JP2013509871A5

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Publication number: JP2013509871A5
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Filing date: 2009-11-28
Publication date: 2015-06-25
Anticipated expiration: 2029-11-28

Description

本発明の一様態によると、
（ａ）ターゲット核酸配列とＴＨＤプライマーをハイブリッド形成させる工程であって、前記ＴＨＤプライマーは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）一つの標識または複数の標識を含む相互作用的標識システムを含む工程と、
（ｂ）鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより前記ＴＨＤプライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応が発生する条件下で、前記工程（ａ）の結果物を５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって、前記ＴＨＤプライマーは、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記ポリメラーゼ活性により伸長されて、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断され、前記ＴＨＤプライマーから前記標識または前記相互作用的標識システムの少なくとも一つの標識が放出されて、これにより前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される工程と、
（ｃ）前記シグナルを検出する工程であって、前記シグナルは、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、
を含み、ターゲットハイブリダイゼーション及び検出プライマー（ＴＨＤｐｒｉｍｅｒ）の５’−切断反応及び３’−伸長反応を利用してＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供する。

ＴＨＤプライマーは、（ｉ）ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）一つの標識または複数の標識を含む相互作用的標識システムを含む。本明細書で使用される用語‘相補的’は、所定のアニーリング条件または厳格条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下でプライマーまたはプローブがターゲット核酸配列に選択的にハイブリッド形成するほど十分相補的なことを意味し、用語‘実質的に相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）’及び‘完全に相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）’を包括する意味を有して、好ましくは、完全に相補的なことを意味する。

本明細書で使用される表現‘相互作用的標識システムの少なくとも１種の標識の放出’は、相互作用的標識システムを構成する複数の標識のうち、少なくとも１種の標識自体の放出または少なくとも１種の標識を含むヌクレオチド切片の放出を意味する。

第一のプロトコールは、下記の工程を含む：
（ａ）ターゲット核酸配列とＴＨＤプライマーをハイブリッド形成させる工程であって、前記ＴＨＤプライマーは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）一つの標識または複数の標識を含む相互作用的標識システムを含む工程と、
（ｂ）鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより前記ＴＨＤプライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応が発生する条件下で、前記工程（ａ）の結果物を５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって、前記ＴＨＤプライマーは、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記ポリメラーゼ活性により伸長されて、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断され、前記ＴＨＤプライマーから前記標識または前記相互作用的標識システムの少なくとも一つの標識が放出されて、これにより前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される工程と、
（ｃ）前記シグナルを検出する工程であって、前記シグナルは、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程。

好ましくは、第一のプロトコールは、下記のような工程を含む：
（ａ）ターゲット核酸配列とＴＨＤプライマーをハイブリッド形成させる工程であって、前記ＴＨＤプライマーは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）一つの標識または複数の標識を含む相互作用的標識システムを含む工程と、
（ｂ）鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより前記ＴＨＤプライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応が発生する条件下で、前記工程（ａ）の結果物を５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって、前記ＴＨＤプライマーは、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記ポリメラーゼ活性により伸長されて、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断され、前記ＴＨＤプライマーから前記標識または前記相互作用的標識システムの少なくとも一つの標識が放出されて、これにより前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される工程と、
（ｂ’）工程（ｂ）の前記結果物を変性させる工程と、
（ｂ”）前記工程（ａ）−（ｂ’）を少なくとも２回反復する工程であって、前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルの両方を増幅させる工程と、
（ｃ）前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルを検出する工程であって、前記検出は、工程（ｂ”）の前記反復の各サイクルにおいて、工程（ｂ”）の前記反復の終了時点で、または工程（ｂ”）の前記反復の間の指定時間間隔のそれぞれで行われて、このようなシグナルは、ターゲット核酸配列の存在を示す工程。

少なくとも二つのＴＨＤプライマーが利用される場合、それらは、分析目的によって多様な組み合わせで標識を含むように製作できる。例えば、ＴＨＤプライマーの複数が全て同一な標識、全て相異なる標識または部分的に相異なる標識と連結され得る。また、少なくとも二つの部分的にまたは全体的に相異なるかまたは同一な標識が一つのＴＨＤプライマーに連結されることもできる。

第二のプロトコールは、下記の工程を含む：
（ａ）ターゲット核酸配列、ＴＨＤプライマー及び標識プローブをハイブリッド形成させる工程であって、前記ＴＨＤプライマーは、（ｉ）ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）一つの標識または複数の標識を含む相互作用的標識システムを含む工程と、
（ｂ）鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより前記ＴＨＤプライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応が発生する条件下で、前記工程（ａ）の結果物を５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって、前記ＴＨＤプライマーは、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記ポリメラーゼ活性により伸長されて、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断され、前記ＴＨＤプライマーから前記標識または前記相互作用的標識システムの少なくとも一つの標識が放出されて、これにより前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生し、前記標識プローブは、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断されて、これにより前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される工程と、
（ｃ）前記シグナルを検出する工程であって、前記シグナルは、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程。

具体的に、第二のプロトコールは、下記のような工程を含む：
（ａ）ターゲット核酸配列、ＴＨＤプライマー及び標識プローブをハイブリッド形成させる工程であって、前記ＴＨＤプライマーは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）一つの標識または複数の標識を含む相互作用的標識システムを含み、前記標識プローブは、ＴＨＤプライマーがハイブリッド形成される位置の下流位置にハイブリッド形成されて、ＴＨＤプライマーと同一な方向性を有する工程と、
（ｂ）鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより前記ＴＨＤプライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応が発生する条件下で、前記工程（ａ）の結果物を５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって、前記ＴＨＤプライマーは、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記ポリメラーゼ活性により伸長されて、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断され、前記ＴＨＤプライマーから前記標識または前記相互作用的標識システムの少なくとも一つの標識が放出されて、前記標識プローブは、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断されて前記プローブから前記標識が放出されて、これにより前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される工程と、
（ｂ’）工程（ｂ）の前記結果物を変性させる工程と、
（ｂ”）前記工程（ａ）−（ｂ’）を少なくとも２回反復する工程であって、前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルの両方を増幅させる工程と、
（ｃ）前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルを検出する工程であって、前記検出は、工程（ｂ”）の前記反復の各サイクルにおいて、工程（ｂ”）の前記反復の終了時点で、または工程（ｂ”）の前記反復の間の指定時間間隔のそれぞれで行われて、このようなシグナルは、ターゲット核酸配列の存在を示す工程。

少なくとも二つのＴＨＤプライマー及び少なくとも二つのプローブが利用される場合、それらは、分析目的によって多様な組み合わせで標識を含むように製作できる。例えば、ＴＨＤプライマーの複数及び少なくとも二つのプローブが全て同一な標識、全て相異なる標識または部分的に相異なる標識と連結され得る。また、少なくとも二つの部分的にまたは全体的に相異なるかまたは同一な標識が一つのＴＨＤプライマーまたはひとつのプローブに連結されることもできる。

第三のプロトコールは、下記の工程を含む：
（ａ）ターゲット核酸配列、ＴＨＤプライマー及び上流プライマーまたは下流プライマーをハイブリッド形成させる工程であって、前記ＴＨＤプライマーは、（ｉ）ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）一つの標識または複数の標識を含む相互作用的標識システムを含み、前記上流プライマーは、ＴＨＤプライマーがハイブリッド形成される位置の上流位置にハイブリッド形成されて、ＴＨＤプライマーと同一な方向性を有し、前記下流プライマーは、ＴＨＤプライマーがハイブリッド形成される位置の下流位置にハイブリッド形成されて、ＴＨＤプライマーと同一な方向性を有する工程と、
（ｂ）鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより前記ＴＨＤプライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応が発生する条件下で、前記工程（ａ）の結果物を５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって、前記ＴＨＤプライマーは、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記ポリメラーゼ活性により伸長されて、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断され、前記ＴＨＤプライマーから前記標識または前記相互作用的標識システムの少なくとも一つの標識が放出されて、これにより前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される工程と、
（ｃ）前記シグナルを検出する工程であって、前記シグナルは、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程。

具体的に、第三のプロトコールは、下記のような工程を含む：
（ａ）ターゲット核酸配列、ＴＨＤプライマー及び上流プライマーまたは下流プライマーをハイブリッド形成させる工程であって、前記ＴＨＤプライマーは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）一つの標識または複数の標識を含む相互作用的標識システムを含み、前記上流プライマーは、ＴＨＤプライマーがハイブリッド形成される位置の上流位置にハイブリッド形成されて、ＴＨＤプライマーと同一な方向性を有し、前記下流プライマーは、ＴＨＤプライマーがハイブリッド形成される位置の下流位置にハイブリッド形成されて、ＴＨＤプライマーと同一な方向性を有する工程と、
（ｂ）鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより前記ＴＨＤプライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応が発生する条件下で、前記工程（ａ）の結果物を５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって、前記ＴＨＤプライマーは、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記ポリメラーゼ活性により伸長されて、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断され、前記ＴＨＤプライマーから前記標識または前記相互作用的標識システムの少なくとも一つの標識が放出されて、これにより前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される工程と、
（ｂ’）工程（ｂ）の前記結果物を変性させる工程と、
（ｂ”）前記工程（ａ）−（ｂ’）を少なくとも２回反復する工程であって、前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルの両方を増幅させる工程と、
（ｃ）前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルを検出する工程であって、前記検出は、工程（ｂ”）の前記反復の各サイクルにおいて、工程（ｂ”）の前記反復の終了時点で、または工程（ｂ”）の前記反復の間の指定時間間隔のそれぞれで行われて、このようなシグナルは、ターゲット核酸配列の存在を示す工程。

本発明の好ましい具現例によると、本発明の方法は、下記の工程を含む：
（ａ）ターゲット核酸配列と一対のプライマーをハイブリッド形成させる工程であって、前記一対のプライマーは、正方向プライマー及び逆方向プライマーから構成されて、これらのうち、少なくとも一つのプライマーは、前記ターゲット核酸配列を増幅できる前記ＴＨＤプライマーであって、前記ＴＨＤプライマーは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）一つの標識または複数の標識を含む相互作用的標識システムを含む工程と、
（ｂ）鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより前記二つのプライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応が発生する条件下で、前記工程（ａ）の結果物を５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって、前記二つのプライマーは、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記ポリメラーゼ活性により伸長されて、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断され、前記二つのプライマーのうち、前記ＴＨＤプライマーから前記標識または前記相互作用的標識システムの少なくとも一つの標識が放出されて、これにより前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される工程と、
（ｃ）工程（ｂ）の前記結果物を変性させる工程と、
（ｄ）前記工程（ａ）−（ｃ）を少なくとも２回反復する工程であって、前記ターゲット核酸配列及び前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルの両方を増幅させる工程と、
（ｅ）前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルを検出する工程であって、前記検出は、工程（ｄ）の前記反復の各サイクルにおいて、工程（ｄ）の前記反復の終了時点で、または前記反復の間の指定時間間隔のそれぞれで行われて、このようなシグナルは、ターゲット核酸配列の存在を示す工程。

本発明の好ましい具現例によると、本発明の方法は、下記の工程を含む：
（ａ）前記ターゲット核酸配列と一対のプライマー及び追加的な標識プローブをハイブリッド形成させる工程であって、前記一対のプライマーは、前記ターゲット核酸配列を増幅できる正方向プライマー及び逆方向プライマーから構成されて、これらのうち、少なくとも一つのプライマーは、前記ＴＨＤプライマーであって、前記ＴＨＤプライマーは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）一つの標識または複数の標識を含む相互作用的標識システムを含み、前記標識プローブは、その３’−末端が修飾されて、鋳型依存的核酸ポリメラーゼによる伸長が防止されて、前記二つのプライマー間の一位置にハイブリッド形成される工程と、
（ｂ）鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより前記二つのプライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応が発生する条件下で、前記工程（ａ）の結果物を５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって、前記二つのプライマーは、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記ポリメラーゼ活性により伸長されて、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断され、前記二つのプライマーのうち、前記ＴＨＤプライマーから前記標識または前記相互作用的標識システムの少なくとも一つの標識が放出されて、前記標識プローブは、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断され、前記プローブから標識が放出されて、これにより前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される工程と、
（ｃ）工程（ｂ）の前記結果物を変性させる工程と、
（ｄ）前記工程（ａ）−（ｃ）を少なくとも２回反復する工程であって、前記ターゲット核酸配列及び前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルの両方を増幅させる工程と、
（ｅ）前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルを検出する工程であって、前記検出は、工程（ｄ）の前記反復の各サイクルにおいて、工程（ｄ）の前記反復の終了時点で、または前記反復の間の指定時間間隔のそれぞれで行われて、このようなシグナルは、ターゲット核酸配列の存在を示す工程。

本発明の好ましい具現例によると、本発明の方法は、下記の工程を含む：
（ａ）前記ターゲット核酸配列と一対のプライマー及び上流プライマー（または下流プライマー）をハイブリッド形成させる工程であって、前記一対のプライマーは、正方向プライマー及び逆方向プライマーから構成されて、これらのうち、少なくとも一つのプライマーはＴＨＤプライマーであって、前記ＴＨＤプライマーは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）一つの標識または複数の標識を含む相互作用的標識システムを含み、前記上流プライマーは、ＴＨＤプライマーがハイブリッド形成される位置の上流位置にハイブリッド形成されて、ＴＨＤプライマーと同一な方向性を有し、前記下流プライマーは、ＴＨＤプライマーがハイブリッド形成される位置の下流位置にハイブリッド形成されて、ＴＨＤプライマーと同一な方向性を有する工程と、
（ｂ）鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより前記二つのプライマー及び上流プライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応が発生する条件下で、前記工程（ａ）の結果物を５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって、前記二つのプライマー及び上流プライマー（または下流プライマー）は、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記ポリメラーゼ活性により伸長されて、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断され、前記二つのプライマーのうち、前記ＴＨＤプライマーから前記標識または前記相互作用的標識システムの少なくとも一つの標識が放出されて、これにより前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される工程と、
（ｃ）工程（ｂ）の前記結果物を変性させる工程と、
（ｄ）前記工程（ａ）−（ｃ）を少なくとも２回反復する工程であって、前記ターゲット核酸配列及び前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルの両方を増幅させる工程と、
（ｅ）前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルを検出する工程であって、前記検出は、工程（ｄ）の前記反復の各サイクルにおいて、工程（ｄ）の前記反復の終了時点で、または前記反復の間の指定時間間隔のそれぞれで行われて、このようなシグナルは、ターゲット核酸配列の存在を示す工程。

本発明の他の様態によると、本発明は、
（ａ）（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）一つの標識または複数の標識を含む相互作用的標識システムを含むＴＨＤプライマーと、
（ｂ）５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼ（前記ＴＨＤプライマーが前記ターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合、前記ＴＨＤプライマーは、前記核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性により伸長されて、前記ＴＨＤプライマーは、前記核酸ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断され、前記ＴＨＤプライマーから前記標識または前記相互作用的標識システムの少なくとも一つの標識が放出されて、これにより前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される）と、
を含み、ターゲットハイブリダイゼーション及び検出プライマー（ＴＨＤｐｒｉｍｅｒ）の５’−切断反応及び３’−伸長反応を利用してＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキットを提供する。

Claims

ターゲットハイブリダイゼーション及び検出プライマー（ｔａｒｇｅｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｐｒｉｍｅｒ、ＴＨＤプライマー）の５’−切断反応及び３’−伸長反応を利用してＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法であって、
（ａ）ターゲット核酸配列とＴＨＤプライマーをハイブリッド形成させる工程であって、前記ＴＨＤプライマーは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）一つの標識または供与体分子及び受容体分子を含む複数の標識を含む相互作用的標識システムを含む工程と、
（ｂ）鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより前記ＴＨＤプライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応が発生する条件下で、前記工程（ａ）の結果物を５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって、前記ＴＨＤプライマーは、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記ポリメラーゼ活性により伸長されて、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断され、前記ＴＨＤプライマーから前記一つの標識または前記相互作用的標識システムにおける前記供与体分子及び前記受容体分子の少なくとも一つの標識が放出されて、これにより前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される工程と、
（ｃ）前記シグナルを検出する工程であって、前記シグナルは、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、
を含むことを特徴とする方法。
前記方法は、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを増幅させるために、前記工程（ａ）−（ｂ）または（ａ）−（ｃ）を少なくとも２回反復する工程と、その反復サイクルの間に変性過程とをさらに含む請求項１に記載の方法。
前記ＴＨＤプライマーは、下記一般式Ｉの二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有するか、または下記一般式ＩＩの修飾二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する請求項１に記載の方法。
５’−Ｘ_ｐ−Ｙ_ｑ−Ｚ_ｒ−３’ （Ｉ）
（式中、Ｘ_ｐは、ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第１プライミング部位であり、Ｙ_ｑは、少なくとも三つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ_ｒは、ターゲット配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第２プライミング部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ、Ｙ及びＺは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであり、５’−第１プライミング部位のＴ_ｍは、３’−第２プライミング部位のＴ_ｍより高く、前記分割部位は、前記三つの領域のうち、最も低いＴ_ｍを有して、前記分割部位は、ターゲット核酸配列に対するアニーリングに関して、５’−第１プライミング部位を３’−第２プライミング部位から分割し、これにより、前記オリゴヌクレオチドの前記アニーリング特異性が、５’−第１プライミング部位及び３’−第２プライミング部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＨＤプライマーの全体アニーリング特異性を向上させる。）
５’−Ｘ’_ｐ−Ｙ’_ｑ−Ｚ’_ｒ−３’ （ＩＩ）
（式中、Ｘ’_ｐは、ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第２プライミング部位であり、Ｙ’_ｑは、少なくとも三つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’_ｒは、ターゲット配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第１プライミング部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであり、５’−第２プライミング部位のＴ_ｍは、３’−第１プライミング部位のＴ_ｍより低く、前記分割部位は、前記Ｘ’_ｐ、Ｙ’_ｑ及びＺ’_ｒの三つの領域のうち、最も低いＴ_ｍを有して、前記分割部位は、ターゲット核酸に対するアニーリングに関して、前記５’−第２プライミング部位を前記３’−第１プライミング部位から分割し、これにより、前記オリゴヌクレオチドの前記アニーリング特異性が、前記５’−第２プライミング部位及び前記３’−第１プライミング部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＨＤプライマーの全体アニーリング特異性を向上させる。）
前記ＴＨＤプライマーは、その５’−末端部位に少なくとも一つの標識を含む請求項１に記載の方法。
前記ＴＨＤプライマーは、その５’−末端に少なくとも一つの標識を含む請求項４に記載の方法。
供与体分子が蛍光レポーター分子であり、受容体分子がクエンチャー分子であり、前記相互作用的標識システムは、前記蛍光レポーター分子及び前記クエンチャー分子の一対であり、前記クエンチャー分子は、前記ＴＨＤプライマー上に前記レポーター分子の蛍光をクエンチングするように位置して、二つの標識は、ヌクレアーゼ切断が起こるＴＨＤプライマー内の一位置により分割されており、これにより、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、前記位置における切断反応によって前記クエンチャー分子から前記レポーター分子を分離させて、これは、前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルが発生されるようにする請求項１に記載の方法。
前記蛍光レポーター分子は、前記ＴＨＤプライマーの５’−末端部位に位置して、前記クエンチャー分子は、前記蛍光レポーター分子から下流に位置する請求項６に記載の方法。
前記クエンチャー分子は、前記ＴＨＤプライマーの５’−末端部位に位置して、前記蛍光レポーター分子は、前記クエンチャー分子から下流に位置する請求項６に記載の方法。
前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、前記ＴＨＤプライマーは、少なくとも２種のプライマーを含む請求項１に記載の方法。
前記ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む請求項１に記載の方法。
前記ターゲット核酸配列は、前増幅された核酸配列である請求項１に記載の方法。
ターゲットハイブリダイゼーション及び検出プライマー（ｔａｒｇｅｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｐｒｉｍｅｒ、ＴＨＤプライマー）の５’−切断反応及び３’−伸長反応を利用してＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法であって、
（ａ）ターゲット核酸配列と一対のプライマーをハイブリッド形成させる工程であって、前記一対のプライマーは、前記ターゲット核酸配列を増幅できる正方向プライマー及び逆方向プライマーから構成されて、これらのうち、少なくとも一つのプライマーは、前記ＴＨＤプライマーであって、前記ＴＨＤプライマーは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）一つの標識または供与体分子及び受容体分子を含む複数の標識を含む相互作用的標識システムを含む工程と、
（ｂ）鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより前記二つのプライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応が発生する条件下で、前記工程（ａ）の結果物を５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって、前記二つのプライマーは、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記ポリメラーゼ活性により伸長されて、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断され、前記二つのプライマーのうち、前記ＴＨＤプライマーから前記一つの標識または前記相互作用的標識システムにおける前記供与体分子及び前記受容体分子の少なくとも一つの標識が放出されて、これにより前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される工程と、
（ｃ）工程（ｂ）の前記結果物を変性させる工程と、
（ｄ）前記工程（ａ）−（ｃ）を少なくとも２回反復する工程であって、前記ターゲット核酸配列及び前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルの両方を増幅させる工程と、
（ｅ）前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルを検出する工程であって、前記検出は、工程（ｄ）の前記反復の各サイクルにおいて、工程（ｄ）の前記反復の終了時点で、または前記反復の間の指定時間間隔のそれぞれで行われて、このようなシグナルは、ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、
を含むことを特徴とする方法。
前記ＴＨＤプライマーは、下記一般式Ｉの二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有するか、または下記一般式ＩＩの修飾二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する請求項１２に記載の方法。
５’−Ｘ_ｐ−Ｙ_ｑ−Ｚ_ｒ−３’ （Ｉ）
（式中、Ｘ_ｐは、ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第１プライミング部位であり、Ｙ_ｑは、少なくとも三つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ_ｒは、ターゲット配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第２プライミング部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ、Ｙ及びＺは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであり、５’−第１プライミング部位のＴ_ｍは、３’−第２プライミング部位のＴ_ｍより高く、前記分割部位は、前記三つの領域のうち、最も低いＴ_ｍを有して、前記分割部位は、ターゲット核酸配列に対するアニーリングに関して、５’−第１プライミング部位を３’−第２プライミング部位から分割し、これにより、前記オリゴヌクレオチドの前記アニーリング特異性が、前記５’−第１プライミング部位及び前記３’−第２プライミング部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＨＤプライマーの全体アニーリング特異性を向上させる。）
５’−Ｘ’_ｐ−Ｙ’_ｑ−Ｚ’_ｒ−３’ （ＩＩ）
（式中、Ｘ’_ｐは、ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第２プライミング部位であり、Ｙ’_ｑは、少なくとも三つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’_ｒは、ターゲット配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第１プライミング部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであり、５’−第２プライミング部位のＴ_ｍは、３’−第１プライミング部位のＴ_ｍより低く、前記分割部位は、前記Ｘ’_ｐ、Ｙ’_ｑ及びＺ’_ｒの三つの領域のうち、最も低いＴ_ｍを有して、前記分割部位は、ターゲット核酸に対するアニーリングに関して、前記５’−第２プライミング部位を前記３’−第１プライミング部位から分割し、これにより、前記オリゴヌクレオチドの前記アニーリング特異性が、前記５’−第２プライミング部位及び前記３’−第１プライミング部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＨＤプライマーの全体アニーリング特異性を向上させる。）
前記ＴＨＤプライマーは、その５’−末端部位に少なくとも一つの標識を含む請求項１２に記載の方法。
前記ＴＨＤプライマーは、その５’−末端に少なくとも一つの標識を含む請求項１４に記載の方法。
供与体分子が蛍光レポーター分子であり、受容体分子がクエンチャー分子であり、前記相互作用的標識システムは、前記蛍光レポーター分子及び前記クエンチャー分子の一対であり、前記クエンチャー分子は、前記ＴＨＤプライマー上に前記レポーター分子の蛍光をクエンチングするように位置して、二つの標識は、ヌクレアーゼ切断が起こるＴＨＤプライマー内の一位置により分割されており、これにより、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、前記位置における切断反応によって前記クエンチャー分子から前記レポーター分子を分離させて、これは、前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルが発生されるようにする請求項１２に記載の方法。
前記蛍光レポーター分子は、前記ＴＨＤプライマーの５’−末端部位に位置して、前記クエンチャー分子は、前記蛍光レポーター分子からの下流に位置する請求項１６に記載の方法。
前記クエンチャー分子は、前記ＴＨＤプライマーの５’−末端部位に位置して、前記蛍光レポーター分子は、前記クエンチャー分子からの下流に位置する請求項１６に記載の方法。
前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、前記正方向プライマー及び前記逆方向プライマーである前記二つのプライマーのそれぞれは、少なくとも２種のプライマーを含む請求項１２に記載の方法。
前記ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む請求項１２に記載の方法。
ターゲットハイブリダイゼーション及び検出プライマー（ｔａｒｇｅｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｐｒｉｍｅｒ、ＴＨＤプライマー）の５’−切断反応及び３’−伸長反応を伴うポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用してＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法であって、
（ａ）ターゲット核酸配列、一対のプライマー及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼを含むＰＣＲ混合物を準備する工程であって、前記一対のプライマーは、前記ターゲット核酸配列を増幅できる正方向プライマー及び逆方向プライマーを含み、これらのうち、少なくとも一つのプライマーは、前記ＴＨＤプライマーであって、前記ＴＨＤプライマーは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子の一対を含み、前記クエンチャー分子は、前記ＴＨＤプライマー上に前記レポーター分子の蛍光をクエンチングするように位置して、二つの標識は、ヌクレアーゼ切断が起こるＴＨＤプライマー内の一位置により分割されており、これによって前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性は、前記位置における切断反応により前記クエンチャー分子から前記レポーター分子を分離させて、これは、前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルが発生されるようにする工程と、
（ｂ）前記ＰＣＲ混合物を利用して前記ターゲット核酸配列を増幅させる工程であって、プライマーアニーリング、プライマー伸長及び変性を少なくとも２回行って、前記二つのプライマーは、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性により伸長されて、ターゲット核酸配列を増幅して、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断されて、二つのプライマーのうち、前記ＴＨＤプライマーから前記レポーター分子または前記クエンチャー分子が放出されて、これにより前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される工程と、
（ｃ）前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記蛍光シグナルを検出する工程であって、前記検出は、工程（ｂ）の前記反復の各サイクルにおいて、工程（ｃ）の前記反復の終了時点で、または前記反復の間の指定時間間隔のそれぞれで行われて、このようなシグナルは、ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、
を含むことを特徴とする方法。
ターゲットハイブリダイゼーション及び検出プライマー（ｔａｒｇｅｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｐｒｉｍｅｒ、ＴＨＤプライマー）の５’−切断反応及び３’−伸長反応を利用してＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキットであって、
（ａ）（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）一つの標識または供与体分子及び受容体分子を含む複数の標識を含む相互作用的標識システムを含むＴＨＤプライマーと、
（ｂ）５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼ（前記ＴＨＤプライマーが前記ターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合、前記ＴＨＤプライマーは、前記核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性により伸長されて、前記ＴＨＤプライマーは、前記核酸ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断され、前記ＴＨＤプライマーから前記一つの標識または前記相互作用的標識システムにおける前記供与体分子及び前記受容体分子の少なくとも一つの標識が放出されて、これにより前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される）と、
を含むことを特徴とするキット。
前記キットは、少なくとも一つの追加的なプライマー、標識プローブ、またはこれらの組み合わせを追加的に含む請求項２２に記載のキット。
前記ＴＨＤプライマーは、下記一般式Ｉの二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有するか、または下記一般式ＩＩの修飾二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する請求項２２に記載のキット。
５’−Ｘ_ｐ−Ｙ_ｑ−Ｚ_ｒ−３’ （Ｉ）
（式中、Ｘ_ｐは、ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第１プライミング部位であり、Ｙ_ｑは、少なくとも三つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ_ｒは、ターゲット配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第２プライミング部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ、Ｙ及びＺは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであり、５’−第１プライミング部位のＴ_ｍは、３’−第２プライミング部位のＴ_ｍより高く、前記分割部位は、前記三つの領域のうち、最も低いＴ_ｍを有して、前記分割部位は、ターゲット核酸配列に対するアニーリング側面で、５’−第１プライミング部位が３’−第２プライミング部位から分割されるようにして、これにより、前記オリゴヌクレオチドの前記アニーリング特異性が、５’−第１プライミング部位及び３’−第２プライミング部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＨＤプライマーの全体アニーリング特異性を向上させる。）
５’−Ｘ’_ｐ−Ｙ’_ｑ−Ｚ’_ｒ−３’ （ＩＩ）
（式中、Ｘ’_ｐは、ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第２プライミング部位であり、Ｙ’_ｑは、少なくとも三つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’_ｒは、ターゲット配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第１プライミング部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであり、５’−第２プライミング部位のＴ_ｍは、３’−第１プライミング部位のＴ_ｍより低く、前記分割部位は、前記Ｘ’_ｐ、Ｙ’_ｑ及びＺ’_ｒの三つの領域のうち、最も低いＴ_ｍを有して、前記分割部位は、ターゲット核酸に対するアニーリングに関して、前記５’−第２プライミング部位を前記３’−第１プライミング部位から分割し、これにより、前記オリゴヌクレオチドの前記アニーリング特異性が、前記５’−第２プライミング部位及び前記３’−第１プライミング部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＨＤプライマーの全体アニーリング特異性を向上させる。）