CN104884635B - 生物探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了生物探针，其特征在于包含末端连接两个不同寡核苷酸区的单链核苷酸区其中寡核苷酸区中至少一个包含具有特征性检测特性的可检测元件且其中可检测元件被布置在寡核苷酸区上以致可检测特性的可检测性低于当相同数量的可检测元件结合到相应数量的单个核苷酸时。该生物探针尤其可用于捕获单个核苷酸或单链核苷酸以产生可由限制酶和外切核酸酶降解的占用探针从而产生携带可检测形式的可检测元件的单个核苷酸。典型地可检测元件是荧光团且通过如使用多个相邻的荧光团或荧光团和与其连接的猝灭剂的混合物使探针中相应的特征性荧光不可检测。优选地单链核苷酸区由单个核苷酸组成，其关联的核苷酸碱基是DNA或RNA中发现的特征性核苷酸碱基之一。

Description

生物探针及其应用

本发明涉及可用于检测含有多核苷酸的靶标分子中互补性单核苷酸或核苷酸序列的存在的生物探针。

在分析分子生物学中广泛应用典型地包含长度少于1000个核苷酸的已知序列顺序的单链寡核苷酸的生物探针。当在探针与靶标的核苷酸碱基之间存在完全的或基本上完全的序列互补性时，所述探针典型地通过将其连接到靶标(例如，来源于天然存在的病原体的DNA的靶标)来起作用。典型地，所述探针的核苷酸标记有可检测元件，如放射性或荧光标记物，以使当所述探针用于处理分析物溶液或底物(据信其中或其上已经捕获了靶标)时，通过寻找并检测所述检测元件的特征性检测特性来揭示所述靶标的存在与否。

一类这样的探针由本领域中被称为‘分子指示标(molecular beacons)’的物质所代表；例如，如在WO02/06531或US 8211644中所述。这些探针由单链寡核苷酸组成，所述单链寡核苷酸实际上回折于其自身上从而产生充当探针的传感器的残余的单链环和短的茎，在所述茎中，邻近两个末端的核苷酸通过互补核苷酸碱基配对彼此结合；由此产生双链的区域。这种布置是高度紧张的，所述布置可以连接到发夹，在所述发夹中，单链环连接到名义上的双链寡核苷酸(即，所述茎)的同一末端的互补链。所述寡核苷酸的游离的3’和5’端(现在彼此邻近并且在茎的远端)分别连接荧光团和猝灭剂。其彼此接近确保了不产生显著的荧光。使用时，靶标与单链环结合，产生额外的应变，所述应变然后使得所述茎解链，由此使所述荧光团和猝灭剂远离，并且允许前者发出荧光。这些探针的一个缺点是所述环需要相对长，例如，20-30个核苷酸，这使得其不适合检测较小的靶标，并且尤其是不适合检测包含单个核苷酸的那些靶标。

US 2006/063193描述了一种检测方法，所述方法包括使未知的单链分析物与各自具有不同序列的不同探针类型的阵列接触；使所述分析物与其互补探针杂交，并且通过对杂交的探针进行质谱法确定序列。然而，与本发明的方法不同的这种方法尤其不适于鉴定单个核苷酸或小的寡核苷酸片段。

EP 1662006教导了DNA探针，所述DNA探针来源于两种不同长度的互补寡核苷酸链，其中较长的那个被设计为单链靶标的序列互补物。在其未使用的状态，所述探针由此包含双链区和单链区，所述单链区可以识别靶标并且通过杂交与靶标部分连接。然后，探针中的两条链中较短的那个和靶标序列的其余部分可以交换，这能够允许所述分析物与所述探针完全杂交。在一个实施方案中，探针的两条链上相应的核苷酸用成对的荧光团和猝灭剂功能化，使得未使用的探针不发出荧光。然而，当较短的链被靶标的其余部分交换掉时，所述荧光团被释放出来发出荧光。

WO 2006/071776描述了一种基于连接的RNA扩增方法，其包括使用包含双链区和单链3’端区域的核酸。在这种方法中，RNA的5’端连接到单链区，并且3’端连接到双链区的5’链。然后，可以利用已知的技术扩增RNA。然而，所述核酸没有表现为标记有可检测元件。

WO 2009/120372教导了一种方法，其中未知序列的双链寡核苷酸先通过首先将第一和第二发夹单链区与其末端连接而转化成模板核酸。然后，这样产生的模板可以用于利用涉及引发发夹的常规聚合酶介导的测序方法在正义和反义方向上同时对双链寡核苷酸进行测序；分离双链寡核苷酸的组成链：并且沿着所分离的链延伸引物。然而，模板中的核苷酸似乎无一被可检测元件标记。

现在我们开发了替代的生物探针，其中可检测元件基本上是不可检测的，除非将其通过一系列生化/酶反应特异性激活，所述反应从所述探针释放一个或一级联的处于更容易检测状态的可检测元件。这样的生物探针可用于靶标浓度非常低的情形，并且尤其可用于这样的情形，其中靶标包含一串单核苷酸，其关联的核苷酸碱基顺序对应于需要确定序列的未知生物分子的顺序。这使得可能在高通量DNA测序装置中使用本发明的探针。

因此，根据本发明，在本发明的第一方面提供一种生物探针，其特征在于，其包含单链核苷酸区，所述单链核苷酸区的末端分别连接两个不同的双链寡核苷酸区，其中所述寡核苷酸区中的至少一个包含具有特征性检测特性的可检测元件，并且其中所述可检测元件被这样布置在所述寡核苷酸区上以致所述可检测特性的可检测性比在相同数量的可检测元件结合到相应数量的单个核苷酸时低。

在一个优选的实施方案中，所述可检测元件包含荧光团，并且所述探针本身在用于检测所述荧光团的那些波长基本上不发荧光。因此，尽管荧光团可能在电磁谱的大部分表现出普遍的、低水平的背景荧光，但是典型地将存在一个或少量的特定波长或波长范围(wavelength envelopes)其中荧光的强度处于最大值。在特征性检测所述荧光团的这些最大值中的一个或多个，基本上不应当产生荧光。在本发明的情形中，术语‘基本上不发荧光’或等价的词语意指与探针相连的全部荧光团在相关特征波长或波长范围的荧光强度不到等量的游离荧光团的相应的荧光强度的25％；优选不到10％；更优选不到1％，并且最优选不到0.1％。

原则上，可以使用任何方法确保在探针的未使用状态，所述荧光团发出的荧光不如当其各自结合到其本身的单个核苷酸上时。一种方法是另外地将猝灭剂与其紧邻地相连。另一种方法是基于这样的观察：当多个荧光团彼此紧邻地连接到同一个探针上时，它们倾向于彼此充分猝灭，使得可以在不需要猝灭剂的条件下实现前段所述的标准。在本专利的这种情形中，构成荧光团之间或荧光团与猝灭剂之间的‘紧邻’的因素取决于所用的特定的荧光团和猝灭剂，并且可能取决于寡核苷酸区的结构特征。由此，意欲根据所需的结果解释该术语，而不将其解释为在探针上的任何特定的结构布置。然而，并且为了提供示例的目的，要指出的是，当邻近的荧光团或邻近的荧光团与猝灭剂相隔以一段距离，并且所述距离对应于其特征性距离(典型地小于5nm)时，将获得充分的猝灭。

优选地，包含探针的寡核苷酸区中的至少一个用多至20个、优选多至10个、并且最优选多至5个荧光团标记。为了获得的最大的优点，优选的是，至少一个寡核苷酸区用至少2个、优选至少3个荧光团标记。因此，本文特别预期由这些最大值与最小值的任意置换构建的范围。如果使用猝灭剂，类似地，优选的是，所述探针用多至20个、优选多至10个、并且最优选多至5个猝灭剂标记。尽管预期可以将超过一种类型的荧光团与探针连接，以便例如给予其特征性指纹，但是，优选的是，与给定探针连接的所有探针都是相同类型的。优选地，所述荧光团和猝灭剂在所述寡核苷酸区的不同链上或者彼此相对(在其通过折叠单链寡核苷酸前体产生的情况下)。

关于荧光团本身，它们原则上可以选自任意本领域中常规使用的那些，包括但不限于呫吨部分，例如，荧光素，罗丹明及其衍生物，如荧光素异硫氰酸酯，罗丹明B等；香豆素部分(例如，羟基-、甲基-和氨基香豆素)和青色素部分如Cy2，Cy3，Cy5和Cy7。具体的实例包括来源于下述常用染料的荧光团：Alexa染料，花青染料，Atto Tec染料，和罗丹明染料。实例还包括：Atto 633(ATTO-TEC GmbH)，Texas Red，Atto 740(ATTO-TEC GmbH)，RoseBengal，Alexa Fluor^TM 750C₅-马来酰亚胺(Invitrogen)，Alexa Fluor^TM 532C₂-马来酰亚胺(Invitrogen)和Rhodamine Red C₂-马来酰亚胺和Rhodamine Green以及亚磷酰胺(phosphoramadite)染料如Quasar 570。备选地，可以使用量子点或近红外线染料如由LI-COR Biosciences所供应的那些。典型地使用本领域中已知的化学方法经由核苷酸碱基将荧光团与寡核苷酸连接。

合适的猝灭剂是通过共振能量转移(FRET)机制起作用的那些。可以结合上述荧光团使用的可商购的猝灭剂的非限制性实例包括但不限于DDQ-1，Dabcyl，Eclipse，Iowa Black FQ和RQ，IR Dye–QC1，BHQ-1，-2和-3和QSY-7和-21。

来看探针的单链核苷酸区，这可以是多至1000个核苷酸，优选地多至300个核苷酸长，并且通过化学合成从头开始产生或来源于天然存在的来源如细菌DNA。在本发明的一个有利的实施方案中，所述核苷酸区的长度适当地为多至100个核苷酸，优选地多至50个核苷酸，并且更优选地多至30个核苷酸。在另一个中，所述单链区仅由一个核苷酸组成，使得所述探针对于具有互补核苷酸碱基的游离核苷酸的检测极具有选择性。在来源于天然存在的DNA或RNA的靶标的情况中，这使得可能使用包含多至四种不同的根据本发明的生物探针的多组分生物探针混合物，所述不同的根据本发明的生物探针各自具有针对靶标特有的一种不同的核苷酸碱基(即，对于DNA，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和胸腺嘧啶中的一种，或对于RNA，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶中的一种)的选择性，并且各自使用不同的可检测元件；特别地，在不同的特征波长或波长范围发荧光的不同的荧光团。

来看双链寡核苷酸区，优选地，它们来源于或者可来源于两个寡核苷酸前体，其各自优选地在远离单链核苷酸区的末端处为闭环，或来源于常见的单链寡核苷酸前体，通过将后者的两个末端回折于其自身上产生两个闭环寡核苷酸区，其中中间的缺口构成单链核苷酸区。在所有情形中，作用是相同的；邻近单链核苷酸区的末端的将是寡核苷酸区的另一条链上的3’和5’游离端，靶标的相应的5’和3’端可以与所述游离端连接。由此，使用所述探针包括这样的过程：通过连接到所述3’和5’端使单链核苷酸区连接到具有互补核苷酸碱基序列的靶标，从而产生沿着其全长都是双链的占用的探针。

当生物探针由两个不连续的双链寡核苷酸组成时，优选地，远离所述核苷酸区的每个末端是闭环。适当地，所述寡核苷酸区的长度多至50个核苷酸对，优选多至45个核苷酸对，更优选在5-40个核苷酸对的范围内，并且最优选在10-30个核苷酸的范围内。可以使用更长的寡核苷酸区，但是，接近所述核苷酸区可能变得受限(通过与其缠绕)的潜在风险使得该实施方案的吸引力减少。

优选地，与寡核苷酸区结合的可检测元件位于远离所述核苷酸区处。当使用两个不连续的寡核苷酸区时，优选地，所述可检测元件位于或簇集于其远离所述核苷酸区的末端中的一个或两者处或朝向其。在一个优选的实施方案中，至少一个寡核苷酸区包含限制酶识别位点，所述识别位点优选地邻近所述可检测元件所位于或簇集的区域。这样的限制酶识别位点典型地包含2-8个核苷酸对的特定序列。在本发明另一个优选的实施方案中，限制酶识别位点通过靶标与核苷酸区的结合产生。

本发明的生物探针原则上可以通过本领域已知的任何核苷酸组装方法制备，包括H-膦酸酯法，磷酸二酯合成，磷酸三酯合成和亚磷酸三酯合成。优选的是使用核苷酸亚磷酰胺结构单元的方法，所述方法是基于所述结构单元的活性。在这些方法中，通过在包括去封闭、偶联、封端和氧化的循环的四步法中在5’位置向生长的核苷酸链顺序添加所选的核苷酸亚磷酰胺而发生合成。该方法的循环性质使其特别适于自动化，并且用于进行该方法的机器可以在市场上容易地得到。当要引入猝灭剂和/或荧光团时，在需要的点处使用适当标记的核苷酸亚磷酰胺。在最优选的实施方案中，利用亚磷酰胺法制备单链寡核苷酸前体，所述前体通过快速加热和缓慢冷却的循环折叠成具有所需的特征的探针。

所述探针典型地在溶液中使用，但是，如果需要，可以有利地固定在基底如聚合物、膜、芯片阵列等上或固定在纳米孔或纳米通道中。

在本发明的第二方面，提供使用所述生物探针检测靶标的方法，所述方法特征在于包括下述步骤：(a)将靶标连接到上述类型的生物探针的单链核苷酸区，以产生完全是双链的占用的探针。典型地，借助聚合酶和连接酶使该步骤(a)发生，所述聚合酶使所述靶标的5’端与所述寡核苷酸的3’端结合，所述连接酶将所述靶标和所述寡核苷酸或其他寡核苷酸的剩余的游离末端连接在一起。可以使用多种聚合酶和连接酶，其包括但不限于来源于容易得到的细菌来源的那些，如噬菌体T4，大肠杆菌(Escherichia Coli)和水生栖热菌(Thermus Aquaticus)(Taq)。优选地，步骤(a)在过量探针存在下在水性介质中进行，适当地，靶标与探针的摩尔比在1:1-1:2000，优选1:1-1:200，更优选1:2-1:50的范围内，最优选是在1:5-1:20的范围内。适当地，所述靶标是单个核苷酸或单链寡核苷酸，其具有与生物探针上的核苷酸区的核苷酸碱基或核苷酸碱基序列互补的核苷酸碱基或核苷酸碱基序列。最优选地，所述靶标是天然存在的DNA或RNA特有的单核苷酸。当反应介质稀时，适当地使用相对于所述靶标化学计量过量的两种酶中的每一种。

优选地，本发明的方法还包括步骤(b)：用限制酶(限制性内切核酸酶)和外切核酸酶处理步骤(a)中得到的占用的探针，从而从其中释放可检测元件，并且所述可检测元件处于可以被检测到的形式。然后，在步骤(c)中，通过观察与这样被释放的可检测元件相关的可检测特性来检测所述可检测元件。因此，当探针中的可检测元件是相对不发荧光的荧光团时，步骤(b)以允许其最佳发出荧光的形式释放它们。然后，可以用常规技术检测并测量该荧光，以提供可以用于分析目的的输出数据组或数据流。在步骤(b)中，这种荧光团的释放首先由限制酶引起，所述限制酶在上文提及的限制酶识别位点处在所述占用的探针中进行双链切割。然后，这样产生的短片段被外切核酸酶进一步降解成单核苷酸，所述单核苷酸中的至少一些是用荧光团标记的。当所述探针包含多个荧光团时，这产生释放的荧光团的级联，所述释放的荧光团由于它们现在彼此分离或者与它们的关联的猝灭剂分离，所以现在以正常方式自由地发出荧光。优选地，在(c)中，通过调节到所述荧光团的特征荧光波长或波长范围的光检测器或等效装置来检测所述荧光。这又使得所述光检测器产生可以正常方式处理和分析的电信号。典型地，步骤(b)也在水性介质中进行，所述水性介质具有过量的酶。为了避免降解未使用的生物探针，优选地，所述限制酶识别位点是通过将所述靶标添加到单链核苷酸区形成的，或备选地，对限制酶进行选择，以使其不与其中含有切口的双链寡核苷酸反应。因此，如果要使探针有最佳表现，则在考虑限制酶位点的特征的情况下对限制酶进行选择，并且所述限制酶尤其是这样的限制酶，其表现出针对所述位点的高保真性。适当的外切核酸酶包括DNA酶I(不含RNA酶)，外切核酸酶I或III(ex E.Coli)，外切核酸酶T，外切核酸酶V(RecBCD)，λ外切核酸酶，微球菌核酸酶(Micrococcal Nuclease)，绿豆核酸酶(Mung Bean Nuclease)，核酸酶BAL-31RecJ_f T5外切核酸酶和T7外切核酸酶。

所述方法的一个优选的应用是在所述靶标是单个核苷酸并且其与四种不同的生物探针的混合物接触的情况下，其中所述四种不同的生物探针各自具有包含不同的单核苷酸的单链核苷酸区，所述不同的单核苷酸选自其关联的核苷酸碱基包含以下的那些：(1)鸟嘌呤，胞嘧啶，腺嘌呤和胸腺嘧啶，或(2)鸟嘌呤，胞嘧啶，腺嘌呤和尿嘧啶。然而，如果需要，可以使用与其他核苷酸碱基(例如，组成其他合成的多核苷酸的那些)相对应的其他核苷酸。在所有情形中，优选地，各探针具有不同的关联的可检测元件，优选不同的荧光团。在最优选的实施方案中，所述靶标包含一串单核苷酸，其顺序与序列未知或仅部分已知的DNA或RNA样品中的核苷酸的序列相对应。通过这样的方式，所述方法可以为DNA或RNA测序装置的设计和操作提供基础。

现在，将通过下述实施例和附图举例说明本发明。

实施例1

具有下述核苷酸碱基序列的103个核苷酸的单链寡核苷酸前体(ex.ATDBio)：

(5')GGCACGATGGXXAXXGCCCGCACTTCAGCGGGCAAYAACCATCGTGCCTGCAGGCTCGACCTTTATTCGCGGCACTTCAGCCGCGAATAAAGGTCGAGCCTGC(3')

其中X是用Quasar 570(荧光团)标记的T碱基，并且其中Y是用BHQ-2猝灭剂标记的T碱基，所述前体通过将其水溶液加热至95℃然后以10分钟/℃的速率缓慢冷却回到室温而围绕第49个核苷酸碱基折叠。在此时间的末尾，形成根据本发明的闭环末端探针，其中第49个核苷酸碱基(此处为T)构成单链核苷酸区，并且长度分别为24和27个核苷酸碱基对的两个双链寡核苷酸在其侧面。

实施例2-4

将实施例1的方法再重复三次，不同之处在于，对所述103个核苷酸的前体进行改变，以使第49位的核苷酸碱基是G(实施例2)，C(实施例3)和A(实施例4)，以产生另外三种对不同的核苷酸碱基有选择性的探针。在这些实施例中的每一个中使用的X碱基是分别用以下各项标记的T碱基：Fluorescein(517nm)，Texas Red(612nm)和青色素-5(667nm)。

实施例5

通过将等摩尔量的实施例1-4的四种探针在室温混合在水溶液中而产生探针混合物。

实施例6

将实施例5的混合物用547纳米激光激发(interrogated)，并且使用光检测器在570nm测量荧光程度。然后，加入包含具有关联的A碱基的单核苷酸的水溶液(单核苷酸与探针的摩尔比是1:50)以及催化量的Klenow片段聚合酶(由DNA聚合酶I(ex.E.Coli)和枯草杆菌蛋白酶产生)和大肠杆菌(E.coli)DNA连接酶。一小时后，再次测量荧光，之后加入催化量的限制酶Sbf1与λ外切核酸酶的水溶液。再经过一小时后，再次测量荧光程度。发现在前两种情况下在570nm测量的荧光比在最后一种情况下测量的荧光小99％。

图1使用凝胶层析数据来举例说明核苷酸-捕获步骤的作用。泳道A显示从上述类型的占用的探针的样品得到的结果。泳道B显示在加入相关的核酸(dNTP形式)、聚合酶和连接酶后来自相似样品的结果。可以看到存在第二条带，其指示完整的探针的存在。

图2使用凝胶层析数据来举例说明限制性内切核酸酶在切割完整的探针时的作用。泳道A显示完整的探针，泳道B显示所述探针与所述限制酶接触一段时间后的状况。泳道B中多条条带的存在表明已经发生切割成两个片段的事实。

最后，图3用图显示在上述类型的切割的‘黑暗的(dark)’完整的探针经受进行的核酸外切降解从而以活性状态释放其组成荧光团后荧光随时间的发展。

Claims (9)

1.检测单核苷酸靶标的方法，其特征在于，其包含下述步骤：

(1)使用聚合酶和连接酶将所述靶标连接到探针，所述探针包含捕获位点，所述捕获位点由与所述靶标互补的单核苷酸组成，所述单核苷酸的末端连接两个不同的双链寡核苷酸区，其中所述寡核苷酸区中的至少一个包含具有特征性检测特性的可检测元件，并且其中所述可检测元件被布置在所述寡核苷酸区上以致所述检测特性的可检测性比在相同数量的可检测元件结合到相应数量的单个核苷酸时低，从而产生完全是双链的占用的探针，和

(2)用限制酶和外切核酸酶处理所述占用的探针，从而释放能够被检测的形式的可检测元件。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于，其还包括观察由所述释放的可检测元件表现出来的可检测特性。

3.权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，所述可检测元件是荧光团。

4.权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，所述占用的探针包含限制酶识别位点，所述限制酶识别位点通过将所述靶标连接到所述捕获位点形成。

5.权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，所述靶标与四种不同的生物探针的混合物接触，所述四种不同的生物探针各自具有单链核苷酸区，所述单链核苷酸区包含选自以下的不同的单个核苷酸：(1)鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和胸腺嘧啶或(2)鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶。

6.权利要求5所述的方法，其特征在于，所述四种探针中的每一种具有不同的可检测元件。

7.权利要求6所述的方法，其特征在于，所述不同的可检测元件是荧光团。

8.权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，所述靶标包含对应于DNA或RNA样品中的核苷酸的序列的一串单核苷酸。

9.前述权利要求中任一项所述的方法用于测序DNA或RNA的用途。