl--(CH2)t /N\/(CH2)!lNH_Ri "T Tl X h | . O L R Jn 15 (III) ./ jossa * jokainen L valitaan itsenäisesti ryhmästä, joka koostuu vedystä, fenyylistä, hetero-*. sykleistä, esim. 1, 2, 3 rengasta, luonnollisesti esiintyvistä nukleoemäksistä ja ei- • luonnollisesti esiintyvistä nukleoemäksistä; t I. I t
* T
i 20 jokainen R valitaan itsenäisesti ryhmästä, joka koostuu vedystä ja luonnollisesti esiintyvien alfa-aminohappojen sivuketjuista; 12 110654 n on kokonaisluku 1-60; jokainen k, 1 ja m on itsenäisesti 0 tai kokonaisluku 1-5; k:n ja m:n summa on edullisesti 1 tai 2, edullisemmin 1;
Rh on OH, NH2 tai -NHLysNH2; ja 5 R‘ on H tai COCH3.
Erityisen edullisia ovat yhdisteet, joiden kaava on (III), jossa jokainen L valitaan itsenäisesti ryhmästä, joka koostuu nukleoemäksistä tyrniini (T), adeniini (A), syto-siini (C), guaniini (G) ja urasiili (U), erityisesti tyrniini ja n on kokonaisluku 1-30, erityisesti 4-20.
10 Keksinnön peptidinukleiinihappoja voidaan syntetisoida sovittamalla peptidisyntee-sin standardimenetelmiä, joko liuoksessa tai kiinteässä faasissa. Käytetyt syntonit voivat olla spesifisesti suunniteltuja monomeeriaminohappoja tai niiden aktiivisia johdannaisia, joita suojaavat standardit suojaavat ryhmät. Oligonukleotidianalogeja voidaan myös syntetisoida käyttämällä vastaavia dihappoja ja diamiineja.
15 Täten monomeerisyntonit, joita käytetään tuottamaan yhdisteitä käytettäväksi keksinnössä, voidaan valita ryhmästä, joka koostuu aminohapoista, dihapoista ja di- amiineista, • : joilla on yleiset kaavat: \ f
: V A A A
4·· E\ /V /F E\ /V
c d tai c c tai c i 20 (IV) (V) (VI) ’ jossa L, A, B, C ja D ovat kuten edellä kuvattiin, paitsi että mitkä tahansa amino- : ryhmät siinä voidaan suojata aminoa suojaavilla ryhmillä: E on COOH, CSOH, ,: SOOH, S020H tai sen aktivoitu johdannainen; ja F on NHR3 tai NPgR3, jossa R3 .: on kuten edellä kuvattiin ja Pg on aminoa suojaava ryhmä.
: 25 Edullisia monomeerisyntoneita ovat aminohapot, joiden kaava on (VII): 13 110694
L
v HOOC .N' NH2 R7 (VII) tai sen aminosuojattuja ja/tai aminoterminaalisia aktivoituja johdannaisia, jossa L valitaan ryhmästä, joka koostuu vedystä, fenyylistä, heterosykleistä, luonnollisesti 5 esiintyvistä nukleoemäksistä ja ei-luonnollisesti esiintyvistä nukleoemäksistä ja nii- • > · , . .71 den suojatuista johdannaisista; ja R valitaan itsenäisesti ryhmästä, joka koostuu vedystä ja luonnollisesti esiintyvien alfa-aminohappojen sivuketjuista. Erityisen edullisia ovat sellaiset syntonit, joiden kaavan on (4), jossa R7 on vetyjä L valitaan ryhmästä, joka koostuu nukleoemäksistä tyrniini (T), adeniini (A), sytosiini (C), 10 guaniini (G) ja urasiili (U) ja niiden suojatuista johdannaisista.
Sellaisten PNA:iden tuotto on kuvattu yksityiskohtaisesti PCT-hakemuksessa nro PCT/EP92/01220, johon edellä on viitattu.
Tähän keksintöön sisältyy testipakkaus käytettäväksi suoritettaessa nukleiinihap-. . : poamplifikaatioreaktio, joihin sisältyy alukkeiden lukuisuus mainittua amplifikaa- 15 tiota varten ja ainakin 1 nukleiinihappoanalogi, jonka sekvenssi on komplementaari-. · nen sekvenssin kanssa yhdessä mainituissa alukkeissa tai amplifloitavan kohdenuk- V leiinihapposekvenssin kanssa käyttämällä alukkeita mainitussa amplifikaatioreak- ; tiossa.
Sellaisessa testipakkauksessa voi lisäksi olla polymeraasi tai ligaasi käytettäväksi . : 20 mainitussa amplifikaatioreaktiossa tuottamaan mainittujen alukkeiden pidentyminen *. tai ligaatio, esim. DNA-polymeraasi, kuten Taq-polymeraasi.
Käytettäväksi "3SR"-tyyppisessä reaktiossa testipakkauksissa voi lisäksi olla mikä tahansa tai useampi käänteistranskriptaasista, RNA-polymeraasista ja nukleaasista, ’ , kuten RNaasi H.
: 25 Yleisesti sellaisissa testipakkauksissa voi lisäksi olla nukleotidejä (joitakin tai kaik ki, dTTP, dCTP, dATP ja dGTP), joista yksi tai useampi voi olla leimattu millä tahansa tunnetulla tai sopivalla tavalla, esim. radioleimattu. Sellaisten leimojen ha- h 110694 vaitsemiseen tarvittavat reagenssit voivat olla mukana. Testipakkauksissa voi lisäksi olla yksi tai useampi puskuri, suoloja, stabiloivia aineita ja nukleiinihapon tunnis-tamisaineita. Nämä voivat olla reagensseja, jotka tunnistavat tarkoin määritetyt sekvenssit tai reagensseja, jotka tunnistavat nukleiinihappoja ei-sekvenssi ominais-5 tavalla, esimerkkinä edellisestä ollessa oligonukleotidit tai PNA-tyyppiset nukle-iinihappoanalogit, mahdollisesti sisältäen havaittavia leimoja ja jälkimmäisten ollessa vasta-aineita nukleiinihapoille.
Sopivia leimoja käytettäväksi keksinnössä ovat radioisotooppileimat, entsyymi-leimat, biotiini, spin-merkitsijät, fluoroforit, kemiluminointileimat, antigeenileimat 10 ja vasta-aineleimat.
Testipakkauksissa voi lisäksi olla reagenssit, joilla suoritetaan positiivinen kontrol-likoe, joihin sisältyy mallisäie amplifikaatiolle käyttämälllä mainittuja alukkeita tuottamaan amplifikaatiotuote, joka on erilainen kuin mainitun nukleiinihap-poamplifikaatioreaktion.
15 Testipakkauksessa voi lisäksi olla reagenssit käytettäväksi sekvenssoitaessa nukle-iinihappoamplifikaatiotuote, esim. polymeraasi, kuten Taq-polymeraasi ja yksi tai useampi didesoksinukleotidi.
Seuraavissa esimerkeissä kaikilla PNA:illa on runko, joka on johdettu kaavan VII : ’: mukaisista syntoneista ja jokaisessa tapauksessa L on yksi luonnollisesti esiintyvistä : 20 nukleoemäksistä, joita esitetään tavallisella tavalla A:lla, C:llä, G:llä tai T:llä. Käy- . tetty nimistö seuraa edellä viitatussa PCT nro PCT/EP92/01220:ssa käytettyä.
1 f t > t : * : Keksintöä kuvataan lisää seuraavissa ominaisissa esimerkeissä, joissa on viitattu !: * liitteenä oleviin piirroksiin, joissa:
Kuvio 1 on autoradiografia geelistä, joka esittää polymeraasin välittämän alukkeen ; 25 PNA:lla tapahtuvan pidentymisen inhibiitiota; \..: Kuvio 2 on etidiumbromidigeeli, joka esittää PCR-reaktioiden selektiivisen blokka- uksen, jonka PNA, joka tekee eron sekvenssien välillä, jotka eroavat yhdellä emäs-··’ parilla, aiheuttaa; >: Kuvio 3 on etidiumbromidigeeli, joka esittää lisäesimerkin PNA:n ohjaamasta . . : 30 PCR:n inhibitiosta;
Kuvio 4 on etidiumbromidigeeli, joka esittää PNA:n ohjaaman PCR-inhibition kohdissa PCR-mallisäiettä, joka menee päällekkäin alukkeen kohteena olevan kohdan 15 110694 kanssa tai ovat ulokkeina vaihtelevilla määrillä alukkeen kohteena olevasta kohdastapa
Kuvio 5 on etidiumbromidigeeli, joka esittää PNA:n, joka on komplementaarinen yhden alukkeen kanssa, aiheuttaman täydellisen PCR-reaktion inhibition; ja 5 Kuvio 6 on etidiumbromidigeeli, joka esittää esimerkin 6 tuloksen valaisten lisää PCR-inhibitiota tunnistamaan yhden emäksen muutos.
Esimerkki 1
Alukkeen pidentymisen estäminen PNA:lla
Inkuboitiin 0,5 μg plasmidia (Bluescript, Stratagene, Inc), jossa oli 10 tymidiini-10 jäännöksen sekvenssi insertoituna (pTIOKS), joka oli pilkottu restriktioendonukle-aasilla PvuII, ja 0,1 pg "käänteisaluketta" (5-AAC AGC TAT GAC CAT G), johon lisättiin 1 μΐ 10 x konsentroitua puskuria (E. coli Klenow DNA -polymeraasia varten: 100 mM Tris-HCl, 100 mM Mg-Cl2, 50 mM NaCl, 1 mM ditiotreitoli (DDT), pH 7,5; Taq DNA-polymeraasia varten: 100 mM Tris-HCl, 15 mM MgCl2, 500 mM 15 NaCl, 1 mg/ml gelatiini pH 8,3) ja 6 μΐ H20 ja 100 ng Ai0 PNA:ta, joka on komplementaarinen Tio-insertin kanssa plasmidissa, 10 min 90 °C:ssa, 60 min 37 °C:ssa ja sitten jäähdytettiin 20 °C:een. Sitten lisättiin 1 μΐ 10 mM DTT:tä, 1 μΐ 10 μΜ dCTP-, dGTP-, dTTP-liuosta ja 1 pCi a32P-dATP:tä ja 1 U sopivaa DNA-poly-’’ ! meraasia. 5 min kuluttua 20 °C:ssa lisättiin 2 μΐ 1 mM dATP-, dCTP-, dGTP- ja ; ’ 20 dTTP-liuosta ja inkubointia jatkettiin 15 min 37 °C:ssa E. coli DNA-polymeraasille ’’ tai 60 °C:ssa Taq-polymeraasille. Sen jälkeen DNA saostettiin lisäämällä 50 μΐ eta- ; : ' nolia, 2 % (w/v) kaliumasetaattia ja analysoitiin elektroforeesilla 8 %:ssa (w/v) ak- II* ryyliamidi/7 M urea sekvenssoivassa geelissä, minkä jälkeen oli autoradiografia.
: : Tulos esitetään kuviossa 1, linjojen vastatessa seuraavaa: , : 25 Linja 1: E. coli DNA-polymeraasi Klenow-ffagmentti, ei PNA:ta.
,,,: Linja 2: kuten linja 1, mutta PNA:n läsnäollessa.
; : Linja 3: Taq-polymeraasi, ei PNA:ta.
| >; Linja 4: Taq-polymeraasi PNA:n läsnäollessa.
:, ‘ * · Linja 5: kontrolli plasmidin kanssa, joka on pilkottu Bam-H 1 :llä.
16 110694
Kaaviokuvasta voidaan nähdä, että A10 PNA:n pitäisi hybridisoitua mallisäie DNA:n yhteen juosteeseen, joka on BamHI-kohdan vieressä. Täten, jos Aio blokkaa alukkeen polymeeripidentymisen, tuotteita pitäisi tuottaa, jotka ajettuna geelissä Bam Hl pilkkomistuotteiden kanssa, jotka nähdään linjassa 5. Jos PN A ei tarkista 5 polymeraasipidentymistä, pitäisi saada pidempiä pidennystuotteita. Voidaan nähdä, että jokaisessa PNA:ta sisältävässä linjassa (2 ja 4) tuotetaan odotettu juova Bam Hl asemassa. PNA:n puuttuessa nähdään pidempi tuote, joka on pääpiirteittäin kokonaan pois PNA/Taq-linjassa (linja 4), osoittaen Taq:n täydellisen blokkaamisen PNA:lla.
10 Esimerkki 2
Yhden emäksen mutaation havaitseminen PCR DNA-amplifikaation PNA kohdistetulla inhibitiolla
Plasmidi pTlOKS rakennettiin kloonaamalla komplementaariset oligonukleotidit 5'-GATCCTioG ja 5'-GATCCAioG vastaaviin juosteisiin Bluescript KS+-plasmidin 15 (Stratagene) BamHI-kohdassa. Plasmidi pT9CKS rakennettiin kloonamalla komplementaariset oligonukleotidit 5'-TCGACT5CT4G ja 5-TCGACA4GA5G pUC19:n Sali-kohtaan.
Polymeraasiketjureaktio (PCR) suoritettiin, jossa oli 25 ng plasmidia 1, 25 ng plas-midia 2 DNA:ta, 1,25 mM dATPitä, 1,25 mM dCTP:tä, 1,25 mM dGTP:tä, ,' 20 1,25 mM dTTP:tä, 0,2 pg aluke l:tä, 0,2 pg aluke 2:ta ja 2,5 pg PNA:ta 50 piissä puskuria (10 mM Tris-HCl, 3,5 mM MgCl2, 50 mM KC1, 0,1 mg/ml gelatiini, : .·, pH 8,3). Näyte kuumennettiin 94 °C:een 5 min, jäähdytettiin 65 °C:een, jossa vai- I » / heessa lisättiin 1 U Taq DNA-polymeraasia (Boehringer Mannheim). Sen jälkeen ; ajettiin 30 lämpötilakierrosta (94 °C (2 min), 40 °C (3 min) ja 65 °C (2 min)).
25 Saatu DNA analysoitiin elektroforeesilla 6 %:ssa (w/v) polyakryyliamidigeelissä *.· ajettuna TBE-puskurissa (90 mM Tris-boraatti, 1 mM EDTA, pH 8,3) ja DNA teh- • ’. tiin näkyväksi värjäämällä etidiumbromidilla.
: : Koe suoritettiin, kuten esimerkissä 1 kuvattiin käyttämällä "M13-aluketta" alukkee- ; na 1 ja "käänteisaluketta" alukkeena 2. Tuloksena oleva geeli nähdään kuviossa 2.
‘ . 30 Käytettiin seuraavia plasmideja ja PNA:ta: '·.'·· Linja 1: pT9CKS (pBluescriptKS+, jossa dA5GA4/dT4CT5 PNA-kohde kloonattiin
Sal I kohtaan) ja pTlOKS (pBluescriptKS+, jossa dAio/dT]0 PNA-kohde kloonattiin Bam Hl kohtaan), ei PNA:ta.
17 11069 s-
Linja 2: kuten linja 1, mutta PNA:n kanssa H-T5CT4LysNH2.
Linja 3: kuten linja 1, mutta PNA:n kanssa H-T10LysNH2.
Linja 4: pTlOKS ja pT9CKS PNA:n kanssa H-T5CT4LysNH2.
Linja 5: pTlOKS ja pT9CKS PNA:n kanssa H-T10LysNH2.
5 Linjassa 1 nähdään selvästi kaksi PCR-tuotetta, yksi kummastakin plasmidista. pTIOK:n amplifikaatio antaa 118 bp fragmentin ja pT9CKS:n amplifikaatio antaa 221 bp fragmentin.
Plasmidissa pT9CKS on kohdesekvenssi PNA T5CT4LysNH2:ta varten. Linjassa 2 ei nähdä juovaa tälle plasmidille osoittaen PCR:n inhibition PNA:lla.
10 Esimerkki 3
Lisää osoitusta PNA:n ohjaamasta PCR-inhibitiosta PNA Tio-LysNH2 syntetisoitiin kuten Egholm, M., Buchardt, O, Nielsen, P.E. ja Berg, R.H. (1992), J. Amer. Chem. Soc. 114, 1895-1897 ja Engholm, M., Buchardt, O, Nielsen, P.E. ja Berg, R.H. (1992), J. Amer. Chem. Soc. 114, 9677-9678. Plas-15 midit pTlOKS ja pT9CKS kuvattiin esimerkissä 2. Kontrolliplasmidi rakennettiin kloonaamalla 99 bp PCR-fragmentti (jossa ei ole kohdekohtia millekään PNA:lle, joita käytetään tässä esimerkissä) bluescript KS+-plasmidin Smal kohtaan. Käyttä-' mällä standarditekniikoita eristettiin plasmideja rekombinantti E. coli JM103:n vali- ’ ‘ tuista klooneista, puhdistettiin tasapainotiheyssentrifugaatiolla CsCl-gradienteissa ja ’* 20 sekvens soitiin didesoksimenetelmällä.
Seuraavia oligonukleotidialukkeita käytettiin PCR-reaktioissa: käänteisaluke (5-CACACAGGAAACAGCTATGAC) ja eteenpäin oleva aluke (5'-GTAAAACGAC-. GGCCAGT). PCR-amplifikaatiot suoritettiin 50 μΐ tilavuudessa, jossa oli 1 ng jo kaista plasmidia, 0,2 μΜ jokaista aluketta, 200 μΜ dNTP:tä, 10 mM Tris-HCl:ää, . ·: 25 pH 8,3 (25 °C:ssa), 10 mM KCl:ää ja 3 mM MgCl2:a.
• ··* PCR-reaktiot peitettiin kahdella pisaralla parafiiniöljyä ja inkuhoitiin 90 °C:ssa 2 ! ‘ min ennen kuin amplifikaatiomenetelmä aloitettiin lisäämällä 3 U stoffel -polyme- ”: raasia (Perkin Elmer Cetus). LEP-amplifikaatiokonetta (IgG Biotech) käytettiin kai- V j kissa kokeissa ja pCR-kierrosprofiilit olivat 96 °C, 2 min - 55 °C, 3 min - 35 °C, 1 30 min - 65 °C, 2 min - 35 kierrosta.
110694 18
Jotta varmistettiin, että PNA/DNA-kompleksien muodostuminen edelsi PCR aluk-keen sitomista ja pidentymistä, normaalia 3 vaiheen PCR-kierrosta laajennettiin erillisellä PNA-hybridisaatiovaiheella lämpötilassa, joka on reilusti PCR-alukkeiden Tm:n yläpuolella.
5 Kuvio 3 osoittaa kokeellisen asetelman ja PCR-inhibiition tuloksen PNA Ti0-LysNH2:n läsnä ollessa. Käytettiin kahta edellä kuvattua plasmidimallisäiettä, nimittäin pTlOKS plasmidi, joka ohjaa 246 bp:n fragmentin, jossa on Aio kohde-kohta, amplifikaatiota, ja kontrolliplasmidia pCKS, joka ohjaa 329 bp:n ei-kohde-fragmentin amplifikaatiota. Kun PNA T10-Lys-NH2 puuttuu (linja 2), ohjaa plasmidi 10 pTlOKS odotetun 246 bp:n PCR-fragmentin synteesiä. 3,2 μΜ PNA Ti0-LysNH2:n läsnä ollessa ei kuitenkaan tuoteta tuotetta (linja 3-5). Tuotteen puuttuminen ei johdu PNA Ti0-LysNH2:n ei-spesifisestä inhibitorisesta vaikutuksesta PCR-reaktioon, koska PNA T10-LysNH2 ei inhiboi odotetun 329 bp:n fragmentin amplifikaatiota pCKS-kontrolliplasmidista (linja 1). Täten on nähty että T10-LysNH2 voi estää sen 15 samaa alkuperää olevan kohde DNA:n amplifikaation sekvenssissä spesifisellä tavalla.
Esimerkki 4
Osoitus, että PNA- ja PCR-alukekohdekohtien suhteellinen asema voidaan muuttaa ilman, että vaikutetaan inhibiitioon » > I . » ' ! » . : 20 Tämä esimerkki esittää saadut vaikutukset, jossa PNA-kohdekohta (1) sijaitsee » PCR-alueen keskellä, (2) sijaitsee välittömästi PCR-alukekohdan vieressä tai (3) I » · . ^ menee päällekkäin yhden PCR-alukekohtien kanssa. On perustavaa laatua olevia I N » ’", * eroavaisuuksia inhibition alla olevien mekanismien välillä näissä kolmessa tapauk- ; sessa. Kun PNA kohdekohta sijaitsee kaukana PCR-alukkeen kohdista, odotetaan I * 25 inhibition toimivan estämällä polymeraasin läpiluku. Päinvastoin, inhibition odotetaan toimivan alukkeen poissulkemisella, kun PNA ja PCR alukekohdekohdat me- » '·! nevät päällekkäin. Lopuksi, kun PNA kohde sijaitsee PCR-alukekohdan vieressä, inhibitio toimii todennäköisesti joko estämällä polymeraasin pääsyn PCR-alukkee-seen ja/tai estämällä alukkeen pidentymisen aloituksen. Kaikissa kolmessa tapauk- t t !/ 30 sessa voidaan saada tehokas inhibitio PNA Ti0-LysNH2:lla, kuten kuviossa 4 esite- t ______ ;* tään. Tässä esimerkissä PCR:hen hyökätään käyttämällä vastaavissa ajoissa kolmea erilaista eteenpäin olevaa aluketta, joihin viitataan "eteenpäin alukkeina", "SK alu-‘.i ke" ja "AIO aluke". Nämä ovat eteenpäin olevia alukkeita (5'-GTAAAACGA- CGGCCAGT), T10 aluke (5'-CATCCTTTTTTTTTTG) ja SK-aluke (5'-TCTA-35 GAACTAGTGGATC). Plasmidissa pTIO KS, jota on käytetty tässä esimerkissä ,9 110694 (ks. esimerkki 2 yksityiskohtia varten), sijaitsee eteenpäin olevan alukekohdekoh-dan 3'-pää 101 bp myötävirtaan AIO kohteesta, SK-alukkeen 3-'pää sijaitsee välittömästi myötävirtaan AIO kohteesta ja AIO aluke ulottuu AIO kohdekohdan yli, mukaanlukien 5 ja 1 bp 5'-ja 3'-päissä vastaavasti. Linjat 1-2: esittävät pT10KS-plas-5 midin amplifikaation käänteis- ja eteenpäin alukkeiden puuttuessa (1) tai 3,2 μΜ (2) PNA T io-LysNH2:n läsnä ollessa. Linjat 3-4: esittävät pT10KS:n amplifikaation käänteis-ja SK-alukkeiden puuttuessa (3) tai 3,2 μΜ PNA Ti0-LysNH2:n läsnä ollessa (4). Linjat 7 ja 8: esittävät pTlOKS-plasmidin amplifikaation käänteis-ja T10-alukkeiden puuttuessa (7) tai 3,2 μΜ PNA Ti0-LysNH2:n läsnä ollessa (8). PCR-10 olosuhteet olivat 96 °C, 2 min - 55 °C, 3 min - 35 °C, 1 min - 65 °C, 2 min - 35 kierrosta. PNA T10-LysNH2 estää PCR-tuotteen muodostumisen mallisäikeestä laajalle ulottuvan PNA- ja PCR-alukekohdekohtien kanssa (linja 2), vieressä olevan PNA- ja PCR-alukekohdekohtien kanssa (linja 4) ja päällekkäin menevien PNA- ja PCR-alukekohdekohtien kanssa (linja 8).
15 Esimerkki 5
Suoritettiin PCR-reaktio yleisesti kuten esimerkissä 2 kuvattiin PNA komplementa-risuuden yhteen alukkeeseen puuttuessa ja läsnäollessa.
Tulokset nähdään kuviossa 5. Linjassa 1 nähdään odotettu PCR-tuote. Linjassa 2 PCR-reaktion osoitetaan olevan kokonaan inhibitoitunut.
* * ; 20 Esimerkki suoritettiin käyttämällä "M13-aluketta" alukkeena 1 ja GATCC Ti0G:tä alukkeena 2. Kohdeplasmidi oli pTlOKS. Jokaisen 30 kierroksen toisessa faasissa >, käytetty lämpötila oli 35 °C 40 °C:een sijasta.
f Γ Esimerkki 6 * PCR-inhibitio PNA-sekvenssin seoksen kanssa i 25 Edellä olleissa esimerkeissä käytetyissä PNA:ssa oli vain pyrimidiinijäännöksiä ja / on osoitettu muodostavan triplettejä niiden kohdesekvenssien kanssa. Täten, jotta osoitetaan periaatteen yleisyys, suoritettiin sarja kokeita PNA:n sekvenssien seok- » f sen kanssa muodostaen standardeja Watson-Crick-duplekseja niiden kohde-DNA:n ! ‘ kanssa. Kuvio 6 osoittaa kokeellisen järjestelyn ja tuloksen yhden emäksen mutaa- ': 30 tioanalyysistä kahden sekoitesekvenssi PNA:n kanssa, jotka eroavat yhdellä ainoal- j la nukleotidillä (PNA-A: H-TTCCGGTTGCC-NH2 ja PNA-B: Gly-TTCCGGCTG- CC-NH2). Kahta mallisäiettä käytetään ("A" ja "B"), joissa on vastaava pistemutaa-tio. Tähän kokeeseen sisältyy kolme oligonukleotidialuketta. Eteenpäin ja kään- 20 110694 teisoligopari, joka tuottaa 750 bp PCR-fragmentin ja degeneroituneen alukkeen, joka on kohdistettu aluetta vastaan, jossa on pistemutaatio. Yhdessä eteenpäin alukkeen kanssa degeneroitunut alue ohjaa 150 bp fragmentin amplifikaation käyttämällä joko A- tai B-alleelia mallisäikeenä. PNA:t kohdistetaan aluetta vastaan, jossa on 5 pistemutaatio ja kiristyksen odotetaan täten toimivan alukkeen poissulkemisella.
Tässä esimerkissä jokainen PCR-reaktio (50 μΐ) sisältää 200 μΜ dNTP:tä, 10 mM Tris-HCl:ää pH 9,9 (20 °C), 50 mM KCl:ää, 1,5 mM MgCl2:a, 0,01 % gelatiinia, 0,1 % Triton X-100:aa, 1 U supertag-entsyymiä (Stratagene), 1 ng alleelispesifistä plasmidia, 10 pmol degeneroivaa aluketta, joka on kohdistettu aluetta vastaan, jossa 10 on mutaatio, 10 pmol eteenpäin aluketta, 10 pmol käänteisaluketta ja PNA:t, kuten osoitettiin. Kuviossa linjat ovat seuraavat:
Linja 1: A-alleeli ja ei PNA:ta. Linja 2: A-alleeli ja 10 μΜ PNA-A:ta. Linja 3: A-alleeli ja 10 μΜ PNA-B:tä. Linja 4: B-alleeli ja ei PNA:ta. Linja 5: B-alleeli ja 10 μΜ PNA-A:ta. Linja 6: B-alleeli ja 10 μΜ PNA-B:tä. PCR-olosuhteet olivat 15 96 °C 1 min - 60 °C, 2 min - 40 °C, 30 sek - 60 °C, 2 min - 30 kierrosta.
Kun A-alleelia käytetään mallisäikeenä, sekä 750 bp (sisäinen PCR kontrolli) että 150 bp fragmentti (alleelin diagnoosi) tuotetaan PNA-A:n puuttuessa (linja 1). Kun reaktiossa on PNA-A, kuitenkin vain 750 bp PCR kontrollifragmentti tuotetaan (lin-ja 2). Päinvastoin, sekä 750 bp että 150 bp fragmentit tuotetaan PNA-B:n läsnä oi- • · · · : 20 lessa (linja 3). Vaihtamalla mallisäie B-alleeliin, ovat tulokset päinvastaiset. Täten PNA-B:n läsnäolo inhiboi 150 bp fragmentin (linja 6) tuoton, kun taas PNA-A:n ; läsnäolo ei (linja 5). Täten me päättelemme, että molemmat sekoitetut sekvenssi PNA:t (A ja B) kykenevät inhiboimaan niiden samaa alkuperää olevan PCR-tuot-•;;; teen pistemutaatiotarkkuudella.
25 • · • 1 » • · t • i • · · • » · M » · • » • · · · « » • ·
Claims (23)
1. Menetelmä nukleiinihappoamplifikaatiomenetelmän inhiboimiseksi, jossa menetelmässä kummassakin kaksijuosteisen kohdenukleiinhapon juosteessa on alue, jota käytetään mallisäikeenä yhdelle tai useammalle alukkeelle, jo(t)ka on tai 5 ovat pidennetyt tai liitetyt yhteen muodostamaan toinen mallisäie, joka on komplementaarinen mainitun mallisäikeen kanssa, tunnettu siitä, että tuotetaan nukleiini-happoanalogi, joka on riittävän komplementaarinen mainitun mallisäikeen tai mainitun alukkeen sekvenssin kanssa hybridisoitumaan sen kanssa, ja että mainittu nuk-leiinihappoanalogi hybridisoituu riittävän voimakkaasti vastaavaan mallisäikeeseen 10 tai alukkeeseen blokkaamaan aluke-mallisäie-hybridisaation tai blokkaamaan alukkeen pidentymisen tai alukkeen yhteenliittymisen menetelmän olosuhteissa.
2. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att amplifikationsproceduren är en PCR- eller LCR-procedur. ' 3. Förfarande enligt patentkrav 1 eller 2, kännetecknat av att amplifikationspro- : 30 ceduren utförs i avsaknad av nämnda nukleinsyraanalog, sä att en önskad niva av ! amplifikationsprodukter samlas och nämnda nukleinsyraanalog sedan tillsätts. 25 110694
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että amplifikaa-tiomenetelmä on PCR- tai LCR-menetelmä.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tun-15 nettu siitä, että amplifikaatiomenetelmä suoritetaan mainitun nukleiinihappoanalo- gin puuttuessa, jotta kerätään toivottu taso amplifikaatiotuotetta ja mainittu nukleii-nihappoanalogi lisätään sitten.
4. Förfarande enligt patentkrav 3, kännetecknat av att nämnda nukleinsyraana-log hybridiseras med nämnda amplifikationsprodukt.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu nuk- j leiinihappoanalogi hybridisoituu mainitun amplifikaatiotuotteen kanssa. • · · • · • · !*·.. 20 5. Patenttivaatimuksen 1 tai patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tun- I nettu siitä, että mainitun tyyppisessä amplifikaatiomenetelmässä käytettävää laitetta käsitellään liuoksella, jossa on mainittu nukleiinihappoanalogi hybridisoimaan mai-. ·: ·. nittu analogi mihin tahansa amplifikaatiotuotteeseen, jota voi olla läsnä kontaminaa- tiona, ja jossa laite pestään sen jälkeen ja käytetään mainitussa amplifikaatiomene-. . 25 telmässä, minkä tahansa amplifikaatiotuotteen, joka on läsnä alunperin kontami-nanttina mainitussa laitteessa, amplifikaation ollessa estynyt mainitulla hybridisaa-• · · * tiolla mainittuun analogiin.
5. Förfarande enligt patentkrav 1 eller 2, kännetecknat av att apparaten som an-vänds i en amplifikationsprocedur av nämnda typ behandlas med en lösning, som 5 innehäller nämnda nukleinsyraanalog för att hybridisera nämnda analog till vilken som heist amplifikationsprodukt som kan vara närvarande i form av kontamination, och att apparaten sedan tvättas och används i nämnda amplifikationsprocedur, var-vid amplifikation av nägon amplifikationsprodukt som ursprungligen är närvarande som kontamination i nämnda apparat förhindras av nämnda hybridisering tili nämn-10 da analog.
6. Förfarande för att förhindra en nukleinsyraamplifikationsprodukt att fungera som templat i en senare amplifikationsprocedur, kännetecknat av att förfarandet innefattar hybridisering av en nukleinsyraanalog tili nukleinsyraamplifikationspro-dukten, varvid analogen med den bildar en hybrid, som är stabil under efterföljande 15 amplifikationsprocedurförhällanden.
6. Menetelmä nukleiinihappoamplifikaatiotuotteen estämiseksi toimimasta mallisäikeenä myöhemmässä amplifikaatiomenetelmässä, tunnettu siitä, että menetel-" “ · 30 mään sisältyy se, että hybridisoidaan nukleiinihappoamplifikaatiotuotteeseen nukle-: \: iinihappoanalogi, joka muodostaa sen kanssa hybridin, joka on stabiili myöhemmin tulevan amplifikaatiomenetelmän olosuhteissa. 110694 22
7. Förfarande för att förhindra en nukleinsyreamplifikationsprodukt som kan vara närvarande i omgivningen att fungera som kontaminerande templat i en senare nukleinsyraamplifikationsprocedur, kännetecknat av att förfarandet innefattar be-handling av omgivningen med en nukleinsyraanalog, som tillsammans med nämnda 20 amplifikationsprodukt bildar en hybrid, som är stabil under efterföljande amplifika-tionsprocedurförhällanden.
7. Menetelmä minkä tahansa nukleiinihappoamplifikaatiotuotteen, jota voi olla läsnä ympäristössä, estämiseksi toimimasta kontaminoivana mallisäikeenä myöhemmässä nukleiinihapon amplifikaatiomenetelmässä, tunnettu siitä, että menetelmään sisältyy käsitellä ympäristöä nukleiinihappoanalogilla, joka muodostaa maini- 5 tun amplifikaatiotuotteen kanssa hybridin, joka on stabiili mainitun myöhemmin tulevan amplifikaatiomenetelmän olosuhteissa.
8. Förfarande för att detektera närvaro eller ffänvaro av en mälnukleinsyrasek- ‘’ vensens, innefattande utförande av en amplifikationsprocedur, i vilken varje sträng i • · « en tvästrängad nukleinsyra har ett omräde som används som templat innefattande 25 den del av nämnda nukleinsyra i vilken nämna malsekvens befinner sig, om närvarande, amplifieras med hybridisering en eller flera primers till nämnda templat samt att förlänga eller sammanfoga nämnda primers för att bilda ett andra templat som är :‘ \ komplementär med nämnda modellfiber, kännetecknat av att en nukleinsyraanalog ästadkoms, som är komplementär med nämnda malsekvens och hybridiseras med · 30 nämnda templat tillräckligt kraftigt för att blockera nämnda amplifikationsprocedur . da nämnda malsekvens är närvarande, men inte i annat fall. • 9. Förfarande enligt patentkrav 8, kännetecknad av att avsaknad av var och en > I _____ av ett flertal sekvenser inom en mälnukleinsyrasekvens mellan ett par av primer- bindpunkter detekteras i tur och ordning genom att utföra en serie PCR-amplifika- 110694 26 tionsprocedurer under användning av samma primers och genom att ästadkomma respektive nukleinsyraanalog i varje nämnda procedur som är komplementär med respektive sekvens av nämnda flertal för att hybridiseras med denna i syfte att blockera nämnda amplifikationsprocedur da nämnda motsvarande sekvens är närva-5 rande, men inte i annat fall.
8. Menetelmä kohteena olevan nukleiinihapposekvenssin läsnäolon tai puuttumisen havaitsemiseksi, johon menetelmään sisältyy se, että suoritetaan amplifikaatio-menetelmä, jossa kummassakin kaksijuosteisen nukleiinhapon juosteessa on alue, 10 jota käytetään mallisäikeenä mukaan luettuna se osa mainitusta nukleiinihaposta, jossa mainittu kohteena oleva sekvenssi sijaitsee, jos läsnä, amplifioidaan hybridi-soimalla yksi tai useampi alukkeista mainittuun mallisäikeeseen ja mainittujen aluk-keiden pidentyminen tai yhteenliittäminen muodostamaan toinen mallisäie, joka on komplementaarinen mainitun mallisäikeen kanssa, tunnettu siitä, että annetaan 15 nukleiinihappoanalogi, joka on komplementaarinen mainitun kohteena olevan sekvenssin kanssa ja hybridisoituu mainitun mallisäikeen kanssa riittävän voimakkaasti blokkaamaan mainitun amplifikaatiomenetelmän, kun mainittu kohteena oleva sekvenssi on läsnä, mutta ei muuten.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että jokaisen lu-: 20 kuisien sekvenssien puuttumisen läsnäolo kohteena olevassa nukleiinihapposek- venssissä alukkeen sitomiskohtien parin välillä määritetään vuorollaan suorittamalla !*·.. sarja PCR-amplifikaatiomenetelmiä käyttämällä samoja alukkeita ja antamalla vas- taava nukleiinihappoanalogi jokaisessa mainitussa menetelmässä, joka on komple- «· · · mentaarinen vastaavan kanssa mainituissa sekvenssien paljoudessa hybridisoitu-.···. 25 maan sen kanssa blokkaamaan mainittu amplifikaatiomenetelmä, kun mainittu vastaava sekvenssi on läsnä, mutta ei muutoin. :.'*i 10. Patenttivaatimuksen 8 tai 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mukaan luettuna kontrollina on toinen nukleiinihapposubstraatti, joka kykenee amplifioi-: maan mainitulla amplifikaatiomenetelmällä käyttämällä samoja alukkeita, joka lä- 30 pikäy amplifikaation tuottamaan tuotteen, joka on erilainen kuin kohteena olevan sekvenssin amplifikaatiotuote. : 11. Menetelmä asymmetrisen nukleiinihappoamplifikaatiomenetelmän suorittami seksi, tunnettu siitä, että menetelmässä kummassakin kaksijuosteisen kohteena olevan nukleiinhapon juosteessa on alue, jota käytetään mallisäikeenä alukkeelle, 35 jota pidennetään muodostamaan toinen mallisäie, joka on komplementaarinen mai- 23 'Πϋ6'>·. nitun mallisäikeen kanssa, jolloin lukuisten amplifikaatiokierrosten jälkeen lisätään nukleiinihappoanalogi, joka hybridisoituu yhteen alukkeista riittävän voimakkaasti inhiboimaan mainitun alukkeen hybridisaatio sen kohteeseen reaktio-olosuhteissa ja mainittua menetelmää jatketaan sitten lukuisilla lisäkierroksilla.
10. Förfarande enligt patentkrav 8 eller 9, kännetecknat av att som kontroll inne-fattas ett andra nukleinsyrasubstrat som förmär amplifieras med nämnda amplifikationsprocedur med användning av samma primers och genomgär amplifikation för att producera en produkt som skiljer sig frän mälsekvensens amplifikationsprodukt. 10
11. Förfarande för att utföra ett asymetriskt nukleinsyraamplifikationsprocedur, kännetecknat av att varje sträng i en tvästrängad mälnukleinsyra har ett omräde som används som templat för en primer som förlängs för att bilda ett andra templat som är komplementärt med nämnda templat varvid efter ett antal amplifikationscyk-ler en nukleinsyraanalog tillsätts som hybridiseras tili en av primers tillräckligt kraf-15 tigt för att inhibera hybridisering av nämnda primer till dess mäl under reaktions-förhällanden, och nämnda procedur fortsätts sedan genom ett antal ytterligare cyk-ler.
12. Förfarande för att inhibera polymerasförmedlad förlänging av en primer som ; · · hybridiserats tili ett nukleinsyratemplat, kännetecknat av att under hybridiserings- '. '. 20 förhällanden ästadkoms en nukleinsyraanalog som bildar en stabil hybrid med pri- : ' · mem eller med templatet pä primerstället eller nedströms frän primerstället. ♦ ·
12. Menetelmä polymeraasin välittämän alukkeen, joka on hybridoitu nukleiini- happomallisäikeeseen, pidentymisen inhiboimiseksi, tunnettu siitä, että tuotetaan hybridisaatio-olosuhteissa nukleiinihappoanalogi, joka muodostaa stabiilin hybridin alukkeen kanssa tai mallisäikeen kanssa alukekohdassa tai myötävirtaan alukekoh-dasta.
13. Testförpackning att användas vid utförandet av en nukleinsyraamplifikations-reaktion med ett förfarande enligt nägot av patentkraven 1-12, kännetecknat av att den innefattar ett flertal primers för nämnda amplifikation och ätminstone en nukle- 25 insyraanalog som har en sekvens som är komplementär med en sekvens hos en av nämnda primers eller tili en mälnukleinsyrasekvens som skall amplifieras med användning av nämnda primers i nämnda amplifikationsreaktion.
13. Testipakkaus käytettäväksi nukleiinihappoamplifikaatioreaktion suorittami sessa missä tahansa patenttivaatimuksessa 1-12 kuvatun menetelmän mukaisesti, tunnettu siitä, että siihen sisältyy lukuisia alukkeita mainittua amplifikaatiota varten ja ainakin yksi nukleiinihappoanalogi, jolla on sekvenssi, joka on komplementaarinen sekvenssin kanssa yhdessä mainituista alukkeista tai kohteena olevan nuk-15 leiinihapposekvenssin kanssa, joka on tarkoitus amplifioida käyttämällä mainittuja alukkeita mainitussa amplifikaatioreaktiossa.
14. Testförpackning enligt patentkrav 13, kännetecknad av att den vidare innefattar en polymeras eller en ligas att användas i nämnda amplifikationsreaktion för 30 att ästadkomma förlängning eller ligering av nämnda primers.
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että siihen lisäksi sisältyy polymeraasi tai ligaasi käytettäväksi mainitussa amplifikaatioreaktios-: : sa tuottamaan mainittujen alukkeiden pidentyminen tai ligaatio. • 20 15. Patenttivaatimuksen 13 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että siihen li- • ** säksi sisältyy mikä tahansa tai useampi käänteistranskriptaasi, RNA-polymeraasi ja : nukleaasi.
15. Testförpackning enligt patentkrav 13, kännetecknad av att den vidare inne- • fattar en eller flera omvända transkriptaser, RNA-polymeraser och nukleaser. 110694 27
16. Testförpackning enligt nägot av patentkraven 13-15, kännetecknad av att den vidare innefattar nukleotider.
16. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 13-15 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että siihen lisäksi sisältyy nukleotidejä. • ·
17. Testförpackning enligt patentkrav 16, kännetecknad av att den innefattar stämplade nukleotider.
17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että siihen si- ' ’ ’: sältyy leimattuja nukleotidejä. • · i.i i 18. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 13-17 mukainen testipakkaus, tunnettu • · · siitä, että siihen lisäksi sisältyy yksi tai useampia puskureita, suoloja, stabiloivia ai-....: neita ja nukleiinihapon tunnistavia aineita. • · ’· *: 30 19. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 13-18 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että siihen lisäksi sisältyy reagenssit positiivisen kontrollikokeen suorittamiseksi, mukaan luettuna mallisäie amplifikaatiota varten käyttämällä mainittuja aluk- 110694 24 keitä tuottamaan amplifikaatiotuote, joka on erilainen kuin mainitun nukleii-nihapporeaktion.
18. Testförpackning enligt nägot av patentkraven 13-17, kännetecknad av att den vidare innefattar en eller flera buffertar, salter, stabiliseringsmedel och nukleinsyra-identifieringsmedel.
19. Testförpackning enligt nägot av patentkraven 13-18, kännetecknad av att den vidare innefattar reagenser för att utföra ett positivt kontrollprov innefattande ett 10 templat för amplifikation med användning av nämnda primers för att producera en annorlunda amplifikationsprodukt än vid nämnda nukleinsyraamplifikationsreak-tion.
20. Testförpackning enligt nägot av patentkraven 13-19, kännetecknad av att den vidare innefattar nukleinsyrasekvenseringsreagenser.
20. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 13-19 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että siihen lisäksi sisältyy nukleiinihapon sekvensoivia reagensseja.
21. Reagens att användas vid förhindrande av en nukleinsyraamplifikationsproce- dur, kännetecknad av att den innefattar en blandning av nukleinsyraanaloger, av vilka var och en har förmäga att hybridiseras tillräckligt kraftigt tili en motsvarande nukleinsyra av komplementär sekvens, om närvarande, under hybridiseringsförhäl-landen för att förhindra nämnda nukleinsyra att fungera som en primer eller ett 20 templat i en amplifikationsprocedur.
21. Reagenssi käytettäväksi tekemään nukleiinihappoamplifikaatiomenetelmä kelpaamattomaksi, tunnettu siitä, että siihen sisältyy nukleiinihappoanalogien seos, joilla jokaisella on kyky hybridisoitua riittävän voimakkaasti komplementaarisen sekvenssin vastaavaan nukleiinihappoon, jos läsnä, hybridisaatio-olosuhteissa estämään mainittua nukleiinihappoa toimimasta alukkeena tai mallisäikeenä amplifikaa-10 tiomenetelmässä.
21 110694 Patentti vaati m ukset
22. Reagens enligt patentkrav 21, kännetecknad av att nämnda blandning inne- ; ’; häller nukleinsyraanalogmolekyler med ett flertal olika sekvenser.
22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että mainitussa seoksessa on nukleiinihappoanalogimolekyylejä, joilla on erilaisten sekvenssien moninaisuus.
23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että mainitut sek-15 venssit ovat satunnaisia. : 1. Förfarande för inhibering av en nukleinsyreamplifikationsprocedur, varvid vardera strängen i en tvä tvästrängad mälnukleinsyra har ett omräde, som används som templat för en eller flera primers, som är förlängd(a) eller hopkopplad(e) för att 20 bilda ett andra templat, som är komplementärt med nämnda templat, kännetecknat • · · av att man producerar en nukleinsyraanalog, som är tillräckligt komplementär med .1.1. en sekvens av nämnda templat eller av nämnda primer för att hybridiseras med den, och att nämnda nukleinsyraanalog hybridiseras tillräckligt starkt med motsvarande templat eller primer för att blockera primer-templat-hybridisering eller för att 25 blockera primems förlängning eller primems sammanfogning under procedurförhäl-landena.
23. Reagens enligt patentkrav 22, kännetecknad av att nämnda sekvenser är slumpmässiga.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB929211979A GB9211979D0 (en) | 1992-06-05 | 1992-06-05 | Uses of nucleic acid analogues |
| GB9211979 | 1992-06-05 | ||
| PCT/EP1993/001435 WO1993025706A1 (en) | 1992-06-05 | 1993-06-07 | Use of nucleic acid analogues in the inhibition of nucleic acid amplification |
| EP9301435 | 1993-06-07 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI945725A FI945725A (fi) | 1994-12-05 |
| FI945725A0 FI945725A0 (fi) | 1994-12-05 |
| FI110694B true FI110694B (fi) | 2003-03-14 |
Family
ID=10716635
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI945725A FI110694B (fi) | 1992-06-05 | 1994-12-05 | Nukleiinihappoanalogien käyttö nukleiinihappoamplifikaation inhibiitiossa |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5891625A (fi) |
| EP (1) | EP0646181B1 (fi) |
| JP (1) | JP3061064B2 (fi) |
| KR (2) | KR0140836B1 (fi) |
| AT (1) | ATE147441T1 (fi) |
| AU (1) | AU674520B2 (fi) |
| CA (1) | CA2136831C (fi) |
| CZ (1) | CZ282786B6 (fi) |
| DE (1) | DE69307317T2 (fi) |
| DK (1) | DK0646181T3 (fi) |
| ES (1) | ES2098752T3 (fi) |
| FI (1) | FI110694B (fi) |
| GB (1) | GB9211979D0 (fi) |
| HU (1) | HU219371B (fi) |
| NO (1) | NO317111B1 (fi) |
| SK (1) | SK149394A3 (fi) |
| WO (1) | WO1993025706A1 (fi) |
Families Citing this family (140)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6020124A (en) * | 1992-04-27 | 2000-02-01 | Trustees Of Dartmouth College | Detection of soluble gene sequences in biological fluids |
| US7825215B1 (en) | 1993-04-26 | 2010-11-02 | Peter E. Nielsen | Substituted nucleic acid mimics |
| GB9311386D0 (en) * | 1993-06-02 | 1993-07-21 | Pna Diagnostics As | Nucleic acid analogue assay procedures |
| EP0726965A1 (en) * | 1993-11-23 | 1996-08-21 | Ciba Corning Diagnostics Corp. | Use of antisense oligomers in a process for controlling contamination in nucleic acid amplification reactions |
| GB2284209A (en) * | 1993-11-25 | 1995-05-31 | Ole Buchardt | Nucleic acid analogue-induced transcription of RNA from a double-stranded DNA template |
| US6133444A (en) | 1993-12-22 | 2000-10-17 | Perseptive Biosystems, Inc. | Synthons for the synthesis and deprotection of peptide nucleic acids under mild conditions |
| AU2369895A (en) * | 1994-04-29 | 1995-11-29 | Perseptive Biosystems, Inc. | Activated esters of 1-phenylpyrazolin-5-one for labelling amine-functionalized molecules |
| US5629152A (en) * | 1994-08-01 | 1997-05-13 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Trisubstituted β-lactams and oligo β-lactamamides |
| ZA956776B (en) * | 1994-08-25 | 1996-03-20 | Akzo Nobel Nv | A process for making the product of a nucleic acid amplification reaction incapable of being a target for further amplification a diagnostic assay employing said process a kit and a container suitable for carrying out said process for assay |
| EP0799888B1 (en) * | 1994-12-09 | 2005-05-18 | Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method of inhibiting non specific hybridization in primer extension |
| CA2214430A1 (en) * | 1995-03-04 | 1996-09-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | Sequence-specific detection of nucleic acids |
| WO1996034983A1 (en) | 1995-05-05 | 1996-11-07 | The Perkin-Elmer Corporation | Methods and reagents for combined pcr amplification and hybridization probing assay |
| US6001645A (en) * | 1995-06-07 | 1999-12-14 | Promega Corporation | Thermophilic DNA polymerases from thermotoga neapolitana |
| JP2001518054A (ja) * | 1995-06-07 | 2001-10-09 | パーセプティブ バイオシステムズ，インコーポレーテッド | Ｐｎａ−ｄｎａキメラと、このキメラ合成用のｐｎａシントン |
| US6077664A (en) * | 1995-06-07 | 2000-06-20 | Promega Corporation | Thermophilic DNA polymerases from Thermotoga neapolitana |
| CA2223050A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Abbott Laboratories | Probe masking method of reducing background in an amplification reaction |
| DE69637086T2 (de) | 1995-10-12 | 2008-01-10 | Lansdorp, Peter M., Vancouver | Verfahren zum nachweis von mehrfachkopien einer wiederholungssequenz in einem nukleinsäuremolekül |
| AU7016096A (en) * | 1995-10-20 | 1997-05-07 | Trustees Of Boston University | Nucleic acid clamps |
| US6143496A (en) | 1997-04-17 | 2000-11-07 | Cytonix Corporation | Method of sampling, amplifying and quantifying segment of nucleic acid, polymerase chain reaction assembly having nanoliter-sized sample chambers, and method of filling assembly |
| US6617422B1 (en) | 1997-05-23 | 2003-09-09 | Peter Nielsen | Peptide nucleic acid monomers and oligomers |
| CA2292893C (en) * | 1997-06-03 | 2012-01-17 | Arch Development Corporation | Plant artificial chromosome (plac) compositions and methods |
| US6900012B1 (en) * | 1997-06-03 | 2005-05-31 | The University Of Chicago | Plant artificial chromosome compositions and methods |
| US7235716B2 (en) | 1997-06-03 | 2007-06-26 | Chromatin, Inc. | Plant centromere compositions |
| US7119250B2 (en) * | 1997-06-03 | 2006-10-10 | The University Of Chicago | Plant centromere compositions |
| US7193128B2 (en) * | 1997-06-03 | 2007-03-20 | Chromatin, Inc. | Methods for generating or increasing revenues from crops |
| US7227057B2 (en) | 1997-06-03 | 2007-06-05 | Chromatin, Inc. | Plant centromere compositions |
| US6485901B1 (en) | 1997-10-27 | 2002-11-26 | Boston Probes, Inc. | Methods, kits and compositions pertaining to linear beacons |
| WO1999034014A2 (en) * | 1997-12-23 | 1999-07-08 | Roche Diagnostics Gmbh | A method for the determination of a nucleic acid |
| JP2002521070A (ja) | 1998-07-31 | 2002-07-16 | ジェン−プローブ・インコーポレーテッド | 可逆的阻害プローブ |
| US7981599B1 (en) | 1998-07-31 | 2011-07-19 | Boston Probes, Inc. | Non-nucleic acid probes, probe sets, methods and kits pertaining to the detection of individual human chromosomes X, Y, 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 17, 18 and 20 as 13/21 as a pair |
| US6165337A (en) * | 1998-12-23 | 2000-12-26 | Shelton Scientific Manufacturing, Inc. | Semi-dry electrophoresis apparatus and method |
| US7989202B1 (en) | 1999-03-18 | 2011-08-02 | The University Of Chicago | Plant centromere compositions |
| EP1226281A2 (en) * | 1999-11-02 | 2002-07-31 | Curagen Corporation | Method and compositions for selectively inhibiting amplification of sequences in a population of nucleic acid molecules |
| EP1255860A2 (en) | 1999-12-29 | 2002-11-13 | Mergen Ltd. | Methods for amplifying and detecting multiple polynucleotides on a solid phase support |
| US20020015951A1 (en) * | 2000-01-06 | 2002-02-07 | Bader Joel S. | Method of analyzing a nucleic acid |
| US20040014644A1 (en) * | 2000-03-14 | 2004-01-22 | Vladimir Efimov | Oligonucleotide analogues and methods of use for modulating gene expression |
| EP1263773A4 (en) | 2000-03-14 | 2005-08-31 | Active Motif | OLIGONUCLEOTIDE ANALOGUES, METHODS OF SYNTHESIS AND METHODS OF IMPLEMENTATION |
| US6962906B2 (en) * | 2000-03-14 | 2005-11-08 | Active Motif | Oligonucleotide analogues, methods of synthesis and methods of use |
| US6376191B1 (en) | 2000-03-22 | 2002-04-23 | Mergen, Ltd. | Microarray-based analysis of polynucleotide sequence variations |
| AU2001256976A1 (en) * | 2000-04-03 | 2001-10-15 | Cytyc Corporation | Detection and typing of human papillomavirus using pna probes |
| US6936443B2 (en) * | 2000-04-03 | 2005-08-30 | Cytyc Corporation | Detection and typing of human papillomavirus using PNA probes |
| GB0021286D0 (en) * | 2000-08-30 | 2000-10-18 | Gemini Genomics Ab | Identification of drug metabolic capacity |
| DE60138916D1 (de) | 2000-09-26 | 2009-07-16 | Boston Probes Inc | Sonden, sondensätzen,verfahren und kits zur nachweis, identifizierung und/oder die zählung von bakterien |
| EP1356113B1 (en) * | 2000-12-15 | 2012-07-18 | Life Technologies Corporation | Methods for determining organisms |
| JP4408628B2 (ja) * | 2001-03-09 | 2010-02-03 | ボストン プローブス，インコーポレイテッド | 組み合わせオリゴマーならびにそれらの調製のためのライブラリーに適する、方法、キット、および組成物 |
| WO2003027328A2 (en) * | 2001-09-24 | 2003-04-03 | Boston Probes, Inc. | Methods, kits and compositions pertaining to the suppression of detectable probe binding to randomly distributed repeat sequences in genomic nucleic acid |
| EP1487858A4 (en) * | 2002-03-21 | 2006-01-04 | Boston Probes Inc | PNA OLIGOMERS, OLIGOMER SETS, PROCESSES AND KITS FOR DETECTION OF BACILLUS ANTHRACIS |
| US20030211509A1 (en) * | 2002-03-26 | 2003-11-13 | Wiley Steven R. | TNF-delta ligand and uses thereof |
| US7052840B2 (en) * | 2002-04-03 | 2006-05-30 | Capitol Genomix, Inc. | Reversible association of nucleic acid with a carboxylated substrate |
| US20030211483A1 (en) * | 2002-05-09 | 2003-11-13 | Schroeder Benjamin G. | Methods for the enrichment of low-abundance polynucleotides |
| WO2003100076A2 (en) * | 2002-05-17 | 2003-12-04 | Applera Corporation | Pna probes, probe sets, method and kits pertaining to the determination of listeria |
| US20030220844A1 (en) * | 2002-05-24 | 2003-11-27 | Marnellos Georgios E. | Method and system for purchasing genetic data |
| EP1558759A4 (en) * | 2002-07-01 | 2007-06-06 | Univ State Cleveland | PROCESS FOR DETECTING MUTATED POLYNUCLEOTIDES WITHIN A LARGE POPULATION OF WILD TYPE POLYNUCLEOTIDES |
| WO2004022578A2 (en) * | 2002-09-08 | 2004-03-18 | Applera Corporation | Methods, compositions and libraries pertaining pna dimer and pna oligomer synthesis |
| DE10253966B4 (de) * | 2002-11-19 | 2005-03-24 | Clondiag Chip Technologies Gmbh | Microarray-basiertes Verfahren zur Amplifikation und Detektion von Nukleinsäuren in einem kontinuierlichen Prozess |
| US20040259132A1 (en) * | 2002-11-22 | 2004-12-23 | Henrik Stender | Peptide nucleic acid probes for analysis of pseudomonas (sensu stricto) |
| EP2112229A3 (en) | 2002-11-25 | 2009-12-02 | Sequenom, Inc. | Methods for identifying risk of breast cancer and treatments thereof |
| WO2004106555A2 (en) | 2003-05-22 | 2004-12-09 | Dow Agrosciences Llc | High-throughput methods of screening dna for deletions and other mutations |
| US20050221310A1 (en) * | 2003-06-06 | 2005-10-06 | Gene Ogic, Inc. | Methods for enhancing gene expression analysis |
| WO2005003370A2 (en) * | 2003-06-06 | 2005-01-13 | Gene Logic, Inc. | Methods for enhancing gene expression analysis |
| CA2533119A1 (en) * | 2003-07-24 | 2005-02-03 | Qiagen Gmbh | Method for the reverse transcription and/or amplification of nucleic acids |
| US20050123975A1 (en) * | 2003-11-19 | 2005-06-09 | Applera Corporation | Methods for determining the degradation state or concentration of nucleic acids |
| MXPA06009225A (es) * | 2004-02-23 | 2007-03-08 | Chromatin Inc | Plantas modificadas con mini-cromosomas. |
| CA2502549C (en) | 2004-04-23 | 2016-02-16 | Becton, Dickinson And Company | Use of an extraction control in a method of extracting nucleic acids |
| WO2005111235A2 (en) * | 2004-05-04 | 2005-11-24 | Dak Denmark A/S | Methods for detecting chromosome aberrations |
| US20080199480A1 (en) * | 2004-07-22 | 2008-08-21 | Sequenom, Inc. | Methods for Identifying Risk of Type II Diabetes and Treatments Thereof |
| US20060223084A1 (en) * | 2004-12-06 | 2006-10-05 | Bioveris Corporation | Methods and compositions for detecting Bacillus anthracis |
| WO2006081426A2 (en) * | 2005-01-28 | 2006-08-03 | Applera Corporation | Compositions and methods for terminating a sequencing reaction at a specific location in a target dna template |
| US20060257902A1 (en) * | 2005-03-25 | 2006-11-16 | Ambion, Inc. | Methods and compositions for depleting abundant RNA transcripts |
| WO2006130872A2 (en) | 2005-06-02 | 2006-12-07 | Advandx, Inc. | Peptide nucleic acid probes for analysis of microorganisms |
| US9017992B2 (en) | 2005-07-01 | 2015-04-28 | Dako Denmark A/S | In situ hybridization detection method |
| US8222028B2 (en) * | 2005-09-08 | 2012-07-17 | Chromatin, Inc. | Plants modified with mini-chromosomes |
| DE102005048503B4 (de) * | 2005-10-07 | 2012-10-18 | InViTek Gesellschaft für Biotechnik & Biodesign mbH | Verfahren zur Steuerung der abschnittsweisen enzymatischen Nukleinsäurevervielfältigung über inkomplette Komplementärstränge |
| EP2479291A1 (en) * | 2005-10-27 | 2012-07-25 | Life Technologies Corporation | Nucleic acid amplification using non-random primers |
| DE602006018352D1 (de) | 2005-12-06 | 2010-12-30 | Ambion Inc | Rückübertragungs-primer und verfahren zu deren entwurf |
| CA2651510C (en) * | 2006-05-12 | 2016-08-09 | Cepheid | Dna recombination junction detection |
| US8679741B2 (en) * | 2006-05-31 | 2014-03-25 | Sequenom, Inc. | Methods and compositions for the extraction and amplification of nucleic acid from a sample |
| CA2654165A1 (en) | 2006-06-05 | 2007-12-13 | Cancer Care Ontario | Assessment of risk for colorectal cancer |
| US8119352B2 (en) * | 2006-06-20 | 2012-02-21 | Cepheld | Multi-stage amplification reactions by control of sequence replication times |
| WO2008070525A1 (en) | 2006-12-04 | 2008-06-12 | Luminex Corporation | Oxocarbonamide peptide nucleic acids and methods of using same |
| US7902345B2 (en) | 2006-12-05 | 2011-03-08 | Sequenom, Inc. | Detection and quantification of biomolecules using mass spectrometry |
| US7955802B2 (en) | 2006-12-13 | 2011-06-07 | Luminex Corporation | Systems and methods for multiplex analysis of PCR in real time |
| WO2008083259A1 (en) * | 2006-12-29 | 2008-07-10 | Applera Corporation | Systems and methods for detecting nucleic acids |
| EP2118310B1 (en) * | 2006-12-29 | 2013-03-06 | Applied Biosystems, LLC | Systems and methods for detecting nucleic acids |
| US8173370B2 (en) * | 2007-02-08 | 2012-05-08 | Sequenom, Inc. | Nucleic acid-based tests for RHD typing, gender determination and nucleic acid quantification |
| GB0703996D0 (en) * | 2007-03-01 | 2007-04-11 | Oxitec Ltd | Nucleic acid detection |
| GB0703997D0 (en) | 2007-03-01 | 2007-04-11 | Oxitec Ltd | Methods for detecting nucleic sequences |
| WO2008106785A1 (en) | 2007-03-05 | 2008-09-12 | Cancer Care Ontario | Assessment of risk for colorectal cancer |
| US8614089B2 (en) * | 2007-03-15 | 2013-12-24 | Chromatin, Inc. | Centromere sequences and minichromosomes |
| AU2008230813B2 (en) | 2007-03-26 | 2014-01-30 | Sequenom, Inc. | Restriction endonuclease enhanced polymorphic sequence detection |
| EP2167537A2 (en) | 2007-07-03 | 2010-03-31 | Dako Denmark A/S | Compiled methods for analysing and sorting samples |
| WO2009032781A2 (en) | 2007-08-29 | 2009-03-12 | Sequenom, Inc. | Methods and compositions for universal size-specific polymerase chain reaction |
| EP2245049B1 (en) | 2008-01-10 | 2015-05-20 | Research Development Foundation | Vaccines and diagnostics for the ehrlichioses |
| US8709726B2 (en) | 2008-03-11 | 2014-04-29 | Sequenom, Inc. | Nucleic acid-based tests for prenatal gender determination |
| EP2276858A4 (en) | 2008-03-26 | 2011-10-05 | Sequenom Inc | RESTRICTED ENDONUCLEASE AMPLIFIED POLYMORPHIC SEQUENCE DETECTION |
| ES2668555T3 (es) | 2008-05-27 | 2018-05-18 | Dako Denmark A/S | Composiciones y métodos para la detección de aberraciones cromosómicas con tampones de hibridación novedosos |
| US8476013B2 (en) * | 2008-09-16 | 2013-07-02 | Sequenom, Inc. | Processes and compositions for methylation-based acid enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses |
| US8962247B2 (en) * | 2008-09-16 | 2015-02-24 | Sequenom, Inc. | Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non invasive prenatal diagnoses |
| CN102272157B (zh) | 2008-11-07 | 2015-11-25 | 研究发展基金会 | 用于抑制cripto/grp78复合物形成和信号的组合物和方法 |
| WO2010077324A2 (en) | 2008-12-17 | 2010-07-08 | Life Technologies Corporation | Methods, compositions, and kits for detecting allelic variants |
| EP3722810A3 (en) | 2009-02-11 | 2021-01-13 | Caris MPI, Inc. | Molecular profiling of tumors |
| WO2010097655A1 (en) | 2009-02-26 | 2010-09-02 | Dako Denmark A/S | Compositions and methods for rna hybridization applications |
| US20100279295A1 (en) * | 2009-03-18 | 2010-11-04 | Sequenom, Inc. | Use of thermostable endonucleases for generating reporter molecules |
| US20110045080A1 (en) * | 2009-03-24 | 2011-02-24 | William Marsh Rice University | Single-Walled Carbon Nanotube/Bioactive Substance Complexes and Methods Related Thereto |
| CN102428190B (zh) | 2009-03-27 | 2014-02-26 | 生命技术公司 | 用于检测等位基因变体的方法、组合物和试剂盒 |
| WO2010115016A2 (en) | 2009-04-03 | 2010-10-07 | Sequenom, Inc. | Nucleic acid preparation compositions and methods |
| EP2449104B1 (en) | 2009-06-29 | 2014-06-04 | Luminex Corporation | Chimeric primers with hairpin conformations and methods of using same |
| CA2767724A1 (en) | 2009-07-23 | 2011-01-27 | Chromatin, Inc. | Sorghum centromere sequences and minichromosomes |
| US20160186266A1 (en) | 2009-10-27 | 2016-06-30 | Carislife Sciences, Inc. | Molecular profiling for personalized medicine |
| CA2781907C (en) | 2009-12-02 | 2019-07-16 | Dako Denmark A/S | Compositions and methods for performing hybridizations with no denaturation |
| US9404160B2 (en) | 2009-12-22 | 2016-08-02 | Becton, Dickinson And Company | Methods for the detection of microorganisms |
| US9926593B2 (en) | 2009-12-22 | 2018-03-27 | Sequenom, Inc. | Processes and kits for identifying aneuploidy |
| CN102741429A (zh) * | 2010-02-25 | 2012-10-17 | 松下电器产业株式会社 | 对双链dna中的目标序列进行扩增的方法 |
| EP2663651B1 (en) | 2011-01-14 | 2018-06-20 | Genefirst Limited | Methods, compositions, and kits for determing the presence/absence of a variant nucleic acid sequence |
| CA2834218C (en) | 2011-04-29 | 2021-02-16 | Sequenom, Inc. | Quantification of a minority nucleic acid species using inhibitory oligonucleotides |
| EP2761028A1 (en) | 2011-09-30 | 2014-08-06 | Dako Denmark A/S | Hybridization compositions and methods using formamide |
| EP3252173A1 (en) | 2011-10-21 | 2017-12-06 | Dako Denmark A/S | Hybridization compositions and methods |
| US20140377762A1 (en) | 2011-12-19 | 2014-12-25 | 360 Genomics Ltd. | Method for enriching and detection of variant target nucleic acids |
| US9605313B2 (en) | 2012-03-02 | 2017-03-28 | Sequenom, Inc. | Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations |
| US9920361B2 (en) | 2012-05-21 | 2018-03-20 | Sequenom, Inc. | Methods and compositions for analyzing nucleic acid |
| EP2872648B1 (en) | 2012-07-13 | 2019-09-04 | Sequenom, Inc. | Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses |
| WO2014033314A1 (en) | 2012-09-03 | 2014-03-06 | Uab Bioseka | Antisense oligonucleotide targeting bacterial glucosyltransferases |
| EP2929050A1 (en) | 2012-12-10 | 2015-10-14 | AdvanDx, Inc. | Use of probes for mass spectrometric identification of microorganisms or cells and associated conditions of interest |
| US9896728B2 (en) | 2013-01-29 | 2018-02-20 | Arcticrx Ltd. | Method for determining a therapeutic approach for the treatment of age-related macular degeneration (AMD) |
| EP3597774A1 (en) | 2013-03-13 | 2020-01-22 | Sequenom, Inc. | Primers for dna methylation analysis |
| EP2970976A4 (en) | 2013-03-15 | 2016-11-02 | Techulon Inc | ANTISENSE MOLECULES FOR THE TREATMENT OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS INFECTIONS |
| SG10201710369RA (en) | 2013-03-15 | 2018-01-30 | Techulon Inc | Antisense molecules for treatment of staphylococcus aureus infection |
| LT6214B (lt) | 2013-10-07 | 2015-08-25 | Uab "Bioseka" | Priešprasminiai oligonukleotidai aterosklerozės ir kardiovaskulinių infekcijų prevencijai |
| JP6640079B2 (ja) | 2013-10-16 | 2020-02-05 | ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア | 小容積の粒子を調製するためのデバイス及び方法 |
| EP3065706A4 (en) | 2013-11-08 | 2017-11-29 | Baylor Research Institute | Nuclear localization of glp-1 stimulates myocardial regeneration and reverses heart failure |
| EP3117011B1 (en) | 2014-03-13 | 2020-05-06 | Sequenom, Inc. | Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations |
| WO2016134293A1 (en) | 2015-02-20 | 2016-08-25 | Baylor College Of Medicine | p63 INACTIVATION FOR THE TREATMENT OF HEART FAILURE |
| CN108291227A (zh) | 2015-10-14 | 2018-07-17 | 拜奥-帕斯控股股份有限公司 | 用于脂质体制剂的对乙氧基核酸 |
| AU2016385135B2 (en) | 2016-01-06 | 2022-02-17 | The University Of British Columbia | Bifurcating mixers and methods of their use and manufacture |
| US20190177391A1 (en) | 2016-03-31 | 2019-06-13 | Baylor Research Institute | Angiopoietin-like protein 8 (angptl8) |
| CN109563506A (zh) | 2016-05-06 | 2019-04-02 | 威廉马歇莱思大学 | 使用随机捕获探针文库的化学计量核酸纯化 |
| EP3512525B1 (en) | 2016-09-16 | 2022-07-27 | Bio-Path Holdings, Inc. | Combination therapy with liposomal antisense oligonucleotides |
| EP3519578B1 (en) | 2016-10-03 | 2021-12-22 | Precision Nanosystems Inc | Compositions for transfecting resistant cell types |
| EP3888021B1 (en) | 2018-11-30 | 2024-02-21 | Caris MPI, Inc. | Next-generation molecular profiling |
| WO2021112918A1 (en) | 2019-12-02 | 2021-06-10 | Caris Mpi, Inc. | Pan-cancer platinum response predictor |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4988617A (en) * | 1988-03-25 | 1991-01-29 | California Institute Of Technology | Method of detecting a nucleotide change in nucleic acids |
| ES2141088T3 (es) * | 1990-02-16 | 2000-03-16 | Hoffmann La Roche | Mejoras en la especificidad y conveniencia de la reaccion en cadena de la polimerasa. |
| AU8920191A (en) * | 1990-10-31 | 1992-05-26 | George D. Cimino | Methods and compositions for minimizing inhibition of nucleic acid amplification |
| DK51092D0 (da) * | 1991-05-24 | 1992-04-15 | Ole Buchardt | Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf |
-
1992
- 1992-06-05 GB GB929211979A patent/GB9211979D0/en active Pending
-
1993
- 1993-06-07 CZ CZ942951A patent/CZ282786B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1993-06-07 ES ES93912907T patent/ES2098752T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-06-07 DE DE69307317T patent/DE69307317T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-06-07 AU AU43235/93A patent/AU674520B2/en not_active Ceased
- 1993-06-07 AT AT93912907T patent/ATE147441T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-06-07 KR KR1019940704472A patent/KR0140836B1/ko active
- 1993-06-07 DK DK93912907.8T patent/DK0646181T3/da active
- 1993-06-07 JP JP6501101A patent/JP3061064B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1993-06-07 EP EP93912907A patent/EP0646181B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-06-07 US US08/338,535 patent/US5891625A/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-06-07 HU HU9403463A patent/HU219371B/hu not_active IP Right Cessation
- 1993-06-07 SK SK1493-94A patent/SK149394A3/sk unknown
- 1993-06-07 WO PCT/EP1993/001435 patent/WO1993025706A1/en active IP Right Grant
- 1993-06-07 CA CA002136831A patent/CA2136831C/en not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-12-02 NO NO19944655A patent/NO317111B1/no unknown
- 1994-12-05 KR KR1019940704472A patent/KR950702252A/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-12-05 FI FI945725A patent/FI110694B/fi not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-10-08 US US08/947,317 patent/US5972610A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5972610A (en) | 1999-10-26 |
| CZ295194A3 (en) | 1995-09-13 |
| GB9211979D0 (en) | 1992-07-15 |
| EP0646181A1 (en) | 1995-04-05 |
| CZ282786B6 (cs) | 1997-10-15 |
| KR0140836B1 (ko) | 1998-06-15 |
| DE69307317D1 (de) | 1997-02-20 |
| FI945725A (fi) | 1994-12-05 |
| CA2136831C (en) | 2002-11-05 |
| NO944655L (no) | 1995-02-03 |
| HUT71931A (en) | 1996-02-28 |
| WO1993025706A1 (en) | 1993-12-23 |
| JP3061064B2 (ja) | 2000-07-10 |
| HU219371B (en) | 2001-03-28 |
| ES2098752T3 (es) | 1997-05-01 |
| ATE147441T1 (de) | 1997-01-15 |
| FI945725A0 (fi) | 1994-12-05 |
| JPH08501681A (ja) | 1996-02-27 |
| AU674520B2 (en) | 1997-01-02 |
| US5891625A (en) | 1999-04-06 |
| SK149394A3 (en) | 1996-01-10 |
| DK0646181T3 (da) | 1997-10-13 |
| KR950702252A (ko) | 1995-06-19 |
| DE69307317T2 (de) | 1997-05-22 |
| NO944655D0 (no) | 1994-12-02 |
| AU4323593A (en) | 1994-01-04 |
| EP0646181B1 (en) | 1997-01-08 |
| NO317111B1 (no) | 2004-08-16 |
| CA2136831A1 (en) | 1993-12-23 |
| HU9403463D0 (en) | 1995-02-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI110694B (fi) | Nukleiinihappoanalogien käyttö nukleiinihappoamplifikaation inhibiitiossa | |
| US20010010915A1 (en) | Methods and compositions pertaining to PD-Loops | |
| EP2989212B1 (en) | Strand-invasion based dna amplification method | |
| US11180787B2 (en) | Strand-invasion based DNA amplification method | |
| JPH09506255A (ja) | 核酸の保護方法および分析方法 | |
| US20110288284A1 (en) | Methods and compositions for isolating polynucleotides | |
| JP2005508642A5 (ja) | 試験サンプル中のＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの存在を決定するための組成物、方法およびキット | |
| US9255298B2 (en) | Probe, and polymorphism detection method using the same | |
| JP6612883B2 (ja) | 相補的塩基配列ないしはミス−マッチされた塩基を含む相補的な塩基配列と連結されたｐｃｒプライマー及びそれを用いた核酸増幅方法 | |
| CN108998535B (zh) | 一种kras基因多重突变位点检测试剂盒 | |
| JP4235283B2 (ja) | 小三本鎖形成ｐｎａオリゴ | |
| WO2008111741A1 (en) | Method for detecting nucleotide variations using labelled primers | |
| Singer et al. | Artificial nucleic acid probes and their applications in clinical microbiology | |
| JP2004194619A (ja) | 競合核酸を使用した酵素反応方法 | |
| KR20240099469A (ko) | 핵산의 대상 염기 서열 중에 있어서의 변이를 검출하기 위한 방법, 핵산의 증폭을 선택적으로 저해하는 방법, 및 이것들을 실시하기 위한 키트 | |
| WO2004104196A1 (ja) | 緩衝剤組成物 | |
| Marras | 2 Artificial Hybridization Probes | |
| JP2005278443A (ja) | オリゴヌクレオチド及びそれを用いた淋菌の検出方法 | |
| Jung et al. | Gold nanoparticles-Based colorimetric single nucleotide polymorphisms genotyping utilizing allele-specific PCR | |
| JPWO2020028631A5 (fi) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MA | Patent expired |