JP2012523821A5

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Publication number: JP2012523821A5
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本明細書に組み入れられ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、本開示のいくつかの例示的な態様を明示し、記述と共に一定の教示を説明するために役立つ。
[本発明1001]
以下の段階を含む、標的配列の少なくとも第二の対立遺伝子変種を含むことが疑われる核酸試料において該標的配列の第一の対立遺伝子変種を検出する方法：
（a）（i）該核酸試料と、
（ii）第一の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が該標的配列の該第一の対立遺伝子変種と相補的である、該第一の対立遺伝子特異的プライマーと、
（iii）該第二の対立遺伝子変種を含む該標的配列の領域と相補的である、第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、該領域が、該第一の対立遺伝子特異的プライマーの該対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の結合位置に対応する位置を包含し、かつ該第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブが副溝バインダー（minor groove binder）を含む、第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブと、
（iv）該標的配列の領域と相補的である第一の座特異的プライマーであって、該領域が、該第一の対立遺伝子変種から3'側であり、かつ反対鎖上に存在する、第一の座特異的プライマーと、
（v）第一の検出プローブと
を混合することによって、第一の反応混合物を形成する段階；
（b）第一のアンプリコンを形成するために、該第一の座特異的プライマーと該第一の対立遺伝子特異的プライマーとを用いて該第一の反応混合物に対して増幅反応を行う段階；ならびに
（c）該第一の検出プローブの検出可能な特性の変化を検出することによって該第一のアンプリコンを検出し、それによって該核酸試料中の標的遺伝子の該第一の対立遺伝子変種を検出する段階。
[本発明1002]
前記第一の検出プローブの検出可能な特性の変化を用いて、前記第一の対立遺伝子変種を定量する段階をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
以下の段階をさらに含む、本発明1001の方法：
（d）（i）前記核酸試料と、
（ii）第二の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が前記標的配列の前記第二の対立遺伝子変種と相補的である、該第二の対立遺伝子特異的プライマーと、
（iii）前記第一の対立遺伝子変種を含む該標的配列の領域と相補的である、第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、該領域が、第二の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の結合位置に対応する位置を包含し、かつ該第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブが副溝バインダーを含む、第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブと、
（iv）該標的配列の領域と相補的である第二の座特異的プライマーであって、該領域が、第二の対立遺伝子変種から3'側であり、かつ反対鎖上に存在する、第二の座特異的プライマーと、
（v）第二の検出プローブと
を混合することによって、第二の反応混合物を形成する段階；
（e）第二のアンプリコンを形成するために、該第二の対立遺伝子特異的プライマーと該座特異的プライマーとを用いて該第二の反応混合物に対して増幅反応を行う段階；ならびに
（f）該検出プローブの検出可能な特性の変化を検出することによって該第二のアンプリコンを検出し、それによって該核酸試料中の標的遺伝子の該第二の対立遺伝子変種を検出する段階。
[本発明1004]
前記第一の反応混合物における前記第一の検出プローブの検出可能な特性の変化を、前記第二の反応混合物における前記第二の検出プローブの検出可能な特性の変化と比較する段階をさらに含む、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記第一の対立遺伝子特異的プライマー、前記第二の対立遺伝子特異的プライマー、もしくは該第一の対立遺伝子特異的プライマーおよび該第二の対立遺伝子特異的プライマー、ならびに／または前記第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ、前記第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ、もしくは該第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブおよび該第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブが、少なくとも1つの修飾塩基を含む、本発明1001または1003の方法。
[本発明1006]
前記修飾塩基が8-アザ-7-デアザ-dN（ppN）塩基類似体であり、Nがアデニン（A）、シトシン（C）、グアニン（G）、またはチミン（T）である、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記修飾塩基がロックド核酸（LNA）塩基である、本発明1005の方法。
[本発明1008]
前記修飾塩基がfdU塩基またはイソdC塩基である、本発明1005の方法。
[本発明1009]
前記修飾塩基が、マッチ（matched）標的配列またはマッチヌクレオチドとミスマッチ（mismatched）標的配列またはミスマッチヌクレオチドとの間のTmを増加させる任意の修飾塩基である、本発明1005の方法。
[本発明1010]
前記修飾塩基が前記対立遺伝子特異的プライマー内および／または前記対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の（a）3'端に、（b）5'端に、（c）内部位置に、または（a）、（b）もしくは（c）の任意の組み合わせに位置する、本発明1005の方法。
[本発明1011]
前記第一の対立遺伝子特異的プライマー、前記第二の対立遺伝子特異的プライマー、もしくは該第一の対立遺伝子特異的プライマーおよび該第二の対立遺伝子特異的プライマーに、ならびに／または前記第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ、前記第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ、もしくは該第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブおよび該第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブに前記修飾塩基を含めることによって、それが存在しない場合と比較して、前記検出する段階の特異性が改善される、本発明1005の方法。
[本発明1012]
前記改善が少なくとも2倍である、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記検出する段階の特異性が、ASB-PCR法を用いて核酸試料中の対立遺伝子変種を検出する特異性と比較して少なくとも2倍改善される、本発明1001または1003の方法。
[本発明1014]
前記増幅反応を行う段階が、2段階サイクリングプロトコールを含む、本発明1001または1003の方法。
[本発明1015]
前記2段階サイクリングプロトコールの第一の段階のサイクル数が、第二の段階で用いられるサイクル数より少ないサイクルを含む、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記第一の段階のサイクル数が前記第二の段階のサイクル数より約90％少ないサイクルである、本発明1014の方法。
[本発明1017]
前記第一の段階のサイクル数が3〜7サイクルであり、かつ前記第二の段階のサイクル数が42〜48サイクルである、本発明1014の方法。
[本発明1018]
前記2段階サイクリングプロトコールの第一のサイクリング段階中に用いられるアニーリング／伸長温度が、第二の段階中に用いられるアニーリング／伸長温度より1〜3℃低い、本発明1014の方法。
[本発明1019]
前記2段階サイクリングプロトコールの前記第一のサイクリング段階中に用いられる前記アニーリング／伸長温度が56〜59℃であり、かつ前記第二の段階中に用いられる前記アニーリング／伸長温度が60〜62℃である、本発明1014の方法。
[本発明1020]
前記段階（a）の前にプレ増幅段階が行われる、本発明1001の方法。
[本発明1021]
前記プレ増幅段階が、対立遺伝子特異的プライマーと座特異的プライマーとの少なくとも2つの完全なセットを用いるマルチプレックス増幅反応を含み、各セットが関心対象の特異的ポリヌクレオチドを増幅するのに適しているかまたは有効である、本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記マルチプレックス増幅反応の産物が、二次シングルプレックス増幅反応に分割され、各々のシングルプレックス増幅反応が、該マルチプレックス反応において既に用いられた少なくとも1つのプライマーセットを含有する、本発明1021の方法。
[本発明1023]
前記マルチプレックス増幅反応が、複数の対立遺伝子特異的ブロッカープローブをさらに含む、本発明1021の方法。
[本発明1024]
前記マルチプレックス増幅反応が、増幅の線形期内に該反応を保つのに適したサイクル数行われる、本発明1021の方法。
[本発明1025]
（a）核酸分子；
（b）対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が標的配列の第一の対立遺伝子変種と相補的である、該対立遺伝子特異的プライマー；
（c）第二の対立遺伝子変種を含む該標的配列の領域と相補的である、対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、該領域が、該対立遺伝子特異的プライマーの該対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の結合位置に対応する位置を包含し、かつ該対立遺伝子特異的ブロッカープローブが副溝バインダーを含む、対立遺伝子特異的ブロッカープローブ；
（d）該標的配列の領域と相補的である座特異的プライマーであって、該領域が、該第一の対立遺伝子変種から3'側であり、かつ反対鎖上に存在する、座特異的プライマー；および
（e）検出プローブ
を含む、反応混合物。
[本発明1026]
前記対立遺伝子特異的プライマーおよび／または前記対立遺伝子特異的ブロッカープローブが少なくとも1つの修飾塩基を含む、本発明1025の反応混合物。
[本発明1027]
前記修飾塩基が、8-アザ-7-デアザ-dN（ppN）塩基類似体であり、Nがアデニン（A）、シトシン（C）、グアニン（G）、またはチミン（T）である、本発明1026の反応混合物。
[本発明1028]
前記修飾塩基がロックド核酸（LNA）塩基である、本発明1026の反応混合物。
[本発明1029]
前記修飾塩基がfdU塩基またはイソdC塩基である、本発明1026の反応混合物。
[本発明1030]
前記修飾塩基が、マッチ標的配列またはマッチヌクレオチドとミスマッチ標的配列またはミスマッチヌクレオチドとの間のTmを増加させる任意の修飾塩基である、本発明1026の反応混合物。
[本発明1031]
前記修飾塩基が、前記対立遺伝子特異的プライマー内および／または前記対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の（a）3'端に、（b）5'端に、（c）内部位置に、または（a）、（b）もしくは（c）の任意の組み合わせに位置する、本発明1026の反応混合物。
[本発明1032]
（a）第一の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が標的配列の第一の対立遺伝子変種と相補的である、該第一の対立遺伝子特異的プライマー；
（b）第二の対立遺伝子変種を含む該標的配列の領域と相補的である、第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、該領域が、該第一の対立遺伝子特異的プライマーの該対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の結合位置に対応する位置を包含し、かつ該第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブが副溝バインダーを含む、第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ
を含む、組成物。
[本発明1033]
座特異的プライマーをさらに含む、組成物であって、
該座特異的プライマーが、前記標的配列の領域と相補的であり、該領域が、前記第一の対立遺伝子変種から3'側であり、かつ反対鎖上に存在する、本発明1032の組成物。
[本発明1034]
前記第一の対立遺伝子特異的プライマーおよび／または前記第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブが少なくとも1つの修飾塩基を含む、本発明1032または1033の組成物。
[本発明1035]
前記修飾塩基が8-アザ-7-デアザ-dN（ppN）塩基類似体であり、Nがアデニン（A）、シトシン（C）、グアニン（G）、またはチミン（T）である、本発明1034の組成物。
[本発明1036]
前記修飾塩基がロックド核酸（LNA）塩基である、本発明1034の組成物。
[本発明1037]
前記修飾塩基がfdU塩基またはイソdC塩基である、本発明1034の組成物。
[本発明1038]
前記修飾塩基が、マッチ標的配列またはマッチヌクレオチドとミスマッチ標的配列またはミスマッチヌクレオチドとの間のTmを増加させる任意の修飾塩基である、本発明1034の組成物。
[本発明1039]
前記修飾塩基が、前記対立遺伝子特異的プライマー内および／または前記対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の（a）3'端に、（b）5'端に、（c）内部位置に、または（a）、（b）もしくは（c）の任意の組み合わせに位置する、本発明1034の組成物。
[本発明1040]
2つまたはそれ以上の容器のうちの1つに独立して分配された以下の構成要素を含む該2つまたはそれ以上の容器を含む、キット：
（a）第一の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が標的配列の第一の対立遺伝子変種と相補的である、該第一の対立遺伝子特異的プライマー；および
（b）第二の対立遺伝子変種を含む該標的配列の領域と相補的である、第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、該領域が、該第一の対立遺伝子特異的プライマーの該対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の結合位置に対応する位置を包含し、かつ該第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブが副溝バインダーを含む、第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ。
[本発明1041]
座特異的プライマーをさらに含む、キットであって、
該座特異的プライマーが、前記標的配列の領域と相補的であり、該領域が、前記第一の対立遺伝子変種から3'側であり、かつ反対鎖上に存在する、本発明1040のキット。
[本発明1042]
前記第一の対立遺伝子特異的プライマーおよび／または前記第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブが少なくとも1つの修飾塩基を含む、本発明1041のキット。
[本発明1043]
前記修飾塩基が8-アザ-7-デアザ-dN（ppN）塩基類似体であり、Nがアデニン（A）、シトシン（C）、グアニン（G）、またはチミン（T）である、本発明1042のキット。
[本発明1044]
前記修飾塩基がロックド核酸（LNA）塩基である、本発明1042のキット。
[本発明1045]
前記修飾塩基が、マッチ標的配列および／またはマッチヌクレオチドとミスマッチ標的配列および／またはミスマッチヌクレオチドとの間のTmを増加させる任意の修飾塩基である、本発明1042のキット。
[本発明1046]
前記対立遺伝子特異的ブロッカープローブが、該対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の3'端に、5'端に、および／または内部位置にMGB部分を含む、本発明1042のキット。
[本発明1047]
以下の段階を含む、核酸試料において標的配列中の第一の対立遺伝子変種を検出する方法：
（a）（i）核酸試料と、
（ii）対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が該標的配列の該第一の対立遺伝子変種と相補的である、該対立遺伝子特異的プライマーと、
（iii）第二の対立遺伝子変種を含む該標的配列の領域と相補的である、対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、該領域が、該対立遺伝子特異的プライマーの該対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の結合位置に対応する位置を包含し、かつ該対立遺伝子特異的ブロッカープローブがブロッキング部分を含む、対立遺伝子特異的ブロッカープローブと、
（iv）該標的配列の領域と相補的である座特異的プライマーであって、該領域が、該第一の対立遺伝子変種から3'側であり、かつ反対鎖上に存在する、座特異的プライマーと、
（v）検出プローブと
を含む反応混合物を形成する段階；
（b）2段階サイクリングプロトコールを用いて該標的配列をPCR増幅する段階であって、該2段階サイクリングプロトコールが、
（i）第一のアニーリング／伸長温度で行われる、第一のサイクル数を含む第一の増幅段階と、
（ii）第二のアニーリング／伸長温度で行われる、第二のサイクル数を含む第二の増幅段階と
を含み、該第一のサイクル数が該第二のサイクル数より少なく、かつ該第一のアニーリング／伸長温度が該第二のアニーリング／伸長温度より低い、段階；
（c）段階（b）によって産生された該標的配列の増幅産物における検出プローブの検出可能な特性の変化を検出し、それによって該核酸試料中の標的遺伝子の該第一の対立遺伝子変種を検出する段階。
[本発明1048]
前記第一の段階のサイクル数が前記第二の段階のサイクル数より約90％少ないサイクルである、本発明1047の方法。
[本発明1049]
前記第一の段階のサイクル数が3〜7サイクルであり、かつ前記第二の段階のサイクル数が42〜48サイクルである、本発明1014の方法。
[本発明1050]
前記2段階サイクリングプロトコールの前記第一の段階中に用いられる前記アニーリング／伸長温度が、前記第二の段階中に用いられる前記アニーリング／伸長温度より1〜3℃低い、本発明1014の方法。
[本発明1051]
前記2段階サイクリングプロトコールの前記第一の段階中に用いられる前記アニーリング／伸長温度が56〜59℃であり、かつ前記第二の段階中に用いられる前記アニーリング／伸長温度が60〜62℃である、本発明1014の方法。
[本発明1052]
以下の段階を含む、核酸試料において標的配列中の対立遺伝子変種を検出する方法：
a）（i）核酸試料、および
（ii）（a）第一の対立遺伝子特異的プライマーおよび第二の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、標的配列内の所定のSNPの第一の対立遺伝子および第二の対立遺伝子とそれぞれ相補的である、該第一および該第二の対立遺伝子特異的プライマーと、
（b）該標的配列の領域と相補的である座特異的プライマーであって、該領域が、該第一および該第二の対立遺伝子から3'側であり、かつ反対鎖上に存在する、座特異的プライマーと
を各セットが含み、異なる標的配列に対して各々が特異的である、少なくとも2つのプライマーセット
を含む第一の反応混合物を、単一の容器において形成する段階；
b）線形期内に反応を保つのに適したサイクル数を用いて該異なる標的配列を増幅する段階；
c）段階b）の増幅産物を少なくとも2つの別個の容器に分割する段階；
d）段階c）の分割した産物の各々に、
（i）段階a）で用いられた少なくとも1つのプライマーセットと、
（ii）第二の対立遺伝子変種を含む該標的配列の領域と相補的である、対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、該領域が、該第一の対立遺伝子特異的プライマーの該対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の結合位置に対応する位置を包含し、かつ第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブが副溝バインダーを含む、対立遺伝子特異的ブロッカープローブと、
（iv）検出プローブと
を添加して、該少なくとも2つの別個の容器において第二および第三の反応混合物を形成する段階；
e）該第二および第三の反応混合物において該標的配列を増幅する段階；ならびに
f）段階e）によって産生された該標的配列の増幅産物の各々における該検出プローブの検出可能な特性の変化を検出し、それによって該核酸試料中の標的遺伝子の該対立遺伝子変種を検出する段階。
[本発明1053]
前記第一の反応混合物がマルチプレックス反応であり、かつ前記第二および第三の反応混合物がシングルプレックス反応である、本発明1052の方法。

Claims

以下の段階を含む、標的配列の少なくとも第二の対立遺伝子変種を含むことが疑われる核酸試料において該標的配列の第一の対立遺伝子変種を検出する方法：
（a）（i）該核酸試料と、
（ii）第一の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が該標的配列の該第一の対立遺伝子変種と相補的である、該第一の対立遺伝子特異的プライマーと、
（iii）該第二の対立遺伝子変種を含む該標的配列の領域と相補的である、第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、該領域が、該第一の対立遺伝子特異的プライマーの該対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の結合位置に対応する位置を包含し、かつ該第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブが副溝バインダー（minor groove binder）を含む、第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブと、
（iv）該標的配列の領域と相補的である第一の座特異的プライマーであって、該領域が、該第一の対立遺伝子変種から3'側であり、かつ反対鎖上に存在する、第一の座特異的プライマーと、
（v）第一の検出プローブと
を混合することによって、第一の反応混合物を形成する段階；
（b）第一のアンプリコンを形成するために、該第一の座特異的プライマーと該第一の対立遺伝子特異的プライマーとを用いて該第一の反応混合物に対して増幅反応を行う段階であって、2段階サイクリングプロトコールを含む、段階；ならびに
（c）該第一の検出プローブの検出可能な特性の変化を検出することによって該第一のアンプリコンを検出し、それによって該核酸試料中の標的遺伝子の該第一の対立遺伝子変種を検出する段階。
前記第一の検出プローブの検出可能な特性の変化を用いて、前記第一の対立遺伝子変種を定量する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
以下の段階をさらに含む、請求項1記載の方法：
（d）（i）前記核酸試料と、
（ii）第二の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が前記標的配列の前記第二の対立遺伝子変種と相補的である、該第二の対立遺伝子特異的プライマーと、
（iii）前記第一の対立遺伝子変種を含む該標的配列の領域と相補的である、第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、該領域が、第二の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の結合位置に対応する位置を包含し、かつ該第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブが副溝バインダーを含む、第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブと、
（iv）該標的配列の領域と相補的である第二の座特異的プライマーであって、該領域が、第二の対立遺伝子変種から3'側であり、かつ反対鎖上に存在する、第二の座特異的プライマーと、
（v）第二の検出プローブと
を混合することによって、第二の反応混合物を形成する段階；
（e）第二のアンプリコンを形成するために、該第二の対立遺伝子特異的プライマーと該座特異的プライマーとを用いて該第二の反応混合物に対して増幅反応を行う段階；ならびに
（f）該検出プローブの検出可能な特性の変化を検出することによって該第二のアンプリコンを検出し、それによって該核酸試料中の標的遺伝子の該第二の対立遺伝子変種を検出する段階。
前記第一の反応混合物における前記第一の検出プローブの検出可能な特性の変化を、前記第二の反応混合物における前記第二の検出プローブの検出可能な特性の変化と比較する段階をさらに含む、請求項3記載の方法。
前記第一の対立遺伝子特異的プライマー、前記第二の対立遺伝子特異的プライマー、もしくは該第一の対立遺伝子特異的プライマーおよび該第二の対立遺伝子特異的プライマー、ならびに／または前記第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ、前記第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ、もしくは該第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブおよび該第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブが、少なくとも1つの修飾塩基を含む、請求項1または3記載の方法。
前記修飾塩基が8-アザ-7-デアザ-dN（ppN）塩基類似体であり、Nがアデニン（A）、シトシン（C）、グアニン（G）、またはチミン（T）である、請求項5記載の方法。
前記修飾塩基がロックド核酸（LNA）塩基である、請求項5記載の方法。
前記修飾塩基がfdU塩基またはイソdC塩基である、請求項5記載の方法。
前記修飾塩基が、マッチ（matched）標的配列またはマッチヌクレオチドとミスマッチ（mismatched）標的配列またはミスマッチヌクレオチドとの間のTmを増加させる任意の修飾塩基である、請求項5記載の方法。
前記修飾塩基が前記対立遺伝子特異的プライマー内および／または前記対立遺伝子特異的ブロッカープローブ内の（a）3'端に、（b）5'端に、（c）内部位置に、または（a）、（b）もしくは（c）の任意の組み合わせに位置する、請求項5記載の方法。
前記第一の対立遺伝子特異的プライマー、前記第二の対立遺伝子特異的プライマー、もしくは該第一の対立遺伝子特異的プライマーおよび該第二の対立遺伝子特異的プライマーに、ならびに／または前記第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ、前記第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブ、もしくは該第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブおよび該第二の対立遺伝子特異的ブロッカープローブに前記修飾塩基を含めることによって、それが存在しない場合と比較して、前記検出する段階の特異性が改善される、請求項5記載の方法。
前記改善が少なくとも2倍である、請求項11記載の方法。
前記検出する段階の特異性が、ASB-PCR法を用いて核酸試料中の対立遺伝子変種を検出する特異性と比較して少なくとも2倍改善される、請求項1または3記載の方法。
前記2段階サイクリングプロトコールの第一の段階のサイクル数が、第二の段階で用いられるサイクル数より少ないサイクルを含む、請求項1記載の方法。
前記第一の段階のサイクル数が前記第二の段階のサイクル数より約90％少ないサイクルである、請求項14記載の方法。
前記第一の段階のサイクル数が3〜7サイクルであり、かつ前記第二の段階のサイクル数が42〜48サイクルである、請求項14記載の方法。
前記2段階サイクリングプロトコールの第一のサイクリング段階中に用いられるアニーリング／伸長温度が、第二の段階中に用いられるアニーリング／伸長温度より1〜3℃低い、請求項1記載の方法。
前記2段階サイクリングプロトコールの前記第一のサイクリング段階中に用いられる前記アニーリング／伸長温度が56〜59℃であり、かつ前記第二の段階中に用いられる前記アニーリング／伸長温度が60〜62℃である、請求項17記載の方法。
前記段階（a）の前にプレ増幅段階が行われる、請求項1記載の方法。
前記プレ増幅段階が、対立遺伝子特異的プライマーと座特異的プライマーとの少なくとも2つの完全なセットを用いるマルチプレックス増幅反応を含み、各セットが関心対象の特異的ポリヌクレオチドを増幅するのに適しているかまたは有効である、請求項19記載の方法。
前記マルチプレックス増幅反応の産物が、二次シングルプレックス増幅反応に分割され、各々のシングルプレックス増幅反応が、該マルチプレックス反応において既に用いられた少なくとも1つのプライマーセットを含有する、請求項20記載の方法。
前記マルチプレックス増幅反応が、複数の対立遺伝子特異的ブロッカープローブをさらに含む、請求項20記載の方法。
前記マルチプレックス増幅反応が、増幅の線形期内に該反応を保つのに適したサイクル数行われる、請求項20記載の方法。
以下の段階を含む、核酸試料において標的配列中の第一の対立遺伝子変種を検出する方法：
（a）（i）核酸試料と、
（ii）対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が該標的配列の該第一の対立遺伝子変種と相補的である、該対立遺伝子特異的プライマーと、
（iii）第二の対立遺伝子変種を含む該標的配列の領域と相補的である、対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、該領域が、該対立遺伝子特異的プライマーの該対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の結合位置に対応する位置を包含し、かつ該対立遺伝子特異的ブロッカープローブがブロッキング部分を含む、対立遺伝子特異的ブロッカープローブと、
（iv）該標的配列の領域と相補的である座特異的プライマーであって、該領域が、該第一の対立遺伝子変種から3'側であり、かつ反対鎖上に存在する、座特異的プライマーと、
（v）検出プローブと
を含む反応混合物を形成する段階；
（b）2段階サイクリングプロトコールを用いて該標的配列をPCR増幅する段階であって、該2段階サイクリングプロトコールが、
（i）第一のアニーリング／伸長温度で行われる、第一のサイクル数を含む第一の増幅段階と、
（ii）第二のアニーリング／伸長温度で行われる、第二のサイクル数を含む第二の増幅段階と
を含み、該第一のサイクル数が該第二のサイクル数より少なく、かつ該第一のアニーリング／伸長温度が該第二のアニーリング／伸長温度より低い、段階；
（c）段階（b）によって産生された該標的配列の増幅産物における検出プローブの検出可能な特性の変化を検出し、それによって該核酸試料中の標的遺伝子の該第一の対立遺伝子変種を検出する段階。
前記第一の段階のサイクル数が前記第二の段階のサイクル数より約90％少ないサイクルである、請求項24記載の方法。
前記第一の段階のサイクル数が3〜7サイクルであり、かつ前記第二の段階のサイクル数が42〜48サイクルである、請求項24記載の方法。
前記2段階サイクリングプロトコールの前記第一の段階中に用いられる前記アニーリング／伸長温度が、前記第二の段階中に用いられる前記アニーリング／伸長温度より1〜3℃低い、請求項24記載の方法。
前記2段階サイクリングプロトコールの前記第一の段階中に用いられる前記アニーリング／伸長温度が56〜59℃であり、かつ前記第二の段階中に用いられる前記アニーリング／伸長温度が60〜62℃である、請求項24記載の方法。
以下の段階を含む、核酸試料において標的配列中の対立遺伝子変種を検出する方法：
a）（i）核酸試料、および
（ii）（a）第一の対立遺伝子特異的プライマーおよび第二の対立遺伝子特異的プライマーの対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分が、標的配列内の所定のSNPの第一の対立遺伝子および第二の対立遺伝子とそれぞれ相補的である、該第一および該第二の対立遺伝子特異的プライマーと、
（b）該標的配列の領域と相補的である座特異的プライマーであって、該領域が、該第一および該第二の対立遺伝子から3'側であり、かつ反対鎖上に存在する、座特異的プライマーと
を各セットが含み、異なる標的配列に対して各々が特異的である、少なくとも2つのプライマーセット
を含む第一の反応混合物を、単一の容器において形成する段階；
b）線形期内に反応を保つのに適したサイクル数を用いて該異なる標的配列を増幅する段階；
c）段階b）の増幅産物を少なくとも2つの別個の容器に分割する段階；
d）段階c）の分割した産物の各々に、
（i）段階a）で用いられた少なくとも1つのプライマーセットと、
（ii）第二の対立遺伝子変種を含む該標的配列の領域と相補的である、対立遺伝子特異的ブロッカープローブであって、該領域が、該第一の対立遺伝子特異的プライマーの該対立遺伝子特異的ヌクレオチド部分の結合位置に対応する位置を包含し、かつ第一の対立遺伝子特異的ブロッカープローブが副溝バインダーを含む、対立遺伝子特異的ブロッカープローブと、
（iv）検出プローブと
を添加して、該少なくとも2つの別個の容器において第二および第三の反応混合物を形成する段階；
e）該第二および第三の反応混合物において該標的配列を増幅する段階；ならびに
f）段階e）によって産生された該標的配列の増幅産物の各々における該検出プローブの検出可能な特性の変化を検出し、それによって該核酸試料中の標的遺伝子の該対立遺伝子変種を検出する段階。
前記第一の反応混合物がマルチプレックス反応であり、かつ前記第二および第三の反応混合物がシングルプレックス反応である、請求項29記載の方法。