ES2533793T3 - Procedimientos de detección de diana con cebador HDD - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento de detección de una secuencia de ácido nucleico diana de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos usando una reacción de escisión en 5' y una reacción de extensión en 3' de un cebador de hibridación y detección de la diana (cebador HDD), que comprende las etapas de: (a) hibridar la secuencia de ácido nucleico diana con el cebador HDD, en el que el cebador HDD comprende (i) hibridar una secuencia nucleotídica complementaria con la secuencia de ácido nucleico diana y (ii) un marcador o un sistema marcador interactivo que contiene una pluralidad de marcadores; (b) poner en contacto el resultante de la etapa (a) con una ácido nucleico polimerasa dependiente de molde que tiene una actividad nucleasa de 5' a 3' en las condiciones de la reacción de escisión en 5' y la reacción de extensión en 3' del cebador HDD mediante el ácido nucleico polimerasa dependiente de molde; en el que el cebador HDD se extiende por acción de la actividad polimerasa de la ácido nucleico polimerasa dependiente de molde y es escindido por la actividad nucleasa de 5' a 3' del ácido nucleico polimerasa dependiente de molde para liberar el marcador, o al menos un marcador del sistema marcador interactivo del cebador HDD, de modo que se obtiene una señal indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana; y (c) detectar la señal indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana.

Description

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puede ser fluorescente o no fluorescente.
En otra forma de sistemas marcadores interactivos, el donante de energía es no fluorescente, por ejemplo un cromóforo y el aceptor de energía es fluorescente. En otra forma más de sistemas marcadores interactivos, el donante de energía es luminiscente, por ejemplo bioluminiscente, quimioluminiscente, electroquimioluminiscente, y el aceptor es fluorescente.
Más preferentemente, la señal indicativa de la secuencia de ácido nucleico diana se genera mediante sistemas marcadores interactivos, lo más preferentemente el sistema marcador FRET.
Cuando se usa el marcador FRET, los dos marcadores (la molécula indicadora fluorescente y una molécula inactivadora colocada en el cebador HDD para inactivar la fluorescencia de la molécula indicadora) están separados por un sitio dentro del cebador HDD susceptible a la escisión por nucleasa, de modo que permite que la actividad nucleasa de 5' a 3' de la ácido nucleico polimerasa dependiente de molde separe la molécula indicadora fluorescente de la molécula inactivadora escindiendo en el sitio susceptible, obteniendo de este modo la señal indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana.
De acuerdo con una realización preferida, la molécula indicadora fluorescente se localiza en una porción terminal en 5’ (más preferentemente en el extremo 5’) del cebador HDD y la molécula inactivadota se localiza en 3’ de la molécula indicadora fluorescente. Como alternativa, la molécula inactivadora se localiza en una porción terminal en 5’ (más preferentemente en el extremo 5’) del cebador HDD y la molécula indicadora fluorescente se localiza en 3’ de la molécula inactivadora.
La molécula indicadora y la molécula inactivadora útiles en la presente invención pueden ser materiales fluorescentes. Las moléculas indicadoras y las moléculas inactivadoras conocidas en la técnica son útiles en la presente invención. Ejemplos de estas son: Cy2™ (506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), Calceína (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), Rodamina 110 (520), 5-FAM (522), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), Rodamina 123 (529), Magnesium Green™ (531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), Ficoeritrina R&B (575), Rodamina Faloidina (575), Calcium Orange™ (576), Pironina Y (580), Rodamina B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Rojo Texas (615), Rojo Nilo (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), R-ficocianina (642), C-ficocianina (648), TO-PRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670), Tiadicarbocianina (671) y Cy5.5 (694). Los números entre paréntesis es una longitud de onda de emisión máxima en nanómetros.
Pares adecuados de indicador-inactivador se divulgan en diversas publicaciones del siguiente modo: Pesce y col., editores, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); White y col., Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2ª Edición (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Color AND Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6ª Edición, Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996; patentes de EE.UU. Nº 3.996.345 y
4.351.760.
Cabe destacar que una molécula inactivadora negra no fluorescente capaz de inactivar una fluorescencia de una amplia gama de longitudes de onda o una longitud de onda específica se puede usar en la presente invención.
En el marcador de FRET adaptado al cebador HDD, el indicador abarca un donante de FRET y el inactivador abarca la otra pareja (aceptor) de FRET. Por ejemplo, se usa un pigmento fluoresceína como indicador y un pigmento rodamina como inactivador.
La presente invención usa dos actividades distintas de la ácido nucleico polimerasa dependiente de molde, incluyendo una actividad polimerasa y una actividad nucleasa de 5' a 3'. La expresión “actividad nucleasa de 5' a 3'" usada en el presente documento significa actividad exonucleasa de 5’ a 3’ generalmente asociada con ADN polimerasas de modo que los nucleótidos se eliminan del extremo 5’ de un oligonucleótido hibridado a un molde, o actividad endonucleasa de 5’ a 3’ de modo que se produce escisión de más de un nucleótido desde el extremo5’ de un oligonucleótido hibridado a un molde.
La reacción catalizada por la actividad polimerasa se expresa en el presente documento como la reacción de extensión en 3’. La reacción catalizada por la actividad nucleasa de 5’ a 3’ se expresa en el presente documento como la reacción de escisión en 5’.
La reacción de escisión en 5’ hace referencia a una reacción nucleolítica en el extremo 5’ o en una porción terminal en 5’ (por ejemplo, más de un nucleótido separado del extremo 5’) de un oligonucleótido (por ejemplo, cebadores y sondas) hibridado con la secuencia de ácido nucleico diana. Esta reacción tiene como resultado la escisión de los cebadores y sondas, dando fragmentos nucleotídicos con varios tamaños.
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extensión en 3’ del cebador HDD mediante la ácido nucleico polimerasa dependiente de molde; en el que el cebador HDD se extiende por acción de la actividad polimerasa de la ácido nucleico polimerasa dependiente de molde y es escindido por la actividad nucleasa de 5' a 3' de la ácido nucleico polimerasa dependiente de molde para liberar el marcador, o al menos un marcador del sistema marcador interactivo del cebador HDD, en el que la sonda marcada se escinde mediante la actividad nucleasa de 5’ a 3’ de la ácido nucleico polimerasa dependiente de molde para liberar el marcador de la sonda, de modo que se obtiene una señal indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana;
(b') desnaturalizar la resultante de la etapa (b);
(b") repetir las etapas (a)-(b') al menos dos veces para amplificar la señal indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana; y
(c) detectar la señal indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana, en el que la detección se realiza para cada ciclo de la repetición de la etapa (b"), al final de la repetición de la etapa (b") o en cada uno de los intervalos de tiempo predeterminados durante la repetición de la etapa (b"), de forma que la señal es indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana.
De acuerdo con una realización preferida, la secuencia de ácido nucleico diana comprende al menos dos tipos (más preferentemente al menos tres tipos, lo más preferentemente al menos cinco tipos) de las secuencias de ácido nucleico y el cebador HDD comprende al menos dos tipos (más preferentemente, al menos tres tipos, lo más preferentemente al menos cinco tipos) de cebadores y la sonda marcada comprende al menos dos tipos (más preferentemente al menos tres tipos, lo más preferentemente al menos cinco tipos) de sondas.
Cuando se usan al menos dos cebadores de HDD y al menos dos sondas, se pueden preparar para que contengan marcadores en varias combinaciones dependiendo de los fines de análisis. Por ejemplo, una pluralidad de los cebadores de HDD y al menos dos sondas pueden unirse a todos los marcadores idénticos, todos los marcadores diferentes o marcadores diferentes parciales. Además, al menos dos marcadores parcial o completamente diferentes
o iguales pueden estar unidos a un cebador HDD o una sonda.
De acuerdo con una realización preferida, la secuencia de ácido nucleico diana comprende una variación nucleotídica.
De acuerdo con una realización preferida, la secuencia de ácido nucleico diana es una secuencia de ácido nucleico preamplificada.
3. Ensayo de detección de la diana con cebador HDD usando un cebador HDD y en dirección 5’ (o cebador en dirección 3’)
De acuerdo con el tercer protocolo, cuando el cebador HDD y un cebador en dirección 5’ (o cebador en dirección 3’) hibridados con la secuencia de ácido nucleico diana se extienden, se produce la reacción de escisión en 5’ sobre el cebador HDD y/o el cebador en dirección 5’ (o cebador en dirección 3’) mediante la ácido nucleico polimerasa dependiente de molde que tiene la actividad nucleasa de 5’ a 3’ para liberar el marcador del cebador HDD, de modo que se obtiene una señal indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana.
El cebador en dirección 5’ hibrida con un sitio en 5’ de un sitio hibridado del cebador HDD y tiene la misma orientación que el cebador HDD. El cebador en dirección 3’ hibrida con un sitio en 3’ de un sitio hibridado del cebador HDD y tiene la misma orientación que el cebador HDD.
Específicamente, el tercer protocolo comprende las etapas de:
(a)
hibridar la secuencia de ácido nucleico diana con el cebador HDD y un cebador en dirección 5’ o un cebador en dirección 3’; en el que el cebador HDD comprende (i) hibridar una secuencia nucleotídica complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana y (ii) un marcador o un sistema marcador interactivo que contiene una pluralidad de marcadores; en el que el cebador en dirección 5’ hibrida con un sitio en dirección 5’ de un sitio hibridado del cebador HDD y tiene la misma orientación que el cebador HDD, en el que el cebador en orientación 3’ hibrida con un sitio en dirección 3’ de un sitio hibridado del cebador HDD y tiene la misma orientación que el cebador HDD;
(b)
poner en contacto el resultante de la etapa (a) con una ácido nucleico polimerasa dependiente de molde que tiene una actividad nucleasa de 5’ a 3’ en las condiciones de la reacción de escisión en 5’ y la reacción de extensión en 3’ del cebador HDD mediante la ácido nucleico polimerasa dependiente de molde; en el que el cebador HDD se extiende por acción de la actividad polimerasa de la ácido nucleico polimerasa dependiente de molde y es escindido por la actividad nucleasa de 5' a 3' de la ácido nucleico polimerasa dependiente de molde para liberar el marcador, o al menos un marcador del sistema marcador interactivo del cebador HDD, de modo que se obtiene una señal indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana;
(c)
detectar la señal indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana.
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cebador es el cebador HDD permite tanto la amplificación de la diana como la amplificación de la señal cuando el procedimiento se lleva a cabo de forma repetida.
De acuerdo con una realización preferida, el presente procedimiento comprende las etapas de:
(a)
hibridar la secuencia de ácido nucleico diana con un par de cebadores compuesto por dos cebadores como cebador directo y cebador inverso en los que al menos un cebador es el cebador HDD capaz de amplificar la secuencia de ácido nucleico diana, en los que el cebador HDD comprende (i) una secuencia nucleotídica de hibridación complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana y (ii) un marcador o un sistema marcador interactivo que contiene una pluralidad de marcadores;
(b)
poner en contacto el resultante de la etapa (a) con una ácido nucleico polimerasa dependiente de molde que tiene una actividad nucleasa de 5’ a 3’ en las condiciones de la reacción de escisión en 5’ y la reacción de extensión en 3’ de los dos cebadores mediante la ácido nucleico polimerasa dependiente de molde; en el que los dos cebadores se extienden por acción de la actividad polimerasa de la ácido nucleico polimerasa dependiente de molde y es escindido por la actividad nucleasa de 5' a 3' de la ácido nucleico polimerasa dependiente de molde para liberar el marcador, o al menos un marcador del sistema marcador interactivo del cebador HDD entre los dos cebadores, de modo que se obtiene una señal indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana;
(c)
desnaturalizar el resultante de la etapa (b);
(d)
repetir las etapas (a)-(c) al menos dos veces para amplificar tanto la secuencia de ácido nucleico diana como la señal indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana; y
(e)
detectar la señal indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana, en el que la detección se realiza para cada ciclo de la repetición de la etapa (d), al final de la repetición de la etapa (d) o en cada uno de los intervalos de tiempo predeterminados durante la repetición, de forma que la señal es indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana.
El cuarto protocolo usa un par de cebadores compuesto por dos cebadores como cebador directo y cebador inverso. Al menos uno de los dos cebadores es el cebador HDD.
De acuerdo con una realización preferida, la etapa (a) se realiza usando al menos un cebador adicional que tiene una orientación inversa al cebador HDD. En este caso, los moldes (es decir, la secuencia de ácido nucleico diana) están más disponibles para la hibridación del cebador HDD.
De acuerdo con una realización preferida, los dos cebadores tienen todos un marcador a liberar en la etapa (b). Los marcadores unidos a los dos cebadores pueden ser iguales o diferentes entre sí. El marcador útil en el cebador homólogo del cebador HDD se describe como el del cebador HDD. Preferentemente, el marcador es un marcador FRET.
La desnaturalizacíón del resultante de la etapa (b) es hacer de los dúplex bicatenarios formados en la etapa (b) ácidos nucleicos monocatenarios. Los procedimientos para la desnaturalizacíón incluyen, entre otros, tratamiento con calor, álcali, formamida, urea y glicoxal, procedimientos enzimáticos (p. ej., acción de la helicasa) y proteínas de unión. Por ejemplo, la desnaturalizacíón se puede conseguir calentando a una temperatura que varía de 80 ºC a 105 ºC. Joseph Sambrook, y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) proporcionan procedimientos generales para realizar este tratamiento.
La presente invención es muy adecuada para la detección multiplexada de las secuencias de ácido nucleico diana. Según el mejor entender de los inventores, la presente invención es un procedimiento único que permite que se haga realidad una detección en tiempo real multiplexada.
En el cuarto protocolo se pueden preparar varias combinaciones del cebador HDD como se muestra en la FIG. 4A:
(A) el cebador HDD como cebador directo; (B) el cebador HDD como cebador inverso y (C) el cebador HDD como cebador directo y como cebador inverso.
La FIG. 15 muestra los resultados de las combinaciones de cebadores ilustradas en la FIG. 4A usando el cebador interno combinado con un cebador HDD como cebador directo, cebador inverso o ambos en la amplificación por PCR a tiempo real para el gen de Neisseria gonorrhoeae (NG).
De acuerdo con una realización preferida, la secuencia de ácido nucleico diana comprende al menos dos tipos (más preferentemente al menos tres tipos, lo más preferentemente al menos cinco tipos) de las secuencias de ácido nucleico, cada uno de los dos cebadores comprende al menos dos tipos (más preferentemente, al menos tres tipos, lo más preferentemente al menos cinco tipos) de cebadores.
De acuerdo con una realización preferida, la secuencia de ácido nucleico diana comprende una variación nucleotídica.
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nucleico, cada uno de los dos cebadores como el cebador directo y el cebador inverso comprende al menos dos tipos (más preferentemente, al menos tres tipos, lo más preferentemente al menos cinco tipos) de cebadores y la sonda marcada comprende al menos dos tipos (más preferentemente al menos tres tipos, lo más preferentemente al menos cinco tipos) de sondas.
5 De acuerdo con una realización preferida, la secuencia de ácido nucleico diana comprende una variación nucleotídica.
De acuerdo con una realización preferida, la secuencia de ácido nucleico diana es una secuencia de ácido nucleico preamplificada.
6. Ensayo de amplificación de la diana en tiempo real usando cebador HDD y cebador en dirección 5’ (o cebador en 10 dirección 3’)
De acuerdo con el sexto protocolo, cuando (i) el par de cebadores compuesto por dos cebadores como cebador directo y cebador inverso en el que al menos un cebador es el cebador HDD, e (ii) el cebador en dirección 5’ (o el cebador en dirección 3’) hibridado con la secuencia de ácido nucleico diana, se extienden, la reacción de escisión en 5’ se produce en los dos cebadores y/o el cebador en dirección 5’ (o el cebador en dirección 3') mediante la ácido
15 nucleico polimerasa dependiente de molde que tiene la actividad nucleasa de 5’ a 3’ para liberar el marcador del cebador HDD entre los dos cebadores, de modo que se obtiene una señal indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana.
De acuerdo con una realización preferida, el presente procedimiento comprende las etapas de:
(a) hibridar la secuencia de ácido nucleico diana con el par de cebadores compuesto por dos cebadores como un
20 cebador directo y un cebador inverso, en el que al menos un cebador es el cebador HDD y el cebador en dirección 5’ (o el cebador en dirección 3’); en el que el cebador HDD comprende (i) hibridar una secuencia nucleotídica complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana y (ii) un marcador o un sistema marcador interactivo que contiene una pluralidad de marcadores; en el que el cebador en dirección 5’ hibrida con un sitio en dirección 5’ de un sitio hibridado del cebador HDD y tiene la misma orientación que el cebador HDD, en el que
25 el cebador en orientación 3’ hibrida con un sitio entre los dos cebadores y tiene la misma orientación que el cebador HDD;
(b) poner en contacto el resultante de la etapa (a) con una ácido nucleico polimerasa dependiente de molde que tiene una actividad nucleasa de 5’ a 3’ en las condiciones de la reacción de escisión en 5’ y la reacción de extensión en 3’ de los dos cebadores y el cebador en dirección 5’ mediante la ácido nucleico polimerasa
30 dependiente de molde; en el que los dos cebadores y el cebador en dirección 5’ (o el cebador en dirección 3’) se extienden por acción de la actividad polimerasa de la ácido nucleico polimerasa dependiente de molde y es escindido por la actividad nucleasa de 5' a 3' de la ácido nucleico polimerasa dependiente de molde para liberar el marcador, o al menos un marcador del sistema marcador interactivo del cebador HDD entre los dos cebadores, de modo que se obtiene una señal indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana;
35 (c) desnaturalizar el resultante de la etapa (b);
(d)
repetir las etapas (a)-(c) al menos dos veces para amplificar tanto la secuencia de ácido nucleico diana como la señal indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana; y
(e)
detectar la señal indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana, en el que la detección se realiza para cada ciclo de la repetición de la etapa (d), al final de la repetición de la etapa (d) o en cada uno de
40 los intervalos de tiempo predeterminados durante la repetición de la etapa (d), de forma que la señal es indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana.
De acuerdo con una realización preferida, la etapa (a) se realiza usando al menos un cebador adicional que tiene una orientación inversa al cebador HDD. En este caso, los moldes (es decir, la secuencia de ácido nucleico diana) están más disponibles para la hibridación del cebador HDD y el cebador en dirección 5’ (o el cebador en dirección
45 3’).
De acuerdo con una realización preferida, no solo el cebador HDD sino también otros cebadores tienen un marcador que genera una señal detectable. Los marcadores unidos a los cebadores pueden ser iguales o diferentes entre sí. El marcador útil en los cebadores se describe como en del cebador HDD. Preferentemente, el marcador es un marcador FRET.
50 En el sexto protocolo se pueden construir varias combinaciones del par de cebadores y el cebador en dirección 5’ como se muestra en la FIG. 4C: (A) los cebadores de HDD como un cebador directo y un cebador en dirección 5’;
(B) los cebadores de HDD como un cebador directo y un cebador inverso; (C) los cebadores de HDD como un cebador directo, un cebador en dirección 5’ y un cebador inverso; (D) el cebador HDD como un cebador directo.
La FIG. 17 muestra los resultados de combinaciones de cebadores ilustradas en la FIG. 4C usando el cebador HDD 55 como un cebador directo combinado con un cebador HDD adicional como un cebador en dirección 5’, un cebador
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inverso o ambos en la amplificación por PCR a tiempo real para el gen de Neisseria gonorrhoeae (NG).
En el sexto protocolo se pueden construir varias combinaciones del par de cebadores y un cebador en dirección 3’ como se muestra en la FIG. 4D: (A) el cebador HDD como cebador directo; (B) el cebador HDD como cebador inverso; (C) el cebador HDD como cebador directo y como cebador inverso.
La FIG. 18 muestra los resultados de las combinaciones de cebadores ilustradas en la FIG. 4D usando un cebador interno combinado con el cebador HDD como un cebador directo, un cebador inverso o ambos en la amplificación por PCR a tiempo real para el gen de Neisseria gonorrhoeae (NG).
En la Figura 4D, el cebador en dirección 3’ se puede expresar como un cebador interno.
De acuerdo con una realización preferida, la secuencia de ácido nucleico diana comprende al menos dos tipos (más preferentemente al menos tres tipos, lo más preferentemente al menos cinco tipos) de las secuencias de ácido nucleico, cada uno de los dos cebadores como el cebador directo y el cebador inverso comprende al menos dos tipos (más preferentemente, al menos tres tipos, lo más preferentemente al menos cinco tipos) de cebadores y el cebador en dirección 5’ (o el cebador en dirección 3’) comprende al menos dos tipos (más preferentemente al menos tres tipos, lo más preferentemente al menos cinco tipos) de cebadores.
De acuerdo con una realización preferida, la secuencia de ácido nucleico diana comprende una variación nucleotídica.
De acuerdo con una realización preferida, la secuencia de ácido nucleico diana es una secuencia de ácido nucleico preamplificada.
Realización preferida: Ensayo de PCR en tiempo real usando el cebador HDD
Los protocolos 4º-6º usan un par de cebadores compuesto por dos cebadores como un cebador directo y un cebador inverso en los que al menos un cebador es el cebador HDD capaz de amplificar la secuencia de ácido nucleico diana. Por tanto, la repetición de la reacción se acompaña de la amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana. Preferentemente, la amplificación se realiza de acuerdo con la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) que se divulga en las patentes de EE.UU. Nº 4.683.195, 4.683.202, y 4.800.159.
De acuerdo con una realización preferida, la presente invención para detectar una secuencia de ácido nucleico diana de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos usando una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) asociada con una reacción de escisión en 5’ y una reacción de extensión en 3' de un cebador de hibridación y detección de la diana (cebador HDD) comprende las etapas de:
(a)
preparar una mezcla de PCR que contiene la secuencia de ácido nucleico diana, un par de cebadores compuesto por dos cebadores en los que al menos un cebador es el cebador HDD capaz de amplificar la secuencia de ácido nucleico diana y una ácido nucleico polimerasa dependiente de molde que tiene una actividad nucleasa de 5' a 3'; en el que el cebador HDD comprende (i) una secuencia nucleotídica de hibridación complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana y (ii) un par de una molécula indicadora fluorescente y una molécula inactivadota colocadas en el cebador HDD para inactivar la fluorescencia de la molécula indicadora; en el que los dos cebadores están separados por un sitio dentro del cebador HDD susceptible a la escisión por nucleasa, de modo que se permite que la actividad nucleasa de 5' a 3' de la ácido nucleico polimerasa dependiente de molde separe la molécula indicadora fluorescente de la molécula inactivadora escindiendo por el sitio susceptible, de modo que se obtiene la señal indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana;
(b)
amplificar la secuencia de ácido nucleico diana usando la mezcla para PCR realizando al menos dos ciclos de hibridación de cebador, extensión y desnaturalización del cebador, en el que los dos cebadores se extienden por la actividad polimerasa de la ácido nucleico polimerasa dependiente de molde para amplificar la secuencia de ácido nucleico diana y son escindidos por la actividad nucleasa 5’ a 3’ de la ácido nucleico polimerasa dependiente de molde para liberar la molécula indicadora o la molécula inactivadota del cebador HDD entre los dos cebadores; de modo que se obtiene una señal indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana; y
(c)
detectar la señal de fluorescencia indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana, en el que la detección se realiza para cada ciclo de la repetición de la etapa (d), al final de la repetición de la etapa (b)
o en cada uno de los intervalos de tiempo predeterminados durante la repetición, de forma que la señal es indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana.
De acuerdo con una realización preferida, el procedimiento se realiza de acuerdo con una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando el par de cebadores en el que al menos un cebador es el cebador HDD.
Como se describe en el cuarto protocolo se pueden sugerir varias combinaciones del cebador HDD en las reacciones de PCR en tiempo real: (A) el cebador HDD como cebador directo; (B) el cebador HDD como cebador inverso y (C) el cebador HDD como cebador directo y como cebador inverso.
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3' en términos de acontecimientos de hibridación al ácido nucleico diana, de modo que la especificidad de la hibridación del oligonucleótido viene determinada doblemente por la primera porción de cebado en 5’ y la segunda porción de cebado en 3' de forma que la especificidad de hibridación global del cebador HDD se potencia;
5'-X'p-Y'q-Z'r-3' (II)
en la que X'p representa una primera porción de cebado en 5’ que tiene una secuencia de nucleótidos de hibridación complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana; Y'q representa una porción de separación que comprende al menos tres bases universales, Z'r representa una segunda porción de cebado en 3' que tiene una secuencia de nucleótidos de hibridación complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana; p, q y r representan el número de nucleótidos, y X', Y' y Z' son desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos; la Tm de la primera porción de cebado en 5’ es inferior a la de la segunda porción de cebado en 3' y la porción de separación tiene la Tm más baja en las tres porciones de X'p, Y'q and Z'r; la porción de separación separa la primera porción de cebado en 5’ de la segunda porción de cebado en 3' en términos de acontecimientos de hibridación al ácido nucleico diana, de modo que la especificidad de la hibridación del oligonucleótido viene determinada doblemente por la primera porción de cebado en 5’ y la segunda porción de cebado en 3' de forma que la especificidad de hibridación global del cebador HDD se potencia.
Más preferentemente, el cebador HDD tiene la estructura de oligonucleótido de cebado doble (OCD) representada por la fórmula general I.
El cebador HDD que tiene una estructura de OEDm es particularmente adecuado en el tercer y el sexto protocolo usando el cebador en dirección 5'. El cebador HDD que tiene una estructura de OCD es adecuado en otros protocolos.
La estructura de OCD como una versión del cebador de OED (oligonucleótido de especificidad doble) la propuso por primera vez el presente inventor (véase el documento WO 2006/095981; Chun y col., Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene, Nucleic Acid Research, 35:6e40(2007)). La estructura de OEDm es una versión recién modificada de la estructura de OCD propuesta por primera vez por el presente inventor (véase el documento WO 2006/095981).
El OCD abarca un nuevo concepto en el que su hibridación viene determinada doblemente por la porción en 5’ de especificidad de Tm alta (o la primera porción de hibridación en 5', la primera porción de cebado e 5') y la porción en 3’ de especificidad de Tm baja (o la segunda porción de hibridación en 3’, la segunda porción de cebado en 3’) separadas por la porción de separación, lo que exhibe una especificidad de hibridación espectacularmente potenciada (véase el documento WO 2006/095981; Kim y col., Direct detection of lamivudine-resistant hepatitis B virus mutants by multiplex PCR using dual-priming oligonucleotide primers, Journal of Virological Methods, 149:76 84(2008); Kim, y col., Rapid detection and identification of 12 respiratory viruses using a dual priming oligonucleotide system-based multiplex PCR assay, Journal of Virological Methods, doi:10.1016/j.jviromet.2008.11.007(2008); Horii y col., Use of dual priming oligonucleotide system to detect multiplex sexually transmitted pathogens in clinical specimens, Letters in Applied Microbiology, doi:10.111/j.1472 -765X2009.02618x(2009)) Como tal, el OCD tiene, en última instancia, dos segmentos cebadores con distintas propiedades de hibridación: la primera porción de cebado en 5’ que inicia una hibridación estable y la segunda porción de cebado en 3’ que principalmente determina la especificidad por la diana.
La estructura de OEDm es la opuesta a la estructura de OED: La segunda porción de cebado en 5’ (o la segunda porción de hibridación en 5’) que determina principalmente la especificidad diana y la primera porción de cebado en 3’ (o la primera porción de hibridación en 3’) que inicia una hibridación estable.
De acuerdo con una realización preferida, la base universal en la porción de separación se selecciona del grupo que consiste en desoxiinosina, inosina, 7-deaza-2'-desoxiinosina, 2-aza-2'-desoxiinosina, 2'-OMe inosina, 2'-F inosina, desoxi 3-nitropirrol, 3-nitropirrol, 2'-OMe 3-nitropirrol, 2'-F 3-nitropirrol, 1-(2'-desoxi-beta-D-ribofuranosil)-3-nitropirrol, desoxi 5-nitroindol, 5-nitroindol, 2'-OMe 5-nitroindol, 2'-F 5-nitroindol, desoxi 4-nitrobencimidazol, 4nitrobencimidazol, desoxi 4-aminobencimidazol, 4-aminobencimidazol, desoxi nebularina, 2'-F nebularina, 2'-F 4nitrobencimidazol, PNA-5-introindol, PNA-nebularina, PNA-inosina, PNA-4-nitrobencimidazol, PNA-3-nitropirrol, morfolino-5-nitroindol, morfolino-nebularina, morfolino-inosina, morfolino-4-nitrobencimidazol, morfolino-3-nitropirrol, fosforamidato-5-nitroindol, fosforamidato-nebularina, fosforamidato-inosina, fosforamidato-4-nitrobencimidazol, fosforamidato-3-nitropirrol, 2'-0-metoxietil inosina, 2'0-metoxietil nebularina, 2'-0-metoxietil 5-nitroindol, 2'-0-metoxietil 4-nitro-bencimidazol, 2'-0-metoxietil 3-nitropirrol, y combinaciones de los mismos. Más preferentemente, la base universal es desoxiinosina, 1-(2'-desoxi-beta-D-ribofuranosil)-3-nitropirrol o 5-nitroindol, lo más preferentemente desoxiinosina.
Preferentemente, la porción de separación comprende nucleótidos contiguos que tienen al menos tres, más preferentemente al menos cuatro, lo más preferentemente al menos cinco bases universales, preferentemente desoxiinosina.
Preferentemente, en la estructura de OCD, la primera porción de cebado en 5’ es más larga que la segunda porción de cebado en 3’. La primera porción de cebado en 5’ tiene, preferentemente, una longitud de 15 -60 nucleótidos,
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