JP2015526069A5 - - Google Patents

Claims (15)

1. 核酸分子の増幅方法であって、当該方法が、
   ＲＮＡテンプレートと、ＲＮＡテンプレートにハイブリダイズすることができる１以上のプライマーと、逆転写酵素と、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）とを含む第１の反応混合物を使用して、リボ核酸（ＲＮＡ）テンプレートを逆転写してｃＤＮＡを形成する工程と、
   １以上の鎖置換ＤＮＡポリメラーゼと、１以上のイノシン含有プライマーと、プライマーのイノシン残基の３’側のＤＮＡにニックを入れることができるヌクレアーゼとを含む第２の反応混合物を使用して、ｃＤＮＡを増幅して増幅産物を形成する工程と
   を含んでおり、
   ｃＤＮＡテンプレートを変性させずに等温条件下で実施される、方法。
2. 逆転写及び増幅が、単一の反応混合物中で達成される、請求項１記載の方法。
3. ＲＮＡにハイブリダイズすることができるプライマーの少なくとも１つが、イノシン含有プライマー、オリゴ（ｄＴ）プライマー、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）及びそれらの組合せを含む、請求項１記載の方法。
4. 第１及び第２の反応混合物の一方又は両方が、ｃＤＮＡにアニーリングするための複数のフォワード及びリバースイノシン含有プライマーを含む、請求項１記載の方法。
5. 逆転写酵素が、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素又はそれらの保存的変異体の１つ以上から選択される、請求項１記載の方法。
6. イノシン含有プライマーがホスホロチオエート結合を含む、請求項１記載の方法。
7. 第１及び第２の反応混合物の一方又は両方が、１以上の伸長テンプレートを含む、請求項１記載の方法。
8. 鎖置換ＤＮＡポリメラーゼがエキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼである、請求項１記載の方法。
9. ヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼＶを含む、請求項１記載の方法。
10. エンドヌクレアーゼＶが、配列番号１、配列番号２、配列番号３又はそれらの保存的変異体の配列を有するタンパク質から選択される、請求項９記載の方法。
11. 第１及び第２の反応混合物の一方又は両方が、１以上の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）をさらに含む、請求項１記載の方法。
12. リボ核酸（ＲＮＡ）テンプレートからデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を増幅するためのキットであって、
    １以上のイノシン含有プライマーと、
    逆転写酵素活酵素と、
    鎖置換ＤＮＡポリメラーゼと、
    プライマーのイノシン残基の３’側のＤＮＡにニックを入れるためのヌクレアーゼと
    を含む、キット。
13. ヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼＶである、請求項１２記載のキット。
14. ＤＮＡポリメラーゼがエキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１２記載のキット。
15. １以上の伸長テンプレートをさらに含む、請求項１２記載のキット。