JP4960536B2 - 二本鎖ｄｎａ中の標的配列を増幅する方法 - Google Patents

Description

本発明は、二本鎖ＤＮＡ中の標的配列を増幅する方法に関する。

図１に示されるポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＰＣＲ」という）は、第１一本鎖ＤＮＡ６および第２一本鎖ＤＮＡ７からなる二本鎖ＤＮＡに含まれる標的配列１を増幅する代表的な方法である。

以下、図１を参照しながらＰＣＲ法を簡単に説明する。

第１一本鎖ＤＮＡ６は、３’末端−第１非増幅配列６ａ−一本鎖標的配列１ａ−第２非増幅配列６ｂ−５’末端からなる。第２一本鎖ＤＮＡ７は、５’末端−第３非増幅配列７ａ−相補的一本鎖標的配列１ｂ−第４非増幅配列７ｂ−３’末端からなる。相補的一本鎖標的配列１ｂ、第３非増幅配列７ａ、および第４非増幅配列７ｂは、それぞれ、一本鎖標的配列１ａ、第１非増幅配列６ａ、および第２非増幅配列６ｂと相補的である。

まず、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、二本鎖ＤＮＡ１、フォワードプライマー４、およびリバースプライマー５を混合して混合液を調製する。

フォワードプライマー４は５〜２０塩基を有する核酸からなり、かつ一本鎖標的配列１ａの３’末端部分６ｃに相補的である。リバースプライマー５は５〜２０塩基を有する核酸からなり、かつ相補的一本鎖標的配列１ｂ’の３’末端部分に相補的である。そのため、フォワードプライマー４およびリバースプライマー５は、それぞれ、３’末端部分６ｃおよび３’末端部分７ｃに結合する。

次に、当該混合液は９４℃〜１００℃で１秒から１００秒間加熱され、その後、５０〜７０℃で１秒から１００秒間冷却される。加熱および冷却を繰り返し、増幅二本鎖ＤＮＡ配列２を得る。増幅二本鎖ＤＮＡ配列２は、一本鎖標的配列１ａと同一である増幅一本鎖標的配列６ｇおよび相補的一本鎖標的配列１ｂと同一である増幅相補的一本鎖標的配列７ｇからなる。

特許文献１から３は、本発明と関連し得る。

特開平５−１９９９００号公報 特表２００３−５３４７７２号公報 特表平３−５０８６３６号公報（特に第３図、第１２図）

図１に示すように、第１非増幅配列６ａが一本鎖標的配列１ａの３’末端部分６ｃと同一の配列６ｄを含む場合、フォワードプライマー４は、３’末端部分６ｃだけでなく当該配列６ｄにも結合する。第１非増幅配列６ａが一本鎖標的配列１ａの３’末端部分６ｃと類似の配列６ｄを含む場合、フォワードプライマー４は、３’末端部分６ｃだけでなく当該配列６ｄにも誤って結合し得る。

そのため、得られる増幅二本鎖ＤＮＡ配列は、望まれる増幅二本鎖ＤＮＡ配列２だけでなく、望まれない増幅二本鎖ＤＮＡ配列３をも含む。当該増幅二本鎖ＤＮＡ配列３は、非特異的増幅の結果物であり、望まれない増幅一本鎖ＤＮＡ３ａおよび増幅相補的一本鎖ＤＮＡ３ｂからなる。

本発明の目的は、望まれない増幅二本鎖ＤＮＡ配列３の発生を抑制することができる増幅方法を提供することである。

上記課題を解決する本発明は、第１一本鎖ＤＮＡおよび第２一本鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡ中の二本鎖標的配列を増幅する方法であって、
前記二本鎖標的配列は、一本鎖標的配列（１ａ）および相補的一本鎖標的配列（１ｂ）からなり、
前記第１一本鎖ＤＮＡは、３’末端−第１非増幅配列（６ａ）−前記一本鎖標的配列（１ａ）−第２非増幅配列（６ｂ）−５’末端からなり、
前記第２一本鎖ＤＮＡは、５’末端−第３非増幅配列（７ａ）−前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）−第４非増幅配列（７ｂ）−３’末端からなり、
前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）、第３非増幅配列（７ａ）、および第４非増幅配列（７ｂ）は、それぞれ、前記一本鎖標的配列（１ｂ）、前記第１非増幅配列（６ａ）、および第２非増幅配列（６ｂ）と相補的であり、
前記方法は、
ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記二本鎖ＤＮＡ（６・７）、フォワードプライマー、リバースプライマー、および第１ブロック核酸（２０）を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記二本鎖標的配列を増幅する工程Ａ、
ここで、
前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーは、いずれも、前記ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応のための起点として作用し、
前記フォワードプライマーは、前記一本鎖標的配列（１ａ）に含まれる３’末端側の配列の部分に相補的であり、
前記リバースプライマーは、前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）に含まれる３’末端側の部分の配列に相補的であり、
前記第１ブロック核酸（２０）は、前記ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応のための起点として作用せず、
前記第１ブロック核酸（２０）は、前記第３非増幅配列（７ａ）の一部と相補的である。

望まれない増幅二本鎖ＤＮＡ配列３の発生が抑制される。

従来のＰＣＲを示す図 本発明に係るＰＣＲを示す図 図２に続く、本発明に係るＰＣＲを示す図 図３に続く、本発明に係るＰＣＲを示す図 図４に続く、本発明に係るＰＣＲを示す図 図５に続く、本発明に係るＰＣＲを示す図 従来のＰＣＲを示す図 図７に続く、従来のＰＣＲを示す図 図８に続く、従来のＰＣＲを示す図 図９に続く、従来のＰＣＲを示す図 図１０に続く、従来のＰＣＲを示す図 実施例１における電気泳動時の結果を示すグラフ 比較例１における電気泳動時の結果を示すグラフ 実施例１および比較例１における非特異的増幅産物の濃度を比較したグラフ 実施例２における電気泳動時の結果を示すグラフ 比較例２における電気泳動時の結果を示すグラフ 実施例２および比較例２における非特異的増幅産物の濃度を比較したグラフ 実施例３における電気泳動時の結果を示すグラフ 比較例３における電気泳動時の結果を示すグラフ 実施例３および比較例３における非特異的増幅産物の濃度を比較したグラフ

以下、本発明の方法を図２〜図１１を参照しながら説明する。

（実施の形態）
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて二本鎖標的配列１を増幅する際に、第１ブロック核酸２０を加えることによって特徴付けられる。

第１ブロック核酸２０は、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応のための起点として作用しない。好ましくは、ブロック核酸は合成オリゴ核酸である。

第１ブロック核酸２０の例は、修飾されたＤＮＡ、修飾されたＬｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（以下、「ＬＮＡ」）、およびペプチド核酸（以下、「ＰＮＡ」）である。

核酸は、糖、リン酸基、および塩基から構成されるヌクレオチドがリン酸エステル結合で連なった生体高分子である。修飾されたＤＮＡおよびＬＮＡの３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基は、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されている。ＰＮＡは当該修飾を必要としない。

フォワードプライマー４は、一本鎖標的配列１ａの３’末端部分６ｃに相補的である。そのため、図２に示すように、当該３’末端部分６ｃにフォワードプライマー４は結合する。さらに、フォワードプライマー４は、第１非増幅配列６ａに含まれ、一本鎖標的配列１ａと同一または類似の配列６ｄにも結合し得る。

リバースプライマー５は、相補的一本鎖標的配列１ｂの３’末端部分に相補的である。そのため、図２に示すように、当該部分にリバースプライマー５は結合する。

ブロック核酸２０は、第３非増幅配列７ａの一部と相補的である。そのため、図２に示すように、ブロック核酸２０は、第３非増幅配列７ａの当該一部と結合する。

ＰＣＲを開始すると、図３に示すように、フォワードプライマー４の３’末端およびリバースプライマー５の３末端’からＤＮＡが伸長し、第１複製配列６ｅ１、第２複製配列７ｅ、および第３複製配列６ｅ２を形成する。

第１複製配列６ｅ１は、一本鎖標的配列１ａと第２非増幅配列６ｂとを連続的につなげることによって形成された配列に相補的である。第３複製配列６ｅ２は、第１非増幅配列６ａの一部と一本鎖標的配列１ａと第２非増幅配列６ｂとを連続的に繋（つな）げることによって形成された配列に相補的である。

ブロック核酸２０は、リバースプライマー５のＤＮＡ伸長を停止する。従って、第２複製配列７ｅは、相補的一本鎖標的配列１ｂと第３非増幅配列７ａの一部とを連続的につなげることによって形成された配列に相補的である。しかし第２複製配列７ｅは、ブロック核酸２０が結合した第２一本鎖ＤＮＡ７の部分から５’末端側の配列に相補的な配列７ｈを含まない。

さらにＰＣＲを進めると、図４に示すように、フォワードプライマー４は第１一本鎖ＤＮＡ配列６および第２複製配列７ｅに結合する。リバースプライマー５は、第２一本鎖ＤＮＡ配列７、第１複製配列６ｅ１、および第３複製配列６ｅ２に結合する。ブロック核酸２０も、第３非増幅配列７ａおよび第３複製配列６ｅ２に結合する。

その後、図５に示すように、２つのフォワードプライマー４の３’末端からＤＮＡが伸長し、第１複製配列６ｅ１および増幅相補的一本鎖標的配列７ｇが形成される。３つのリバースプライマー５の３’末端からＤＮＡが伸長し、１本の増幅一本鎖標的配列６ｇおよび２本の第２複製配列７ｅが形成される。増幅一本鎖標的配列６ｇおよび増幅相補的一本鎖標的配列７ｇは、それぞれ、一本鎖標的配列１ａおよび相補的一本鎖標的配列１ｂと同一である。

すなわち、第１一本鎖ＤＮＡ配列６およびフォワードプライマー４から第１複製配列６ｅ１が形成される。第１複製配列６ｅ１およびリバースプライマー５から増幅一本鎖標的配列６ｇが形成される。第２複製配列６ｅ２およびリバースプライマー５から第２複製配列７ｅが形成される。同様に、第２一本鎖ＤＮＡ配列７およびリバースプライマー５から第２複製配列７ｅが形成される。第２複製配列７ｅおよびフォワードプライマー４から増幅相補的一本鎖標的配列７ｇが形成される。

さらにＰＣＲが進められると、図６に示すように、１回のサイクルで、図５において形成される配列だけでなく、増幅一本鎖標的配列６ｇおよびフォワードプライマー４から増幅相補的一本鎖標的配列７ｇが形成される。増幅相補的一本鎖標的配列７ｇおよびリバースプライマー５から増幅一本鎖標的配列６ｇも形成される。

ｎ回のサイクルを行った後には、２^ｎ個の増幅一本鎖標的配列６ｇおよび増幅相補的一本鎖標的配列７ｇが得られる。一方、望まれない増幅二本鎖ＤＮＡ配列３は存在しない。これは、言うまでもないが、ブロック核酸２０のためである。

図２においても、通常のＰＣＲと同様に、二本鎖ＤＮＡをほどいて一本鎖ＤＮＡを得るために温度が上げられ、そしてプライマー４・５を結合させるために温度が下げられる。

図７は、ブロック核酸２０を用いない従来のＰＣＲを示す。

フォワードプライマー４は、一本鎖標的配列１ａの３’末端部分６ｃに相補的である。そのため、図７に示すように、当該３’末端部分６ｃにフォワードプライマー４は結合する。さらに、第１非増幅配列６ａが当該３’末端部分６ｃと同一または類似の配列６ｄを含む場合、フォワードプライマー４は、当該部分６ｃだけでなく当該配列６ｄにも結合し得る。

ＰＣＲを開始すると、図２〜図６と異なり、図８に示すように、相補的一本鎖配列１ｂと第３非増幅配列７ａとが連続的につなげることとによって形成された配列と相補的な第２複製配列７ｅ２が形成される。当該第２複製配列７ｅ２は、３’末端部分６ｃだけでなく配列６ｄも含む。

さらにＰＣＲを進めると、図９に示すように、第２複製配列７ｅ２にフォワードプライマー４が結合する。このとき、フォワードプライマー４は、第２複製配列７ｅ２に含まれる部分６ｃだけでなく配列６ｄにも結合する。

そのため、図１０に示すように、増幅一本鎖標的配列６ｇおよび増幅相補的一本鎖標的配列７ｇだけでなく、望まれない増幅一本鎖配列３ａおよび望まれない増幅相補的一本鎖配列３ｂまでもが形成されてしまう。そして、ｎ回のサイクルを行うと、２^ｎ個の増幅一本鎖標的配列６ｇおよび増幅相補的一本鎖標的配列７ｇだけでなく、２^ｎ個の望まれない増幅一本鎖配列３ａおよび望まれない増幅相補的一本鎖配列３ｂも形成されてしまう。

図２〜図６および図７〜図１０から理解されるように、ブロック核酸２０が、望まれない増幅二本鎖ＤＮＡ配列３を形成する望まれない増幅一本鎖配列３ａおよび望まれない増幅相補的一本鎖配列３ｂの形成を阻害する。このように、本発明は望まれない増幅二本鎖ＤＮＡ配列３の発生を抑制することができる。

図２に示すように、ブロック核酸２０の５’末端と相補的標的配列１ｂの５’末端側の配列１００は、０塩基以上２０塩基以下であることが好ましい。配列１００が、一本鎖標的配列１ａの３’末端部分６ｃと同一または類似の配列６ｄを含むことは極めて望ましくないからである。すなわち、配列１００が配列６ｄを含む場合、フォワードプライマー４は誤って当該配列６ｄに結合し得、そして図１に示すように、望ましくない増幅二本鎖ＤＮＡ配列３を形成する。

図１１に示すように、第２ブロック核酸３０が用いられ得る。当該第２ブロック核酸３０は、第２非増幅配列６ｂの一部と相補的である。第２ブロック核酸３０は、第１ブロック核酸２０と同様、修飾されたＤＮＡ、修飾されたＬＮＡ、またはＰＮＡからなる。

図２と比較して、図１１に示すように２つのブロック核酸２０・３０は、望まれない増幅二本鎖ＤＮＡ配列３の発生をより効率的に抑制し得る。

本発明において用いられるＤＮＡポリメラーゼの一例は、Ｔａｑ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅおよびＰｆｕ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅである。ＤＮＡポリメラーゼは５’−＞３’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ活性を有さないことが好ましい。

デオキシヌクレオシド三リン酸は、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、およびデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）の混合物である。デオキシヌクレオシド三リン酸は、通常、等量のこれらの４種類を含み、その濃度は２０μＭ〜２００μＭである。

（実施例）
以下、本発明の実験例を説明する。

（実施例１）
実施例１は、ヒトのＡＢＯ式血液型遺伝子のＥｘｏｎ６の領域を増幅する例を示す。

表１は、フォワードプライマー４（以下、「ＡＢＯ−Ｆ」）およびリバースプライマー５（以下、「ＡＢＯ−Ｒ」）の配列を示す。

表２は、ブロック核酸２０（以下、「ＡＢＯ−Ｂｌｏｃｋ」）の配列を示す。

ＡＢＯ−ＦおよびＡＢＯ−Ｒからなる一対のプライマーにより、ＡＢＯ式血液型遺伝子中のＡＢ型被験者の１３５個の塩基対の標的配列が増幅される。

ＡＢＯ−Ｂｌｏｃｋは、第３非増幅配列７ａの３’末端側から数えて１９〜３９番目の塩基に相補的な２１塩基配列からなる。当該部分は、第２一本鎖ＤＮＡ７の３’末端側から数えて２０１番目から２２１番目の塩基配列である。ＡＢＯ−Ｂｌｏｃｋの３’末端のヌクレオチドに含まれる３位の糖はリン酸化によって修飾されている。

ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＡＢ型被験者の血液１００μLからゲノムＤＮＡを抽出し、１０ｎｇ／μＬの鋳型ＤＮＡを調製した。

ＰＣＲの反応溶液は、以下の通りである。

1×ＴＩＴＡＮＩＵＭ Ｔａｑ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）
２００μＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ混合物）、

１×ＴＩＴＡＮＩＵＭ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、

１μＭ ＡＢＯ−Ｆ

１μＭ ＡＢＯ−Ｒ

０．５ｎｇ／μＬのゲノムＤＮＡ、および

１０μＭ ＡＢＯ−Ｂｌｏｃｋ

全量：１０μＬ

ＰＣＲ増幅を、以下のサーマルプロファイル：９５℃で１分間を１サイクル、９５℃で１秒間（変性のため）と６２℃で１秒間（アニールのため）と７２℃で１秒間（ＤＮＡ伸長のため）を５０サイクル、で行った。

ＰＣＲ反応後、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いて、ＰＣＲ反応物を電気泳動に供した。図１２は電気泳動の結果を示す。図１２から明らかなように、１３５個の塩基対からなる標的配列のみが特異的に増幅され、非特異的な増幅が発生していない。図３中のＭａｒｋｅｒは電気泳動キットに付属されているＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒである。

（比較例１）
実施例１における反応溶液のブロック核酸を蒸留水に置換したこと以外は、実施例１と同様にＰＣＲ反応を実施した。図１３は比較例１の電気泳動の結果を示す。

図１３より明らかなように、１３５個の塩基対からなる標的配列が増幅されただけでなく１８３個〜１２０９個の塩基対からなる２本鎖ＤＮＡが非特異的に増幅されている。

これは、ブロック核酸２０が非特異的な増幅を抑制することを示す。

図１４は、実施例１および比較例１において、電気泳動の解析結果から算出された非特異的な増幅産物の濃度の総和を示すグラフである。図１４から明らかなように、比較例１では１６．１５ｎｇ／μＬの非特異的な増幅が起こっている。一方、実施例１では非特異的な増幅を完全に抑制することができた。これは非特異的な増幅を抑制することによって得られる相乗効果であると考えられる。つまり、余分な試薬の消費を抑えることができ、さらに反応溶液中の標的配列の比率が増すことで、標的配列の優先的な増幅が可能となる。このように、ブロック核酸２０は標的配列の効率的な増幅に寄与することが示された。

（実施例２）
実施例２は、ヒトのアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ２遺伝子の第１２エクソンの領域を増幅する例を示す。

表３は、フォワードプライマー４（以下、「ＡＬＤＨ２−Ｆ」）およびリバースプライマー５（以下、「ＡＬＤＨ２−Ｒ」）の配列を示す。

表４は、ブロック核酸２０（以下、「ＡＬＤＨ２−Ｂｌｏｃｋ」）の配列に示す。

ＡＬＤＨ２−ＦおよびＡＬＤＨ２−Ｒからなる一対プライマーによって、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ２遺伝子中の１５５個の塩基対からなる標的配列が増幅される。

ＡＬＤＨ２−Ｂｌｏｃｋは第３非増幅配列７ａの３’末端側から数えて７７〜９７番目の塩基に相補的な２１塩基配列からなる。ＡＬＤＨ２−Ｂｌｏｃｋの３’末端のヌクレオチドに含まれる３位の糖はリン酸化によって修飾されている。

ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてヒトの血液１００μLからゲノムＤＮＡを抽出し、１０ｎｇ／μＬの鋳型ＤＮＡを調製した。

ＰＣＲの反応溶液は以下の通りである。

１×ＬＡ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ社製）
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２

各２００μＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ混合物）
０．０５Ｕ／１０μＬ ＬＡ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社製）
1μＭ ＡＬＤＨ２−Ｆ

１μＭ ＡＬＤＨ２−Ｒ

０．５ｎｇ／μＬのＤＮＡ、および

１０μＭ ＡＬＤＨ２−Ｂｌｏｃｋ

全量：１０μＬ

ＰＣＲ増幅を、以下のサーマルプロファイル：９５℃で１分間を１サイクル、９５℃で１秒間（変性のため）と５８℃で１秒間（アニールのため）と７２℃で１秒間（ＤＮＡ伸長のため）を３０サイクル、で行った。

ＰＣＲ反応後、実施例１と同様にＰＣＲ反応物を電気泳動に供した。図１５は電気泳動の結果を示す。図１５から明らかな通り、１５５個の塩基対からなる標的配列が効率的に増幅されている。

（比較例２）
実施例２における反応溶液のブロック核酸を蒸留水に置換したこと以外は、実施例１と同様にＰＣＲ反応を実施した。図１６は比較例２の電気泳動の結果を示す。

図１６から明らかなように、１５５ｂｐの標的配列が増幅されただけでなく、６６５〜１２５２個の塩基対からなる２本鎖ＤＮＡが非特異的に増幅されている。

図１７は、実施例２および比較例２において、電気泳動の解析結果から算出された非特異的な増幅産物の濃度の総和を示すグラフである。図１７から明らかなように、比較例２では４．０７ｎｇ／μＬの非特異的な増幅が生じている。一方、実施例２では当該総和はわずか０．６ｎｇ／μＬに減少している。このことは、実施例１と同様、ブロック核酸２０は標的配列の効率的な増幅に寄与することを示す。

（実施例３）
本実施例は、ヒトのジストロフィン遺伝子を増幅する例を示す。

表５は、フォワードプライマー４（以下、「Ｄｙｓ−Ｆ」）およびリバースプライマー５（以下、「Ｄｙｓ−Ｒ」）の配列を示す。

表６は、第１ブロック核酸２０（以下、「Ｄｙｓ−Ｂｌｏｃｋ−１」）および第２ブロック核酸３０（以下、「Ｄｙｓ−Ｂｌｏｃｋ−２と表記」）の配列を示す。

Ｄｙｓ−ＦおよびＤｙｓ−Ｒからなる一対のプライマーによって、ジストロフィン遺伝子中の１４７個の塩基対からなる標的配列が増幅される。

Ｄｙｓ−Ｂｌｏｃｋ−１は第３非増補配列７ａの３’末端側から数えて４０〜６５番目の塩基に相補的な２６塩基配列からなる。Ｄｙｓ−Ｂｌｏｃｋ−２は第２非増補配列６ｂの３’末端側から数えて２２２〜２４６番目の塩基に相補的な２５塩基配列からなる。

Ｄｙｓ−Ｂｌｏｃｋ−１およびＤｙｓ−Ｂｌｏｃｋ−２の３’末端のヌクレオチドに含まれる３位の糖は、いずれもリン酸化によって修飾されている。

ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてヒトの血液１００μLからゲノムＤＮＡを抽出し、１０ｎｇ／μＬの鋳型ＤＮＡを調製した。

ＰＣＲの反応溶液は以下の通りである。

１×ＴＩＴＡＮＩＵＭ Ｔａｑ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）
各２００μＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ混合物）
１×ＴＩＴＡＮＩＵＭ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）
１μＭ Ｄｙｓ−Ｆ
１μＭ Ｄｙｓ−Ｒ、０．５ｎｇ／μＬのゲノムＤＮＡ
１０μＭ Ｄｙｓ−Ｂｌｏｃｋ−１、および
１０μＭ Ｄｙｓ−Ｂｌｏｃｋ−２
全量：１０μＬ

ＰＣＲ増幅を、以下のサーマルプロファイル：９５℃で１分間を１サイクル、９５℃で１秒間（変性のため）と５４℃で１秒間（アニールのため）と７２℃で１秒間（ＤＮＡ伸長のため）を５０サイクル、で行った。

ＰＣＲ反応後、実施例１と同様にＰＣＲ反応物を電気泳動に供した。図１８は電気泳動の結果を示す。図１８から明らかな通り、１４７ｂｐの標的配列が効率的に増幅された。

（比較例３）
実施例３における反応溶液のブロック核酸を蒸留水に置換したこと以外は、実施例１と同様にＰＣＲ反応を実施した。図１９は比較例３の電気泳動の結果を示す。

図１９から明らかなように、１４７個の塩基対からなる標的配列が増幅されただけでなく、３７５〜７１２個の塩基対からなる２本鎖ＤＮＡが非特異的に増幅されている。

図２０は、実施例３および比較例３において、電気泳動の解析結果から算出された非特異的な増幅産物の濃度の総和を示すグラフである。図２０から明らかなように、比較例３では２６．９３ｎｇ／μＬの非特異的な増幅が生じている。一方、実施例３では当該総和はわずか５．９７ｎｇ／μＬに減少している。このことは、実施例１および実施例２と同様、第１ブロック核酸２０および第２ブロック核酸３０は標的配列の効率的な増幅に寄与することを示す。

本発明は、一般的なＰＣＲ反応に利用可能である。本発明は、臨床検査のためのＰＣＲにも利用できる。

１ 二本鎖標的配列
１ａ 一本鎖標的配列
１ｂ 相補的一本鎖標的配列
２ 望まれる増幅二本鎖ＤＮＡ配列
３ 望まれない増幅二本鎖ＤＮＡ配列
３ａ 望まれない増幅一本鎖ＤＮＡ
３ｂ 望まれない増幅相補的一本鎖ＤＮＡ
４ フォワードプライマー
５ リバースプライマー
６ 第１一本鎖ＤＮＡ
６ａ 第１非増幅配列
６ｂ 第２非増幅配列
６ｃ 一本鎖標的配列１ａの３’末端部分
６ｅ１ 第１複製配列
６ｅ２ 第３複製配列
６ｇ 増幅一本鎖標的配列
７ 第２一本鎖ＤＮＡ
７ａ 第３非増幅配列
７ｂ 第４非増幅配列
７ｃ 相補的一本鎖標的配列１ｂの３’末端部分
７ｅ 第２複製配列
７ｅ２ 第２複製配列
７ｇ 増幅相補的一本鎖標的配列
２０ 第１ブロック核酸
３０ 第２ブロック核酸

配列番号１：標的配列としてのヒトのＡＢＯ式血液型遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー
配列番号２：標的配列としてのヒトのＡＢＯ式血液型遺伝子を増幅するためのリバースプライマー
配列番号３：標的配列以外の非特異的増幅を抑えるためのオリゴ核酸（ＤＮＡ）
配列番号４：標的配列としてのヒトアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ２遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー
配列番号５：標的配列としてのヒトアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ２遺伝子を増幅するためのリバースプライマー
配列番号６：標的配列以外の非特異的増幅を抑えるためのオリゴ核酸（ＤＮＡ）
配列番号７：標的配列としてのヒトジストロフィン遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー
配列番号８：標的配列としてのヒトジストロフィン遺伝子を増幅するためのリバースプライマー
配列番号９：標的配列以外の非特異的増幅を抑えるためのオリゴ核酸（ＤＮＡ）
配列番号１０：標的配列以外の非特異的増幅を抑えるためのオリゴ核酸（ＤＮＡ）

Claims (8)

1. 第１一本鎖ＤＮＡおよび第２一本鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡ中の二本鎖標的配列を増幅する方法であって、
   前記二本鎖標的配列は、一本鎖標的配列および相補的一本鎖標的配列からなり、
   前記第１一本鎖ＤＮＡは、３’末端−第１非増幅配列−前記一本鎖標的配列−第２非増幅配列−５’末端からなり、
   前記第２一本鎖ＤＮＡは、５’末端−第３非増幅配列−前記相補的一本鎖標的配列−第４非増幅配列−３’末端からなり、
   前記相補的一本鎖標的配列、第３非増幅配列、および第４非増幅配列は、それぞれ、前記一本鎖標的配列、前記第１非増幅配列、および第２非増幅配列と相補的であり、
   前記方法は、
   ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記二本鎖ＤＮＡ、フォワードプライマー、リバースプライマー、および第１ブロック核酸を混合し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記二本鎖標的配列を増幅する工程Ａ、
   ここで、
   前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマーは、いずれも、前記ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応のための起点として作用し、
   前記フォワードプライマーは、前記一本鎖標的配列に含まれる３’末端側の配列の部分に相補的であり、
   前記リバースプライマーは、前記相補的一本鎖標的配列に含まれる３’末端側の部分の配列に相補的であり、
   前記第１ブロック核酸は、前記ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応のための起点として作用せず、
   前記第１ブロック核酸は、前記第３非増幅配列の一部と相補的である、方法。
2. 前記第１ブロック核酸は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＤＮＡからなる、請求項１に記載の方法。
3. 前記第１ブロック核酸は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＬｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄからなる、請求項１に記載の方法。
4. 前記第１ブロック核酸は、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄからなる、請求項１に記載の方法。
5. 前記工程Ａにおいて、第２ブロック核酸も混合される、請求項１に記載の方法。
   ここで、前記第２ブロック核酸は、前記ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応のための起点として作用せず、かつ前記第２非増幅配列の一部と相補的である。
6. 前記第２ブロック核酸は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＤＮＡからなる、請求項５に記載の方法。
7. 前記第２ブロック核酸は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオール基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＬｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄからなる、請求項５に記載の方法。
8. 前記第２ブロック核酸は、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄからなる、請求項５に記載の方法。

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