JP6403674B2 - 生体プローブおよびその使用 - Google Patents
生体プローブおよびその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6403674B2 JP6403674B2 JP2015535113A JP2015535113A JP6403674B2 JP 6403674 B2 JP6403674 B2 JP 6403674B2 JP 2015535113 A JP2015535113 A JP 2015535113A JP 2015535113 A JP2015535113 A JP 2015535113A JP 6403674 B2 JP6403674 B2 JP 6403674B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleotide
- stranded
- region
- double
- probe
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6823—Release of bound markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
ヌクレオチド塩基配列:
(5’)GGCACGATGGXXAXXGCCCGCACTTCAGCGGGCAAYAACCATCGTGCCTGCAGGCTCGACCTTTATTCGCGGCACTTCAGCCGCGAATAAAGGTCGAGCCTGC(3’)
[XはQuasar 570(フルオロフォア)で標識されたT塩基であり、YはBHQ−2クエンチャで標識されたT塩基である]を有する103ヌクレオチド一本鎖オリゴヌクレオチド前駆体(例えばATDBio)を、その水溶液を95℃まで加熱した後、1℃当たり10分の割合で室温までゆっくり冷却することにより、第49ヌクレオチド塩基辺りで折り畳んだ。この時間の終わりに、第49ヌクレオチド塩基(ここではT)が一本鎖ヌクレオチド領域ならびにその両側にそれぞれ24および27ヌクレオチド塩基対長の2つの二本鎖オリゴヌクレオチドを備えた、本発明による末端がクローズドループであるプローブを形成した。
第49位のヌクレオチド塩基がG(実施例2)、C(実施例3)およびA(実施例4)となるように103ヌクレオチド前駆体を修飾したことを除き、実施例1の方法をさらに3回繰り返し、異なるヌクレオチド塩基について選択的な3つのさらなるプローブを作製した。これらの各実施例において用いたX塩基は、それぞれ、フルオレセイン(517nm)、テキサスレッド(612nm)およびシアニン−5(667nm)で標識されたT塩基である。
プローブ混合物を、等モル量の実施例1〜4の4つのプローブを水溶液中で室温で混合することにより、作製した。
実施例5の混合物を547ナノメートルレーザー光で調査し、光検出器を用いて蛍光度を570nmで測定した。その後、触媒量のクレノウ断片ポリメラーゼ(DNAポリメラーゼI(例えば大腸菌)およびサブチリシンから生成)および大腸菌DNAリガーゼとともに、関連A塩基を有する単一ヌクレオチドを備える水溶液を添加した(単一ヌクレオチドのプローブに対するモル比1:50)。1時間後、制限酵素Sbf1およびλエキソヌクレアーゼの水溶液を触媒量で添加する前に、蛍光を再度測定した。さらに1時間が経過した後、蛍光度を再度測定した。最初の2回において570nmで測定した蛍光は、最後に測定したものの99%未満であることがわかる。
Claims (22)
- 末端が2つの異なるクローズドループの二本鎖オリゴヌクレオチド領域に結合した、単一ヌクレオチド標的に相補的なヌクレオチドからなる一本鎖ヌクレオチド領域を備える単一ヌクレオチド標的捕捉部位を備えることを特徴とする生体プローブであって、
2つの前記二本鎖オリゴヌクレオチド領域の少なくとも1つは、特徴的な検出特性を有する検出可能要素とクエンチャとを備え、
前記検出可能要素は、複数のフルオロフォアを備え、
前記単一ヌクレオチド標的は、遊離した単一ヌクレオチドであり、
前記フルオロフォア及び前記クエンチャは、前記フルオロフォアが前記クエンチャによりクエンチングされるように、前記二本鎖オリゴヌクレオチド領域の少なくとも1つにおける一部分に存在し、
前記単一ヌクレオチド標的を前記一本鎖ヌクレオチド領域に結合させることにより、前記プローブ中に少なくとも1つの制限酵素認識部位がもたらされる、生体プローブ。 - 前記プローブは、前記フルオロフォアが検出される波長において本質的に非蛍光性であることを特徴とする、請求項1に記載の生体プローブ。
- 2つの前記二本鎖オリゴヌクレオチド領域が、前記一本鎖ヌクレオチド領域によって互いに接続され、前記複数のフルオロフォアが、互いに近接している、ことを特徴とする、請求項2に記載の生体プローブ。
- 前記クエンチャが、前記フルオロフォアに近接している、ことを特徴とする、請求項2または請求項3に記載の生体プローブ。
- 前記単一ヌクレオチドが、チミン、グアニン、シトシン、アデニンおよびウラシルの1つから選択されるヌクレオチド塩基からなることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の生体プローブ。
- 各二本鎖オリゴヌクレオチド領域が、最大で50のヌクレオチド対からなることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の生体プローブ。
- 各二本鎖オリゴヌクレオチド領域が、10〜30のヌクレオチド対からなることを特徴とする、請求項6に記載の生体プローブ。
- 二本鎖オリゴヌクレオチド領域における最大で10のヌクレオチド対が、フルオロフォアで標識されることを特徴とする、請求項6または請求項7のいずれかに記載の生体プローブ。
- 二本鎖オリゴヌクレオチド領域における最大で10のヌクレオチド対が、クエンチャで標識されることを特徴とする、請求項2〜8のいずれか1項に記載の生体プローブ。
- 前記二本鎖オリゴヌクレオチド領域が、末端を折り畳み、前記一本鎖ヌクレオチド領域を備えるギャップを残すことにより、一本鎖オリゴヌクレオチド前駆体から誘導されることを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項に記載の生体プローブ。
- 前記クエンチャが、全ての前記フルオロフォアが自己クエンチングできるように配置されるフルオロフォアを備える、ことを特徴とする、請求項1〜10のいずれか1項に記載の生体プローブ。
- 基質上に支持されることを特徴とする、請求項1〜11のいずれか1項に記載の生体プローブ。
- ポリメラーゼおよびリガーゼを用いて単一ヌクレオチドの標的をプローブの一本鎖ヌクレオチド領域に結合させて、全体として二本鎖である使用済プローブをもたらすステップを備えることを特徴とする、単一ヌクレオチドの標的を検出するための請求項1〜12のいずれか1項に記載の生体プローブの使用方法。
- 前記使用済プローブを、制限酵素およびエキソヌクレアーゼで処理して、検出可能要素を検出することができる形態に解放する追加ステップを備えることを特徴とする、請求項13に記載の方法。
- 前記解放された検出可能要素により示される検出可能特性を観察するステップを備えることを特徴とする、請求項14に記載の方法。
- 前記検出可能要素が、フルオロフォアであることを特徴とする、請求項13〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記使用済プローブが、前記一本鎖ヌクレオチド領域への前記標的の結合により形成された制限酵素認識部位を備えることを特徴とする、請求項13〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的が、単一ヌクレオチドであり、これを、(1)グアニン、シトシン、アデニンおよびチミンまたは(2)グアニン、シトシン、アデニンおよびウラシルから選択される異なる単一ヌクレオチドを備える一本鎖ヌクレオチド領域をそれぞれ有する4つの異なる生体プローブの混合物と接触させることを特徴とする、請求項13〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記4つのプローブのそれぞれが、異なる検出可能要素を有することを特徴とする、請求項18に記載の方法。
- 前記異なる検出可能要素が、フルオロフォアであることを特徴とする、請求項19に記載の方法。
- 前記標的が、DNAまたはRNAの試料中のヌクレオチドの配列に対応する一連の単一ヌクレオチドを備えることを特徴とする、請求項18〜20のいずれか1項に記載の方法。
- (1)ヌクレオチドホスホラミダイトモノマーから一本鎖オリゴヌクレオチド前駆体を合成するステップ、および(2)前記前駆体の末端を折り畳み、一本鎖ヌクレオチド領域の両側に並置する2つの二本鎖オリゴヌクレオチド領域をもたらすステップを備えることを特徴とする、請求項1に記載の生体プローブの作製方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB1217770.5 | 2012-10-04 | ||
GBGB1217770.5A GB201217770D0 (en) | 2012-10-04 | 2012-10-04 | Biological probes and the use thereof |
PCT/GB2013/052594 WO2014053853A1 (en) | 2012-10-04 | 2013-10-04 | Biological probes and the use thereof |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2015532098A JP2015532098A (ja) | 2015-11-09 |
JP6403674B2 true JP6403674B2 (ja) | 2018-10-10 |
Family
ID=47225675
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015535113A Expired - Fee Related JP6403674B2 (ja) | 2012-10-04 | 2013-10-04 | 生体プローブおよびその使用 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20150275293A1 (ja) |
EP (1) | EP2904114B1 (ja) |
JP (1) | JP6403674B2 (ja) |
KR (1) | KR20150060987A (ja) |
CN (1) | CN104884635B (ja) |
CA (1) | CA2887320A1 (ja) |
DK (1) | DK2904114T3 (ja) |
ES (1) | ES2613863T3 (ja) |
GB (1) | GB201217770D0 (ja) |
WO (1) | WO2014053853A1 (ja) |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB201217772D0 (en) * | 2012-10-04 | 2012-11-14 | Base4 Innovation Ltd | Sequencing method |
EP3149195B1 (en) * | 2014-06-02 | 2018-12-05 | Base4 Innovation Ltd | Nucleotide polymorphism detection method |
GB201412977D0 (en) * | 2014-07-22 | 2014-09-03 | Base4 Innovation Ltd | Single nucleotide detection method |
GB201501012D0 (en) * | 2015-01-21 | 2015-03-04 | Base4 Innovation Ltd | Improved droplet sequencing apparatus and method |
EP3115109A1 (en) | 2015-07-06 | 2017-01-11 | Base4 Innovation Limited | Droplet sequencing device |
EP3207982A1 (en) | 2016-02-17 | 2017-08-23 | Base4 Innovation Limited | Improved droplet sequencing apparatus and method |
EP3211092B1 (en) | 2016-02-24 | 2019-03-27 | Base4 Innovation Ltd | Single nucleotide detection method |
EP3269444A1 (en) | 2016-07-14 | 2018-01-17 | Base4 Innovation Ltd | Method of identifying droplets in a stack and an associated sequencer |
US20190226014A1 (en) * | 2016-09-02 | 2019-07-25 | Base4 Innovation Limited | Single nucleotide detection method and associated probes |
CN109790573A (zh) * | 2016-09-06 | 2019-05-21 | 贝斯4创新公司 | 单核苷酸检测方法及相关的探针 |
EP3516073A1 (en) | 2016-09-20 | 2019-07-31 | Base4 Innovation Limited | Single nucleotide detection method and associated probes |
US11920192B2 (en) | 2017-05-15 | 2024-03-05 | Lightcast Discovery Ltd | Single nucleotide detection method and associated probes |
WO2018234448A1 (en) | 2017-06-21 | 2018-12-27 | Base4 Innovation Limited | METHOD FOR SEARCHING MOLECULES SUCH AS NUCLEIC ACIDS |
AU2018288533B2 (en) | 2017-06-21 | 2023-07-13 | Lightcast Discovery Ltd | Microfluidic analytical device |
US20210213453A1 (en) | 2018-05-18 | 2021-07-15 | Lightcast Discovery Ltd. | Droplet manipulation device and method |
WO2019243577A1 (en) | 2018-06-21 | 2019-12-26 | Base4 Innovation Limited | Sequencing method using modified nucleoside polyphosphates |
Family Cites Families (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5268266A (en) * | 1984-05-07 | 1993-12-07 | Genetics Institute, Inc. | Process and nucleic acid construct for producing reagent complexes useful in determining target nucleotide sequences |
GB9210177D0 (en) * | 1992-05-12 | 1992-06-24 | Cemu Bioteknik Ab | Loop structures |
US5925517A (en) * | 1993-11-12 | 1999-07-20 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits |
CN1123328A (zh) * | 1994-11-17 | 1996-05-29 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 高温、高传真脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶(HiFi Bst) |
AU5305296A (en) * | 1995-03-07 | 1996-09-23 | Biomolecular Assays, Inc. | Pressure cycling reactor |
US20060063193A1 (en) | 1995-04-11 | 2006-03-23 | Dong-Jing Fu | Solid phase sequencing of double-stranded nucleic acids |
US6803188B1 (en) * | 1996-01-31 | 2004-10-12 | The Regents Of The University Of California | Tandem fluorescent protein constructs |
WO2001094625A2 (en) * | 2000-06-06 | 2001-12-13 | Tm Bioscience Corporation | Capture moieties for nucleic acids and uses thereof |
US6596490B2 (en) | 2000-07-14 | 2003-07-22 | Applied Gene Technologies, Inc. | Nucleic acid hairpin probes and uses thereof |
US6982165B2 (en) * | 2001-09-24 | 2006-01-03 | Intel Corporation | Nucleic acid sequencing by raman monitoring of molecular deconstruction |
WO2003048378A2 (en) * | 2001-12-04 | 2003-06-12 | Euregen Llc | Methods and compositions for selectively cleaving dna containing duplex acids in a complex nucleic acid mixture |
CN1488763A (zh) * | 2002-10-09 | 2004-04-14 | 英科新创(厦门)科技有限公司 | 改良的分子信标探针及其应用 |
WO2005012571A1 (ja) | 2003-07-30 | 2005-02-10 | The Circle For The Promotion Of Science And Engineering | 部分二重鎖型核酸分子 |
DK1836302T3 (da) | 2004-12-23 | 2010-08-02 | Ge Healthcare Bio Sciences | Ligeringsbaseret RNA-amplifikation |
US20070015176A1 (en) * | 2005-02-18 | 2007-01-18 | Applera Corporation | Small nucleic acid detection probes and uses thereof |
EP2274449B1 (en) | 2008-03-28 | 2015-12-23 | Pacific Biosciences of California, Inc. | Methods for nucleic acid sequencing |
US8211644B2 (en) | 2008-07-13 | 2012-07-03 | Ribomed Biotechnologies, Inc. | Molecular beacon-based methods for detection of targets using abscription |
EP2300617B1 (en) * | 2008-07-16 | 2016-03-23 | Monsanto Technology LLC | Methods and vectors for producing transgenic plants |
WO2011063388A2 (en) * | 2009-11-23 | 2011-05-26 | Becton, Dickinson And Company | Assay method for target nucleic acid by signal amplification using probe hybridization and restriction |
US9828628B2 (en) * | 2010-11-24 | 2017-11-28 | The Regents Of The University Of California | Nucleotide-based probes and methods for the detection and quantification of macromolecules and other analytes |
GB201217772D0 (en) * | 2012-10-04 | 2012-11-14 | Base4 Innovation Ltd | Sequencing method |
-
2012
- 2012-10-04 GB GBGB1217770.5A patent/GB201217770D0/en not_active Ceased
-
2013
- 2013-10-04 US US14/433,416 patent/US20150275293A1/en not_active Abandoned
- 2013-10-04 JP JP2015535113A patent/JP6403674B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2013-10-04 ES ES13798365.6T patent/ES2613863T3/es active Active
- 2013-10-04 DK DK13798365.6T patent/DK2904114T3/en active
- 2013-10-04 WO PCT/GB2013/052594 patent/WO2014053853A1/en active Application Filing
- 2013-10-04 KR KR1020157011616A patent/KR20150060987A/ko not_active Application Discontinuation
- 2013-10-04 EP EP13798365.6A patent/EP2904114B1/en not_active Not-in-force
- 2013-10-04 CN CN201380062825.XA patent/CN104884635B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2013-10-04 CA CA2887320A patent/CA2887320A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2904114A1 (en) | 2015-08-12 |
CN104884635B (zh) | 2017-08-25 |
WO2014053853A1 (en) | 2014-04-10 |
GB201217770D0 (en) | 2012-11-14 |
KR20150060987A (ko) | 2015-06-03 |
ES2613863T3 (es) | 2017-05-26 |
JP2015532098A (ja) | 2015-11-09 |
CA2887320A1 (en) | 2014-04-10 |
DK2904114T3 (en) | 2017-03-13 |
US20150275293A1 (en) | 2015-10-01 |
CN104884635A (zh) | 2015-09-02 |
EP2904114B1 (en) | 2016-11-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6403674B2 (ja) | 生体プローブおよびその使用 | |
JP6396299B2 (ja) | 配列決定方法 | |
JP6343659B2 (ja) | マイクロ流体核酸配列決定装置及びその使用 | |
JP6381659B2 (ja) | メチル化検出方法 | |
CN109562376A (zh) | 一种基于荧光能量转移的单分子/集群dna合成测序 | |
CA2955967A1 (en) | Multifunctional oligonucleotides | |
JP2019511915A (ja) | 単一ヌクレオチドの検出方法 | |
JP6442534B2 (ja) | ヌクレオチド多型の検出方法 | |
US10000802B2 (en) | Sequencing method | |
CN109477139A (zh) | 使用长ssDNA多核苷酸作为PCR测定中的引物的方法 | |
JP2019532632A (ja) | 単一ヌクレオチド検出方法および関連プローブ | |
JP7230039B2 (ja) | 単一ヌクレオチド分析方法及び関連するプローブ |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160819 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20170623 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170704 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170823 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180109 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180308 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20180904 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20180911 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6403674 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |