KR101959446B1 - 폴리뉴클레오티드 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

표적핵산에 대하여 상보적이고, 역배열(reverse configuration)인 2이상의 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 그의 용도를 제공한다.

Description

폴리뉴클레오티드 및 그의 용도{Polynucleotide and use thereof}
표적핵산에 대하여 상보적이고, 역배열(reverse configuration)인 2이상의 상보영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 그의 용도에 관한 것이다.
핵산의 증폭은 핵산 폴리머라제의 존재하에서 프라이머의 3'-말단으로부터 뉴클레오티드 서열을 연장하는 것을 포함한다. 상기 프라이머는 표적 핵산과 상보적인 서열을 포함한다. 서열의 연장을 위하여, 프라이머가 표적핵산과 특이적으로 안정적으로 혼성화될 것을 필요로 한다. 핵산 혼성화 산물의 안정성은 상보적 서열의 길이에 비례하는 것으로 알려져 있다. 반면, 프라이머의 길이가 길어지면, 증폭되는 표적 핵산의 길이 짧아진다.
종래 기술에 의하더라도, 표적핵산에 대하여 특이적으로 안정적으로 결합하면서도 증폭되는 표적핵산의 길이를 증가시킬 수 있는 폴리뉴클레오티드가 요구되고 있다.
일 양상은 표적핵산을 효율적으로 증폭할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
다른 양상은 표적핵산을 효율적으로 증폭할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다.
다른 양상은 표적핵산을 효율적으로 증폭할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키트를 제공한다.
다른 양상은 표적핵산에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 효율적으로 생산하는 방법을 제공한다.
일 양상은 표적핵산에 상보적인 2이상의 상보영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 제1 상보영역은 3'-말단으로부터 하나이상의 연속 뉴클레오티드가 표적핵산과 상보적인 것이고, 하나이상의 제2 상보영역은 제1 상보영역의 5' 방향의 하나이상의 연속 뉴클레오티드가 표적핵산과 상보적인 것이고, 제1 상보영역은 표적핵산의 뉴클레오티드 순서를 기준으로 제2 상보영역의 5' 방향 쪽에 혼성화하는 것인 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드에 있어서, 제2 상보영역은 1 내지 3개, 예를 들면, 1, 2, 또는 3 개일 수 있다. 또한, 제2 상보영역은 5' 말단으로부터 5' 말단 뉴클레오티드를 포함한 하나이상의 연속 뉴클레오티드가 표적핵산과 상보적인 것일 수 있다. 예를 들면, 1 내지 50nt, 예를 들면, 1-40, 1-30, 1-20, 1-10, 2-40, 2-30, 2-20, 2-10, 3-40, 3-30, 3-20, 또는 3-10nt일 수 있다. 제2 상보영역은 DNA, RNA, 또는 뉴클레오티드 유사체 (nucleotide analogue), 예를 들면, PNA 및 LNA를 포함하는 것일 수 있다. 제2 상보영역은 3 이상의 연속 뉴클레오티드가 표적핵산과 상보적인 것일 수 있다. 예를 들면, 3 내지 50nt, 3 내지 40nt, 3 내지 30nt, 3 내지 20nt, 3 내지 10nt, 또는 4 내지 16nt의 연속 뉴클레오티드가 표적핵산과 상보적인 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드에 있어서, 제1 상보영역은 2 이상의 연속 뉴클레오티드가 표적핵산과 상보적인 것일 수 있다. 예를 들면, 2 내지 50nt, 2 내지 40nt, 2 내지 30nt, 2 내지 20nt, 2 내지 10nt, 3 내지 50nt, 4 내지 40nt, 3 내지 30nt, 3 내지 20nt, 3 내지 10nt,또는 3 내지 16nt의 연속 뉴클레오티드가 표적핵산과 상보적인 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드에 있어서, 제1 상보영역과 제2 상보영역은 하나이상의 뉴클레오티드에 의하여 이격되어 있는 것일 수 있다. 제1 상보영역과 제2 상보영역은 링커에 의하여 이격되어 있는 것일 수 있다. 상기 링커는 핵산, 핵산 변형체, 단백질, 당, 또는 지질 분자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 핵산 변형체는 PNA, 또는 LNA를 포함하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 링커는 0 내지 50nt를 포함하는 핵산을 포함하는 것일 수 있다. 상기 링커의 길이는 예를 들면, 2 내지 50nt, 2 내지 40nt, 2 내지 30nt, 2 내지 20nt, 2 내지 10nt, 3 내지 50nt, 4 내지 40nt, 3 내지 30nt, 3 내지 20nt, 3 내지 10nt,또는 4 내지 10nt일 수 있다. 이 경우, 상기 링커는 프라이머 결합 부위, 제한효소 인식부위, 또는 프로브 결합 부위를 포함하는 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드에 있어서, 제1 상보영역은 표적핵산의 3'-말단으로부터 3'-말단 뉴클레오티드를 포함한 하나이상의 연속 뉴클레오티드와 상보적인 것일 수 있다. 예를 들면, 표적핵산의 3'-말단으로부터 3'-말단 뉴클레오티드를 포함한 2 이상의 연속 뉴클레오티드가 표적핵산과 상보적인 것일 수 있다. 예를 들면, 2 내지 50nt, 2 내지 40nt, 2 내지 30nt, 2 내지 20nt, 2 내지 10nt, 3 내지 50nt, 4 내지 40nt, 3 내지 30nt, 3 내지 20nt, 3 내지 10nt,또는 3 내지 16nt의 연속 뉴클레오티드가 표적핵산과 상보적인 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드에 있어서, 제2 상보영역은 표적핵산의 5'-말단으로부터 하나이상의 연속 뉴클레오티드와 상보적인 것일 수 있다. 예를 들면, 제2 상보영역은 표적핵산의 5'-말단으로부터 5'-말단 뉴클레오티드를 포함한 하나이상의 연속 뉴클레오티드와 상보적인 것일 수 있다. 이 경우, 제2 상보영역은 2이상의 연속 뉴클레오티드와 상보적인 것일 수 있다. 예를 들면, 2 내지 50nt, 2 내지 40nt, 2 내지 30nt, 2 내지 20nt, 2 내지 10nt, 3 내지 50nt, 4 내지 40nt, 3 내지 30nt, 3 내지 20nt, 3 내지 10nt,또는 3 내지 16nt의 연속 뉴클레오티드가 표적핵산과 상보적인 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체, 예를 들면, PNA 및 LNA를 포함하는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 제2 상보영역에 뉴클레오티드 유사체, 예를 들면, PNA 및 LNA를 포함하는 것일 수 있다. 그러나, 상기 뉴클레오티드 유사체, 예를 들면, PNA 및 LNA는 제2 상보영역뿐만 아니라 제1 상보영역에 포함될 수도 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단일가닥인 것일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 길이가 7 nt 내지 200 nt, 7 nt 내지 180 nt, 7 nt 내지 150 nt,7 nt 내지 130 nt,7 nt 내지 100 nt,7 nt 내지 80 nt,7 nt 내지 50 nt,7 nt 내지 30 nt, 7 nt 내지 20 nt, 7 nt 내지 15 nt, 또는 10 nt 내지 40 nt인 것일 수 있다.
상기 표적핵산은 DNA, RNA 또는 DNA와 RNA의 키메라일 수 있다. 상기 표적핵산은 단일가닥 또는 이중가닥인 것일 수 있다. 상기 표적핵산은 길이가 20 nt 내지 200 nt, 20 nt 내지 180 nt, 20 nt 내지 150 nt, 20 nt 내지 130 nt,20 nt 내지 100 nt,20 nt 내지 80 nt, 20 nt 내지 50 nt, 20 nt 내지 30 nt, 또는 20 nt 내지 40 nt인 것일 수 있다. 상기 표적핵산은 small RNA일 수 있다. small RNA는 예를 들면, microRNA, siRNA 또는 tRNA인 것일 수 있다. 또한, 상기 표적핵산은 200nt 이상의 뉴클레오티드를 갖는 RNA로서, 연속적인 30nt 서열의 GC 함유량이 30%이만이거나 80%이상인 영역이 존재하는 RNA, 분자 내에서 서로 상보적인 염기서열이 5 nt이상 연속적으로 존재하여 분자내 2차 구조 (secondary structure)를 형성할 수 있는 RNA, 동일한 nt가 연속적으로 5개이상 존재하는 RNA 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드의 제1 상보영역 및 제2 상보영역은 표적핵산에 대하여 혼성화된 경우, 1nt 이상 서로 이격되어 표적핵산에 혼성화되는 것일 수 있다. 예를 들면, 1-20nt, 1-10nt, 1-5nt, 2nt, 3nt, 4nt, 5nt, 6nt, 7nt, 8nt, 9nt, 10nt 또는 11nt 이격된 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 주형 의존적 핵산 합성에서 프라이머로서 작용할 수 있다. 따라서, 상기 폴리뉴클레오티드는 프라이머로 사용되는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 시료 중의 표적 핵산의 존재를 확인하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다.
다른 양상은 표적핵산에 상보적인 2이상의 상보영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 제1 상보영역은 3'-말단으로부터 하나이상의 연속 뉴클레오티드가 표적핵산과 상보적인 것이고, 하나이상의 제2 상보영역은 제1 상보영역의 5' 방향의 하나이상의 연속 뉴클레오티드가 표적핵산과 상보적인 것이고, 제1 상보영역은 표적핵산의 뉴클레오티드 순서를 기준으로 제2 상보영역의 3' 방향 쪽에 혼성화하는 것인 폴리뉴클레오티드; 및 표적 핵산을 포함하는, 표적핵산을 증폭하기 위한 조성물을 제공한다.
상기 조성물에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드에 대하여는 상기한 바와 같다. 또한, 상기 표적핵산에 대하여는 상기한 바와 같다.
상기 조성물은 표적핵산을 증폭하기 위한 조성물이다. 상기 증폭은 핵산 증폭을 위하여 알려진 방법일 수 있다. 상기 증폭은 예를 들면, DNA 증폭 또는 RNA 증폭일 수 있다. 상기 증폭 방법은 열순환 (termal cycling)을 필요로 하는 것 또는 등온 (isothermal)에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 증폭방법은 폴리머라제 연쇄 반응 (polymerase chain reaction: PCR), NASBA (핵산 서열-기초 증폭), LCR (리가제 연쇄반응), 가닥치환 증폭 (strand displacement amplificaton: SDA), 롤링서클증폭(rolling circle amplification: RCA) 등을 포함할 수 있다. 상기 증폭방법은 또한, RNA 증폭 방법을 포함할 수 있다. 예를 들면, 역전사 (reverse transcription: RT) 또는 역전사-PCR을 포함할 수 있다. 증폭이란 표적핵산 서열 또는 그에 상보적인 서열의 카피 수를 증가시키는 것일 수 있다. "PCR"은 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법일 수 있다.
따라서, 상기 조성물은 표적핵산의 증폭에 요구되는 알려진 물질을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 핵산 폴리머라제, 그의 활성에 필요한 버퍼, 보조인자, 및/또는 기질을 더 포함할 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 역전사 효소 (reverse transcriptase) 및 이들의 조합일 수 있다. 역전사 (reverse transcription)란 RNA를 주형으로 하여 RNA 서열에 상보적인 DNA 가닥을 합성하는 것일 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 가닥치환활성을 갖는 것일 수 있다. 예를 들면, 레트로바이러스, 예를 들면, HIV, MMLV, 및 AMV로부터 유래된 하나이상의 역전사 효소일 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 3'-> 5' 엑소뉴클레아제 활성 (exonuclease activity)을 갖지 않는 것일 수 있다. 상기 조성물은 역전사 또는 PCR 증폭에 필요한 물질을 포함하는 것일 수 있다.
다른 양상은 표적핵산에 상보적인 2이상의 상보영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 제1 상보영역은 3'-말단으로부터 하나이상의 연속 뉴클레오티드가 표적핵산과 상보적인 것이고, 하나이상의 제2 상보영역은 제1 상보영역의 5' 방향의 하나이상의 연속 뉴클레오티드가 표적핵산과 상보적인 것이고, 제1 상보영역은 표적핵산의 뉴클레오티드 순서를 기준으로 제2 상보영역의 3' 방향 쪽에 혼성화하는 것인 폴리뉴클레오티드; 및 표적 핵산을 포함하는, 표적핵산을 증폭하기 위한 키트를 제공한다.
상기 키트에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드에 대하여는 상기한 바와 같다. 또한, 상기 표적핵산에 대하여는 상기한 바와 같다.
상기 키트는 표적핵산을 증폭하기 위한 것이다. 상기 증폭은 핵산 증폭을 위하여 알려진 방법일 수 있다. 상기 증폭은 예를 들면, DNA 증폭 또는 RNA 증폭일 수 있다. 상기 증폭 방법은 열순환 (termal cycling)을 필요로 하는 것 또는 등온 (isothermal)에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 증폭방법은 폴리머라제 연쇄 반응 (polymerase chain reaction: PCR), NASBA (핵산 서열-기초 증폭), LCR (리가제 연쇄반응), 가닥치환 증폭 (strand displacement amplificaton: SDA), 롤링서클증폭(rolling circle amplification: RCA) 등을 포함할 수 있다. 상기 증폭방법은 또한, RNA 증폭 방법을 포함할 수 있다. 예를 들면, 역전사 (reverse transcription: RT) 또는 역전사-PCR을 포함할 수 있다. 증폭이란 표적핵산 서열 또는 그에 상보적인 서열의 카피 수를 증가시키는 것일 수 있다. "PCR"은 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법일 수 있다.
따라서, 상기 키트는 표적핵산의 증폭에 요구되는 알려진 물질을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 키트는 핵산 폴리머라제, 그의 활성에 필요한 버퍼, 보조인자, 및/또는 기질을 더 포함할 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 역전사 효소 (reverse transcriptase) 및 이들의 조합일 수 있다. 역전사 (reverse transcription)란 RNA를 주형으로 하여 RNA 서열에 상보적인 DNA 가닥을 합성하는 것일 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 가닥치환 활성을 갖는 것일 수 있다. 예를 들면, 레트로바이러스, 예를 들면, HIV, MMLV, 및 AMV로부터 유래된 역전사 효소일 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 3'-> 5' 엑소뉴클레아제 활성 (exonuclease activity)을 갖지 않는 것일 수 있다. 상기 키트는 역전사 또는 PCR 증폭에 필요한 물질을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 키트는 표적핵산을 증폭하기 위하여 사용하기 위한 설명서를 더 포함할 수 있다.
다른 양상은 표적핵산에 상보적인 2이상의 상보영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 제1 상보영역은 3'-말단으로부터 하나이상의 연속 뉴클레오티드가 표적핵산과 상보적인 것이고, 하나이상의 제2 상보영역은 제1 상보영역의 5' 방향의 하나이상의 연속 뉴클레오티드가 표적핵산과 상보적인 것이고, 제1 상보영역은 표적핵산의 뉴클레오티드 순서를 기준으로 제2 상보영역의 3' 방향 쪽에 혼성화하는 것인 폴리뉴클레오티드와 표적핵산을 혼성화시키는 단계; 및 상기 혼성화 산물을 핵산 폴리머라제의 존재하에서 인큐베이션시켜, 상기 폴리뉴클레오티드의 3'-말단으로부터 상기 표적핵산에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 연장시키는 단계;를 포함하는, 표적핵산에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 방법은, 표적핵산에 상보적인 2이상의 상보영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 제1 상보영역은 3'-말단으로부터 하나이상의 연속 뉴클레오티드가 표적핵산과 상보적인 것이고, 하나이상의 제2 상보영역은 제1 상보영역의 5' 방향의 하나이상의 연속 뉴클레오티드가 표적핵산과 상보적인 것이고, 제1 상보영역은 표적핵산의 뉴클레오티드 순서를 기준으로 제2 상보영역의 3' 방향 쪽에 혼성화하는 것인 폴리뉴클레오티드와 표적핵산을 혼성화시키는 단계를 포함한다.
상기 혼성화는 알려진 방법에 의하여 수행되는 것일 수 있다. 예를 들면, 핵산의 혼성화에 적절한 것으로 알려진 버퍼 중에서 상기 폴리뉴클레오티드와 표적핵산을 인큐베이션함으로써 수행될 수 있다. 상기 혼성화는 적절한 온도 예를 들면, 0℃ 내지 25℃, 또는 4℃에서 수행될 수 있다. 상기 온도는 선택되는 폴리뉴클레오티드와 표적핵산의 서열 및 길이에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 상기 혼성화는 적절한 시간 예를 들면, 1 시간 내지 12시간 (밤새) 동안일 수 있다. 상기 혼성화 단계에 있어서, 사용된 폴리뉴클레오티드 및 표적핵산에 대하여는 상기한 바와 같다.
상기 방법은, 상기 혼성화 산물을 핵산 폴리머라제의 존재하에서 인큐베이션시켜, 상기 폴리뉴클레오티드의 3'-말단으로부터 상기 표적핵산에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 연장시키는 단계를 포함한다.
상기 인큐베이션은 상기 핵산 폴리머라제의 활성에 적절한 조건에서 수행될 수 있다. 상기 인큐베이션은 핵산 폴리머라제, 그의 활성에 필요한 버퍼, 보조인자, 및 기질의 존재하에서 수행될 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 역전사 효소 (reverse transcriptase) 및 이들의 조합일 수 있다. 역전사 (reverse transcription)란 RNA를 주형으로 하여 RNA 서열에 상보적인 DNA 가닥을 합성하는 것일 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 가닥치환 활성을 갖는 것일 수 있다. 예를 들면, 레트로바이러스, 예를 들면, HIV, MMLV, 및 AMV로부터 유래된 역전사 효소일 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 3'-> 5' 엑소뉴클레아제 활성 (exonuclease activity)을 갖지 않는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 인큐베이션은 역전사 또는 PCR 증폭에 필요한 물질을 포함하는 조건에서 수행하는 것을 포함할 수 있다.
상기 인큐베이션에 의하여, 상기 폴리뉴클레오티드의 3'-말단으로부터 상기 표적핵산에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 연장시킬 수 있다. 상기 연장은 상기 핵산 폴리머라제가 상기 폴리뉴클레오티드의 3'-말단으로부터, 표적핵산과 혼성화된 상기 폴리뉴클레오티드의 5'-말단을 치환시키면서 연장하는 것을 포함한다.
상기 방법은, 생산된 산물 즉, 표적핵산에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 존재 여부를 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 결정 결과, 상기 생산된 산물이 존재하는 경우, 시료 중에 상기 표적핵산이 존재하는 것으로 결정하고, 상기 생산된 산물이 존재하지 않는 경우, 시료 중에 상기 표적핵산이 존재하지 않는 것으로 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 방법은 또한, 상기 생산된 산물 즉, 표적핵산에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 주형으로 하여, 핵산을 증폭하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 증폭은 알려진 방법에 의하여 수행될 수 있다. 증폭 방법에 대하여는 상기한 바와 같다.
상기 방법은, 증폭된 결과 생산된 산물 즉, 표적핵산에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 존재 여부를 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 결정 결과, 상기 증폭 산물이 존재하는 경우, 시료 중에 상기 표적핵산이 존재하는 것으로 결정하고, 상기 증폭 산물이 존재하지 않는 경우, 시료 중에 상기 표적핵산이 존재하지 않는 것으로 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 방법은 제1 상보영역에 표적핵산과 미스매치(mismatch)인 하나이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 표적핵산에 상보적인 2이상의 상보영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 제1 상보영역은 3'-말단으로부터 하나이상의 연속 뉴클레오티드가 표적핵산과 상보적인 것이고, 하나이상의 제2 상보영역은 제1 상보영역의 5' 방향의 하나이상의 연속 뉴클레오티드가 표적핵산과 상보적인 것이고, 제1 상보영역은 표적핵산의 뉴클레오티드 순서를 기준으로 제2 상보영역의 5' 방향 쪽에 위치하는 것인 폴리뉴클레오티드와 표적핵산을 혼성화시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 미스매치는 1 내지 4nt 미스매치, 예를 들면, 1, 2, 3, 또는 4nt 미스매치일 수 있다. 상기 미스매치(mismatch)는 제1 상보영역의 3'-말단으로부터 1번째, 2번째, 3번째, 4번째, 5번째, 또는 6번째에 위치하는 하나의 뉴클레오티드 미스매치일 수 있다. 상기 방법은 미스매치를 포함하는 상기 폴리뉴클레오티드와 미스매치를 포함하지 않는 상기 폴리뉴클레오티드를 사용하여, 상기 방법에 의하여 얻어진 연장된 산물을 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 비교 결과에 기초하여 표적핵산에 돌연변이가 존재하는지를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, 미스매치를 포함하는 상기 폴리뉴클레오티드로부터 연장된 산물이 얻어지지만, 미스매치를 포함하지 않는 상기 폴리뉴클레오티드로부터 연장된 산물이 얻어지지 않는 경우, 상기 미스매치에 대응된 표적핵산의 뉴클레오티드는 돌연변이가 있는 것으로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다. 반대로, 미스매치를 포함하는 상기 폴리뉴클레오티드로부터 연장된 산물이 얻어지지 않지만, 미스매치를 포함하지 않는 상기 폴리뉴클레오티드로부터 연장된 산물이 얻어지지는 경우, 상기 미스매치에 대응된 표적핵산의 뉴클레오티드는 돌연변이가 없는 것으로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
도 1은 일 양상에 따른 폴리뉴클레오티드 및 표적핵산에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 생산하는 방법을 나타낸 도면이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 제1 상보영역(1)은 3'-말단으로부터 하나이상의 연속 뉴클레오티드가 표적핵산(4)과 상보적인 것이고, 하나이상의 제2 상보영역 (2)은 제1 상보영역(1)의 5' 방향의 하나이상의 연속 뉴클레오티드가 표적핵산(4)과 상보적인 것이고, 제1 상보영역(1)은 표적핵산(4)의 뉴클레오티드 순서를 기준으로 제2 상보영역(2)의 3' 방향 쪽에 혼성화하는 것이다. 제1 상보영역과 제2 상보영역은 표적핵산과 상보적이기 때문에 상승적으로 혼성화에 기여하여 혼성화 산물의 안정화에 상승적으로 기여할 수 있다. 따라서, 핵산 증폭 반응에서 프라이밍 (priming)에 기여하는 제1 상보영역의 길이는 증폭 특이도 (specificity), 민감도 (sensitivity) 및/또는 속도(speed)를 손실 없이 단축될 수 있다. 또한, 핵산 폴리머라제에 의하여 상기 폴리뉴클레오티드의 3'-말단이 연장되는 경우(5), 상기 표적핵산을 증폭할 수 있다. 도 1에서, 상기 폴리뉴클레오티드의 3'-말단의 연장(5)은 역전사 또는 DNA 가닥으로부터 DNA 가닥 합성을 포함한다. 표적핵산에 혼성화된 제1 상보영역 및 제2 상보영역은 1nt 이상의 뉴클레오티드에 의하여 이격되어 위치하는 것일 수 있다.
일 양상에 따른 폴리뉴클레오티드에 의하면, 표적핵산을 효율적으로 증폭하는데 사용될 수 있다.
일 양상에 따른 조성물 및 키트에 의하면, 표적핵산을 효율적으로 증폭하는데 사용될 수 있다.
일 양상에 따른 표적핵산에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 생산하는 방법에 의하면, 표적핵산에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 효율적으로 생산할 수 있다.
도 1은 일 양상에 따른 폴리뉴클레오티드 및 표적핵산에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 생산하는 방법을 나타낸 도면이다.
도 2는 제1 상보영역의 길이가 연장 효율에 미치는 영향을 나타낸 도면이다.
도 3은 반응 온도, 및 프라이머 농도가 역전사에 의하여 RCP의 3'-말단의 연장 효율에 미치는 영향을 나타낸다.
도 4는 표적 핵산이 miR-3141인 경우, 제2 상보영역의 길이가 연장 효율에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 5는 표적 핵산이 miR-16인 경우, 제2 상보영역의 길이가 연장 효율에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 6 내지 도 8은 표적핵산 서열에 미치매치인 뉴클레오티드를 포함하는 제1 상보영역이 연장 효율에 미치는 영향을 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
본 실시예에서는 표적핵산에 상보적인 2이상의 상보영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 제1 상보영역은 3'-말단으로부터 하나이상의 연속 뉴클레오티드가 표적핵산과 상보적인 것이고, 하나이상의 제2 상보영역은 제1 상보영역의 5' 방향의 하나이상의 연속 뉴클레오티드가 표적핵산과 상보적인 것이고, 제1 상보영역은 표적핵산의 뉴클레오티드 순서를 기준으로 제2 상보영역의 5' 방향 쪽에 위치하는 것인 폴리뉴클레오티드 (이하 "역배열 프라이머 (reverse configuration primer), 또는 "RC 프라이머", 또는 RCP라고 한다)를 사용하여 표적핵산에 상보적인 서열을 3'-말단으로부터 연장시켰다. 대조군으로서, 역배열이 없는 통상적인 프라이머 (이하 "선형(linear) 프라이머" 또는 "linear 프라이머"라 한다)를 사용하였다. 역배열 프라이머에 있어서, 제1 상보영역은 "프라이밍 영역 (priming region)", 제2 상보영역은 "아답터 영역(adaptor region)" 또는 "아답터"라고도 한다.
1. 제1 상보영역의 길이가 연장 효율에 미치는 영향
역배열 프라이머에 있어서, 제1 상보영역의 길이를 3mer 내지 7mer로 변화시키면서 연장 반응을 수행하였다. 연장 반응은 역전사 반응을 수행하였다.
역전사 효소(reverse transcriptase)로서, Superscript IIITM (Invitrogen)를 사용하였다. 역전사는 역배열 프라이머와 RNA 주형을 37.5mM KCl, 3mM MgCl2, 및 10mM DTT를 함유한 50mM Tris-HCl (실온에서 pH8.3) 중에서 42℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로서 수행하였다. RNA 주형은 5'-말단에 20nt 태그 서열이 부가된 miR-16 RNA(서열번호 9)를 사용하였다. Superscript IIITM 역전사 효소는 RNA H 활성이 감소되고 증가된 열안정을 제공하도록 조작된 M-MLV (Maloney murine leukemia virus) 역전사 효소의 변이체이다.
그 결과 얻어진 연장 산물을 PCR에 의하여 증폭하였다. PCR은 2xSYBR RT-PCR 마스터 혼합물 (Exiqon)에 프라이머 각 50nM 및 연장 산물을 첨가하고 열순환시킴으로써 수행되었다. 열순환은 95℃에서 10분, 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분을 45회 수행하였다. 다음으로, 융해 곡선 분석 (melting curve analysis)을 5측정/℃에 의하여 수행하였다. 사용된 RT 프라이머는 RCP-3mer (서열번호 1), RCP-4mer (서열번호 2), RCP-6mer (서열번호 3), RCP-7mer (서열번호 4), RCP-3mer (서열번호 5), Linear-4mer (서열번호 6), Linear-6 (서열번호 7), 및 Linear-7mer (서열번호 8)이었다. PCR 프라이머는 포워드 프라이머 (서열번호 10) 및 리버스 프라이머 (서열번호 11)를 사용하였다.
도 2는 제1 상보영역의 길이가 연장 효율에 미치는 영향을 나타낸 도면이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 제1 상보영역의 길이가 3mer 및 4mer인 경우, Linear 프라이머에 비하여 RCP를 사용한 경우 Cp 값이 현저하게 감소하였다. 제1 상보영역의 길이가 4mer인 경우, Cp 값은 대조군에 비하여 6.3 감소하였다.
2. 반응 온도, 및 프라이머 농도가 연장 효율에 미치는 영향
(1)의 결과, 대조군과 RCP 사이에 연장 효율의 차이가 적은 것으로 확인된 제1 상보영역이 6mer인 RCP 및 대조군 프라이머를 사용하여 표적핵산을 증폭하였다.
RCP 및 대조군 프라이머는 각각 서열번호 12 및 서열번호 13, 및 표적 RNA (5'-말단에 20nt 태그 서열이 부가된 miR-3141 RNA)는 서열번호 14의 서열을 사용하였다. 프라이머 농도는 각각 1nM,10nM, 및 100nM를 사용하였고, 역전사 온도는 각각 42℃, 50℃, 및 55℃를 각각 사용하였다. 그 외에 역전사 및 PCR 조건은 1에 기재된 바와 같다.
도 3은 반응 온도, 및 프라이머 농도가 역전사에 의하여 RCP의 3'-말단의 연장 효율에 미치는 영향을 나타낸다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비하여 RCP를 사용한 경우, Cp 값이 감소하였다.
3. 제2 상보영역의 길이가 연장 효율에 미치는 영향
RCP를 사용한 전사 및 PCR 증폭에서 제2 상보영역의 길이가 연장 효율에 미치는 영향을 확인하였다.
표적 RNA는 5'-말단에 20nt 태그 서열이 부가된 miR-16 (서열번호 9)과 5'-말단에 20nt 태그 서열이 부가된 miR-3141 (서열번호 14)을 사용하였다. 사용된 RCP는, miR-3141에 대하여, 각각 5' 말단에 표적 RNA에 상보적인 4, 8, 10, 12, 14, 및 15mer (제2 상보영역)가 부가된 서열번호 15, 16, 17, 18, 19, 및 20을 사용하였다. miR-16에 대하여, 각각 5' 말단에 표적 RNA에 상보적인 4, 8, 10, 12, 14, 및 16mer (제2 상보영역)가 부가된 서열번호 21, 22, 23, 24, 25, 및 26을 사용하였다.
도 4는 표적 핵산이 miR-3141인 경우, 제2 상보영역의 길이가 연장 효율에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 제2 상보영역의 길이가 10mer인 경우 Cp 값이 가장 낮았다.
도 5는 표적 핵산이 miR-16인 경우, 제2 상보영역의 길이가 연장 효율에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 제2 상보영역의 길이가 12mer인 경우 Cp 값이 가장 낮았다.
표 1 (miR-3141) 및 표 2 (miR-16)는 제2 상보영역의 특성을 나타낸 것이다.
제2 상보영역 길이 서열 GC 함량(%) 기본 Tm(℃) 염농도 조정된 Tm(℃) NN Tm (℃)
4 CCTC 3 14 14 -
8 CCGCCCTC 7 30 30 18.73
10 ACCCGCCCTC 8 36 36 31.49
12 CCACCCGCCCTC 10 44 44 40.98
14 CTCCACCCGCCCTC
 11 49.1 52.7 46.58
제2 상보영역 길이 서열 GC 함량(%) 기본 Tm(℃) 염농도 조정된 Tm(℃) NN Tm (℃)
4 TGCT 2 12 12 -
8 GTGCTGCT 5 26 26 8.98
10 ACGTGCTGCT 6 32 32 28.32
12 TTACGTGCTGCT 6 36 36 33.97
14 ATTTACGTGCTGCT 6 34.4 38 38.41
16 ATATTTACGTGCTGCT 6 38.3 43.2 41.29
표 1 및 2 중 NN은 Nearest neighbor을 나타낸다.
4. 표적핵산 서열에 미치매치인 뉴클레오티드를 포함하는 제1 상보영역이 연장 효율에 미치는 영향
RCP를 사용한 전사 및 PCR 증폭에서 제1 상보영역에 표적핵산 서열에 대하여 미스매치인 뉴클레오티드 포함하는 경우, 연장 효율에 미치는 영향을 확인하였다.
프라이머는 제1 상보영역의 길이가 각각 0, 1, 2, 3, 4, 6mer이고, 미스매치를 포함하지 않고 표적 핵산에 상보적인 서열 (이하 "야생형 (Wild-type): WT"이라고도 함), miR-3141의 3'-말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6번째 위치 (각각 M1, M2, M3, M4, M5 및 M6 위치)에 대응하는 서열이 각각 미스매치인 서열을 사용하였다. 제1 상보영역의 길이가 6mer인 경우, WT 프라이머, M1, M2, M3, M4, M5 및 M6 미스매치 프라이머는 각각 서열 27, 28, 29, 30, 31, 32, 및 33의 서열을 갖는다. 표적 핵산은 서열번호 14의 miR-3141 RNA를 사용하였다.
제1 상보영역의 길이가 4mer인 경우, WT 프라이머, M1, M2, M3, 및 M4 미스매치 프라이머는 각각 서열 34, 35, 36, 37, 및 38의 서열을 갖는다.
제1 상보영역의 길이가 3mer인 경우, WT 프라이머, M1, M2, 및 M3 미스매치 프라이머는 각각 서열 39, 40, 41, 및 42의 서열을 갖는다.
제1 상보영역의 길이가 2mer인 경우, WT 프라이머, M1 및 M2 미스매치 프라이머는 각각 서열 43, 44 및 45의 서열을 갖는다.
제1 상보영역의 길이가 1mer인 경우, WT 프라이머, 및 M1 미스매치 프라이머는 각각 서열 46 및 47의 서열을 갖는다.
제1 상보영역의 길이가 0mer인 경우, WT 프라이머는 각각 서열 48의 서열을 갖는다.
프라이머 농도는 10nM, 100nM, 1uM을 사용하였다. 그외의 역전사 및 PCR 조건은 1에서 설명한 바와 같다.
도 6 내지 도 8은 표적핵산 서열에 미치매치인 뉴클레오티드를 포함하는 제1 상보영역이 연장 효율에 미치는 영향을 나타낸 도면이다. 도 6 내지 도 8은 각각 프라이머 농도는 1uM, 100nM, 및 10nM을 사용한 경우를 나타낸다. 도 6 내지 도 8에 나타낸 바와 같이, RCP의 제1 상보영역에 미스매치 서열이 도입된 경우와 그렇지 않은 경우, Cp 값은 현저하게 차이가 있었다. 도 6 내지 도 8에서, 제1 상보영역의 길이가 4mer인 경우, WT 프라이머에 비하여 Cp 값이 10.7-6.8 더 증가하였다. 도 6 내지 도 8에서, 미스매치 위치는 하기 서열번호 14의 miR-3141에서 3'-말단으로부터 각각 M1, M2, M3, M4, M5, 및 M6으로 지정하였다.
cggugagguc uuugguucau gagggcgggu ggag(M6)g(M5)a(M4)g(M3)g(M2)a(M1)
도 6 내지 도 8에 의하면, 제1 상보영역에 미스매치 서열을 도입함으로써, 표적핵산에 돌연변이가 존재하는지 여부를 확인할 수 있다는 것을 나타낸다. 표적핵산에 돌연변이가 도입되었는지 여부는, 미스매치가 도입된 프라이머와 도입되지 않은 프라이머로부터 얻어진 증폭 산물을 비교함으로써, 확인할 수 있다.
<110> Samsung Electronics. Co. Ltd. <120> Polynucleotide and use thereof <130> PN096414 <160> 48 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RCP-3mer <400> 1 ttacgtgctg ctaggtggta gccttgagga cacgc 35 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RCP-4mer <400> 2 ttacgtgctg ctaggtggta gccttgagga cacgcc 36 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RCP-6mer <400> 3 ttacgtgctg ctaggtggta gccttgagga cacgccaa 38 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RCP-7mer <400> 4 ttacgtgctg ctaggtggta gccttgagga cacgccaat 39 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linear-3mer <400> 5 aggtggtagc cttgaggaca cgc 23 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linear-4mer <400> 6 aggtggtagc cttgaggaca cgcc 24 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linear-6mer <400> 7 aggtggtagc cttgaggaca cgccaa 26 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linear-7mer <400> 8 aggtggtagc cttgaggaca cgccaat 27 <210> 9 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-16 RNA with 20nt 5'-tag seqeuence <400> 9 cggugagguc uuugguucau uagcagcacg uaaauauugg cg 42 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer <400> 10 cggtgaggtc tttggttcat 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer <400> 11 aggtggtagc cttgaggaca 20 <210> 12 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RCP RT primer with 6mer 1st complementary region <400> 12 ccacccgccc tcaggtggta gccttgagga catcctcc 38 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Control RT primer <400> 13 aggtggtagc cttgaggaca cgatcgtcct cc 32 <210> 14 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-3141 with 5'-20nt tag sequence <400> 14 cggugagguc uuugguucau gagggcgggu ggaggagga 39 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RCP with 5' terminal 4mer adaptor sequence <400> 15 cctcaggtgg tagccttgag gacatcct 28 <210> 16 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RCP with 5' terminal 8mer adaptor sequence <400> 16 ccgccctcag gtggtagcct tgaggacatc ct 32 <210> 17 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RCP with 5' terminal 10mer adaptor sequence <400> 17 acccgccctc aggtggtagc cttgaggaca tcct 34 <210> 18 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RCP with 5' terminal 12mer adaptor sequence <400> 18 ccacccgccc tcaggtggta gccttgagga catcct 36 <210> 19 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RCP with 5' terminal 14mer adaptor sequence <400> 19 ctccacccgc cctcaggtgg tagccttgag gacatcct 38 <210> 20 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RCP with 5' terminal 15mer adaptor sequence <400> 20 cctccacccg ccctcaggtg gtagccttga ggacatcct 39 <210> 21 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RCP with 5' terminal 4mer adaptor sequence complementary to miR-16 <400> 21 tgctaggtgg tagccttgag gacacgcc 28 <210> 22 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RCP with 5' terminal 8mer adaptor sequence complementary to miR-16 <400> 22 gtgctgctag gtggtagcct tgaggacacg cc 32 <210> 23 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RCP with 5' terminal 10mer adaptor sequence complementary to miR-16 <400> 23 acgtgctgct aggtggtagc cttgaggaca cgcc 34 <210> 24 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RCP with 5' terminal 12mer adaptor sequence complementary to miR-16 <400> 24 ttacgtgctg ctaggtggta gccttgagga cacgcc 36 <210> 25 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RCP with 5' terminal 14mer adaptor sequence complementary to miR-16 <400> 25 atttacgtgc tgctaggtgg tagccttgag gacacgcc 38 <210> 26 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RCP with 5' terminal 16mer adaptor sequence complementary to miR-16 <400> 26 atatttacgt gctgctaggt ggtagccttg aggacacgcc 40 <210> 27 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RC primer with 6mer 1st comlementary region <400> 27 acccgccctc aggtggtagc cttgaggaca tcctcc 36 <210> 28 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RC primer with 6mer 1st comlementary region and M1 mismatch <400> 28 acccgccctc aggtggtagc cttgaggaca acctcc 36 <210> 29 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RC primer with 6mer 1st comlementary region and M2 mismatch <400> 29 acccgccctc aggtggtagc cttgaggaca tactcc 36 <210> 30 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RC primer with 6mer 1st comlementary region and M3 mismatch <400> 30 acccgccctc aggtggtagc cttgaggaca tcatcc 36 <210> 31 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RC primer with 6mer 1st comlementary region and M4 mismatch <400> 31 acccgccctc aggtggtagc cttgaggaca tccacc 36 <210> 32 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RC primer with 6mer 1st comlementary region and M5 mismatch <400> 32 acccgccctc aggtggtagc cttgaggaca tcctac 36 <210> 33 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RC primer with 6mer 1st comlementary region and M6 mismatch <400> 33 acccgccctc aggtggtagc cttgaggaca tcctca 36 <210> 34 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RC primer with 4mer 1st comlementary region <400> 34 acccgccctc aggtggtagc cttgaggaca tcct 34 <210> 35 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RC primer with 4mer 1st comlementary region and M1 mismatch <400> 35 acccgccctc aggtggtagc cttgaggaca acct 34 <210> 36 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RC primer with 4mer 1st comlementary region and M2 mismatch <400> 36 acccgccctc aggtggtagc cttgaggaca tact 34 <210> 37 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RC primer with 4mer 1st comlementary region and M3 mismatch <400> 37 acccgccctc aggtggtagc cttgaggaca tcat 34 <210> 38 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RC primer with 4mer 1st comlementary region and M4 mismatch <400> 38 acccgccctc aggtggtagc cttgaggaca tcca 34 <210> 39 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RC primer with 3mer 1st comlementary region <400> 39 acccgccctc aggtggtagc cttgaggaca tcc 33 <210> 40 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RC primer with 3mer 1st comlementary region and M1 mismatch <400> 40 acccgccctc aggtggtagc cttgaggaca acc 33 <210> 41 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RC primer with 3mer 1st comlementary region and M2 mismatch <400> 41 acccgccctc aggtggtagc cttgaggaca tac 33 <210> 42 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RC primer with 3mer 1st comlementary region and M3 mismatch <400> 42 acccgccctc aggtggtagc cttgaggaca tca 33 <210> 43 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RC primer with 2mer 1st comlementary region <400> 43 acccgccctc aggtggtagc cttgaggaca tc 32 <210> 44 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RC primer with 2mer 1st comlementary region and M1 mismatch <400> 44 acccgccctc aggtggtagc cttgaggaca ac 32 <210> 45 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RC primer with 2mer 1st comlementary region and M2 mismatch <400> 45 acccgccctc aggtggtagc cttgaggaca aa 32 <210> 46 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RC primer with 1mer 1st comlementary region <400> 46 acccgccctc aggtggtagc cttgaggaca t 31 <210> 47 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RC primer with 1mer 1st comlementary region and M1 mismatch <400> 47 acccgccctc aggtggtagc cttgaggaca a 31 <210> 48 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RC primer with 0mer 1st comlementary region <400> 48 acccgccctc aggtggtagc cttgaggaca 30

Claims (20)

  1. 표적핵산에 상보적인 2이상의 상보영역을 포함하는 선형의 폴리뉴클레오티드와 표적핵산을 혼성화시키는 단계로서,
    상기 폴리뉴클레오티드의 제1 상보영역은 3'-말단으로부터 하나이상의 연속 뉴클레오티드가 표적핵산과 상보적인 것이고, 하나이상의 제2 상보영역은 제1 상보영역의 5' 방향의 하나이상의 연속 뉴클레오티드가 표적핵산과 상보적인 것이고, 제1 상보영역은 표적핵산의 뉴클레오티드 순서를 기준으로 제2 상보영역의 3' 방향 쪽에 혼성화하고,
    상기 제1 상보영역의 길이는 3 뉴클레오티드(nt) 또는 4 nt인 것인 단계; 및
    혼성화 산물을 핵산 폴리머라제의 존재하에서 인큐베이션시켜, 상기 선형의 폴리뉴클레오티드의 3'-말단으로부터 상기 표적핵산에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 연장시키는 단계를 포함하는,
    표적핵산에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 생산하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 제2 상보영역은 5'-말단으로부터 5'-말단 뉴클레오티드를 포함한, 하나이상의 연속 뉴클레오티드가 표적핵산과 상보적인 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 제1 상보영역은 3'-말단으로부터 3'-말단 뉴클레오티드를 포함한, 2 내지 7nt의 연속 뉴클레오티드가 표적핵산과 상보적인 것인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 제1 상보영역과 제2 상보영역은 링커에 의하여 이격되어 있는 것인 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 링커는 핵산, 핵산 변형체, 단백질, 당, 또는 지질 분자인 것인 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 링커는 프라이머 결합 부위, 제한효소 인식부위, 또는 프로브 결합 부위를 포함하는 것인 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 제1 상보영역은 표적핵산의 3'-말단으로부터 3'-말단 뉴클레오티드를 포함한 하나이상의 연속 뉴클레오티드와 상보적인 것인 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 제2 상보영역은 표적핵산의 5'-말단으로부터 5'-말단 뉴클레오티드를 포함한 하나이상의 연속 뉴클레오티드와 상보적인 것인 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 길이가 7 nt 내지 100 nt인 것인 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 표적핵산은 길이가 15 nt 내지 200 nt인 것인 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 표적핵산은 RNA인 것인 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 표적핵산은 microRNA, siRNA 또는 tRNA인 것인 방법.
  13. 청구항 1에 있어서, 제1 상보영역 및 제2 상보영역 중 하나이상은 DNA, RNA, PNA 또는 LNA를 포함하는 것인 방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산 폴리머라제는 가닥 치환 핵산 폴리머라제인 것인 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 가닥 치환 핵산 폴리머라제는 HIV, MMLV, 및 AMV로부터 유래된 하나이상의 역전사 효소인 것인 방법.
  19. 삭제
  20. 삭제
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