JP5637853B2 - 縮重オリゴヌクレオチドおよびその使用 - Google Patents
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Description
本発明の一態様は、セミランダム配列を含む複数のオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドのセミランダム配列は、実質的に非相補的であるヌクレオチドを含み、それによって、複数のオリゴヌクレオチドの分子内および分子間相互作用を減少させる。しかしながら、オリゴヌクレオチドのセミランダム配列は、最大数の標的核酸群内に含まれる配列へのハイブリダイゼーションを可能にするために実質的配列多様性も提供する。本発明のオリゴヌクレオチドは、非ランダム配列をさらに含んでもよい。
複数のオリゴヌクレオチドのセミランダム配列は、縮重ヌクレオチドを含む(表A参照)。縮重ヌクレオチドは、2重縮重(つまり、2つのヌクレオチドのうちの1つであってもよい)、3重縮重(つまり、3つのヌクレオチドのうちの1つであってもよい)、または4重縮重(つまり、4つのヌクレオチドのうちの1つであってもよい)を有してもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、縮重するため、それらは、類似するが同一ではないオリゴヌクレオチドの混合物である。オリゴヌクレオチドの完全縮重は、以下のとおり算出してもよく、
縮重=2aX3bX4c
式中、「a」は、2重縮重ヌクレオチドの総数(Zとして上述に定義)であり、「b」は、3重縮重ヌクレオチドの総数(Xとして上述に定義)であり、「c」は、4重ヌクレオチドの総数(Nとして上述に定義)である。
表A:縮重ヌクレオチド
Nは、アデノシン(A)、シチジン(C)、グアノシン(G)、およびチミジン/ウリジン(T/U)から成る群から選択される、4重縮重ヌクレオチドであり、
Xは、B、D、H、およびVから成る群から選択される、3重縮重ヌクレオチドであって、Bは、C、G、およびT/Uから成る群から選択され、Dは、A、G、およびT/Uから成る群から選択され、Hは、A、C、およびT/Uから成る群から選択され、Vは、A、C、およびGから成る群から選択される、3重縮重ヌクレオチドであり、
Zは、K、M、R、およびYから成る群から選択される、2重縮重ヌクレオチドであって、Kは、GおよびT/Uから成る群から選択され、Mは、AおよびCから成る群から選択され、Rは、AおよびGから成る群から選択され、Yは、CおよびT/Uから成る群から選択される、2重縮重ヌクレオチドであり、
m、p、およびqは、整数であり、mは、0または2〜20の間の整数であり、pおよびqは、0〜20の間の整数であるが、ただし、2つの整数が0ではないか、または、mおよびqの両方が0であるかのどちらか一方であり、さらに、少なくとも2つのN残基を有する、Nを含むオリゴヌクレオチドは、前記2つのN残基を分離させるXまたはZ残基を有する。
表B:例示的なオリゴヌクレオチドの式.
表C:例示的セミランダム領域のヌクレオチド配列5′〜3′
表D:3つ以上の連続N残基を有さない、例示的セミランダム領域のヌクレオチド配列(5′〜3′)
表E:例示的セミランダム領域のヌクレオチド配列(5′〜3)
表F:3つ以上の連続N残基を有さない例示的セミランダム領域のヌクレオチド配列(5′〜3′)
上述のオリゴヌクレオチドは、標準(非縮重)ヌクレオチドを含む非ランダム配列をさらに含んでもよい。該非ランダム配列は、各オリゴヌクレオチドの5′末端に位置する。一般的に、非縮重ヌクレオチドの配列は、複数のオリゴヌクレオチドの中でも一定である。典型的に、一定の非縮重配列は、ユニバーサルプライミング部位等の周知の配列を含む。好適なユニバーサルプライミング部位の制限されない例には、T7プロモーター配列、T3プロモーター配列、SP6プロモーター配列、M13順方向配列、またはM13逆方向配列が含まれる。あるいは、一定の非縮重配列は、増幅される核酸に存在しない、いかなる人工配列を実質的に含んでもよい。一実施形態では、一定の非縮重配列は、配列5′−GTAGGTTGAGGATAGGAGGGTTAGG−3′(配列番号3)を含んでもよい。別の実施形態では、一定の非縮重配列は、配列5′−GTGGTGTGTTGGGTGTGTTTGG−3′(配列番号28)を含んでもよい。
本発明の別の態様は、後でさらに増幅し得る増幅可能な分子のライブラリーを作成して標的核酸群を増幅する方法を提供する。増幅可能な分子のライブラリーは、標的核酸全体にわたって複数の複製開始部位を提供するために、本発明の複数の縮重オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、連続する独自の方法で生成される。縮重オリゴヌクレオチドプライマーのセミランダム配列は、依然配列多様性を提供しながら、複数のオリゴヌクレオチドプライマーの分子内および分子間相互作用を最小限にし、それによって、全体の標的核酸の複製を促進する。したがって、標的核酸は、いかなる所与の配列表示を損なわず、著しい偏向(つまり、3′末端偏向)なく増幅し得る。増幅された標的核酸は、全ゲノムまたは全トランスクリプトームであってもよい。
標的核酸群を代表する増幅可能な分子のライブラリーは、標的核酸を本発明の複数の縮重オリゴヌクレオチドプライマーと接触させることによって生成される。該縮重オリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸全体にわたって若干均一に散在した無作為部位でハイブリダイズして、標的核酸の複製のために複数のプライミング部位を提供する。該標的核酸は、複製中に複製された鎖が置換され、さらなる回数の複製のテンプレートとなる様に、鎖置換活性を有する酵素で複製されてもよい。あるいは、標的核酸は、2段階プロセス、つまり、第1の鎖cDNAが逆転写酵素で合成され、第2の鎖cDNAが鎖置換活性を有さない酵素で合成されるプロセスを介して複製されてもよい。いずれかの方法の結果として、複製された鎖の量は、開始標的核酸の量を超過し、それは、標的核酸の増幅を示唆する。
標的核酸群は、多様であり得、変化する。一実施形態では、標的核酸群は、ゲノムDNAであってもよい。ゲノムDNAは、真核細胞、真正細菌細胞、古細菌細胞、またはウイルスの核またはオルガネラ(例えば、ミトコンドリア、葉緑体、またはキネトプラスト)内に自然発生する、1つもしくは複数の染色体DNA分子を指す。これらの分子は、RNAに転写される配列、ならびにRNAに転写されない配列を含む。その場合、ゲノムDNAは、生物体の全ゲノムを含んでもよい、または単染色体またはその断片等のゲノムの一部を含んでもよい。
標的核酸と接触した複数のオリゴヌクレオチドプライマーは、上記のセクション(1)(a)に記載した。該オリゴヌクレオチドプライマーは、完全(つまり、4重)縮重および部分的(つまり、3重および/または2重)縮重ヌクレオチドの混合物を含むセミランダム領域を含む。該部分的縮重ヌクレオチドは、少なくとも1つの2重または3重縮重ヌクレオチドが、少なくとも2つの4重縮重ヌクレオチドを分離するように、完全な縮重ヌクレオチドの中で分散する。非相補的な2重縮重ヌクレオチドおよび/または部分的に非相補的な3重縮重ヌクレオチドの存在により、高配列多様性を提供しながら、完全な縮重ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプライマーの自己ハイブリダイズおよび/またはクロスハイブリダイズする能力が低下する。
プライムされる標的核酸は、鎖置換活性を有する酵素によって複製されてもよい。適切な鎖置換ポリメラーゼの例は、エキソ−マイナスクレノウDNAポリメラーゼ(つまり、5′→3′および3′→5′エキソヌクレアーゼ活性の両方が欠乏するDNAPolIの大きな断片)、エキソ−マイナスT7DNAポリメラーゼ(つまり、SEQUENASE(登録商標)バージョン2.0、USB社、Cleveland、OH)、Phi29DNAポリメラーゼ、BstDNAポリメラーゼ、Bcaポリメラーゼ、ベントDNAポリメラーゼ、9°NmDNAポリメラーゼ、MMLV逆転写酵素、AMV逆転写酵素、HIV逆転写酵素、それらの変異体、またはそれらの混合物を含むが、それらに限定されない。一実施形態では、鎖置換ポリメラーゼは、エキソ−マイナスクレノウDNAポリメラーゼであってもよい。別の実施形態では、鎖置換ポリメラーゼは、MMLV逆転写酵素であってもよい。さらに別の実施形態では、鎖置換ポリメラーゼは、MMLV逆転写酵素およびエキソ−マイナスクレノウDNAポリメラーゼの両方を含んでもよい。
当該方法は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プロセスによって、ライブラリーを増幅する方法をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、上述のとおり、複製された鎖のライブラリーは、一定の非縮重末端配列によって隣接されてもよい。別の実施形態では、少なくとも1つのアダプターは、分子のライブラリーが増幅可能であるように、ライブラリーの複製された鎖の末端のそれぞれに結合されてもよい。該アダプターは、上述のとおり、ユニバーサルプライミング配列、またはポリGまたはポリC等のホモポリマー状配列を含んでもよい。適切なリガーゼ酵素および連結反応技術が、当該技術において周知である。
本発明のさらなる態様は、標的核酸群を増幅するためのキットを含む。当該キットは、上記のセクション(I)で定義された複数のオリゴヌクレオチドプライマー、および上記のセクション(II)(a)(iii)で定義された複製酵素を含む。
本発明の理解を容易にするために、以下にいくつかの用語を記載する。
WGAおよびWTA用途に使用するプライマーの縮重を増加する目的において、セミランダム領域が9つのD残基(D9)を含んだライブラリー合成プライマーを、合成した。当該プライマーは、一定(ユニバーサル)の5′領域も含んだ。多くのアンプリコンを効果的に増幅するこのプライマーの能力を、セミランダム領域が9つのK残基(K9)を含む標準的ライブラリー合成プライマー(例えば、ルビコンTRANSPLEX(登録商標)全トランスクリプトーム増幅(WAT)キット、Sigma−Aldrich、St.Louis、MOで提供されたもの)の能力と比較した。K9およびD9で増幅した両方のcDNAを、qPCRおよびマイクロアレイ分析によって、未増幅のcDNAと比較した。
一本鎖cDNAは、MMLV逆転写酵素(カタログ番号M1203:Sigma−Aldrich)に記載した手順に続き、1μMオリゴdT19プライマーを使用して、50マイクロリットルの反応液当たり1マイクログラムの総RNAの濃度で、30マイクログラムの全ヒト肝臓RNA(カタログ番号7960、Ambion,Austin,TX)およびUniversal Human Reference(UFR)全RNA(カタログ番号74000、Stratagene,La Jolla,CA)から調製した。
25マイクロリットル当たり1マイクログラムのヒト肝臓またはUHR総RNAおよび1μMのオリゴdTプライマー(5′−GTAGGTTGAGGATAGGAGGGTTAGGT19−3′、配列番号1)を、70℃で5分間インキュベーションし、氷の上で急速冷却した直後に、10単位/マイクロリットルのMMLV逆転写酵素(Sigma−Aldrich)、1xPCRバッファ(カタログ番号P2192、Sigma−Aldrich)、3mM最終濃度に添加された塩化マグネシウム(カタログ番号M8787、Sigma−Aldrich)、500μMdNTP、および2.5%(体積)のリボヌクレアーゼ阻害剤(カタログ番号R2520、Sigma−Aldrich)を添加し、37℃で5分間、42℃で45分間、94℃で5分間インキュベーションし、氷の上で急速冷却した。
増幅されたcDNAは、Rubicon Transplex(登録商標)WTAキット(上記参照)の合成要素および手順を使用して、0.2マイクログラムの総RNA(上記参照)から調製した。
未増幅の対照cDNAおよび増幅されたcDNAにおける総RNAテンプレートは、0.5MのEDTAの1/3最終cDNA/増幅反応量、および1MのNaOHの1/3最終cDNA/増幅反応量の(配列における)を添加し、65℃で15分間インキュベーションして分解した。次いで、反応は、1MのトリスHCI、H7.4の5/6最終cDNA/増幅反応量で中和し、上述のGenElute PCR Cleanupキット(カタログ番号NA1020、Sigma−Aldrich)を使用して精製した。
増幅されたcDNAおよび未増幅の対照cDNAは、2XSYBR(登録商標)Green JUMPSTART(登録商標)Taq(カタログ番号S4438、Sigma−Aldrich)に定められた条件を使用して、250nMのヒトプライマー対(表1参照)とともに、リアルタイム定量PCRによって分析した。サイクル条件は、94℃で1.5分の1サイクル、94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で2.5分の30回のサイクルであった。
qPCRに使用したプライマー
標的cDNAは、Kreatech社のULS(登録商標)システム(Kreatech Biotechnology,Amsterdam, Netherland、標識は、Mogene, LC, NIDUS Center for Scientific Enterprise, 893 North Warson Road, Saint Louis, MO,63141によって実施された)を使用して標識された。精製された未増幅のcDNA、D増幅されたcDNAおよびK増幅されたcDNAは、マイクロアレイ分析用にMogene, LCに送った。このために、750ナノグラムの標的を、Agilent Whole Genome Chip(カタログ番号G4112A、Agilent Technologies, Santa Clara,CA)でインキュベーションした。
ライブラリー合成プライマーの縮重をさらに増大するために、セミランダム領域は、N残基、ならびにDまたはK残基のいずれかを含むように修飾した。Nの追加は、配列多様性を増大させ、KまたはD残基によるNの阻害が、プライマーの分子内および分子間相互作用を減少させるものと推論した。表2は、256個の考えられるKで中断されたN配列(1K9とも言われる対照K9配列を含む)を記載し、表3は、256個の考えられるDで中断されたN配列(1D9とも言われる対照D9配列を含む)を記載する。
考えられる9merKN配列
384個の中断されたN配列は、384個のライブラリー合成プライマーを形成するために使用した。それぞれのプライマーは、一定の5′ユニバーサル配列(5′−GTGGTGTGTTGGGTGTGTTTGG−3′、配列番号28)および表4に記載する9−merの中断されたN配列の1つを含んだ。該プライマーは、全トランスクリプトーム増幅(WTA)にそれらを使用してスクリーニングした。WTAスクリーニングプロセスは、3つのステップ(1.ライブラリー合成、2.ライブラリー増幅、3.遺伝子特異的qPCR)で実施した。
それぞれのライブラリー合成反応液は、2.5μlの1.66ng/μl総RNA(肝臓)および2.5μlの5μMの384個のライブラリー合成プライマーのうちの1つを含んだ。混合物を70℃に5分間加熱し、次いで、氷の上で冷却した。それぞれの反応混合物に、2.5μlのライブラリーマスターミックスを添加した(上述のとおり、マスターミックスは、1.5mMのdNTP、3XMMLV反応バッファ、24単位/μlのMMLV逆転写酵素、および1.2単位/μlのクレノウエキソ−マイナスDNAポリメラーゼを含んだ)。該反応液を混合し、18℃で10分間、25℃で10分間、37℃で30分間、42℃で10分間、95℃で5分間インキュベーションし、次いで、希釈まで4℃で保管した。
WTA生成物のそれぞれは、下記の表5に示すとおり、180μlのH2Oで希釈し、一連の「淘汰する」qPCRを実施した。これらのqPCR反応に使用する遺伝子特異的プライマーは、表6に記載する。反応混合物のそれぞれは、10μlの希釈されたWTA生成物ライブラリーおよび10μlの2倍増幅ミックス(2X SYBR(登録商標)Green JUMPSTART(登録商標)ならびに0.5μlの遺伝子特異的プライマーのそれぞれ)を含んだ。該混合物は、94℃に2分間加熱し、次いで、94℃で30秒、60℃で30秒、および72℃で30秒のサイクルを40回実施した。該プレートは、72、76、80、および84℃で解読した(MJ Opticom Monitor2サーマルサイクラー、MJ Research, Waltham,MA)。蛍光が所定の閾値を超過する間のPCRサイクルを表すCt値は、それぞれの反応で決定した。
スクリーニング戦略
第1のqPCRスクリーニング−ベータアクチンの増幅
第2のqPCRスクリーニング−NM_001799の増幅
第3のqPCRスクリーニング
第4のqPCRスクリーニング
(a)分解したRNAの増幅
WTAプロセスの所望の態様は、分解したRNAを増幅する能力である。スクリーニング4からの上位9つの中断されたNライブラリー合成プライマー(表11参照)ならびに1K9および1D9プライマーを使用して、NaOH消化されたRNAを増幅した。簡潔に言えば、20μlの水中の5μgの肝臓の総RNAに、20μlの0.1MNaOHを添加した。該混合物は、25℃で0分間〜12分間インキュベーションした。0、1、2、3、4、6、8、および12分間の時点で、2μlのアリコートを除去し、100μlの10mMトリス−HCI、pH7中で急冷した。WTAは、上述と同様に実施した。つまり、ライブラリー合成では、2μlのNaOHで消化されたRNA、2μlの5μMのライブラリー合成プライマーを70℃で5分間加熱し、4μlの2倍MMLVバッファ、10U/μlのMMLV、および1mMのdNTPを添加し、42℃で15分間インキュベートし、および30μlのH2Oで希釈する。増幅は、8μlの希釈されたライブラリーと12μlの増幅ミックス(2X SYBR(登録商標)Green JUMPSTART(登録商標)Taq READYMIX(登録商標)、および5μMのユニバーサルプライマー)を混合して行う。アガロースゲル電気泳動によるWTA生成物の分析から、すべてのプライマー(1K9および1D9ライブラリー合成プライマーを除く)が、比較的高いレベルのWTAアンプリコンを形成した(図3参照)ことが明らかになった。
理想的なライブラリー合成プライマーの別の所望の特性は、最小限のプライマー二量体を形成する、またはそれを形成しないことである。上述の分解されたRNA実験に使用する11個の中断されたNプライマーに、テンプレートの欠損した状態を除いてWTAを実施した。ライブラリー合成は、MMLV逆転写酵素、またはMMLVおよびクレノウエキソ−マイナスDNAポリメラーゼの両方のどちらかの存在下でも実施した。ライブラリー増幅は、JUMPSTART(登録商標)TaqまたはKLENTAQ(登録商標)(Simga−Aldrich)のいずれか一方によっても触媒した。図4は、MMLVおよびクレノウエキソ−マイナスDNAポリメラーゼの組み合わせによる合成、およびJUMPSTART(登録商標)TaqDNAポリメラーゼによる増幅が高いレベルのアンプリコンを提供したことを示す。さらに、この実験は、プライマー二量体の形成は、これらの11個のライブラリー合成プライマーのどのプライマーにおいても、有意な問題ではないことを明らかにした(RNAテンプレートを使用しないゲル参照)。
好適なライブラリー合成プライマーは、分子内および/または分子間プライマーの特異的相互作用(たとえば、プライマー二量体)による感度の損失なく、最大数のアンプリコンを提供するプライマーであってもよい。したがって、qPCR淘汰実験、プライマー二量体分析、およびバイオインフォマティック分析は、これらの要件を満たす5つの中断されたN配列を明らかにした。つまりライブラリー合成に使用されたときに、すべてのqPCRスクリーニングに増幅可能なテンプレートを提供したWTA生成物を産出した、5つの配列(つまり、11K4、15K4、19K4、および27K4)は、テンプレートの存在なく、最少量のプライマー二量体を産出し、ヒトトランスクリプトームから少なくとも100万個のWTAアンプリコンを形成することが可能であった。
個別のプライマーまたはプライマーの組み合わせを使用するqPCR
**1=10μM、2=2μM、3=0.4μM、4=0.08μM
ペアワイズアライメント
Claims (25)
- 複数のオリゴヌクレオチドであって、それぞれのオリゴヌクレオチドは、式NmXpZqを有し、式中、
Nは、アデノシン(A)、シチジン(C)、グアノシン(G)、およびチミジン/ウリジン(T/U)から成る群から選択される、4重縮重ヌクレオチドであり、
Xは、B、D、H、およびVから成る群から選択される、3重縮重ヌクレオチドであって、Bは、C、G、およびT/Uから成る群から選択され、Dは、A、G、およびT/Uから成る群から選択され、Hは、A、C、およびT/Uから成る群から選択され、Vは、A、C、およびGから成る群から選択される、3重縮重ヌクレオチドであり、
Zは、K、M、R、およびYから成る群から選択される、2重縮重ヌクレオチドであって、Kは、GおよびT/Uから成る群から選択され、Mは、AおよびCから成る群から選択され、Rは、AおよびGから成る群から選択され、Yは、CおよびT/Uから成る群から選択される、2重縮重ヌクレオチドであり、
m、p、およびqは、整数であり、mは、0または2〜20の間の整数であり、pおよびqは、0〜20の間の整数であるが、ただし、2つの整数が0ではないか、または、mおよびqの両方が0であるかのどちらか一方であり、さらに、少なくとも2つのN残基を有する、Nを含むオリゴヌクレオチドは、前記2つのN残基を分離させる、少なくとも1つのXまたはZ残基を有する、
複数のオリゴヌクレオチド。 - 1つの整数が、0であり、前記オリゴヌクレオチドの式が、NmXp、NmZq、およびXpZqから成る群から選択され、式中、mは、2〜8の間の整数であり、pおよびqは、それぞれ、1〜8の間の整数であり、前記2つの整数の合計が、9である、請求項1に記載の複数のオリゴヌクレオチド。
- mおよびqの両方が、0であり、前記オリゴヌクレオチドの式は、Xpであって、式中、pが、2〜20の間の整数である、請求項1に記載の複数のオリゴヌクレオチド。
- それぞれのオリゴヌクレオチドが、5′末端に非縮重ヌクレオチドの配列をさらに含み、前記非縮重配列が、前記複数のオリゴヌクレオチドの中で一定であり、前記一定の非縮重配列が、14ヌクレオチド〜24ヌクレオチド長である、請求項1に記載の複数のオリゴヌクレオチド。
- 標的核酸群を増幅するための方法であって、
(a)前記標的核酸群を複数のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させて、複数の核酸プライマー二本鎖を形成するステップであって、前記オリゴヌクレオチドプライマーのそれぞれが、式NmXpZqを有し、式中、
Nは、アデノシン(A)、シチジン(C)、グアノシン(G)、およびチミジン/ウリジン(T/U)から成る群から選択される、4重縮重ヌクレオチドであり、
Xは、B、D、H、およびVから成る群から選択される、3重縮重ヌクレオチドであって、Bは、C、G、およびT/Uから成る群から選択され、Dは、A、G、およびT/Uから成る群から選択され、Hは、A、C、およびT/Uから成る群から選択され、Vは、A、C、およびGから成る群から選択される、3重縮重ヌクレオチドであり、
Zは、K、M、R、およびYから成る群から選択される、2重縮重ヌクレオチドであって、Kは、GおよびT/Uから成る群から選択され、Mは、AおよびCから成る群から選択され、Rは、AおよびGから成る群から選択され、Yは、CおよびT/Uから成る群から選択される、2重縮重ヌクレオチドであり、
m、p、およびqは、整数であり、mは、0または2〜20の間の整数であり、pおよびqは、0〜20の間の整数であるが、ただし、2つの整数が0ではなく、さらに、少なくとも2つのN残基を有する、Nを含むオリゴヌクレオチドは、前記2つのN残基を分離させる少なくとも1つのXまたはZ残基を有する、
ステップと、
(b)前記複数の核酸プライマー二重鎖を複製して、複製鎖のライブラリーを作成するステップであって、複製鎖の量がステップ(a)で使用する標的核酸の量を超過し、前記超過が前記標的核酸群の増幅を示唆する、ステップと、
を含む、方法。 - 前記複数のオリゴヌクレオチドプライマーの式が、NmXp、NmZq、およびXpZqから成る群から選択され、mは、2〜8の間の整数であり、pおよびqは、それぞれ、1〜8の間の整数であり、前記2つの整数の合計が、9である、請求項5に記載の方法。
- Nを含む前記オリゴヌクレオチドプライマーが、3つ以下の連続N残基を有する、請求項6に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプライマーのそれぞれが、KNNNKNKNK、NKNNKNNKK、およびNNNKNKKNKから成る群から選択される配列を有する、請求項7に記載の方法。
- それぞれのオリゴヌクレオチドプライマーは、5′末端に非縮重ヌクレオチドの配列をさらに含み、前記非縮重配列が、複数のオリゴヌクレオチドの中で一定であり、前記一定の非縮重配列が、14ヌクレオチド〜24ヌクレオチド長である、請求項5に記載の方法。
- 前記標的核酸の複製が、エキソ−マイナスクレノウDNAポリメラーゼ、エキソ−マイナスT7DNAポリメラーゼ、Phi29DNAポリメラーゼ、BstDNAポリメラーゼ、Bcaポリメラーゼ、ベントDNAポリメラーゼ、9°NmDNAポリメラーゼ、MMLV逆転写酵素、AMV逆転写酵素、HIV逆転写酵素、それらの変異体、およびそれらの混合物から成る群から選択される酵素によって触媒される、請求項5に記載の方法。
- ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、複製鎖の前記ライブラリーを増幅するステップをさらに含む、請求項5に記載の方法。
- 増幅が、前記複製鎖の終端における一定領域に相補的であるプライマー、および一対のプライマーから成る群から選択される、少なくとも1つのプライマーを使用する、請求項11に記載の方法。
- 前記増幅されたライブラリーが、前記ポリメラーゼ連鎖反応中の少なくとも1つの修飾ヌクレオチドの取り込みによって標識され、前記修飾ヌクレオチドが、蛍光標識されたヌクレオチド、アミノアリル−dUTP、ブロモ−dUTP、およびジゴキシゲニン標識されたヌクレオチドから成る群から選択される、請求項11に記載の方法。
- 前記標的核酸が、機械的、化学的、熱的、および酵素的手段から成る群から選択される方法によって断片化される、請求項5に記載の方法。
- 前記標的核酸が、DNAであり、前記複製が、エキソ−マイナスクレノウDNAポリメラーゼによって触媒され、および前記増幅が、TaqDNAポリメラーゼによって触媒される、請求項11に記載の方法。
- 前記標的核酸が、RNAであり、前記複数のオリゴヌクレオチドプライマーが、オリゴdTプライマーをさらに含み、前記複製が、MMLV逆転写酵素および/またはエキソ−マイナスクレノウDNAポリメラーゼによって触媒され、前記増幅が、TaqDNAポリメラーゼによって触媒される、請求項11に記載の方法。
- 前記複製が、前記オリゴdTプライマーおよびMMLV逆転写酵素を使用する第1の反応と、前記複数のオリゴヌクレオチドプライマーおよびTaqDNAポリメラーゼを使用する第2の反応とを含む、請求項16に記載の方法。
- 標的核酸を増幅するためのキットであって、
(a)複数のオリゴヌクレオチドプライマーであって、それぞれのオリゴヌクレオチドプライマーは、式NmXp Z qを有し、式中、
Nは、アデノシン(A)、シチジン(C)、グアノシン(G)、およびチミジン/ウリジン(T/U)から成る群から選択される、4重縮重ヌクレオチドであり、
Xは、B、D、H、およびVから成る群から選択される、3重縮重ヌクレオチドであって、Bは、C、G、およびT/Uから成る群から選択され、Dは、A、G、およびT/Uから成る群から選択され、Hは、A、C、およびT/Uから成る群から選択され、Vは、A、C、およびGから成る群から選択される、3重縮重ヌクレオチドであり、
Zは、K、M、R、およびYから成る群から選択される、2重縮重ヌクレオチドであって、Kは、GおよびT/Uから成る群から選択され、Mは、AおよびCから成る群から選択され、Rは、AおよびGから成る群から選択され、Yは、CおよびT/Uから成る群から選択される、2重縮重ヌクレオチドであり、
m、p、およびqは、整数であり、mは、0または2〜20の間の整数であり、pおよびqは、0〜20の間の整数であるが、ただし、2つの整数が0ではなく、さらに、少なくとも2つのN残基を有する、Nを含むオリゴヌクレオチドは、前記2つのN残基を分離させる少なくとも1つのXまたはZ残基を有する、複数のオリゴヌクレオチドプライマーと、
(b)複製酵素と、
を備える、キット。 - 前記複数のオリゴヌクレオチドプライマーの式が、NmXp、NmZq、およびXpZqから成る群から選択され、mが、2〜8の間の整数であり、pおよびqが、それぞれ、1〜8の間の整数であり、前記2つの整数の合計が、9である、請求項18に記載のキット。
- Nを含む前記複数のオリゴヌクレオチドプライマーが、3つ以下の連続N残基を有する、請求項19に記載のキット。
- 前記オリゴヌクレオチドプライマーのそれぞれが、KNNNNKNKNK、NKNNKNNKK、およびNNNKNKKNKから成る群から選択される配列を有する、請求項20に記載のキット。
- 前記複数のオリゴヌクレオチドプライマーが、オリゴdTプライマーをさらに含む、請求項19に記載のキット。
- それぞれのオリゴヌクレオチドプライマーは、5′末端に非縮重ヌクレオチドの配列をさらに含み、前記非縮重配列が、前記複数のオリゴヌクレオチドの中で一定であり、前記一定の非縮重配列が、14ヌクレオチド〜24ヌクレオチド長である、請求項18に記載のキット。
- 前記複製酵素が、エキソ−マイナスクレノウDNAポリメラーゼ、エキソ−マイナスT7DNAポリメラーゼ、Phi29DNAポリメラーゼ、BstDNAポリメラーゼ、Bcaポリメラーゼ、ベントDNAポリメラーゼ、9°NmDNAポリメラーゼ、MMLV逆転写酵素、AMV逆転写酵素、HIV逆転写酵素、それらの変異体、およびそれらの混合物から成る群から選択される、請求項18に記載のキット。
- TaqDNAポリメラーゼ、PfuDNAポリメラーゼ、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される熱安定性DNAポリメラーゼをさらに含む、請求項18に記載のキット。
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