CN102782150A - 利用靶杂交及检测引物进行靶检测 - Google Patents

利用靶杂交及检测引物进行靶检测 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用靶杂交及检测引物（THD primer）的靶核酸序列的检测。本发明将对PCR（聚合酶链式反应）反应中使用的引物引入标记，使靶以及信号均得到扩增，并无需使用复杂的寡核苷酸，利用PCR（聚合酶链式反应）反应也可进行实时靶检测。本发明摆脱以往的实时PCR（聚合酶链式反应）方法的顽固的问题以及缺点。本发明仅利用标记引物成功的进行实时靶检测。利用这些本发明的特征，在多路传输方式中可进行优秀的实时靶检测。

Description

利用靶杂交及检测引物进行靶检测
【技术领域】
本发明涉及一种利用靶杂交及检测引物（THD primer）进行靶核酸序列的检测。
【背景技术】
用于检测靶核酸的大部分技术包括靶核酸的扩增过程。核酸扩增是在分子生物学领域中所利用的必须的过程，并对此提出了多种扩增方法。例如，密勒（Miller）、H.I.等（WO89/06700）公开了包括将助催化剂/引物序列与靶单链DNA（"ssDNA"）进行杂交之后，转录上述序列的许多RNA复制过程的核酸序列扩增方法。其他公知的核酸扩增方法包括基于转录的扩增系统（Kwoh，D.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，86:1173（1989）；以及GingerasT.R.etal.，WO88/10315）。
公知为聚合酶连锁反应（以下简称为“PCR”）的最为广泛利用的核酸扩增方法包括双链DNA的变性、向DNA模板进行寡核苷酸引物的退火以及DNA聚合酶引起的引物延长的反复的循环过程（Mullis等，美国专利第4，683，195号，第4，683，202号以及第4，800，159号；Saiki等，（1985）Science 230，1350-1354）。
基于聚合酶链式反应（PCR）的技术不仅利用在靶DNA序列的扩增，还广泛地利用在生物学和医学研究领域中的科学应用或方法中，例如，靶序列的检测、反转录酶-聚合酶链式反应（RT-PCR）、分别表示（DifferentialDisplay）-聚合酶链式反应（DD-PCR）、公知或未知的利用基因的PCR的克隆、cDNA末端的高速扩增（RACE）、任意的引发-聚合酶链式反应（AP-PCR）、多重PCR、单核苷酸多态性（SNP）基因组分型以及基于PCR的基因组分析等（McPherson andMoller，2000）PCR.BIOSScientificPublishers，Springer-VerlagNewYorkBerlinHeidelberg，NY）。
另一方面，基于至今提出的核酸扩增的靶核酸检测方法进行如下概括。
【1．急行-聚合酶链式反应（post-PCR）检测方法】
典型的急行-聚合酶链式反应（post-PCR）方法包括核酸扩增及之后的扩增产物的检测，用于分析靶核酸序列。根据以往的急行-聚合酶链式反应（post-PCR）检测方法，应将扩增产物按其大小差异分离（通常利用凝胶电泳来实施）或通过扩增产物的固定化而分离。但是，分离过程会引起污染以及低工作性等严重的问题。
【2．实时检测方法】
为了克服急行-聚合酶链式反应（post-PCR）方法的问题，提出了实时检测扩增产物的实时PCR的方法，以此摆脱污染，能够定量地分析靶核酸序列。
【2.1利用杂交及延长反应的方法】
【2.1.1发卡式引物的设计方法】
该方法利用发卡式引物（sunrise primer），其通过在5’末端形成发夹环来使一对的荧光团以及猝灭剂相邻近，从而表示出减少的荧光。这样的引物包含在PCR的产物时，其尾部成为双链，并且其发夹环被解开，以此增加荧光（Nazarenko等，2516-2521NucleicAcidsResearch，1997，v.25no.12，以及美国专利第6,117,635号）。但是，就发卡式引物设计方法而言，使引物包含与靶核酸序列互补的序列及能够在其5’末端形成发夹环的序列，这种设计非常复杂，因此大大降低了便利性。
【2.1.2加尾引物的设计方法（蝎形引物设计方法）】
该方法利用加尾（tailed）引物（蝎形引物）以及集成的（integrated）信号系统。上述引物具有模板结合区域以及尾部，尾部包含连接肽与靶结合区域（region）。靶结合区域在引物的延长产物中与互补的序列进行杂交。之后，靶特意杂交结果与信号系统联结，并且杂交引起可检测的变化。加尾引物的连接肽妨碍引物模板的尾部区域的聚合酶-介质链式复制（Whitcombe等，804-807，Nature Biotechnology v.17AUGUST 1999美国专利第6.6，326，145号）。加尾引物应包含用于产生扩增子-依赖性信号的连接肽及与引物延长产物杂交的靶结合区域，因此类似于发卡式引物方法，难以对引物进行设计以及合成。
【2.2利用杂交反应的方法】
【2.2.1分子信标（Molecular beacon）方法】
虽然分子信标包含荧光以及猝灭染料，但是只有在猝灭染料与荧光染料邻近的情况下发生荧光共振能量转移（FRET，fluorescenceresonance energy transfer）。分子信标通过利用发夹结构（液相中自由）而进行设计，并使两个染料邻近。分子信标与靶进行杂交时，荧光及猝灭染料将会分离。不发生荧光共振能量转移（FRET），且荧光染料通过照射（irradiation）来发光（Indian J Med Res 124:385-398（2006）以及Tyagietal，NatureBiotechnologyv.14MARCH 1996）。
但是，分子信标方法存在如下几个缺点。
第一、发夹结构的2个反向重复序列（inverted repeat）应在靶核酸具有互补的配对物，这在靶上也要求反向重复的存在。
第二、具有互补的核酸序列的发夹结构的环部位的Tm以及茎区部位的Tm需仔细地保持均衡，这需从分析温度的观点保持均衡，其无需非特异性伸展（unfolding），在存在靶的情况下使发夹探针可进行特异性伸展。
最终，该方法为了扩增核酸序列需要追加的引物。
【2.2.2杂交探针的设计方法】
该方法利用四个寡核苷酸，即为2个引物以及2个探针。这些杂交探针具有单一标记时，一个具有供体荧光团，另一个具有受体荧光团。2个探针的序列被选为，使这些序列以头尾排列方式（head to tailarrangement）与靶序列进行杂交，并使两个染料相邻近来发生荧光共振能量转移（FRET）。探针中一个探针的受体染料转移能量，另一个探针在其他波长放出荧光。荧光的量与在PCR过程中生成的靶DNA的量成正比例（385-398，Indian J Med Res 124，review article October2006以及303-308以及Bernad等，147-148Clin Chem 2000；4646）。
但是，该方法不适合于多重检测，为了对靶核酸序列进行扩增，需要追加的引物。
【2.3利用杂交以及核酸酶活性的方法】
【2.3.1拖慢（TaqMan）探针方法（5’→3’核酸酶活性）】
这些拖慢（TaqMan）探针制备成，能够在PCR产物的内部进行杂交。在PCR期间，即，聚合酶复制结合有拖慢（TaqMan）探针的模板时，聚合酶的5’外切核酸酶活性用于切割探针。这将分离荧光和猝灭染料，且不再发生荧光共振能量转移（FRET，fluorescenceresonance energy transfer）（385-398，IndianJMedRes 124，reviewarticleOctober 2006以及303-308，美国专利第5,210,015号）。
但是，该方法在利用三个寡核苷酸（1个双重标记探针以及2个引物）的方面具有限界点。该方法导致探针的设计、合成以及反应条件的最佳化变得复杂。
【2.3.2标记引物法（3’→5’核酸酶活性）】
该方法利用在引物的3’末端人为的错配至少1个核苷酸的标记引物。在杂交发生的充分的条件下培养标记引物以及试样，接着，试样暴露于具有3’→5’校正活性的核酸聚合酶，以此放出标记或标记系统的一部分（美国专利第6,248,526号）。
但是，错配引物需设计成复杂的形态，即在其3’末端包含错配核苷酸。更为困难的是在3’-末端与非-靶序列发生错配的情况下，错配的引物由具有3’→5’校正活性的核酸聚合酶来产生假阳性信号的可能性也大。
如上所述，至今开发出的以往的大部分靶检测方法具有本质上的缺点，这将被视为难以克服。
因此，需要开发出改善了技术性-、实践性-以及比容积-效率性的用于检测靶核酸序列的新颖的接近法。
在本说明书全文中参照多个专利及文献，其引用由括号来表示。这些专利及文献，作为参照全部包括在本说明书中，因此能够更加明确地说明本发明所属的技术领域的水准及本发明的内容。
【发明概述】
本发明者为了克服用于检测靶核酸序列的以往技术的缺点而锐意研究努力。本发明者研制出了具有双重功能，即，具有探索以及引发功能的新颖的分析-功能性引物，并利用上述引物定立了用于检测靶核酸序列的多种方案。其结果，本发明者确认了，本发明的新颖的方案或者方法在靶核酸序列的检测，特别是在实时检测的方面呈现出优秀的工作性，且以更强、更快的方式产生用于表示靶核酸序列的信号。
本发明者的核心发现在于，借助模板-依赖性核酸聚合酶发生引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的条件下，与靶核酸序列杂交的引物与具有5’→3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶接触的情况下，其3’-末端被延长并且其5’-末端部位被切割，这是掌握本发明的基础。以这样的发现为基础，在PCR反应中用于生成扩增子的引物包含可检测信号的标记时，查明了在实时PCR反应期间产生信号的原因。经研究本发明，在靶检测方面相比以往的需要追加性的探针或引物的变形的方法，本发明更为有效。本发明的标记引物不仅能够为靶核酸序列的有效检测提供既卓越又灵活的手段（tool），还能够以更简便、更快捷、更经济性的方式进行实时PCR试验的开发。
因此，本发明的目的在于提供一种利用靶杂交及检测引物（THDprimer）的5’-切割反应以及3’-延长反应，从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法。
本发明的再一目的在于提供一种利用伴随有靶杂交及检测引物（THD primer）的5’-切割反应及3’-延长反应的聚合酶连锁反应（PCR），从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法。
本发明的另一目的在于提供一种利用靶杂交及检测引物（检测primer）的5’-切割反应以及3’-延长反应，从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的试剂盒。
参照所附的权利要求书以及附图，能够更加明确地说明本发明的其他目的及优点。
【附图说明】
本发明的基本原理概括在图1-图4。
图1表示关于利用基于具有5’→3’核苷酸活性的模板-依赖性核酸聚合酶的THD引物的5’-切割反应及3’-延长反应，来检测靶核酸序列的试验的步骤。图1a表示具有检测靶核酸序列的常规结构的THD引物的利用。图1b表示，在靶核酸序列的检测上，为了引物退火特异性，利用具有双重引发寡核苷酸（DPO）结构的THD引物。
图2表示利用基于具有5’→3’核苷酸活性的模板-依赖性核酸聚合酶的THD引物的5’-切割反应及3’-延长反应，没有靶核酸序列的扩增地检测靶核酸序列的实时信号扩增试验。图2a表示具有检测靶核酸序列的常规结构的THD引物的利用。图2b表示，在靶核酸序列的检测中，为了引物退火特异性，而利用具有双重引发寡核苷酸（DPO）结构的THD引物。
图3表示利用本发明的THD引物实施的实时PCR过程中靶核酸及信号的实时扩增。图3a表示为了实时PCR扩增，具有常规结构的THD引物的利用。图3b表示，在实时PCR扩增中，为了引物退火特异性，具有双重引发寡核苷酸（DPO）结构的THD引物的利用。
图4表示，在PCR扩增中的THD引物组合的多样性。图4a表示作为正向引物的THD引物、作为反向引物的THD引物或者均作为两种引物的THD引物的利用。图4b表示与标记探针一起利用作为正向引物的THD引物、作为反向引物的THD引物或者均作为两种引物的THD引物的例。图4c表示与作为正向引物的THD引物一起追加地利用上游引物、反向引物或者均作为两种引物的THD引物的例。图4d表示与内部引物一起利用作为正向引物的THD引物、作为反向引物的THD引物或者均作为两种引物的THD引物的例。
图5表示没有变性、杂交、切割及延长的反复地利用本发明的THD引物及Taq DNA聚合酶的，在预定时间间隔中的靶核酸序列的检测。
图6表示与变性、杂交、切割及延长的反复一起利用THD引物及Taq DNA聚合酶的，在dNTP的多种浓度中的实时信号扩增结果。
图7表示对在对肺炎链球菌（SP，Streptococcus pneumoniae）基因的实时PCR扩增中的THD引物及标记探针的比较。图7a表示实时PCR扩增的结果。图7b是呈现实时PCR扩增的结果的琼脂糖凝胶照片。
图8表示对在对脑膜炎奈瑟菌（NM，Neisseria meningitides）基因的实时PCR扩增中的THD引物及标记探针的比较。图8a表示实时PCR扩增的结果。图8b是呈现实时PCR扩增的结果的琼脂糖凝胶照片。
图9表示对在实时PCR扩增中作为正向引物利用THD引物的肺炎链球菌（SP，Streptococcus pneumoniae）基因的实时PCR特异度。
图10表示对在实时PCR扩增中作为正向引物利用THD引物的脑膜炎奈瑟菌（NM，Neisseria meningitides）基因的实时PCR特异度。
图11表示对在实时PCR扩增中作为正向引物利用THD引物的肺炎链球菌（SP，Streptococcus pneumoniae）基因的实时PCR灵敏度。
图12表示对在实时PCR扩增中作为正向引物利用THD引物的脑膜炎奈瑟菌（NM，Neisseria meningitides）基因的实时PCR灵敏度。
图13表示对在嵌套实时PCR扩增中作为正向引物利用THD引物的肺炎链球菌（SP，Streptococcus pneumoniae）基因的实时PCR特异度。
图14表示对在嵌套实时PCR扩增中作为正向引物利用THD引物的肺炎链球菌（SP，Streptococcus pneumoniae）基因的实时PCR灵敏度。
图15表示在对淋病奈瑟菌（NG，Neisseria gonorrhoeae）基因进行的实时PCR扩增中，利用作为正向引物的THD引物、作为反向引物的THD引物或者均作为两种引物的THD引物的结果。
图16表示在对淋病奈瑟菌（NG，Neisseriagonorrhoeae）基因的实时PCR扩增中，组合标记探针与作为正向引物的THD引物、作为反向引物的THD引物或者均作为两种引物的THD引物而利用的结果。
图17表示在对淋病奈瑟菌（NG，Neisseriagonorrhoeae）基因的实时PCR扩增中，组合作为正向引物的THD引物、追加地组合上游引物、反向引物或者均作为两种引物的THD引物而利用的结果。
图18表示在对淋病奈瑟菌（NG，Neisseriagonorrhoeae）基因的实时PCR扩增中，组合内部引物与作为正向引物的THD引物、作为反向引物的THD引物或者均作为两种引物的THD引物而利用的结果。
图19表示在对淋病奈瑟菌（NG，Neisseriagonorrhoeae）基因的实时PCR扩增中，利用THD引物及TaqMan探针的方法的比较。
【发明详述】
本发明介绍利用具有标记的引物以及模板-依赖性核酸聚合酶的5’→3’核酸酶活性来检测靶核酸序列的新颖的方法。尤其是，本发明提出以实时方式检测靶核酸序列的卓越的方法。
如果被命名为靶杂交及检测引物（THD primer）的标记引物与靶核酸序列杂交，则上述引物被延长，以此合成对于靶核酸序列的互补的序列，之后将上述引物切割下来，从上述引物放出标记，以此产生用于表示靶核酸序列存在的信号。即，靶杂交及检测引物经过5’-切割反应以及3’-延长反应过程。
本发明者发现了，将具有包含荧光报道分子以及猝灭分子的相互作用性标记系统的靶杂交及检测引物与靶核酸序列进行杂交之后，与具有5’→3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶进行培养时，标记（标记片段）从靶杂交及检测引物放出而产生用于表示靶核酸序列存在的信号。
并且，本发明者发现了在靶杂交及检测引物3’-末端的延长反应能够降低基于反应温度变化的信号强度的变化（variation）程度，对此可判断出靶杂交及检测引物3’-末端的延长反应可使信号几乎不受反应温度变化或者使之不受影响，终究能够得出更具有可靠性、稳定性的信号结果。此外，在本发明的方法中，靶杂交及检测引物又可用作扩增引物来提供，因此靶核酸序列与信号扩增一同扩增。
根据本发明，利用标记的引物以及模板-依赖性核酸聚合酶的5’→3’核酸酶活性，通过显著提高的有效性及可靠性来可实时检测靶核酸序列。本发明者可知，由本发明者最先提出了这些科学性的结果以及技术性的战略。
3’-延长反应对用于降低随着靶核酸序列与靶杂交及检测引物的杂交稳定化以及反应温度变化而发生的信号强度的变化起重要的作用。
基于如上的本发明者的研究结果，提出本发明的普通的方法如下：通过以往的方法，将标记的引物以及具有5’→3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶与包含靶核酸序列的试样同时进行培养，诱导出引物的3’-延长反应以及5’-切割反应，使得标记从引物放出，最终产生用于表示靶核酸序列存在的信号。
根据本发明，使得相互作用性标记以实时方式检测靶核酸序列，上述相互作用性标记是利用FRET（fluorescence resonance energytransfer）现象的标记。
并且，连续的两个步骤，即，靶核酸序列与引物的杂交以及与具有5’→3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶反复进行的培养，使得对靶核酸序列的信号得到扩增。因此，信号扩增对提高靶检测的灵敏度相当有贡献。
对于本发明来说，同时利用靶杂交及检测引物以及能够扩增靶的配对引物时，不仅能够扩增信号，还能够扩增靶序列，由此成功的提供同类的（homogeneous）试验方法。
本发明的同类的（homogeneous）试验方法与至今开发出的以往的方法明确不同。
为了检测靶提出了利用标记引物的发卡式引物设计方法（Nazarenko等，2516-2521NucleicAcidsResearch，1997，v.25no.12，以及美国专利第6，117，635号）以及蝎形引物设计方法（Whitcombe等，804-807，NatureBiotechnologyv.17AUGUST 1999美国专利第6，326，145号）。这种方法只有在引物延长的时候才能产生表示靶的信号，而不利用核酸聚合酶的5’→3’核酸酶的活性。但是，在本发明的方法中，上述核酸酶的活性对信号的产生起重要的作用。这种信号产生机制的区别在于，以往的方法必须利用复杂结构的引物，本发明提供的方法无需利用复杂的引物，也能够更容易地检测出靶核酸序列。
美国专利第6,248,526号中公开了利用标记引物以及核酸聚合酶的靶检测方法。这种方法为了产生信号，利用核酸聚合酶的3’→5’校正活性来切割标记引物的3’-末端部位。总而言之，以往的方法利用不同于本发明提供的核酸酶活性。在利用核酸聚合酶的3’→5’校正活性的情况下，难以在3’-末端设计包含错配序列的靶-杂交引物。引物仅除了3’-末端的错配序列，与非-靶序列进行杂交时，错配序列借助3’→5’校正活性所切割，产生假阳性信号。但是，本发明无需错配序列，因此摆脱以往方法的问题。
在本领域中利用核酸聚合酶的5’→3’核酸酶活性的拖慢（TaqMan）探针方法主要用于靶检测（美国专利第5,210,015号）。上述方法需要标记探针以及上游引物，以此产生用于表示靶的信号。
拖慢（TaqMan）探针技术提出针对信号产生的两种接近法：聚合-依赖性切割以及聚合-独立性切割。在聚合-依赖性切割中，上游引物的延长必须在核酸聚合酶与标记探针的5’-末端接触之前发生。接着延长反应，聚合酶逐渐地切割标记探针的5’-末端。在聚合-独立性切割中，上游引物以及标记探针非常邻近，以此与靶核酸进行杂交，与上游引物的3’-末端结合的核酸聚合酶与标记探针的5’-末端相接触，最终放出标记。如上所述，为了利用拖慢（TaqMan）探针技术来产生信号，不仅需要上游引物，还需要标记探针。标记探针并不参与靶扩增。
与拖慢（TaqMan）探针技术不同地本发明以独立的方式利用核酸聚合酶的5’→3’核酸酶活性来产生信号，5’→3’核酸酶活性无需其他活性（例如，聚合活性）以及其他添加物（例如，上游引物）也能够表示其核酸切割反应。
本发明者为了克服用于检测靶核酸序列的以往技术的问题而锐意研究。本发明者研制出了具有双重功能，例如，具有探索以及引发功能的新颖的分析-功能性引物，并且定立了利用引物来检测靶核酸序列的多种方案。其结果，本发明者确认到，新颖的方案或者方法非常适合于靶核酸序列的检测，尤其是实时检测，以更强、更快的方式产生用于表示靶核酸序列的信号。
本发明者的核心发现在于，在借助模板-依赖性核酸聚合酶来发生引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的条件下，与靶核酸序列杂交的引物与具有5’→3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶接触时，其3’-末端被延长，并且其5’-末端部位被切割，这就是掌握本发明的基础。基于这些发现确认到，在PCR反应中用于生成扩增子的引物包含可产生检测信号的标记时，在实时PCR反应期间产生信号。以往的方法需要探针或者引物的进一步的变形，可知本发明比以往的方法，在靶检测方面更为有效。本发明的标记引物不仅能够提供用于有效检测靶核酸序列的既卓越又灵活的手段（tool），还能够以更简便、更缩短的、更经济的方式来开发出实时PCR试验的方法。
根据本发明的一实施方式，提供一种利用靶杂交及检测引物（THD primer）的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，包括以下步骤：
步骤（a），对上述靶核酸序列与上述THD引物进行杂交，上述THD引物包含：（i）杂交核苷酸序列，其与上述靶核酸序列互补，以及（ii）相互作用性标记系统，其包含一个标记（label）或者多个标记；
步骤（b），借助模板-依赖性核酸聚合酶发生上述THD引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的条件下，将上述步骤（a）的结果物与具有5’→3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶进行接触，上述THD引物借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的上述聚合酶活性而延长，并且借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的上述5’→3’核酸酶活性所切割，从而上述THD引物放出上述标记（label）或者上述相互作用性标记系统的至少一个标记，以此产生用于表示上述靶核酸序列存在的信号；以及，
步骤（c），对上述信号进行检测，上述信号表示上述靶核酸序列的存在。
根据本发明，与靶核酸序列杂交的寡核苷酸，对靶核酸序列表示出双重功能：第一，互补序列的合成；第二，产生用于表示靶核酸序列的信号。
因此，将上述寡核苷酸命名为“靶杂交及检测引物（THD primer”，且将本发明的方法命名为“THD引物靶检测试验”。
根据本发明，首先靶核酸序列与THD引物进行杂交。
在本说明书中使用的术语“靶核酸”、“靶核酸序列”或者“靶序列”意味着所要检测的核酸序列，且，在杂交、退火或者扩增条件下与引物以及探针进行退火或者杂交。
在本说明书中使用的术语“引物”意味着寡核苷酸，在诱导与核酸链（模板）互补的引物延长产物的合成的条件，即，如核苷酸和DNA聚合酶等聚合剂的存在以及适合的温度与pH的条件下，可起到合成的起始点的作用。优选地，引物在扩增中作为具有最大有效性的单链。优选地，引物为寡脱氧核糖核苷酸。在本发明中利用的引物可包含自然（naturally occurring）脱氧单磷酸核苷（dNMP）（即，脱氧腺苷酸（dAMP）、dGMP（脱氧鸟苷酸）、dCMP（脱氧胞苷酸）及dTMP（脱氧胸苷酸））、变形的核苷酸或者非-自然核苷酸。并且，探针还可包含核糖核苷酸。
就引物而言，应充分长，以便能够在聚合剂的存在之下引发延长产物的合成。引物的适合的长度取决于多个因素，例如，温度、应用领域及引物的根源（source）。在本说明书中使用的术语“退火”或“引发”意味着在模板核酸并置（apposition）寡脱氧核苷酸或者核酸，就上述并置而言，通过聚合酶对核苷酸进行聚合而在模板核酸或者其一部分形成互补的核酸分子。
在本说明书中使用的术语“杂交（hybridization）”意味着互补的单链核酸形成双链核酸。在本说明书中使用的术语“退火”和“杂交”没有区分，在本说明书中混用。
在本说明书中使用的术语“THD引物”意味着与靶核酸序列杂交的引物，该引物诱导出靶核酸序列的互补的序列的生产，其5’-末端部位由具有5'→3'核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶所切割。
本说明书中使用的术语“正向引物”意味着与向3’→5’方向排列的靶核酸序列的单链互补的引物。反向引物在上述核酸序列的另一侧链上具有互补的序列。
说明书中使用的术语“上游引物”意味着，与在目的（或者关注的）引物（a primer of interest）进行杂交的位点（site）的上游位点杂交的引物，与目的（或者关注的）引物具有相同的方向性。
本说明书中使用的术语“下游引物”意味着，在目的（或者关注的）引物（aprimerofinterest）进行杂交位点（site）的下游位点进行杂交的引物，且，与目的（或者关注的）引物具有相同的方向性。
THD引物包含：（i）杂交核苷酸序列，其与上述靶核酸序列互补，以及（ii）相互作用性标记系统，其包含一个标记或者多个标记。在本说明书中使用的术语“互补的”意味着在预定的退火条件或者严格条件（stringent conditions）下引物或者探针以选择性地与靶核酸序列杂交的程度充分地互补，并包括术语“实质上互补的（substantiallycomplementary）”及“完全互补的（perfectly complementary）”，优选地意味着完全互补的意思。
根据本发明的优选实施例，THD引物的5’-末端或者5’-末端部位与靶核酸序列是完全互补的。
在本说明书中提及THD引物而使用的术语“5’-末端部位”意味着，从THD引物的5’-末端包含某一长度的连续序列的部位或者区域。优选地，THD引物的5’-末端部位由从其5’-末端包含1-10核苷酸的序列组成（更优选为1-5核苷酸，进而优选为1-3核苷酸）。
本发明中所利用的，产生可检测信号的标记均包含本发明所属技术领域公知的任何标记。大部分标记包含单分子或者单原子（atom）标记；但是，部分标记（例如，相互作用性标记系统）包含至少两个或者其以上的标记分子或者原子。
根据本发明的优选实例，THD引物在其5’-末端部位包含至少一个标记（更优选地，包含来自5’-末端的1-10核苷酸的序列的任何位点（site），进而优选地，包含来自5’-末端的1-5核苷酸的序列的任何位点，尤其优选地，包含来自5’-末端的1-3核苷酸的序列的任何位点）。最优选地，THD引物在其5’-末端包含至少一个标记。
在模板-依赖性核酸聚合酶的5’→3’核酸酶活性为5’→3’外切核酸酶活性的情况下，与THD引物的5’-末端连接的标记可借助外切核酸酶的活性所切割。在模板-依赖性核酸聚合酶的5’→3’核酸酶活性为5’→3’内切核酸酶活性的情况下，与从THD引物的5’-末端隔开1-3核苷酸的位点连接的标记可借助内切核酸酶的活性所切割。
除了包含至少两种标记分子的相互作用性标记系统以外，一个或者一个以上的标记（优选地，一个标记）可与THD引物的5’-末端部位连接。例如，利用包含一对的供体分子以及受体分子的相互作用性标记系统的情况下，如果两个分子之间发生能量传递，上述一对中的一个与THD引物的5’-末端部位连接，另一个可与THD引物的任何位点连接。
根据本发明的优选实例，用于产生可检测的信号的标记为化学标记、酶标记、放射性标记、荧光标记、发光标记、化学发光标记或者金属标记（例如，金）。
上述化学标记包含生物素。链霉亲和素（或者抗生物素蛋白）与生物素的结合特异性产生表示靶核酸序列的间接性信号。
上述酶标记包含碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）、β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）、β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）、荧光素酶（luciferase）、细胞色素（cytochrome）P450及辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase）。利用对于上述酶标记的基质，从而能够得到表示靶核酸序列的信号。利用碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）时，5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐（BCIP，bromochloroindolylphosphate）、氮蓝四唑（NBT，nitro bluetetrazolium）或者无元素氯（ECF，elemental chlorine free）可作为对于显色反应的基质而利用，利用辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase）时，氯萘酚（chloronaphtol）、氨基乙基咔唑（aminoethylcarbazol）、二氨基联苯胺（diaminobenzidine）、D-虫荧光素（D-luciferin）、光泽精（lucigenin）（双（N-甲基二吖啶）硝酸盐：bis-N-methylacridiniumnitrate）、苄氧基试卤灵（resorufinbenzyl ether）、鲁米诺（luminol）、安普思红试剂（AmplexRedreagent）（10-乙酰基-3,7-二羟基吩恶嗪（10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine））、HYR（对苯二胺-氯化氢（p-phenylenediamine-HCl）及邻苯二酚（pyrocatechol））、TMB（3,3’,5,5’-四甲基联苯胺：3,3’,5,5’-TETRAMETHYLBENZIDINE）、ABTS（2，2-连氮-二（3-乙基苯并噻唑啉磺酸酯）：2，2-AZINE-DI[3-ETHYLBENZTHIAZOLINESULFONATE]）、邻苯二胺（OPD：o-phenylenediamine）或者萘酚/派洛宁（naphtol/pyronine）可作为基质而利用；并且利用葡糖氧化酶（glucoseoxidase）时，t-NBT（氮蓝四唑）或者m-PMS（吩嗪硫酸甲酯：phenazinemethosulfate）可作为基质而利用。
上述放射性标记包含C14、I125、P32及S35。
根据本发明的优选实例，与THD引物连接的标记为能够提供实时信号的单一标记。例如，上述单一标记为荧光铽（Tb）螯合物（terbiumchelate）（Nurmi等，Nucleic Acids Research，2000，Vol．28No．8）。努米（Nurmi）等提出了上述标记在探针-连接的形态中放出低水准的荧光，但是借助5’→3’核酸切割活性而从探针-模板二聚物解离时，增加荧光信号。因此，单一标记与探针或者THD引物连接时，上述荧光铽（Tb）螯合物在本发明中能够实现实时靶检测。
上述相互作用性标记系统为能量非-放射性地（non-radioacively）传达到供体分子及受体分子之间的信号产生系统。
作为相互作用性标记系统的代表性例子，荧光共振能量转移技术（FRET，fluorescence resonance energy transfer）标记系统包含荧光报道分子（供体分子）及猝灭分子（受体分子）。在荧光共振能量转移技术中，能量供体为荧光性，但是，能量受体可以是荧光性或者非-荧光性。
在相互作用性标记系统的再一形态中，能量供体为非-荧光性，例如，为发色团（chromophore），能量受体为荧光性。在相互作用性标记系统的另一形态中，能量供体为发光性，例如，生物发光性、化学发光性或者电化学发光性，受体为荧光性。
更优选地，用于表示靶核酸序列的信号借助相互作用性标记系统来产生，进而优选为荧光共振能量转移标记系统。
利用荧光共振能量转移标记时，两种标记（位于THD引物上的荧光报道分子及猝灭分子，上述猝灭分子位于猝灭上述报道分子的荧光的位点）借助THD引物内的一个位点（产生核酸酶切割的部位）而分离，由此模板-依赖性核酸聚合酶的5’→3’核酸酶活性通过在上述位点的切割反应从猝灭分子分离报道分子，这将会产生用于表示靶核酸序列的存在的信号。
根据本发明的优选实例，荧光报道分子位于THD引物的5’-末端部位（更优选为5’-末端），猝灭分子位于荧光报道分子的下游位点。选择性地，猝灭分子位于THD引物的5’-末端部位（更优选地，5’-末端），荧光报道分子位于上述猝灭分子的下游位点。
在本发明中利用的荧光分子以及猝灭分子还可以是荧光物质。报道分子以及猝灭分子可利用本发明所属技术领域中公知的任何标记，例如：Cy2TM（506）、YOPROTM-1（509）、YOYOTM-1（509）、Calcein（517）、FITC（518）、FluorXTM（519）、AlexaTM（520）、Rhodamine110（520）、5-FAM（522）、Oregon GreenTM500（522）、Oregon 25GreenTM488（524）、RiboGreenTM（525）、Rhodamine GreenTM（527）、Rhodamine123（529）、Magnesium GreenTM（531）、Calcium GreenTM（533）、TO-PROTM-1（533）、TOTO1（533）、JOE（548）、BODIPY530/550（550）、Dil（565）、BODIPY TMR（568）、BODIPY558/568（568）、BODIPY564/570（570）、Cy3TM（570）、AlexaTM546（570）、TRITC（572）、Magnesium OrangeTM（575）、Phucoerythrin R&B（575）、Rhodamine Phalloidin（575）、CalciumOrangeTM（576）、PyroninY（580）、Rhodamine B（580）、TAMRA（582）、Rhodamine RedTM（590）、Cy3.5TM（596）、ROX（608）、Calcium CrimsonTM（615）、AlexaTM594（615）、Texas Red（615）、Nile Red（628）、YO-PROTM-3（631）、YOYOTM-3（631）、Rphycocyanin（642）、C-Phycocyanin（648）、TO-PROTM-3（660）、TOTO3（660）、DiD DilC（5）（665）、Cy5TM（670）、Thiadicarbocyanine（671）以及Cy5.5（694）。括号的数字为以纳米单位表示的最大发光波长。
适合的一对报道分子-猝灭分子公开在如下的许多文献中：Pesce等，editors，FLUORESCENCE SPECTROSCOPY（MarcelDekker,NewYork,1971）；White等，FLUORESCENCEANALYSIS：A PRACTICAL APPROACH（MarcelDekker,NewYork,1970）；Berlman，HANDBOOK OFFLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES，2ndEDITION（AcademicPress,NewYork，1971）；Griffiths，COLOUR ANDCONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES（AcademicPress,NewYork,1976）；Bishop，editor，INDICATORS（PergamonPress,Oxford,1972）；Haugland，HANDBOOK OFFLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS（Molecular Probes,Eugene,1992）；Pringsheim，FLUORESCENCEAND PHOSPHORES CENCE（IntersciencePublishers,NewYork,1949）；Haugland，R.P.,HANDBOOK OFFLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS，SixthEdition，Molecular Probes，Eugene，Oreg.,1996；美国专利第3,996,345号以及第4,351,760号。
本发明中，值得关注的是可以利用能够对广范围波长或者特定波长的荧光进行猝灭的非-荧光黑猝灭分子。
在应用于THD引物的荧光共振能量转移标记中，报道分子包含荧光共振能量转移的供体，猝灭分子包含荧光共振能量转移的剩余伙伴（受体）。例如，荧光素染料（fluorescein dye）利用为报道分子，罗丹明染料（rhodamine dye）利用为猝灭分子。
本发明利用包含聚合酶活性以及5’→3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶的两种不同的活性。本说明书中使用的术语“5’→3’核酸酶活性”通常意味着与DNA聚合酶建立关联的5’→3’外切核酸酶活性（以此核苷酸从与模板杂交的寡核苷酸的5’-末端开始被切割）或者5’→3’内切核酸酶活性（从与模板杂交的寡核苷酸的5’-末端隔开一个以上核苷酸的位点被切割）。
在本说明书中，将借助聚合酶活性而发生催化的反应表现为3’-延长反应。在本说明书中，将借助5’→3’核酸酶活性而催化的反应表现为5’-切割反应。
5’-切割反应意味着，与靶核酸序列杂交的寡核苷酸（例如，引物以及探针）的5’-末端或者5’-末端部位（例如，从5’-末端隔开一个以上核苷酸）的核酸切割反应。该反应引起引物以及探针的切割现象，产生各种大小的核苷酸切片。
3’-延长反应意味着借助模板-依赖性核酸聚合酶而发生的引物3’-末端的核酸聚合反应。
本说明书中使用的“标记的放出”的表现包括标记自身的放出或者包含标记（或多个标记）的核苷酸切片的（或多个核苷酸切片）放出。利用于本发明的寡核苷酸（例如，引物以及探针）包含至少两种标记时，“标记的放出”的表现意味着至少一种标记的放出或者包含至少一种标记的至少一种核苷酸切片的放出。
本说明书中使用的“相互作用性标记系统的至少一种标记的放出”的表现意味着组成相互作用性标记系统的多个标记中至少一种标记本身的放出，或者包含至少一种标记的核苷酸切片（多个核苷酸切片）的放出。
本发明通常包括用于检测靶核酸序列的六个具体方案，但不局限于此：
第一方案为仅利用THD引物来检测核酸序列。
第二方案为利用THD引物以及标记探针来检测靶核酸序列。
第三方案为利用THD引物以及上游引物（或者下游引物）来检测靶核酸序列。
第四方案为利用正向引物以及反向引物中的至少一个引物为THD引物的一对引物来检测靶核酸序列。
第五方案为利用（i）正向引物以及反向引物中至少一个引物为THD引物的一对引物，以及（ii）标记探针来检测靶核酸序列。
第六方案为利用（i）正向引物以及反向引物中至少一个引物为THD引物的一对引物，以及（ii）上游引物（或者下游引物）来检测靶核酸序列。
如下，将对所有的检测方案进行详细的说明。
【1．利用THD引物的THD引物靶检测试验】
根据本发明的最基本过程的第一方案，与靶核酸序列杂交的THD引物被延长的情况下，其由具有5’→3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶所切割，使得标记从THD引物放出，以此产生用于表示靶核酸序列存在的信号。
第一方案包括如下的步骤：
步骤（a），对靶核酸序列与THD引物进行杂交，上述THD引物包含：（i）杂交核苷酸序列，其与靶核酸序列互补，以及（ii）相互作用性标记系统，其包含一个标记或者多个标记；
步骤（b），借助模板-依赖性核酸聚合酶发生上述THD引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的条件下，将上述步骤（a）的结果物与具有5’→3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶进行接触；上述THD引物借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的上述聚合酶的活性而延长，并且借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的上述5’→3’核酸酶活性所切割，从而上述THD引物放出上述标记（label）或者上述相互作用性标记系统的至少一个的标记，以此产生用于表示上述靶核酸序列的存在的信号；以及，
步骤（c），对上述信号进行检测，上述信号表示上述靶核酸序列的存在。
图1表示第一方案的基本步骤，图5表示，无需反复地进行变性、杂交、切割以及延长，利用本发明的THD引物以及Taq DNA聚合酶的、在预定时间间隔内的靶核酸序列的检测。
优选地，上述方法在反复循环之间包括变性过程，还包括至少反复进行两次上述步骤（a）-步骤（b）或者步骤（a）-步骤（c）的步骤，以便扩增用于表示靶核酸序列存在的信号。反复循环切割与靶核酸序列杂交的THD引物，贡献于表示靶核酸序列存在信号的扩增。这样的信号扩增被视为实时信号扩增。
优选地，第一方案包括以下步骤：
步骤（a），对靶核酸序列与THD引物进行杂交，上述THD引物包含：（i）杂交核苷酸序列，其与上述靶核酸序列互补，以及（ii）相互作用性标记系统，其包含一个标记或者多个标记；
步骤（b），借助模板-依赖性核酸聚合酶发生上述THD引物的5’-切割反应以及3’-延长反应发生的条件下，将上述步骤（a）的结果物与具有5’→3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶进行接触；上述THD引物借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的上述聚合酶的活性而延长，并且借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的上述5’→3’核酸酶活性所切割，从而上述THD引物放出上述标记（label）或者上述相互作用性标记系统的至少一个标记，以此产生用于表示上述靶核酸序列的存在的信号；
步骤（b'），使步骤（b）的上述结果物发生变性；
步骤（b"），至少反复两次上述步骤（a）-步骤（b'），用于对表示上述靶核酸序列存在的所有的上述信号进行扩增；以及，
步骤（c），用于检测上述靶核酸序列存在的上述信号，上述检测在步骤（b"）的上述反复的各循环中，在步骤（b"）的上述反复的终点或者步骤（b"）的上述反复过程中的各个预定时间间隔内实施，这些信号表示靶核酸序列的存在。
图2表示包括上述反复步骤的该方法，图6表示利用变性、杂交、切割以及反复延长的同时利用THD引物以及Taq DNA聚合酶的，在dNTP各种浓度中的实时信号扩增结果。
根据第一方案，表示靶核酸序列的存在的信号仅借助THD引物中的切割反应来发生或扩增。
步骤（b）的上述结果物的变性使通过步骤（b）中形成的双链二聚物变成单链核酸。关于变性的方法包括加热、碱、甲酰胺、尿素及乙醇酸处理、酶方法（例如，解旋酶反应）及结合蛋白质，但并不局限于此。例如，变性可以通过以80℃至105℃范围的温度进行加热而达成。用于达成这种处理的一般的方法提供在Joseph Sambrook，等，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，ColdSpring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.（2001）。
根据本发明的优选实例，信号的检测，以实时方式、终-点（end-point）方式或者以预定时间间隔（predetermined time interval）方式来实施。实时方式中的检测指反复的各循环中检测信号。终-点方式中的检测指反复的终点检测信号的方法。预定时间间隔方式中的检测指在反复过程期间在各个预定时间间隔检测信号的方法。
本发明非常适合靶核酸序列的多重检测。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列至少包含两种核酸序列（更优选为至少三种，最优选为至少五种），上述THD引物包含至少二种引物（更优选为至少三种，最优选为至少五种）。
利用至少两个THD引物的情况下，可制备出根据不同的分析目的以不同的组合来包含标记的引物。例如，多个THD引物可与全部相同的标记、全部不同的标记或者部分不同的标记连接。并且，要么部分或全部不同，要么部分或全部相同的至少两个标记可与一个THD引物相连接。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含核苷酸变异。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列为预-扩增的核酸序列。本发明利用预-扩增的核酸序列，使得对靶检测的灵敏度以及特异性显著提高。少量的靶核酸序列以适当的水准进行预-扩增之后，基于本发明来进行检测，从而大大提高靶检测的灵敏度。有趣的是，能够与预-扩增反应中利用的引物的下游序列进行杂交的THD引物，也可用作提高靶检测特异性的套式引物。
【2．利用THD引物以及标记探针的THD引物靶检测试验】
第二方案不仅利用THD引物，还利用标记探针。标记探针具有产生可检测信号的标记，标记探针与THD引物进行杂交的位点（site）的下游位点进行杂交，且与THD引物具有相同的方向性，在连续的步骤中被切割。
标记探针的3’-末端被阻断（blocking），以便抑制延长。就上述阻断而言，可以利用非-互补的碱基或者在其最后核苷酸的3’羟基添加如生物素或者磷酸盐基的化学组成部分（moiety）而达成。并且，阻断过程可利用去除3’-OH或者如双脱氧核苷酸一样没有3’-OH的核苷酸来实现。
本说明书中利用的术语“探针（probe）”意味着与靶核酸序列实质性的互补的部位或者包含这些部位的单-链核酸分子。
第二方案中，不仅是THD引物，还有标记探针都能够产生信号，因此相比仅利用THD引物的第一方案，对靶核酸序列就有更高的信号强度。
对标记探针有用的标记如THD引物中所述。优选地，标记为FRET标记。
并且，标记探针由具有5’→3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶所切割，使标记从标记探针放出。因此，第二方案提供用于表示靶核酸序列存在的两个不同信号。
根据第二方案，与靶核酸序列杂交的THD引物延长的情况下，由具有5’→3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶，在THD引物和/或标记探针中发生5’-切割反应，从而标记从THD引物和/或标记探针放出，以此产生用于表示靶核酸序列的存在的信号。
第二方案包括如下的步骤：
步骤（a），对靶核酸序列、THD引物以及标记探针进行杂交，上述THD引物包含：（i）杂交核苷酸序列，其与靶核酸序列互补，以及（ii）相互作用性标记系统，其包含一个标记或者多个标记；
步骤（b），借助模板-依赖性核酸聚合酶发生上述THD引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的条件下，将上述步骤（a）的结果物与具有5’→3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶进行接触，上述THD引物借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的上述聚合酶活性而延长，并且借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的上述5’→3’核酸酶活性所切割，从而上述THD引物放出上述标记（label）或者上述相互作用性标记系统的至少一个标记，以此产生用于表示上述靶核酸序列存在的信号；上述标记探针借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的上述5’→3’核酸酶活性所切割，以此产生用于表示上述靶核酸序列存在的信号；以及，
步骤（c），对上述信号进行检测，上述信号表示上述靶核酸序列的存在。
优选地，第二方案在反复循环之间包括变性过程，还包括至少反复进行两次上述步骤（a）-步骤（b）或者步骤（a）-步骤（c）的步骤，以便扩增用于显示靶核酸序列存在的信号。
具体地，第二方案包括如下的步骤：
步骤（a），对靶核酸序列、THD引物以及标记探针进行杂交，上述THD引物包含：（i）杂交核苷酸序列，其与上述靶核酸序列互补，以及（ii）相互作用性标记系统，其包含一个标记或者多个标记；上述标记探针与在THD引物进行杂交的位点（site）的下游位点杂交，并且与THD引物具有相同的方向性；
步骤（b），借助模板-依赖性核酸聚合酶发生上述THD引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的条件下，将上述步骤（a）的结果物与具有5’→3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶进行接触：上述THD引物借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的上述聚合酶活性而延长，并且借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的上述5’→3’核酸酶活性所切割，从而上述THD引物放出上述标记或者上述相互作用性标记系统的至少一个标记；上述标记探针借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的上述5’→3’核酸酶活性所切割，使得上述探针放出上述标记，以此产生用于表示上述靶核酸序列存在的信号；
步骤（b'），使步骤（b）的上述结果物发生变性；
步骤（b"），至少反复两次上述步骤（a）-步骤（b'），对表示上述靶核酸序列存在的上述所有信号进行扩增；以及，
步骤（c），用于检测表示上述靶核酸序列存在的上述信号；上述检测在步骤（b"）的上述反复的各循环中，在步骤（b"）的上述反复的终点或者步骤（b"）的上述反复期间的各个预定时间间隔内实施，这些信号表示靶核酸序列的存在。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含至少两种核酸序列（更优选为，至少三种，最优选为至少5种），上述THD引物包含至少两种引物（更优选为，至少三种，最优选为至少5种），上述标记探针包含至少两种探针（更优选为，至少三种，最优选为至少5种）。
在利用至少两个THD引物以及至少两个探针的情况下，这些根据分析目的，可制备出以多种组合包含标记。例如，多个THD引物以及至少两个探针可与全部相同的标记、全部不同的标记或者部分不同的标记进行连接。并且，要么部分或全部不同，要么部分或全部相同的至少两个标记可与一个THD引物或者一个探针进行连接。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含核苷酸变异。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列为预-扩增出的核酸序列。
【3．利用THD引物以及上游引物（或者下游引物）的THD引物靶检测试验】
根据第三方案，在与靶核酸序列杂交的THD引物以及上游引物（或者下游引物）延长的情况下，由具有5’→3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶，在THD引物和/或上游引物（或者下游引物）发生5’-切割反应，使得标记从THD引物放出，以此产生用于表示靶核酸序列存在的信号。
上游引物与在THD引物进行杂交的位点（site）的上游位点杂交，且具有与THD引物相同的方向性。下游引物与在THD引物进行杂交的位点（site）的下游位点杂交，并具有与THD引物相同的方向性。
第三方案包括如下步骤：
步骤（a），对靶核酸序列、THD引物以及上游引物或者下游引物进行杂交，上述THD引物包含：（i）杂交核苷酸序列，其与靶核酸序列互补，以及（ii）相互作用性标记系统，其包含一个标记或者多个标记；上述上游引物与在THD引物进行杂交的位点（site）的上游位点杂交，具有与THD引物相同的方向性；上述下游引物与在THD引物进行杂交的位点（site）的下游位点杂交，并具有与THD引物相同的方向性；
步骤（b），借助模板-依赖性核酸聚合酶发生上述THD引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的条件下，将上述步骤（a）的结果物与具有5’→3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶进行接触，上述THD引物借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的上述聚合酶活性而延长，并且，借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的上述5’→3’核酸酶活性所切割，从而上述THD引物放出上述标记（label）或者上述相互作用性标记系统的至少一个标记，以此产生用于表示上述靶核酸序列存在的信号；以及，
步骤（c），对上述信号进行检测，上述信号表示上述靶核酸序列的存在。
优选地，上述方法在反复循环之间包括变性过程，还包括至少反复进行两次上述步骤（a）-步骤（b）或者步骤（a）-步骤（c）的步骤，以便扩增用于显示靶核酸序列存在的信号。反复循环切割与靶核酸序列进行杂交的THD引物，贡献于表示靶核酸序列存在信号的扩增。
具体地，第三方案包括如下的步骤：
步骤（a），对靶核酸序列、THD引物以及上游引物或者下游引物进行杂交，上述THD引物包含：（i）杂交核苷酸序列，其与靶核酸序列互补，以及（ii）相互作用性标记系统，其包含一个标记或者多个标记；上述上游引物与在THD引物进行杂交的位点（site）的上游位点进行杂交，具有与THD引物相同的方向性；上述下游引物与在THD引物进行杂交的位点（site）的下游位点进行杂交，并具有与THD引物相同的方向性；
步骤（b），借助模板-依赖性核酸聚合酶发生上述THD引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的条件下，将上述步骤（a）的结果物与具有5’→3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶进行接触，上述THD引物借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的上述聚合酶活性而延长，并且借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的上述5’→3’核酸酶活性所切割，从而上述THD引物放出上述标记（label）或者上述相互作用性标记系统的至少一个标记，以此产生用于表示上述靶核酸序列存在的信号；
步骤（b'），使步骤（b）的上述结果物变形；
步骤（b"），至少反复两次上述步骤（a）-（b'），对用于表示上述靶核酸序列存在的所有的上述信号进行扩增；以及，
步骤（c），用于检测表示上述靶核酸序列存在的上述信号，在步骤（b"）的上述反复的各循环中进行上述检测，在步骤（b"）的上述反复的终点或者步骤（b"）的上述反复进行期间在各预定时间间隔实施，且这些信号表示靶核酸序列的存在。
根据本发明的优选实例，上游引物或者下游引物具有产生可检测信号的标记。与上游引物或者下游引物连接的标记与THD引物连接的标记可同时从步骤（b）中放出，并且可参与步骤（c）发出的信号。根据实例，与上游引物或者下游引物连接的标记不同于与THD引物连接的标记。有用于上游引物或者下游引物的标记如THD引物的说明相同。优选地，标记为FRET标记。
上游引物或者下游引物具有标记的情况下，第三方案不仅是THD引物，还从标记的上游引物（或者标记的下游引物）也可产生信号，因此相比仅利用THD引物的第一方案相比，对靶核酸序列可产生更高的信号强度。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含至少两种核酸序列（更优选为至少三种，最优选为至少五种），上述THD引物包含至少两种引物（更优选为至少三种，最优选为至少五种），上述上游引物（或者下游引物）包含至少两种引物（更优选为，至少三种，最优选为至少五种）。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含核苷酸变异。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列为预-扩增的核酸序列。
【4．利用THD引物的实时靶扩增试验】
根据第四方案，由正向引物以及反向引物组成，其中，作为至少一个引物与靶核酸序列进行杂交的THD引物的一对引物延长的情况下，由具有5’→3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶，在两个引物中发生5’-切割反应，使得标记从THD引物放出，以此产生用于表示靶核酸序列存在的信号（图3）。
在正向引物以及反向引物中至少一个引物，即，作为THD引物的一对引物在反复实施步骤的情况下均可进行靶扩增以及信号扩增。
根据本发明的优选实例，本发明的方法包括如下的步骤：
步骤（a），对上述靶核酸序列与一对引物进行杂交，上述一对引物由正向引物以及反向引物组成，其中，至少一个引物为能够对上述靶核酸序列进行扩增的上述THD引物；上述THD引物包含：（i）杂交核苷酸序列，其与上述靶核酸序列互补，以及（ii）相互作用性标记系统，其包含一个标记（label）或者多个标记；
步骤（b），借助模板-依赖性核酸聚合酶发生上述两个引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的条件下，将上述步骤（a）的结果物与具有5’→3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶进行接触，上述两个引物借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的上述聚合酶活性而延长，借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的上述5’→3’核酸酶活性所切割，使得上述两个引物中的上述THD引物中放出上述标记（label）或者上述相互作用性标记系统的至少一个标记，以此产生用于表示上述靶核酸序列存在的信号；
步骤（c），使步骤（b）的上述结果物发生变性；
步骤（d），至少反复两次上述步骤（a）-步骤（c）；用于扩增对上述靶核酸序列以及表示上述靶核酸序列存在的所有的上述信号；以及，
步骤（e），用于检测表示上述靶核酸序列存在的上述信号；上述检测在步骤（d）的上述反复的各循环中，在步骤（d）的上述反复的终点或者上述反复期间的各个时间间隔内实施，这些信号表示靶核酸序列的存在。
第四方案利用由正向引物以及反向引物组成的一对引物。两个引物中至少一个为THD引物。
根据本发明的优选实例，步骤（a）利用针对THD引物具有反方向的至少一个追加的标记探针来实施。此时，模板（即，靶核酸序列）的可利用性更为提高，且可利用于THD引物的杂交。
根据本发明的优选实例，两个引物均具有步骤（b）中放出的一个标记。与两个引物连接的标记相同或者不同。作为THD引物的配对引物的有效标记，如THD引物说明。优选地，标记为FRET标记。
步骤（b）的上述结果物的变性使步骤（b）形成的双链二聚物变成单链核酸。关于变性的方法包括加热、碱、甲酰胺、尿素及乙醇酸处理、酶方法（例如，解旋酶反应）及结合蛋白质，但并不局限于此。例如，变性可以通过以80℃至105℃范围的温度进行加热而达成。用于达成这种处理的一般的方法提供在Joseph Sambrook,等，MolecularCloning，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.（2001）。
本发明非常适合于靶核酸序列的多重检测。本发明者可知，本发明是能够实现多重实时检测的唯一的方法。
第四方案，如图4所述，可制备出THD引物的多种组合。（A）作为正向引物的THD引物；（B）作为反向引物的THD引物；以及（C）作为正向引物及反向引物的THD引物。
图15表示对淋病奈瑟菌（NG，Neisseria gonorrhoeae）基因进行的实时PCR扩增中，利用正向引物、反向引物或者作为这两种引物的THD引物的图4a的引物组合的结果。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含至少两种核酸序列（更优选为至少三种，最优选为至少五种），上述THD引物包含至少两种引物（更优选为至少三种，最优选为至少五种），两个引物包含至少两种引物（更优选为至少三种，最优选为至少五种）。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含核苷酸变异。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列为预-扩增的核酸序列。本发明的方法利用预-扩增的核酸序列作为初始物质时，可诱导出套式扩增，以便大大改善靶检测中的灵敏度以及特异性。
【5．利用THD引物以及标记探针的实时靶扩增试验】
第五方案，不仅利用正向引物以及反向引物中至少一个引物为THD引物的一对引物，还利用标记探针。标记探针具有产生可检测信号的标记，标记探针与在THD引物进行杂交的位点（site）的下游位点杂交，具有与THD引物相同的方向性，之后在后续的步骤中被切割。两个引物与靶核酸序列进行杂交而延长的情况下，两个引物由具有5’→3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶而发生5’-切割反应，使标记从两个引物中的THD引物放出；就上述标记探针而言，其3’-末端发生变形，防止模板-依赖性核酸聚合酶引起的延长，并且在上述两个引物之间的一个位点上进行杂交和切割，使与上述标记探针连接的标记放出，以此产生用于表示靶核酸序列存在的信号（图4b）。
根据本发明的优选实例，本发明的方法包括如下步骤：
步骤（a），对上述靶核酸序列与一对引物以及追加的标记探针进行杂交，上述一对引物由能够对上述靶核酸序列进行扩增的正向引物以及反向引物组成，其中，至少一个引物为上述THD引物；上述THD引物包含：（i）杂交核苷酸序列，其与上述靶核酸序列互补，以及（ii）相互作用性标记系统，其包含一个标记（label）或者多个标记；就上述标记探针而言，其3’-末端发生变形，防止模板-依赖性核酸聚合酶引起的延长，并与上述两个引物之间的某一位点进行杂交；
步骤（b），借助模板-依赖性核酸聚合酶发生上述两个引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的条件下，将上述步骤（a）的结果物与具有5’→3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶进行接触，上述两个引物借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的上述聚合酶活性而延长，并且借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的上述5’→3’核酸酶活性所切割，使得上述两个引物中的上述THD引物中放出上述标记（label）或上述相互作用性标记系统中的至少一个标记；上述标记探针借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的上述5’→3’核酸酶活性所切割，使上述探针放出标记，以此产生用于表示上述靶核酸序列存在的信号；
步骤（c），使步骤（b）的上述结果物发生变性；
步骤（d），至少反复两次上述步骤（a）-步骤（c），对上述靶核酸序列以及表示上述靶核酸序列存在的上述所有信号进行扩增；以及，
步骤（e），用于检测表示上述靶核酸序列存在的上述信号；上述检测在步骤（d）的上述反复的各循环中，在步骤（d）的上述反复的终点或者上述反复期间的各个时间间隔内实施，这些信号表示靶核酸序列的存在。
根据本发明的优选实例，步骤（a）利用具有与THD引物的方向相反的方向的至少一个追加引物来实施。这时，可更多利用模板（即，靶核酸序列），可利用于对THD引物以及上游引物（或者下游引物）的杂交。
根据本发明的优选实例，两个引物均具有步骤（b）中放出的标记。与两个引物连接的标记相同或者不同。对THD引物的配对引物有用的标记如同THD引物说明。优选地，标记为FRET标记。
第五方案，如图4b所示，可制备出一对引物以及标记探针的各种组合。其为如下：（A）作为正向引物的THD引物；（B）作为反向引物的THD引物；以及（C）作为正向引物及反向引物的THD引物。
图16表示图4b例示的引物组合的结果，并对淋病奈瑟菌（NG，Neisseria gonorrhoeae）基因进行的实时PCR扩增中，与标记探针同时利用正向引物、反向引物或者作为正向引物以及反向引物的THD引物。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含至少两种核酸序列（更优选为至少三种，最优选为至少五种），上述THD引物包含至少两种引物（更优选为至少三种，最优选为至少五种），作为正向引物以及反向引物的两种引物分别包含至少两种引物（更优选为至少三种，最优选为至少五种），标记探针包含至少两种探针（更优选为至少三种，最优选为至少五种）。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含核苷酸变异。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列为预-扩增的核酸序列。
【6．利用THD引物以及上游引物（或者下游引物）的实时靶扩增试验】
根据第六方案，与靶核酸序列杂交的（i）正向引物以及反向引物中至少一个引物为THD引物的一对引物，以及（ii）上游引物（或者下游引物）延长的情况下，由具有5’→3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶而在两个引物和/或上游引物（或者下游引物）上发生5’-切割反应，使得标记从两个引物中的THD引物放出，以此产生用于表示靶核酸序列存在的信号。
根据本发明的优选实例，本发明的方法包括如下的步骤：
步骤（a），对上述靶核酸序列与一对引物以及上游引物（或者下游引物）进行杂交，上述一对引物由正向引物以及反向引物组成，其中，至少一个引物为THD引物；上述THD引物包含：（i）杂交核苷酸序列，其与上述靶核酸序列互补，以及（ii）相互作用性标记系统，其包含一个标记（label）或者多个标记；上述上游引物与在THD引物进行杂交的位点（site）的上游位点杂交，具有与THD引物相同的方向性；上述下游引物与在THD引物进行杂交的位点（site）的下游位点杂交，具有与THD引物相同的方向性；
步骤（b），借助模板-依赖性核酸聚合酶发生上述两个引物及上游引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的条件下，将上述步骤（a）的结果物与具有5’→3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶进行接触，上述两个引物以及上游引物（或者下游引物）借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的上述聚合酶活性而延长，并且借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的上述5’→3’核酸酶活性所切割，使得上述两个引物中的上述THD引物中放出上述标记（label）或者上述相互作用性标记系统中的至少一个标记，以此产生用于表示上述靶核酸序列存在的信号；
步骤（c），使上述步骤（b）的上述结果物发生变性；
步骤（d），至少反复两次上述步骤（a）-步骤（c），用于对上述靶核酸序列以及表示上述靶核酸序列存在的上述所有信号进行扩增；以及，
步骤（e），用于检测表示靶核酸序列存在的上述信号；上述检测在步骤（d）的上述反复的各循环中，在骤（d）的上述反复的终点或者上述反复期间的各个预定时间间隔内实施，这些信号表示靶核酸序列的存在。
根据本发明的优选实例，步骤（a）利用与THD引物的方向相反方向的至少一个追加引物来实施。这时，模板（即，靶核酸序列）的利用可能性变多，且可利用在THD引物以及上游引物（或者下游引物）的杂交上。
根据本发明的优选实例，不仅是上述THD引物，还有其他引物均具有产生可检测信号的标记。与引物连接的标记相同或者不同。对引物有用的标记如上述THD引物的说明。优选地，标记为FRET标记。
第六方案中，可如图4c所示的方法来制备一对引物以及上游引物的各种组合。其为如下：（A）作为正向引物以及上游引物的THD引物；（B）作为正向引物以及反向引物的THD引物；（C）作为正向引物、上游引物以及反向引物的THD引物；（D）作为正向引物的THD引物。
图17表示图4c所示的引物组合的结果，对淋病奈瑟菌（NG，Neisseria gonorrhoeae）基因进行的实时PCR扩增中，与作为正向引物的THD引物一起追加利用上游引物、反向引物或者作为该两种引物的THD引物。
第六方案中，如图4d所示，可制备一对引物以及下游引物的各种组合。其为如下：（A）作为正向引物的THD引物；（B）作为反向引物的THD引物；以及（C）作为正向引物以及反向引物的THD引物。
图18表示图4d所示的引物组合的结果，对淋病奈瑟菌（NG，Neisseria gonorrhoeae）基因进行的实时PCR扩增中，利用内部引物，追加利用正向引物、反向引物或者作为该两种引物的THD引物。
图4d中，下游引物可表现为内部引物。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含至少两种核酸序列（更优选为至少三种，最优选为至少五种），作为正向引物以及反向引物的两个引物分别包含至少两种引物（更优选为至少三种，最优选为至少五种），上游引物包含至少两种引物（更优选为至少三种，最优选为至少五种）。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列包括核苷酸变异。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列为预-扩增的核酸序列。
【优选实例：利用THD引物的实时聚合酶链式反应（PCR）试验】
第四-第六方案中，正向引物以及反向引物中至少一个引物利用作为THD引物的一对引物，该引物能够扩增出靶核酸序列。因此，反应的反复伴随着靶核酸序列的扩增。优选地，上述扩增根据PCR（聚合酶连锁反应）实施，这公开在美国专利号第4,683,195号、第4,683,202号以及第4,800,159号中。
根据本发明的优选实例，本发明提供一种利用伴随有靶杂交及检测引物（THD primer）的5’-切割反应以及3’-延长反应的聚合酶连锁反应（PCR），从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，该方法包括以下步骤：
步骤（a），准备包含上述靶核酸序列、一对引物以及具有5’→3’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶的的PCR混合物，上述一对引物包含可扩增出上述靶核酸序列的两个引物，其中，至少一个引物为上述THD引物；上述THD引物包含：（i）杂交核苷酸序列，其与上述靶核酸序列互补，以及（ii）一对的荧光报道分子以及猝灭分子；并且上述猝灭分子位于上述THD引物上，以便对上述报道分子的荧光进行猝灭；上述两个标记通过发生核酸酶切割的THD引物内的一个位点而分离，以此上述模板-依赖性核酸聚合酶的5’→3’核酸酶活性通过上述位点上的切割反应来将上述报道分子从上述猝灭分子中分离出，以便产生用于表示上述靶核酸序列存在的上述信号；
步骤（b），利用上述PCR混合物来对上述靶核酸序列进行扩增，将引物退火、引物延长以及变性至少实施两次，上述两个引物借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的聚合酶活性而延长，以此对靶核酸序列进行扩增，并且借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的5’→3’核酸酶活性所切割，来从两个引物中的上述THD引物中放出上述报道分子或者上述猝灭分子，以此产生用于表示上述靶核酸序列存在的信号；以及，
步骤（c），检测用于表示上述靶核酸序列存在的上述荧光信号，上述检测在步骤（b）的上述反复的各循环中，在步骤（c）的上述反复的终点或者上述反复期间各个预定时间间隔内实施，这些信号表示靶核酸序列的存在。
如上所述，第四方案可提出实时PCR反应中的THD引物的各种组合，其为如下：（A）作为正向引物的THD引物；（B）作为反向引物的THD引物；以及（C）作为正向引物以及反向引物的THD引物。
根据本发明的优选实例，PCR混合物包含正向引物以及反向引物中至少一个引物为THD引物的一对引物、上游引物（或者下游引物）以及具有5’→3’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶；上述上游引物与在上述THD引物进行杂交的位点（site）的上游位点杂交，并且具有与上述THD引物相同的方向。
根据本发明的优选实例，PCR混合物包含两个引物中至少一个引物为THD引物的一对引物以及具有产生可检测信号的标记的标记探针；就上述标记探针而言，3’-末端发生变形，防止模板-依赖性核酸聚合酶引起的延长，与上述两个引物之间的某一位点（site）杂交。
根据本发明的优选实例，因为此方案不仅由THD引物，而且由标记探针也产生信号，所以比起仅利用一对引物的方案，能对靶核酸序列产生更高的信号强度。
根据本发明的优选实例，步骤（a）通过利用具有与THD引物的方向相反的方向的至少一个追加引物来实施。这种情况时，模板（即，靶核酸序列）将更可利用，也可利用于THD引物的杂交。
根据本发明的优选实例，步骤（c）的检测通过实时方式、终点方式（end-point）或预定时间间隔（predetermined time interval）方式来进行。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含至少两种核酸序列（更优选为至少三种，最优选为至少五种），作为正向引物及反向引物的两个引物分别包含至少两种引物（更优选为至少三种，最优选为至少五种）。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含至少两种核酸序列（更优选为至少三种，最优选为至少五种），作为正向引物及反向引物的两个引物分别包含至少两种引物（更优选为至少三种，最优选为至少五种），上游引物（或下游引物）包含至少两种引物（更优选为至少三种，最优选为至少五种）。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含至少两种核酸序列（更优选为至少三种，最优选为至少五种），作为正向引物及反向引物的两个引物分别包含至少两种引物（更优选为至少三种，最优选为至少五种），标记探针包含至少两种探针（更优选为至少三种，最优选为至少五种）。
根据本发明的优选实例，不仅是THD引物，还有其他引物均具有产生可检测信号的标记。与引物连接的标记可能相同或相异。对引物有用的标记的说明如同在THD引物中所做的叙述。优选地，标记为FRET标记。
在不仅是THD引物，还有其他引物均具有标记的情况时，由于不仅是由THD引物，还有由其他引物均产生信号，因而比起仅利用THD引物的方案，能对靶核酸序列产生更高的信号强度。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含核苷酸变异。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列为预-扩增的核酸序列。
根据本发明的优选实例，所利用的THD引物具有以下通式I的双重引发寡核苷酸（DPO）结构或者以下通式II的变性双重特异性寡核苷酸（mDSO）：
5’-Xp-Yq-Zr-3’（I）
在上述通式中，Xp为具有与靶序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第一次引发部位（5’-first priming portion）；Yq为包含三个以上的通用碱基的分离部位（separation portion）；Zr为具有与靶序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第二次引发部位（3’-second priming portion）；p、q及r表示核苷酸的数量，X、Y及Z为脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’-第一次引发部位的Tm高于3’-第二次引发部位的Tm，上述分离部位在上述三个区域中具有最低的Tm；上述分离部位在针对靶核酸的退火方面，使上述5’-第一次引发部位从上述3’-第二次引发部位分离，由此上述寡核苷酸的上述退火特异性借助上述5’-第一次引发部位及上述3’-第二次引发部位来双重性地决定，其结果，使上述THD引物的整体杂交特异性得到提高；
5’-X'p-Y'q-Z'r-3’（II）
在上述通式中，X'p为具有与靶序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第二次引发部位（5’-second priming portion）；Y'q为包含至少三个通用碱基的分离部位（separation portion）；Z'r为具有与靶序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第一次引发部位（3’-first priming portion）；p、q及r表示核苷酸的数量，X'、Y'及Z'为脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’-第二次引发部位的Tm高于3’-第一次引发部位的Tm，上述分离部位在上述三个区域中具有最低的Tm；上述分离部位在针对靶核酸的退火方面，使上述5’-第二次引发部位从上述3’-第一次引发部位分离，由此上述寡核苷酸的上述退火特异性借助上述5’-第二次引发部位以及上述3’-第一次引发部位来双重性地决定，其结果，使上述THD引物的整体杂交特异性得到提高。
更为优选的是，THD引物具有通式I的双重引发寡核苷酸（DPO）结构。
具有变性双重特异性寡核苷酸（mDSO）结构的THD引物尤其适合于利用上游引物的第三及第六方案。具有双重引发寡核苷酸（DPO）的THD引物适合于其他方案。
作为双重特异性寡核苷酸（DSO，dual specificity oligonucleotide）的引物形态的双重引发寡核苷酸（DPO）的结构首次由本发明者所提出（参照WO2006/095981；Chun et al.,Dual priming oligonucleotidesystem for the multiplex detection of respiratory viruses and SNPgenotyping of CYP2C19 gene,Nucleic Acid Research,35:6e40（2007）））。变性双重特异性寡核苷酸（mDSO）结构是双重引发寡核苷酸（DPO）结构的新的变形形态，此首次由本发明者所提出（参照WO2006/095981）。
双重引发寡核苷酸（DPO）体现杂交或退火借助分离区域相互分离的5’-高Tm特异性部位（或者5’-第一次杂交部位、5’-第一次引发部位）及3’-低Tm特异性部位（或者3’-第二次杂交部位、3’-第二次引发部位）双重性地决定的新颖的概念，表示出非常惊人的杂交特异性（参照WO2006/095981；Kim et al.,Direct detection oflamivudine-resistant hepatitis B virus mutants by multiplex PCRusing dual-priming oligonucleotide primers,Journal of VirologicalMethods,149:76-84(2008);Kim,et.al.,Rapid detection andidentification of 12 respiratory viruses using a dual primingoligonucleotide system-based multiplex PCR assay,Journal ofVirological Methods,doi:10.1016/j.jviromet.2008.11.007(2008);Horiiet.al.,Use of dual priming oligonucleotide system to detect multiplexsexually transmitted pathogens in clinical specimens,Letters inApplied Microbiology,doi:10.111/j.1472-765X2009.02618x（2009）））。如上所述，双重引发寡核苷酸（DPO）最终获得具有相互不同的杂交特性的两个引物部分（segment），其为如下：造成初期的稳定的杂交的5’-第一次引发部位及决定靶特异性的3’-第二次引发部位。
变性双重特异性寡核苷酸（mDSO）结构是上述双重特异性寡核苷酸（DSO）结构逆转而成的，即，决定靶特异性的5’-第二次引发部位（或者5’-第二次杂交部位）及造成初期的稳定的杂交的3’-第一次引发部位（或者3’-第一次杂交部位）。
根据本发明的优选实例，位于分离部位的通用碱基选自包含脱氧肌苷（deoxyinosine）、肌苷（inosine）、7-去氮-2’-脱氧肌苷（7-deaza-2’-deoxyinosine）、2-氮杂-2’-脱氧肌苷（2-aza-2’-deoxyinosine）、2’-甲氧基肌苷（2’-OMe inosine）、2’-F肌苷（2’-F inosine）、脱氧3-硝基吡咯（deoxy 3-nitropyrrole）、3-硝基吡咯（3-nitropyrrole）、2’-甲氧基3-硝基吡咯（2’-OMe3-nitropyrrole）、2’-F3-硝基吡咯（2’-F 3-nitropyrrole）、1-（2’-脱氧-β-D-呋喃核糖）-3-硝基吡咯（1-（2’-deoxybeta-D-ribofuranosyl）-3-nitropyrrole）、脱氧5-硝基吡咯（deoxy 5-nitroindole）、5-硝基吲哚（5-nitroindole）、2’-甲氧基5-硝基吲哚（2’-OMe 5-nitroindole）、2’-F5-硝基吲哚（2’-F 5-nitroindole）、脱氧4-硝基苯并咪唑（deoxy4-nitrobenzimidazole）、4-硝基苯并咪唑（4-nitrobenzimidazole）、脱氧4-氨基苯并咪唑（deoxy 4-aminobenzimidazole）、4-氨基苯并咪唑（4-aminobenzimidazole）、脱氧水粉蕈素（deoxy nebularine）、2’-F水粉蕈素（2’-F nebularine）、2’-F 4-硝基苯并咪唑（2’-F4-nitrobenzimidazole）、肽核酸-5-硝基吲哚（PNA-5-nitroindole）、肽核酸-水粉蕈素（PNA-nebularine）、肽核酸-肌苷（PNA-inosine）、肽核酸-4-硝基苯并咪唑（PNA-4-nitrobenzimidazole）、肽核酸-3-硝基吡咯（PNA-3-nitropyrrole）、吗啉基-5硝基吲哚（morpholino-5-nitroindole）、吗啉基-水粉蕈素（morpholino-nebularine）、吗啉基-肌苷（morpholino-inosine）、吗啉基-4-硝基苯并咪唑（morpholino-4-nitrobenzimidazole）、吗啉基-3-硝基吡咯（morpholino-3-nitropyrrole）、氨基磷酸酯-5-硝基吲哚（phosphoramidate-5-nitroindole）、氨基磷酸酯-水粉蕈素（phosphoramidate-nebularine）、氨基磷酸酯-肌苷（phosphoramidate-inosine）、氨基磷酸酯-4-硝基苯并咪唑（phosphoramidate-4-nitrobenzimidazole）、氨基磷酸酯-3-硝基吡咯（phosphoramidate-3-nitropyrrole）、2’-0-甲氧基乙基肌苷（2’-0-methoxyethyl inosine）、2’-0-甲氧基乙基水粉蕈素（2’0-methoxyethyl nebularine）、2’-0-甲氧基乙基5-硝基吲哚（2’-0-methoxyethyl 5-nitroindole）、2’-0-甲氧基乙基4-硝基-苯并咪唑（2’-0-methoxyethyl 4-nitro-benzimidazole）、2’-0-甲氧基乙基3-硝基吡咯（2’-0-methoxyethyl 3-nitropyrrole）及上述碱基的组合的群。更优选地，通用碱基为脱氧肌苷（deoxyinosine）、1-（2’-脱氧-β-D-呋喃核糖）-3-硝基吡咯（1-（2’-deoxybeta-D-ribofuranosyl）-3-nitropyrrole）或者5-硝基吲哚（5-nitroindole），最优选为脱氧肌苷（deoxyinosine）。
优选地，上述分离部位包含至少三个通用碱基，更优选地包含至少四个通用碱基，最优选地包含至少五个通用碱基。
优选地，双重引发寡核苷酸（DPO）的结构的5’-第一次引发部位的长度比3’-第二次引发部位的长度更长。上述5’-第一次引发部位优选地具有15-60核苷酸的长度，更优选地具有15-40核苷酸的长度，进而优选地具有15-25核苷酸的长度。优选地，上述3’-第二次引发部位具有3-15核苷酸的长度，更优选地具有5-15核苷酸的长度，进而优选地具有6-13核苷酸的长度。优选地，上述分离部位具有3-10核苷酸的长度，更优选地具有4-8核苷酸的长度，最优选地具有5-7核苷酸的长度。根据本发明的优选实例，上述5’-第一次引发部位具有40℃-80℃的Tm，更优选地具有45℃-65℃的Tm。上述3’-第二次引发部位优选地具有10℃-40℃的Tm。上述分离部位优选地具有3℃-15℃的Tm。
优选地，变性双重特异性寡核苷酸（mDSO）结构的3’-第一次引发部位（或者3’-第一次杂交部位）的长度比5’-第二次引发部位（或者5’-第二次杂交部位）的长度更长。上述3’-第一次引发部位优选地具有15-60核苷酸的长度，更优选地具有15-40核苷酸的长度，进而优选地具有15-25核苷酸的长度。优选地，上述5’-第二次引发部位具有3-15核苷酸的长度，更优选地具有5-15核苷酸的长度，进而优选地具有6-13核苷酸的长度。优选地，上述分离部位具有3-10核苷酸的长度，更优选地具有4-8核苷酸的长度，最优选地具有5-7核苷酸的长度。
根据本发明的优选实例，上述3’-第一次引发部位具有40℃-80℃的Tm，更优选地具有45℃-65℃的Tm。上述5’-第二次引发部位优选地具有10℃-40℃的Tm。上述分离部位优选地具有3℃-15℃的Tm。
根据本发明的优选实例，标记探针具有通式II的变性双重特异性寡核苷酸（mDSO）结构：
5’-X'p-Y'q-Z'r-3’（II）
在上述通式中，X'p为具有与靶序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第二次引发部位（或者5’-第二次杂交部位）；Y'q为包含三个以上的通用碱基的分离部位（separation portion）；Z'r为具有与靶序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第一次引发部位（或者3’-第一次杂交部位）；p、q及r表示核苷酸的数量，X'、Y'及Z'为脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’-第二次引发部位（或者5’-第二次杂交部位）的Tm低于3’-第一次引发部位（或者3’-第一次杂交部位）的Tm，上述分离部位在上述三个区域中具有最低的Tm；上述分离部位在针对靶核酸的退火方面，使上述5’-第二次引发部位（或者5’-第二次杂交部位）从上述3’-第一次引发部位（或者3’-第一次杂交部位）分离，由此上述寡核苷酸的上述退火特异性借助上述5’-第二次引发部位（或者5’-第二次杂交部位）及上述3’-第一次引发部位（或者3’-第一次杂交部位）来双重性地决定，其结果，使上述探针的整体退火特异性的得到提高。
优选地，用于标记探针的变性双重特异性寡核苷酸（mDSO）结构的3’-第一次引发部位（或者3’-第一次杂交部位）的长度比5’-第二次引发部位（或者5’-第二次杂交部位）的长度更长。上述3’-第一次引发部位优选地具有15-60核苷酸的长度，更优选地具有15-40核苷酸的长度，进而优选地具有15-25核苷酸的长度。优选地，上述5’-第二次引发部位具有3-15核苷酸的长度，更优选地具有5-15核苷酸的长度，进而优选地具有6-13核苷酸的长度。优选地，上述分离部位具有3-10核苷酸的长度，更优选地具有4-8核苷酸的长度，最优选地具有5-7核苷酸的长度。
根据本发明的优选实例，上述3’-第一次引发部位（或者3’-第一次杂交部位）具有40℃-80℃的Tm，更优选地具有45℃-65℃的Tm。上述5’-第二次引发部位（或者5’-第二次杂交部位）优选地具有10℃-40℃的Tm。上述分离部位优选地具有3℃-15℃的Tm。
根据本发明的优选实例，上游引物或者下游引物具有以下通式I的双重引发寡核苷酸（DPO）结构：
5’-Xp-Yq-Zr-3’（I）
在上述通式中，Xp为具有与靶序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第一次引发部位（5’-first priming portion）；Yq为包含至少三个通用碱基的分离部位（separation portion）；Zr为具有与靶序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第二次引发部位（3’-second priming portion）；p、q及r表示核苷酸的数量，X、Y及Z为脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’-第一次引发部位的Tm高于3’-第二次引发部位的Tm，上述分离部位在上述三个区域中具有最低的Tm；上述分离部位在针对靶核酸的退火方面，使上述5’-第一次引发部位从上述3’-第二次引发部位分离，由此上述寡核苷酸的上述退火特异性借助上述5’-第一次引发部位及上述3’-第二次引发部位来双重性地决定，其结果，使得上述上游引物的整体退火特异性得到提高。
根据本发明的优选实例，利用于靶扩增的引物（即，配对引物）及THD引物具有以下通式I的双重引发寡核苷酸（DPO）结构：
5’-Xp-Yq-Zr-3’（I）
在上述通式中，Xp为具有与靶序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第一次引发部位（5’-first priming portion）；Yq为包含三个以上的通用碱基的分离部位（separation portion）；Zr为具有与靶序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第二次引发部位（3’-second priming portion）；p、q及r表示核苷酸的数量，X、Y及Z为脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’-第一次引发部位的Tm高于3’-第二次引发部位的Tm，上述分离部位在上述三个区域中具有最低的Tm；上述分离部位在针对靶核酸的退火方面，使上述5’-第一次引发部位从上述3’-第二次引发部位分离，由此上述寡核苷酸的上述退火特异性借助上述5’-第一次引发部位及上述3’-第二次引发部位来双重性地决定，其结果，使得上述引物的整体退火特异性得到提高。
为检测靶核酸而利用引物的以往技术，因所使用的引物的内在的局限性，并不能充分摆脱误差信号。但是包含为摆脱此种情况刻意设计的双重引发寡核苷酸（DPO）或者变性双重特异性寡核苷酸（mDSO）结构的THD引物、标记引物、上游引物、上游引物及反向引物，以戏剧性地提高的特异度与靶核酸序列杂交，以便无误差信号地检测出靶核酸序列。
在本说明书中揭示引物或者探针而使用的术语“常规的”意味着不包含双重引发寡核苷酸（DPO）或者变性双重特异性寡核苷酸（mDSO）结构的所有引物或者探针。这些在本说明书中被解释为常规引物或者常规探针。
与靶核酸序列杂交后，与在借助模板-依赖性核酸聚合酶发生上述THD引物的5’-切割反应及3’-延长反应的条件下，将上述步骤（a）的结果物与具有5’→3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶接触；上述THD引物借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的上述聚合酶的活性而延长，借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的上述5’→3’核酸酶活性所切割，从上述THD引物放出上述标记或者上述相互作用性标记系统的至少一个标记，由此产生用于表示上述靶核酸序列的存在的信号。
“在借助模板-依赖性核酸聚合酶发生THD引物的5’-切割反应及3’-延长反应的条件下”的内容意味着由具有5’→3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶充分诱导在上述THD引物的3’-末端的延长反应及在5’-末端或者5’-末端部位的切割反应的条件。这些条件可遵循以往核酸聚合酶引起的引物延长所需的条件。例如，这些条件可在JosephSambrook等、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Cold SpringHarbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.（2001）中确认。如实施例所示，条件包含适当时间内在相对高温（例如，50℃-75℃）下的靶核酸序列、THD引物、热稳定性DNA聚合酶（例如，Taq DNA聚合酶）、dNTPs及MgCl2的培养。
“在借助模板-依赖性核酸聚合酶发生两种引物的5’-切割反应及3’-延长反应的条件下”的内容意味着由具有5’→3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶充分诱导用于扩增靶的上述一对引物（正向引物及反向引物）在3’-末端的延长反应及在5’-末端或者5’-末端部位的切割反应的条件。对条件的详细说明可在上述所叙述的内容的参照中说明。
根据本发明的优选实例，具有5’→3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶是热稳定性DNA聚合酶，能从多种细菌种类中获得，例如包含Thermus aquaticus(Taq)、Thermus thermophilus(Tth)、Thermus filiformis、Thermis flavus、Thermococcus literalis、Pyrococcus furiosus(Pfu)、Thermus antranikianii、Thermuscaldophilus、Thermus chliarophilus、Thermus flavus、Thermusigniterrae、Thermus lacteus、Thermus oshimai、Thermus ruber、Thermus rubens、Thermus scotoductus、Thermus silvanus、Thermusspecies Z05、Thermus species sps 17、Thermus thermophilus、Thermotoga maritima、Thermotoga neapolitana及Thermosiphoafricanus。最优选地，具有5’→3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶是Taq DNA聚合酶。
最终，检测出表示靶核酸序列的存在的信号。信号的检测可在反复的各循环、在反复的结束点或者在反复的过程中的各个预定时间间隔实施。优选地，信号检测应在反复的各循环实施，这将提高检测的准确性。
本发明对需要检测和/或扩增的靶核酸序列并不需要任何特定序列或者长度。RNA靶序列应被反转录为cDNA（Joseph Sambrook等、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Cold Spring HarborLaboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.（2001）；及Noonan、K.F.等、Nucleic Acids Res.16:10366（1988））。尤其，在本发明中能够检测和/或扩增的靶核酸序列包含任何核酸分子，例如，也可以均包含DNA（gDNA或者cDNA）及RNA分子。靶核酸序列还均包含任何自然（naturally occurring）原核细胞核酸、真核细胞（例如，原生动物和寄生动物、菌类、酵母、高等植物、低等动物及包含哺乳动物和人类的高等动物）核酸、病毒（例如，疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒（HIV：HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS）、流感病毒、EB病毒（Epstein-Barr virus）、肝炎病毒以及脊髓灰质炎病毒等）核酸或者类病毒核酸。
与靶核酸序列杂交的THD引物由具有5’→3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶被切割，放出与THD引物连接的标记，产生用于表示靶核酸序列的存在的信号。对各标记的信号可通过以往方法进行检测或测定。例如，标记包含酶时，利用酶的基质检测信号。利用作为金属标记的金属粒子时，通过利用硝酸银的银染色法检测信号。荧光信号可通过以往方法，例如，利用荧光强度测定仪进行检测或测定。
检测的信号可直接从标记本身得到，或间接地从连续的包含标记的反应得到。此外，检测的信号可从释放的标记或保留的标记（不包括在切割的核苷酸中）得到（例如，反应性标记系统）。
能同时检测至少两个靶核酸序列，这一点能更加突显本发明的优点。根据本发明的优选实例，能同时检测多个靶核酸序列。
并且，本发明对核苷酸变异的检测而言非常有用。在本发明中使用的术语“核苷酸变异”意味着在连续的DNA片段或者序列类似的DNA片段中存在于特定位点的DNA序列的核苷酸的多样性。这种连续的DNA片段包含一个基因或者一个染色体的任意其他部位。例如，可以通过本发明的方法而检测的核苷酸变异包括缺失、插入、置换。核苷酸变异的例子包括：人类基因组的多种变异（例如，亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR，methylenetetrahydrofolate reductase）基因的变异）、药物耐性病原体的核苷酸变异及癌产生-相关核苷酸的变异。
优选的是，在本发明中被检测的核苷酸变异为碱基置换，更优选为单核苷酸多态性（SNP，single nucleotide polymorphism）及点突变。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供一种利用靶杂交及检测引物（THD primer）的5’-切割反应及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，包含：
（a）THD引物，其包含：（i）杂交核苷酸序列，其与上述靶核酸序列互补；以及（ii）相互作用性标记系统，其包含一个标记（label）或者多个标记；以及
（b）模板-依赖性核酸聚合酶，其具有5’→3’核酸酶活性；
上述THD引物与上述靶核酸序列进行杂交的情况下，上述THD引物借助上述核酸聚合酶的聚合酶活性而延长，上述THD引物借助上述核酸聚合酶的5’→3’核酸酶活性所切割，从上述THD引物放出上述标记（label）或者上述相互作用性标记系统的至少一个标记，以此产生用于表示上述靶核酸序列存在的信号。
根据本发明的优选实例，上述试剂盒还包含用于扩增靶的追加的引物、THD引物、上游引物、下游引物、标记探针或者它们的组合。
根据本发明的优选实例，用于扩增靶的追加引物、上游引物和/或下游引物具有标记。
对引物或者标记探针有用的标记的说明如在THD引物中所述的内容。优选地，标记为FRET标记。
并且，标记探针及被标记的引物由具有5’→3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶所切割，由此放出标记，并提供用于表示靶核酸序列的存在的两种不同的信号。
本发明的试剂盒是通过实施上述的本发明的检测方法而构成的，为了避免本说明书的复杂性，故而省略与其重复的内容。
本发明的试剂盒可选择性地包含在靶扩增聚合酶链式反应（PCR）（例如，聚合酶链式反应）中所需的如缓冲液、DNA聚合酶辅因子及脱氧核糖核苷酸-5-三磷酸酯等试剂。选择性地，本发明的试剂盒还可包含多种多聚核苷酸分子、反转录酶、多种缓冲液、试剂以及抑制DNA聚合酶活性的抗体。
并且，试剂盒可包含实施阳性对照组及阴性对照组反应时所需的试剂。熟知本说明书的公开事项的本领域的技术人员能够容易地决定在任意一个特定反应中使用的试剂的最适量。典型的是，本发明的试剂盒由包含在前面揭示的组成成分的额外的包装或者部分而制备。
可以对本发明的特征和优点如下进行概括：
（a）以往的实时PCR方法需要如标记探针或者发夹结构一样复杂地变形的引物结构，这导致难以选择探针及引物的设计、合成或者序列。但是，就本发明的THD引物而言，没有追加的标记探针或者复杂地变形的引物结构地，不仅利用于靶扩增，而且还利用于信号扩增，因此相对简单而容易地选择用于PCR的THD引物的设计、合成或者序列。
（b）不仅对引物，而且还对探针最佳化的杂交条件对以往的实时PCR反应为必需，因此难以实现以往的实时PCR方法的最佳化。利用具有形成发夹环的尾部的引物的以往的实时PCR方法，考虑到在引物中的发夹环形成及变形，应实现反应条件的最佳化。但是，本发明可以完全摆脱关于以往的实时PCR方法的最佳化的顽固性问题及缺点。
（c）如在实施例7中确认，（ⅰ）作为正向引物、反向引物或者上游引物的THD引物的多种组合，或者（ⅱ）THD引物及探针的多种组合有效地检测靶核酸序列。
（d）就以往的实时PCR方法而言，由于难以实现引物或者探针的设计及最佳化，因此不适于多重试验。相反，本发明在实时PCR中，没有追加的探针或者复杂地变形的引物结构地，仅利用标记的引物，因此，能够以多重方式，卓越地呈现实时靶检测。
（e）与以往的实时PCR探针相比较，THD引物被延长，延长的THD引物对靶核酸序列呈现更加高的结合力。以往的实时PCR引物需要如发夹结构一样复杂地变形的结构，这妨碍与靶核酸序列结合。相反，THD引物不需要那种变形，从而具有THD引物与靶核酸序列的更好的结合效率。这一特征贡献于基于本发明的靶检测效率的提高。
（f）本发明一般利用使用于PCR反应的引物，从而可以容易地实施实时PCR反应。简言之，在PCR反应中生成扩增子的引物确保成功的实时PCR反应。因此，本发明在实时PCR试验的开发中，视为改善了时间有效性及费用有效性。
（g）如上所述，就在本发明中使用的具有DPO或者mDSO结构的引物和/或探针而言，在实时PCR反应中，带来了结合特异性的提高，由此除去关于引物和/或探针的非-靶结合的假阳性信号。
下面，将通过实施例对本发明进行更详细的说明。这些实施例仅用于更加具体说明本发明，根据本发明的宗旨，本发明的范围不局限于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。
【实施例】
【实施例1：靶核酸检测中的THD引物的评价】
在Taq DNA聚合酶反应下，评价了本发明的THD引物与靶核酸序列进行退火，由具有5’→3’核苷酸活性的模板-依赖性核酸聚合酶实施THD引物的5’-切割反应及3’-延长反应，而荧光报道分子从位于THD引物上的猝灭分子分离时，双重-标记THD引物能否产生充分对靶核酸序列进行检测的信号。THD引物作为报道分子具有6-羧基荧光素（6-FAM，6-carboxy-fluorescein），作为猝灭分子具有黑洞猝灭剂（BHQ-1，Black Hole Quencher 1）。标记的位点表示在寡核苷酸序列。
为了对此评价进行实验，本发明者将金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）基因用作模板，为了确保实验的简便，将对于金黄色葡萄球菌（S.aureus）基因的合成寡核苷酸用作模板。在没有靶核酸序列的扩增的预定时间间隔（predetermined time interval）内测定了信号。
对于作为靶的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）基因的信号的产生及检测的方法及结果，在说明书中进行了叙述。
在本实施例中利用的合成模板及双重-标记THD引物的序列如下：
SA-Tem
5’-gccaataaaactaggaggaaatttaaatgttagaatttgaacaaggatttaatcatttagcgactttaaaggtcattggtgtaggtggtggcggtaacaacgccgtaaaccgaatgattgaccacggaatgaataatgttgaatttatcgctatcaacacagacggtcaagctttaaacttatctaaagctgaatctaaa-3’（SEQ ID NO：1）；及
SA-THD
5’-[6-FAM]CATTCCG[BHQ1-dT]GGTCAATCATTCGGTT-3’
（SEQ ID NO：2）。
含有模板2pmole（皮摩尔）（SEQ ID NO：1）、10mM MgCl2的2X主混合液10μl、含有Taq DNA聚合酶（索尔杰恩特公司，韩国：Solgent，Korea）2单元（unit）、4种dNTPs（dATP、dCTP、dGTP及dTTP）各200M及双重-标记THD引物（SEQ ID NO：2）5pmole的20μl为最终体积实施了双重-标记THD引物的5’-切割反应及3’-延长反应；将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪（CFX96，伯乐公司：Bio-Rad）；将上述反应混合物在95℃中进行10分钟变性后，在55℃或者65℃下，60秒过程反复进行了40次。检测基于预定时间间隔（predetermined time interval）的各循环中产生的信号。
如图5所示，在没有靶核酸序列的扩增的情况的反应中，也将在预定时间间隔中的荧光信号，通过监控，以对于金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的荧光信号的增加为实时单位进行了观察。并且，没有出现55℃（No.2）及65℃（No.4）之间的信号差。没有模板时，不出现荧光信号的变化（No.1及3）。
【实施例2：在用于靶核酸检测的实时PCR反应条件下的THD引物的评价】
本发明者在实时PCR反应条件下，将变性、杂交、切割及延长的反复适用于dNTP的多种浓度时，还确认了THD引物能否产生充分对靶核酸序列进行检测的信号。
为了对此评价进行实验，将在本实施例1中利用的同一模板（SEQID NO：1）及双重-标记THD引物（SEQ ID NO：2）利用于实时靶信号扩增。
将多种浓度的dNTP（最终浓度500M、200M、20M及0M），以含有模板2pmole（SEQ ID NO：1）、10mM MgCl2的2X主混合液10μl、Taq DNA聚合酶（索尔杰恩特公司，韩国：Solgent，Korea）2单元及含有双重-标记THD引物（SEQ ID NO：2）5pmole的20μl为最终体积实施了实时靶信号扩增；将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪（CFX96，伯乐公司：Bio-Rad）；将上述反应混合物在95℃中进行10分钟变性后，在94℃下、30秒及在55℃下90秒及72℃下90秒的过程反复进行了40次。检测了各循环的延长步骤（72℃）中产生的信号。
如图6所示，在如没有Taq DNA聚合酶（No.1），或者没有模板情况（N0.2）的阴性对照组反应中没有出现靶核酸序列的荧光信号扩增。这样的结果表示，通过靶模板和THD引物的杂交或者单链的THD引物本身的切割，不会发生信号的扩增。另一方面，不仅在没有dNTP的情况（N0.6），而且还在dNTP的其他浓度下（No.3、4及5）也确认了靶核酸序列的荧光信号。就20M dNTP而言，Ct值最低，信号的强度最高（No.5），就500M dNTP而言，Ct值最高，信号的强度最低（No.3）。
因此，没有靶核酸序列的扩增地，利用THD引物的变性、杂交、切割及延长的反复充分都能产生靶荧光信号，由此，能够实现基于实时信号扩增的靶核酸序列的检测。
【实施例3：在实时PCR扩增中的THD引物及探针的不同点】
引物及探针的最大的不同点是，探针不包含于扩增产物。为了确认THD引物包含于实时PCR扩增产物，但是探针在实时PCR条件下不包含在内，作为正向引物利用THD引物实施了检测肺炎链球菌基因及脑膜炎奈瑟菌基因的实时PCR。
将肺炎链球菌（S.pneumoniae）基因的靶核酸序列作为模板利用时，在本实施例中利用的作为正向引物的双重-标记THD引物、反向引物及双重-标记探针的序列如下：
SP-THD
5’-[6-FAM]TCCTTCAAACTGTGGATT[BHQ1-dT]GGGTGT-3’（SEQ ID NO：4）
SP-Probe
5’-[6-FAM]TCCTTCAAACTGTGGATT[BHQ1-dT]GGGTGT[Phos-Q]-3’（SEQ ID NO：5）
SP-P2 5’-GGTTTCCGTACAGCCTTGA-3’（SEQ ID NO：6）
含有肺炎链球菌（S.pneumoniae）基因组DNA 10ng、6mM MgCl2的2X QIAGEN多重主混合液10μl、含有Taq DNA聚合酶、dNTP（QIAGEN）、双重-标记THD引物（SEQ ID NO：4）10pmole或者双重-标记探针（SEQ ID NO：5）10pmole及反向引物（SEQ ID NO：6）10pmole的20μl为最终体积实施了实时PCR；将包含上述反应混合物的管位于实时热循环仪（CFX96，伯乐公司：Bio-Rad）；将上述反应混合物在95℃中进行10分钟变性后，在94℃下，30秒及在60℃下，90秒及在72℃下90秒的过程反复进行了40次。检测了在各循环的延长步骤（72℃）中产生的信号。在利用溴化乙锭染色的2%琼脂糖凝胶中分离了扩增的PCR产物。
如图7所示，在实时PCR中，THD引物不仅可以通过靶信号扩增，而且还可以通过靶核酸序列的扩增得到产物（图7a的No.3），在琼脂糖凝胶上确认了从扩增的靶核酸序列S.pneumoniae产生的产物（图7b的通道2）。另一方面，与THD引物不同，在利用双重-标记探针的实时PCR中没有出现任何荧光信号（图7a的No.1），并且在琼脂糖凝胶上也不能确认任何产物（图7b的通道1）。
将脑膜炎奈瑟菌（N.meningitidis）基因的靶核酸序列用作模板时，在本实施例中利用的作为正向引物的双重-标记THD引物、反向引物及双重-标记探针的序列如下：
NM-THD2
5’-[6-FAM]TCCACCAATGGCG[BHQ1-dT]ATAGCGGA-3’（SEQID NO：8）
NM-Probe
5’-[6-FAM]TCCACCAATGGCGTATAGCGGA[BHQ1a-Q]-3’（SEQID NO：9）
NM-P1 5’-CCAATCCCTATACCTTTACGTC-3’（SEQ ID NO：10）
利用含有肺炎链球菌（S.pneumoniae）基因组DNA 10ng、6mMMgCl2的2X QIAGEN多重主混合液10μl、Taq DNA聚合酶、dNTP（QIAGEN）、含有双重-标记THD引物（SEQ ID NO:8）10pmole或者双重-标记探针（SEQ ID NO：9）10pmole及反向引物（SEQ IDNO：10）10pmole的20μl的最终体积实施了实时PCR；将包含上述反应混合物的管位于实时热循环仪（CFX96，伯乐公司：Bio-Rad）；将上述反应混合物在95℃中进行10分钟的变性后，在94℃下30秒、60℃下90秒及72℃下90秒的过程反复进行了40次。检测了在各循环的延长步骤（72℃）中产生的信号。从利用溴化乙锭染色的2%琼脂糖凝胶中分离了扩增的PCR产物。
对于作为靶核酸的脑膜炎奈瑟菌（N.meningitidis）基因的实时PCR扩增呈现与图7类似的结果。利用THD引物的实时PCR的结果不仅表示出了靶信号的扩增，而且还表示出了靶核酸序列的扩增（图8a的No.3），在琼脂糖凝胶上检测出脑膜炎奈瑟菌（N.meningitidis）基因的PCR产物（图8b的通道2）。但是，在利用双重-标记探针的实时PCR中没有出现任何荧光信号（图8a的No.1），并且，在琼脂糖凝胶上也没能确认靶核酸序列的任何产物（图8b的通道1）。
【实施例4：利用THD引物的实时PCR特异度】
通过检测出肺炎链球菌（S.pneumoniae）基因及脑膜炎奈瑟菌（N.meningitidis）基因的靶核酸序列，确认了利用THD引物的实时PCR特异度。为了本实验，在实时PCR扩增中，将双重-标记THD引物用作正向引物。
【A.对于肺炎链球菌（S.pneumoniae）的实时PCR特异度】
在本实施例中利用的双重-标记THD引物及反向引物的序列如下：
SP-THD
5’-[6-FAM]TCCTTCAAACTGTGGATT[BHQ1-dT]GGGTGT-3’（SEQ ID NO：4）
SP-P2 5’-GGTTTCCGTACAGCCTTGA-3’（SEQ ID NO：6）
利用含有肺炎链球菌（S.pneumoniae）、脑膜炎奈瑟菌（N.meningitidis）或者淋病奈瑟菌（N.gonorrhoeae）基因组DNA 1ng、6mM MgCl2的2X QIAGEN多重主混合液10μl、Taq DNA聚合酶、dNTP（QIAGEN）、含有双重-标记THD引物（SEQ ID NO：4）10pmole及反向引物（SEQ ID NO：6）10pmole的20μl的最终体积实施了实时PCR；将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪（CFX96，伯乐公司：Bio-Rad）；将上述反应混合物在95℃中进行10分钟的变性后，在94℃下30秒、60℃下90秒及72℃下90秒的过程反复进行了40次。检测了在各循环的延长步骤（72℃）中产生的信号。
在作为靶核酸利用S.pneumoniae基因的实时PCR中，产生了荧光信号扩增（图9的No.1），相反，不仅在如N.gonorrhoeae（图9的No.2）及N.meningitidis（图9的No.3）的非-靶核酸序列，而且还在阴性对照组（图9的No.4）的实时PCR中未观察到任何荧光信号扩增。
【B．对于脑膜炎奈瑟菌（N.meningitidis）的实时PCR特异度】
在本实施例中利用的双重-标记THD引物及反向引物的序列如下：
NM-THD1
5’-[6-FAM]CCATAACC[BHQ1-dT]TGAGCAATCCAIIIIICCTGACGTTC-3’（SEQ ID NO：7）
NM-P1 5’-CCAATCCCTATACCTTTACGTC-3’（SEQ ID NO：10）
利用含有S.pneumoniae、N.meningitidis或者N.gonorrhoeae基因组DNA 1ng、6mM MgCl2的2X QIAGEN多重主混合液10μl、TaqDNA聚合酶、dNTP（QIAGEN）、含有双重-标记THD引物（SEQ IDNO：7）10pmole及反向引物（SEQ ID NO：10）10pmole的20μl的最终体积实施了实时PCR；将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪（CFX96，伯乐公司：Bio-Rad）；将上述反应混合物在95℃中进行10分钟的变性后，在94℃下30秒、60℃下90秒及72℃下90秒的过程反复进行了40次。检测了在各循环的延长步骤（72℃）中产生的信号。
在作为靶核酸利用N.meningitidis基因的实时PCR中，产生了荧光信号扩增（图10的No.1），相反，不仅在如N.gonorrhoeae（图10的No.2）及S.pneumoniae（图10的No.3）的非-靶核酸序列，而且还在阴性对照组（图10的No.4）的实时PCR中未观察到任何荧光信号扩增。
【实施例5：利用THD引物的实时PCR灵敏度】
通过检测S.pneumoniae基因及N.meningitidis基因的靶核酸序列，来确认了利用THD引物的实时PCR灵敏度。为了本实验，在实时PCR扩增中，将双重-标记THD引物用作正向引物。
【A．对于肺炎链球菌（S.pneumoniae）的实时PCR灵敏度】
在本实施例中利用的双重-标记THD引物及反向引物的序列如下：
SP-THD
5’-[6-FAM]TCCTTCAAACTGTGGATT[BHQ1-dT]GGGTGT-3’（SEQ ID NO：4）
SP-P2 5’-GGTTTCCGTACAGCCTTGA-3’（SEQ ID NO：6）
利用含有一连的稀释的S.pneumoniae基因组DNA（10ng、1ng、100pg、10pg、1pg或者0.1pg）、6mM MgCl2的2X QIAGEN多重主混合液10μl、Taq DNA聚合酶、dNTP（QIAGEN）、含有双重-标记THD引物（SEQ ID NO：4）10pmole及反向引物（SEQ ID NO：6）10pmole的20μl的最终体积实施了实时PCR；将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪（CFX96，伯乐公司：Bio-Rad）；将上述反应混合物在95℃中进行10分钟的变性后，在94℃下30秒、60℃下90秒及72℃下90秒的过程反复进行了40次。检测了在各循环的延长步骤（72℃）中产生的信号。
如图11所示，利用从10ng开始一连稀释的S.pneumoniae基因组DNA来实施实时PCR的情况，直到稀释到0.1pg情况也检测到了靶核酸序列（No.1-6）。
【B．对于脑膜炎奈瑟菌（N.meningitidis）的实时PCR灵敏度】
在本实施例中利用的双重-标记THD引物及反向引物的序列如下：
NM-THD1
5’-[6-FAM]CCATAACC[BHQ1-dT]TGAGCAATCCAIIIIICCTGACGTTC-3’（SEQ ID NO：7）
NM-P1 5’-CCAATCCCTATACCTTTACGTC-3’（SEQ ID NO：10）
利用含有一连的稀释的N.meningitidis基因组DNA（10ng、1ng、100pg、10pg、1pg或者0.1pg）、6mM MgCl2的2X QIAGEN多重主混合液10μl、Taq DNA聚合酶、dNTP（QIAGEN）、含有双重-标记THD引物（SEQ ID NO：7）10pmole及反向引物（SEQ ID NO：10）10pmole的20μl的最终体积实施实时PCR；将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪（CFX96，伯乐公司：Bio-Rad）；将上述反应混合物在95℃中进行10分钟的变性后，在94℃下30秒、60℃下90秒及72℃下90秒的过程反复进行了40次。检测了在各循环的延长步骤（72℃）中产生的信号。
如图12所示，利用从10ng开始一连稀释的N.meningitidis基因组DNA来实施实时PCR的情况，直到稀释到0.1pg情况也检测到了靶核酸序列（No.1-6）。
【实施例6：利用THD引物的嵌套实时PCR】
通过检测S.pneumoniae基因的靶核酸序列，还确认了利用THD引物的嵌套（Nested）实时PCR的特异度及灵敏度。为了本实验，在实时PCR扩增中，将双重-标记THD引物用作正向引物。
【A．嵌套实时PCR的特异度】
本实施例中，利用于第一次PCR的正向引物及反向引物的序列和利用于嵌套实时PCR的双重-标记THD引物的序列如下：
SP-P1 5’-TTGACCACTTCGCTATTTCC-3’（SEQ ID NO：3）
SP-THD
5’-[6-FAM]TCCTTCAAACTGTGGATT/BHQ1-dT/GGGTGT-3’（SEQ ID NO：4）
SP-P2 5’-GGTTTCCGTACAGCCTTGA-3’（SEQ ID NO：6）
利用含有S.pneumoniae、N.meningitidis或者N.gonorrhoeae基因组DNA 10ng、6mM MgCl2的2X QIAGEN多重主混合液10μl、TaqDNA聚合酶、dNTP（QIAGEN）、含有正向引物（SEQ ID NO：3）10pmole及反向引物（SEQ ID NO：6）10pmole的20μl的最终体积实施了第一次PCR扩增；将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪（ABI9700，ABI）；将上述反应混合物在95℃中进行10分钟的变性后，在94℃下30秒、60℃下90秒及72℃下90秒的过程反复进行了30次。
利用含有第一次PCR产物2μl、6mM MgCl2的2X QIAGEN多重主混合液10μl、Taq DNA聚合酶、dNTP（QIAGEN）、含有双重-标记THD引物（SEQ ID NO：4）5pmole及反向引物（SEQ ID NO：6）5pmole的20μl的最终体积实施嵌套实时PCR；将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪（CFX96，伯乐公司：Bio-Rad）；将上述反应混合物在95℃中进行10分钟的变性后，在94℃下30秒、60℃下90秒及72℃下90秒的过程反复进行了20次。检测了在各循环的延长步骤（72℃）中产生的信号。
如图13所示，在对于作为靶核酸的S.pneumoniae（No.1）的实时PCR中确认到了信号，但是在对于作为非-靶核酸的N.gonorrhoeae（No.2）及N.meningitidis（No.3）和没有模板的阴性对照组（No.4）的实时PCR中没有出现任何信号。
【B．嵌套实时PCR的灵敏度】
在本实施例中利用的正向引物、反向引物及双重-标记THD引物的序列如下：
利用了在对于嵌套实时PCR的特异度的实施例6A中利用的，第一次PCR用正向引物及反向引物的序列以及与嵌套实时PCR用双重-标记THD引物的序列相同的序列。
利用含有一连的稀释的S.pneumoniae基因组DNA（10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg或者1fg）、6mM MgCl2的2X QIAGEN多重主混合液10μl、Taq DNA聚合酶、dNTP（QIAGEN）、含有正向引物（SEQ ID NO：3）10pmole及反向引物（SEQ ID NO：6）10pmole的20μl的最终体积实施了第一次PCR扩增；将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪（ABI9700，ABI）；将上述反应混合物在95℃中进行10分钟的变性后，在94℃下30秒、60℃下90秒及72℃下90秒的过程反复进行了30次。
利用含有PCR产物2μl、6mM MgCl2的2X QIAGEN多重主混合液10μl、Taq DNA聚合酶、dNTP（QIAGEN）、含有双重-标记THD引物（SEQ ID NO：4）5pmole及反向引物（SEQ ID NO：6）5pmole的20μl的最终体积实施了嵌套实时PCR；将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪（CFX96，伯乐公司：Bio-Rad）；将上述反应混合物在95℃中进行10分钟变性后，在94℃下30秒、60℃下90秒及72℃下90秒的过程反复进行了20次。检测了在各循环的延长步骤（72℃）中产生的信号。
如图14所示，利用从10ng开始一连稀释的作为靶模板的S.pneumoniae基因组DNA来实施实时PCR时，直到稀释到10fg基因组DNA浓度情况也检测到了靶核酸序列（No.1-7）。
【实施例7：利用THD引物的多种组合的实时PCR】
在分子信标、发卡式引物或者蝎形引物中，没有如发夹茎区的任何结构变形地，能够将常规的引物作为双重功能利用于实时PCR，这通过本发明第一次提出：第一功能为互补的序列的合成，第二功能为表示靶核酸序列的信号的产生。因此，本发明者在实时PCR扩增中适用了THD引物的多种组合，这是THD引物的最大的优点之一。
为了本实验，将N.gonorrhoeae基因用作靶核酸模板。THD引物具有DPO结构或者包含双重标记的以往的结构。
在本实施例中利用的双重-标记THD引物及引物的序列如下：
NG-P1
5’-CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3’（SEQID NO：11）
NG-THD1
5’-[6-FAM]CAATGGATCGG[BHQ1-dT]ATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3’（SEQ ID NO：12）
NG-P2 5’-ATTGGCGTGTTTCGCATATTTAAG-3’（SEQ IDNO：13）
NG-THD2
5’-[6-FAM]ATTGGCGTGTTTCGCATA[BHQ1-dT]TTAAG-3’（SEQID NO：14）
NG-Probe
5’-[6-FAM]ATTGGCGTGTTTCGCATA[BHQ1-dT]TTAAG[Phos-Q]-3’（SEQ ID NO：15）
NG-P3
5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3’（SEQID NO：16）
NG-THD3
5’-[6-FAM]TACGCCTGCTAC[BHQ1-dT]TTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3’（SEQ ID NO：17）
【A．作为正向引物的双重-标记THD引物、作为反向引物的双重-标记THD引物或者该两个组合】
利用含有N.gonorrhoeae基因组DNA 1ng、6mM MgCl2的2XQIAGEN多重主混合液10μl、Taq DNA聚合酶、dNTP（QIAGEN）、含有作为正向引物的双重-标记THD引物（SEQ ID NO：12）10pmole、作为反向引物的双重-标记THD引物（SEQ ID NO：17）10pmole或者该两个组合（SEQ ID NO：12及17）及作为正向引物的引物（SEQID NO：11）10pmole或者作为反向引物的引物（SEQ ID NO：16）10pmole的20μl的最终体积实施了实时PCR；将包含上述反应混合物的管位于实时热循环仪（CFX96，伯乐公司：Bio-Rad）；将上述反应混合物在95℃中进行10分钟的变性后，在94℃下30秒、60℃下90秒及72℃下90秒的过程反复进行了40次。检测了在各循环的延长步骤（72℃）中产生的信号。
【B．双重-标记THD引物及双重-标记内部探针的组合】
除了使用双重-标记内部探针以外，双重-标记THD引物的组合及实时PCR反应与实施例7A相同（5pmole，SEQ ID NO：15）。
【C.作为正向引物的双重-标记THD引物及反向引物和/或上游引物的组合】
除了使用作为正向引物的双重-标记THD引物（5pmole，SEQ IDNO：14）及上游双重-标记THD引物（10pmole，SEQ ID NO：12）或者上游引物（10pmole，SEQ ID NO：11）以外，与实施例7A相同地实施了实时PCR反应。
【D．内部非标记引物及双重-标记THD引物的组合】
就实时PCR反应而言，除了使用内部引物以外，与在实施例7A利用的相同（10pmole，SEQ ID NO：13）。
如图15-18所示，就实时PCR扩增而言，实时信号扩增及靶核酸序列扩增表示出多种THD引物组合的可适用性。
【实施例8：在实时PCR中，Taq Man探针方法与THD引物方法的比较】
为了调查信号的机制，本发明者利用作为靶核酸模板的N.gonorrhoeae基因，通过Taq Man实时PCR方法，对利用THD引物的本发明的实时PCR方法进行了比较。
THD引物具有包含双重标记的双重引发寡核苷酸（DPO）结构。本实施例中利用的双重-标记THD引物、Taq Man探针及引物的序列如下：
NG-P1
5’-CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3’(SEQ ID NO:11)
NG-THD1
5’-[6-FAM]CAATGGATCGG[BHQ1-dT]ATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3’(SEQ ID NO:12)
NG-P2 5’-ATTGGCGTGTTTCGCATATTTAAG-3’（SEQ IDNO：13）
NG-Probe
5’-[6-FAM]ATTGGCGTGTTTCGCATA[BHQ1-dT]TTAAG[Phos-Q]-3’（SEQ ID NO：15）
NG-P3
5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3’（SEQID NO：16）
NG-THD3
5’-[6-FAM]TACGCCTGCTAC[BHQ1-dT]TTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3’（SEQ ID NO：17）
利用含有N.gonorrhoeae基因组DNA 1ng、6mM MgCl2的2XQIAGEN多重主混合液10μl、Taq DNA聚合酶、dNTP（QIAGEN）、含有作为正向引物的引物（SEQ ID NO：11）10pmole或者双重-标记THD引物（SEQ ID NO：12）10pmole、作为反向引物的引物（SEQ IDNO：16）10pmole或者双重-标记THD引物（SEQ ID NO：17）或者作为内部探针/引物的Taq Man探针（SEQ ID NO：15）5pmole或者内部引物（SEQ ID NO：13）5pmole的20μl的最终体积实施了实时PCR；将包含上述反应混合物的管位于实时热循环仪（CFX96，伯乐公司：Bio-Rad）；将上述反应混合物在95℃中进行10分钟的变性后，在94℃下30秒、60℃下90秒及72℃下90秒的过程反复进行了20次。检测了在各循环的延长步骤（72℃）中产生的信号。
如图19所示，证明出多种THD引物组合对靶核酸序列进行扩增的情况。但是，一般而言，即时没有Taq Man探针方法（No.4）中要求的双重-标记探针时，信号扩增也能更加有效地发生（No.2、3、5及6）。即，与Taq Man探针反应相比较，不仅呈现更低的Ct值，而且还呈现出更高的强度的荧光信号。因此，与以往Taq Man探针方法不同地，仅利用设计成能够使靶核酸序列扩增的引物，可以更加有效地扩增靶信号及靶核酸序列。
对本发明的优选实例进行了详细记述，可以进行根据本发明的原理的变形及修正，本发明的范围借助所附的权利要求和与其均等的内容而定义，这对于本发明所属的技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。
Figure IDA00001857117500011
Figure IDA00001857117500021
Figure IDA00001857117500031
Figure IDA00001857117500041

Claims (94)

1.一种利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，包括以下的步骤：
步骤（a），对上述靶核酸序列与上述靶杂交及检测引物进行杂交，上述靶杂交及检测引物包含：（i）杂交核苷酸序列，其与上述靶核酸序列互补，以及（ii）相互作用性标记系统，其包含一个标记或者多个标记；
步骤（b），借助模板-依赖性核酸聚合酶发生上述靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的条件下，将上述步骤（a）的结果物与具有5’→3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶进行接触，上述靶杂交及检测引物借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的上述聚合酶活性而延长，并且借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的上述5’→3’核酸酶活性而切割，从而上述靶杂交及检测引物放出上述标记或者上述相互作用性标记系统的至少一个标记，以此产生用于表示上述靶核酸序列存在的信号；以及，
步骤（c），对上述信号进行检测，上述信号表示上述靶核酸序列的存在。
2.根据权利要求1所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述步骤（a）借助（i）上述靶杂交及检测引物以及（ii）利用标记探针来实施；上述标记探针使其3’-末端发生变形来防止模板-依赖性核酸聚合酶引起的延长，上述靶杂交及检测引物进行杂交的位点的下游位点进行杂交，且，在步骤（b）中被切割而放出与上述标记探针连接的标记。
3.根据权利要求1所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述步骤（a）借助（i）上述靶杂交及检测引物以及（ii）利用上游引物或者下游引物来实施；上述上游引物与上述靶杂交及检测引物杂交的位点的上游位点进行杂交，并且，与上述靶杂交及检测引物具有相同的方向；上述下游引物与上述靶杂交及检测引物杂交的位点的下游位点进行杂交，且与上述靶杂交及检测引物具有相同的方向。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述方法在反复循环之间包括变性过程，还包括至少反复进行两次上述步骤（a）-步骤（b）或者步骤（a）-步骤（c）的步骤，以便扩增用于表示靶核酸序列存在的信号。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述步骤（c）的上述检测以实时方式、终-点方式或者预定时间间隔方式来实施。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶杂交及检测引物，具有以下通式I的双重引发寡核苷酸结构或具有以下通式Ⅱ的变性双重特异性寡核苷酸结构：
5’-Xp-Yq-Zr-3’（I）
上述通式中，Xp为具有与靶序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第一次引发部位；Yq为包含三个以上的通用碱基的分离部位；Zr为具有与靶序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第二次引发部位；p、q以及r表示核苷酸的数量，X、Y以及Z为脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’-第一次引发部位的Tm高于3’-第二次引发部位的Tm，上述分离部位在上述三个区域中具有最低的Tm；上述分离部位在针对靶核酸的退火方面，使上述5’-第一次引发部位从上述3’-第二次引发部位分离，由此上述寡核苷酸的上述退火特异性借助上述5’-第一次引发部位以及上述3’-第二次引发部位来双重性地决定，其结果，使上述靶杂交及检测引物的整体杂交特异性得到提高；
5’-X'p-Y'q-Z'r-3’（Ⅱ）
上述通式中，X'p为具有与靶序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第二次引发部位；Y'q为包含三个以上的通用碱基的分离部位；Z'r为具有与靶序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第一次引发部位；p、q以及r表示核苷酸的数量，X'、Y'以及Z'为脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’-第二次引发部位的Tm低于3’-第一次引发部位的Tm，上述分离部位在上述X'、Y'以及Z'三个区域中具有最低的Tm；上述分离部位在针对靶核酸的退火方面，使上述5’-第二次引发部位从上述3’-第一次引发部位分离，由此上述寡核苷酸的上述退火特异性借助上述5’-第二次引发部位以及上述3’-第一次引发部位来双重性地决定，其结果，使上述靶杂交及检测引物的整体杂交特异性得到提高；
7.根据权利要求6所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶杂交及检测引物具有上述权利要求6的通式I的双重引发寡核苷酸结构。
8.根据权利要求2所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述标记探针具有上述权利要求6的通式Ⅱ的变性双重特异性寡核苷酸结构。
9.根据权利要求3所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述上游引物或者上述下游引物具有上述权利要求6的通式I的双重引发寡核苷酸结构。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶杂交及检测引物在其5’-末端部位包含至少一个标记。
11.根据权利要求10所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶杂交及检测引物在其5’-末端包含至少一个标记。
12.根据权利要求1至3中任一项所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述标记为化学标记、酶标记、放射性标记、荧光标记、发光标记、化学发光标记或者金属标记。
13.根据权利要求1至3中任一项所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述相互作用性标记系统为一对的荧光报道分子以及猝灭分子，上述猝灭分子位于上述靶杂交及检测引物上，以便对上述报道分子的荧光进行猝灭，上述两个标记通过发生核酸酶切割的靶杂交及检测引物内的某一位点而分离，由此上述模板-依赖性核酸聚合酶的5’→3’核酸酶活性，通过上述位点中的切割反应从上述猝灭分子中分离出上述报道分子，以便产生用于表示上述靶核酸序列的存在的上述信号。
14.根据权利要求13所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述荧光报道分子位于上述靶杂交及检测引物的5’-末端部位，上述猝灭分子位于上述荧光报道分子的下游位点。
15.根据权利要求13所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述猝灭分子位于上述靶杂交及检测引物的5’-末端部位，上述荧光报道分子位于上述猝灭分子的下游位点。
16.根据权利要求2所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，与上述标记探针连接的上述标记不同于与上述靶杂交及检测引物连接的标记。
17.根据权利要求3所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述上游引物或者上述下游引物具有步骤（b）中放出的标记。
18.根据权利要求17所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，与上述上游引物或者下游引物连接的上述标记不同于与上述靶杂交及检测引物进行连接的标记。
19.根据权利要求1至3中任一项所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，具有5’→3’核酸酶活性的上述模板-依赖性核酸聚合酶为具有5’→3’核酸酶活性的热稳定性DNA聚合酶。
20.根据权利要求1所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列包含至少两种核酸序列，上述靶杂交及检测引物包含至少两种引物。
21.根据权利要求2所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列包含至少两种核酸序列，上述靶杂交及检测引物包含至少两种引物，上述标记探针包含至少两种探针。
22.根据权利要求3所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列包含至少两种核酸序列，上述靶杂交及检测引物包含至少两种引物，上述上游引物或者上述下游引物包含至少两种引物。
23.根据权利要求1至3中任一项所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列包含核苷酸变异。
24.根据权利要求1至3中任一项所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列为预-扩增的核酸序列。
25.一种利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，包括以下的步骤：
步骤（a），对上述靶核酸序列与一对引物进行杂交，上述一对引物由能够对上述靶核酸序列进行扩增的正向引物以及反向引物组成，这些引物中的至少一个引物为上述靶杂交及检测引物；上述靶杂交及检测引物包含：（i）杂交核苷酸序列，其与上述靶核酸序列互补，以及（ii）相互作用性标记系统，其包含一个标记或者多个标记；
步骤（b），借助模板-依赖性核酸聚合酶发生上述靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的条件下，将上述步骤（a）的结果物与具有5’→3’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶进行接触，上述靶杂交及检测引物借助上述模板依赖性核酸聚合酶的上述聚合酶活性而延长，并且借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的上述5’→3’核酸酶活性所切割，使得上述两个引物中的上述靶杂交及检测引物中放出上述标记或上述相互作用性标记系统的至少一个标记，以此产生用于表示上述靶核酸序列存在的信号；
步骤（c），使步骤（b）的上述结果物变形；
步骤（d），至少反复两次上述步骤（a）-步骤（c），用于对上述靶核酸序列以及表示上述靶核酸序列存在的上述所有信号进行扩增；以及，
步骤（e），用于检测表示靶核酸序列存在的上述信号；上述检测在步骤（d）的上述反复的各循环中，在步骤（d）的上述反复的终点或者上述反复期间的各个预定时间间隔内实施，这些信号表示靶核酸序列的存在。
26.根据权利要求25所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述步骤（a）利用追加的标记探针来实施；上述标记探针，其通过3’-末端发生变性来防止模板-依赖性核酸聚合酶引起的延长，在上述两个引物之间的某一位点进行杂交，并且，在步骤（b）中被切割而放出与上述标记探针连接的标记。
27.根据权利要求25所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述步骤（a）追加利用上游引物或者下游引物来实施；上述上游引物与上述靶杂交及检测引物进行杂交的位点的上游位点进行杂交，且与上述靶杂交及检测引物具有相同的方向；上述下游引物与上述两个引物之间的某一位点进行杂交，且与上述靶杂交及检测引物具有相同的方向。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述步骤（a）利用具有与靶杂交及检测引物的方向相反的方向的至少一个追加引物来实施。
29.根据权利要求25至27中任一项所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶杂交及检测引物具有以下通式I的双重引发寡核苷酸结构或具有以下通式Ⅱ的变性双重特异性寡核苷酸结构：
5’-Xp-Yq-Zr-3’（I）
上述通式中，Xp为具有与靶序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第一次引发部位；Yq为包含三个以上的通用碱基的分离部位，Zr为具有与靶序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第二次引发部位；p、q以及r表示核苷酸的数量，X、Y以及Z为脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’-第一次引发部位的Tm高于3’-第二次引发部位的Tm，上述分离部位在上述三个区域中具有最低的Tm；上述分离部位在针对靶核酸的退火方面，使上述5’-第一次引发部位从上述3’-第二次引发部位分离，由此上述寡核苷酸的上述退火特异性借助上述5’-第一次引发部位以及上述3’-第二次引发部位来双重性地决定，其结果，使上述靶杂交及检测引物的整体杂交特异性得到提高；
5’-X'p-Y'q-Z'r-3’（Ⅱ）
上述通式中，X'p为具有与靶序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第二次引发部位；Y'q为包含三个以上的通用碱基的分离部位，Z'r为具有与靶序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第一次引发部位；p、q以及r表示核苷酸的数量，X'、Y'以及Z'为脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’-第二次引发部位的Tm低于3’-第一次引发部位的Tm，上述分离部位在上述X'p、Y'q以及Z'r三个区域中具有最低的Tm；上述分离部位在针对靶核酸的退火方面，使上述5’-第二次引发部位从上述3’-第一次引发部位分离，由此上述寡核苷酸的上述退火特异性借助上述5’-第二次引发部位以及上述3’-第一次引发部位来双重性地决定，其结果，使上述靶杂交及检测引物的整体杂交特异性得到提高。
30.根据权利要求29所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶杂交及检测引物具有上述权利要求29的通式I的双重引发寡核苷酸结构。
31.根据权利要求25至27以及29中的任一项所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述两个引物中非靶杂交及检测引物的另一个引物具有上述权利要求29的通式I的双重引发寡核苷酸（DPO）结构。
32.根据权利要求26所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述标记探针具有上述权利要求29的通式Ⅱ的变性双重特异性寡核苷酸（mDSO）结构。
33.根据权利要求27所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述上游引物或者上述下游引物具有上述权利要求29的通式I的双重引发寡核苷酸结构。
34.根据权利要求25至27中的任一项所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶杂交及检测引物在其5’-末端部位包含至少一个标记。
35.根据权利要求34所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶杂交及检测引物在其5’-末端包含至少一个标记。
36.根据权利要求25至27中的任一项所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述标记为化学标记、酶标记、放射性标记、荧光标记、发光标记、化学发光标记或者金属标记。
37.根据权利要求25至27中的任一项所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述相互作用性标记系统为一对的荧光报道分子以及猝灭分子，上述猝灭分子位于上述靶杂交及检测引物上，以便对上述报道分子的荧光进行猝灭，并且，上述两个标记通过发生核酸酶切割的靶杂交及检测引物内的某一位点而分离，由此上述模板-依赖性核酸聚合酶的5’→3’核酸酶活性通过上述位点上的切割反应从上述猝灭分子分离上述报道分子，以便产生用于表示上述靶核酸序列存在的上述信号。
38.根据权利要求37所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述荧光报道分子位于上述靶杂交及检测引物的5’-末端部位，上述猝灭分子位于上述荧光报道分子的下游位点。
39.根据权利要求37所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述猝灭分子位于上述靶杂交及检测引物的5’-末端部位，上述荧光报道分子位于上述猝灭分子的下游位点。
40.根据权利要求25至27中的任一项所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述两个引物均具有步骤（b）中放出的标记。
41.根据权利要求40所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，与上述两个引物连接的上述标记为互不相同的标记。
42.根据权利要求26所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，与上述标记探针连接的上述标记不同于与上述靶杂交及检测引物连接的标记。
43.根据权利要求27所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述上游引物或者上述下游引物具有步骤（b）中放出的标记。
44.根据权利要求43所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，与上述上游引物或者上述下游引物连接的上述标记不同于与上述靶杂交及检测引物连接的标记。
45.根据权利要求25至27中的任一项所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，具有5’→3’核酸酶活性的上述模板-依赖性核酸聚合酶为具有5’→3’核酸酶活性的热稳定性DNA聚合酶。
46.根据权利要求25所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序包含至少两种核酸序列，作为上述正向引物以及上述反向引物的上述两个引物各包含至少两种引物。
47.根据权利要求26所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列包含至少两种核酸序列，作为上述正向引物以及上述反向引物的上述两个引物各包含至少两种引物，上述标记探针包含至少两种探针。
48.根据权利要求27所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列包含至少两种核酸序列，作为上述正向引物以及上述反向引物的上述两个引物各包含至少两种引物，上述上游引物或者下游引物包含至少两种引物。
49.根据权利要求25至27中的任一项所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列包括核苷酸变异。
50.根据权利要求25至27中的任一项所述的利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列为预-扩增的核酸序列。
51.一种利用伴随有靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的聚合酶连锁反应，从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤（a），准备包含上述靶核酸序列、一对引物以及具有5’→3’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶的PCR混合物，上述一对引物包含可扩增出上述靶核酸序列的正向引物及反向引物，其中，至少一个引物为上述靶杂交及检测引物；上述靶杂交及检测引物包含：（i）杂交核苷酸序列，其与上述靶核酸序列互补，以及（ii）一对的荧光报道分子以及猝灭分子；上述猝灭分子位于上述靶杂交及检测引物上，以便对上述报道分子的荧光进行猝灭；上述两个标记通过发生核酸酶切割的靶杂交及检测引物内的一个位点而分离，以此上述模板-依赖性核酸聚合酶的5’→3’核酸酶活性通过上述位点上的切割反应来将上述报道分子从上述猝灭分子中分离出，以便产生用于表示上述靶核酸序列存在的上述信号；
步骤（b），利用上述PCR混合物来对上述靶核酸序列进行扩增，将引物退火、引物延长以及变性至少实施两次，上述两个引物借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的聚合酶活性而延长，以此对靶核酸序列进行扩增，并且借助上述模板-依赖性核酸聚合酶的5’→3’核酸酶活性所切割，来从两个引物中的上述靶杂交及检测引物中放出上述报道分子或者上述猝灭分子，以此产生用于表示上述靶核酸序列存在的信号；以及，
步骤（c），检测用于表示上述靶核酸序列存在的上述荧光信号，上述检测在步骤（b）的上述反复的各循环中，在步骤（c）的上述反复的终点或者上述反复期间各个预定时间间隔内实施，这些信号表示靶核酸序列的存在。
52.根据权利要求51所述的利用伴随有靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的聚合酶连锁反应，从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述步骤（a）追加利用标记探针来实施，上述标记探针使其3’-末端发生变形来防止模板-依赖性核酸聚合酶引起的延长，在上述两个引物之间的某一位点进行杂交，在步骤（b）中被切割而放出与上述标记探针连接的标记。
53.根据权利要求51所述的利用伴随有靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的聚合酶连锁反应，从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述步骤（a）通过追加利用上游引物或者下游引物来实施；上述上游引物与上述靶杂交及检测引物杂交的位点的上游位点进行杂交，且与上述靶杂交及检测引物具有相同的方向；上述下游引物与上述两个引物之间的某一位点进行杂交，且与上述靶杂交及检测引物具有相同的方向。
54.根据权利要求51至53中的任一项所述的利用伴随有靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的聚合酶连锁反应，从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述步骤（a）利用具有与靶杂交及检测引物的方向相反的方向的至少一个追加引物来实施。
55.根据权利要求51至53中的任一项所述的利用伴随有靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的聚合酶连锁反应，从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶杂交及检测引物具有以下通式I的双重引发寡核苷酸结构或具有以下通式Ⅱ的变性双重特异性寡核苷酸结构：
5’-Xp-Yq-Zr-3’（I）
上述通式中，Xp为具有与靶序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第一次引发部位；Yq为包含三个以上的通用碱基的分离部位；Zr为具有与靶序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第二次引发部位；p、q以及r表示核苷酸的数量，X、Y以及Z为脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’-第一次引发部位的Tm高于3’-第二次引发部位的Tm，上述分离部位在上述三个区域中具有最低的Tm；上述分离部位在针对靶核酸的退火方面，使上述5’-第一次引发部位从上述3’-第二次引发部位分离，由此上述寡核苷酸的上述退火特异性借助上述5’-第一次引发部位以及上述3’-第二次引发部位来双重性地决定，其结果，使上述靶杂交及检测引物的整体杂交特异性得到提高；
5’-X'p-Y'q-Z'r-3’（Ⅱ）
上述通式中，X'p为具有与靶序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第二次引发部位；Y'q为包含三个以上的通用碱基的分离部位；Z'r为具有与靶序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第一次引发部位；p、q以及r表示核苷酸的数量，X'、Y'以及Z'为脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’-第二次引发部位的Tm低于3’-第二次引发部位的Tm，上述分离部位在上述X'p、Y'q以及Z'r三个区域中具有最低的Tm；上述分离部位在针对靶核酸的退火方面，使上述5’-第二次引发部位从上述3’-第一次引发部位分离，由此上述寡核苷酸的上述退火特异性借助上述5’-第二次引发部位以及上述3’-第一次引发部位来双重性地决定，其结果，使上述靶杂交及检测引物的整体杂交特异性得到提高。
56.根据权利要求55所述的利用伴随有靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的聚合酶连锁反应，从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶杂交及检测引物具有权利要求55的上述通式I的双重引发寡核苷酸结构。
57.根据权利要求51至53及55中的任一项所述的利用伴随有靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的聚合酶连锁反应，从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述两个引物中，非靶杂交及检测引物的另一个引物具有权利要求55的上述通式I的双重引发寡核苷酸结构。
58.根据权利要求52所述的利用伴随有靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的聚合酶连锁反应，从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述标记探针具有权利要求55的上述通式Ⅱ的变性双重特异性寡核苷酸结构。
59.根据权利要求53所述的利用伴随有靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的聚合酶连锁反应，从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述上游引物或者上述下游引物具有权利要求55的上述通式I的双重引发寡核苷酸结构。
60.根据权利要求51至53中的任一项所述的利用伴随有靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的聚合酶连锁反应，从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶杂交及检测引物在其5’-末端部位包含至少一个标记。
61.根据权利要求60所述的利用伴随有靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的聚合酶连锁反应，从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶杂交及检测引物在其5’-末端包含至少一个标记。
62.根据权利要求51所述的利用伴随有靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的聚合酶连锁反应，从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述荧光报道分子位于上述靶杂交及检测引物的5’-末端部位，上述猝灭分子位于上述荧光报道分子的下游位点。
63.根据权利要求51所述的利用伴随有靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的聚合酶连锁反应，从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述猝灭分子位于上述靶杂交及检测引物的5’-末端部位，并且，上述荧光报道分子位于上述荧光报道分子的下游位点。
64.根据权利要求51至53中的任一项所述的利用伴随有靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的聚合酶连锁反应，从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述两个引物均具有步骤（b）中放出的标记。
65.根据权利要求64所述的利用伴随有靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的聚合酶连锁反应，从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，与上述两个引物连接的上述标记为互不相同的标记。
66.根据权利要求52所述的利用伴随有靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的聚合酶连锁反应，从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，与上述标记探针连接的上述标记不同于与上述靶杂交及检测引物连接的标记。
67.根据权利要求53所述的利用伴随有靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的聚合酶连锁反应，从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述上游引物或者上述下游引物具有步骤（b）中放出的标记。
68.根据权利要求67所述的利用伴随有靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的聚合酶连锁反应，从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，与上述上游引物或者上述下游引物连接的上述标记不同于与上述靶杂交及检测引物连接的标记。
69.根据权利要求51至53中的任一项所述的利用伴随有靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的聚合酶连锁反应，从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，具有5’→3’核酸酶活性的上述模板-依赖性核酸聚合酶为具有5’→3’核酸酶活性的热稳定性DNA聚合酶。
70.根据权利要求51所述的利用伴随有靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的聚合酶连锁反应，从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列包含至少两种核酸序列，作为上述正向引物以及上述反向引物的上述两个引物各包含至少两种引物。
71.根据权利要求52所述的利用伴随有靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的聚合酶连锁反应，从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列包含至少两种核酸序列，作为上述正向引物以及上述反向引物的上述两个引物各包含至少两种引物，上述标记探针具有至少两种探针。
72.根据权利要求53所述的利用伴随有靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的聚合酶连锁反应，从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列包含至少两种核酸序列，作为上述正向引物以及上述反向引物的上述两个引物各包含至少两种引物，上述上游引物或者下游引物包含至少两种引物。
73.根据权利要求51至53中的任一项所述的利用伴随有靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的聚合酶连锁反应，从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列包含核苷酸变异。
74.根据权利要求51至53中的任一项所述的利用伴随有靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应的聚合酶连锁反应，从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列为预-扩增的核酸序列。
75.一种利用靶杂交及检测引物的5’-切割反应以及3’-延长反应来从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，包括：
（a）靶杂交及检测引物，其包含：（i）杂交核苷酸序列，其与上述靶核酸序列互补；以及（ii）相互作用性标记系统，其包含一个标记或者多个标记；以及
（b）模板-依赖性核酸聚合酶，其具有5’→3’核酸酶活性；上述靶杂交及检测引物与上述靶核酸序列进行杂交的情况下，上述靶杂交及检测引物借助上述核酸聚合酶的聚合酶活性而延长，上述靶杂交及检测引物借助上述核酸聚合酶的5’→3’核酸酶活性所切割，从上述靶杂交及检测引物放出上述标记或者上述相互作用性标记系统的至少一个标记，以此产生用于表示上述靶核酸序列存在的信号。
76.根据权利要求75所述的试剂盒，其特征在于，上述试剂盒还包括至少一个追加引物、标记探针或者这些组合。
77.根据权利要求76所述的试剂盒，其特征在于，上述至少一个追加引物包含相互作用性标记的系统，该相互作用性标记的系统包含一个标记或者多个标记。
78.根据权利要求75所述的试剂盒，其特征在于，上述靶杂交及检测引物具有以下通式I的双重引发寡核苷酸结构或具有以下通式Ⅱ的变性双重特异性寡核苷酸结构：
5’-Xp-Yq-Zr-3’（I）
上述通式中，Xp为具有与靶序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第一次引发部位；Yq为包含三个以上的通用碱基的分离部位；Zr为具有与靶序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第二次引发部位；p、q以及r表示核苷酸的数量，X、Y以及Z为脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’-第一次引发部位的Tm高于3’-第二次引发部位的Tm，上述分离部位在上述三个区域中具有最低的Tm；上述分离部位在针对靶核酸的退火方面，使上述5’-第一次引发部位从上述3’-第二次引发部位分离，由此上述寡核苷酸的上述退火特异性借助上述5’-第一次引发部位以及上述3’-第二次引发部位来双重性地决定，其结果，使上述靶杂交及检测引物的整体杂交特异性得到提高；
5’-X'p-Y'q-Z'r-3’（Ⅱ）
上述通式中，X'p为具有与靶序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第二次引发部位；Y'q为包含三个以上的通用碱基的分离部位；Z'r为具有与靶序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第一次引发部位；p、q以及r表示核苷酸的数量，X'、Y'以及Z'为脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；5’-第二次引发部位的Tm低于3’-第一次引发部位的Tm，上述分离部位在上述X'p、Y'q及Z'r三个区域中具有最低的Tm；上述分离部位在针对靶核酸的退火方面，使上述5’-第二次引发部位从上述3’-第一次引发部位分离，由此上述寡核苷酸的上述退火特异性借助上述5’-第二次引发部位以及上述3’-第一次引发部位来双重性地决定，其结果，使上述靶杂交及检测引物的整体杂交特异性得到提高。
79.根据权利要求76或者77所述的试剂盒，其特征在于，上述至少一个追加引物具有上述权利要求78的通式I的双重引发寡核苷酸结构。
80.根据权利要求76所述的试剂盒，其特征在于，上述标记探针具有上述权利要求78的通式Ⅱ的变性双重特异性寡核苷酸结构。
81.根据权利要求75所述的试剂盒，其特征在于，上述靶杂交及检测引物在其5’-末端部位包含至少一个标记。
82.根据权利要求81所述的试剂盒，其特征在于，上述靶杂交及检测引物在其5’-末端包含至少一个标记。
83.根据权利要求75或者77所述的试剂盒，其特征在于，上述标记为化学标记、酶标记、放射性标记、荧光标记、发光标记、化学发光标记或者金属标记。
84.根据权利要求75或者77所述的试剂盒，其特征在于，上述相互作用性标记系统为一对的荧光报道分子以及猝灭分子，上述猝灭分子位于上述靶杂交及检测引物上，以便对上述报道分子的荧光进行猝灭，并且，上述两个标记通过发生核酸酶切割的靶杂交及检测引物内的某一位点而分离，由此上述模板-依赖性核酸聚合酶的5’→3’核酸酶活性通过上述位点上的切割反应从上述猝灭分子分离上述报道分子，以便产生用于表示上述靶核酸序列存在的上述信号。
85.根据权利要求84所述的试剂盒，其特征在于，上述荧光报道分子位于上述靶杂交及检测引物的5’-末端部位，上述猝灭分子位于上述荧光报道分子的下游位点。
86.根据权利要求84所述的试剂盒，其特征在于，上述猝灭分子位于上述靶杂交及检测引物的5’-末端部位，上述荧光报道分子位于上述猝灭分子的下游位点。
87.根据权利要求75或者77中的任一项所述的试剂盒，其特征在于，具有5’→3’核酸酶活性的上述模板-依赖性核酸聚合酶为具有5’→3’核酸酶活性的热稳定性DNA聚合酶。
88.根据权利要求76或者77所述的试剂盒，其特征在于，上述追加引物（多个引物）和/或与上述标记探针连接的上述标记不同于与上述靶杂交及检测引物连接的标记。
89.根据权利要求75所述的试剂盒，其特征在于，上述靶核酸序列包含至少两种核酸序列，上述靶杂交及检测引物包含至少两种引物。
90.根据权利要求76所述的试剂盒，其特征在于，上述靶核酸序列包含至少两种核酸序列，上述靶杂交及检测引物包含至少两种引物，上述追加的各个引物（多个引物）包含至少两种引物。
91.根据权利要求76所述的试剂盒，其特征在于，上述靶核酸序列包含至少两种核酸序列，上述靶杂交及检测引物包含至少两种引物，上述标记探针包含至少两种探针。
92.根据权利要求76所述的试剂盒，其特征在于，上述靶核酸序列包含至少两种核酸序列，上述靶杂交及检测引物包含至少两种引物，且，上述追加的各个引物（多个引物）包含至少两种引物，上述标记探针包含至少两种探针。
93.根据权利要求75至77中的任一项所述的试剂盒，其特征在于，上述靶核酸序列包含核苷酸变异。
94.根据权利要求75至77中的任一项所述的试剂盒，其特征在于，上述靶核酸序列为预-扩增的核酸序列。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106434857A (zh) * 2009-09-03 2017-02-22 Seegene株式会社 靶区分性探针及其用途
CN107075576A (zh) * 2015-02-25 2017-08-18 精确诊断有限公司 哑铃结构寡核苷酸、包含其的核酸扩增用引物及利用该引物的核酸扩增方法
CN107937607A (zh) * 2017-11-30 2018-04-20 东北农业大学 用于猪传染性胃肠炎病毒检测的dpo引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用
CN108060269A (zh) * 2018-01-19 2018-05-22 东北农业大学 用于猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒检测的dpo引物组及其应用
CN108603193A (zh) * 2015-12-30 2018-09-28 生物辐射实验室股份有限公司 分裂循环和tape扩增
CN105368943B (zh) * 2015-11-21 2018-10-16 中国人民解放军第三〇九医院 一种用于鉴定分枝杆菌菌种的试剂盒及方法
CN114008217A (zh) * 2020-09-23 2022-02-01 迈克生物股份有限公司 检测核酸的组合、方法及试剂盒

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2480689A4 (en) * 2009-09-24 2013-05-15 Seegene Inc DETECTION OF TARGET NUCLEIC ACID SEQUENCES USING CYCLIC EXONUCLEOLYTIC REACTIONS
WO2011078441A1 (en) 2009-12-21 2011-06-30 Seegene, Inc. Tsg primer target detection
WO2011078439A1 (en) * 2009-12-24 2011-06-30 Seegene, Inc. Real-time multiplexing detection of target nucleic acid sequences with elimination of false signals
US9074249B2 (en) 2012-06-04 2015-07-07 New England Biolabs, Inc. Detection of amplification products
US9074243B2 (en) 2012-07-27 2015-07-07 New England Biolabs, Inc. Detection of amplification products
SG11201506146TA (en) * 2013-02-07 2015-09-29 Univ Rutgers Highly selective nucleic acid amplification primers
WO2024054924A1 (en) * 2022-09-08 2024-03-14 Gen-Probe Incorporated Method of detecting nucleic acid analytes using dual-specificity primers

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006095941A1 (en) * 2005-03-05 2006-09-14 Seegene, Inc. Processes using dual specificity oligonucleotide and dual specificity oligonucleotide
WO2007058499A1 (en) * 2005-11-18 2007-05-24 Seegene, Inc. Oligonucleotides for detecting respiratory virus nucleic acids

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4351760A (en) 1979-09-07 1982-09-28 Syva Company Novel alkyl substituted fluorescent compounds and polyamino acid conjugates
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
IL86724A (en) 1987-06-19 1995-01-24 Siska Diagnostics Inc Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences
JP2846018B2 (ja) 1988-01-21 1999-01-13 ジェネンテク，インコーポレイテッド 核酸配列の増幅および検出
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US6117635A (en) 1996-07-16 2000-09-12 Intergen Company Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon
ES2290979T3 (es) 1997-12-15 2008-02-16 Csl Behring Gmbh Cebador marcado para uso en la deteccion de acidos nucleicos diana.
GB9812768D0 (en) 1998-06-13 1998-08-12 Zeneca Ltd Methods
US6322980B1 (en) * 1999-04-30 2001-11-27 Aclara Biosciences, Inc. Single nucleotide detection using degradation of a fluorescent sequence
US7344830B2 (en) * 2000-09-26 2008-03-18 Health Research Inc. Heteroduplex tracking assay
EP1439222A1 (en) * 2001-10-26 2004-07-21 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Method of detecting target nucleic acid and nucleic acid probe
US6818420B2 (en) * 2002-02-27 2004-11-16 Biosource International, Inc. Methods of using FET labeled oligonucleotides that include a 3′-5′ exonuclease resistant quencher domain and compositions for practicing the same
JP3923917B2 (ja) * 2003-03-26 2007-06-06 株式会社東芝 ターゲットの製造方法、標的配列検出方法、ターゲットおよび標的配列検出用アッセイキット
EP1502958A1 (en) * 2003-08-01 2005-02-02 Roche Diagnostics GmbH New detection format for hot start real time polymerase chain reaction
KR20100099333A (ko) * 2005-03-05 2010-09-10 주식회사 씨젠 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드를 사용한 방법 및 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드
WO2007011946A2 (en) 2005-07-15 2007-01-25 Applera Corporation Detection of nucleic acid amplification
WO2007096702A2 (en) * 2005-07-25 2007-08-30 Asm Scientific, Inc. Methods for multiplexing recombinase polymerase amplification
WO2011027966A2 (en) * 2009-09-03 2011-03-10 Seegene, Inc. Td probe and its uses

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006095941A1 (en) * 2005-03-05 2006-09-14 Seegene, Inc. Processes using dual specificity oligonucleotide and dual specificity oligonucleotide
WO2007058499A1 (en) * 2005-11-18 2007-05-24 Seegene, Inc. Oligonucleotides for detecting respiratory virus nucleic acids

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHUN JY等: "Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene.", 《NUCLEIC ACIDS RES.》 *
MARRAS SA等: "Real-time assays with molecular beacons and other fluorescent nucleic acid hybridization probes.", 《CLIN CHIM ACTA.》 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106434857A (zh) * 2009-09-03 2017-02-22 Seegene株式会社 靶区分性探针及其用途
CN107075576A (zh) * 2015-02-25 2017-08-18 精确诊断有限公司 哑铃结构寡核苷酸、包含其的核酸扩增用引物及利用该引物的核酸扩增方法
CN105368943B (zh) * 2015-11-21 2018-10-16 中国人民解放军第三〇九医院 一种用于鉴定分枝杆菌菌种的试剂盒及方法
CN108603193A (zh) * 2015-12-30 2018-09-28 生物辐射实验室股份有限公司 分裂循环和tape扩增
CN108603193B (zh) * 2015-12-30 2022-07-22 生物辐射实验室股份有限公司 分裂循环和tape扩增
CN107937607A (zh) * 2017-11-30 2018-04-20 东北农业大学 用于猪传染性胃肠炎病毒检测的dpo引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用
CN108060269A (zh) * 2018-01-19 2018-05-22 东北农业大学 用于猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒检测的dpo引物组及其应用
CN108060269B (zh) * 2018-01-19 2020-12-01 东北农业大学 用于猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒检测的dpo引物组及其应用
CN114008217A (zh) * 2020-09-23 2022-02-01 迈克生物股份有限公司 检测核酸的组合、方法及试剂盒
CN114008217B (zh) * 2020-09-23 2024-05-10 迈克生物股份有限公司 检测核酸的组合、方法及试剂盒

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