JP6608384B2 - コピー数が保持されるrna分析法 - Google Patents
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Description
a)第1のオリゴヌクレオチドプライマーを、上記鋳型RNAの予め選択された核酸領域でアニーリングさせること、
b)該第1のオリゴヌクレオチドプライマーを鋳型特異的に伸長させることによって、通常は該鋳型RNAを含む二本鎖の状態にある第1の伸長された鎖を得ること、
c)該RNA鋳型を少なくとも上記二本鎖から除去すること、
d)1又は複数種の更なるオリゴヌクレオチドプライマーを上記第1の伸長された鎖にアニーリングさせること、
e)上記1又は複数種の更なるオリゴヌクレオチドプライマーを、鋳型特異的に、1)上記第1の伸長された鎖にアニーリングされたプライマーを置換することなく、又は2)置換された鎖を破壊するポリメラーゼを用いて伸長させることによって、更なる伸長産物を生成すること、
f)上記第1のオリゴヌクレオチドプライマーに相補的に(又は相補して)伸長された核酸部分を含む上記更なる伸長産物の伸長産物を単離及び/又は増幅すること、
を含む、方法を提供する。
手短に言えば、ライブラリー生成の原理は、図1に記載されるようにして実施される。a)cDNA合成は、既に存在するか(ここではmRNAのポリ(A))又は先行する反応で結合されたかいずれかの既知の領域又はタグにプライミングすることによって開始される。P1は、上記の既知の領域に相補的であり、ユニバーサルタグとしてはたらく非相補的な特異的配列を5’末端に更に含む。b)RNAは、RNA依存性ポリメラーゼ、すなわち逆転写酵素によってcDNAへと逆転写される。c)cDNA合成後に、該RNA鋳型はRNアーゼ、pH変化(NaOH及び熱)又は二価カチオン(Mn2+、Mg2+及び熱)のいずれかによって加水分解又は分解される。d)次いで、該一本鎖cDNAは、多数のランダムプライマー、P(n)、P(n+1)...P(n+n)によってプライミングされる。e)そして第二鎖は、鎖置換を伴わないDNA依存性ポリメラーゼを使用して合成される。鎖置換の欠如は、最も3’側の断片だけが、2つのタグ、つまり一方は、cDNA合成プライマー由来のものであり、かつもう一方が第二鎖合成プライマー由来のものであるタグを含むであろうことを保証する。
アッセイの説明:
準備されたアッセイの概略図は図2に示されて説明されている。鎖置換を伴い、置換された鎖を破壊する能力を有する方と有さない方との異なるポリメラーゼ及び鎖置換を伴わないポリメラーゼを、図2で記載されるアッセイを使用して評価した。簡潔には、配列番号1、配列番号2及び配列番号3を、種々のポリメラーゼの相応のバッファー中でハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの後に、ポリメラーゼを添加(3UのT4 DNAポリメラーゼ、10UのT7 DNAポリメラーゼ又は5Uのクレノウ断片(3’−5’exo−)し、そして該反応を図3及び図4に示されるようにして実施した。反応時間は、指定した温度で10分であった。その後に該反応を、シリカカラムを介して精製し、特にサイズ選択をせずにバッファー成分及び酵素を除去した。試料を、10%のPAAゲル(ローディングダイと混合し、95℃で2分間にわたり変性されている)上にロードし、58℃において100Vで10分間にわたって流し、次いで180Vで120分間にわたって流した。ゲルをGYBR Goldで染色した。
マウス肝臓から単離された全RNAは、111ntの一本鎖DNA(ssDNA)オリゴ(配列番号7)でスパイクした(レーン1及びレーン10を参照のこと)。全RNAは長いため、ゲルではより小さいRNAバンドしか確認することができず、その長いRNA断片はスロット中に残る。断片化に際し、より長いRNA断片は分解されることとなり、ポリアクリルアミドゲル上ではスメアとして確認することができる。標準的なRTバッファーである50mMのトリスHCl(25℃でpH8.3)、75mMのKCl、3mMのMgCl2及び10mMのDTT中での、95℃で30分間並びに98℃で5分間、98℃で10分間、98℃で20分間及び98℃で30分間の熱処理によって、該RNAは分解されるが、該RNAは完全に除去されない。RNA/ssDNA混合物をRNアーゼ H/A/T1ミックスと一緒に、25℃又は37℃のいずれかで30分間にわたりインキュベートすることで、該RNAは一本鎖DNAを分解することなく完全に除去される。高められた温度で10分間(55℃)、0.1NのNaOHの存在下でインキュベートすることで、該RNAは分解されるものの、完全には分解されない。0.1NのNaOH中にて95℃で10分後に、該RNAは完全に除去されるが、上記ssDNAも分解し始める(レーン7〜10)。10mMのMnCl2をRNA/ssDNA/RTバッファー混合物に添加して、98℃で5分間、10分間、20分間、そして30分間にわたり熱処理することで、ssDNAを分解することなく、該RNAの完全な分解がもたらされる。試料を、精製せずに10%のPAAゲル(ローディングダイと混合し、95℃で2分間にわたり変性されている)上にロードし、58℃において100Vで10分間にわたって流し、次いで180Vで70分間にわたって流した。ゲルをGYBR Goldで染色した。
500ngの全RNAを、配列番号8(20μl中の最終濃度:25nM)と混合し、そして4μlの5×RTバッファーを含有する10μlの容量で85℃に3分間にわたり加熱した。37℃に冷却した後に、1μlの1mMのdNTP、200ユニットのM−MLVを加え、そして37℃で15分間にわたりインキュベートした。引き続いてのRNA加水分解は、図6に示されるように異なる。RT反応バッファーにおけるビオチン−ストレプトアビジンつり上げ(fishing)を、NEB製の5μgのストレプトアビジンビーズを使用して20分間(25℃で1250rpmで振とう器において)にわたり実施した。ビーズを洗浄バッファーで2回洗浄し、そして10μlのMB−H2O中にて80℃で何分かにわたり加熱することによって試料をビーズから放出させた。マグネットを使用してビーズを回収し、そして澄明な上清を種々のチューブに移し、第二鎖cDNA合成を、3ユニットのT4 DNAポリメラーゼ、配列番号9及び10(20μl中の最終濃度 0.1μM)、8%のPEG、10mMのMgCl2及び0.5mMのdNTPを使用して20μlの全容量で実施した。ポリメラーゼを添加する前に、98℃で1分間の変性工程と、ゆっくりとしたアニーリング(15分以内で25℃にまで下降)とが含まれていた。次いで試料をSENSEユーザーガイドに従ってシリカにより精製して(第二鎖合成後の部分精製)、25μlの10mMのトリス(pH8)において溶出させた。10μlの精製された生成物を、次いでSENSE mRNA Seq PCRに従って配列番号11及び12をPCRプライマーとして使用して18サイクルにわたり増幅した。次いで試料をSENSEユーザーガイドに従ってシリカにより精製して(第二鎖合成後の部分精製)、15μlの10mMのトリス(pH8)において溶出させた。1μlの精製されたPCR産物を、High−sensitivity DNA−Chip(Agilent)へと製造元の指示に従ってロードした。
RNAが変性される容量は、該変性の間に存在するMgCl2濃度にも影響を及ぼし、これはまた、どれほどの長さのcDNAが、その僅かに断片化されたRNAから生成されるのかも決める。
全てのライブラリーは17サイクル。全ての反応条件は、実施例5に従うが、以下の濃度に変える。a)逆転写(RT)工程の間に50nMの配列番号8並びに第二鎖合成(SSS)において0.1μMの配列番号9及び10、b)RTの間に25nMの配列番号8並びにSSSの間に0.5μMの配列番号9及び10、ライブラリーはロードする前に1:3希釈した、c)RTの間に50nMの配列番号8並びにSSSの間に0.5μMの配列番号9及び10、ライブラリーはロードする前に1:3希釈した、d)RTの間に25nMの配列番号8並びにSSSの間に0.1μMの配列番号9及び10。
全ての工程は実施例6(c)に記載される通りであるが、異なる精製を用いる。シリカ精製は、実施例5に記載されるようにして行い、かつヒドロキシル変性された磁性ビーズ及び塩−PEGバッファーを用いるSPRI精製は、製造元(Agentcourt製のAMPure XPビーズ)の指示に従って実施した。
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- 鋳型RNA分子から核酸産物を生成する方法であって、鋳型RNAを得た後に、
a)第1のオリゴヌクレオチドプライマーを、前記鋳型RNAの予め選択された核酸領域でアニーリングさせること、
b)該第1のオリゴヌクレオチドプライマーを鋳型特異的に伸長させることによって、第1の伸長された鎖を得ること、
c)該RNA鋳型を除去すること、
d)1つよりも多い種の更なるオリゴヌクレオチドプライマーを前記第1の伸長された鎖にアニーリングさせること、
e)鎖置換活性を欠くポリメラーゼを用いて、及び/又はポリメラーゼによる鎖置換に抵抗性を有するプライマーを使用して、前記第1の伸長された鎖にアニーリングされたプライマーを置換することなく、前記1つよりも多い種の更なるオリゴヌクレオチドプライマーを鋳型特異的に伸長し、更なる伸長産物を生成すること、
ここで、工程a)〜e)は、1つの引き続き増大していく流体容量で実施される、
f)前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーに相補的に伸長された核酸部分を含む前記の更なる伸長産物の伸長産物を単離及び/又は増幅すること、
を含む、方法。 - 前記鎖置換活性を欠くポリメラーゼが、T7、T4若しくはQ5 DNAポリメラーゼである、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼによる鎖置換に抵抗性を有するプライマーが、LNA若しくは2’フルオロ修飾を有するヌクレオチドを有するプライマーである、請求項1又は2に記載の方法。
- 工程a)〜e)が、洗浄することなく実施される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 工程a)〜e)が、流体を除去することなく実施される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記予め選択された核酸領域は、3’末端核酸領域である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記3’末端核酸領域は、ポリAテールを含む、請求項6に記載の方法。
- 前記方法は、3’ポリヌクレオチドテールを前記鋳型RNAの3’末端に付加する工程を更に含み、前記予め選択された3’末端核酸領域は、前記3’ポリヌクレオチドテールを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のオリゴヌクレオチドプライマー及び/又は更なるオリゴヌクレオチドプライマーは、DNAである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のオリゴヌクレオチドプライマー及び/又は更なるオリゴヌクレオチドプライマーは、非アニーリング配列タグ又はリンカー配列を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記非アニーリング配列タグ又はリンカー配列は、増幅プライマー結合のために使用される、請求項10に記載の方法。
- 前記非アニーリング配列タグ又はリンカー配列は、バーコードを含む、請求項10に記載の方法。
- 前記非アニーリング配列タグ又はリンカー配列は、ランダムバーコードを含む、請求項10に記載の方法。
- 前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーを鋳型特異的に伸長させることb)は、逆転写によって行われ、かつ該第1の伸長された鎖は、DNA鎖である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記RNA鋳型を除去することc)は、酵素的RNA消化、アルカリ性分解、又は二価カチオンの存在下での加熱を含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酵素的RNA消化がRNアーゼにより実施され、前記アルカリ性分解がNaOH処理により実施され、又は前記加熱がMn 2+ 若しくはMg 2+ の存在下で実施される、請求項15に記載の方法。
- 前記1つよりも多い種の更なるオリゴヌクレオチドプライマーは、ランダムプライマー及び/又は少なくとも10種の異なるプライマーを含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つよりも多い種の更なるオリゴヌクレオチドプライマーは、ランダムプライマー及び/又は少なくとも20種の異なるプライマーを含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つよりも多い種の更なるオリゴヌクレオチドプライマーは、ランダムプライマー及び/又は少なくとも100種の異なるプライマーを含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記予め選択された核酸領域は、1つ又は複数の関心の鋳型RNAに存在する、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つよりも多い種の更なるオリゴヌクレオチドプライマーは、それぞれ1種の鋳型RNA又は該RNAにある遺伝子配列に特異的である、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つよりも多い種の更なるオリゴヌクレオチドプライマーは、1つ又は複数の関心のRNAの特異的領域にアニーリングする、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つよりも多い種の更なるオリゴヌクレオチドプライマーを鋳型特異的に伸長させることe)は、クラウディング剤の存在下で実施される、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記クラウディング剤が、PEGである、請求項23に記載の方法。
- 前記鋳型RNAは、1番目のプライマーアニーリングの前に断片化される、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 工程e)の伸長産物を精製する工程を更に含む、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記更なる伸長産物に対して、該伸長産物の配列タグ又はリンカー配列に特異的なプライマーを使用してPCRを実施することを含む、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PCRの少なくとも1種のプライマーは、更なる配列タグ又はリンカー配列を含む、請求項27に記載の方法。
- 請求項1〜28のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットの使用であって、該キットは、逆転写酵素、dNTP、補因子又はポリメラーゼに必要とされる金属イオンの塩、プライマー、鎖置換活性を有さないDNAポリメラーゼ、例えばT7、Q5若しくはT4 DNAポリメラーゼ及びランダムオリゴヌクレオチドプライマーを含む、使用。
- 前記金属イオンが、Mg 2+ である、請求項29に記載の使用。
- 前記キットが、RNA分解剤及び/又はクラウディング剤、例えばPEGを更に含む、請求項29又は30に記載の使用。
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