CN102741429A - 对双链dna中的目标序列进行扩增的方法 - Google Patents

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CN102741429A CN2010800626937A CN201080062693A CN102741429A CN 102741429 A CN102741429 A CN 102741429A CN 2010800626937 A CN2010800626937 A CN 2010800626937A CN 201080062693 A CN201080062693 A CN 201080062693A CN 102741429 A CN102741429 A CN 102741429A
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Abstract

本发明提供在PCR法中抑制非特异性扩增的方法。本发明为一种PCR法，其是利用正向引物和反向引物对模板双链DNA中的所需目标序列进行扩增的PCR法，其特征在于，在所述PCR溶液中含有寡核酸A和寡核酸B中的至少任一种，所述寡核酸A是结合在所述模板双链DNA中所述正向引物所结合的单链DNA上、其结合位置比所述正向引物更靠3′侧下游且为目标序列的外侧、不会成为利用DNA聚合酶的延伸反应的起点；所述寡核酸B是结合在所述模板双链DNA中所述反向引物所结合的单链DNA上、其结合位置比所述反向引物更靠3′侧下游且为目标序列的外侧、不会成为利用DNA聚合酶的延伸反应的起点。

Description

对双链DNA中的目标序列进行扩增的方法
技术领域
本发明涉及对双链DNA中的目标序列进行扩增的方法。
背景技术
图1所示的聚合酶链反应（以下称作“PCR”）是对由第1单链DNA6和第2单链DNA7构成的双链DNA中所含的目标序列1进行扩增的代表性方法。
以下一边参照图1一边简单地说明PCR法。
第1单链DNA6由3’末端-第1非扩增序列6a-单链目标序列1a-第2非扩增序列6b-5’末端构成。第2单链DNA7由5’末端-第3非扩增序列7a-互补性单链目标序列1b-第4非扩增序列7b-3’末端构成。互补性单链目标序列1b、第3非扩增序列7a和第4非扩增序列7b分别与单链目标序列1a、第1非扩增序列6a和第2非扩增序列6b互补。
首先，将DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸、双链DNA1、正向引物4和反向引物5混合，制备混合液。
正向引物4由具有5～20个碱基的核酸构成、且与单链目标序列1a的3’末端部分6c互补。反向引物5由具有5～20个碱基的核酸构成、且与互补性单链目标序列1b’的3’末端部分互补。因此，正向引物4和反向引物5分别结合在3’末端部分6c和3’末端部分7c。
接着，将该混合液在94℃～100℃下从1秒钟开始加热100秒钟，之后在50～70℃下从1秒钟开始冷却100秒钟。反复进行加热和冷却，获得扩增双链DNA序列2。扩增双链DNA序列2由与单链目标序列1a相同的扩增单链目标序列6g和与互补性单链目标序列1b相同的扩增互补性单链目标序列7g构成。
专利文献1~3可以与本发明相关。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平5-199900号公报
专利文献2：日本特表2003-534772号公报
专利文献3：日本特表平3-508636号公报（特别是图3、图12）
发明内容
发明要解决的技术问题
如图1所示，当第1非扩增序列6a含有与单链目标序列1a的3’末端部分6c相同的序列6d时，正向引物4不仅结合在3’末端部分6c、还结合在该序列6d上。当第1非扩增序列6a含有与单链目标序列1a的3’末端部分6c相类似的序列6d时，正向引物4不仅结合在3’末端部分6c、还会错误地结合在该序列6d上。
因此，所得的扩增双链DNA序列不仅包含所期望的扩增双链DNA序列2、还包含不希望的扩增双链DNA序列3。该扩增双链DNA序列3是非特异性扩增的产物，由不希望的扩增单链DNA3a和扩增互补性单链DNA3b构成。
本发明的目的在于提供能够抑制不希望的扩增双链DNA序列3的产生的扩增方法。
用于解决技术问题的手段
解决上述课题的本发明是对由第1单链DNA和第2单链DNA构成的双链DNA中的双链目标序列进行扩增的方法，其中，
所述双链目标序列由单链目标序列（1a）和互补性单链目标序列（1b）构成，
所述第1单链DNA由3’末端-第1非扩增序列（6a）-所述单链目标序列（1a）-第2非扩增序列（6b）-5’末端构成，
所述第2单链DNA由5’末端-第3非扩增序列（7a）-所述互补性单链目标序列（1b）-第4非扩增序列（7b）-3’末端构成，
所述互补性单链目标序列（1b）、第3非扩增序列（7a）和第4非扩增序列（7b）分别与所述单链目标序列（1b）、所述第1非扩增序列（6a）和第2非扩增序列（6b）互补，
所述方法是将DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸、所述双链DNA（6、7）、正向引物、反向引物和第1阻碍核酸（20）混合，使用聚合酶链反应对所述双链目标序列进行扩增的工序A，
其中，所述正向引物和所述反向引物均作为用于利用所述DNA聚合酶的延伸反应的起点发挥作用，
所述正向引物与所述单链目标序列（1a）所含的3’末端侧的序列的部分互补，
所述反向引物与所述互补性单链目标序列（1b）所含的3’末端侧部分的序列互补，
所述第1阻碍核酸（20）不会作为用于利用所述DNA聚合酶的延伸反应的起点发挥作用，
所述第1阻碍核酸（20）与所述第3非扩增序列（7a）的一部分互补。
发明效果
可以抑制不希望的扩增双链DNA序列3的产生。
附图说明
[图1]表示以往PCR的图
[图2]表示本发明的PCR的图
[图3]接图2、表示本发明的PCR的图
[图4]接图3、表示本发明的PCR的图
[图5]接图4、表示本发明的PCR的图
[图6]接图5、表示本发明的PCR的图
[图7]表示以往PCR的图
[图8]接图7、表示以往PCR的图
[图9]接图8、表示以往PCR的图
[图10]接图9、表示以往PCR的图
[图11]接图10、表示以往PCR的图
[图12]表示实施例1的电泳时的结果的图表
[图13]表示比较例1的电泳时的结果的图表
[图14]对实施例1和比较例1中非特异性扩增产物的浓度进行了比较的图表
[图15]表示实施例2的电泳时的结果的图表
[图16]表示比较例2的电泳时的结果的图表
[图17]对实施例2和比较例2中非特异性扩增产物的浓度进行了比较的图表
[图18]表示实施例3的电泳时的结果的图表
[图19]表示比较例3的电泳时的结果的图表
[图20]对实施例3和比较例3中非特异性扩增产物的浓度进行了比较的图表
具体实施方式
以下一边参照图2~图11一边说明本发明的方法。
（实施方式）
本发明通过在使用聚合酶链反应扩增双链目标序列1时添加第1阻碍核酸20而被赋予特征。
第1阻碍核酸20不会作为用于利用DNA聚合酶的延伸反应的起点发挥作用。优选阻碍核酸为合成寡核酸。
第1阻碍核酸20的例子有经修饰的DNA、经修饰的锁定核酸（以下记为“LNA”）和肽核酸（以下记为“PNA”）。
核酸是由糖、磷酸基和碱基构成的核苷酸通过磷酸酯键连接而成的生物体高分子。位于经修饰的DNA和LNA的3’末端的核苷酸所含的糖的3位OH基被氢、磷酸基、氨基、生物素基、巯基或它们的衍生物取代或修饰。PNA不需要该修饰。
正向引物4与单链目标序列1a的3’末端部分6c互补。因而，如图2所示，正向引物4结合在该3’末端部分6c。进而，正向引物4包含在第1非扩增序列6a中，也可结合在与单链目标序列1a相同或类似的序列6d上。
反向引物5与互补性单链目标序列1b的3’末端部分互补。因此，如图2所示，反向引物5结合在该部分。
阻碍核酸20与第3非扩增序列7a的一部分互补。因此，如图2所示，阻碍核酸20与第3非扩增序列7a的该部分相结合。
当开始PCR时，如图3所示，DNA从正向引物4的3’末端和反向引物5的3末端’开始延伸，形成第1复制序列6e1、第2复制序列7e和第3复制序列6e2。
第1复制序列6e1与通过将单链目标序列1a和第2非扩增序列6b连续地连接所形成的序列互补。第3复制序列6e2与通过将第1非扩增序列6a的一部分、单链目标序列1a和第2非扩增序列6b连续地连接所形成的序列互补。
阻碍核酸20将反向引物5的DNA延伸停止。因此，第2复制序列7e与通过将互补性单链目标序列1b和第3非扩增序列7b的一部分连续地连接所形成的序列互补。但是，第2复制序列7e不含有与从结合有阻碍核酸20的第2单链DNA7的部分至5’末端侧的序列相互补的序列7h。
当进一步进行PCR时，如图4所示，正向引物4结合在第1单链DNA序列6和第2复制序列7e上。反向引物5结合在第2单链DNA序列7、第1复制序列6e1和第3复制序列6e2上。阻碍核酸20也结合在第3非扩增序列7a和第3复制序列6e2上。
之后，如图5所示，DNA从2个正向引物4的3’末端开始延伸，形成第1复制序列6e1和扩增互补性单链目标序列7g。DNA从3个反向引物5的3’末端开始延伸，形成1条扩增单链目标序列6g和两条第2复制序列7e。扩增单链目标序列6g和扩增互补性单链目标序列7g分别与单链目标序列1a和互补性单链目标序列1b相同。
即，由第1单链DNA序列6和正向引物4形成第1复制序列6e1。由第1复制序列6e1和反向引物5形成扩增单链目标序列6g。由第2复制序列6e2和反向引物5形成第2复制序列7e。同样地，由第2单链DNA序列7和反向引物5形成第2复制序列7e。由第2复制序列7e和正向引物4形成扩增互补性单链目标序列7g。
当进一步进行PCR时，如图6所示，通过1次循环，不仅形成在图5中形成的序列、还由扩增单链目标序列6g和正向引物4形成扩增互补性单链目标序列7g。由扩增互补性单链目标序列7g和反向引物5还形成扩增单链目标序列6g。
在进行n次循环后，获得2n个扩增单链目标序列6g和扩增互补性单链目标序列7g。另一方面，不希望的扩增双链DNA序列3是不存在的。其原因自不必说，是由于阻碍核酸20的原因。
在图2中，与通常的PCR同样，为了打开双链DNA以获得单链DNA而提高温度，进而为了使引物4、5结合而降低温度。
图7表示未使用阻碍核酸20的以往的PCR。
正向引物4与单链目标序列1a的3’末端部分6c互补。因此，如图7所示，正向引物4结合在该3’末端部分6c上。进而，当第1非扩增序列6a含有与该3’末端部分6c相同或类似的序列6d时，正向引物4不仅结合在该部分6c上、还可结合在该序列6d上。
当开始PCR时，与图2～图6不同，如图8所示，形成与通过将互补性单链序列1b和第3非扩增序列7a连续地连接所形成的序列相互补的第2复制序列7e2。该第2复制序列7e2不仅含有3’末端部分6c、还含有序列6d。
当进一步进行PCR时，如图9所示，正向引物4结合在第2复制序列7e2上。此时，正向引物4不仅结合在第2复制序列7e2所含的部分6c上、还结合在序列6d上。
因此，如图10所示，不仅形成了扩增单链目标序列6g和扩增互补性单链目标序列7g，还形成了不希望的扩增单链序列3a和不希望的扩增互补性单链序列3b。而且，当进行n次循环时，不仅形成2n个的扩增单链目标序列6g和扩增互补性单链目标序列7g，还会形成2n个不希望的扩增单链序列3a和不希望的扩增互补性单链序列3b。
由图2～图6和图7～图10可知，阻碍核酸20阻碍了会形成不希望的扩增双链DNA序列3的不希望的扩增单链序列3a和不希望的扩增互补性单链序列3b的形成。这样，本发明可以抑制不希望的扩增双链DNA序列3的产生。
如图2所示，与阻碍核酸20的5’末端互补的目标序列1b的5’末端侧的序列100优选为0个碱基以上且20个碱基以下。这是由于非常不希望序列100含有与单链目标序列1a的3’末端部分6c相同或类似的序列6d。即，当序列100含有序列6d时，正向引物4可错误地与该序列6d结合、从而如图1所示，形成不希望的扩增双链DNA序列3。
如图11所示，可使用第2阻碍核酸30。该第2阻碍核酸30与第2非扩增序列6b的一部分互补。第2阻碍核酸30与第1阻碍核酸20同样，由经修饰的DNA、经修饰的LNA或PNA构成。
与图2相比，如图11所示，2个阻碍核酸20、30可更有效地抑制不希望的扩增双链DNA序列3的产生。
本发明中可用的DNA聚合酶的一个例子是Taq DNA聚合酶和PfuDNA聚合酶。DNA聚合酶优选不具有5’->3’核酸外切酶活性。
脱氧核苷三磷酸为脱氧腺苷三磷酸（dATP）、脱氧胸苷三磷酸（dTTP）、脱氧鸟苷三磷酸（dGTP）和脱氧胞苷三磷酸（dCTP）的混合物。脱氧核苷三磷酸通常含有等量的这4种物质，其浓度为20μM～200μM。
（实施例）
以下说明本发明的实验例。
（实施例1）
实施例1表示对人的ABO式血型基因的Exon6区域进行扩增的例子。
表1示出正向引物4（以下记为“ABO-F”）和反向引物5（以下记为“ABO-R”）的序列。
表1人的ABO式血型基因扩增用的引物的序列
 ABO-F   5’-TAGGAAGGATGTCCGCG-3’（序列号1）
 ABO-R   5’-TTCTTGATGGCAAACACAGTTAACC-3’（序列号2）
表2示出阻碍核酸20（以下记为“ABO-Block”）的序列。
表2人的ABO式血型基因扩增用的阻碍核酸的序列
 ABO-Block   5’-GTGCGGCCACATGGAGCTGGC-3’（序列号3）
通过由ABO-F和ABO-R构成的一对引物，ABO式血型基因中的AB型待测者的135个碱基对的目标序列被扩增。
ABO-Block由与从第3非扩增序列7a的3’末端侧开始数的第19～39个碱基相互补的21个碱基序列构成。该部分是从第2单链DNA7的3’末端侧开始数的第201~第221个的碱基序列。ABO-Block的3’末端的核苷酸所含的3位的糖通过磷酸化被修饰。
使用DNA Micro Kit（QIAGEN公司制），从AB型待测者的血液100μL中提取基因组DNA，制备10ng/μL的模板DNA。
PCR的反应溶液如下所述。
1×TITANIUM Taq PCR缓冲液（Clontech公司制）
200μM dNTP（dATP、dTTP、dGTP和dCTP混合物）、
1×TITANIUM Taq DNA聚合酶（Clontech公司制）、
1μM ABO-F
1μM ABO-R
0.5ng/μL的基因组DNA和10μM ABO-Block
总量：10μL
在以下的热循环程序进行PCR扩增：95℃下1分钟的循环进行1个、95℃下1秒钟（用于变性）和62℃下1秒钟（用于退火）和72℃下1秒钟（用于DNA延伸）的循环进行50个。
PCR反应后，使用BioAnalyzer（Agilent公司制）将PCR反应物供至电泳。图12表示电泳的结果。由图12可知，仅特异性地扩增了由135个碱基对构成的目标序列，未发生非特异性的扩增。图3中的标记物是电泳试剂盒自带的DNA标记物。
（比较例1）
除了将实施例1中的反应溶液的阻碍核酸替换成蒸馏水之外，与实施例1同样地实施PCR反应。图13表示比较例1的电泳的结果。
由图13可知，不仅扩增了由135个碱基对构成的目标序列，还非特异性地扩增了由183个～1209个碱基对构成的双链DNA。
这表示阻碍核酸20会抑制非特异性的扩增。
图14为表示实施例1和比较例1中由电泳的分析结果算出的非特异性扩增产物的浓度总和的图表。如图14可知，比较例1中发生了16.15ng/μL的非特异性扩增。而实施例1中完全地抑制了非特异性的扩增。可以认为这是通过抑制非特异性扩增所获得的协同效果。即，可以抑制过多的试剂消耗，进而反应溶液中的目标序列的比例增加，从而目标序列的优先扩增变得可能。由此表明阻碍核酸20有助于目标序列的高效扩增。
（实施例2）
实施例2表示对人的乙醛脱氢酶2基因的第12外显子区域进行扩增的例子。
表3示出正向引物4（以下记为“ALDH2-F”）和反向引物5（以下记为“ALDH2-R”）的序列。
表3人乙醛脱氢酶2基因扩增用的引物的序列
 ALDH2-F   5’-GGCTGCAGGCATACACT-3’（序列号4）
 ALDH2-R   5’-GGCAGGTCCTGAACCTC-3’（序列号5）
表4示出阻碍核酸20（以下记为“ALDH2-Block”）的序列。
表4人乙醛脱氢酶2基因扩增时的阻碍核酸的序列
 ALDH2-Block   5’-AGCAGTTGACCCTGTAATTTG-3’（序列号6）
通过由ALDH2-F和ALDH2-R构成的一对引物，由乙醛脱氢酶2基因中的155个碱基对构成的目标序列被扩增。
ALDH2-Block由与从第3非扩增序列7a的3’末端侧开始数的第77~97个碱基互补的21个碱基序列构成。ALDH2-Block的3’末端的核苷酸所含的3位的糖通过磷酸化被修饰。
使用DNA Micro Kit（QIAGEN公司制）从人的血液100μL中提取基因组DNA，制备10ng/μL的模板DNA。
PCR的反应溶液如下所述。
1×LA PCR缓冲液（TaKaRa公司制）
1.5mM MgCl2
各200μM dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP混合物）
0.05U/10μL LA Taq（TaKaRa公司制）
1μM ALDH2-F
1μM ALDH2-R
0.5ng/μL的DNA和10μM ALDH2-Block
总量：10μL
在以下的热循环程序下进行PCR扩增：95℃下1分钟的循环进行1个、95℃下1秒钟（用于变性）和58℃下1秒钟（用于退火）和72℃下1秒钟（用于DNA延伸）的循环进行30个。
PCR反应后，与实施例1同样地将PCR反应物供至电泳。图15表示电泳的结果。由图15可知，仅高效地扩增了由155个碱基对构成的目标序列。
（比较例2）
除了将实施例2中的反应溶液的阻碍核酸替换成蒸馏水以外，与实施例1同样地实施PCR反应。图16表示比较例2的电泳结果。
由图16所示可知，不仅扩增了155bp的目标序列，还非特异性地扩增了由665～1252个碱基对构成的双链DNA。
图17为表示实施例2和比较例2中由电泳的分析结果算出的非特异性扩增产物的浓度的总和的图表。由图17可知，比较例2中发生了4.07ng/μL的非特异性扩增。而实施例2中该总和减少至仅0.6ng/μL。这表明与实施例1同样，阻碍核酸20有助于目标序列的高效扩增。
（实施例3）
本实施例表示对人的肌萎缩蛋白基因进行扩增的例子。
表5示出正向引物4（以下记为“Dys-F”）和反向引物5（以下记为“Dys-R”）的序列。
表5人肌萎缩蛋白基因扩增用的引物的序列
 Dys-F  5’-AGGCTTGAAAGGGCAAGTAGAAGT-3’（序列号7）
 Dys-R  5’-GCTGATCTGCTGGCATCTTGC-3’（序列号8）
表6示出第1阻碍核酸20（以下记为“Dys-Block-1”）和第2阻碍核酸30（以下记为“Dys-Block-2”）的序列。
表6人肌萎缩蛋白基因扩用的阻碍核酸的序列
 Dys-Block-1   5’-GACTTTTTCTCAACACTTTTGCCATC-3’（序列号9）
 Dys-Block-2   5’-TGGAAGAAAATGGGATGTGGTAGAA-3’（序列号10）
通过由Dys-F和Dys-R构成的一对引物，由肌萎缩蛋白基因中的147个碱基对构成的目标序列被扩增。
Dys-Block-1由与从第3非扩增序列7a的3’末端侧开始数的第40～65个碱基互补的26个碱基序列构成。Dys-Block-2由与从第2非扩增序列6b的3’末端侧开始数的第222～246个碱基互补的25个碱基序列构成。
Dys-Block-1和Dys-Block-2的3’末端的核苷酸所含的3位的糖均通过磷酸化被修饰。
使用DNA Micro Kit（QIAGEN公司制）从人的血液100μL中提取基因组DNA，制备10ng/μL的模板DNA。
PCR的反应溶液如下所述。
1×TITANIUM Taq PCR缓冲液（Clontech公司制）
各200μM dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP混合物）
1×TITANIUM Taq DNA聚合酶（Clontech公司制）
1μM Dys-F
1μM Dys-R、0.5ng/μL的基因组DNA
10μM Dys-Block-1和10μM Dys-Block-2
总量：10μL
在以下的热循环程序下进行PCR扩增：95℃下1分钟的循环进行1个、95℃下1秒钟（用于变性）和54℃下1秒钟（用于退火）和72℃下1秒钟（用于DNA延伸）的循环进行50个。
PCR反应后，与实施例1同样地将PCR反应物供至电泳。图18表示电泳的结果。由图18可知，高效地扩增了147bp的目标序列。
（比较例3）
除了将实施例3中的反应溶液的阻碍核酸替换成蒸馏水以外，与实施例1同样地实施PCR反应。图19表示比较例3的电泳结果。
由图19所示可知，不仅扩增了147个碱基对构成的目标序列，还非特异性地扩增了由375～712个碱基对构成的双链DNA。
图20为表示实施例3和比较例3中由电泳的分析结果算出的非特异性扩增产物的浓度总和的图表。由图20可知，比较例3中发生了26.93ng/μL的非特异性扩增。而实施例3中该总和减少至仅5.97ng/μL。这表明与实施例1和实施例2同样，第1阻碍核酸20和第2阻碍核酸30有助于目标序列的高效扩增。
产业上的可利用性
本发明可用于通常的PCR反应。本发明还可用于用以临床检查的PCR。
符号说明
1双链目标序列
1a单链目标序列
1b互补性单链目标序列
2所希望的扩增双链DNA序列
3不希望的扩增双链DNA序列
3a不希望的扩增单链DNA
3b不希望的扩增互补性单链DNA
4正向引物
5反向引物
6第1单链DNA
6a第1非扩增序列
6b第2非扩增序列
6c单链目标序列1a的3’末端部分
6e1第1复制序列
6e2第3复制序列
6g扩增单链目标序列
7第2单链DNA
7a第3非扩增序列
7b第4非扩增序列
7c互补性单链目标序列1b的3’末端部分
7e第2复制序列
7e2第2复制序列
7g扩增互补性单链目标序列
20第1阻碍核酸
30第2阻碍核酸
序列表非关键词文字
序列号1：用于对作为目标序列的人ABO式血型基因进行扩增的正向引物
序列号2：用于对作为目标序列的人ABO式血型基因进行扩增的反向引物
序列号3：用于抑制目标序列以外的非特异性扩增的寡核酸（DNA）
序列号4：用于对作为目标序列的人乙醛脱氢酶2基因进行扩增的正向引物
序列号5：用于对作为目标序列的人乙醛脱氢酶2基因进行扩增的反向引物
序列号6：用于抑制目标序列以外的非特异性扩增的寡核酸（DNA）
序列号7：用于对作为目标序列的人肌萎缩蛋白基因进行扩增的正向引物
序列号8：用于对作为目标序列的人肌萎缩蛋白基因进行扩增的反向引物
序列号9：用于抑制目标序列以外的非特异性扩增的寡核酸（DNA）
序列号10：用于抑制目标序列以外的非特异性扩增的寡核酸（DNA）
Figure IDA00001948332500011
Figure IDA00001948332500021

Claims (8)

1.一种对由第1单链DNA和第2单链DNA构成的双链DNA中的双链目标序列进行扩增的方法，其中，
所述双链目标序列由单链目标序列和互补性单链目标序列构成，
所述第1单链DNA由3’末端-第1非扩增序列-所述单链目标序列-第2非扩增序列-5’末端构成，
所述第2单链DNA由5’末端-第3非扩增序列-所述互补性单链目标序列-第4非扩增序列-3’末端构成，
所述互补性单链目标序列、第3非扩增序列和第4非扩增序列分别与所述单链目标序列、所述第1非扩增序列和第2非扩增序列互补，
所述方法是将DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸、所述双链DNA、正向引物、反向引物和第1阻碍核酸混合，使用聚合酶链反应对所述双链目标序列进行扩增的工序A，
其中，所述正向引物和所述反向引物均作为用于利用所述DNA聚合酶的延伸反应的起点发挥作用，
所述正向引物与所述单链目标序列所含的3’末端侧的序列的部分互补，
所述反向引物与所述互补性单链目标序列所含的3’末端侧部分的序列互补，
所述第1阻碍核酸不会作为用于利用所述DNA聚合酶的延伸反应的起点发挥作用，
所述第1阻碍核酸与所述第3非扩增序列的一部分互补。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第1阻碍核酸由位于3’末端的核苷酸所含的糖的3位OH基被氢、磷酸基、氨基、生物素基、巯基或它们的衍生物取代或修饰的DNA构成。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第1阻碍核酸由位于3’末端的核苷酸所含的糖的3位OH基被氢、磷酸基、氨基、生物素基、巯基或它们的衍生物取代或修饰的锁定核酸构成。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第1阻碍核酸由肽核酸构成。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述工序A中还混合第2阻碍核酸，所述第2阻碍核酸不作为用于利用所述DNA聚合酶的延伸反应的起点发挥作用，且与所述第2非扩增序列的一部分互补。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述第2阻碍核酸由位于3’末端的核苷酸所含的糖的3位OH基被氢、磷酸基、氨基、生物素基、巯基或它们的衍生物取代或修饰的DNA构成。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述第2阻碍核酸由位于3’末端的核苷酸所含的糖的3位OH基被氢、磷酸基、氨基、生物素基、巯基或它们的衍生物取代或修饰的锁定核酸构成。
8.根据权利要求5所述的方法，其中，所述第2阻碍核酸由肽核酸构成。
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