JP2013509871A - Ｔｈｄプライマーターゲット検出 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ターゲットハイブリダイゼーション及び検出プライマー（ＴＨＤ ｐｒｉｍｅｒ）を利用したターゲット核酸配列の検出に関する。本発明は、ＰＣＲ反応で使用されるプライマーに標識を導入して、ターゲット及びシグナルが全部増幅されるようにして、複雑なオリゴヌクレオチドの使用無しに、ＰＣＲ反応を利用してリアルタイムターゲット検出を可能にする。本発明は、従来のリアルタイムＰＣＲ方法に係わる問題点及び短所から完璧に自由である。本発明は、標識されたプライマーだけを利用して、成功的にリアルタイムターゲット検出ができるようにする。このような本発明の特徴は、マルチプレックス方式において優れたリアルタイムターゲット検出を可能にする。
【選択図】
図１ａ

Description

本発明は、ターゲットハイブリダイゼーション及び検出プライマー（ｔａｒｇｅｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒ、ＴＨＤプライマー）を利用したターゲット核酸配列の検出に関する。
ターゲット核酸を検出するための大部分の技術は、ターゲット核酸増幅過程を含んでいる。核酸増幅は、分子生物学分野で利用される極めて重要（ｐｉｖｏｔａｌ）な過程であって、多様な増幅方法が提示された。例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈ．Ｉ．ら（特許文献１）は、プロモーター／プライマー配列をターゲット一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）にハイブリッド形成させた後、前記配列の多いＲＮＡコピーを転写する過程を含む核酸配列増幅方法を開示している。他の公知の核酸増幅方法は、転写増幅システムを含む（非特許文献１；及びＧｉｎｇｅｒａｓ Ｔ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．，特許文献２）。
ポリメラーゼ連鎖反応（以下、‘ＰＣＲ’という）として公知された、最もよく利用される核酸増幅方法は、二本鎖ＤＮＡの変性、ＤＮＡ鋳型へのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング及びＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長の繰り返されたサイクル過程を含む（Ｍｕｌｌｉｓら、特許文献３〜５；非特許文献２）。
ＰＣＲ関連技術は、ターゲットＤＮＡ配列の増幅だけではなく、生物学と医学の研究分野で科学的応用または方法に広く利用されており、例えば、ターゲット配列の検出、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ディファレンシャルディスプレイ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｄｉｓｐｌａｙ）ＰＣＲ（ＤＤ−ＰＣＲ）、公知あるいは未知の遺伝子のＰＣＲを利用したクローニング、ｃＤＮＡ末端の高速増幅（ＲＡＣＥ）、任意的プライミングＰＣＲ（ＡＰ−ＰＣＲ）、マルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＰＣＲ、ＳＮＰゲノムタイピング及びＰＣＲ関与ゲノム分析（非特許文献３）がある。
一方、現在まで提示された核酸増幅に基づいたターゲット核酸検出方法は、以下の通りである。
１．ポストＰＣＲ検出方法
典型的にポストＰＣＲ方法は、ターゲット核酸配列を分析するために、核酸増幅及び以後の増幅産物の検出を含む。従来のポストＰＣＲ検出方法によると、増幅産物を大きさの差によって分離するか（一般に、ゲル電気泳動を利用して行う）、または増幅産物の固定化により分離しなければならない。しかし、分離過程は、持ち込み物による汚染及び低い処理性のような深刻な問題を引き起こす。
２．リアルタイム検出方法
ポストＰＣＲ方法の問題点を克服するために、リアルタイムで増幅された産物を検出するリアルタイムＰＣＲ方法が提示されて、汚染から自由になって、ターゲット核酸配列を定量的に分析することができるようになった。
２．１ ハイブリッド形成及び伸長反応を利用した方法
２．１．１ サンライズプライマー方法
この方法は、５’末端にヘアピンループを形成し、蛍光団及びクエンチャーの一対を互いに隣接させ、減少された蛍光を示すサンライズプライマー（Ｓｕｎｒｉｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）を利用する。このようなプライマーがＰＣＲ産物に取り込まれた場合、テイル部分が二重鎖になって、ヘアピンが解けて蛍光を増加させる（非特許文献４、及び特許文献６）。しかし、サンライズプライマー方法は、プライマーがターゲット核酸配列に相補的な配列及びその５’−末端にヘアピンループを形成できる配列を含むように複雑にデザインしなければならず、このような側面で便宜性が大きく劣る。
２．１．２ テイルドプライマー方法（スコーピオンプライマー方法）
この方法は、テイルド（ｔａｉｌｅｄ）プライマー（スコーピオンプライマー）及び統合（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）シグナリングシステムを利用する。前記プライマーは、鋳型結合領域及びテイルを有して、テイルは、リンカーとターゲット結合領域（ｒｅｇｉｏｎ）を含む。ターゲット結合領域は、プライマーの伸長産物で相補的な配列とハイブリッド形成される。その後、ターゲット特異ハイブリダイゼーションイベントは、シグナリングシステムとカップリングされて、ハイブリダイゼーションは、検出可能な変化を引き起こす。テイルドプライマーのリンカーは、プライマー鋳型のテイル領域のポリメラーゼ−媒介連鎖複写を妨害する（非特許文献５、特許文献７）。テイルドプライマーは、アンプリコン−依存的シグナルを発生させるためのリンカーと、プライマー伸長産物とハイブリッド形成されるターゲット結合領域をプライマーに含ませる必要があるため、サンライズプライマー方法と同様に、プライマーのデザイン及び合成に困難がある。
２．２ ハイブリッド形成反応を利用した方法
２．２．１ 分子ビーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ）方法
分子ビーコンは、蛍光及びクエンチング染料を含むが、クエンチング染料が蛍光染料に隣接している場合にのみ、ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）が発生する。分子ビーコンは、ヘアピン構造（溶液中で自由である）を利用してデザインされて、二つの染料を近接させる。分子ビーコンがターゲットとハイブリッド形成される場合、蛍光及びクエンチャー染料は、分離される。ＦＲＥＴは発生せず、蛍光染料は、照射（ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ）により光を放出する（非特許文献６及び７）。
しかし、分子ビーコン方法には幾つかの短所がある。
第一に、ヘアピン構造の二つの逆反復（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅｐｅａｔ）は、ターゲット核酸に相補的カウンターパートを有しなければならず、これは、ターゲットにおいても逆反復の存在を要求する。
第二に、相補的核酸配列を有するヘアピン構造のループ部位のＴｍ及びステム部位のＴｍは、注意を払って均衡を合わせることが必要であり、これは、非特異的アンフォールディング（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）無しにターゲットが存在する時、ヘアピンプローブの特異的アンフォールディングが可能であるよう分析温度を調節しなければならない。
最後に、この方法は、ターゲット核酸配列を増幅するために、追加的にプライマーを必要とする。
２．２．２ ハイブリダイゼーションプローブ法
この方法は、四つのオリゴヌクレオチドを利用する：二つのプライマー及び二つのプローブ。ハイブリダイゼーションプローブは単一標識を有して、一つは供与体蛍光団、他の一つは、受容体蛍光団を有する。二つのプローブの配列は、これらがヘッドトゥーテイル配置（ｈｅａｄ ｔｏ ｔａｉｌ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）でターゲット配列にハイブリッド形成されるように選択されて、二つの染料を互いに近接するようにして、ＦＲＥＴが起こるようにする。プローブの一つにある受容体染料は、エネルギーを転移させて、他の一つは、異なる波長で蛍光を放出させる。蛍光の量は、ＰＣＲ過程の間に生成されるターゲットＤＮＡの量に正比例する（非特許文献６、８及び９）。
しかし、この方法は、マルチプレックス検出に適しておらず、ターゲット核酸配列を増幅するために、追加的にプライマーを必要とする。
２．３ ハイブリダイゼーション及びヌクレアーゼ活性を利用した方法
２．３．１ ＴａｑＭａｎプローブ法（５’→３’ヌクレアーゼ活性）
ＴａｑＭａｎプローブは、ＰＣＲ産物の内部にハイブリッド形成されるように製作される。ＰＣＲの間、即ち、ポリメラーゼがＴａｑＭａｎプローブの取り込まれた鋳型を複製すると、ポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性は、プローブを切断させる。これは、蛍光とクエンチング染料を分離して、ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）は、それ以上起こらない（非特許文献６及び８、並びに特許文献８）。
しかし、この方法は、三つのオリゴヌクレオチド（一つの二重標識プローブ及び二つのプライマー）を利用するという側面で限界点を有する。この方法は、プローブのデザイン及び合成、そして反応条件の最適化を複雑にする。
２．３．２ 標識プライマー方法（３’→５’ヌクレアーゼ活性）
この方法は、プライマーの３’−末端に少なくとも一つのヌクレオチドを人為的にミスマッチさせた標識プライマーを利用する。ハイブリッド形成がなされるに十分な条件下で標識プライマー及び試料がインキュベーションされて、次いで試料は、３’→５’校正活性を有する核酸ポリメラーゼに暴露されて、これにより、標識または標識システムの一部が放出される（特許文献９）。
しかし、ミスマッチプライマーは、その３’末端にミスマッチヌクレオチドを含むように複雑にデザインしなければならない。しかも、３’末端が非ターゲット配列とミスマッチされる場合も、ミスマッチプライマーは、３’→５’校正活性を有する核酸ポリメラーゼにより、擬陽性シグナルを生じる可能性が高い。
以上のように、今まで開発された従来のターゲット検出方法の大部分は、本質的な欠点を有して、これは、克服することが難しいと考えられる。
したがって、技術的、時間的及び費用的に効果的な、ターゲット核酸配列を検出する新規なやり方が要求される。
本明細書全体にかけて多数の特許及び文献が参照されて、その引用が表示されている。引用された特許及び文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
国際公開第８９／０６７００号パンフレット 国際公開第８８／１０３１５号パンフレット 米国特許第４，６８３，１９５号 米国特許第４，６８３，２０２号 米国特許第４，８００，１５９号 米国特許第６，１１７，６３５号 米国特許第６，３２６，１４５号 米国特許第５，２１０，０１５号 米国特許第６，２４８，５２６号
Ｋｗｏｈ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６：１１７３−１１７７（１９８９） Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０，１３５０−１３５４（１９８５） ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｍｏｌｌｅｒ， ＰＣＲ． ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ＮＹ（２０００） Ｎａｚａｒｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２５ ｎｏ．１２：２５１６−２５２１（１９９７） Ｗｈｉｔｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１７ ＡＵＧＵＳＴ：８０４−８０７（１９９９） Ｐａｒｅｓｈａｒ Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｍｅｄ Ｒｅｓ，１２４：３８５−３９８（２００６） Ｔｙａｇｉ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１４ ＭＡＲＣＨ：３０３−３０８（１９９６） Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｍｅｄ Ｒｅｓ １２４：３０３−３０８（２００６） Ｂｅｒｎａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ，４６：１４７−１４８（２０００）
本発明者らは、ターゲット核酸配列の検出に対する従来技術の問題点を克服するために鋭意研究した。本発明者らは、二重監視機能、即ち、プロービング及びプライミング機能を有する新規な分析−機能的プライマーを考案し、前記プライマーを利用してターゲット核酸配列の検出のための多様なプロトコールを立案した。その結果、本発明者らは、本発明の新規なプロトコールまたは方法が、ターゲット核酸配列の検出、特に、リアルタイム検出において優れた作動性を示し、より強くて速い方式でターゲット核酸配列を検出するシグナルを発生させるということを確認した。
本発明者らの鍵となる発見は、鋳型依存的核酸ポリメラーゼによりプライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応が発生する条件下で、ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されたプライマーが５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触する場合、その３’−末端が伸長されて、またその５’−末端部位が切断されることであり、これは、本発明を掌握している基盤である。このような発見に基づいて、ＰＣＲ反応においてアンプリコンを生成させるためのプライマーに検出可能なシグナルを発生する標識が含まれた場合、リアルタイムＰＣＲ反応の間、シグナルが発生されることを見出した。追加的なプローブまたはプライマーの修飾が必要な既存の方法と比較し、ターゲット検出において、本発明は、さらに効率的であることが明かされた。本発明の標識プライマーは、ターゲット核酸配列の効果的な検出のための卓越で且つ柔軟なツール（ｔｏｏｌ）を提供することができるだけではなく、より簡便でより短縮された、そしてより経済的な方式で、リアルタイムＰＣＲアッセイの開発を可能にする。
したがって、本発明の目的は、ターゲットハイブリダイゼーション及び検出プライマー（ｔａｒｇｅｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒ、ＴＨＤ ｐｒｉｍｅｒ）の５’−切断反応及び３’−伸長反応を利用して、ＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、ターゲットハイブリダイゼーション及び検出プライマー（ＴＨＤ ｐｒｉｍｅｒ）の５’−切断反応及び３’−伸長反応を伴うポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用して、ＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供することにある。
本発明のまた他の目的は、ターゲットハイブリダイゼーション及び検出プライマー（ＴＨＤ ｐｒｉｍｅｒ）の５’−切断反応及び３’−伸長反応を利用して、ＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するキットを提供することにある。
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。
本発明の基本原理は、図１〜４に要約した。
５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼによるＴＨＤプライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応を利用して、ターゲット核酸配列を検出するアッセイに係わる工程を模式的に示す。図１ａは、ターゲット核酸配列を検出する標準的な構造を有するＴＨＤプライマーの利用を示す。 ５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼによるＴＨＤプライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応を利用して、ターゲット核酸配列を検出するアッセイに係わる工程を模式的に示す。図１ｂは、ターゲット核酸配列の検出において、プライマーアニーリング特異性のために、二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有するＴＨＤプライマーの利用を示す。 ５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼによるＴＨＤプライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応を利用して、ターゲット核酸配列の増幅無しにターゲット核酸配列を検出するリアルタイムシグナル増幅アッセイを模式的に示す。図２ａは、ターゲット核酸配列を検出する標準的な構造を有するＴＨＤプライマーの利用を示す。 ５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼによるＴＨＤプライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応を利用して、ターゲット核酸配列の増幅無しにターゲット核酸配列を検出するリアルタイムシグナル増幅アッセイを模式的に示す。図２ｂは、ターゲット核酸配列の検出において、プライマーアニーリング特異性のために、二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有するＴＨＤプライマーの利用を示す。 本発明のＴＨＤプライマーを利用して実施したリアルタイムＰＣＲの間、ターゲット核酸及びシグナルのリアルタイム増幅を模式的に示す。図３ａは、リアルタイムＰＣＲ増幅のために標準的な構造を有するＴＨＤプライマーの利用を示す。 本発明のＴＨＤプライマーを利用して実施したリアルタイムＰＣＲの間、ターゲット核酸及びシグナルのリアルタイム増幅を模式的に示す。図３ｂは、リアルタイムＰＣＲ増幅において、プライマーアニーリング特異性のために、二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有するＴＨＤプライマーの利用を示す。 リアルタイムＰＣＲ増幅において、ＴＨＤプライマー組み合わせの多様性を模式的に示す。図４ａは、正方向プライマーとしてのＴＨＤプライマー、逆方向プライマーとしてのＴＨＤプライマー、または両方のプライマーとしてのＴＨＤプライマーの利用を示す。 リアルタイムＰＣＲ増幅において、ＴＨＤプライマー組み合わせの多様性を模式的に示す。図４ｂは、標識プローブと共に、正方向プライマーとしてのＴＨＤプライマー、逆方向プライマーとしてのＴＨＤプライマー、または両方のプライマーとしてのＴＨＤプライマーを利用した例を示す。 リアルタイムＰＣＲ増幅において、ＴＨＤプライマー組み合わせの多様性を模式的に示す。図４ｃは、正方向プライマーとしてのＴＨＤプライマーと共に、追加的に上流プライマー、逆方向プライマー、または両方のプライマーとしてのＴＨＤプライマーを利用した例を示す。 リアルタイムＰＣＲ増幅において、ＴＨＤプライマー組み合わせの多様性を模式的に示す。図４ｄは、内部プライマーと共に、正方向プライマーとしてのＴＨＤプライマー、逆方向プライマーとしてのＴＨＤプライマー、または両方のプライマーとしてのＴＨＤプライマーを利用した例を示す。 変性、ハイブリッド形成、切断及び伸長の繰り返し無しに、本発明のＴＨＤプライマー及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを利用した、指定時間間隔におけるターゲット核酸配列の検出を示す。１） 鋳型は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドである。２） ＴＨＤプライマーは、標準的な構造を有し、二重標識を有する。 変性、ハイブリッド形成、切断及び伸長の繰り返しと共に、ＴＨＤプライマー及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを利用した、ｄＮＴＰの多様な濃度におけるリアルタイムシグナル増幅結果を示す。１） 鋳型は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドである。２） ＴＨＤ プライマーは、標準的な構造を有し、二重標識を有する。 Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＳＰ）遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲ増幅におけるＴＨＤプライマー及び標識プローブを比較して示す。図７ａは、リアルタイムＰＣＲ増幅の結果を示す。１） 鋳型は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのゲノムＤＮＡである。２） ＴＨＤは、標準的な構造を有し、二重標識を有するＴＨＤプライマーを示す。３） プローブは、標準的な構造を有し、二重標識及びその３’−末端にホスフェートを有する。４） プライマーは、標準的な構造を有し、標識のないプライマーである。 Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＳＰ）遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲ増幅におけるＴＨＤプライマー及び標識プローブを比較して示す。図７ｂは、リアルタイムＰＣＲ増幅の結果を示すアガロースゲル写真である。 Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ（ＮＭ）遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲ増幅におけるＴＨＤプライマー及び標識プローブを比較して示す。図８ａは、リアルタイムＰＣＲ増幅の結果を示す。１） 鋳型は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのゲノムＤＮＡである。２） ＴＨＤは、標準的な構造を有し、二重標識を有するＴＨＤプライマーを示す。３） プローブは、標準的な構造を有し、二重標識及びその３’−末端にホスフェートを有する。４） プライマーは、標準的な構造を有し、標識のないプライマーである。 Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ（ＮＭ）遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲ増幅におけるＴＨＤプライマー及び標識プローブを比較して示す。図８ｂは、リアルタイムＰＣＲ増幅の結果を示すアガロースゲル写真である。 リアルタイムＰＣＲ増幅において、正方向プライマーとしてＴＨＤプライマーを利用したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＳＰ）遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲ特異性を示す。１） 鋳型は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＳＰ）、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）またはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＮＭ）のゲノムＤＮＡである。２） ＴＨＤは、標準的な構造を有し、二重標識を有するＴＨＤプライマーを示す。３） プライマーは、標準的な構造を有し、標識のないプライマーである。 リアルタイムＰＣＲ増幅において、正方向プライマーとしてＴＨＤプライマーを利用したＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ（ＮＭ）遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲ特異性を示す。１） 鋳型は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＮＭ）、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）またはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＳＰ）のゲノムＤＮＡである。２） ＴＨＤは、ＤＰＯ構造を有し、二重標識を有するＴＨＤプライマーを示す。３） プライマーは、標準的な構造を有し、標識のないプライマーである。 リアルタイムＰＣＲ増幅において、正方向プライマーとしてＴＨＤプライマーを利用したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＳＰ）遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲ感度を示す。１） 鋳型は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのゲノムＤＮＡである。２） ＴＨＤは、標準的な構造を有し、二重標識を有するＴＨＤプライマーを示す。３） プライマーは、標準的な構造を有し、標識のないプライマーである。 リアルタイムＰＣＲ増幅において、正方向プライマーとしてＴＨＤプライマーを利用した Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ（ＮＭ）遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲ感度を示す。１） 鋳型は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのゲノムＤＮＡである。２） ＴＨＤは、ＤＰＯ構造を有し、二重標識を有するＴＨＤプライマーを示す。３） プライマーは、標準的な構造を有し、標識のないプライマーである。 ｎｅｓｔｅｄリアルタイムＰＣＲ増幅において、正方向プライマーとしてＴＨＤプライマーを利用したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＳＰ）遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲ特異性を示す。１） 鋳型は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＳＰ）、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）またはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＮＭ）のゲノムＤＮＡである。２） ＴＨＤは、標準的な構造を有し、二重標識を有するＴＨＤプライマーを示す。３） プライマーは、標準的な構造を有し、標識のないプライマーである。 ｎｅｓｔｅｄリアルタイムＰＣＲ増幅において、正方向プライマーとしてＴＨＤプライマーを利用したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＳＰ）遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲ感度を示す。１） 鋳型は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのゲノムＤＮＡである。２） ＴＨＤは、標準的な構造を有し、二重標識を有するＴＨＤプライマーを示す。３） プライマーは、標準的な構造を有し、標識のないプライマーである。 Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ（ＮＭ）遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲ増幅に、正方向プライマーとしてのＴＨＤプライマー、逆方向プライマーとしてのＴＨＤプライマー、または両方のプライマーとしてのＴＨＤプライマーを利用した結果を示す。１） 鋳型は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのゲノムＤＮＡである。２） ＴＨＤは、ＤＰＯ構造を有し、二重標識を有するＴＨＤプライマーを示す。３） プライマーは、ＤＰＯ構造を有し、標識のないプライマーを示す。 Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ（ＮＭ）遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲ増幅に、標識プローブと共に、正方向プライマーとしてのＴＨＤプライマー、逆方向プライマーとしてのＴＨＤプライマー、または両方のプライマーとしてのＴＨＤプライマーを組み合わせて利用した結果を示す。１） 鋳型は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのゲノムＤＮＡである。２） ＴＨＤは、ＤＰＯ構造を有し、二重標識を有するＴＨＤプライマーを示す。３） プライマーは、ＤＰＯ構造を有し、標識のないプライマーを示す。４） 内部プローブは、標準的な構造を有し、二重標識を有する。 Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ（ＮＭ）遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲ増幅に、正方向プライマーとしてのＴＨＤプライマーと、追加的に上流プライマー、逆方向プライマー、または両方のプライマーとしてのＴＨＤプライマーを組み合わせて利用した結果を示す。１） 鋳型は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのゲノムＤＮＡである。２）、４） 上流プライマー及び逆方向プライマーは、ＤＰＯ構造を有する。３） 正方向プライマーは、標準的な構造を有する。５） ＴＨＤは、二重標識を有するＴＨＤプライマーを示す。６） プライマーは、ＤＰＯ構造を有し、標識のないプライマーを示す。 Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ （ＮＭ）遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲ増幅に、内部プライマーと共に、正方向プライマーとしてのＴＨＤプライマー、逆方向プライマーとしてのＴＨＤプライマー、または両方のプライマーとしてのＴＨＤプライマーを組み合わせて利用した結果を示す。１） 鋳型は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのゲノムＤＮＡである。２） ＴＨＤは、ＤＰＯ構造を有し、二重標識を有するＴＨＤプライマーを示す。３） プライマーは、ＤＰＯ構造を有し、標識のないプライマーを示す。４） 内部プライマーは、標準的な構造を有し、標識がない。 Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ（ＮＭ）遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲ増幅に、ＴＨＤプライマー及びＴａｑＭａｎプローブを利用した方法を比較して示す。１） 鋳型は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのゲノムＤＮＡである。２） ＴＨＤは、ＤＰＯ構造を有し、二重標識を有するＴＨＤプライマーを示す。３） プライマーは、ＤＰＯ構造を有し、標識のないプライマーを示す。４） 内部プライマーは、標準的な構造を有し、標識がない。４） 内部プローブは、標準的な構造を有し、二重標識を有する。
本発明は、標識を有するプライマー及び鋳型依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性を利用してターゲット核酸配列を検出する新規な方法を提示する。特に、本発明は、リアルタイム方式でターゲット核酸配列を検出する卓越な方法を提案する。
ターゲットハイブリダイゼーション及び検出プライマー（ｔａｒｇｅｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒ、ＴＨＤ ｐｒｉｍｅｒ）と命名された、標識されたプライマーがターゲット核酸配列にハイブリッド形成されると、前記プライマーは伸長されて、ターゲット核酸配列に対する相補的な配列が合成されて、その後、前記プライマーは切断され、前記プライマーから標識が放出されて、これによりターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生する。即ち、ＴＨＤプライマーは、５’−切断反応及び３’−伸長反応過程を経る。
本発明者らは、蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的標識システムを有するＴＨＤプライマーをターゲット核酸配列にハイブリッド形成させた後、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼとインキュベーションさせた場合、標識（標識断片）がＴＨＤプライマーから放出され、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生するということを見出した。
また、本発明者らは、ＴＨＤプライマーの３’−末端における伸長反応が、反応温度変化によるシグナル強度の変化（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）の程度を抑えることを見出して、これは、ＴＨＤプライマーの３’−末端の伸長は、シグナルが反応温度の変化による影響をほとんど受けないか、全く影響を受けないようにして、結局、より信頼性があって安定的なシグナル結果が得られるようになる。加えて、本発明の方法において、ＴＨＤプライマーは、増幅プライマーとして提供できるため、ターゲット核酸配列は、シグナル増幅と共に増幅される。
本発明によると、標識されたプライマー及び鋳型依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性を利用して、極めて向上された効率性及び信頼度でターゲット核酸配列をリアルタイムで検出することができる。本発明者らが知る限りでは、このような科学的結果及び技術的な戦略は、本発明者らによって最初に提示された。
３’−伸長反応は、ターゲット核酸配列とＴＨＤプライマーのハイブリッド形成安定化及び反応温度の変化によるシグナル強度の変化を低く維持するに重要な役割をする。
上記のような本発明者らの結果に基づいて、本発明の一般的な方法を下記の通りに提示する：従来方法により標識されたプライマー及び５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼを、ターゲット核酸配列を含んでいる試料と共にインキュベーションさせて、プライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応が誘導されてプライマーから標識が放出され、最終的にターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生する。
本発明によると、ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）現象を利用した標識である相互作用的標識が、リアルタイム方式で簡単にターゲット核酸配列を検出できるようにする。
また、連続的な二つの工程、即ち、ターゲット核酸配列とプライマーのハイブリッド形成及び５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼとのインキュベーションの繰り返しは、ターゲット核酸配列に対するシグナルを増幅する。したがって、シグナル増幅は、ターゲット検出の感度を向上させるに非常に寄与する。
本発明において、ＴＨＤプライマー及びターゲットを増幅できるカウンターパートプライマーを一緒に利用する場合、シグナル増幅だけではなく、ターゲット配列増幅が同時に達成されて、同時的（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）アッセイ方法を成功裏に提供する。
本発明の同時的アッセイ方法は、現在まで開発された従来の方法と明白に異なっている。
ターゲット検出のために標識プライマーを利用する方法として、サンライズ方法（Ｎａｚａｒｅｎｋｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｖ．２５ ｎｏ．１２，２５１６−２５２１（１９９７） 及び米国特許第６，１１７，６３５号）及びスコーピオン方法（Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅら、 Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖ．１７ ＡＵＧＵＳＴ， ８０４−８０７（１９９９） 、及び米国特許第６，３２６，１４５号）が提示された。このような方法は、プライマー伸長によってのみターゲットを示すシグナルを発生して、核酸ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性を利用しない；しかし、本発明の方法において、前記ヌクレアーゼ活性は、シグナル発生に重要な役割をする。このようなシグナル発生メカニズムにおける相違点は、既存の方法において必須的である複雑な構造のプライマーを利用しなくても、本発明によって、より容易にターゲット核酸配列が検出できるようにする。
米国特許第６，２４８，５２６号では、標識プライマー及び核酸ポリメラーゼを利用したターゲット検出方法を開示している。このような方法は、シグナル発生のために、核酸ポリメラーゼの３’→５’校正活性を利用して標識プライマーの３’−末端部位を切断する。要するに、従来の方法は、本発明の方法とは相異なるヌクレアーゼ活性を利用する。核酸ポリメラーゼの３’→５’校正活性を利用する場合、３’−末端にミスマッチを含むターゲットにハイブリッド形成可能なプライマーをデザインすることは困難である。３’−末端のミスマッチ配列のみを除いて非ターゲット配列にプライマーがハイブリッド形成される場合、ミスマッチ配列は、３’→５’校正活性により切断され、擬陽性シグナルが発生する。しかし、本発明は、ミスマッチ配列を必要とせず、従来の方法における問題点はない。
核酸ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性を利用したＴａｑＭａｎプローブ法は、主にターゲット検出のために当業界で利用される（米国特許第５，２１０，０１５号）。上記方法は、ターゲットを示すシグナルを発生させるために、標識プローブ及び上流プライマーを必要とする。
ＴａｑＭａｎプローブ技術は、シグナル発生に対する二つの接近法を提示する：重合依存的切断及び重合独立的切断。重合依存的切断において、上流プライマーの伸長は、必ず核酸ポリメラーゼが標識プローブの５’−末端に接触する前に起こらなければならない。伸長反応に続いて、ポリメラーゼは、標識プローブの５’−末端を徐々に切断する。重合独立的切断において、上流プライマー及び標識プローブは、非常に近接してターゲット核酸にハイブリッド形成されて、これにより、上流プライマーの３’−末端に結合された核酸ポリメラーゼは、標識プローブの５’−末端に接触するようになり、結局、標識が放出される。上述のように、ＴａｑＭａｎプローブ技術は、シグナルの発生のために、上流プライマーだけではなく、標識プローブを必要とする。標識プローブは、ターゲット増幅には関与しない。
ＴａｑＭａｎプローブ技術とは異なって、本発明は、シグナル発生のために、独立的な方式で核酸ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性を利用して、５’→３’ヌクレアーゼ活性は、他の活性（例えば、重合活性）及び他の添加物（例えば、上流プライマー）の助け無しに、その核酸切断反応を起こす。ＴａｑＭａｎプローブ技術とは異なり、本発明は、標識をプローブではなく、プライマーに付加している。
本発明者らは、ターゲット核酸配列の検出に対する従来技術の問題点を克服するために鋭意研究した。本発明者らは、二重監視機能、即ち、プロービング及びプライミング機能を有する新規な分析−機能的プライマーを考案し、前記プライマーを利用してターゲット核酸配列の検出のための多様なプロトコールを確立した。その結果、本発明者らは、本発明の新規なプロトコールまたは方法が、ターゲット核酸配列の検出、特に、リアルタイム検出に適した方法であることを示し、より強くて速い方式でターゲット核酸配列を示すシグナルを発生させるということを確認した。
本発明者らの鍵となる発見は、鋳型依存的核酸ポリメラーゼによりプライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応が発生する条件下で、ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されたプライマーが５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触する場合、その３’−末端が伸長されて、またその５’−末端部位が切断されることであり、これは、本発明を掌握している基盤である。このような発見に基づいて、ＰＣＲ反応においてアンプリコンを生成させるためのプライマーに検出可能なシグナルを発生する標識が含まれた場合、リアルタイムＰＣＲ反応の間、シグナルが発生することを確認した。追加的なプローブまたはプライマーの修飾が必要な既存の方法に比べ、本発明がターゲット検出においてさらに効率的であることが分かる。本発明の標識プライマーは、ターゲット核酸配列の効果的な検出のための卓越で且つ柔軟なツール（ｔｏｏｌ）を提供することができるだけではなく、より簡便でより短縮された、そしてより経済的な方式で、リアルタイムＰＣＲアッセイの開発を可能にする。
本発明の一様態によると、
（ａ）ターゲット核酸配列とＴＨＤプライマーをハイブリッド形成させる工程であって、前記ＴＨＤプライマーは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）一つの標識または多数の標識を含む相互作用的標識システムを含む工程と、
（ｂ）鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより前記ＴＨＤプライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応が発生する条件下で、前記工程（ａ）の結果物を５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって、前記ＴＨＤプライマーは、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記ポリメラーゼ活性により伸長されて、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断され、前記ＴＨＤプライマーから前記標識または前記相互作用的標識システムの少なくとも一つの標識が放出されて、これにより前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される工程と、
（ｃ）前記シグナルを検出する工程であって、前記シグナルは、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、
を含み、ターゲットハイブリダイゼーション及び検出プライマー（ＴＨＤ ｐｒｉｍｅｒ）の５’−切断反応及び３’−伸長反応を利用してＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供する。
本発明によると、ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されるオリゴヌクレオチドは、ターゲット核酸配列とのハイブリッド形成に二重監視機能を示す：その一は、相補的な配列の合成であり；その二は、ターゲット核酸配列を示すシグナルの発生である。
したがって、前記オリゴヌクレオチドは、‘ターゲットハイブリダイゼーション及び検出プライマー（ｔａｒｇｅｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒ、ＴＨＤ ｐｒｉｍｅｒ）’と命名されて、本発明の方法は、‘ＴＨＤプライマーターゲット検出アッセイ’と命名される。
本発明によると、まず、ターゲット核酸配列は、ＴＨＤプライマーとハイブリッド形成される。
本明細書で使用される用語‘ターゲット核酸’、‘ターゲット核酸配列’または‘ターゲット配列’は、検出しようとする核酸配列を意味し、ハイブリッド形成、アニーリングまたは増幅条件下でプライマー及びプローブとアニーリングまたはハイブリッド形成される。
本明細書で使用された用語‘プライマー’は、オリゴヌクレオチドを意味するもので、核酸鎖（鋳型）に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件、即ち、ヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼのような重合剤の存在、そして適した温度とｐＨの条件で合成の開始点として作用できる。好ましくは、プライマーは、増幅において最大効率を有する一本鎖である。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。本発明で利用されるプライマーは、天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ｄＮＭＰ（即ち、ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰ及びｄＴＭＰ）、修飾ヌクレオチドまたは非−天然ヌクレオチドが含まれる。また、プライマーは、リボヌクレオチドも含むことができる。
プライマーは、重合剤の存在下で伸長産物の合成をプライミングさせることができるほど十分長くなければならない。プライマーの適した長さは、多数の要素、例えば、温度、応用分野及びプライマーのソース（ｓｏｕｒｃｅ）によって決定される。用語‘アニーリング’または‘プライミング’は、鋳型核酸にオリゴデオキシヌクレオチドまたは核酸が並置（ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）されることを意味し、前記並置は、ポリメラーゼがヌクレオチドを重合させて、鋳型核酸またはその一部分に相補的な核酸分子を形成するようにする。
本明細書で使用される用語‘ハイブリッド形成、ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）’は、相補的な一本鎖核酸が二本鎖核酸を形成することを意味する。本明細書で使用された用語‘アニーリング’と‘ハイブリッド形成’に差はなく、本明細書で混用される。
本明細書で使用される用語‘ＴＨＤプライマー’は、ターゲット核酸配列とハイブリッド形成されるプライマーを意味し、これは、ターゲット核酸配列の相補的な配列の生産を誘導して、その５’−末端部位は、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより切断される。
本明細書で使用される用語‘正方向プライマー’は、３’→５’方向に配列されたターゲット核酸配列の一つの鎖に相補的なプライマーを意味する。逆方向プライマーは、前記核酸配列の他の一つの鎖に相補的な配列を有する。
明細書で使用される用語‘上流プライマー’は、目的の（または関心の）プライマー（ａ ｐｒｉｍｅｒ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）がハイブリッド形成される位置の上流位置にハイブリッド形成されるプライマーを意味し、目的の（または関心の）プライマーと同一な方向性を有する。
明細書で使用される用語‘下流プライマー’は、目的の（または関心の）プライマー（ａ ｐｒｉｍｅｒ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）がハイブリッド形成される位置の下流位置にハイブリッド形成されるプライマーを意味し、目的の（または関心の）プライマーと同一な方向性を有する。
ＴＨＤプライマーは、（ｉ）ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）一つの標識または多数の標識を含む相互作用的標識システムを含む。本明細書で使用される用語‘相補的’は、所定のアニーリング条件または厳格条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下でプライマーまたはプローブがターゲット核酸配列に選択的にハイブリッド形成するほど十分相補的なことを意味し、用語‘実質的に相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）’及び‘完全に相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）’を包括する意味を有して、好ましくは、完全に相補的なことを意味する。
本発明の好ましい具現例によると、ＴＨＤプライマーの５’−末端または５’−末端部位は、ターゲット核酸配列に完全に相補的である。
本明細書において、ＴＨＤプライマーを言及しながら使用された用語‘５’−末端部位’は、ＴＨＤプライマーの５’−末端からある長さの連続的な配列を含む部位または領域を意味する。好ましくは、ＴＨＤプライマーの５’−末端部位は、その５’−末端から１〜１０ヌクレオチドを含む配列で構成される（より好ましくは、１〜５ヌクレオチド、より好ましくは、１〜３ヌクレオチド）。
本発明で利用される、検出可能なシグナルを発生する標識は、当業界に知られたあらゆる標識を含む。標識の大部分は、単一分子または単一原子（ａｔｏｍ）標識を含むが、一部標識（例えば、相互作用的標識システム）は、少なくとも二つまたはそれ以上の標識分子または原子を含む。
本発明の好ましい具現例によると、ＴＨＤプライマーは、その５’−末端部位に少なくとも一つの標識を含む（より好ましくは、５’−末端からの１〜１０ヌクレオチドを含む配列のある位置であり、さらに好ましくは、５’−末端からの１〜５ヌクレオチドを含む配列のある位置、よりさらに好ましくは、その５’−末端からの１〜３ヌクレオチドを含む配列のある位置）。最も好ましくは、ＴＨＤプライマーは、その５’−末端に少なくとも一つの標識を含む。
鋳型依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性が５’→３’エキソヌクレアーゼ活性である場合、ＴＨＤプライマーの５’−末端に連結された標識は、エキソヌクレアーゼ活性により切断され得る。鋳型依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性が５’→３’エンドヌクレアーゼ活性である場合、ＴＨＤプライマーの５’−末端から１〜３ヌクレオチド離隔された位置に連結された標識は、エンドヌクレアーゼ活性により切断され得る。
少なくとも２種の標識分子を含む相互作用的標識システムを除いて、一つまたはそれ以上の標識（好ましくは、一つの標識）は、ＴＨＤプライマーの５’−末端部位に連結できる。例えば、供与体分子及び受容体分子の一対を含む相互作用的標識システムを利用する場合、二つの分子間にエネルギーが伝達されると、前記一対のうち、一つがＴＨＤプライマーの５’−末端部位に連結されて、他の一つは、ＴＨＤプライマーのどのような位置にも連結できる。
本発明の好ましい具現例によると、検出可能なシグナルを発生する標識は、化学的標識、酵素標識、放射能標識、蛍光標識、発光標識、化学発光標識または金属標識（例えば、金）である。
前記化学的標識は、ビオチンを含む。ストレプトアビジン（またはアビジン）とビオチンの結合特異性は、ターゲット核酸配列を示す間接的なシグナルが発生されるようにする。
前記酵素標識は、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ルシフェラーゼ、シトクロムＰ４５０及びホースラディッシュペルオキシダーゼを含む。前記酵素標識に対する基質を利用することにより、ターゲット核酸配列を示すシグナルを得ることができる。アルカリホスファターゼを利用する場合、ＢＣＩＰ（ｂｒｏｍｏｃｈｌｏｒｏｉｎｄｏｌｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＮＢＴ（ｎｉｔｒｏ ｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）またはＥＣＦが発色反応に対する基質として利用でき、ホースラディッシュペルオキシダーゼを利用する場合、クロロナフトール、アミノエチルカルバゾール、ジアミノベンジジン、Ｄ−ルシフェリン、ルシゲニン（ビス−Ｎ−メチルアクリジニウムニトレート）、レゾルフィンベンジルエーテル、ルミノール、アンプレックスレッド試薬（１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン）、ＨＹＲ（ｐ−フェニレンジアミン−ＨＣｌ及びピロカテコール）、ＴＭＢ（３，３，５，５−テトラメチルベンジジン）、ＡＢＴＳ（２，２−アジン−ジ［３−エチルベンズチアゾリンスルホネート］）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）またはナフトール／ピロニンが基質として利用でき；そして、グルコースオキシダーゼを利用する場合、ｔ−ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）またはｍ−ＰＭＳ（フェナジンメトスルファート）が基質として利用できる。
前記放射能性標識は、Ｃ１４、Ｉ１２５、Ｐ３２及びＳ３５を含む。
本発明の好ましい具現例によると、ＴＨＤプライマーに連結された標識は、リアルタイムシグナルを提供できる単一標識である。例えば、前記単一標識は、蛍光テルビウムキレート（ｔｅｒｂｉｕｍ ｃｈｅｌａｔｅ）である（Ｎｕｒｍｉ ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２０００， Ｖｏｌ． ２８ Ｎｏ．８）。Ｎｕｒｍｉらは、前記標識がプローブ−連結された形態では低い水準の蛍光を放出するが、５’→３’核酸切断活性によりプローブ−鋳型二本鎖から解離される場合、蛍光シグナルが増加されることを開示された。したがって、単一標識がＴＨＤプローブに連結された場合も、前記蛍光テルビウムキレートは、本発明でリアルタイムターゲット検出が可能にする。
前記相互作用的標識システムは、供与体分子及び受容体分子間にエネルギーが非−放射能的（ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｉｖｅｌｙ）に伝達されるシグナル発生システムである。
相互作用的標識システムの代表的例として、ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）標識システムは、蛍光レポーター分子（供与体分子）及びクエンチング分子（受容体分子）を含む。ＦＲＥＴでエネルギー供与体は、蛍光性であるが、エネルギー受容体は、蛍光性または非−蛍光性である。
相互作用的標識システムの他の形態において、エネルギー供与体は、非−蛍光性、例えば、発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）であり、エネルギー受容体は、蛍光性である。相互作用的標識システムのまた他の形態において、エネルギー供与体は、発光性、例えば、生物発光性、化学発光性または電気化学発光性であり、受容体は、蛍光性である。
より好ましくは、ターゲット核酸配列を示すシグナルは、相互作用的標識システムにより発生して、さらに好ましくは、ＦＲＥＴ標識システムである。
ＦＲＥＴ標識を利用する場合、二種の標識（ＴＨＤプライマー上に位置した蛍光レポーター分子及びクエンチング分子であり、前記クエンチャー分子は、前記レポーター分子の蛍光をクエンチングするように位置）は、ＴＨＤプライマー内の一位置（ヌクレアーゼ切断が起こる部位）により分割されており、これにより、鋳型依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性は、前記位置における切断反応でクエンチャー分子からレポーター分子を分離させて、これは、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生されるようにする。
本発明の好ましい具現例によると、蛍光レポーター分子は、ＴＨＤプライマーの５’−末端部位に位置して（より好ましくは、５’−末端）、クエンチャー分子は、蛍光レポーター分子から下流に位置する。択一的に、クエンチャー分子は、ＴＨＤプライマーの５’−末端部位に位置して（より好ましくは、５’−末端）、蛍光レポーター分子は、前記クエンチャー分子から下流に位置する。
本発明に利用された蛍光分子及びクエンチャー分子は、蛍光物質である。レポーター分子及びクエンチャー分子は、当業界に公知されている如何なるものでも利用でき、その例は、下記の通りである：Ｃｙ２ＴＭ（５０６）、ＹＯＰＲＯＴＭ−１（５０９）、ＹＯＹＯＴＭ−１（５０９）、Ｃａｌｃｅｉｎ（５１７）、ＦＩＴＣ（５１８）、ＦｌｕｏｒＸＴＭ（５１９）、ＡｌｅｘａＴＭ（５２０）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １１０（５２０）、５−ＦＡＭ（５２２）、Ｏｒｅｇｏｎ ＧｒｅｅｎＴＭ５００（５２２）、Ｏｒｅｇｏｎ ２５ ＧｒｅｅｎＴＭ４８８（５２４）、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ（５２５）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＧｒｅｅｎＴＭ（５２７）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １２３（５２９）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ＧｒｅｅｎＴＭ（５３１）、Ｃａｌｃｉｕｍ ＧｒｅｅｎＴＭ（５３３）、ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−１（５３３）、ＴＯＴＯ１（５３３）、ＪＯＥ（５４８）、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０（５５０）、Ｄｉｌ（５６５）、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０（５７０）、Ｃｙ３ＴＭ（５７０）、ＡｌｅｘａＴＭ５４６（５７０）、ＴＲＩＴＣ（５７２）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ＯｒａｎｇｅＴＭ（５７５）、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｒ＆Ｂ（５７５）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（５７５）、Ｃａｌｃｉｕｍ ＯｒａｎｇｅＴＭ（５７６）、Ｐｙｒｏｎｉｎ Ｙ（５８０）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ（５８０）、ＴＡＭＲＡ （５８２）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＲｅｄＴＭ（５９０）、Ｃｙ３．５ＴＭ（５９６）、ＲＯＸ（６０８）、Ｃａｌｃｉｕｍ ＣｒｉｍｓｏｎＴＭ（６１５）、ＡｌｅｘａＴＭ５９４（６１５）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（６１５）、Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ（６２８）、ＹＯ−ＰＲＯＴＭ−３（６３１）、ＹＯＹＯＴＭ−３（６３１）、Ｒｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４２）、Ｃ−Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４８）、ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−３（６６０）、ＴＯＴＯ３（６６０）、ＤｉＤ ＤｉｌＣ（５）（６６５）、Ｃｙ５ＴＭ（６７０）、Ｔｈｉａｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ（６７１）及びＣｙ５．５（６９４）。括弧の数字は、ナノメートル単位で表示した最大発光波長である。
適したレポーター−クエンチャー対は、下記のようなたくさんの文献に開示されている：Ｐｅｓｃｅら、ｅｄｉｔｏｒｓ， ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＳＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰＹ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７１）； Ｗｈｉｔｅら、ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ： Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７０）； Ｂｅｒｌｍａｎ， ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＳＰＥＣＴＲＡ ＯＦ ＡＲＯＭＡＴＩＣ ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ， ２ｎｄ ＥＤＩＴＩＯＮ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７１）； Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ， ＣＯＬＯＵＲ ＡＮＤ ＣＯＮＳＴＩＴＵＴＩＯＮ ＯＦ ＯＲＧＡＮＩＣ ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７６）； Ｂｉｓｈｏｐ， ｅｄｉｔｏｒ， ＩＮＤＩＣＡＴＯＲＳ （Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， １９７２）； Ｈａｕｇｌａｎｄ， ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ ＰＲＯＢＥＳ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， １９９２）； Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ， ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＨＯＳＰＨＯＲＥＳＣＥＮＣＥ （Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９４９）； Ｈａｕｇｌａｎｄ， Ｒ． Ｐ．， ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ ＰＲＯＢＥＳ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ， Ｓｉｘｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， Ｏｒｅｇ．， １９９６； Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏｓ． ３，９９６，３４５及び４，３５１，７６０。
本発明において、広範囲波長または特定波長の蛍光をクエンチングできる非−蛍光ブラッククエンチャー分子が利用できるということは、注目すべきことである。
ＴＨＤプライマーに適用されるＦＲＥＴ標識において、レポーターは、ＦＲＥＴの供与体を含み、クエンチャーは、ＦＲＥＴのその他のパートナー（受容体）を含む。例えば、フルオレセイン色素（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｙｅ）は、レポーター分子として利用されて、ロダミン色素（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｄｙｅ）は、クエンチャー分子として利用される。
本発明は、ポリメラーゼ活性及び５’→３’ヌクレアーゼ活性を含む鋳型依存的核酸ポリメラーゼの二つの異なる活性を利用する。本明細書で使用される用語‘５’→３’ヌクレアーゼ活性’は、一般にＤＮＡポリメラーゼに係わる５’→３’エキソヌクレアーゼ活性（これにより、鋳型にハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドの５’−末端からヌクレオチドが切断される）、または５’→３’エンドヌクレアーゼ活性（鋳型にハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドの５’−末端から一つ以上のヌクレオチドが離隔された位置で切断される）を意味する。
ポリメラーゼ活性により触媒された反応は、本明細書で３’−伸長反応と表現される。５’→３’ヌクレアーゼ活性により触媒された反応は、本明細書で５’−切断反応と表現される。
５’−切断反応は、ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチド（例えば、プライマー及びプローブ）の５’−末端または５’−末端部位（例えば、５’−末端から一つ以上のヌクレオチド離隔された）における核酸切断反応を意味する。この反応は、プライマー及びプローブの切断を引き起こし、多様な大きさのヌクレオチド切片を生産する。
３’−伸長反応は、鋳型依存的核酸ポリメラーゼによるプライマー３’−末端における核酸重合反応を意味する。
本明細書で使用される表現‘標識の放出’は、標識自体の放出または標識を含むヌクレオチド切片の放出を含む。本発明で利用されるオリゴヌクレオチド（例えば、プリマー及びプローブ）が少なくとも２種の標識を含む場合、表現‘標識の放出’は、少なくとも１種の標識の放出または少なくとも１種の標識を含む少なくとも１種のヌクレオチド切片の放出を意味する。
本明細書で使用される表現‘相互作用的標識システムの少なくとも１種の標識の放出’は、相互作用的標識システムを構成する多数の標識のうち、少なくとも１種の標識自体の放出または少なくとも１種の標識を含むヌクレオチド切片の放出を意味する。
本発明は、ターゲット核酸配列を検出するための６個の具体的なプロトコールを一般的に含んでいるが、これに限定されるものではない。
第一のプロトコールは、ＴＨＤプライマーのみを利用してターゲット核酸配列を検出する。
第二のプロトコールは、ＴＨＤプライマー及び標識プローブを利用してターゲット核酸配列を検出する。
第三のプロトコールは、ＴＨＤプライマー及び上流プライマー（または下流プライマー）を利用してターゲット核酸配列を検出する。
第四のプロトコールは、正方向プライマー及び逆方向プライマーの少なくとも一つのプライマーがＴＨＤプライマーである一対のプライマーを利用してターゲット核酸配列を検出する。
第五のプロトコールは、（ｉ）正方向プライマー及び逆方向プライマーの少なくとも一つのプライマーがＴＨＤプライマーである一対のプライマー、及び（ｉｉ）標識プローブを利用してターゲット核酸配列を検出する。
第六のプロトコールは、（ｉ）正方向プライマー及び逆方向プライマーの少なくとも一つのプライマーがＴＨＤプライマーである一対のプライマー、及び（ｉｉ）上流プライマー（または下流プライマー）を利用してターゲット核酸配列を検出する。
全ての検出プロトコールは、以下の通りに、より詳細に説明できる。
１．ＴＨＤプライマーを利用したＴＨＤプライマーターゲット検出アッセイ
本発明の最も基本的な過程である第一のプロトコールによると、ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されたＴＨＤプライマーが伸長される場合、それは、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより切断されて標識がＴＨＤプライマーから放出されて、これにより、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される。
第一のプロトコールは、下記の工程を含む：
（ａ）ターゲット核酸配列とＴＨＤプライマーをハイブリッド形成させる工程であって、前記ＴＨＤプライマーは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）一つの標識または多数の標識を含む相互作用的標識システムを含む工程と、
（ｂ）鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより前記ＴＨＤプライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応が発生する条件下で、前記工程（ａ）の結果物を５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって、前記ＴＨＤプライマーは、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記ポリメラーゼ活性により伸長されて、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断され、前記ＴＨＤプライマーから前記標識または前記相互作用的標識システムの少なくとも一つの標識が放出されて、これにより前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される工程と、
（ｃ）前記シグナルを検出する工程であって、前記シグナルは、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程。
図１は、第一のプロトコールの基本的な工程を模式的に示し、図５は、変性、ハイブリッド形成、切断及び伸長の繰り返し無しに、本発明のＴＨＤプライマー及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを利用した、指定時間間隔におけるターゲット核酸配列の検出を示す。
好ましくは、前記方法は、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを増幅させるために、前記工程（ａ）−（ｂ）または（ａ）−（ｃ）を少なくとも２回反復する工程と、その反復サイクルの間に変性過程をさらに含む。サイクルの反復は、ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されたＴＨＤプライマーが切断されるようにして、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルの増幅に寄与する。このようなシグナル増幅は、リアルタイムシグナル増幅と見なされる。
好ましくは、第一のプロトコールは、下記のような工程を含む：
（ａ）ターゲット核酸配列とＴＨＤプライマーをハイブリッド形成させる工程であって、前記ＴＨＤプライマーは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）一つの標識または多数の標識を含む相互作用的標識システムを含む工程と、
（ｂ）鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより前記ＴＨＤプライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応が発生する条件下で、前記工程（ａ）の結果物を５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって、前記ＴＨＤプライマーは、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記ポリメラーゼ活性により伸長されて、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断され、前記ＴＨＤプライマーから前記標識または前記相互作用的標識システムの少なくとも一つの標識が放出されて、これにより前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される工程と、
（ｂ’）工程（ｂ）の前記結果物を変性させる工程と、
（ｂ”）前記工程（ａ）−（ｂ’）を少なくとも２回反復する工程であって、前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルの両方を増幅させる工程と、
（ｃ）前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルを検出する工程であって、前記検出は、工程（ｂ”）の前記反復の各サイクルにおいて、工程（ｂ”）の前記反復の終了時点で、または工程（ｂ”）の前記反復の間の指定時間間隔のそれぞれで行われて、このようなシグナルは、ターゲット核酸配列の存在を示す工程。
上記反復する工程を含むこの方法を図２で模式的に示し、図６は、変性、ハイブリッド形成、切断及び伸長の繰り返しと共に、ＴＨＤプライマー及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを利用した、ｄＮＴＰの多様な濃度におけるリアルタイムシグナル増幅結果を示す。
第一のプロトコールによると、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルは、ＴＨＤプライマーにおける切断反応によってのみ発生されるか増幅される。
工程（ｂ）の前記結果物の変性は、工程（ｂ）で形成された二本鎖二合体が一本鎖核酸になるようにする。変性に対する方法は、熱、アルカリ、ホルムアミド、ウレア及びグリコサール処理、酵素方法（例えば、ヘリカーゼ反応）、及び結合タンパク質を含むが、これらに限定されるものではない。例えば、変性は、８０℃乃至１０５℃範囲の温度に熱を加えて達成できる。このような処理を達成するための一般的な方法は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（２００１）により提供される。
本発明の好ましい具現例によると、シグナルの検出は、リアルタイム方式、エンド−ポイント（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ）方式または指定時間間隔（ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｔｉｍｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ）方式で行われる。リアルタイム方式における検出は、反復の各サイクルでシグナルを検出するものである。エンド−ポイント方式における検出は、反復の終了時点でシグナルを検出するものである。指定時間間隔方式における検出は、反復の間、指定時間間隔のそれぞれでシグナルを検出するものである。
本発明は、ターゲット核酸配列のマルチプレックス検出に非常に適している。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み（より好ましくは、少なくとも３種であり、最も好ましくは、少なくとも５種である）、前記ＴＨＤプライマーは、少なくとも２種のプライマーを含む（より好ましくは、少なくとも３種であり、最も好ましくは、少なくとも５種である）。
少なくとも二つのＴＨＤプライマーが利用される場合、それらは、分析目的によって多様な組み合わせで標識を含むように製作できる。例えば、ＴＨＤプライマーの多数が全て同一な標識、全て相異なる標識または部分的に相異なる標識と連結され得る。また、少なくとも二つの部分的にまたは全体的に相異なるかまたは同一な標識が一つのＴＨＤプライマーに連結されることもできる。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、前増幅された核酸配列である。本発明における前増幅された核酸配列の利用は、ターゲット検出に対する感度及び特異性が顕著に向上されるようにする。少量のターゲット核酸配列が適した水準に前増幅された後、本発明により検出することにより、ターゲット検出の感度が大きく向上されるようにする。興味深いことに、前増幅反応に利用されたプライマーの下流配列にハイブリッド形成できるＴＨＤプライマーは、ターゲット検出の特異性を向上させるｎｅｓｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒとして利用できる。
２．ＴＨＤプライマー及び標識プローブを利用したＴＨＤプライマーターゲット検出アッセイ
第二のプロトコールは、ＴＨＤプライマーだけではなく、標識プローブを利用する。標識プローブは、検出可能なシグナルを発生する標識を有して、標識プローブは、ＴＨＤプライマーがハイブリッド形成される位置の下流位置にハイブリッド形成されて、ＴＨＤプライマーと同一な方向性を有して、連続的な工程で切断される。
標識プローブの３’−末端は、伸長が抑制されるようにブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）されている。ブロッキングは、非相補的な塩基を利用するか、あるいは最後のヌクレオチドの３’ヒドロキシル基にビオチンまたはホスフェート基のような化学的部分（ｍｏｉｅｔｙ）を追加して達成できる。また、ブロッキングは、３’−ＯＨ基を除去するか、またはジデオキシヌクレオチドのように、３’−ＯＨ基のないヌクレオチドを利用することにより達成できる。
本明細書で使用される用語‘プローブ（ｐｒｏｂｅ）’は、ターゲット核酸配列に実質的に相補的な部位または部位を含む一本鎖核酸分子を意味する。
第二のプロトコールは、ＴＨＤプライマーだけではなく、標識プローブからもシグナルが発生するため、ＴＨＤプライマーのみを利用した第一のプロトコールに比べ、ターゲット核酸配列に対してさらに高いシグナル強度を発生させることができる。
標識プローブに有用な標識は、ＴＨＤプライマーで述べたものと同様である。好ましくは、標識は、ＦＲＥＴ標識である。
また、標識プローブは、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより切断されて、標識が標識プローブから放出される。したがって、第二のプロトコールは、ターゲット核酸配列の存在を示す二つの異なるシグナルを提供する。
第二のプロトコールによると、ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されたＴＨＤプライマーが伸長される場合、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼによりＴＨＤプライマー及び／または標識プローブから５’−切断反応が起こり、標識がＴＨＤプライマー及び／または標識プローブから放出されて、これにより、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生する。
第二のプロトコールは、下記の工程を含む：
（ａ）ターゲット核酸配列、ＴＨＤプライマー及び標識プローブをハイブリッド形成させる工程であって、前記ＴＨＤプライマーは、（ｉ）ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）一つの標識または多数の標識を含む相互作用的標識システムを含む工程と、
（ｂ）鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより前記ＴＨＤプライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応が発生する条件下で、前記工程（ａ）の結果物を５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって、前記ＴＨＤプライマーは、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記ポリメラーゼ活性により伸長されて、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断され、前記ＴＨＤプライマーから前記標識または前記相互作用的標識システムの少なくとも一つの標識が放出されて、これにより前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生し、前記標識プローブは、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断されて、これにより前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される工程と、
（ｃ）前記シグナルを検出する工程であって、前記シグナルは、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程。
好ましくは、第二のプロトコールは、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを増幅させるために、前記工程（ａ）−（ｂ）または（ａ）−（ｃ）を少なくとも２回反復する工程と、その反復サイクルの間に変性過程をさらに含む。
具体的に、第二のプロトコールは、下記のような工程を含む：
（ａ）ターゲット核酸配列、ＴＨＤプライマー及び標識プローブをハイブリッド形成させる工程であって、前記ＴＨＤプライマーは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）一つの標識または多数の標識を含む相互作用的標識システムを含み、前記標識プローブは、ＴＨＤプライマーがハイブリッド形成される位置の下流位置にハイブリッド形成されて、ＴＨＤプライマーと同一な方向性を有する工程と、
（ｂ）鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより前記ＴＨＤプライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応が発生する条件下で、前記工程（ａ）の結果物を５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって、前記ＴＨＤプライマーは、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記ポリメラーゼ活性により伸長されて、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断され、前記ＴＨＤプライマーから前記標識または前記相互作用的標識システムの少なくとも一つの標識が放出されて、前記標識プローブは、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断されて前記プローブから前記標識が放出されて、これにより前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される工程と、
（ｂ’）工程（ｂ）の前記結果物を変性させる工程と、
（ｂ”）前記工程（ａ）−（ｂ’）を少なくとも２回反復する工程であって、前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルの両方を増幅させる工程と、
（ｃ）前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルを検出する工程であって、前記検出は、工程（ｂ”）の前記反復の各サイクルにおいて、工程（ｂ”）の前記反復の終了時点で、または工程（ｂ”）の前記反復の間の指定時間間隔のそれぞれで行われて、このようなシグナルは、ターゲット核酸配列の存在を示す工程。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み（より好ましくは、少なくとも３種であり、最も好ましくは、少なくとも５種である）、前記ＴＨＤプライマーは、少なくとも２種のプライマーを含み（より好ましくは、少なくとも３種であり、最も好ましくは、少なくとも５種である）、前記標識プローブは、少なくとも２種のプローブを含む（より好ましくは、少なくとも３種であり、最も好ましくは、少なくとも５種である）。
少なくとも二つのＴＨＤプライマー及び少なくとも二つのプローブが利用される場合、それらは、分析目的によって多様な組み合わせで標識を含むように製作できる。例えば、ＴＨＤプライマーの多数及び少なくとも二つのプローブが全て同一な標識、全て相異なる標識または部分的に相異なる標識と連結され得る。また、少なくとも二つの部分的にまたは全体的に相異なるかまたは同一な標識が一つのＴＨＤプライマーまたはひとつのプローブに連結されることもできる。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、前増幅された核酸配列である。
３．ＴＨＤプライマー及び上流プライマー（または下流プライマー）を利用したＴＨＤプライマーターゲット検出アッセイ
第三のプロトコールによると、ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されたＴＨＤプライマー及び上流プライマー（また下流プライマー）が伸長される場合、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼによりＴＨＤプライマー及び／または上流プライマー（また下流プライマー）で５’−切断反応が起こり、標識がＴＨＤプライマーから放出されて、これにより、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される。
上流プライマーは、ＴＨＤプライマーがハイブリッド形成される位置の上流位置にハイブリッド形成されて、ＴＨＤプライマーと同一な方向性を有する。下流プライマーは、ＴＨＤプライマーがハイブリッド形成される位置の下流位置にハイブリッド形成されて、ＴＨＤプライマーと同一な方向性を有する。
第三のプロトコールは、下記の工程を含む：
（ａ）ターゲット核酸配列、ＴＨＤプライマー及び上流プライマーまたは下流プライマーをハイブリッド形成させる工程であって、前記ＴＨＤプライマーは、（ｉ）ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）一つの標識または多数の標識を含む相互作用的標識システムを含み、前記上流プライマーは、ＴＨＤプライマーがハイブリッド形成される位置の上流位置にハイブリッド形成されて、ＴＨＤプライマーと同一な方向性を有し、前記下流プライマーは、ＴＨＤプライマーがハイブリッド形成される位置の下流位置にハイブリッド形成されて、ＴＨＤプライマーと同一な方向性を有する工程と、
（ｂ）鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより前記ＴＨＤプライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応が発生する条件下で、前記工程（ａ）の結果物を５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって、前記ＴＨＤプライマーは、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記ポリメラーゼ活性により伸長されて、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断され、前記ＴＨＤプライマーから前記標識または前記相互作用的標識システムの少なくとも一つの標識が放出されて、これにより前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される工程と、
（ｃ）前記シグナルを検出する工程であって、前記シグナルは、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程。
好ましくは、上記方法は、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを増幅させるために、前記工程（ａ）−（ｂ）または（ａ）−（ｃ）を少なくとも２回反復する工程と、その反復サイクルの間に変性過程をさらに含む。サイクルの反復は、ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されたＴＨＤプライマーが切断されるようにして、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルの増幅に寄与する。
具体的に、第三のプロトコールは、下記のような工程を含む：
（ａ）ターゲット核酸配列、ＴＨＤプライマー及び上流プライマーまたは下流プライマーをハイブリッド形成させる工程であって、前記ＴＨＤプライマーは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）一つの標識または多数の標識を含む相互作用的標識システムを含み、前記上流プライマーは、ＴＨＤプライマーがハイブリッド形成される位置の上流位置にハイブリッド形成されて、ＴＨＤプライマーと同一な方向性を有し、前記下流プライマーは、ＴＨＤプライマーがハイブリッド形成される位置の下流位置にハイブリッド形成されて、ＴＨＤプライマーと同一な方向性を有する工程と、
（ｂ）鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより前記ＴＨＤプライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応が発生する条件下で、前記工程（ａ）の結果物を５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって、前記ＴＨＤプライマーは、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記ポリメラーゼ活性により伸長されて、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断され、前記ＴＨＤプライマーから前記標識または前記相互作用的標識システムの少なくとも一つの標識が放出されて、これにより前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される工程と、
（ｂ’）工程（ｂ）の前記結果物を変性させる工程と、
（ｂ”）前記工程（ａ）−（ｂ’）を少なくとも２回反復する工程であって、前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルの両方を増幅させる工程と、
（ｃ）前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルを検出する工程であって、前記検出は、工程（ｂ”）の前記反復の各サイクルにおいて、工程（ｂ”）の前記反復の終了時点で、または工程（ｂ”）の前記反復の間の指定時間間隔のそれぞれで行われて、このようなシグナルは、ターゲット核酸配列の存在を示す工程。
本発明の好ましい具現例によると、上流プライマーまたは下流プライマーは、検出可能なシグナルを発生する標識を有する。上流プライマーまたは下流プライマーに連結された標識は、ＴＨＤプライマーに連結されたものと共に工程（ｂ）で放出できて、または工程（ｃ）におけるシグナルに関与できる。具現例によると、上流プライマーまたは下流プライマーに連結された標識は、ＴＨＤプライマーに連結されたものと相異なっている。上流プライマーまたは下流プライマーに有用な標識は、ＴＨＤプライマーで述べたものと同様である。好ましくは、標識は、ＦＲＥＴ標識である。
上流プライマーまたは下流プライマーが標識を有する場合、第三のプロトコールは、ＴＨＤプライマーだけではなく、標識された上流プライマー（または標識された下流プライマー）からもシグナルが発生するため、ＴＨＤプライマーのみを利用した第一のプロトコールに比べ、ターゲット核酸配列に対してさらに高いシグナル強度を発生させることができる。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み（より好ましくは、少なくとも３種であり、最も好ましくは、少なくとも５種である）、前記ＴＨＤプライマーは、少なくとも２種のプライマーを含み（より好ましくは、少なくとも３種であり、最も好ましくは、少なくとも５種である）、前記上流プライマー（または下流プライマー）は、少なくとも２種のプライマーを含む（より好ましくは、少なくとも３種であり、最も好ましくは、少なくとも５種である）。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、前増幅された核酸配列である。
４．ＴＨＤプライマーを利用したリアルタイムターゲット増幅アッセイ
第四のプロトコールによると、正方向プライマー及び逆方向プライマーから構成されて、これらの少なくとも一つのプライマーがターゲット核酸配列にハイブリッド形成されるＴＨＤプライマーである一対のプライマーが伸長される場合、プライマー５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより、二つのプライマーで５’−切断反応が起こり、標識がＴＨＤプライマーから放出されて、これにより、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される（図３）。
正方向プライマー及び逆方向プライマーの少なくとも一つのプライマーはＴＨＤプライマーである一対のプライマーは、過程が反復的に行われる場合、ターゲット増幅及びシグナル増幅を両方ともすることができる。
本発明の好ましい具現例によると、本発明の方法は、下記の工程を含む：
（ａ）ターゲット核酸配列と一対のプライマーをハイブリッド形成させる工程であって、前記一対のプライマーは、正方向プライマー及び逆方向プライマーから構成されて、これらのうち、少なくとも一つのプライマーは、前記ターゲット核酸配列を増幅できる前記ＴＨＤプライマーであって、前記ＴＨＤプライマーは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）一つの標識または多数の標識を含む相互作用的標識システムを含む工程と、
（ｂ）鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより前記二つのプライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応が発生する条件下で、前記工程（ａ）の結果物を５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって、前記二つのプライマーは、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記ポリメラーゼ活性により伸長されて、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断され、前記二つのプライマーのうち、前記ＴＨＤプライマーから前記標識または前記相互作用的標識システムの少なくとも一つの標識が放出されて、これにより前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される工程と、
（ｃ）工程（ｂ）の前記結果物を変性させる工程と、
（ｄ）前記工程（ａ）−（ｃ）を少なくとも２回反復する工程であって、前記ターゲット核酸配列及び前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルの両方を増幅させる工程と、
（ｅ）前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルを検出する工程であって、前記検出は、工程（ｄ）の前記反復の各サイクルにおいて、工程（ｄ）の前記反復の終了時点で、または前記反復の間の指定時間間隔のそれぞれで行われて、このようなシグナルは、ターゲット核酸配列の存在を示す工程。
第四のプロトコールは、正方向プライマー及び逆方向プライマーから構成された一対のプライマーを利用する。二つのプライマーのうち、少なくとも一つは、ＴＨＤプライマーである。
本発明の好ましい具現例によると、工程（ａ）は、ＴＨＤプライマーに対して逆方向を有する少なくとも一つの追加的な標識プローブを利用して行われる。この場合、鋳型（即ち、ターゲット核酸配列）がより利用可能になって、ＴＨＤプライマーのハイブリッド形成に利用できる。
本発明の好ましい具現例によると、二つのプライマーは、両方とも工程（ｂ）で放出される一つの標識を有する。二つのプライマーに連結された標識は、互いに同一であるかまたは相異なっている。ＴＨＤプライマーのカウンターパートプライマーに有用な標識は、ＴＨＤプライマーで述べたものと同様である。好ましくは、標識は、ＦＲＥＴ標識である。
工程（ｂ）の前記結果物の変性は、工程（ｂ）で形成された二本鎖二合体が一本鎖核酸になるようにする。変性に対する方法は、熱、アルカリ、ホルムアミド、ウレア及びグリコサール処理、酵素方法（例えば、ヘリカーゼ反応）、及び結合タンパク質を含むが、これらに限定されるものではない。例えば、変性は、８０℃乃至１０５℃範囲の温度に熱を加えて達成できる。このような処理を達成するための一般的な方法は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（２００１）により提供される。
本発明は、ターゲット核酸配列のマルチプレックス検出に非常に適している。本発明者らが知る限りでは、本発明は、マルチプレックスリアルタイム検出が実現されるようにする唯一の方法である。
第四のプロトコールでは、図４ａに示したように、ＴＨＤプライマーの多様な組み合わせを製作することができる：（Ａ）正方向プライマーとしてＴＨＤプライマー；（Ｂ）逆方向プライマーとしてＴＨＤプライマー；及び（Ｃ）正方向プライマー及び逆方向プライマーとしてのＴＨＤプライマー。
図１５は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲ増幅に正方向プライマー、逆方向プライマー、または両方のプライマーとしてのＴＨＤプライマーを利用した図４ａにおけるプライマー組み合わせの結果を示す。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み（より好ましくは、少なくとも３種であり、最も好ましくは、少なくとも５種である）、前記ＴＨＤプライマーは、少なくとも２種のプライマーを含み（より好ましくは、少なくとも３種であり、最も好ましくは、少なくとも５種である）、二つのプライマーのそれぞれは、少なくとも２種のプライマーを含む（より好ましくは、少なくとも３種であり、最も好ましくは、少なくとも５種である）。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、前増幅された核酸配列である。本発明の方法において、初期物質として前増幅された核酸配列を利用する場合、ターゲット検出における感度及び特異性が大きく改善されるようにｎｅｓｔｅｄ増幅が誘導される。
５．ＴＨＤプライマー及び標識プローブを利用したリアルタイムターゲット増幅アッセイ
第五のプロトコールは、正方向プライマー及び逆方向プライマーの少なくとも一つのプライマーがＴＨＤプライマーである一対のプライマーだけではなく、標識プローブを利用する。標識プローブは、検出可能なシグナルを発生する標識を有して、標識プローブは、ＴＨＤプライマーがハイブリッド形成される位置の下流位置にハイブリッド形成されて、ＴＨＤプライマーと同一な方向性を有して、続く工程で切断される。二つのプライマーがターゲット核酸配列とハイブリッド形成されて伸長される場合、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより二つのプライマーで５’−切断反応が起こり、標識が、二つのプライマーのうち、ＴＨＤプライマーから放出されて、前記標識プローブは、その３’−末端が修飾されて鋳型依存的核酸ポリメラーゼによる伸長が防止され、前記二つのプライマー間の一位置にハイブリッド形成されて、切断され前記標識プローブに連結された標識が放出されて、これにより、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される（図４ｂ）。
本発明の好ましい具現例によると、本発明の方法は、下記の工程を含む：
（ａ）前記ターゲット核酸配列と一対のプライマー及び追加的な標識プローブをハイブリッド形成させる工程であって、前記一対のプライマーは、前記ターゲット核酸配列を増幅できる正方向プライマー及び逆方向プライマーから構成されて、これらのうち、少なくとも一つのプライマーは、前記ＴＨＤプライマーであって、前記ＴＨＤプライマーは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）一つの標識または多数の標識を含む相互作用的標識システムを含み、前記標識プローブは、その３’−末端が修飾されて、鋳型依存的核酸ポリメラーゼによる伸長が防止されて、前記二つのプライマー間の一位置にハイブリッド形成される工程と、
（ｂ）鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより前記二つのプライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応が発生する条件下で、前記工程（ａ）の結果物を５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって、前記二つのプライマーは、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記ポリメラーゼ活性により伸長されて、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断され、前記二つのプライマーのうち、前記ＴＨＤプライマーから前記標識または前記相互作用的標識システムの少なくとも一つの標識が放出されて、前記標識プローブは、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断され、前記プローブから標識が放出されて、これにより前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される工程と、
（ｃ）工程（ｂ）の前記結果物を変性させる工程と、
（ｄ）前記工程（ａ）−（ｃ）を少なくとも２回反復する工程であって、前記ターゲット核酸配列及び前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルの両方を増幅させる工程と、
（ｅ）前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルを検出する工程であって、前記検出は、工程（ｄ）の前記反復の各サイクルにおいて、工程（ｄ）の前記反復の終了時点で、または前記反復の間の指定時間間隔のそれぞれで行われて、このようなシグナルは、ターゲット核酸配列の存在を示す工程。
本発明の好ましい具現例によると、工程（ａ）は、ＴＨＤプライマーに対して逆方向を有する少なくとも一つの追加的なプライマーを利用して行われる。この場合、鋳型（即ち、ターゲット核酸配列）がより利用可能になって、ＴＨＤプライマー及び上流プライマー（または下流プライマー）のハイブリッド形成に利用できる。
本発明の好ましい具現例によると、二つのプライマーは、両方とも工程（ｂ）で放出される標識を有する。二つのプライマーに連結された標識は、互いに同一であるかまたは相異なっている。ＴＨＤプライマーのカウンターパートプライマーに有用な標識は、ＴＨＤプライマーで述べたものと同様である。好ましくは、標識は、ＦＲＥＴ標識である。
第五のプロトコールでは、図４ｂに示したように、プライマー対及び標識プローブの多様な組み合わせを製作することができる：（Ａ）正方向プライマーとしてＴＨＤプライマー；（Ｂ）逆方向プライマーとしてＴＨＤプライマー；及び（Ｃ）正方向プライマー及び逆方向プライマーとしてＴＨＤプライマー。
図１６は、図４ｂに例示されたプライマー組み合わせの結果を示し、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲ増幅において、標識プローブと共に、正方向プライマー、逆方向プライマー、または両方のプライマーとしてのＴＨＤプライマーを利用する。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み（より好ましくは、少なくとも３種であり、最も好ましくは、少なくとも５種である）、前記ＴＨＤプライマーは、少なくとも２種のプライマーを含み（より好ましくは、少なくとも３種であり、最も好ましくは、少なくとも５種である）、正方向プライマー及び逆方向プライマーとしての二つのプライマーのそれぞれは、少なくとも２種のプライマーを含み（より好ましくは、少なくとも３種であり、最も好ましくは、少なくとも５種である）、標識プローブは、少なくとも２種のプローブを含む（より好ましくは、少なくとも３種であり、最も好ましくは、少なくとも５種である）。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、前増幅された核酸配列である。
６．ＴＨＤプライマー及び上流プライマー（または下流プライマー）を利用したリアルタイムターゲット増幅アッセイ
第六のプロトコールによると、ターゲット核酸配列にハイブリッド形成される（ｉ）正方向プライマー及び逆方向プライマーのうち、少なくとも一つのプライマーがＴＨＤプライマーである一対のプライマー、及び（ｉｉ）上流プライマー（また下流プライマー）が伸長される場合、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより二つのプライマー及び／または上流プライマー（また下流プライマー）で５’−切断反応が起こり、標識が、二つのプライマーのうち、ＴＨＤプライマーから放出されて、これにより、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される。
本発明の好ましい具現例によると、本発明の方法は、下記の工程を含む：
（ａ）前記ターゲット核酸配列と一対のプライマー及び上流プライマー（または下流プライマー）をハイブリッド形成させる工程であって、前記一対のプライマーは、正方向プライマー及び逆方向プライマーから構成されて、これらのうち、少なくとも一つのプライマーはＴＨＤプライマーであって、前記ＴＨＤプライマーは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）一つの標識または多数の標識を含む相互作用的標識システムを含み、前記上流プライマーは、ＴＨＤプライマーがハイブリッド形成される位置の上流位置にハイブリッド形成されて、ＴＨＤプライマーと同一な方向性を有し、前記下流プライマーは、ＴＨＤプライマーがハイブリッド形成される位置の下流位置にハイブリッド形成されて、ＴＨＤプライマーと同一な方向性を有する工程と、
（ｂ）鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより前記二つのプライマー及び上流プライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応が発生する条件下で、前記工程（ａ）の結果物を５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって、前記二つのプライマー及び上流プライマー（または下流プライマー）は、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記ポリメラーゼ活性により伸長されて、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断され、前記二つのプライマーのうち、前記ＴＨＤプライマーから前記標識または前記相互作用的標識システムの少なくとも一つの標識が放出されて、これにより前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される工程と、
（ｃ）工程（ｂ）の前記結果物を変性させる工程と、
（ｄ）前記工程（ａ）−（ｃ）を少なくとも２回反復する工程であって、前記ターゲット核酸配列及び前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルの両方を増幅させる工程と、
（ｅ）前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルを検出する工程であって、前記検出は、工程（ｄ）の前記反復の各サイクルにおいて、工程（ｄ）の前記反復の終了時点で、または前記反復の間の指定時間間隔のそれぞれで行われて、このようなシグナルは、ターゲット核酸配列の存在を示す工程。
本発明の好ましい具現例によると、工程（ａ）は、ＴＨＤプライマーに対して逆方向を有する少なくとも一つの追加的なプライマーを利用して行われる。この場合、鋳型（即ち、ターゲット核酸配列）がより利用可能になって、ＴＨＤプライマー及び上流プライマー（または下流プライマー）のハイブリッド形成に利用できる。
本発明の好ましい具現例によると、前記ＴＨＤプライマーだけではなく、他のプライマーも検出可能なシグナルを発生させる標識を有する。プライマーに連結された標識は、互いに同一であるかまたは相異なっている。プライマーに有用な標識は、ＴＨＤプライマーで述べたものと同様である。好ましくは、標識は、ＦＲＥＴ標識である。
第六のプロトコールにおいて、プライマー対及び上流プライマーの多様な組み合わせを、図４ｃに示したように製作することができる：（Ａ）正方向プライマー及び上流プライマーとしてＴＨＤプライマー；（Ｂ）正方向プライマー及び逆方向プライマーとしてＴＨＤプライマー；及び（Ｃ）正方向プライマー、上流プライマー及び逆方向プライマーとしてＴＨＤプライマー；（Ｄ）正方向プライマーとしてＴＨＤプライマー。
図１７は、図４ｃに例示されたプライマー組み合わせの結果を示し、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲ増幅において、正方向プライマーとしてのＴＨＤプライマーと共に、追加的に上流プライマー、逆方向プライマー、または両方のプライマーとしてのＴＨＤプライマーを利用する。
第六のプロトコールでは、図４ｄに示したように、プライマー対及び下流プライマーの多様な組み合わせを製作することができる：（Ａ）正方向プライマーとしてＴＨＤプライマー；（Ｂ）逆方向プライマーとしてＴＨＤプライマー；及び（Ｃ）正方向プライマー及び逆方向プライマーとしてＴＨＤプライマー。
図１８は、図４ｄに例示されたプライマー組み合わせの結果を示し、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲ増幅に、内部プライマーと、追加的に正方向プライマー、逆方向プライマー、または両方のプライマーとしてのＴＨＤプライマーを利用する。
図４ｄにおいて、下流プライマーは、内部プライマーとして表現できる。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み（より好ましくは、少なくとも３種であり、最も好ましくは、少なくとも５種である）、正方向プライマー及び逆方向プライマーとしての二つのプライマーのそれぞれは、少なくとも２種のプライマーを含み（より好ましくは、少なくとも３種であり、最も好ましくは、少なくとも５種である）、上流プライマーは、少なくとも２種のプローブを含む（より好ましくは、少なくとも３種であり、最も好ましくは、少なくとも５種である）。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、前増幅された核酸配列である。
好ましい具現例：ＴＨＤプライマーを利用したリアルタイムＰＣＲアッセイ
第四〜第六のプロトコールは、正方向プライマー及び逆方向プライマーの少なくとも一つのプライマーがＴＨＤプライマーである、ターゲット核酸配列を増幅できる一対のプライマーを利用する。したがって、反応の繰り返しは、ターゲット核酸配列の増幅が伴われる。好ましくは、前記増幅は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって行われて、これは、Ｕ．Ｓ．特許番号４，６８３，１９５， ４，６８３，２０２及び４，８００，１５９に開示されている。
本発明の好ましい具現例によると、本発明は、
（ａ）ターゲット核酸配列、一対のプライマー及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼを含むＰＣＲ混合物を準備する工程であって、前記一対のプライマーは、前記ターゲット核酸配列を増幅できる二つのプライマーを含み、これらのうち、少なくとも一つのプライマーは、前記ＴＨＤプライマーであって、前記ＴＨＤプライマーは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子の一対を含み、前記クエンチャー分子は、前記ＴＨＤプライマー上に前記レポーター分子の蛍光をクエンチングするように位置して、二つの標識は、ヌクレアーゼ切断が起こるＴＨＤプライマー内の一位置により分割されており、これによって前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性は、前記位置における切断反応により前記クエンチャー分子から前記レポーター分子を分離させて、これは、前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルが発生されるようにする工程と、
（ｂ）前記ＰＣＲ混合物を利用して前記ターゲット核酸配列を増幅させる工程であって、プライマーアニーリング、プライマー伸長及び変性を少なくとも２回行って、前記二つのプライマーは、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性により伸長されて、ターゲット核酸配列を増幅して、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断されて、二つのプライマーのうち、前記ＴＨＤプライマーから前記レポーター分子または前記クエンチャー分子が放出されて、これにより前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される工程と、
（ｃ）前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記蛍光シグナルを検出する工程であって、前記検出は、工程（ｂ）の前記反復の各サイクルにおいて、工程（ｃ）の前記反復の終了時点で、または前記反復の間の指定時間間隔のそれぞれで行われて、このようなシグナルは、ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、
を含み、ターゲットハイブリダイゼーション及び検出プライマー（ＴＨＤ ｐｒｉｍｅｒ）の５’−切断反応及び３’−伸長反応を伴うポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用してＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する発明である。
第四のプロトコールで述べたように、リアルタイムＰＣＲ反応におけるＴＨＤプライマーの多様な組み合わせが提示できる：（Ａ）正方向プライマーとしてＴＨＤプライマー；（Ｂ）逆方向プライマーとしてＴＨＤプライマー；及び（Ｃ）正方向プライマー及び逆方向プライマーとしてのＴＨＤプライマー。
本発明の好ましい具現例によると、ＰＣＲ混合物は、正方向プライマー及び逆方向プライマーの少なくとも一つのプライマーがＴＨＤプライマーである一対のプライマー、上流プライマー（または下流プライマー）及び５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼを含み、前記上流プライマーは、前記ＴＨＤプライマーがハイブリッド形成される位置の上流位置にハイブリッド形成されて、前記ＴＨＤプライマーと同一な方向を有する。
本発明の好ましい具現例によると、ＰＣＲ混合物は、二つのプライマーのうち、少なくとも一つのプライマーがＴＨＤプライマーである一対のプライマー及び検出可能なシグナルを発生する標識を有する標識プローブを含み、前記標識プローブは、その３’−末端が修飾されて鋳型依存的核酸ポリメラーゼによる伸長が防止され、前記二つのプライマー間の一位置にハイブリッド形成される。
本発明の好ましい具現例によると、このプロトコールは、ＴＨＤプライマーだけではなく、標識プローブからもシグナルが発生するため、プライマー対のみを利用したプロトコールに比べ、ターゲット核酸配列に対してさらに高いシグナル強度を発生させることができる。
本発明の好ましい具現例によると、工程（ａ）は、ＴＨＤプライマーに対して逆方向を有する少なくとも一つの追加的なプライマーを利用して行われる。この場合、鋳型（即ち、ターゲット核酸配列）がより利用可能になって、ＴＨＤプライマーのハイブリッド形成に利用できる。
本発明の好ましい具現例によると、工程（ｃ）の前記検出は、リアルタイム方式、エンド−ポイント（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ）方式または指定時間間隔（ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｔｉｍｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ）方式で行われる。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み（より好ましくは、少なくとも３種であり、最も好ましくは、少なくとも５種である）、正方向プライマー及び逆方向プライマーとしての二つのプライマーのそれぞれは、少なくとも２種のプライマーを含む（より好ましくは、少なくとも３種であり、最も好ましくは、少なくとも５種である）。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み（より好ましくは、少なくとも３種であり、最も好ましくは、少なくとも５種である）、正方向プライマー及び逆方向プライマーとしての二つのプライマーのそれぞれは、少なくとも２種のプライマーを含み（より好ましくは、少なくとも３種であり、最も好ましくは、少なくとも５種である）、上流プライマー（または下流プライマー）は、少なくとも２種のプライマーを含む（より好ましくは、少なくとも３種であり、最も好ましくは、少なくとも５種である）。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み（より好ましくは、少なくとも３種であり、最も好ましくは、少なくとも５種である）、正方向プライマー及び逆方向プライマーとしての二つのプライマーのそれぞれは、少なくとも２種のプライマーを含み（より好ましくは、少なくとも３種であり、最も好ましくは、少なくとも５種である）、標識プローブは、少なくとも２種のプローブを含む（より好ましくは、少なくとも３種であり、最も好ましくは、少なくとも５種である）。
本発明の好ましい具現例によると、ＴＨＤプライマーだけではなく、他のプライマーも検出可能なシグナルを発生する標識を有する。プライマーに連結された標識は、互いに同一であるかまたは相異なっている。プライマーに有用な標識は、ＴＨＤプライマーで述べたものと同様である。好ましくは、標識は、ＦＲＥＴ標識である。
ＴＨＤプライマーだけではなく、他のプライマーも標識を有する場合、ＴＨＤプライマーだけではなく他のプライマーからもシグナルが発生するため、ＴＨＤプライマーのみを利用したプロトコールに比べ、ターゲット核酸配列に対してさらに高いシグナル強度を発生させることができる。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット核酸配列は、前増幅された核酸配列である。
本発明の好ましい具現例によると、利用されるＴＨＤプライマーは、下記一般式Ｉの二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有するか、または下記一般式ＩＩの修飾二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する：
５’−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−３’ （Ｉ）
（式中、Ｘｐは、ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第１プライミング部位であり、Ｙｑは、少なくとも三つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚｒは、ターゲット配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第２プライミング部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ、Ｙ及びＺは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであり、５’−第１プライミング部位のＴｍは、３’−第２プライミング部位のＴｍより高く、前記分割部位は、前記三つの領域のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、ターゲット核酸配列に対するアニーリングに関して、５’−第１プライミング部位を３’−第２プライミング部位から分割し、これにより、前記オリゴヌクレオチドの前記アニーリング特異性が、５’−第１プライミング部位及び３’−第２プライミング部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＨＤプライマーの全体アニーリング特異性を向上させる。）
５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （ＩＩ）
（式中、Ｘ’ｐは、ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第２プライミング部位であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’ｒは、ターゲット配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第１プライミング部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであり、５’−第２プライミング部位のＴｍは、３’−第１プライミング部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記Ｘ’ｐ、Ｙ’ｑ及びＺ’ｒの三つの領域のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、ターゲット核酸に対するアニーリングに関して、前記５’−第２プライミング部位を前記３’−第１プライミング部位から分割し、これにより、前記オリゴヌクレオチドの前記アニーリング特異性が、前記５’−第２プライミング部位及び前記３’−第１プライミング部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＨＤプライマーの全体アニーリング特異性を向上させる。）
より好ましくは、ＴＨＤプライマーは、一般式Ｉの二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有する。
ｍＤＳＯ構造を有するＴＨＤプライマーは、上流プライマーを利用する第三及び第四のプロトコールに好適である。ＤＰＯを有するＴＨＤプライマーは、他のプロトコールに好適である。
ＤＳＯ（ｄｕａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）のプライマー形態であるＤＰＯ構造は、本発明者らにより最初に提示された（参照ＷＯ ２００６／０９５９８１；Ｃｈｕｎ ｅｔ ａｌ．， Ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ＳＮＰ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ＣＹＰ２Ｃ１９ ｇｅｎｅ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ３５：６ｅ４０（２００７））。ｍＤＳＯ構造は、ＤＰＯ構造の新規に修飾された形態であり、これは、本発明者らにより最初に提示された（参照ＷＯ ２００６／０９５９８１）。
ＤＳＯは、ハイブリッド形成またはアニーリングが分割領域により互いに分離された５’−高Ｔｍ特異性部位（または５’−第１ハイブリッド形成部位、５’−第１プライミング部位）及び３’−低Ｔｍ特異性部位（または３’−第２ハイブリッド形成部位、３’−第２プライミング部位）により二重的に決定されるようにする新規な概念を具現したもので、非常に驚くべきアニーリング特異性を示す（参照：ＷＯ ２００６／０９５９８１； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｒｅｃｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｍｕｔａｎｔｓ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ ｄｕａｌ−ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒｓ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， １４９：７６−８４（２００８）； Ｋｉｍ， ｅｔ． ａｌ．， Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ １２ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｖｉｒｕｓｅｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｓｔｅｍ−ｂａｓｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ａｓｓａｙ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｖｉｒｏｍｅｔ．２００８．１１．００７（２００８）； Ｈｏｒｉｉ ｅｔ． ａｌ．， Ｕｓｅ ｏｆ ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｓｅｘｕａｌｌｙ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ， Ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ｄｏｉ：１０．１１１／ｊ．１４７２−７６５Ｘ２００９．０２６１８ｘ（２００９）））。上述のように、ＤＳＯは、互いに異なるハイブリッド形成特性を有する二つのプライマー部分（ｓｅｇｍｅｎｔ）、すなわち、初期の安定したハイブリッド形成を招来する５’−第１プライミング部位；及びターゲット特異性を決定する３’−第２プライミング部位を究極的に有するようになる。
ｍＤＳＯ構造は、前記ＤＳＯ構造が逆転されたものである：ターゲット特異性を決定する５’−第２プライミング部位（または５’−第２ハイブリッド形成部位）及び初期の安定したハイブリッド形成を招来する３’−第１プライミング部位（または３’−第１ハイブリッド形成部位）。
本発明の好ましい具現例によると、分割部位に位置するユニバーサル塩基は、デオキシイノシン、イノシン、７−デアザ−２’−デオキシイノシン、２−アザ−２’−デオキシイノシン、２’−ＯＭｅイノシン、２’−Ｆイノシン、デオキシ３−ニトロピロール、３−ニトロピロール、２’−ＯＭｅ３−ニトロピロール、２’−Ｆ３−ニトロピロール、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、デオキシ５−ニトロインドール、５−ニトロインドール、２’−ＯＭｅ５−ニトロインドール、２’−Ｆ５−ニトロインドール、デオキシ４−ニトロベンズイミダゾール、４−ニトロベンズイミダゾール、デオキシ４−アミノベンズイミダゾール、４−アミノベンズイミダゾール、デオキシネブラリン、２’−Ｆネブラリン、２’−Ｆ４−ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ−５−イントロインドール、ＰＮＡ−ネブラリン、ＰＮＡ−イノシン、ＰＮＡ−４−ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ−３−ニトロピロール、モルフォリノ−５−ニトロインドール、モルフォリノ−ネブラリン、モルフォリノ−イノシン、モルフォリノ−４−ニトロベンズイミダゾール、モルフォリノ−３−ニトロピロール、ホスホルアミデート−５−ニトロインドール、ホスホルアミデート−ネブラリン、ホスホルアミデート−イノシン、ホスホルアミデート−４−ニトロベンズイミダゾール、ホスホルアミデート−３−ニトロピロール、２’−Ｏ−メトキシエチルイノシン、２’−Ｏ−メトキシエチルネブラリン、２’−Ｏ−メトキシエチル５−ニトロインドール、２’−Ｏ−メトキシエチル４−ニトロ−ベンズイミダゾール、２’−Ｏ−メトキシエチル３−ニトロピロール、及び前記塩基の組み合せからなる群から選択される。より好ましくは、ユニバーサル塩基は、デオキシイノシン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロールまたは５−ニトロインドールであり、最も好ましくは、デオキシイノシンである。
好ましくは、前記分割部位は、少なくとも３ユニバーサル塩基、より好ましくは、少なくとも４ユニバーサル塩基、最も好ましくは、少なくとも５ユニバーサル塩基を有する連続したヌクレオチドを含む。
好ましくは、ＤＰＯ構造の５’−第１プライミング部位の長さは、３’−第２プライミング部位より長い。５’−第１プライミング部位は、好ましくは、１５〜６０ヌクレオチドの長さを有して、より好ましくは、１５〜４０ヌクレオチド、さらに好ましくは、１５〜２５ヌクレオチドの長さを有する。好ましくは、前記３’−第２プライミング部位は、好ましくは、３〜１５ヌクレオチドの長さを有して、より好ましくは、５〜１５ヌクレオチド、最も好ましくは、６〜１３ヌクレオチドの長さを有する。好ましくは、前記分割部位は、３〜１０ヌクレオチド、より好ましくは、４〜８ヌクレオチド、最も好ましくは、５〜７ヌクレオチドの長さを有することが好ましい。本発明の好ましい具現例によると、５’−第１プライミング部位は、４０℃〜８０℃のＴｍを有して、より好ましくは、４５℃〜６５℃のＴｍを有する。前記３’−第２プライミング部位は、好ましくは、１０℃〜４０℃のＴｍを有する。前記分割部位は、好ましくは、３℃〜１５℃のＴｍを有する。
好ましくは、ｍＤＳＯ構造の３’−第１プライミング部位（または３’−第１ハイブリッド形成部位）の長さは、５’−第２プライミング部位（または５’−第２ハイブリッド形成部位）より長い。前記３’−第１プライミング部位は、好ましくは、１５〜６０ヌクレオチドの長さを有して、より好ましくは、１５〜４０ヌクレオチド、さらに好ましくは、１５〜２５ヌクレオチドの長さを有する。好ましくは、前記５’−第２プライミング部位は、３〜１５ヌクレオチドの長さを有して、より好ましくは、５〜１５ヌクレオチド、最も好ましくは、６〜１３ヌクレオチドの長さを有する。好ましくは、前記分割部位は、３〜１０ヌクレオチド、より好ましくは、４〜８ヌクレオチド、最も好ましくは、５〜７ヌクレオチドの長さを有する。
本発明の好ましい具現例によると、前記３’−第１プライミング部位は、４０℃〜８０℃のＴｍを有して、より好ましくは、４５℃〜６５℃のＴｍを有する。前記５’−第２プライミング部位は、好ましくは、１０℃〜４０℃のＴｍを有する。前記分割部位は、好ましくは、３℃〜１５℃のＴｍを有する。
本発明の好ましい具現例によると、標識プローブは、下記一般式ＩＩの修飾二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する：
５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （ＩＩ）
（式中、Ｘ’ｐは、ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第２プライミング部位（または５’−第２ハイブリッド形成部位）であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’ｒは、ターゲット配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第１プライミング部位（または３’−第１ハイブリッド形成部位）であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであり、５’−第２プライミング部位（または５’−第２ハイブリッド形成部位）のＴｍは、３’−第１プライミング部位（または３’−第１ハイブリッド形成部位）のＴｍより低く、前記分割部位は、前記三つの領域のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、ターゲット核酸に対するアニーリングに関して、前記５’−第２プライミング部位（または５’−第２ハイブリッド形成部位）を前記３’−第１プライミング部位（または３’−第１ハイブリッド形成部位）から分割し、これにより、前記オリゴヌクレオチドの前記アニーリング特異性が、前記５’−第２プライミング部位（または５’−第２ハイブリッド形成部位）及び前記３’−第１プライミング部位（または３’−第１ハイブリッド形成部位）により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記プローブの全体アニーリング特異性を向上させる。）
好ましくは、標識プローブのためのｍＤＳＯ構造の３’−第１プライミング部位（または３’−第１ハイブリッド形成部位）の長さは、５’−第２プライミング部位（または５’−第２ハイブリッド形成部位）より長い。前記３’−第１プライミング部位は、好ましくは、１５〜６０ヌクレオチドの長さを有して、より好ましくは、１５〜４０ヌクレオチド、さらに好ましくは、１５〜２５ヌクレオチドの長さを有する。好ましくは、前記５’−第２プライミング部位は、３〜１５ヌクレオチドの長さを有して、より好ましくは、５〜１５ヌクレオチド、最も好ましくは、６〜１３ヌクレオチドの長さを有する。好ましくは、前記分割部位は、３〜１０ヌクレオチド、より好ましくは、４〜８ヌクレオチド、最も好ましくは、５〜７ヌクレオチドの長さを有する。
本発明の好ましい具現例によると、前記３’−第１プライミング部位（または３’−第１ハイブリッド形成部位）は、４０℃〜８０℃のＴｍを有して、より好ましくは、４５〜６５℃のＴｍを有する。前記５’−第２プライミング部位（または５’−第２ハイブリッド形成部位）は、好ましくは、１０℃〜４０℃のＴｍを有する。前記分割部位は、好ましくは、３〜１５℃のＴｍを有する。
本発明の好ましい具現例によると、上流プライマーまたは下流プライマーは、下記一般式Ｉの二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有する：
５’−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−３’ （Ｉ）
（式中、Ｘｐは、ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第１プライミング部位であり、Ｙｑは、少なくとも三つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚｒは、ターゲット配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第２プライミング部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ、Ｙ及びＺは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであり、５’−第１プライミング部位のＴｍは、３’−第２プライミング部位のＴｍより高く、前記分割部位は、前記三つの領域のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、ターゲット核酸配列に対するアニーリングに関して、前記５’−第１プライミング部位を３’−第２プライミング部位から分割し、これにより、前記オリゴヌクレオチドの前記アニーリング特異性が、前記５’−第１プライミング部位及び前記３’−第２プライミング部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記上流プライマーの全体アニーリング特異性を向上させる。）
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット増幅に利用されたプライマー（即ち、カウンターパートプライマー）及びＴＨＤプライマーは、下記一般式Ｉの二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有する：
５’−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−３’ （Ｉ）
（式中、Ｘｐは、ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第１プライミング部位であり、Ｙｑは、少なくとも三つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚｒは、ターゲット配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第２プライミング部位であり、ｐ， ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ， Ｙ及びＺは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであり、５’−第１プライミング部位のＴｍは、３’−第２プライミング部位のＴｍより高く、前記分割部位は、前記三つの領域のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、ターゲット核酸配列に対するアニーリングに関して、前記５’−第１プライミング部位を３’−第２プライミング部位から分割し、これにより、前記オリゴヌクレオチドの前記アニーリング特異性が、前記５’−第１プライミング部位及び前記３’−第２プライミング部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記プライマーの全体アニーリング特異性を向上させる。）
ターゲット核酸を検出するためにプライマーを利用する従来技術は、使用されるプライマーの内在的限界のため、エラーシグナルから十分に自由ではない。しかし、そのような意図的デザインのＤＰＯまたはｍＤＳＯ構造を含むＴＨＤプライマー、標識プライマー、上流プライマー及び逆方向プライマーは、顕著に向上された特異性でターゲット核酸配列にハイブリッド形成され、エラーシグナル無しにターゲット核酸配列が検出されるようにする。
本明細書において、プライマーまたはプローブを言及しながら使用される用語‘標準的な’は、ＤＰＯまたはｍＤＳＯ構造を含まない全てのプライマーまたはプローブを意味する。それらは、本明細書において標準的なプライマーまたは標準的なプローブとして説明される。
ターゲット核酸配列とのハイブリッド形成後、鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより前記ＴＨＤプライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応が発生する条件下で、前記工程（ａ）の結果物を５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させて；前記ＴＨＤプライマーは、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記ポリメラーゼ活性により伸長されて、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断され、前記ＴＨＤプライマーから前記標識または前記相互作用的標識システムの少なくとも一つの標識が放出されて、これにより前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される。
表現‘鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより前記ＴＨＤプライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応が発生する条件下で’は、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより前記ＴＨＤプライマーの３’−末端における伸長反応及び５’−末端または５’−末端部位における切断反応が誘導されるに十分な条件を意味する。このような条件は、従来核酸ポリメラーゼによるプライマー伸長のための条件に従うことができる。例えば、条件は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（２００１）で確認することができる。実施例から分かるように、条件には、適する時間の間、相対的に高温（例えば、５０〜７５℃）におけるターゲット核酸配列、ＴＨＤプライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）、ｄＮＴＰｓ及びＭｇＣｌ２のインキュベーションが含まれる。
表現‘鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより二つのプライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応が発生する条件下で’は、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより、ターゲットを増幅する前記プライマー対（正方向プライマー及び逆方向プライマー）の３’−末端における伸長反応及び５’−末端または５’−末端部位における切断反応が誘導されるに十分な条件を意味する。条件の詳細な説明は、上述と同様である。
本発明の好ましい具現例によると、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり、これは、多様なバクテリア種から得ることができて、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｈｅｒｍｉｓ ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌｉｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ （Ｐｆｕ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｌａｃｔｅｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｏｓｈｉｍａｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｎｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｉｌｖａｎｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｚ０５、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｓｐｓ １７、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ及びＴｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓを含む。最も好ましくは、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼである。
最終的に、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが検出される。シグナル検出は、反復の各サイクルにおいて、反復の終了時点で、または反復の間の指定時間間隔のそれぞれで行うことができる。好ましくは、シグナル検出は、反復の各サイクルで行って、これは、検出の正確性を向上させる。
本発明は、検出及び／または増幅しようとするターゲット核酸配列に対して、特定配列または長さを必要としない。ＲＮＡターゲット配列は、ｃＤＮＡで逆転写されなければならない（Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（２００１）； 及びＮｏｏｎａｎ， Ｋ． Ｆ．ら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：１０３６６ （１９８８）。特に、本発明で検出及び／または増幅できるターゲット核酸配列は、如何なる核酸分子、例えば、ＤＮＡ（ｇＤＮＡまたはｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子も全て含む。ターゲット核酸配列は、如何なる天然（Ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）の原核細胞核酸、真核細胞（例えば、原生動物と寄生動物、菌類、酵母、高等植物、下等動物、及び哺乳動物と人間を含む高等動物）核酸、ウイルス（例えば、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、 Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス、肝炎ウイルス、ポリオウイルスなど）核酸、またはウイロイド核酸も全て含む。
ターゲット核酸配列にハイブリッド形成されたＴＨＤプライマーは、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより切断されて、ＴＨＤプライマーに連結された標識が放出され、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される。シグナルは各標識にとって公知の方法により、検出または測定することができる。例えば、標識が酵素を含む場合、シグナルは、酵素に対する基質を利用して検出される。金属標識として金粒子が利用される場合、シグナルは、硝酸銀を利用したシルバーステイニング方法を利用して検出する。蛍光シグナルは、従来の方法、例えば、蛍光強度測定器を利用して検出するか測定することができる。
検出されるシグナルは、標識自体から直接的に得てもよく、連続的な標識関連反応から間接的に得てもよい。また、検出されるシグナルは、放出された標識または残留した標識（切断されたヌクレオチドに含まれていない）（例えば、相互作用する標識システム）から得てもよい。
少なくとも二つのターゲット核酸配列が同時に検出されるという点に本発明の格別な利点がある。本発明の好ましい具現例によると、反応において多数のターゲット核酸配列を同時に検出することができる。
また、本発明は、ヌクレオチド変異の検出において非常に有用である。本発明で使用される用語‘ヌクレオチド変異（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）’は、連続的ＤＮＡ断片または配列が類似したＤＮＡ断片において、特定位置に存在するＤＮＡ配列のヌクレオチド多様性を意味する。そのような連続的ＤＮＡ断片は、一つの遺伝子または一つの染色体のある他の部位を含む。例えば、本発明の方法により検出できるヌクレオチド変異は、欠失、挿入、置換を含む。ヌクレオチド変異の例は、ヒトゲノムにある多様な変異（例えば、ＭＴＨＦＲ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）遺伝子の変異）、薬剤耐性病原体のヌクレオチド変異及び癌発生−関連ヌクレオチドの変異を含む。
好ましくは、本発明で検出されるヌクレオチド変異は、塩基置換であり、より好ましくは、ＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）及び点突然変異である。
本発明の他の様態によると、本発明は、
（ａ）（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）一つの標識または多数の標識を含む相互作用的標識システムを含むＴＨＤプライマーと、
（ｂ）５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼ（前記ＴＨＤプライマーが前記ターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合、前記ＴＨＤプライマーは、前記核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性により伸長されて、前記ＴＨＤプライマーは、前記核酸ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断され、前記ＴＨＤプライマーから前記標識または前記相互作用的標識システムの少なくとも一つの標識が放出されて、これにより前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される）と、
を含み、ターゲットハイブリダイゼーション及び検出プライマー（ＴＨＤ ｐｒｉｍｅｒ）の５’−切断反応及び３’−伸長反応を利用してＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキットを提供する。
本発明の好ましい具現例によると、前記キットは、ターゲット増幅のための追加的なプライマー、ＴＨＤプライマー、上流プライマー、下流プライマー、標識プローブ、またはこれらの組み合わせを追加的に含む。
本発明の好ましい具現例によると、ターゲット増幅のための追加的なプライマー、上流プライマー及び／または下流プライマーは、標識を有する。
プライマーまたは標識プローブに有用な標識は、ＴＨＤプライマーで述べたものと同様である。好ましくは、標識は、ＦＲＥＴ標識である。
また、標識プローブ及び標識されたプライマーは、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより切断され、標識がそれらから放出されて、ターゲット核酸配列の存在を示す二種の異なるシグナルが提供する。
本発明のキットは、上述の本発明の検出方法を実施して構成されるため、その重複する内容は、本明細書の複雑性を避けるために、その記載を省く。
本発明のキットは、バッファー、ＤＮＡポリメラーゼ助因子及びデオキシリボヌクレオチド−５−トリホスフェートのようなターゲット増幅ＰＣＲ反応（例えば、ＰＣＲ反応）に必要な試薬を選択的に含むことができる。また、選択的に本発明のキットは、多様なポリヌクレオチド分子、逆転写酵素、多様なバッファー及び試薬、及びＤＮＡポリメラーゼ活性を抑制する抗体を含むことができる。
また、キットは、陽性対照群及び陰性対照群反応を実施するに必須的な試薬を含むことができる。ある一つの特定反応で使用される試薬の最適量は、本明細書の開示事項を習得した当業者により容易に決定できる。典型的に、本発明のキットは、上記言及された構成成分を含む別途の包装または区分で製作される。
本発明の特徴と利点は、下記のように要約できる：
（ａ）従来のリアルタイムＰＣＲ方法は、標識プローブまたはヘアピン構造のように複雑に修飾されたプライマー構造を必要とし、これは、プローブ及びプライマーのデザイン、合成または配列の選択を難しくする。しかし、本発明のＴＨＤプライマーは、追加的な標識プローブまたは複雑に修飾されたプライマー構造無しに、ターゲット増幅だけではなく、シグナル増幅に利用されるため、リアルタイムＰＣＲのためのＴＨＤプライマーのデザイン、合成または配列の選択が相対的に簡単且つ容易である。
（ｂ）プライマーだけではなく、プローブに対しても最適化されたハイブリッド形成条件が従来のリアルタイムＰＣＲ反応に必須であるため、従来のリアルタイムＰＣＲ方法の最適化は難しい。ヘアピンループを形成するテイルを有するプライマーを利用する従来のリアルタイムＰＣＲ方法は、プライマーにおけるヘアピンループ形成及び修飾を考慮して反応条件を最適化する必要がある。しかし、本発明は、従来のリアルタイムＰＣＲ方法の最適化に係わる問題点及び短所から完璧に自由である。
（ｃ）実施例７で確認したように、（ｉ）正方向プライマー、逆方向プライマーまたは上流プライマーとしてのＴＨＤプライマーの多様な組み合わせ、または（ｉｉ）ＴＨＤプライマー及びプローブの多様な組み合わせは、ターゲット核酸配列が効果的に検出されるようにする。
（ｄ）従来のリアルタイムＰＣＲ方法は、プライマーまたはプローブのデザイン及び最適化が難しいため、マルチプレックスアッセイが適切ではない。それに対し、本発明は、リアルタイムＰＣＲにおいて、追加的なプローブまたは複雑に修飾されたプライマー構造無しに、標識されたプライマーだけを利用するため、マルチプレックス方式で卓越にリアルタイムにターゲット検出をすることが可能である。
（ｅ）従来のリアルタイムＰＣＲプローブと比較し、ＴＨＤプライマーは伸長されて、伸長されたＴＨＤプライマーは、ターゲット核酸配列に対してより高い結合力を示す。従来のリアルタイムＰＣＲプライマーは、ヘアピン構造のように複雑に修飾された構造を必要とし、これは、ターゲット核酸配列に結合することを妨害する。その反面、ＴＨＤプライマーは、そのような修飾を必要とせず、ＴＨＤプライマーがターゲット核酸配列とのよりよい結合効率を有する。この特徴は、本発明によるターゲット検出効率の向上に寄与する。
（ｆ）本発明は、一般にＰＣＲ反応に使用するプライマーを利用して、リアルタイムＰＣＲ反応を容易に実施することができる。要するに、ＰＣＲ反応でアンプリコンを生成させるプライマーは、成功的なリアルタイムＰＣＲ反応を保障する。したがって、本発明は、リアルタイムＰＣＲアッセイの開発において、時間的−及び費用的−効率性が改善されたと判断される。
（ｇ）上記論議のように、本発明で使用されるＤＰＯまたはｍＤＳＯ構造を有するプライマー及び／またはプローブは、リアルタイムＰＣＲ反応において、結合特異性の向上をもたらし、これにより、プライマー及び／またはプローブの非−ターゲット結合に係わる擬陽性シグナルが除去される。
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
実施例１：ターゲット核酸検出におけるＴＨＤプライマーの評価
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応下で、本発明のＴＨＤプライマーがターゲット核酸配列にアニーリングして、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼによりＴＨＤプライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応が実施され、ＴＨＤプライマー上に位置したクエンチャー分子から蛍光レポーター分子が分離される場合、二重−標識ＴＨＤプライマーがターゲット核酸配列を検出するに十分なシグナルを発生することができるかどうかを評価した。ＴＨＤプライマーは、レポーター分子として６−ＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）を有して、クエンチャー分子としてＢＨＱ−１（Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ １）を有する。標識の位置は、オリゴヌクレオチド配列に表示した。
この評価を実験するために、本発明者らは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ遺伝子をターゲット鋳型として利用して、実験便宜のために、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドを鋳型として利用した。ターゲット核酸配列の増幅のない指定時間間隔（ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｔｉｍｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ）でシグナルを測定した。
ターゲットであるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ遺伝子のシグナルの発生及び検出に対する方法及び結果は、本明細書に記載した。
本実施例で利用された合成鋳型及び二重標識ＴＨＤプライマーの配列は、下記の通りである：
ＳＡ−Ｔｅｍ：５’−ｇｃｃａａｔａａａａｃｔａｇｇａｇｇａａａｔｔｔａａａｔｇｔｔａｇａａｔｔｔｇａａｃａａｇｇａｔｔｔａａｔｃａｔｔｔａｇｃｇａｃｔｔｔａａａｇｇｔｃａｔｔｇｇｔｇｔａｇｇｔｇｇｔｇｇｃｇｇｔａａｃａａｃｇｃｃｇｔａａａｃｃｇａａｔｇａｔｔｇａｃｃａｃｇｇａａｔｇａａｔａａｔｇｔｔｇａａｔｔｔａｔｃｇｃｔａｔｃａａｃａｃａｇａｃｇｇｔｃａａｇｃｔｔｔａａａｃｔｔａｔｃｔａａａｇｃｔｇａａｔｃｔａａａ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；及び
ＳＡ−ＴＨＤ：５’−［６−ＦＡＭ］ＣＡＴＴＣＣＧ［ＢＨＱ１−ｄＴ］ＧＧＴＣＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＴＴ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）。
鋳型２ｐｍｏｌｅ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）， １０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有した２×マスターミックス１０μＬ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）２ユニット、４種のｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰｄＣＴＰｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）を各２００μＭ及び二重標識ＴＨＤプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）５ｐｍｏｌｅを含有した２０μＬの最終容量で、二重標識ＴＨＤプライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応を行った；前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）設置し；前記反応混合物を９５℃で１０分間変性させた後、５５℃または６５℃で６０秒過程を４０回繰り返した。指定時間間隔（ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｔｉｍｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ）による各サイクルで発生したシグナルを検出した。
図５に示されたように、ターゲット核酸配列の増幅がない場合の反応でも、指定時間間隔にある蛍光シグナルを、モニタリングによりＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに対する蛍光シグナルの増加をリアルタイム単位で観察した。また、５５℃（Ｎｏ．２）及び６５℃（Ｎｏ．４）間のシグナル差は表れなかった。鋳型がない場合、蛍光シグナルの変化がなかった（Ｎｏ．１及び３）。
実施例２：ターゲット核酸検出のためのリアルタイムＰＣＲ反応条件下におけるＴＨＤプライマーの評価
本発明者らは、リアルタイムＰＣＲ反応条件下で、変性、ハイブリッド形成、切断及び伸長の繰り返しをｄＮＴＰの多様な濃度に適用させた場合、ＴＨＤプライマーがターゲット核酸配列を検出するに十分なシグナルを発生することができるかどうかを追加的に確認した。
この評価を実験するために、本実施例１で利用されたのと同一な鋳型（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及び二重−標識ＴＨＤプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）をリアルタイムターゲットシグナル増幅に利用した。
多様な濃度のｄＮＴＰ（最終濃度５００μＭ、２００μＭ、２０μＭ及び０μＭ）を鋳型２ｐｍｏｌｅ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有した２×マスターミックス１０μＬ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、Ｋｏｒｅａ）２ユニット及び二重標識ＴＨＤプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）５ｐｍｏｌｅを含有した２０μＬの最終容量でリアルタイムターゲットシグナル増幅を行った；前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）設置し；前記反応混合物を９５℃で１０分間変性させた後、９４℃で３０秒、５５℃で９０秒及び７２℃で９０秒過程を４０回繰り返した。各サイクルの伸長工程（７２℃）で発生したシグナルを検出した。
図６に示されたように、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼがないか（Ｎｏ．１）または鋳型がない場合（ＮＯ．２）のような陰性対照群反応において、ターゲット核酸配列の蛍光シグナル増幅が表れなかった。このような結果は、ターゲット鋳型とＴＨＤプライマーのハイブリッド形成または一本鎖のＴＨＤプライマーの切断によってはシグナルの増幅が起こらないということを示す。一方、ｄＮＴＰがない場合（ＮＯ．６）だけではなく、ｄＮＴＰの異なる濃度下で（Ｎｏ．３、４及び５）、ターゲット核酸配列の蛍光シグナルを確認した。２０μＭ ｄＮＴＰの場合、Ｃｔ値が最も低く、シグナルの強度は最も高くて（Ｎｏ．５）、５００μＭ ｄＮＴＰの場合、Ｃｔ値が最も高くて、シグナルの強度が最も低かった（Ｎｏ．３）。
したがって、ターゲット核酸配列の増幅無しに、ＴＨＤプライマーを利用した変性、ハイブリッド形成、切断及び伸長の繰り返しがターゲット蛍光シグナルを発生させるに十分であり、これにより、リアルタイムシグナル増幅によるターゲット核酸配列の検出が可能になる。
実施例３：リアルタイムＰＣＲ増幅におけるＴＨＤプライマー及びプローブの相違点
プライマー及びプローブの最も大きい相違点は、プローブは、増幅産物に含まれないということである。ＴＨＤプライマーは、リアルタイムＰＣＲ増幅産物に含まれるが、プローブは、リアルタイムＰＣＲ条件下で含まれないことを確認するために、正方向プライマーとしてＴＨＤプライマーを利用してＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ遺伝子及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ遺伝子を検出するリアルタイムＰＣＲを実施した。
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ遺伝子のターゲット核酸配列を鋳型として利用する場合、本実施例で利用された正方向プライマーとしての二重標識ＴＨＤプライマー、逆方向プライマー及び二重標識プローブの配列は、下記の通りである：
ＳＰ−ＴＨＤ：５’−［６−ＦＡＭ］ＴＣＣＴＴＣＡＡＡＣＴＧＴＧＧＡＴＴ［ＢＨＱ１−ｄＴ］ＧＧＧＴＧＴ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）
ＳＰ−Ｐｒｏｂｅ：５’−［６−ＦＡＭ］ＴＣＣＴＴＣＡＡＡＣＴＧＴＧＧＡＴＴ［ＢＨＱ１−ｄＴ］ＧＧＧＴＧＴ［Ｐｈｏｓ−Ｑ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
ＳＰ−Ｐ２：５’−ＧＧＴＴＴＣＣＧＴＡＣＡＧＣＣＴＴＧＡ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅゲノムＤＮＡ１０ｎｇ、６ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有した２×ＱＩＡＧＥＮマルチプレックスマスターミックス１０μＬ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（ＱＩＡＧＥＮ）、二重標識ＴＨＤプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）１０ｐｍｏｌｅまたは二重標識プローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）１０ｐｍｏｌｅ、及び逆方向プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）１０ｐｍｏｌｅを含有した２０μＬの最終容量でリアルタイムＰＣＲを行った：前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）設置し；前記反応混合物を９５℃で１０分間変性させた後、９４℃で３０秒、６０℃で９０秒及び７２℃で９０秒過程を４０回繰り返した。各サイクルの伸長工程（７２℃）で発生したシグナルを検出した。エチジウムブロマイドで染色した２％アガロースゲルで増幅されたＰＣＲ産物を分離した。
図７に示されたようにリアルタイムＰＣＲでＴＨＤプライマーは、ターゲットシグナル増幅だけではなく、ターゲット核酸配列の増幅から産物を得ることができるようにして（図７ａのＮｏ．３）、増幅されたターゲット核酸配列Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅから出た産物をアガロースゲル上で確認した（図７ｂのレーン２）。一方、ＴＨＤプライマーと異なって、二重標識プローブを利用したリアルタイムＰＣＲでは、如何なる蛍光シグナルも表れなく（図７ａのＮｏ．１）、またアガロースゲル上からも如何なる産物も確認することができなかった（図７ｂのレーン１）。
Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ遺伝子のターゲット核酸配列を鋳型として利用する場合、本実施例で利用された正方向プライマーとしての二重標識ＴＨＤプライマー、逆方向プライマー及び二重標識プローブの配列は、下記の通りである：
ＮＭ−ＴＨＤ２：５’−［６−ＦＡＭ］ＴＣＣＡＣＣＡＡＴＧＧＣＧ［ＢＨＱ１−ｄＴ］ＡＴＡＧＣＧＧＡ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）
ＮＭ−Ｐｒｏｂｅ：５’−［６−ＦＡＭ］ＴＣＣＡＣＣＡＡＴＧＧＣＧＴＡＴＡＧＣＧＧＡ［ＢＨＱ１ａ−Ｑ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）
ＮＭ−Ｐ１：５’−ＣＣＡＡＴＣＣＣＴＡＴＡＣＣＴＴＴＡＣＧＴＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅゲノムＤＮＡ１０ｎｇ、６ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有した２×ＱＩＡＧＥＮマルチプレックスマスターミックス１０μＬ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（ＱＩＡＧＥＮ）、二重標識ＴＨＤプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）１０ｐｍｏｌｅまたは二重標識プローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）１０ｐｍｏｌｅ、及び逆方向プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）１０ｐｍｏｌｅを含有した２０μＬの最終容量でリアルタイムＰＣＲを行った：前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）設置し；前記反応混合物を９５℃で１０分間変性させた後、９４℃で３０秒、６０℃で９０秒及び７２℃で９０秒過程を４０回繰り返した。各サイクルの伸長工程（７２℃）で発生したシグナルを検出した。エチジウムブロマイドで染色した２％アガロースゲルで増幅されたＰＣＲ産物を分離した。
ターゲット核酸であるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲ増幅は、図７と類似した結果を示す。ＴＨＤプライマーを利用したリアルタイムＰＣＲの結果は、ターゲットシグナルの増幅だけではなく、ターゲット核酸配列の増幅を示して（図８ａのＮｏ．３）、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ遺伝子のＰＣＲ産物をアガロースゲル上で確認した（図８ｂのレーン２）。一方、二重標識プローブを利用したリアルタイムＰＣＲでは、如何なる蛍光シグナルも表れなく（図８ａのＮｏ．１）、またアガロースゲル上からもターゲット核酸配列の如何なる産物も確認することができなかった（図８ｂのレーン１）。
実施例４：ＴＨＤプライマーを利用したリアルタイムＰＣＲ特異性
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ遺伝子及びＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ遺伝子のターゲット核酸配列を検出することにより、ＴＨＤプライマーを利用したリアルタイムＰＣＲ特異性を確認した。本実験のために、リアルタイムＰＣＲ増幅に二重−標識ＴＨＤプライマーを正方向プライマーとして利用した。
Ａ． Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対するリアルタイムＰＣＲ特異性
本実施例で利用された二重標識ＴＨＤプライマー及び逆方向プライマーの配列は、下記の通りである：
ＳＰ−ＴＨＤ：５’−［６−ＦＡＭ］ＴＣＣＴＴＣＡＡＡＣＴＧＴＧＧＡＴＴ［ＢＨＱ１−ｄＴ］ＧＧＧＴＧＴ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）
ＳＰ−Ｐ２：５’−ＧＧＴＴＴＣＣＧＴＡＣＡＧＣＣＴＴＧＡ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓまたはＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅゲノムＤＮＡ１ｎｇ、６ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有した２×ＱＩＡＧＥＮマルチプレックスマスターミックス１０μＬ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（ＱＩＡＧＥＮ）、二重標識ＴＨＤプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）１０ｐｍｏｌｅ及び逆方向プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）１０ｐｍｏｌｅを含有した２０μＬの最終容量でリアルタイムＰＣＲを行った：前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）設置し；前記反応混合物を９５℃で１０分間変性させた後、９４℃で３０秒、６０℃で９０秒及び７２℃で９０秒過程を４０回繰り返した。各サイクルの伸長工程（７２℃）で発生したシグナルを検出した。
ターゲット核酸としてＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ遺伝子を利用したリアルタイムＰＣＲでは、蛍光シグナル増幅が発生したが（図９のＮｏ．１）、その反面、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（図９のＮｏ．２）及びＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（図９のＮｏ．３）のような非ターゲット核酸配と、陰性対照群（図９のＮｏ．４）のリアルタイムＰＣＲでは、如何なる蛍光シグナル増幅も観察されなかった。
Ｂ． Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対するリアルタイムＰＣＲ特異性
本実施例で利用された二重標識ＴＨＤプライマー及び逆方向プライマーの配列は、下記の通りである：
ＮＭ−ＴＨＤ１：５’−［６−ＦＡＭ］ＣＣＡＴＡＡＣＣ［ＢＨＱ１−ｄＴ］ＴＧＡＧＣＡＡＴＣＣＡＩＩＩＩＩＣＣＴＧＡＣＧＴＴＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
ＮＭ−Ｐ１：５’−ＣＣＡＡＴＣＣＣＴＡＴＡＣＣＴＴＴＡＣＧＴＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓまたはＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅゲノムＤＮＡ１ｎｇ、６ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有した２×ＱＩＡＧＥＮマルチプレックスマスターミックス１０μＬ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（ＱＩＡＧＥＮ）、二重標識ＴＨＤプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）１０ｐｍｏｌｅ及び逆方向プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）１０ｐｍｏｌｅを含有した２０μＬの最終容量でリアルタイムＰＣＲを行った：前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）設置し；前記反応混合物を９５℃で１０分間変性させた後、９４℃で３０秒、６０℃で９０秒及び７２℃で９０秒過程を４０回繰り返した。各サイクルの伸長工程（７２℃）で発生したシグナルを検出した。
ターゲット核酸としてＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ遺伝子を利用したリアルタイムＰＣＲでは、蛍光シグナル増幅が発生したが（図１０のＮｏ．１）、その反面、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（図１０のＮｏ．２）及びＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（図１０のＮｏ．３）のような非ターゲット核酸配列だけではなく、陰性対照群（図１０のＮｏ．４）のリアルタイムＰＣＲでは、如何なる蛍光シグナル増幅も観察されなかった。
実施例５：ＴＨＤプライマーを利用したリアルタイムＰＣＲ感度
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ遺伝子及びＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ遺伝子のターゲット核酸配列を検出することにより、ＴＨＤプライマーを利用したリアルタイムＰＣＲ感度を確認した。本実験のために、リアルタイムＰＣＲ増幅に二重−標識ＴＨＤプライマーを正方向プライマーとして利用した。
Ａ． Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対するリアルタイムＰＣＲ感度
本実施例で利用された二重標識ＴＨＤプライマー及び逆方向プライマーの配列は、下記の通りである：
ＳＰ−ＴＨＤ：５’−［６−ＦＡＭ］ＴＣＣＴＴＣＡＡＡＣＴＧＴＧＧＡＴＴ［ＢＨＱ１−ｄＴ］ＧＧＧＴＧＴ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）
ＳＰ−Ｐ２：５’−ＧＧＴＴＴＣＣＧＴＡＣＡＧＣＣＴＴＧＡ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
一連の希釈したＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅゲノムＤＮＡ（１０ｎｇ、１ｎｇ、１００ｐｇ、１０ｐｇ、１ｐｇまたは０．１ｐｇ）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有した２×ＱＩＡＧＥＮマルチプレックスマスターミックス１０μＬ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（ＱＩＡＧＥＮ）、二重標識ＴＨＤプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）１０ｐｍｏｌｅ及び逆方向プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）１０ｐｍｏｌｅを含有した２０μＬの最終容量でリアルタイムＰＣＲを行った：前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）設置し；前記反応混合物を９５℃で１０分間変性させた後、９４℃で３０秒、６０℃で９０秒及び７２℃で９０秒過程を４０回繰り返した。各サイクルの伸長工程（７２℃）で発生したシグナルを検出した。
図１１に示されたように、１０ｎｇから一連の希釈したＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅゲノムＤＮＡを利用してリアルタイムＰＣＲを行う場合、０．１ｐｇまで希釈した場合も、ターゲット核酸配列が検出された（Ｎｏ．１−６）。
Ｂ． Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対するリアルタイムＰＣＲ感度
本実施例で利用された二重標識ＴＨＤプライマー及び逆方向プライマーの配列は、下記の通りである：
ＮＭ−ＴＨＤ１：５’−［６−ＦＡＭ］ＣＣＡＴＡＡＣＣ［ＢＨＱ１−ｄＴ］ＴＧＡＧＣＡＡＴＣＣＡＩＩＩＩＩＣＣＴＧＡＣＧＴＴＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
ＮＭ−Ｐ１：５’−ＣＣＡＡＴＣＣＣＴＡＴＡＣＣＴＴＴＡＣＧＴＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）
一連の希釈したＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓゲノムＤＮＡ（１０ｎｇ、１ｎｇ、１００ｐｇ、１０ｐｇ、１ｐｇまたは０．１ｐｇ）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有した２×ＱＩＡＧＥＮマルチプレックスマスターミックス１０μＬ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（ＱＩＡＧＥＮ）、二重標識ＴＨＤプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）１０ｐｍｏｌｅ及び逆方向プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）１０ｐｍｏｌｅを含有した２０μＬの最終容量でリアルタイムＰＣＲを行った：前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）設置し；前記反応混合物を９５℃で１０分間変性させた後、９４℃で３０秒、６０℃で９０秒及び７２℃で９０秒過程を４０回繰り返した。各サイクルの伸長工程（７２℃）で発生したシグナルを検出した。
図１２に示されたように、１０ｎｇから一連の希釈したＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓゲノムＤＮＡを利用してリアルタイムＰＣＲを行う場合、０．１ｐｇまで希釈した場合も、ターゲット核酸配列が検出された（Ｎｏ．１−６）。
実施例６：ＴＨＤプライマーを利用したｎｅｓｔｅｄリアルタイムＰＣＲ
Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ 遺伝子のターゲット核酸配列を検出することにより、ＴＨＤプライマーを利用したＮｅｓｔｅｄリアルタイムＰＣＲの特異性及び感度を追加的に確認した。本実験のために、リアルタイムＰＣＲ増幅に二重−標識ＴＨＤプライマーを正方向プライマーとして利用した。
Ａ．Ｎｅｓｔｅｄ リアルタイムＰＣＲの特異性
本実施例で第１ＰＣＲに利用された正方向プライマー及び逆方向プライマーの配列と、ＮｅｓｔｅｄリアルタイムＰＣＲに利用された二重標識ＴＨＤプライマーの配列は、下記の通りである：
ＳＰ−Ｐ１：５’−ＴＴＧＡＣＣＡＣＴＴＣＧＣＴＡＴＴＴＣＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
ＳＰ−ＴＨＤ：５’−［６−ＦＡＭ］ＴＣＣＴＴＣＡＡＡＣＴＧＴＧＧＡＴＴ／ＢＨＱ１−ｄＴ／ＧＧＧＴＧＴ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）
ＳＰ−Ｐ２：５’−ＧＧＴＴＴＣＣＧＴＡＣＡＧＣＣＴＴＧＡ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓまたはＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅゲノムＤＮＡ１０ｎｇ、６ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有した２×ＱＩＡＧＥＮマルチプレックスマスターミックス１０μＬ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（ＱＩＡＧＥＮ）、正方向プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）１０ｐｍｏｌｅ及び逆方向プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）１０ｐｍｏｌｅを含有した２０μＬの最終容量でリアルタイムＰＣＲを行った：前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＡＢＩ９７００、ＡＢＩ）設置し；前記反応混合物を９５℃で１０分間変性させた後、９４℃で３０秒、６０℃で９０秒及び７２℃で９０秒過程を３０回繰り返した。
第１ＰＣＲ産物２μＬ、６ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有した２×ＱＩＡＧＥＮマルチプレックスマスターミックス１０μＬ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（ＱＩＡＧＥＮ）、二重標識ＴＨＤプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）５ｐｍｏｌｅ及び逆方向プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）５ｐｍｏｌｅを含有した２０μＬの最終容量でＮｅｓｔｅｄリアルタイムＰＣＲを行った：前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）設置し；前記反応混合物を９５℃で１０分間変性させた後、９４℃で３０秒、６０℃で９０秒及び７２℃で９０秒過程を２０回繰り返した。各サイクルの伸長工程（７２℃）で発生したシグナルを検出した。
図１３に示されたように、ターゲット核酸であるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｎｏ．１）に対するリアルタイムＰＣＲでは、シグナルが確認されたが、非ターゲット核酸であるＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（Ｎｏ．２）及びＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ｎｏ．３）と鋳型のない陰性対照群（Ｎｏ．４）に対するリアルタイムＰＣＲでは、如何なるシグナルも表れなかった。
Ｂ．ＮｅｓｔｅｄリアルタイムＰＣＲの感度
本実施例で利用された正方向プライマー、逆方向プライマー及び二重標識ＴＨＤプライマーの配列は、下記の通りである：
ＮｅｓｔｅｄリアルタイムＰＣＲの特異性に対する実施例６Ａで利用された、第１ＰＣＲ用正方向プライマー及び逆方向プライマーの配列、そしてＮｅｓｔｅｄリアルタイムＰＣＲ用二重−標識ＴＨＤプライマーの配列と同一な配列を利用した。
一連の希釈したＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅゲノムＤＮＡ（１０ｎｇ、１ｎｇ、１００ｐｇ、１０ｐｇ、１ｐｇ、１００ｆｇ、１０ｆｇまたは１ｆｇ）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有した２×ＱＩＡＧＥＮマルチプレックスマスターミックス１０μＬ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（ＱＩＡＧＥＮ）、正方向プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）１０ｐｍｏｌｅ及び逆方向プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）１０ｐｍｏｌｅを含有した２０μＬの最終容量で第１ＰＣＲ増幅を行った：前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＡＢＩ９７００、ＡＢＩ）設置し；前記反応混合物を９５℃で１０分間変性させた後、９４℃で３０秒、６０℃で９０秒及び７２℃で９０秒過程を３０回繰り返した。
ＰＣＲ産物２μｌ、６ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有した２×ＱＩＡＧＥＮマルチプレックスマスターミックス１０μＬ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（ＱＩＡＧＥＮ）、二重標識ＴＨＤプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）５ｐｍｏｌｅ及び逆方向プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）５ｐｍｏｌｅを含有した２０μＬの最終容量でＮｅｓｔｅｄリアルタイムＰＣＲを行った：前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）設置し；前記反応混合物を９５℃で１０分間変性させた後、９４℃で３０秒、６０℃で９０秒及び７２℃で９０秒過程を２０回繰り返した。各サイクルの伸長工程（７２℃）で発生したシグナルを検出した。
図１４に示されたように、１０ｎｇから一連の希釈したターゲット鋳型であるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅゲノムＤＮＡを利用してリアルタイムＰＣＲを行う場合、１０ｆｇゲノムＤＮＡ濃度まで希釈した場合も、ターゲット核酸配列が検出された（Ｎｏ．１−７）。
実施例７：ＴＨＤプライマーの多様な組み合わせを利用したリアルタイムＰＣＲ
分子ビーコン、サンライズまたはスコーピオンでは、ヘアピンステムのような如何なる構造的修飾無しに、一般的なプライマーを二重監視機能でリアルタイムＰＣＲに利用できるということが、本発明により最初に提示された：第１の機能は、相補的な配列の合成であり、第２の機能は、ターゲットヌクレオチド配列を示すシグナルの発生である。したがって、本発明者らは、リアルタイムＰＣＲ増幅にＴＨＤプライマーの多様な組み合わせを適用して、これは、ＴＨＤプライマーの最も大きい長所の一つである。
本実験のために、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子をターゲット核酸鋳型として利用した。ＴＨＤプライマーは、ＤＰＯ構造または二重標識を含む従来の構造を有する。
本実施例で利用された二重−標識ＴＨＤプライマー及びプライマーの配列は、下記の通りである：
ＮＧ−Ｐ１：５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣＩＩＩＩＩＣＧＡＧＣＡＡＧＡＡＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）
ＮＧ−ＴＨＤ１：５’−［６−ＦＡＭ］ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧ［ＢＨＱ１−ｄＴ］ＡＴＣＡＣＴＣＧＣＩＩＩＩＩＣＧＡＧＣＡＡＧＡＡＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）
ＮＧ−Ｐ２：５’−ＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧＣＡＴＡＴＴＴＡＡＧ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）
ＮＧ−ＴＨＤ２：５’−［６−ＦＡＭ］ＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧＣＡＴＡ［ＢＨＱ１−ｄＴ］ＴＴＡＡＧ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）
ＮＧ−Ｐｒｏｂｅ：５’−［６−ＦＡＭ］ＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧＣＡＴＡ［ＢＨＱ１−ｄＴ］ＴＴＡＡＧ［Ｐｈｏｓ−Ｑ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）
ＮＧ−Ｐ３：５’−ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴＩＩＩＩＩＧＴＡＡＴＣＡＧＡＴＧ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）
ＮＧ−ＴＨＤ３：５’−［６−ＦＡＭ］ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣ［ＢＨＱ１−ｄＴ］ＴＴＣＡＣＧＣＴＩＩＩＩＩＧＴＡＡＴＣＡＧＡＴＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）
Ａ．正方向プライマーとしての二重標識ＴＨＤプライマー、逆方向プライマーとしての二重標識ＴＨＤプライマー、またはこれらの組み合わせ
Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅゲノムＤＮＡ１ｎｇ、６ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有した２×ＱＩＡＧＥＮマルチプレックスマスターミックス１０μＬ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（ＱＩＡＧＥＮ）、正方向プライマーとして二重標識ＴＨＤプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）１０ｐｍｏｌｅ、逆方向プライマーとして二重標識ＴＨＤプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）１０ｐｍｏｌｅまたはこれらの組み合わせ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２及び１７）及び正方向プライマーとしてのプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）１０ｐｍｏｌｅまたは逆方向プライマーとしてのプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）１０ｐｍｏｌｅを含有した２０μＬの最終容量でリアルタイムＰＣＲを行った：前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）設置し；前記反応混合物を９５℃で１０分間変性させた後、９４℃で３０秒、６０℃で９０秒及び７２℃で９０秒過程を４０回繰り返した。各サイクルの伸長工程（７２℃）で発生したシグナルを検出した。
Ｂ．二重標識ＴＨＤプライマー及び二重標識内部プローブの組み合わせ
二重標識内部プローブの使用を除いて、二重標識ＴＨＤプライマーの組み合わせ及びリアルタイムＰＣＲ反応は、実施例７Ａと同一である（５ｐｍｏｌｅ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）。
Ｃ．正方向プライマーとしての二重標識ＴＨＤプライマー及び逆方向プライマー及び／または上流プライマーの組み合わせ
正方向プライマーとしての二重標識ＴＨＤプライマー（５ｐｍｏｌｅ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）の使用及び上流二重標識ＴＨＤプライマー（１０ｐｍｏｌｅ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）または上流プライマー（１０ｐｍｏｌｅ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）の使用を除いては、実施例７Ａと同様にリアルタイムＰＣＲ反応を行った。
Ｄ．内部非標識プライマー及び二重標識ＴＨＤプライマーの組み合わせ
リアルタイムＰＣＲ反応は、内部プライマーの使用を除いては、実施例７Ａに利用されたものと同一である（１０ｐｍｏｌｅ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）。
図１５〜１８に示されたように、リアルタイムシグナル増幅及びターゲット核酸配列増幅は、リアルタイムＰＣＲ増幅において、多様なＴＨＤプライマー組み合わせの適用可能性を示す。
実施例８：リアルタイムＰＣＲにおいて、ＴａｑＭａｎプローブ法とＴＨＤプライマーを用いる方法の比較
シグナリングのメカニズムを調べるために、本発明者は、ターゲット核酸鋳型にＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子を利用して、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲ法でＴＨＤプライマーを利用した本発明のリアルタイムＰＣＲ法を比較した。
ＴＨＤプライマーは、二重標識を含むＤＰＯ構造を有する。本実施例で利用された二重標識ＴＨＤプライマー、ＴａｑＭａｎプローブ及びプライマーの配列は、下記の通りである：
ＮＧ−Ｐ２：５’−ＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧＣＡＴＡＴＴＴＡＡＧ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）
ＮＧ−Ｐｒｏｂｅ：５’−［６−ＦＡＭ］ＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧＣＡＴＡ［ＢＨＱ１−ｄＴ］ＴＴＡＡＧ［Ｐｈｏｓ−Ｑ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）
ＮＧ−Ｐ３：５’−ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴＩＩＩＩＩＧＴＡＡＴＣＡＧＡＴＧ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）
ＮＧ−ＴＨＤ３：５’−［６−ＦＡＭ］ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣ［ＢＨＱ１−ｄＴ］ＴＴＣＡＣＧＣＴＩＩＩＩＩＧＴＡＡＴＣＡＧＡＴＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）
Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅゲノムＤＮＡ１ｎｇ、６ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有した２×ＱＩＡＧＥＮマルチプレックスマスターミックス１０μＬ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（ＱＩＡＧＥＮ）、正方向プライマーとしてプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）１０ｐｍｏｌｅまたは二重標識ＴＨＤプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）１０ｐｍｏｌｅ、逆方向プライマーとしてプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）１０ｐｍｏｌｅまたは二重標識ＴＨＤプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、内部プローブ／プライマーとしてＴａｑＭａｎプローブ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）５ｐｍｏｌｅまたは内部プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）５ｐｍｏｌｅを含有した２０μＬの最終容量でリアルタイムＰＣＲを行った：前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）設置し；前記反応混合物を９５℃で１０分間変性させた後、９４℃で３０秒、６０℃で９０秒及び７２℃で９０秒過程を２０回繰り返した。各サイクルの伸長工程（７２℃）で発生したシグナルを検出した。
図１９に示されたように、多様なＴＨＤプライマー組み合わせがターゲット核酸配列を増幅させるということが証明された。しかし、一般にＴａｑＭａｎプローブ法（Ｎｏ．４）で要求される二重標識プローブがない場合も、シグナル増幅は、より効率的に発生する（Ｎｏ．２、３、５及び６）。即ち、ＴａｑＭａｎプローブ反応と比較し、さらに低いＣｔ値を表すだけではなく、さらに高い強度の蛍光シグナルを示した。したがって、既存のＴａｑＭａｎプローブ法とは異なって、ターゲット核酸配列を増幅するようにデザインされたプライマーだけを利用し、より効率的にターゲットシグナル及びターゲット核酸配列を増幅することが可能である。
以上、本発明の望ましい具体例を詳細に記述したが、当業者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具体例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその均等物により定義されると言える。

Claims (94)

  1. ターゲットハイブリダイゼーション及び検出プライマー（ｔａｒｇｅｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒ、ＴＨＤプライマー）の５’−切断反応及び３’−伸長反応を利用してＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法であって、
    （ａ）ターゲット核酸配列とＴＨＤプライマーをハイブリッド形成させる工程であって、前記ＴＨＤプライマーは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）一つの標識または多数の標識を含む相互作用的標識システムを含む工程と、
    （ｂ）鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより前記ＴＨＤプライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応が発生する条件下で、前記工程（ａ）の結果物を５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって、前記ＴＨＤプライマーは、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記ポリメラーゼ活性により伸長されて、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断され、前記ＴＨＤプライマーから前記標識または前記相互作用的標識システムの少なくとも一つの標識が放出されて、これにより前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される工程と、
    （ｃ）前記シグナルを検出する工程であって、前記シグナルは、前記ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、
    を含むことを特徴とする方法。
  2. 前記工程（ａ）は、（ｉ）前記ＴＨＤプライマー及び（ｉｉ）標識プローブを利用して行われて、前記標識プローブは、その３’−末端が修飾されて鋳型依存的核酸ポリメラーゼによる伸長が防止され、前記ＴＨＤプライマーがハイブリッド形成される位置の下流位置にハイブリッド形成されて、工程（ｂ）で切断されて前記標識プローブに連結された標識が放出される請求項１に記載の方法。
  3. 前記工程（ａ）は、（ｉ）前記ＴＨＤプライマー及び（ｉｉ）上流プライマーまたは下流プライマーを利用して行われて、前記上流プライマーは、前記ＴＨＤプライマーがハイブリッド形成される位置の上流位置にハイブリッド形成されて、前記ＴＨＤプライマーと同一な方向を有して、前記下流プライマーは、前記ＴＨＤプライマーがハイブリッド形成される位置の下流位置にハイブリッド形成されて、前記ＴＨＤプライマーと同一な方向を有する請求項１に記載の方法。
  4. 前記方法は、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを増幅させるために、前記工程（ａ）−（ｂ）または（ａ）−（ｃ）を少なくとも２回反復する工程と、その反復サイクルの間に変性過程とをさらに含む請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記工程（ｃ）の前記検出は、リアルタイム方式、エンド−ポイント（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ）方式または指定時間間隔（ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｔｉｍｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ）方式で行われる請求項１から４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記ＴＨＤプライマーは、下記一般式Ｉの二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有するか、または下記一般式ＩＩの修飾二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する請求項１から３のいずれかに記載の方法。
    ５’−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−３’ （Ｉ）
    （式中、Ｘｐは、ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第１プライミング部位であり、Ｙｑは、少なくとも三つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚｒは、ターゲット配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第２プライミング部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ、Ｙ及びＺは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであり、５’−第１プライミング部位のＴｍは、３’−第２プライミング部位のＴｍより高く、前記分割部位は、前記三つの領域のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、ターゲット核酸配列に対するアニーリングに関して、５’−第１プライミング部位を３’−第２プライミング部位から分割し、これにより、前記オリゴヌクレオチドの前記アニーリング特異性が、５’−第１プライミング部位及び３’−第２プライミング部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＨＤプライマーの全体アニーリング特異性を向上させる。）
    ５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （ＩＩ）
    （式中、Ｘ’ｐは、ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第２プライミング部位であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’ｒは、ターゲット配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第１プライミング部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであり、５’−第２プライミング部位のＴｍは、３’−第１プライミング部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記Ｘ’ｐ、Ｙ’ｑ及びＺ’ｒの三つの領域のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、ターゲット核酸に対するアニーリングに関して、前記５’−第２プライミング部位を前記３’−第１プライミング部位から分割し、これにより、前記オリゴヌクレオチドの前記アニーリング特異性が、前記５’−第２プライミング部位及び前記３’−第１プライミング部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＨＤプライマーの全体アニーリング特異性を向上させる。）
  7. 前記ＴＨＤプライマーは、請求項６に記載の一般式Ｉの二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有する請求項６に記載の方法。
  8. 前記標識プローブは、請求項６に記載の一般式ＩＩの修飾二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する請求項２に記載の方法。
  9. 前記上流プライマーまたは前記下流プライマーは、請求項６に記載の一般式Ｉの二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有する請求項３に記載の方法。
  10. 前記ＴＨＤプライマーは、その５’−末端部位に少なくとも一つの標識を含む請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  11. 前記ＴＨＤプライマーは、その５’−末端に少なくとも一つの標識を含む請求項１０に記載の方法。
  12. 前記標識は、化学的標識、酵素標識、放射能標識、蛍光標識、発光標識、化学発光標識または金属標識である請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  13. 前記相互作用的標識システムは、蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子の一対であり、前記クエンチャー分子は、前記ＴＨＤプライマー上に前記レポーター分子の蛍光をクエンチングするように位置して、二つの標識は、ヌクレアーゼ切断が起こるＴＨＤプライマー内の一位置により分割されており、これにより、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、前記位置における切断反応によって前記クエンチャー分子から前記レポーター分子を分離させて、これは、前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルが発生されるようにする請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  14. 前記蛍光レポーター分子は、前記ＴＨＤプライマーの５’−末端部位に位置して、前記クエンチャー分子は、前記蛍光レポーター分子から下流に位置する請求項１３に記載の方法。
  15. 前記クエンチャー分子は、前記ＴＨＤプライマーの５’−末端部位に位置して、前記蛍光レポーター分子は、前記クエンチャー分子から下流に位置する請求項１３に記載の方法。
  16. 前記標識プローブに連結された前記標識は、前記ＴＨＤプライマーに連結されたものと相異なっている請求項２に記載の方法。
  17. 前記上流プライマーまたは前記下流プライマーは、工程（ｂ）で放出される標識を有する請求項３に記載の方法。
  18. 前記上流プライマーまたは下流プライマーに連結された前記標識は、前記ＴＨＤプライマーに連結されたものと相異なっている請求項１７に記載の方法。
  19. 前記５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  20. 前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、前記ＴＨＤプライマーは、少なくとも２種のプライマーを含む請求項１に記載の方法。
  21. 前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、前記ＴＨＤプライマーは、少なくとも２種のプライマーを含み、前記標識プローブは、少なくとも２種のプローブを含む請求項２に記載の方法。
  22. 前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、前記ＴＨＤプライマーは、少なくとも２種のプライマーを含み、前記上流プライマーまたは前記下流プライマーは、少なくとも２種のプライマーを含む請求項３に記載の方法。
  23. 前記ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  24. 前記ターゲット核酸配列は、前増幅された核酸配列である請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  25. ターゲットハイブリダイゼーション及び検出プライマー（ｔａｒｇｅｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒ、ＴＨＤプライマー）の５’−切断反応及び３’−伸長反応を利用してＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法であって、
    （ａ）ターゲット核酸配列と一対のプライマーをハイブリッド形成させる工程であって、前記一対のプライマーは、前記ターゲット核酸配列を増幅できる正方向プライマー及び逆方向プライマーから構成されて、これらのうち、少なくとも一つのプライマーは、前記ＴＨＤプライマーであって、前記ＴＨＤプライマーは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）一つの標識または多数の標識を含む相互作用的標識システムを含む工程と、
    （ｂ）鋳型依存的核酸ポリメラーゼにより前記二つのプライマーの５’−切断反応及び３’−伸長反応が発生する条件下で、前記工程（ａ）の結果物を５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼと接触させる工程であって、前記二つのプライマーは、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記ポリメラーゼ活性により伸長されて、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの前記５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断され、前記二つのプライマーのうち、前記ＴＨＤプライマーから前記標識または前記相互作用的標識システムの少なくとも一つの標識が放出されて、これにより前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される工程と、
    （ｃ）工程（ｂ）の前記結果物を変性させる工程と、
    （ｄ）前記工程（ａ）−（ｃ）を少なくとも２回反復する工程であって、前記ターゲット核酸配列及び前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルの両方を増幅させる工程と、
    （ｅ）前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルを検出する工程であって、前記検出は、工程（ｄ）の前記反復の各サイクルにおいて、工程（ｄ）の前記反復の終了時点で、または前記反復の間の指定時間間隔のそれぞれで行われて、このようなシグナルは、ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、
    を含むことを特徴とする方法。
  26. 前記工程（ａ）は、追加的な標識プローブを利用して行われて、前記標識プローブは、その３’−末端が修飾されて鋳型依存的核酸ポリメラーゼによる伸長が防止され、前記二つのプライマー間の一位置にハイブリッド形成されて、工程（ｂ）で切断されて前記標識プローブに連結された標識が放出される請求項２５に記載の方法。
  27. 前記工程（ａ）は、追加的に上流プライマーまたは下流プライマーを利用して行われて、前記上流プライマーは、前記ＴＨＤプライマーがハイブリッド形成される位置の上流位置にハイブリッド形成されて、前記ＴＨＤプライマーと同一な方向を有して、前記下流プライマーは、前記二つのプライマー間の一位置にハイブリッド形成されて、前記ＴＨＤプライマーと同一な方向を有する請求項２５に記載の方法。
  28. 前記工程（ａ）は、ＴＨＤプライマーに対して逆方向を有する少なくとも一つの追加的なプライマーを利用して行われる請求項２５から２７のいずれかに記載の方法。
  29. 前記ＴＨＤプライマーは、下記一般式Ｉの二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有するか、または下記一般式ＩＩの修飾二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する請求項２５から２７のいずれかに記載の方法。
    ５’−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−３’ （Ｉ）
    （式中、Ｘｐは、ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第１プライミング部位であり、Ｙｑは、少なくとも三つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚｒは、ターゲット配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第２プライミング部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ、Ｙ及びＺは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであり、５’−第１プライミング部位のＴｍは、３’−第２プライミング部位のＴｍより高く、前記分割部位は、前記三つの領域のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、ターゲット核酸配列に対するアニーリングに関して、５’−第１プライミング部位を３’−第２プライミング部位から分割し、これにより、前記オリゴヌクレオチドの前記アニーリング特異性が、前記５’−第１プライミング部位及び前記３’−第２プライミング部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＨＤプライマーの全体アニーリング特異性を向上させる。）
    ５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （ＩＩ）
    （式中、Ｘ’ｐは、ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第２プライミング部位であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’ｒは、ターゲット配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第１プライミング部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであり、５’−第２プライミング部位のＴｍは、３’−第１プライミング部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記Ｘ’ｐ、Ｙ’ｑ及びＺ’ｒの三つの領域のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、ターゲット核酸に対するアニーリングに関して、前記５’−第２プライミング部位を前記３’−第１プライミング部位から分割し、これにより、前記オリゴヌクレオチドの前記アニーリング特異性が、前記５’−第２プライミング部位及び前記３’−第１プライミング部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＨＤプライマーの全体アニーリング特異性を向上させる。）
  30. 前記ＴＨＤプライマーは、請求項２９に記載の一般式Ｉの二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有する請求項２９に記載の方法。
  31. 前記二つのプライマーのうち、ＴＨＤプライマーではない他のプライマーは、請求項２９に記載の一般式Ｉの二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有する請求項２５から２７及び２９のいずれかに記載の方法。
  32. 前記標識プローブは、請求項２９に記載の一般式ＩＩの修飾二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する請求項２６に記載の方法。
  33. 前記上流プライマーまたは前記下流プライマーは、請求項２９に記載の一般式Ｉの二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有する請求項２７に記載の方法。
  34. 前記ＴＨＤプライマーは、その５’−末端部位に少なくとも一つの標識を含む請求項２５から２７のいずれかに記載の方法。
  35. 前記ＴＨＤプライマーは、その５’−末端に少なくとも一つの標識を含む請求項３４に記載の方法。
  36. 前記標識は、化学的標識、酵素標識、放射能標識、蛍光標識、発光標識、化学発光標識または金属標識である請求項２５から２７のいずれかに記載の方法。
  37. 前記相互作用的標識システムは、蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子の一対であり、前記クエンチャー分子は、前記ＴＨＤプライマー上に前記レポーター分子の蛍光をクエンチングするように位置して、二つの標識は、ヌクレアーゼ切断が起こるＴＨＤプライマー内の一位置により分割されており、これにより、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、前記位置における切断反応によって前記クエンチャー分子から前記レポーター分子を分離させて、これは、前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルが発生されるようにする請求項２５から２７のいずれかに記載の方法。
  38. 前記蛍光レポーター分子は、前記ＴＨＤプライマーの５’−末端部位に位置して、前記クエンチャー分子は、前記蛍光レポーター分子から下流に位置する請求項３７に記載の方法。
  39. 前記クエンチャー分子は、前記ＴＨＤプライマーの５’−末端部位に位置して、前記蛍光レポーター分子は、前記クエンチャー分子から下流に位置する請求項３７に記載の方法。
  40. 前記二つのプライマーは、両方とも工程（ｂ）で放出される標識を有する請求項２５から２７のいずれかに記載の方法。
  41. 前記二つのプライマーに連結された前記標識は、互いに異なっている請求項４０に記載の方法。
  42. 前記標識プローブに連結された前記標識は、前記ＴＨＤプライマーに連結されたものと相異なっている請求項２６に記載の方法。
  43. 前記上流プライマーまたは前記下流プライマーは、工程（ｂ）で放出される標識を有する請求項２７に記載の方法。
  44. 前記上流プライマーまたは下流プライマーに連結された前記標識は、前記ＴＨＤプライマーに連結されたものと相異なっている請求項４３に記載の方法。
  45. ５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである請求項２５から２７のいずれかに記載の方法。
  46. 前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、前記正方向プライマー及び前記逆方向プライマーである前記二つのプライマーのそれぞれは、少なくとも２種のプライマーを含む請求項２５に記載の方法。
  47. 前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、前記正方向プライマー及び前記逆方向プライマーである前記二つのプライマーのそれぞれは、少なくとも２種のプライマーを含み、前記標識プローブは、少なくとも２種のプローブを含む請求項２６に記載の方法。
  48. 前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、前記正方向プライマー及び前記逆方向プライマーである前記二つのプライマーのそれぞれは、少なくとも２種のプライマーを含み、前記上流プライマーまたは下流プライマーは、少なくとも２種のプライマーを含む請求項２７に記載の方法。
  49. 前記ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む請求項２５から２７のいずれかに記載の方法。
  50. 前記ターゲット核酸配列は、前増幅された核酸配列である請求項２５から２７のいずれかに記載の方法。
  51. ターゲットハイブリダイゼーション及び検出プライマー（ｔａｒｇｅｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒ、ＴＨＤプライマー）の５’−切断反応及び３’−伸長反応を伴うポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用してＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法であって、
    （ａ）ターゲット核酸配列、一対のプライマー及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼを含むＰＣＲ混合物を準備する工程であって、前記一対のプライマーは、前記ターゲット核酸配列を増幅できる正方向プライマー及び逆方向プライマーを含み、これらのうち、少なくとも一つのプライマーは、前記ＴＨＤプライマーであって、前記ＴＨＤプライマーは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子の一対を含み、前記クエンチャー分子は、前記ＴＨＤプライマー上に前記レポーター分子の蛍光をクエンチングするように位置して、二つの標識は、ヌクレアーゼ切断が起こるＴＨＤプライマー内の一位置により分割されており、これによって前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性は、前記位置における切断反応により前記クエンチャー分子から前記レポーター分子を分離させて、これは、前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルが発生されるようにする工程と、
    （ｂ）前記ＰＣＲ混合物を利用して前記ターゲット核酸配列を増幅させる工程であって、プライマーアニーリング、プライマー伸長及び変性を少なくとも２回行って、前記二つのプライマーは、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性により伸長されて、ターゲット核酸配列を増幅して、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断されて、二つのプライマーのうち、前記ＴＨＤプライマーから前記レポーター分子または前記クエンチャー分子が放出されて、これにより前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される工程と、
    （ｃ）前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記蛍光シグナルを検出する工程であって、前記検出は、工程（ｂ）の前記反復の各サイクルにおいて、工程（ｃ）の前記反復の終了時点で、または前記反復の間の指定時間間隔のそれぞれで行われて、このようなシグナルは、ターゲット核酸配列の存在を示す工程と、
    を含むことを特徴とする方法。
  52. 前記工程（ａ）は、追加的に標識プローブを利用して行われて、前記標識プローブは、その３’−末端が修飾されて鋳型依存的核酸ポリメラーゼによる伸長が防止され、前記二つのプライマー間の一位置にハイブリッド形成されて、工程（ｂ）で切断されて前記標識プローブに連結された標識が放出される請求項５１に記載の方法。
  53. 前記工程（ａ）は、追加的に上流プライマーまたは下流プライマーを利用して行われて、前記上流プライマーは、前記ＴＨＤプライマーがハイブリッド形成される位置の上流位置にハイブリッド形成されて、前記ＴＨＤプライマーと同一な方向を有して、前記下流プライマーは、前記二つのプライマー間の一位置にハイブリッド形成されて、前記ＴＨＤプライマーと同一な方向を有する請求項５１に記載の方法。
  54. 前記工程（ａ）は、ＴＨＤプライマーに対して逆方向を有する少なくとも一つの追加的なプライマーを利用して行われる請求項５１から５３のいずれかに記載の方法。
  55. 前記ＴＨＤプライマーは、下記一般式Ｉの二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有するか、または下記一般式ＩＩの修飾二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する請求項５１から５３のいずれかに記載の方法。
    ５’−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−３’ （Ｉ）
    （式中、Ｘｐは、ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第１プライミング部位であり、Ｙｑは、少なくとも三つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚｒは、ターゲット配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第２プライミング部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ、Ｙ及びＺは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであり、５’−第１プライミング部位のＴｍは、３’−第２プライミング部位のＴｍより高く、前記分割部位は、前記三つの領域のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、ターゲット核酸配列に対するアニーリングに関して、５’−第１プライミング部位を３’−第２プライミング部位から分割し、これにより、前記オリゴヌクレオチドの前記アニーリング特異性が、前記５’−第１プライミング部位及び前記３’−第２プライミング部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＨＤプライマーの全体アニーリング特異性を向上させる。）
    ５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （ＩＩ）
    （式中、Ｘ’ｐは、ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第２プライミング部位であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’ｒは、ターゲット配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第１プライミング部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであり、５’−第２プライミング部位のＴｍは、３’−第１プライミング部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記Ｘ’ｐ、Ｙ’ｑ及びＺ’ｒの三つの領域のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、ターゲット核酸に対するアニーリングに関して、前記５’−第２プライミング部位を前記３’−第１プライミング部位から分割し、これにより、前記オリゴヌクレオチドの前記アニーリング特異性が、前記５’−第２プライミング部位及び前記３’−第１プライミング部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＨＤプライマーの全体アニーリング特異性を向上させる。）
  56. 前記ＴＨＤプライマーは、請求項５５に記載の一般式Ｉの二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有する請求項５５に記載の方法。
  57. 前記二つのプライマーのうち、ＴＨＤプライマーではない他のプライマーは、請求項５５に記載の一般式Ｉの二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有する請求項５１から５３及び５５のいずれかに記載の方法。
  58. 前記標識プローブは、請求項５５に記載の一般式ＩＩの修飾二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する請求項５２に記載の方法。
  59. 前記上流プライマーまたは前記下流プライマーは、請求項５５に記載の一般式Ｉの二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有する請求項５３に記載の方法。
  60. 前記ＴＨＤプライマーは、その５’−末端部位に少なくとも一つの標識を含む請求項５１から５３のいずれかに記載の方法。
  61. 前記ＴＨＤプライマーは、その５’−末端に少なくとも一つの標識を含む請求項６０に記載の方法。
  62. 前記蛍光レポーター分子は、前記ＴＨＤプライマーの５’−末端部位に位置して、前記クエンチャー分子は、前記蛍光レポーター分子から下流に位置する請求項５１に記載の方法。
  63. 前記クエンチャー分子は、前記ＴＨＤプライマーの５’−末端部位に位置して、前記蛍光レポーター分子は、前記クエンチャー分子から下流に位置する請求項５１に記載の方法。
  64. 前記二つのプライマーは、両方とも工程（ｂ）で放出される標識を有する請求項５１から５３のいずれかに記載の方法。
  65. 前記二つのプライマーに連結された前記標識は、互いに異なっている請求項６４に記載の方法。
  66. 前記標識プローブに連結された前記標識は、前記ＴＨＤプライマーに連結されたものと相異なっている請求項５２に記載の方法。
  67. 前記上流プライマーまたは前記下流プライマーは、工程（ｂ）で放出される標識を有する請求項５３に記載の方法。
  68. 前記上流プライマーまたは下流プライマーに連結された前記標識は、前記ＴＨＤプライマーに連結されたものと相異なっている請求項６７に記載の方法。
  69. ５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである請求項５１から５３のいずれかに記載の方法。
  70. 前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、前記正方向プライマー及び前記逆方向プライマーである前記二つのプライマーのそれぞれは、少なくとも２種のプライマーを含む請求項５１に記載の方法。
  71. 前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、前記正方向プライマー及び前記逆方向プライマーである前記二つのプライマーのそれぞれは、少なくとも２種のプライマーを含み、前記標識プローブは、少なくとも２種のプローブを含む請求項５２に記載の方法。
  72. 前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、前記正方向プライマー及び前記逆方向プライマーである前記二つのプライマーのそれぞれは、少なくとも２種のプライマーを含み、前記上流プライマーまたは下流プライマーは、少なくとも２種のプライマーを含む請求項５３に記載の方法。
  73. 前記ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む請求項５１から５３のいずれかに記載の方法。
  74. 前記ターゲット核酸配列は、前増幅された核酸配列である請求項５１から５３のいずれかに記載の方法。
  75. ターゲットハイブリダイゼーション及び検出プライマー（ｔａｒｇｅｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒ、ＴＨＤプライマー）の５’−切断反応及び３’−伸長反応を利用してＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキットであって、
    （ａ）（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）一つの標識または多数の標識を含む相互作用的標識システムを含むＴＨＤプライマーと、
    （ｂ）５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型依存的核酸ポリメラーゼ（前記ＴＨＤプライマーが前記ターゲット核酸配列とハイブリッド形成される場合、前記ＴＨＤプライマーは、前記核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性により伸長されて、前記ＴＨＤプライマーは、前記核酸ポリメラーゼの５’→３’ヌクレアーゼ活性により切断され、前記ＴＨＤプライマーから前記標識または前記相互作用的標識システムの少なくとも一つの標識が放出されて、これにより前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生される）と、
    を含むことを特徴とするキット。
  76. 前記キットは、少なくとも一つの追加的なプライマー、標識プローブ、またはこれらの組み合わせを追加的に含む請求項７５に記載のキット。
  77. 前記少なくとも一つの追加的なプライマーは、一つの標識または多数の標識を含む相互作用的標識システムを含む請求項７６に記載のキット。
  78. 前記ＴＨＤプライマーは、下記一般式Ｉの二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有するか、または下記一般式ＩＩの修飾二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する請求項７５に記載のキット。
    ５’−Ｘｐ−Ｙｑ−Ｚｒ−３’ （Ｉ）
    （式中、Ｘｐは、ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第１プライミング部位であり、Ｙｑは、少なくとも三つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚｒは、ターゲット配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第２プライミング部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ、Ｙ及びＺは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであり、５’−第１プライミング部位のＴｍは、３’−第２プライミング部位のＴｍより高く、前記分割部位は、前記三つの領域のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、ターゲット核酸配列に対するアニーリング側面で、５’−第１プライミング部位が３’−第２プライミング部位から分割されるようにして、これにより、前記オリゴヌクレオチドの前記アニーリング特異性が、５’−第１プライミング部位及び３’−第２プライミング部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＨＤプライマーの全体アニーリング特異性を向上させる。）
    ５’−Ｘ’ｐ−Ｙ’ｑ−Ｚ’ｒ−３’ （ＩＩ）
    （式中、Ｘ’ｐは、ターゲット核酸配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する５’−第２プライミング部位であり、Ｙ’ｑは、少なくとも三つ以上のユニバーサル塩基を含む分割部位であり、Ｚ’ｒは、ターゲット配列と相補的なハイブリッド形成ヌクレオチド配列を有する３’−第１プライミング部位であり、ｐ、ｑ及びｒは、ヌクレオチドの数を示し、Ｘ’、Ｙ’及びＺ’は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであり、５’−第２プライミング部位のＴｍは、３’−第１プライミング部位のＴｍより低く、前記分割部位は、前記Ｘ’ｐ、Ｙ’ｑ及びＺ’ｒの三つの領域のうち、最も低いＴｍを有して、前記分割部位は、ターゲット核酸に対するアニーリングに関して、前記５’−第２プライミング部位を前記３’−第１プライミング部位から分割し、これにより、前記オリゴヌクレオチドの前記アニーリング特異性が、前記５’−第２プライミング部位及び前記３’−第１プライミング部位により二重的に決定されるようにして、これは結局、前記ＴＨＤプライマーの全体アニーリング特異性を向上させる。）
  79. 前記少なくとも一つの追加的なプライマーは、請求項７８に記載の一般式Ｉの二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有する請求項７６または７７に記載のキット。
  80. 前記標識プローブは、請求項７８に記載の一般式ＩＩの修飾二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する請求項７６に記載のキット。
  81. 前記ＴＨＤプライマーは、その５’−末端部位に少なくとも一つの標識を含む請求項７５に記載のキット。
  82. 前記ＴＨＤプライマーは、その５’−末端に少なくとも一つの標識を含む請求項８１に記載のキット。
  83. 前記標識は、化学的標識、酵素標識、放射能標識、蛍光標識、発光標識、化学発光標識または金属標識である請求項７５または７７に記載のキット。
  84. 前記相互作用的標識システムは、蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子の一対であり、前記クエンチャー分子は、前記ＴＨＤプライマー上に前記レポーター分子の蛍光をクエンチングするように位置して、二つの標識は、ヌクレアーゼ切断が起こるＴＨＤプライマー内の一位置により分割されており、これにより、前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、前記位置における切断反応によって前記クエンチャー分子から前記レポーター分子を分離させて、これは、前記ターゲット核酸配列の存在を示す前記シグナルが発生されるようにする請求項７５または７７に記載のキット。
  85. 前記蛍光レポーター分子は、前記ＴＨＤプライマーの５’−末端部位に位置して、前記クエンチャー分子は、前記蛍光レポーター分子から下流に位置する請求項８４に記載のキット。
  86. 前記クエンチャー分子は、前記ＴＨＤプライマーの５’−末端部位に位置して、前記蛍光レポーター分子は、前記クエンチャー分子から下流に位置する請求項８４に記載のキット。
  87. ５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する前記鋳型依存的核酸ポリメラーゼは、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである請求項７５から７７のいずれかに記載のキット。
  88. 前記追加的なプライマー及び／または前記標識プローブに連結された前記標識は、前記ＴＨＤプライマーに連結されたものと相異なっている請求項７６または７７に記載のキット。
  89. 前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、前記ＴＨＤプライマーは、少なくとも２種のプライマーを含む請求項７５に記載のキット。
  90. 前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、前記ＴＨＤプライマーは、少なくとも２種のプライマーを含み、前記追加的なプライマーのそれぞれは、少なくとも２種のプライマーを含む請求項７６に記載のキット。
  91. 前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、前記ＴＨＤプライマーは、少なくとも２種のプライマーを含み、前記標識プローブは、少なくとも２種のプローブを含む請求項７６に記載のキット。
  92. 前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種の核酸配列を含み、前記ＴＨＤプライマーは、少なくとも２種のプライマーを含み、前記追加的なプライマーのそれぞれは、少なくとも２種のプライマーを含み、前記標識プローブは、少なくとも２種のプローブを含む請求項７６に記載のキット。
  93. 前記ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む請求項７５から７７のいずれかに記載のキット。
  94. 前記ターゲット核酸配列は、前増幅された核酸配列である請求項７５から７７のいずれかに記載のキット。
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