JP2017537658A5 - - Google Patents
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Claims (19)
- 試料中の標的核酸を増幅するための核酸プライマーセットであって、標的核酸が第一の鋳型鎖、及び任意選択により、第二の鋳型鎖を含み、第二の鋳型鎖が第一の鋳型鎖に相補的であり、プライマーセットが、第一の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも2つの第一のプライマーの形態である、又は第一の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも2つの第一のプライマーを形成することができるオリゴヌクレオチドを含み、少なくとも2つの第一のプライマーが、
第一の鋳型鎖配列a'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列aを含む第一の外側プライマー;並びに
a'に隣接する、及びa'の5'側にある、第一の鋳型鎖配列b'に特異的にハイブリダイズする一本鎖プライマー配列bを含む第一の内側プライマー
を含み、一本鎖プライマー配列bがその5'端で、
一本鎖プライマー配列bに隣接する、及び一本鎖プライマー配列bの5'側にあるプライマー配列a;並びに
第一の鎖鋳型配列a'に隣接する、及び第一の鎖鋳型配列a'の3'側にある第一の鎖鋳型配列d'に相補的ではなく、プライマー配列aに隣接する、及びプライマー配列aの5'側にあるクランプ配列c
を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する、核酸プライマーセット。 - 第二の鋳型鎖に特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも1つの第二のプライマーを更に含む、請求項1に記載のプライマーセット。
- 試料中の標的核酸を増幅するための方法であって、標的核酸が第一の鋳型鎖、及び任意選択により、第二の鋳型鎖を含み、第二の鋳型鎖が第一の鋳型鎖に相補的であり、
(a)試料を、
(i)第一の鋳型鎖配列a'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列aを含む第一の外側プライマー;並びに
a'に隣接する、及びa'の5'側にある第一の鋳型鎖配列b'に特異的にハイブリダイズする一本鎖プライマー配列bを含む第一の内側プライマー
を含み、一本鎖プライマー配列bがその5'端で、
一本鎖プライマー配列bに隣接する、及び一本鎖プライマー配列bの5'側にあるプライマー配列a;並びに
第一の鎖鋳型配列a'に隣接する、及び第一の鎖鋳型配列a'の3'側にある、第一の鎖鋳型配列d'に相補的ではない、プライマー配列aに隣接する、及びプライマー配列aの5'側にあるクランプ配列c
を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する、第一の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも2つの第一のプライマー;並びに
(ii)第二の鋳型鎖に特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも1つの第二のプライマー
と接触させる工程であって、存在する場合、プライマーがそれらの鋳型鎖にアニールする条件下で接触が行われる、接触させる工程;並びに
(b)5'から3'エクソヌクレアーゼ活性を欠損するDNAポリメラーゼを使用して、鎖置換が生じる条件下で、存在する場合、標的核酸を増幅して、鋳型配列a'から第二のプライマーの結合部位へと伸長する配列を含むアンプリコンを産生する工程
を含む、方法。 - DNAポリメラーゼが鎖置換活性を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載のプライマーセット又は方法。
- 二本鎖形態の結合した配列c-aのTmが、二本鎖形態の結合した配列a-bのTmより高い、請求項1から4のいずれか一項に記載のプライマーセット又は方法。
- 結合した配列c-aが、結合した配列a-bよりもGCリッチであり、及び/又はより多くの安定化塩基を含有する、請求項1から5のいずれか一項に記載のプライマーセット又は方法。
- 前記増幅が、PCRの対数期中に3サイクル数までの速さで標的核酸を増幅する、請求項3から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増幅が、単一のフォワード及び単一のリバースプライマーのみを使用する検出に必要とされるよりも、約12%〜42%少ない増幅サイクル内で、生体試料中の単一コピーの核酸の前記検出を可能にする、請求項3から7のいずれか一項に記載の方法。
- 第二のプライマーが、第二の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも2つの第二のプライマーの形態である、又は第二の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも2つの第二のプライマーを形成することができるオリゴヌクレオチドを含み、少なくとも2つの第二のプライマーが、
第二の鋳型鎖配列e'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列eを含む第二の外側プライマー;並びに
第二の鋳型鎖配列f'に特異的にハイブリダイズする一本鎖プライマー配列f
を含み、f'がe'に隣接する、及びe'の5'側にあり、一本鎖プライマー配列fがその5'端で、
一本鎖プライマー配列fに隣接する、及び一本鎖プライマー配列fの5'側にあるプライマー配列e;並びに
第二の鎖鋳型配列e'に隣接する、及び第二の鎖鋳型配列e'の3'側にあり、第二の鎖鋳型配列h'に相補的ではない、プライマー配列eに隣接する、及びプライマー配列eの5'側にあるクランプ配列g
を含む二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する第二の内側プライマー
を含む、請求項1、2、5、若しくは6に記載のプライマーセット、又は請求項3から8のいずれか一項に記載の方法。 - 二本鎖形態の結合した配列g-eのTmが、二本鎖形態の結合した配列e-fのTmよりも高い、請求項9に記載のプライマーセット又は方法。
- 結合した配列g-eが、結合した配列e-fよりもGCリッチであり、及び/又はより多くの安定化塩基を含有する、請求項9又は10に記載のプライマーセット又は方法。
- 前記増幅が、PCRの対数期中に6サイクル数までの速さで標的核酸を増幅する、請求項9から11のいずれか一項に記載のプライマーセット又は方法。
- 前記増幅が、単一のフォワード及び単一のリバースプライマーのみを使用する検出に必要とされるよりも、約36%〜66%少ない増幅サイクル内で、生体試料中の単一コピーの核酸の前記検出を可能にする、請求項9から12のいずれか一項に記載のプライマーセット又は方法。
- クランプ配列c及びgが、存在する場合、増幅中にコピーされ得ない、請求項1から13のいずれか一項に記載のプライマーセット又は方法。
- クランプ配列c及び/又はgが、存在する場合、2'-O-メチルRNAを含む、請求項14に記載のプライマーセット又は方法。
- 第一の内側プライマー及び/又は第二の内側プライマーの二本鎖プライマー配列が、存在する場合、ヘアピン配列を含まない、請求項1から15のいずれか一項に記載のプライマーセット又は方法。
- 第一の内側プライマーの二本鎖プライマー配列が、クランプ配列cが相補的な配列c'に連結するヘアピン配列を含む、及び/又は第二の内側プライマーの二本鎖プライマー配列が、存在する場合、クランプ配列gが相補的な配列g'に連結するヘアピン配列を含む、請求項3から15のいずれか一項に記載のプライマーセット又は方法。
- 試料中の標的核酸を増幅するための核酸プライマーセットであって、標的核酸が第一の鋳型鎖、及び任意選択により、第二の鋳型鎖を含み、第二の鋳型鎖が第一の鋳型鎖に相補的であり、プライマーセットが、第一の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも3つの第一のプライマーの形態である、又は前記第一の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも3つの第一のプライマーを形成することができるオリゴヌクレオチドを含み、少なくとも3つの第一のプライマーが、
第一の鋳型鎖配列d'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列dを含む第一の外側プライマー;
第一の中間プライマーであって、第一の鋳型鎖配列a'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列aを含み、a'がd'に隣接する、及びd'の5'側にあり、一本鎖プライマー配列aがその5'端で、
一本鎖プライマー配列aに隣接する、及び一本鎖プライマー配列aの5'側にあるプライマー配列d;並びに
第一の鎖鋳型配列d'に隣接する、及び第一の鎖鋳型配列d'の3'側にある第一の鎖鋳型配列i'に相補的ではなく、プライマー配列dに隣接する、及びプライマー配列dの5'側にあるクランプ配列c1
を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する、中間プライマー;並びに、
第一の内側プライマーであって、第一の鋳型鎖配列b'に特異的にハイブリダイズする一本鎖プライマー配列bを含み、b'がa'に隣接する、及びa'の5'側にあり、一本鎖プライマー配列bがその5'端で、
一本鎖プライマー配列bに隣接する、及び一本鎖プライマー配列aの5'側にあるプライマー配列a;
プライマー配列aに隣接する、及びプライマー配列aの5'側にあるプライマー配列d;並びに
プライマー配列dに隣接する、及びプライマー配列dの5'側にあり、第一の鎖鋳型配列i'に相補的ではないクランプ配列c2
を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する、内側プライマーを含む、核酸プライマーセット。 - 試料中の標的核酸を増幅するための方法であって、標的核酸が第一の鋳型鎖、及び任意選択により、第二の鋳型鎖を含み、第二の鋳型鎖が第一の鋳型鎖に相補的であり、
(a)試料を、
(i)第一の鋳型鎖配列d'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列dを含む第一の外側プライマー;
第一の中間プライマーであって、第一の鋳型鎖配列a'に特異的にハイブリダイズするプライマー配列aを含み、a'がd'に隣接する、及びd'の5'側にあり、一本鎖プライマー配列aがその5'端で、
一本鎖プライマー配列aに隣接する、及び一本鎖プライマー配列aの5'側にあるプライマー配列d;並びに
第一の鎖鋳型配列d'に隣接する、及び第一の鎖鋳型配列d'の3'側にある第一の鎖鋳型配列i'に相補的ではなく、プライマー配列dに隣接する、及びプライマー配列dの5'側にあるクランプ配列c1
を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する、中間プライマー;並びに、
第一の内側プライマーであって、第一の鋳型鎖配列b'に特異的にハイブリダイズする一本鎖プライマー配列bを含み、b'がa'に隣接する、及びa'の5'側にあり、一本鎖プライマー配列bがその5'端で、
一本鎖プライマー配列bに隣接する、及び一本鎖プライマー配列bの5'側にあるプライマー配列a;
プライマー配列aに隣接する、及びプライマー配列aの5'側にあるプライマー配列d;並びに
プライマー配列dに隣接する、及びプライマー配列dの5'側にある、第一の鎖鋳型配列i'に相補的ではないクランプ配列c2
を含む、二本鎖プライマー配列の第一の鎖に連結する、内側プライマー
を含む、第一の鋳型鎖にハイブリダイズすることができる少なくとも3つの第一のプライマー、並びに
(ii)第二の鋳型鎖に特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも1つの第二のプライマー
と接触させる工程であって、存在する場合、プライマーがそれらの鋳型鎖にアニールする条件下で接触が行われる、接触させる工程、並びに
(b)5'から3'エクソヌクレアーゼ活性を欠損するDNAポリメラーゼを使用して、鎖置換が生じる条件下で、存在する場合、標的核酸を増幅して、鋳型配列a'から第二のプライマーの結合部位へと伸長する配列を含むアンプリコンを産生する工程
を含む、方法。
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