CN110819673B - 一种原核生物cDNA5′末端快速扩增方法 - Google Patents
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- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种原核生物cDNA5′末端快速扩增方法，包括如下步骤：（1）利用牛痘病毒加帽系统对原核生物总RNA进行加帽；（2）以莫洛尼氏鼠白血病病毒反转录酶进行反转录；（3）向体系中加入含有3′末端含有3个单脱氧鸟嘌呤的特异性模板转换引物（TSO），与cDNA的胞嘧啶尾退火杂交，反转录以TSO为模板继续转录；（4）巢式PCR扩增，第一轮PCR引物为与TSO互补的外侧引物和GSP1，第二轮PCR引物为与TSO互补的内侧引物和GSP2。本发明为原核生物基因转录起始位点的鉴定提供了一种既简单又精确的方法。特别适用于低丰度转录本5′末端的快速、精确扩增。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种原核生物cDNA5′末端快速扩增方法。
背景技术
cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术可用于快速获得转录本的5′末端序列。RACE技术从提出至今经过了不断的改进和完善。在传统RACE中，一个同聚物尾巴在末端转移酶(TDT)的存在下加到第一链cDNA的3′末端，从而作为锚定序列引发第二链cDNA的合成(Frohman,M.A.et al,1988；Ohara,O.et al,1989；Loh,E.Y.etal,1989)。传统RACE的主要缺点在于作为合成第二链的引物包含与同聚物尾巴互补的序列，容易产生非特异性扩增。
Edwards研究小组和Troutt研究小组分别提出了SLIC-PCR(Sequence-andligation-independent cloning PCR)和LA-PCR(ligation-anchored PCR)，这两种方法原理相似，都是基于T4 RNA连接酶将序列已知的锚头直接连在第一链cDNA的3′末端，然后用锚头中含有的部分序列和基因特异性引物(GSP)对cDNA进行扩增(Edwards,J.B.etal,1991；Troutt,A.B.et al,1992)。但是由于反转录提前终止产生的非特异性扩增比较严重。针对于此，Liu等人提出了RLM-RACE(RNA ligase-mediatedamplification of cDNAends)的方法，RLM-RACE用β消除法或烟草酸焦磷酸酶(TAP)去除mRNA的5′端帽子，然后在T4RNA连接酶的作用下连上一段序列已知的接头(Liu,X.et al,1993)。然而，这种方法仍存在缺陷，不完全的RNA也能连上接头从而造成非特性的扩增。
1996年Clontech公司推出了基于模板转换的CapFinder技术，当反转录进行到转录本的5′端帽子结构时，莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MuLV)反转录酶表现出末端转移酶活性，在第一链cDNA3′末端加上3～4个胞嘧啶(Clontech,1996)。此时，在反应体系中加入3′末端含有多聚鸟嘌呤核苷酸(polyG)的特异性模板转换引物(TSO)，与cDNA 3′末端的胞嘧啶退火杂交，反转录酶会以TSO为模板继续向前转录，从而向cDNA3′末端引入了特异性序列，最后再进行PCR扩增。但是该方法依赖于RNA5′端的帽子结构，只适用于真核生物的转录本。
目前，针对于原核生物的转录本没有一个既简单又精确的5′RACE方法，RLM-RACE需要多部酶步骤并且特异性相对较低，而CapFinder技术只能用于真核生物。因此，本领域迫切需要开发一种应用于原核生物的简单、精确的5′RACE方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种原核生物cDNA5′末端快速扩增方法，方法简单，精确。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种原核生物cDNA5′末端快速扩增方法，包括下述步骤：利用NEB牛痘病毒加帽系统对原核生物的总RNA进行加帽处理，在5′三磷酸RNA的末端加上一个7-甲基鸟苷帽子结构，然后依照CapFinder的步骤，对目的基因的5′末端进行扩增。
以上所述的方法中，优选的，加帽后的步骤如下：
1.以基因特异性引物1(GSP1)作为反转录引物在莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MuLV)反转录酶存在下起始第一链cDNA的合成，当反转录进行到RNA的5′末端时，反转录酶表现出末端转移酶活性，在第一链cDNA的3′末端加上3～4个胞嘧啶。
2.反转录完之后在体系中加入3′末端含有3个单脱氧鸟嘌呤的模板转换引物(TSO)，与第一链cDNA的胞嘧啶尾退火杂交，反转录以TSO为模板继续进行。
3.巢式PCR扩增基因5′末端序列，第一轮PCR引物为与TSO互补的外侧引物和GSP1，第二轮PCR引物为与TSO互补的内侧引物和GSP2。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
本方法相对简单，只需要对原核生物总RNA进行加帽处理，避免了多种酶步骤引起的RNA降解和成本增加。本方法特异性的在初始转录本的5′末端加上一个帽子结构，从而使初始转录本的cDNA 3′末端附加上一段已知序列，具有精确性高、特异性好的优点，特别适用于低丰度转录本5′末端的快速扩增。
附图说明
图1为本发明所述的应用于原核生物的简单、精确的5′RACE方法的原理示意图；
其中rG为单脱氧鸟嘌呤。
图2为利用本发明鉴定大肠杆菌MG1655菌株编码基因ompA、sodB和shiA的转录起始位点的巢式PCR产物琼脂糖胶电泳结果。
图3为ompA、sodB和shiA的5′RACE的第二轮PCR产物的部分测序结果。
图4为利用本发明鉴定大肠杆菌MG1655菌株sRNA ryhB和micC的转录起始位点的巢式PCR产物琼脂糖胶电泳结果。
图5为ryhB和micC5′RACE的第二轮PCR产物的部分测序结果。
图6为利用本发明鉴定布鲁氏菌16M菌株编码基因ompA、rne和rppH的转录起始位点的巢式PCR产物琼脂糖胶电泳结果。
图7为ompA、rne和rppH5′RACE的第二轮PCR产物的部分测序结果。
图8为利用本发明鉴定布鲁氏菌16M菌株sRNA bsnc135和bsnc149的转录起始位点的巢式PCR产物琼脂糖胶电泳结果。
图9为bsnc135和bsnc1495′RACE的第二轮PCR产物的部分测序结果。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
一种原核生物cDNA5′末端快速扩增方法：
以大肠杆菌MG1655菌株的三个编码基因ompA、sodB和shiA为试验对象，扩增这三个基因的转录起始位点。
1.核酸序列的设计
本实施例中所使用的核酸序列如下：
表中rG为单脱氧鸟嘌呤。
2.总RNA的加帽处理：利用NEB牛痘病毒加帽系统对大肠杆菌的总RNA进行加帽处理。
将1～3μg大肠杆菌总RNA加入到200uL PCR管中，用适量的DEPC水补齐至终体积15uL。65℃孵育5min，置于冰上5min。加入如下体系到PCR管中：
| 组分 | 体积(uL) |
| 10×Capping Buffer | 2 |
| GTP(10mM) | 1 |
| SAM(2mM) | 1 |
| Vaccinia Capping Enzyme | 1 |
| Total Volume | 20 |
37℃反应30min，乙醇沉降回收。
3.反转录反应体系：
将10pg加帽的总RNA和2pmol的GSP1加入到200uL PCR管中，用适量的DEPC水补齐至终体积6uL。65℃孵育5min，置于冰上2min。加入如下体系到PCR管中：
| 组分 | 体积(uL) |
| 10mM dNTPs | 1 |
| 5×SSIV buffer | 2 |
| 100mM DTT | 0.5 |
| SuperScript<sup>TM</sup>IV Reverse Transcriptase(200U/uL) | 0.5 |
| Total Volume | 10 |
50℃反应60min。
4.模板转换反应体系：
加入如下体系到步骤3中的反转录体系中：
| 组分 | 体积(uL) |
| 0.1％bovine serum albumin(BSA) | 2 |
| 50mM MnCl<sub>2</sub> | 0.8 |
| 20uM TSO | 1 |
| 5×SSIV buffer | 2 |
| 100mM DTT | 0.5 |
| SuperScript<sup>TM</sup>IV Reverse Transcriptase(200U/uL) | 0.5 |
| DEPC水 | 3.2 |
| Total Volume | 20 |
42℃反应90min，70℃反应10min。
5.巢式PCR反应体系：
利用诺唯赞2×Rapid Taq Master Mix进行PCR扩增。
第一轮PCR：
| 组分 | 体积(uL) |
| Template(cDNA) | 1 |
| outer primer(10uM) | 0.4 |
| GSP1(10uM) | 0.4 |
| 2×PCR mix | 10 |
| ddH<sub>2</sub>O | 8.2 |
| Total Volume | 20 |
扩增程序：
第二轮PCR：
将第一轮PCR产物稀释100倍，作为第二轮PCR的模板。
| 组分 | 体积(uL) |
| Template(第一轮PCR产物) | 1 |
| inner primer(10uM) | 0.4 |
| GSP2(10uM) | 0.4 |
| 2×PCR mix | 10 |
| ddH<sub>2</sub>O | 8.2 |
| Total Volume | 20 |
扩增程序：
将两轮PCR产物进行1％琼脂糖胶电泳检测，结果如图2所示。其中泳道1代表第一轮PCR产物，泳道2代表第二轮PCR产物。结果显示，第一轮PCR扩增未见特异性扩增条带，经第二轮PCR扩增之后，获得了特异性的清晰可见的单一条带。
将第二轮PCR产物进行琼脂糖胶电泳回收纯化，然后克隆至pMD18-T载体(Takara)中，挑取阳性克隆测序，结果如图3所示。测序结果所显示的TSS位点与之前的报道(Gama-Castro Set al,2015)一致，表明我们准确地获得了大肠杆菌MG1655菌株三个编码基因ompA、sodB和shiA的转录起始位点。
实施例2：
一种原核生物cDNA5′末端快速扩增方法：
以大肠杆菌MG1655菌株的两个sRNA ryhB和micC为试验对象，扩增这两个sRNA的转录起始位点。
设计针对这两个sRNA的特异性引物，序列如下：
参照实施例1的方法鉴定ryhB和micC的转录起始位点。结果如图4和图5所示。结果表明，我们获得了条带清晰单一的第二轮PCR产物(图4)，成功的获得了大肠杆菌MG1655菌株两个sRNA ryhB和micC的转录起始位点(图5)，并与之前的报道一致(Gama-Castro Setal,2015)。
实施例3：
一种原核生物cDNA5′末端快速扩增方法：
以布鲁氏菌16M菌株的三个编码基因ompA、rne和rppH为试验对象，扩增这三个基因的转录起始位点。
设计针对这三个基因的特异性引物，序列如下：
参照实施例1的方法鉴定ompA、rne和rppH的转录起始位点。结果如图6和图7所示。结果表明，我们获得了条带清晰单一的第二轮PCR产物(图6)，成功的获得了布鲁氏菌16M菌株三个编码基因ompA、rne和rppH的转录起始位点(图7)。
实施例4：
一种原核生物cDNA5′末端快速扩增方法：
以布鲁氏菌16M菌株的两个sRNA bsnc135和bsnc149为试验对象，扩增这两个sRNA的转录起始位点。
设计针对这两个sRNA的特异性引物，序列如下：
参照实施例1的方法鉴定bsnc135和bsnc149的转录起始位点。结果如图8和图9所示。结果表明，我们获得了条带清晰单一的第二轮PCR产物(图8)，成功的获得了布鲁氏菌16M菌株两个sRNA bsnc135和bsnc149的转录起始位点(图9)，并与之前的报道一致(SaadehBet al,2015)。
以上实施例表明，我们的5′RACE方法能够简单、精确地鉴定原核生物的编码基因和非编码基因的转录起始位点。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种原核生物cDNA5′末端快速扩增方法
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctggg 36
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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Claims (1)
1.一种原核生物cDNA5′末端快速扩增方法，包括下述步骤：利用NEB牛痘病毒加帽系统对原核生物的总RNA进行加帽处理，在5′三磷酸RNA的末端加上一个7-甲基鸟苷帽子结构；将加帽的总RNA和GSP1加入到PCR管中并在莫洛尼氏鼠白血病病毒反转录酶的作用下进行反转录，反转录完之后在体系中加入3′末端含有3个单脱氧鸟嘌呤的模板转换引物，与第一链cDNA的胞嘧啶尾退火杂交，反转录以TSO为模板继续进行；最后巢式PCR扩增基因5′末端序列，第一轮PCR引物为与TSO互补的外侧引物和GSP1，第二轮PCR引物为与TSO互补的内侧引物和GSP2。
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Legal Events
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| GR01 | Patent grant | ||
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