CN106133150B - 甲基化检测方法 - Google Patents

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Abstract

确定给定的单一核苷酸是被甲基化的还是未被甲基化的方法，其特征在于下述步骤：(a)使所述单一核苷酸与一种或多种杂交探针类型接触，每种所述杂交探针类型在其未使用形式包含：(1)连接一个或多个处于基本不可检测状态的第一可检测元件的第一寡核苷酸，并且所述第一寡核苷酸还包含：(i)双链和单链区，和(ii)连接在所述双链区邻近所述单链区的末端的耐受核酸外切降解的区域，和(2)连接一个或多个也处在基本不可检测状态的第二可检测元件的第二单链寡核苷酸，并且改变所述第二单链寡核苷酸为至少部分是所述第一寡核苷酸的单链区的核苷酸序列互补物；(b)对于引起(i)所述单一核苷酸与所述耐受核酸外切降解的区域和所述单链区结合，和(ii)所述第二寡核苷酸与所述单一核苷酸和所述单链核苷酸区结合，以产生基本上双链的使用的探针的相关的探针类型；(c1)将所述使用的探针用甲基化依赖性限制性内切核酸酶在如果所述单一核苷酸被甲基化，则所述使用的探针在邻近耐受核酸外切降解的区域处被切割成两个双链寡核苷酸产物的条件下处理，或者(c2)将所述使用的探针用甲基化敏感性限制性内切核酸酶在如果所述单一核苷酸未被甲基化，则所述使用的探针在邻近耐受核酸外切降解的区域处被切割成两个双链寡核苷酸产物的条件下处理；并且，然后(d1)将步骤(c1)的产物用外切核酸酶或展现出外切核酸酶活性的聚合酶处理，使得如果所述单一核苷酸被甲基化，则仅释放处于可检测状态的第一可检测元件或释放处于可检测状态的第一和第二可检测元件二者，或如果所述单一核苷酸未被甲基化，则仅释放第二可检测元件，或者，(d2)将步骤(c2)的产物用外切核酸酶或展现出外切核酸酶活性的聚合酶处理，使得如果所述单一核苷酸未被甲基化，则仅释放处于可检测状态的第一可检测元件或释放处于可检测状态的第一和第二可检测元件二者，或如果所述单一核苷酸被甲基化，则仅释放第二可检测元件。

Description

甲基化检测方法
本发明涉及一种用于确定来源于多核苷酸分析物的给定的核苷酸被甲基化还是没有被甲基化的方法。
遗传物质的下一代测序已经对总体生物学和医学产生巨大的影响，尤其是因为测序的单位成本随着越来越快的测序仪进入市场而直线下降。因此，在一种这样的仪器中，首先通过将双链DNA分析物分解为多个更小的多核苷酸片段而直接对双链DNA分析物测序，各个多核苷酸片段首先在一条链的两端被腺苷酸化，使得单链第一寡核苷酸可以通过与未配对的腺嘌呤碱基杂交结合于其互补物(compliment)的两端。然后将这样获得的处理的片段按大小进行选择并捕获到用结合的单链第二寡核苷酸包被的表面上，所述单链第二寡核苷酸自身是第一个的序列互补物，使得实质上，通过进一步杂交可以形成表面结合的双链片段的文库。在随后的聚类(clustering)步骤中，随后使用延伸和等温桥接反应将这些文库组分在表面上克隆扩增数百万次，以利用未使用的第二寡核苷酸。这实质上产生了通过其一条链结合于表面的稠密浓度的多核苷酸片段。然后除去各个片段的未结合的互补链，从而留下结合的单链片段供测序使用。在测序阶段，用引物引发(prime)这些单链片段中的每个并且通过使用聚合酶链式反应和双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTP)形式的DNA的四种特征核苷酸碱基的混合物进行延伸来再产生其互补链。各个ddNTP类型用在不同波长发荧光的不同荧光团标记的结构部分封端。然后延伸反应采用三步骤的循环形式；首先相关ddNTP结合到生长的链中；接下来通过照射样品并检测荧光的波长来鉴定其包含的核苷酸碱基，并且最后除去末端封端及其相关荧光团从而允许接下来的延伸事件发生。通过这种方式，互补链的序列可以逐个碱基地建立。将理解的是，虽然这种方法可以是高度自动化的并且可以产生高准确度的序列读取，但其运行速度受延伸循环速率的限制。因此，在实践中，该技术的使用倾向于包括平行处理相对短的多核苷酸片段和从由其获得的各种读取结果(reads)组装整个序列。这本身可能导致计算的复杂度并且可能引入错误。
最近，已经尝试开发备用的直接测序方法。例如，在我们之前的申请GB1217772.1(现在公布为WO2014/053854)、GB1306444.9(现在公布为WO2014/167323)和GB1306445.6(现在公布为WO2014/167324)中，我们已经记载了一种新的测序方法，其涉及多核苷酸分析物的进行性焦磷酸解作用或外切核酸降解作用(exonucleolysis)，以产生有序的单核苷酸流，该单核苷酸可以逐一被捕获入小滴流中的相应的小滴。然后，可以化学和/或酶操作每个小滴，以揭示其原始包含的具体的单一核苷酸。在一个实施方案中，这些化学和/或酶操作包括涉及使用一种或多种两个组分的寡核苷酸探针类型的方法，其中改变每个探针类型为能够选择性捕获组成所述分析物的单一核苷酸类型中的一种。典型地，在每个这样的探针类型中，两个寡核苷酸组分中的一个包含特征性荧光团，并且，在探针的未使用状态，这些荧光团发荧光的能力通过邻近放置的猝灭剂的存在或通过自猝灭而保持熄灭(extinguished)。在使用中，当探针已经捕获了其相应的单核苷酸时，其可以被限制性酶切割，使其对后续外切核酸降解作用敏感，由此从猝灭剂和/或彼此释放荧光团，使得它们自由发荧光。通过这种方式，可以通过分光镜方式间接地鉴定每个小滴中存在的原始单一核苷酸。
我们现在已经开发了这种方法的变化形式，具体地设计用来检测遗传物质中存在或不存在甲基化，并且适用于我们的小滴技术。理解例如在哺乳动物DNA样品中给定的包含胞嘧啶或腺嘌呤的核苷酸被甲基化还是没有被甲基化是极重要的医学问题，原因在于已知该现象是遗传物质转录中的重要调节器。例如，相对于标准物，高水平的甲基化已经与人们发展恶性肿瘤的倾向性相关。因此，知晓人基因组中甲基化的程度可以促进此类问题的早期鉴定和改善。由此，按照本发明的第一方面，提供一种确定给定的单一核苷酸是被甲基化还是没有被甲基化的方法，其特征在于下述步骤：(a)使所述单一核苷酸与一种或多种杂交探针类型接触，所述每种杂交探针类型在其未使用形式包含：(1)连接一个或多个处于基本不可检测状态的第一可检测元件的第一寡核苷酸，并且所述第一寡核苷酸还包含：(i)双链和单链区，和(ii)连接在双链区邻近单链区的末端的耐受核酸外切降解的区域，和(2)连接一个或多个也处在基本不可检测状态的第二可检测元件的第二单链寡核苷酸，并且改变所述第二单链寡核苷酸以至少部分是第一寡核苷酸的单链区的核苷酸序列互补物；(b)对于引起：(i)单一核苷酸与耐受核酸外切降解的区域和单链区结合，和(ii)第二寡核苷酸与单一核苷酸和单链核苷酸区结合，以产生基本上双链的使用的探针的相关的探针类型；(c1)将所述使用的探针用甲基化依赖性限制性内切核酸酶在如果所述单一核苷酸被甲基化，则所述使用的探针在邻近耐受核酸外切降解的区域处被切割成两个双链寡核苷酸产物的条件下处理，或者，(c2)将所述使用的探针用甲基化敏感性限制性内切核酸酶在如果所述单一核苷酸未被甲基化，则所述使用的探针在邻近耐受核酸外切降解的区域处被切割成两个双链寡核苷酸产物的条件下处理；并且然后，(d1)将步骤(c1)的产物用外切核酸酶或展现出外切核酸酶活性的聚合酶处理，使得如果所述单一核苷酸被甲基化，则仅释放处于可检测状态的第一可检测元件或释放处于可检测状态的第一和第二可检测元件二者，或如果所述单一核苷酸未被甲基化，则仅释放第二可检测元件，或者，(d2)将步骤(c2)的产物用外切核酸酶或展现出外切核酸酶活性的聚合酶处理，使得如果所述单一核苷酸未被甲基化，则仅释放处于可检测状态的第一可检测元件或释放处于可检测状态的第一和第二可检测元件二者，或如果所述单一核苷酸被甲基化，则仅释放第二可检测元件。
在本发明的一个实施方案中，通过例如焦磷酸解作用或核酸外切降解，由前体多核苷酸分析物产生待确定的单一核苷酸。此处和其他实施方案中使用的此类分析物可以适当地包含遗传物质的片段；例如，人或其他哺乳动物DNA或RNA的片段。适当地，该片段是多个核苷酸长；例如，大于500、1,000、5,000或甚至10,000个核苷酸长度。在另一个实施方案中，焦磷酸解作用或核酸外切降解进行性地进行，使得以流动系统产生与分析物的核苷酸序列相对应的单一核苷酸的流。在另一个实施方案中，在该流中的单一核苷酸逐一插入到小滴流中相对应的空小滴中，使得每个小滴包含不超过一个单一核苷酸。优选地，填充的小滴流中的所述单一核苷酸的顺序对应于分析物的核苷酸序列，并且本发明的方法通过在已经引入单一核苷酸之前或之后或同时向其中插入各种探针类型而在单个小滴上进行。适当地，小滴流包含油中的水滴流；优选地是例如，在上文引用的我们之前的申请中公开的油中的水微滴。
在本发明方法的步骤(a)中，将待确定的单一核苷酸与一种或多种探针类型接触。所用的每种探针类型由于碱基配对原则能够结合不同的单一核苷酸类型。由此，对于DNA，存在四种不同的单一核苷酸类型，它们对应核苷酸碱基鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)，它们以C-G和A-T的互补方式配对，对于RNA，存在四种类型，它们对应于鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶(U)，其中A和U配对。在一个实施方案中，在所述方法中使用与这些单一核苷酸类型中的一种相对应的一种探针类型；优选地，与胞嘧啶或腺嘌呤相对应。在另一个实施方案中，使用与上文提及的单一核苷酸类型中的任意两对相对应的两种探针类型。在另一个实施方案总，使用与这些单一核苷酸类型中的任意三联体相对应的三种类型。最后，另一个实施方案涉及使用所有四种探针类型。
在本发明的方法中所用的杂交探针本身在其未使用状态包括两种寡核苷酸组分。第一寡核苷酸是包含双链和单链区的一种寡核苷酸，并且其具有与其连接的一种或多种处于不可检测状态的第一可检测元件。在第一寡核苷酸的一种优选的种类中，这些双链和单链区可以来源于或视为来源于单链前体寡核苷酸，其3’端已部分回折并且通过互补核苷酸杂交与自身部分结合。基于其结构外观，这样得到有时称为‘j-型’的产物保留包含超过3’端‘j’的茎的单链区。
第一寡核苷酸进一步特征在于，包含连接在双链区邻近单链区的末端的耐受核酸外切降解的区域。在上文提及的j-型第一寡核苷酸的情形中，这位于3’端，并且通过修饰在该位置的最后的核苷酸、优选最后两个核苷酸之间的连接而得到，使得其包含耐受性结构部分，诸如硫代磷酸酯，而不是常规的磷酸二酯。由于这样的硫代磷酸酯键以两种异构形式存在，本发明的一个实施方案包括仅在第一寡核苷酸中使用两种中更耐受降解的那种。
依据本发明的第二方面，因此，提供杂交探针组分，其在其未使用状态耐受核酸外切降解，特征在于，其包含具有3’和5’端和单链和双链核苷酸区的j-型寡核苷酸，其中至少一些邻近3’端的核苷酸通过硫代磷酸酯键连接。在一个实施方案中，邻近3’端的两个核苷酸这样连接。在另一个实施方案中，j-型寡核苷酸具有与其连接的可检测元件(例如，荧光团)和任选地猝灭剂，以使所述荧光团不可检测。
第二寡核苷酸是单链的寡核苷酸，并且也具有与其连接的一种或多种同样处于不可检测状态的第二可检测元件。改变该第二寡核苷酸为至少部分是第一寡核苷酸的单链区的核苷酸序列互补物，由此使得二者能够在捕获所述单一核苷酸的过程中杂交在一起形成基本上双链的使用的探针。当与j-型第一寡核苷酸一起使用时，第二寡核苷酸有时称为‘i-型’的，并且，当将第二寡核苷酸的5’端从超出第一寡核苷酸的3’端两个核苷酸的点处比对时，发生在其与第一寡核苷酸的单链区之间的序列互补。该净效应(net effect)可以视为在第一寡核苷酸上留下单一未杂交的核苷酸洞(紧邻3’端)，其组成可以捕获单一核苷酸的位点。将理解，由于核苷酸碱基配对，洞中的该单一未杂交的核苷酸的性质将决定探针的选择性特性；例如，如果其包含鸟嘌呤碱基，则探针对包含胞嘧啶碱基的单一核苷酸有选择性；如果其是胸腺嘧啶，则探针对腺嘌呤等有选择性。
在一个实施方案中，第二寡核苷酸和第一寡核苷酸上的单链区独立地多至50个核苷酸长，优选多至45个核苷酸长，更优选在5-40个核苷酸的范围内，并且最优选在10-30个核苷酸的范围内。在另一个实施方案中，第二寡核苷酸短于第一寡核苷酸的单链区，使得在杂交后，后者的5’端伸出前者的3’端。这样形成的突出典型地为几个核苷酸长；例如，多至15个核苷酸长。
依据本发明的第三方面，因此，提供两组分杂交探针，所述探针在其未使用状态耐受核酸外切降解，特征在于，其包含：具有3’和5’端以及单链和双链核苷酸区的j-型第一寡核苷酸，其中邻近3’端的至少一些核苷酸通过硫代硫酸酯键连接，和第二单链寡核苷酸，当从超出3’端两个核苷酸的起点比对时，其核苷酸序列至少部分与第一寡核苷酸的单链核苷酸区的核苷酸序列互补。
关于分别连接到探针的第一和第二寡核苷酸组分上的第一和第二可检测元件，这些原理上可以是具有能够容易区分的不同的特征性检测特性的任意元件。适当地，所有第一可检测元件是相同的一种类型，并且所有第二可检测元件是另一种类型。第一和第二可检测元件连接到第一和第二寡核苷酸上，以在探针处于未使用状态时处于基本不可检测的状态。
在一个实施方案中，所述检测特性是荧光，并且第一和第二可检测元件包含在不同特征波长发荧光的不同的荧光团类型。当是这种情形时，第一和第二荧光团类型连接到第一和第二寡核苷酸上，以在设计它们以正常检测的那些波长基本上不发荧光。例如，尽管给定的荧光团可能在电磁辐射谱的大部分上表现出普遍的、低水平的背景荧光，但是典型地存在其中荧光强度处于最大值的一个或少数的特定波长或波长范围(wavelengthenvelopes)。在特征性检测所述荧光团的这些最大值中的一个或多个，基本上应当不产生荧光。在本发明的情形中，术语‘基本上不发荧光’或等价的词语意指连接到相关寡核苷酸的全部荧光团在相关特征性波长或波长范围的荧光强度小于等量的游离荧光团的相应的荧光强度的25％；优选小于10％；更优选小于1％，并且最优选小于0.1％。
原则上，可以使用任何方法确保在探针的未使用状态，所述第一和第二荧光团类型比其游离时发出的荧光少。一种方法是另外将对于第一和第二寡核苷酸中的每一个的猝灭剂紧密接近它们的荧光团连接。另一种方法是基于这样的观察：当多个荧光团彼此紧邻地连接到同一个寡核苷酸组分上时，它们倾向于彼此充分自猝灭，使得可以在不需要猝灭剂的条件下实现前段所述的标准。在本专利的这种情形中，什么构成荧光团之间或荧光团与猝灭剂之间的‘紧邻’将取决于所用的特定的荧光团和猝灭剂，并且可能取决于第一和第二寡核苷酸的结构特征。由此，意欲根据所需的结果解释该术语，而不是在寡核苷酸上的任意特定的结构布置。然而，并且仅是为了提供示例的目的，要指出的是，当邻近的荧光团或邻近的荧光团与猝灭剂由对应于多至它们的特征性距离(典型地小于5nm)的距离分开时，通常将实现充分的猝灭。
优选地，第一和第二寡核苷酸中的每一个用多至20个、优选多至10个并且最优选多至5个荧光团标记。为了获得的最大的优点，优选地，用至少2个、优选至少3个荧光团标记每个寡核苷酸。接着，本文特别设想由这些最大值和最小值的任意置换构建范围。如果使用猝灭剂，类似地，优选的是，一种寡核苷酸或两种寡核苷酸二者用多至20个、优选多至10个、并且最优选多至5个猝灭剂标记。尽管设想探针可以将多于一种类型的荧光团连接于探针，例如，为了给予其特征性的指纹，但是，优选的是连接到给定探针的所有探针都是相同类型的。然而，将理解，当在所述方法中使用多种杂交探针时，每种探针组分上的荧光团的选择需要认真选择，以获得能够在可能的结果范围之间被分析和区分的信号。
关于荧光团本身，它们原则上可以选自任意本领域中常规使用的那些，包括但不限于呫吨结构部分，例如，荧光素，罗丹明及其衍生物如荧光素异硫氰酸酯，罗丹明B等；香豆素结构部分(例如，羟基-、甲基-和氨基香豆素)和青色素结构部分如Cy2，Cy3，Cy5和Cy7。具体的实例包括来源于下述常用染料的荧光团：Alexa染料，青色素染料，Atto Tec染料和罗丹明染料。实例还包括：Atto 633(ATTO-TEC GmbH)，Texas Red，Atto 740(ATTO-TECGmbH)，Rose Bengal，Alexa FluorTM 750C5-马来酰亚胺(Invitrogen)，Alexa FluorTM 532C2-马来酰亚胺(Invitrogen)和Rhodamine Red C2-马来酰亚胺和Rhodamine Green以及亚磷酰胺(phosphoramadite)染料如Quasar 570。备选地，可以使用量子点或近红外染料，诸如LI-COR Biosciences所供应的那些。典型地利用本领域已知的化学方法经由核苷酸碱基将荧光团连接到寡核苷酸。
适当的猝灭剂是通过共振能量转移(FRET)机制起作用的那些。可以与上文提及的荧光团关联使用的可商购的猝灭剂的实例包括但不限于DDQ-1，Dabcyl，Eclipse，Iowa Black FQ和RQ，IR Dye–QC1，BHQ-1，-2和-3以及QSY-7和-21。
用于本发明的方法的第一和第二寡核苷酸原则上可以通过本领域已知的任何核苷酸组装方法制备，包括H-膦酸酯法，磷酸二酯合成，磷酸三酯合成和亚磷酸三酯合成。优选的是使用核苷酸亚磷酰胺结构单元的方法，这是由于其反应性。在这些方法中，通过在涉及去封闭、偶联、封端和氧化的循环的四步法中在5’位置向生长的核苷酸链顺序添加所选的核苷酸亚磷酰胺而进行合成。该方法的循环性质使其特别适合自动化，并且用于进行该方法的仪器在市场上容易得到。在要引入猝灭剂和/或荧光团的情况下，在需要的点使用适当标记的核苷酸亚磷酰胺。当第一寡核苷酸是j-型时，优选使用亚磷酰胺法首先制备单链寡核苷酸前体，所述前体通过快速加热和缓慢冷却的循环折叠成具有所需结构特征的产物。
在本发明的方法的步骤(b)中，待检测的单一核苷酸与探针的第一和第二寡核苷酸组分反应，或者如果使用多于一种探针，与相关探针的第一和第二寡核苷酸组分反应，以使其与耐受核酸外切降解的区域和第二寡核苷酸二者结合。通过这种方式，产生双链的使用的探针。在上述j-型/i-型寡核苷酸探针的情形中，这涉及例如，使用聚合酶和连接酶，以使单一核苷酸结合到第一寡核苷酸的3’端和第二寡核苷酸的5’端。可以使用宽泛范围的聚合酶和连接酶来实现这一结果，包括，但不限于，来源于容易获得的细菌来源的那些，诸如来源于噬菌体T4、大肠杆菌(Escherichia Coli)和嗜热水生菌(Thermus Aquaticus)(Taq)的那些。优选地，该步骤在存在过量探针的条件下在水性介质中进行，单一核苷酸：相关探针的摩尔比例适当地在1:1至1:2000、优选1:1至1:200、更优选1:2至1:50的范围内，最优选是1:5至1:20。也适当地使用相对靶标化学计量过量的两种酶中的每一种。在一个实施方案中，选择第二寡核苷酸，使其在发生连接之前不进行与第一寡核苷酸的单链区的杂交。将理解，当在方法中使用多于一种探针时，仅针对讨论的单一核苷酸有选择性的探针将进行步骤(b)，其他的基本上保持惰性，并且在所述方法中不起其他作用。
在本发明的方法的步骤(c)中，将在步骤(b)中产生的双链的使用的探针用能够在特征性识别位点分裂其的限制性内切核酸酶处理。在一个实施方案中，以下称为步骤(c1)，将所述使用的探针在这样的条件下用甲基化-依赖性限制性内切核酸酶处理：由于该条件，仅当被捕获的单一核苷酸被甲基化时，所述探针在单一核苷酸与携带第二寡核苷酸的一侧相反的一侧在邻近或基本上邻近耐受核酸外切降解的区域被切割成两个主要是双链的寡核苷酸片段。通过这种方式，耐受核酸外切降解的区域保持与包含第二寡核苷酸的切割的探针的该部分连接。
关于甲基化依赖性内切核酸酶，这可以例如是，LpnPI，其仅在识别位点5’--C*CDG--3'(D＝A或T，并且C*是5-甲基胞嘧啶或5-羟基甲基胞嘧啶)切割双链寡核苷酸。此处，并且假设已经正确选择在要插入单一核苷酸的洞周围的第一和第二寡核苷酸上的核苷酸，需要的识别位点将仅在探针处于其使用的形式时产生，并且所述使用的探针仅在所插入的单一寡核苷酸被甲基化时(即，在该具体情形中，当其为C*时)被切割成分开的双链片段。否则，步骤(b)中产生的双链的使用的探针将保持完整。
在另一个实施方案中，以下称为步骤(c2)，将所述使用的探针备选地用甲基化敏感性限制性内切核酸酶在这样的条件下处理：由于该条件，仅当被捕获的单一核苷酸未被甲基化时，所述使用的探针在所述单一核苷酸与携带第二寡核苷酸的一侧相反的一侧上邻近耐受核酸外切降解的区域被切割成两个双链寡核苷酸片段。通过这种方式，耐受核酸外切降解的区域保持与包含第二寡核苷酸的切割的探针的那部分连接。例如，甲基化敏感性内切核酸酶MspI和Hpall仅在具有序列5’--CC*GG--3’的识别位点切割双链寡核苷酸，并且DnpI和DnpII内切核酸酶仅在具有序列5’--GA*TC--3’的识别位点切割，其中A*是甲基化的腺嘌呤。在这些情形中，并且同样假设已经正确选择在要插入单一核苷酸的洞周围的第一和第二寡核苷酸上的核苷酸，需要的识别位点将仅在所述探针处于其使用形式时产生，并且所述使用的探针因此仅在插入的单一核苷酸是未甲基化的C或A(视情况而定)时被切割成分开的双链片段。否则，步骤(b)中产生的双链的使用的探针将保持完整。
在使用的探针上发生限制性内切核酸酶切割的位点位于耐受核酸外切降解的区域的5’侧，使得该区域在携带原始第二寡核苷酸的片段中终止。在一个实施方案中，该切割将在两个产生的片段上留下5’单链突出。典型地，也在水性介质中用过量的内切核酸酶进行步骤(c)。所用的内切核酸酶应该是这样的内切核酸酶：如果从其识别位点失去核苷酸，则其不切割使用的探针。
所述方法的最后步骤包括两个备选方案(d1)和(d2)，它们对应于使用聚合酶或外切核酸酶(适当地，具有3’-5’双链外切核酸酶活性但是不具有5’-3’和单链外切核酸酶活性的那种)处理步骤(c1)或步骤(c2)的产物，以从所述使用的探针或使用的探针片段释放处于未猝灭并且因此是可检测的状态的多种可检测元件。对于步骤(d1)和(d2)中的每一步，存在两种方案。因此，如果捕获在使用的探针中的单一核苷酸是被甲基化的，并且随后使用步骤(c1)，则所述使用的探针现在将被甲基化依赖性限制性内切核酸酶切割成两个双链片段(每一个双链片段分别携带第一和第二可检测元件)。那么，按照步骤(d1)用外切核酸酶或表现出外切核酸酶活性的聚合酶处理这些片段将引起3’-5’方向的核酸外切降解，并且由于随着携带它们的个体核苷酸被释放，去除了猝灭或自猝灭作用，引起处于可检测形式的第一和第二可检测元件的级联的释放。因此，如果第一和第二可检测元件是不同的荧光团，则将观察到两种不同的荧光信号的产生。在备选的实施方案中，步骤(c1)可以引起携带第二可检测元件的片段(关于去杂交不稳定)成为其组成单链，在该情形中，没有发生该片段的外切核酸降解，没有发生处于非猝灭形式的第二可检测元件的相对应的释放，并且仅观察到第一可检测元件特有的信号。另一方面，如果捕获在使用的探针中的单一核苷酸没有被甲基化，则步骤(c1)的应用对所述使用的探针将没有作用，使得当随后使用步骤(d1)时，核酸外切降解仅导致使用的探针消化至远至耐受核酸外切降解的区域的，以致仅观察到第二可检测元件的释放。
将容易显而易见的是，当在步骤(d2)中处理步骤(c2)的产物时，可以反过来应用相同的推理，以致所有不同的结果可以总结在下表中：
由于步骤(d1)或步骤(d2)中的两种结果导致不同的观察结果，因此，显而易见，本发明的方法以其各种形式允许使用者容易地区分甲基化和未甲基化的核苷酸。
聚合酶或外切核酸酶可以在任何时间添加到反应混合物中，例如，在进行步骤(c1)或步骤(c2)之前或之后。在优选的实施方案中，其与步骤(b)中的聚合酶和连接酶同时引入。在后一种情形中，优选地，所述外切核酸酶是热激活的酶，并且步骤(d1)或步骤(d2)包括另外的通过加热激活其的亚步骤。可以使用上述任意的外切核酸酶或表现出外切核酸酶行为的聚合酶。
在一个实施方案中，本发明的方法适用于通过其进展性的焦磷酸解作用或核酸外切降解来分析来源于多核苷酸分析物的单一核苷酸。典型地，所分析的单一核苷酸是核苷酸三磷酸酯，优选的是包含脱氧核糖结构部分的核苷酸三磷酸酯(dNTP)。当使用外切核酸酶产生单一核苷酸时，初始形成的核苷酸单磷酸酯和二磷酸酯可以使用例如激酶转化成它们相对应的三磷酸酯。
在另一个实施方案中，本发明的方法与在上述我们的专利申请中的那些中所述的小滴测序技术组合使用；它们的内容通过引用结合在本文中。在该测序技术的一个优选的实例中，通过进行性焦磷酸解作用从前体分析物产生小滴流，它们中的至少一些包含单一核苷酸三磷酸酯。在另一个实施方案中，在所述小滴流中的核苷酸三磷酸酯的顺序对应于分析物中核苷酸的序列。在另一个实施方案中，通过在小滴流中适当的点插入需要的杂交探针、限制性内切核酸酶、连接酶和外切核酸酶或表现出外切核酸酶活性的聚合酶，本发明的方法相应应用于每个小滴。在可检测元件是荧光团的情形中，则随后可以检查每个小滴，以确定发射的荧光的性质。例如，这可以通过使用光检测器进行，其相应能够产生可以通过微处理器和相连的计算机算法进一步处理和分析的电信号。
现在，将通过下述实施例和附图举例说明本发明的方法。
实施例1
113个核苷酸的单链寡核苷酸前体(ex.ATDBio)具有下述核苷酸碱基序列：
(5′)GTAGGTCCTGGAAACGAAAAACGGAGGmCCAGAAGCAAAAAGCAGGGACGTGATGTTCCATGACTG ATTTTTTTTTCAGTCATGGAACATCACGTCCCTGCXXQXXGCTTCTG-G(3′)
其中X是用Quasar 570(荧光团)标记的T碱基，Q是用BHQ-2猝灭剂标记的T碱基，mC是5-甲基胞嘧啶核苷酸，并且‘-’是硫代磷酸酯键，通过将该单链寡核苷酸前体的水溶液加热至95℃并然后以10分钟/℃的速率缓慢冷却回室温，而在约第70个核苷酸碱基将其折叠。该时间结束时，形成根据本发明的闭环末端的探针，其中第67-74个核苷酸碱基(此处全是T)包含单链核苷酸环区。
第二的20个核苷酸的单链寡核苷酸前体(ex.ATDBio)具有下述核苷酸碱基序列：
(5')CTCCGYYQYYCGTTTCCAGA(3')
其中Y是用Alexa Fluor 633(荧光团)标记的T碱基，并且Q是用BHQ-2猝灭剂标记的T碱基，将所述单链寡核苷酸前体在溶液中与等摩尔浓度的第一寡核苷酸前体和HaemoKlenTaq DNA聚合酶、Taq DNA连接酶、AxoI限制性内切核酸酶和KOD极端热启动DNA聚合酶混合。然后加入包含甲基化的或未甲基化的dCTP(脱氧胞苷三磷酸酯)的溶液。
将制备的混合物在50℃孵育一小时，允许下述酶促步骤发生：
1.HaemoKlenTaq聚合酶将dCTP核苷酸结合到第一寡核苷酸的3’-凹陷末端。
2.Taq连接酶将第二寡核苷酸仅连接到已经具有结合的dCTP的那些第一寡核苷酸的3’-凹陷末端上，产生‘完整的’捕获分子。
3.在结合的dCTPs被甲基化的情形中，AxoI限制性内切核酸酶将每个完整的捕获分子切割成两段。在结合的dCTPs未被甲基化的情形中，没有发生切割。
在这些步骤后，将温度升高至70℃以激活KOD极端热启动聚合酶，并且在该温度保持15分钟。在结合的dCTPs没有被甲基化的情形中，使完整的捕获分子用聚合酶进行3’-5’消化，将Alexa Fluor 633荧光团释放到溶液中，然后所述荧光团自由发荧光。在结合的dCTPs被甲基化的情形中，完整的捕获分子的包含第二寡核苷酸的切割的一半将解链(melt)，并且因此，不易于被聚合酶降解。在该情形中，完整的捕获分子被切割的另一半将易于被降解，将Quasar 570荧光团释放到溶液中，然后所述荧光团自由发荧光。通过检测得到的溶液的特征性荧光谱，由此可以推测加入到原始混合物中的dCTP核苷酸本质是甲基化的还是未被甲基化的。
步骤1-3的结果显示在图1中，所述结果关于甲基化的和未甲基化的dCTP。在该凝胶电泳图像中，标记为‘1’的泳道显示步骤1-3的完全反应的结果，标记为‘2’的泳道显示不存在任意核苷酸的情况下的反应，标记为‘3’的泳道是不存在AxoI限制性内切核酸酶，标记为‘4’的泳道是不存在连接酶。可以清楚地看出，在存在未甲基化的dCTP条件下的完全反应(最左侧泳道‘1’)产生一对条带(由于不同的可能的结构排列)，对应于两个寡核苷酸前体与dCTP组合成单一构建体。在存在和不存在AxoI的条件下的反应(泳道1和3)之间没有观察到差别，这表明限制性内切核酸酶在该情形中具有零活性。对于在存在甲基化的dCTP的条件下的反应(最右侧四个泳道)，在不存在AxoI的条件下观察到相同的结果(泳道3)，但是在存在AxoI的条件下(泳道1)，得到的DNA片段有效地被限制性内切核酸酶切割，产生多个与所得到的DNA片段相对应的条带。
图2显示在存在(虚线)和不存在(实线)dCTP的情况下下通过聚合酶对步骤1-3获得的产物的外切核酸降解消化的结果。聚合酶通过在时间T＝20分钟升高温度而激活，并且在存在dCTP时，观察到荧光的大量增加，而在不存在dCTP时，观察到非常小的变化。
实施例2
113个核苷酸的单链寡核苷酸前体(ex.ATDBio)具有下述核苷酸碱基序列：
(5′)GTAGGTCCTGGAAACGAAAAACGGACGTACGAAGCAAAAAGCAGGGACGTGATGTTCCATGACTGAT TTTTTTTTCAGTCATGGAACATCACGTCCCTGCXXQXXGCTTCGT-A(3′)
其中X是用Quasar 570(荧光团)标记的T碱基，Q是用BHQ-2猝灭剂标记的T碱基，mC是5-甲基胞嘧啶核苷酸，并且‘-’是硫代磷酸酯键，通过将该单链寡核苷酸前体的水溶液加热至95℃然后以10分钟/℃的速率缓慢冷却至室温，而在约第70个核苷酸碱基将其折叠。该时间结束时，形成根据本发明的闭环末端的探针，其中第67-74个核苷酸碱基(此处全是T)包含单链核苷酸环区。
第二的20个核苷酸的单链寡核苷酸前体(ex.ATDBio)具有下述核苷酸碱基序列：
(5')GTCCGYYQYYCGTTTCCAGA(3')
其中Y是用Alexa Fluor 633(荧光团)标记的T碱基，Q是用BHQ-2猝灭剂标记的T甲基，将所述单链寡核苷酸前体在溶液中与等摩尔浓度的第一寡核苷酸前体和HaemoKlenTaqDNA聚合酶、Taq DNA连接酶、BsiWI限制性内切核酸酶和KOD极端热启动DNA聚合酶混合。然后加入包含甲基化的或未甲基化的dCTP的溶液。
将制备的混合物在50℃孵育一小时，允许下述酶促步骤发生：
1.HaemoKlenTaq聚合酶将dCTP核苷酸结合到第一寡核苷酸的3’-凹陷末端。
2.Taq连接酶将第二寡核苷酸仅连接到已经具有结合的dCTP的那些第一寡核苷酸的3’-凹陷末端上，产生‘完整的’捕获分子。
3.在结合的dCTPs未被甲基化的情形中，AxoI限制性内切核酸酶将每个完整的捕获分子切割成两段。在结合的dCTPs被甲基化的情形中，没有发生切割。
在这些步骤后，温度升高至70℃以激活KOD极端热启动聚合酶，并且在该温度保持15分钟。在结合的dCTPs被甲基化的情形中，使完整的捕获分子通过聚合酶进行3’-5’消化，将Alexa Fluor 633荧光团释放到溶液中，然后所述荧光团自由发荧光。在结合的dCTPs未被甲基化的情形中，完整的捕获分子的包含第二寡核苷酸的切割的一半将解链，并且因此，不易于被聚合酶降解。在该情形中，完整的捕获分子被切割的另一半将易于被降解，将Quasar 570荧光团释放到溶液中，然后所述荧光团自由发荧光。通过检测得到的溶液的特征性荧光谱，由此可以推测加入到原始混合物中的dCTP核苷酸本质是甲基化的还是未被甲基化的。

Claims (14)

1.一种确定给定的单一核苷酸是被甲基化的还是未被甲基化的方法，所述方法特征在于下述步骤：(a)使处于分离的核苷酸三磷酸酯分子形式的所述单一核苷酸与一种或多种杂交探针类型接触，每种所述杂交探针类型在其未使用形式包含：(1)包括5'突出和连接一个或多个处于基本不可检测状态的第一可检测元件的第一发夹寡核苷酸，并且所述第一寡核苷酸还包含：(i)双链和单链区，和(ii)位于在所述双链区邻近所述单链区的3'末端的耐受核酸外切降解的区域，和(2)连接一个或多个也处在基本不可检测状态的第二可检测元件的第二单链寡核苷酸，并且改变所述第二单链寡核苷酸为至少部分从所述突出的第二核苷酸开始与所述5'突出互补；(b)使所述第二单链寡核苷酸与所述5'突出杂交，和通过使用聚合酶和连接酶使分离的单一核苷酸结合到第一寡核苷酸的3'端和第二寡核苷酸的5'端，以产生基本上双链的使用的探针的相关的探针类型；(c1)将所述使用的探针用甲基化依赖性限制性内切核酸酶在如果所述单一核苷酸被甲基化，则所述使用的探针在邻近耐受核酸外切降解的区域处被切割成两个双链寡核苷酸产物的条件下处理，或者(c2)将所述使用的探针用甲基化敏感性限制性内切核酸酶在如果所述单一核苷酸未被甲基化，则所述使用的探针在邻近耐受核酸外切降解的区域处被切割成两个双链寡核苷酸产物的条件下处理，从而在任一情况下使得所述耐受核酸外切降解的区域保持与包含第二寡核苷酸的切割的使用的探针部分连接；并且，然后(d1)将步骤(c1)的产物用外切核酸酶或聚合酶处理，所述外切核酸酶或聚合酶各自展现出3'-5'双链外切核酸酶活性并且既没有5'-3'也没有单链外切核酸酶活性，使得如果所述单一核苷酸被甲基化，则仅释放处于可检测状态的第一可检测元件或释放处于可检测状态的第一和第二可检测元件二者，或如果所述单一核苷酸未被甲基化，则仅释放第二可检测元件，或者，(d2)将步骤(c2)的产物用外切核酸酶或聚合酶处理，所述外切核酸酶或聚合酶各自展现出3'-5'双链外切核酸酶活性并且既没有5'-3'也没有单链外切核酸酶活性，使得如果所述单一核苷酸未被甲基化，则仅释放处于可检测状态的第一可检测元件或释放处于可检测状态的第一和第二可检测元件二者，或如果所述单一核苷酸被甲基化，则仅释放第二可检测元件。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述耐受核酸外切降解的区域包括两个核苷酸之间的硫代磷酸酯键。
3.权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征在于，所述双链的使用的探针具有单链突出区。
4.权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征在于，使用两种以上的探针类型，并且其中，在每个类型中，所述单链区上紧邻耐受核酸外切降解的区域的核苷酸是不同的。
5.权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征在于，使用包含两种不同的第一寡核苷酸的两种不同的探针类型，并且，其中在所述单链区上邻近耐受核酸外切降解的区域的两种不同的核苷酸包括下述核苷酸碱基对中的一种：鸟嘌呤和胞嘧啶；腺嘌呤和胸腺嘧啶或腺嘌呤和尿嘧啶。
6.权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征在于，使用包含四种不同的第一寡核苷酸的四种不同的探针，并且，其中在所述单链区上邻近耐受核酸外切降解的区域的四种不同的核苷酸包括：(a)四种核苷酸碱基鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和胸腺嘧啶中的一种，或(b)四种核苷酸碱基鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶中的一种。
7.权利要求4所述的方法，其特征在于，每个第一寡核苷酸包含其自身特征性可检测元件。
8.权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征在于，使用的至少一些第一寡核苷酸类型包含多种第一可检测元件。
9.权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征在于，每种第二寡核苷酸包含多种第二可检测元件。
10.权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征在于，各种第一和第二可检测元件包含各自表现出不同的检测特征的不同的荧光团或量子点。
11.权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征在于，所述可检测元件是荧光团，并且，通过存在猝灭剂或通过相互的自猝灭使得它们在所述探针中是不可检测的。
12.权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(d1)或步骤(d2)中所用的外切核酸酶是热激活的外切核酸酶。
13.权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征在于，其还包括检测在步骤(d1)或步骤(d2)中释放的各种可检测元件的步骤(e)。
14.权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法应用于小滴流，所述小滴中的至少一些包含来源于多核苷酸分析物的单一核苷酸三磷酸酯。
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