JP2015511818A5

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Publication number: JP2015511818A5
Application number: JP2014556886A
Authority: JP
Filing date: 2013-02-20
Publication date: 2016-04-14
Anticipated expiration: 2033-02-20

Claims

試料中の標的ポリヌクレオチドの存在または不存在を決定する方法であって、
オリゴヌクレオチドの５’末端で終止し、標的ポリヌクレオチドの鎖の第１部分に相補的塩基対合によりハイブリダイズ可能な第１プライマー成分と、
オリゴヌクレオチドの３’末端で終止し、標的ポリヌクレオチドの鎖の第２部分に相補的塩基対合によりハイブリダイズ可能な第２プライマー成分を含むプライマーオリゴヌクレオチドを準備すること、
標的ポリヌクレオチドを含んでいる可能性のある試料を、第１プライマー成分と第２プライマー成分を標的ポリヌクレオチド鎖とハイブリダイズさせるのに適当な条件下で、プライマーオリゴヌクレオチドと接触させることであって、そうすることで２本鎖デュプレックスが形成され（ここでデュプレックスの中間部の少なくとも１本の鎖が、中間部の対向鎖に少なくとも４つのヌクレオチドの配列と塩基対相補性を共有するヌクレオチド配列が存在しないので中間部の対向鎖とハイブリダイズしないままである少なくとも４つのヌクレオチドの配列を含み、およびここで標的ポリヌクレオチドの第１部分と第２部分が１つまたは複数の介在するヌクレオチドで分離されている）、
試料を標的ポリヌクレオチド鎖を鋳型として用いることができるポリメラーゼ酵素と接触させることであって、デュプレックスのプライマーオリゴヌクレオチドを伸長させ、そうすることで第１と第２の末端成分の中間の内部成分を含む単位複製配列が生成され（ここで
単位複製配列の第１末端成分が相補的塩基対合により標的ポリヌクレオチド鎖の前記第１部分とハイブリダイズ可能であり、
単位複製配列の第２末端成分が相補的塩基対合により標的ポリヌクレオチド鎖の前記第２部分とハイブリダイズ可能であり、
単位複製配列の第１および第２末端成分の標的ポリヌクレオチド鎖との前記ハイブリダイズにより、単位複製配列の内部成分は、標的ポリヌクレオチド鎖の第１および第２部分の間の内部成分と塩基対相補性を共有しない標的ポリヌクレオチド鎖のヌクレオチドの中間配列に対向して位置する）および
単位複製配列が生成したかどうかを検出すること（ここで、単位複製配列の検出は、試料中の標的ポリヌクレオチドの存在を示し、単位複製配列の検出失敗は、試料中の標的ポリヌクレオチドの不存在を示す）を含む、前記方法。
前記単位複製配列が生成したかどうかを検出することは、単位複製配列の内部成分、または単位複製配列の内部成分に相補的なヌクレオチドの配列を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
相補的塩基対合による標的ポリヌクレオチド鎖との前記ハイブリダイズ時、第１プライマー成分の融解温度が第２プライマー成分の融解温度よりも高い、請求項１または２に記載の方法。
プライマーオリゴヌクレオチドが、第１プライマー成分と第２プライマー成分の間に位置する第３プライマー成分を含み、第３プライマー成分は
標的ポリヌクレオチド鎖のヌクレオチドの前記中間配列と塩基対相補性を共有せず、
単位複製配列の内部成分中のヌクレオチド配列と同一であり、
任意に、第３プライマー成分がプライマーオリゴヌクレオチドの３’ハーフに部分的または完全に位置する、
ヌクレオチド配列からなる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
（ｉ）第３プライマー成分とヌクレオチドの中間配列のヌクレオチド数が等しい、または
（ｉｉ）第３プライマー成分中のヌクレオチド数がヌクレオチドの前記中間配列のヌクレオチド数よりも多い、請求項４に記載の方法。
第３プライマー成分中のヌクレオチド数がヌクレオチドの前記中間配列のヌクレオチド数よりも少ない、請求項４に記載の方法。
標的ポリヌクレオチド鎖が、標的ポリヌクレオチド集団の２以上の個体メンバー間で異なる多型領域を含み、
第１プライマー成分と第２プライマー成分がそれぞれ、多型領域の上流に位置する標的ポリヌクレオチド鎖の成分と配列相補性を共有する第１プライマー成分と、多型領域の下流に位置する標的ポリヌクレオチド鎖の成分と配列相補性を共有する第２プライマー成分により、集団の複数のメンバーとハイブリダイズすることが可能であり、
多型領域は、第１プライマー成分と第２プライマー成分が標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするとき、プライマーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしないままである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
標的ポリヌクレオチド鎖が一塩基多型（ＳＮＰ）および／または点変異を含み、
単位複製配列が
（ｉ）ＳＮＰに相補的なヌクレオチドおよび／または
（ｉｉ）点変異に相補的なヌクレオチドを含み、
第１または第２プライマー成分が上記（ｉ）および／または（ｉｉ）と相補的塩基対合によりハイブリダイズできる、請求項１から６のいずれか１つに記載の方法。
第２プライマー成分が、
第２プライマー成分の３’末端、
第２プライマー成分の３’末端の１、２、３、４、５ヌクレオチドまたは５以上のヌクレオチド上流、
第２プライマー成分の３’末端（ここで第２プライマー成分は、３’末端の２、３、４、５、６ヌクレオチドまたは６以上のヌクレオチド上流に位置する標的ポリヌクレオチドに非相補的なヌクレオチドも含む）、または
第２プライマー成分の３’末端の１、２、３、４、５ヌクレオチドまたは５以上のヌクレオチド上流（ここで第２プライマー成分は、標的に非相補的なさらなるヌクレオチドも含み、前記さらなるヌクレオチドはＳＮＰまたは点変異に相補的な前記ヌクレオチドの３’または５’に位置する）に位置する、ＳＮＰに相補的なヌクレオチドまたは点変異に相補的なヌクレオチドを含む、請求項８に記載の方法。
標的ポリヌクレオチド鎖が、標的ポリヌクレオチド集団の少なくとも２つの個体メンバー間で異なる多型領域を含み、
多型領域が、多型領域が標的ポリヌクレオチドの前記集団の２以上の個体メンバー間で異なるように１または複数ヌクレオチドの欠失を含み、
第１プライマー成分または第２プライマー成分が、前記標的ポリヌクレオチド鎖中の多型領域に相補的塩基対合によりハイブリダイズ可能であり、多型領域は集団メンバーの１サブセットのみの標的ポリヌクレオチド鎖中に存在する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
前記単位複製配列が生成したかどうかを検出することが、少なくとも２以上のパートザイム成分オリゴヌクレオチドを含む多成分核酸酵素（ＭＮＡザイム）の使用を含み、ここで少なくとも第１パートザイム成分と第２パートザイム成分が単位複製配列の存在下で自己集合して触媒活性ＭＮＡザイムを形成し、ここで第１および第２パートザイム成分は基質アーム部分、触媒コア部分およびセンサーアーム部分を含み、
自己集合時、第１および第２パートザイム成分のセンサーアーム部分がＭＮＡザイムのセンサーアームとして作用し、第１および第２パートザイム成分の基質アーム部分がＭＮＡザイムの基質アームとして作用し、第１および第２パートザイム成分の触媒コア部分がＭＮＡザイムの触媒コアとして作用し、
ＭＮＡザイムのセンサーアームが単位複製配列の一部または全部と相補的塩基対合によりハイブリダイズして第１と第２パートザイム成分を近くに維持するので第１と第２パートザイム成分はそれぞれの触媒コア部分と会合してＭＮＡザイムの触媒コアを形成し、触媒コアは少なくとも１つの基質を修飾可能であり、ＭＮＡザイムの基質アームが基質と結合してＭＮＡザイムの触媒コアが基質を修飾でき、そうすることで検出可能な効果が得られる、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
前記ＭＮＡザイムの第１および／または第２センサーアームが、
単位複製配列中の内部成分もしくはその成分または
単位複製配列中の内部成分もしくはその成分に相補的なヌクレオチドの配列を含むかそれからなるヌクレオチドの配列に相補的または実質的に相補的であり、
任意に、前記ＭＮＡザイムの第１および／または第２センサーアームが、
単位複製配列の第１末端成分および／もしくは第２末端成分またはその成分あるいは
単位複製配列の第１末端成分および／もしくは第２末端成分またはその成分に相補的なヌクレオチドの配列を含むかそれからなる単位複製配列中のヌクレオチドの配列にさらに相補的である、
請求項１１に記載の方法。
前記ＭＮＡザイムの第１および／または第２センサーアームが、
標的ポリヌクレオチド鎖中に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）および／または点変異または
標的ポリヌクレオチド鎖中に存在するＳＮＰに相補的なヌクレオチドおよび／または点変異に相補的なヌクレオチド、に相補的なヌクレオチドを含む、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
標的ポリヌクレオチド鎖が、標的ポリヌクレオチド集団の２以上の個体メンバー間で異なる多型領域を含み、
前記ＭＮＡザイムの第１および／または第２センサーアームが、
集団の所与のメンバーの多型領域もしくはその成分、または
集団の所与のメンバーの多型領域もしくはその成分に相補的なヌクレオチドの配列、を含むかそれからなる単位複製配列中のヌクレオチド配列にさらに相補的である、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の方法。
ＭＮＡザイムのセンサーアームが、第１センサーアーム成分、第２センサーアーム成分および第３センサーアーム成分を含むかそれらからなり、
第１センサーアーム成分は相補的塩基対合により単位複製配列とハイブリダイズでき、
第２センサーアーム成分は相補的塩基対合により単位複製配列とハイブリダイズでき、
第３センサーアーム成分は第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分の間に位置し、第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分が単位複製配列とハイブリダイズするときに単位複製配列と相補的塩基対合によりハイブリダイズできない、請求項１１に記載の方法。
標的ポリヌクレオチド鎖が、標的ポリヌクレオチド集団の２以上の個体メンバー間で異なる多型領域を含み、
前記準備することが、プライマーオリゴヌクレオチドの複数の形態を準備することを含み、プライマーオリゴヌクレオチドの異なる形態は、
多型領域の異なる形態または
多型領域の１または複数の型に隣接または実質的に隣接する標的ポリヌクレオチド鎖の一部分と塩基対相補性を共有し、
プライマーオリゴヌクレオチドと前記接触させることが、標的ポリヌクレオチド集団の１または複数のメンバーを含んでいる可能性がある試料をプライマーオリゴヌクレオチドの前記複数の形態とハイブリダイゼーションに適した条件下で接触させることを含み、
プライマーオリゴヌクレオチドの複数の形態がそれぞれ、第１プライマー成分と第２プライマー成分の間に位置し、標的ポリヌクレオチド鎖中のヌクレオチドの前記中間配列と塩基対相補性を共有しないヌクレオチドの配列からなる前記第３プライマー成分を含む、請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
前記検出することが、第１センサーアーム成分、第２センサーアーム成分および第３センサーアーム成分を含むＭＮＡザイムを用いることを含み、
第１センサーアーム成分は単位複製配列の内部成分と、また所望により単位複製配列の第１末端成分と、相補的塩基対合によりハイブリダイズでき、
第２センサーアーム成分は単位複製配列の第２末端成分と相補的塩基対合によりハイブリダイズでき、
第３センサーアーム成分は第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分の間に位置し、第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分が単位複製配列とハイブリダイズするときに前記多型領域または前記多型領域に相補的なヌクレオチドの配列と相補的塩基対合によりハイブリダイズできない、請求項１６に記載の方法。
多型領域を含む単位複製配列の複数の形態が、試料をポリメラーゼ酵素と前記接触させることにより生成され、単位複製配列の前記各複数の形態の多型領域が異なり、
センサーアームが、第１センサーアーム成分、第２センサーアーム成分および多型領域を含むかそれからなる単位複製配列中のヌクレオチドの配列に非相補的な第３センサーアーム成分を含み、
第１センサーアーム成分は、多型領域の上流の単位複製配列の前記形態のいずれかと相補的塩基対合によりハイブリダイズでき、
第２センサーアーム成分は、多型領域の下流の単位複製配列の前記形態のいずれかと相補的塩基対合によりハイブリダイズでき、
第３センサーアーム成分は第１センサーアーム成分と第２センサーアーム成分の間に位置し、単位複製配列の前記形態のいずれかの前記多型領域と相補的塩基対合によりハイブリダイズできない、請求項１７に記載の方法。
第２ポリヌクレオチドに相補的塩基対合によりハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、単離された２本鎖核酸デュプレックスであって、
オリゴヌクレオチドの第１成分がオリゴヌクレオチドの５’末端で終止し、第２ポリヌクレオチドの第１部分と相補的塩基対合によりハイブリダイズし、
オリゴヌクレオチドの第２成分がオリゴヌクレオチドの３’末端で終止し、第２ポリヌクレオチドの第２部分と相補的塩基対合によりハイブリダイズし、
オリゴヌクレオチドの第３成分が前記第１と第２成分の間に位置し、第２ポリヌクレオチドのヌクレオチドの反対の配列と塩基対相補性を共有しない少なくとも４つのヌクレオチドの配列を含み、
第２ポリヌクレオチドが、第２ポリヌクレオチドが前記第１成分と第２成分にハイブリダイズした部分の間に位置する１または複数のハイブリダイズしないヌクレオチドを含み、
オリゴヌクレオチドの第３成分がオリゴヌクレオチドの３’ハーフに部分的または完全に位置する、前記単離された２本鎖核酸デュプレックス。
前記第３成分中のヌクレオチドの数が、前記第１と第２の成分とハイブリダイズした第２ポリヌクレオチドの部分の間に位置する第２ポリヌクレオチド中のハイブリダイズしないヌクレオチドの数と等しいか、またはその数より多い、請求項１９に記載の２本鎖核酸デュプレックス。