ES2245315T3 - Metodo de amplificacion para la deteccion de acidos nucleicos diana que implica transferencia de energia fluorescente. - Google Patents
Metodo de amplificacion para la deteccion de acidos nucleicos diana que implica transferencia de energia fluorescente.Info
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Abstract
Un método para detectar la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra, comprendiendo dicho método someter dicha muestra a una reacción de amplificación en la que dicho ácido nucleico diana puede amplificarse, utilizando un conjunto de nucleótidos, al menos uno de los cuales está marcado con un primer marcaje, y un reactivo que comprende un cebador de amplificación que puede hibridar con dicha secuencia diana cuando está en forma monocatenaria, y que está conectado, mediante un grupo de engarce químico que no es reconocido por una ADN polimerasa, por su extremo 5¿ con una sonda que porta un segundo marcaje, siendo dicha sonda marcada de una secuencia que es similar a la de dicha secuencia diana, de tal modo que puede hibridar con una región complementaria en un producto de amplificación de tal modo que la energía fluorescente puede transferirse entre el primer y segundo marcajes, y en el que uno del primer o segundo marcajes comprende un marcaje donante y el otro comprende un marcaje aceptor, comprendiendo el marcaje donante una molécula fluorescente que es capaz de donar energía fluorescente al marcaje aceptor; y monitorizar la fluorescencia de dicha muestra.
Description
Método de amplificación para la detección de
ácidos nucleicos diana que implica transferencia de energía
fluorescente.
La presente invención proporciona un método para
detectar un polinucleótido diana en una muestra, por ejemplo,
monitorizando una reacción de amplificación, preferiblemente de
manera cuantitativa, así como sondas y kits para uso en estos
métodos. El método es también adecuado para la detección de
características de secuencia tales como polimorfismos o variaciones
alélicas, y así puede utilizarse en métodos de diagnóstico.
Las técnicas conocidas de monitorización por
fluorescencia de reacción en cadena con polimerasa (PCR) incluyen
tanto técnicas de intercalado de ADN específicas de cadena como
genéricas que pueden utilizarse en dispositivos de ciclación térmica
por PCR de pocos segundos de generación.
Los métodos genéricos de PCR por fluorescencia
utilizan tintes intercalantes de ADN que exhiben una fluorescencia
aumentada cuando se unen a especies bicatenarias de ADN. El aumento
de fluorescencia debido a un aumento en la concentración volumétrica
de ADN durante las amplificaciones puede utilizarse para medir la
progresión de la reacción y para determinar el número de copias de
la molécula diana original. Además, al monitorizar la fluorescencia
con un cambio controlado de temperatura, pueden generarse curvas de
fusión de ADN, por ejemplo, al final de la ciclación térmica por
PCR.
Estos métodos genéricos de PCR por fluorescencia
monitorizan el aumento de la concentración volumétrica de ácidos
nucleicos sin penalización temporal. Puede tomarse una única lectura
fluorescente en el mismo punto de cada reacción. Puede utilizarse el
análisis de curva de fusión de punto final para discriminar los
artefactos del amplicón, y para discriminar los amplicones. Pueden
observarse picos de productos a concentraciones que no pueden
visualizarse mediante electroforesis en gel de agarosa.
Para obtener datos de fusión de alta resolución,
el experimento de fusión debe realizarse lentamente en las
instalaciones existentes, llevando hasta 5 minutos. Sin embargo, al
monitorizar continuamente la amplificación por fluorescencia, puede
producirse una imagen tridimensional de la histéresis de fusión e
hibridación. Esta imagen tridimensional es dependiente del amplicón
y puede proporcionar suficiente información para la discriminación
del producto.
Se ha encontrado que, en general, el análisis de
la curva de fusión del ADN es una poderosa herramienta para
optimizar la ciclación térmica por PCR. Al determinar las
temperaturas de fusión de los amplicones, es posible reducir las
temperaturas de desnaturalización en ciclos de PCR posteriores a
esta temperatura. La optimización para la amplificación a partir de
productos de reacción de primera generación, en lugar de ADN
genómico, reduce la formación de artefactos que aparece en ciclos
posteriores. Pueden utilizarse las temperaturas de fusión de
oligonucleótidos cebadores y sus complementos para determinar sus
temperaturas de apareamiento, reduciendo la necesidad de
optimización empírica.
Sin embargo, los métodos intercalantes genéricos
son sólo casi específicos de cadena, y por lo tanto no muy útiles
cuando se requiere detección específica de cadena.
Los métodos específicos de cadena de PCR de
fluorescencia utilizan componentes de reacción de ácido nucleico
adicionales para monitorizar la progresión de las reacciones de
amplificación. Estos métodos pueden utilizar transferencia de
energía de fluorescencia (TEF) como base de detección. Se marcan una
o más sondas de ácido nucleico con moléculas fluorescentes, una de
las cuales es capaz de actuar como donante de energía y la otra es
una molécula aceptora de energía. Éstas son a veces conocidas como
molécula informadora y molécula extintora, respectivamente. La
molécula donante se excita con una longitud de onda de luz
específica para la que exhibirá normalmente una longitud de onda de
emisión de fluorescencia. La molécula aceptora se excita a esta
longitud de onda de emisión de tal modo que puede aceptar la energía
de emisión de la molécula donante mediante una variedad de
mecanismos de transferencia de energía dependientes de la distancia.
Un ejemplo específico de transferencia de energía de fluorescencia
que puede aparecer es la transferencia de energía por resonancia de
fluorescencia o "TERF". Generalmente, la molécula aceptora
acepta la energía de emisión de la molécula donante cuando están en
estrecha proximidad (por ejemplo, en la misma o en una molécula
vecina). La base de la detección por TEF o TERF es monitorizar los
cambios a la longitud de onda de emisión de la donante. Cuando la
aceptora es también una molécula fluorescente, pueden monitorizarse
también las longitudes de onda de emisión de la aceptora.
Existen dos tipos utilizados habitualmente de
sondas de TEF o TERF, aquellas que utilizan hidrólisis de sondas de
ácidos nucleicos para separar la donante de la aceptora, y aquellas
que utilizan hibridación para alterar la relación espacial de las
moléculas donante y aceptora.
Las sondas de hidrólisis están comercialmente
disponibles como sondas TaqMan™. Éstas consisten en oligonucleótidos
de ADN que están marcados con moléculas donantes y aceptoras. Las
sondas se diseñan para unirse a una región específica en una cadena
de un producto de PCR. Después del apareamiento del cebador de PCR
con esta cadena, la enzima Taq extiende el ADN con la
actividad polimerasa 5' a 3'. La enzima Taq exhibe también
actividad exonucleasa 5' a 3'. Las sondas TaqMan™ se protegen en el
extremo 3' mediante fosforilación para evitar que ceben la extensión
de Taq. Si la sonda TaqMan™ híbrida con la cadena de
producto, entonces una molécula Taq extensora puede
hidrolizar también la sonda, liberando la donante de la aceptora
como base de la detección. La señal en este caso es acumulativa,
aumentando la concentración de moléculas donantes y aceptoras libres
con cada ciclo de la reacción de amplificación.
El hecho de que la generación de señal dependa de
la aparición de reacciones de hidrólisis de sonda significa que
existe una penalización temporal asociada a este método. Además, la
presencia de la sonda puede interrumpir la operación regular del
proceso de PCR.
Además, se ha encontrado que la hidrólisis puede
volverse no específica, particularmente cuando se requieren grandes
números de ciclos de amplificación, por ejemplo más de 50 ciclos. En
estos casos, la hidrólisis no específica de la sonda dará como
resultado una señal indebidamente elevada.
Esto significa que dichas técnicas no son muy
compatibles con métodos de PCR rápidos que se están haciendo más
destacados con el desarrollo de cicladores térmicos rápidos de aire
caliente tales como RapidCycler™ y LightCycler™ de Idaho
Technologies Inc. Se describen otros dispositivos rápidos de PCR,
por ejemplo, en las solicitudes de patente británica en tramitación
junto con la presente nº 9625442.0 y 9716052.7. Los méritos de la
ciclación rápida frente a la ciclación térmica convencional se han
reseñado en otras partes. Dichas técnicas son particularmente
útiles, por ejemplo, en sistemas de detección de armamento biológico
cuando la velocidad del resultado es importante si ha de evitarse la
pérdida de vidas o lesiones graves.
Además, las sondas de hidrólisis no proporcionan
información significativa con respecto a la histéresis de la fusión,
puesto que la generación de señal es, por regla general, dependiente
de la hidrólisis de la sonda en lugar de la temperatura de fusión
del amplicón o sonda.
Las sondas de hibridación están disponibles en
una serie de aspectos. Las sondas fluorescibles son oligonucleótidos
que tienen secuencias 5' y 3' complementarias de tal modo que pueden
formar bucles de horquilla. Los marcajes fluorescentes terminales
están en estrecha proximidad para que aparezca TERF cuando se forma
la estructura de horquilla. Después de la hibridación de las sondas
fluorescibles con una secuencia complementaria, se separan los
marcajes fluorescentes de modo que no aparezca TERF, y esto forma la
base de la detección.
Pueden utilizarse también pares de
oligonucleótidos marcados. Estos hibridan en estrecha proximidad con
una cadena producto de PCR juntando moléculas donantes y aceptoras
de modo que pueda aparecer TERF. La TERF potenciada es la base de la
detección. Las variantes de este tipo incluyen utilizar un cebador
de amplificación marcado con una sola sonda adyacente.
El uso de dos sondas, o un tipo de sonda de sonda
fluorescible que incluye dos moléculas de marcaje, aumenta el coste
implicado en el proceso. Además, este método requiere la presencia
de una secuencia conocida razonablemente larga de modo que sean
conocidas dos sondas que sean suficientemente largas para unirse
específicamente en estrecha proximidad entre sí. Esto puede ser un
problema en algunas aplicaciones de diagnóstico, en las que la
longitud de las secuencias conservadas en un organismo que puede
utilizarse para diseñar una sonda eficaz, tal como el virus VIH,
puede ser relativamente corta.
Además, el uso de pares de sondas implica un
diseño experimental más complejo. Por ejemplo, una señal
proporcionada en el momento de fusión de una sonda es una función de
la fusión de ambas sondas. El estudio de pequeños desapareamientos,
o cuando es necesaria una de las sondas para unirse a lo largo de
una región de ayuste (por ejemplo, para detectar ARN en comparación
con ADN en una muestra en la que la secuencia a cada lado de un
intrón puede utilizarse como sitio de sonda), puede proporcionar
resultados incorrectos si la otra sonda se funde antes.
El documento EP 0566751 da a conocer un método
para detectar la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana
en una muestra.
La solicitud de patente internacional en
tramitación junto con la presente nº PCT/GB990504 describe un ensayo
para detectar la presencia de secuencias de ácido nucleico
particulares que puede adaptarse para cuantificar la cantidad de
secuencia diana en la muestra. En este ensayo, se efectúa una
reacción de amplificación utilizando un conjunto de nucleótidos, al
menos uno de los cuales está marcado fluorescentemente. Por tanto,
el producto de amplificación tiene un marcaje fluorescente
incorporado al mismo. La reacción se efectúa en presencia de una
sonda que puede hibridar con el producto de amplificación, y que
incluye una molécula reactiva que es capaz de absorber fluorescencia
de o donar energía de fluorescencia a dicho nucleótido marcado
fluorescente. La reacción puede monitorizarse después midiendo la
fluorescencia de dicha muestra, ya que ésta se alterará durante el
transcurso de la reacción a medida que se forma más producto que
híbrida con la sonda y da lugar a interacción TEF o TERF entre
ellos.
Los solicitantes han encontrado ahora un modo
mejorado de efectuar dicho ensayo.
La invención proporciona un método para detectar
la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana en una
muestra, comprendiendo dicho método someter dicha muestra a una
reacción de amplificación en la que dicho ácido nucleico diana puede
amplificarse utilizando un conjunto de nucleótidos, al menos uno de
los cuales está marcado con un primer marcaje, y un reactivo que
comprende un cebador de amplificación que puede hibridar con dicha
secuencia diana cuando está en forma monocatenaria, y que está
conectado, mediante un grupo de enlace químico que no es reconocido
por una ADN polimerasa, por su extremo 5' con una sonda que porta un
segundo marcaje, siendo dicha sonda marcada una secuencia que es
similar a la de dicha secuencia diana, de tal modo que puede
hibridar con una región complementaria en un producto de
amplificación de tal modo que puede transferirse energía
fluorescente entre el primer y segundo marcajes, y en el que uno de
los primer o segundo marcajes comprende un marcaje donante y el otro
comprende un marcaje aceptor, comprendiendo el marcaje donante una
molécula fluorescente que es capaz de donar energía fluorescente al
marcaje aceptor; y monitorizar la fluorescencia de dicha
muestra.
En este ensayo, en una primera etapa, la
secuencia diana se vuelve monocatenaria de modo que la región
cebadora del reactivo pueda hibridar con ella. Esto puede iniciar
así la extensión de la cadena para generar una cadena complementaria
que incluirá nucleótidos marcados, y tendrá también una región de
sonda marcada cadena arriba de su extremo 5' que es complementaria
de una región cadena abajo del producto.
Una vez se completa la fase de extensión, se
separa el producto de su cadena molde durante una fase de fusión, y
se vuelve así monocatenaria. En esta forma, la región de sonda
marcada es capaz de girarse e hibridar con la región complementaria
de la cadena producto, tras de lo cual el marcaje que es capaz de
donar energía fluorescente (donante) al otro marcaje mediante TEF o
TERF lo hace, cambiando así la señal fluorescente de la muestra.
Este cambio de la señal puede monitorizarse a lo largo de la
reacción para monitorizar la progresión de la reacción de
amplificación.
En la segunda y posteriores etapas de
amplificación, la cadena de producto puede actuar por sí misma como
cadena molde para extensión. Sin embargo, el enlace químico detendrá
la reacción de extensión antes de producir una secuencia
complementaria de dicha sonda. Por tanto, la región de sonda
permanece monocatenaria.
Si es necesario, puede estar también presente
durante la reacción de amplificación un correspondiente cebador de
amplificación que no está unido a una región de sonda marcada. Este
cebador daría como resultado la producción de un producto de
amplificación no marcado convencional que puede servir para mediar
la señal en el intervalo dinámico del dispositivo detector que se
está utilizando. Puede mejorar también la eficacia de la reacción,
que puede verse afectada adversamente por la presencia de una
estructura de complejo sonda/cebador.
Cuando el marcaje que es capaz de absorber
fluorescencia del marcaje donante (aceptor) realiza esta función, se
reduce la fluorescencia del donante. Esta reducción puede
detectarse, y esto indica unión a la región de sonda.
Lo más preferiblemente, el marcaje que es capaz
de absorber fluorescencia (aceptor) es una molécula fluorescente por
sí misma que emite fluorescencia a una longitud de onda
característica. En este caso, el aumento de fluorescencia de la
molécula aceptora, que es de una longitud de onda diferente que la
del marcaje donante, indicará también unión de la sonda.
Adecuadamente, el marcaje donante se proporciona
en los nucleótidos, y el marcaje aceptor se proporciona en la sonda.
En este caso, la presencia del producto de amplificación así marcado
puede detectarse monitorizando la fluorescencia de la molécula
aceptora en la sonda, que se une principalmente a una región cadena
abajo de la misma cadena de producto. En este caso, la señal del
producto de amplificación puede distinguirse de la señal de fondo
del marcaje fluorescente y también de cualquier producto de
amplificación no específico.
El hecho de que la señal se produzca sólo por el
producto de amplificación marcado, significa que el sistema es
altamente específico en términos de detectar secuencias diana
específicas en mezclas de reacción que contienen grandes cantidades
de ADN de fondo. Esto es debido a que el producto de amplificación
no específico no hibridará con la región de sonda, y no contribuye
así a la señal medida.
Puede llevarse a cabo un ensayo de esta
naturaleza utilizando reactivos económicos. Las sondas marcadas una
vez son más económicas que aquellas que incluyen tanto moléculas
aceptoras como donantes.
La sonda marcada en el reactivo puede ser
monocatenaria o puede incluir secuencias 5' y 3' complementarias
tales que tome la forma de una sonda fluorescible como se describe
anteriormente. Sin embargo, en este caso, la sonda requiere sólo una
molécula de marcaje, ya que la señal de TEF o TERF que forma la base
de la detección surge como resultado de la interacción entre el
marcaje en la sonda y los nucleótidos marcados en la cadena de
amplicón.
Como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "conjunto de nucleótidos" designa un grupo de
nucleótidos que son suficientes para formar ácidos nucleicos tales
como ADN y ARN y otros análogos. Por tanto, estos comprenden
nucleótidos que contienen adenosina, citosina, guanina y timina o
uracilo. Uno o más de estos está marcado fluorescentemente. El
uracilo marcado está disponible en Boehringer Mannheim. Los marcajes
fluorescentes adecuados incluyen fluoresceína.
El uso de uracilo marcado puede preferirse
particularmente porque su uso puede englobarse en una estrategia
para la prevención de la contaminación o transferencia de una
reacción de amplificación a otras posteriores llevadas a cabo en los
recipientes de reacción. Pueden utilizarse las enzimas que digieren
ácidos nucleicos que contienen uracilo, tales como
uracil-N-glicosilasa, en una etapa de incubación de
preciclación, para asegurar que cualquier amplicón residual se
digiere antes de comenzar la ciclación térmica en la posterior
aplicación.
Adecuadamente, más de un nucleótido, y
posiblemente todos los nucleótidos, están marcados, ya que esto
moderará el nivel de señal del producto de amplificación y por tanto
la señal de TEF o TERF. La amplificación se efectúa adecuadamente
utilizando reacciones de amplificación conocidas tales como la
reacción en cadena con polimerasa (PCR), el ensayo de desplazamiento
de cadena (SDA) o NASBA, pero preferiblemente PCR.
Preferiblemente, se monitorizan la fluorescencia
tanto del primer como del segundo marcajes (concretamente, tanto de
los marcajes donante como aceptor), y se calcula la relación entre
las emisiones.
Los marcajes aceptores adecuados son tintes
fluorescentes tales como tintes de rodamina u otros tintes tales
como Cy5. Como alternativa, el marcaje aceptor puede comprender una
molécula aceptora no fluorescente, a veces conocida como "aceptor
oscuro", tal como DABCYL o rojo de metilo. Estos pueden unirse a
la sonda de manera convencional. La posición del marcaje aceptor a
lo largo de la sonda es indiferente, aunque en general se colocarán
en una región terminal de la sonda.
Para que aparezca TEF, tal como TERF, entre el
primer y segundo marcajes, la emisión fluorescente del marcaje
donante debe ser de longitud de onda más corta que el marcaje
aceptor.
Por lo tanto, se dan a continuación combinaciones
adecuadas en la siguiente tabla:
Donante | Aceptor |
SYBRGold | Rodamina |
SYBRGreen I | Rodamina |
Fluoresceína | Rodamina |
SYBRGold | Cy5 |
SYBRGreen I | Cy5 |
Fluoresceína | Cy5 |
Fluoresceína | Bromuro de etidio |
Fluoresceína | Dabcyl |
Fluoresceína | Rojo de metilo |
Fluoresceína | Tintes de diarilrodamina QSY-7* |
* disponibles en Molecular Probes, R.U. |
Preferiblemente, las moléculas utilizadas como
donante y/o aceptora producen picos de emisión estrechos, y hay poca
o ninguna superposición en las longitudes de onda de emisión. En
estas circunstancias, puede no ser necesario resolver el "pico
específico de cadena" de la señal producida por el producto de
amplificación. Una sola medida de la señal específica de cadena sola
(concretamente, la proporcionada por el marcaje aceptor)
proporcionará información respecto a la extensión de la TEF o TERF
causadas por la reacción diana.
Sin embargo, cuando hay una superposición
espectral en las señales fluorescentes de los marcajes donante y
aceptor, esto puede tenerse en cuenta en los resultados, por ejemplo
determinando empíricamente la relación entre los espectros y
utilizando esta relación para normalizar las señales a partir de las
dos señales.
El enlace químico que separa la sonda marcada del
cebador es adecuadamente cualquier molécula que pueda unirse a
secuencias nucleotídicas, pero que no sea reconocida por una ADN
polimerasa. Está disponible un amplio intervalo de engarces químicos
que satisfarían este requisito.
Se describen ejemplos de los tipos de compuestos
químicos y reacciones que pueden utilizarse en la formación de
engarces, por ejemplo, en el documento WO 95/08642. En particular,
el engarce químico comprende un grupo de átomos que unen entre sí
las dos secuencias polinucleotídicas (cebador y sonda). El engarce
puede unirse a las respectivas secuencias polinucleotídicas mediante
cualquier método convencional.
Hablando en general, el engarce derivará de un
compuesto químico orgánico que tenga un primer y un segundo grupo
funcionales mediante los que pueda unirse a las secuencias de sonda
y cebador, respectivamente, o a nucleótidos individuales a partir de
los cuales se genera posteriormente la secuencia de sonda o
cebador.
La unión del engarce puede ser, por ejemplo,
mediante un enlace sencillo carbono-carbono, un
enlace doble carbono-carbono, un enlace triple
carbono-carbono, un enlace sencillo
carbono-nitrógeno, un enlace doble
carbono-nitrógeno, un enlace sencillo
carbono-oxígeno, un enlace sencillo
carbono-azufre, un enlace sencillo
carbono-silicio, un enlace
azufre-nitrógeno, un enlace
azufre-oxígeno, un enlace
fósforo-oxígeno o un enlace
fósforo-nitrógeno, dependiendo de la naturaleza del
compuesto químico y de la reacción utilizada en la formación del
engarce.
Los grupos funcionales adecuados incluyen, pero
sin limitación, grupos hidroxilo, grupos amino, grupos tio, sulfatos
de alquilo y haluros.
Adecuadamente, el engarce puede introducirse por
etapas.
Por ejemplo, puede hacerse reaccionar el
compuesto químico que tiene un primer grupo funcional pero con un
segundo grupo funcional bloqueado (por ejemplo en forma de grupos
alcohol, éster, tioalquilo, etc.) con las secuencias de sonda o
cebador para unirlo a un extremo de las mismas. Después de la
retirada del grupo bloqueante utilizando métodos convencionales,
puede hacerse reaccionar el segundo grupo funcional con el otro de
sonda o cebador para formar un engarce químico entre ellos.
Como alternativa, el engarce químico puede
generarse in situ a partir de dos partes, utilizando por
ejemplo el siguiente esquema de reacción:
en el que P^{1} y P^{2}
representan las secuencias polinucleotídicas de cebador y sonda; X
es un grupo funcional que reacciona con un extremo 3' de una
secuencia polinucleotídica formando un resto -X'-, Z es un grupo
funcional que reacciona con un extremo 5' de una secuencia
polinucleotídica formando un resto -Z'-, Y e Y' son grupos
funcionales que no reaccionan con polinucleótidos pero que
reaccionan entre sí formando un grupo Y'', y R^{1} y R^{2} son
partes del
engarce.
Dependiendo de la naturaleza de la reacción que
tiene lugar, X', Y'' o Z' pueden ser enlaces directos. Los ejemplos
de grupos R^{1} y/o R^{2} adecuados incluyen:
-NH-CH_{2}-CH=CH-,
SH-CH_{2}-CH_{2}=CH-CH-,
-NH-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{2}-CH=CH-,
-(CH_{2})_{n}-O-, en la que n es un
entero de 1 a 20.
Cuando el engarce está unido al extremo 5' ó 3'
del polinucleótido, los enlaces convenientes incluyen enlaces
fosfato, carboxi o éter, particularmente enlaces fosfato. Los
engarces fosfato adecuados incluyen grupos aminoalquilfosforilo,
especialmente aquellos que comprenden una cadena alquilo
C_{1-12}, especialmente una cadena alquilo
C_{6}. Estos engarces pueden unirse fácilmente a oligonucleótidos
sintéticos durante síntesis en fase sólida, véanse por ejemplo, S.
Agrawal et al., Nucleic Acids Research, 1986, 14, 6227
y el documento WO-88/02004 (Applied Biosystems).
Se discuten otros métodos generales para unir un
engarce a una base polinucleotídica en J.L. Ruth y O.E. Bergstrom,
J. Org. Chem., 1978, 43, 2870; D.E. Bergstrom y M.K. Ogawa,
J. Amer. Chem. Soc., 1978, 10, 8106; y C.F. Bigge, P.
Kalaritis, J.R. Deck y M.P. Mertes, J. Amer. Chem. Soc.,
1980, 102, 2033. Es un método preferido el dado a conocer con
detalle en la solicitud de patente europea nº 063.879. El método
implica hacer reaccionar un engarce o un fragmento de engarce que
contiene un grupo alfa-vinilo con una base
mercuriada en presencia de K_{2}PdCl_{4}, estando unido el
mercurio en forma de Hg^{+} a la posición de la base que ha de
reaccionar con el engarce.
El tamaño o el contenido del engarce pueden
variar considerablemente, a condición de que pueda actuar como
bloqueo para la extensión mientras permite la hibridación entre la
región de sonda y la secuencia diana. El engarce puede contener de
aproximadamente 2 carbonos a cualquier número de carbonos, por
ejemplo hasta 20 átomos. El engarce puede contener heteroátomos e
insaturaciones. Pueden estar presentes grupos alifáticos,
alicíclicos, aromáticos o heterocíclicos en el engarce químico.
Convenientemente, comprende -(CH_{2})_{n}-. Sin embargo,
puede incluir otros grupos tales como -O-, -CHOH-, -COO- y
-CH_{2}CH_{2}-O-, que ayudan a mantener la
solubilidad acuosa.
La unión del engarce al grupo azúcar de un
polinucleótido puede ser mediante una base de Schiff al
1'-aldehído después de despurinación o
despirimidación de bases preseleccionadas, o puede ser al
2'-hidoxi en el caso en que el azúcar sea ribosa. La
unión de un brazo de engarce al resto fosfato puede ser mediante
alquilación de los grupos fosfato, por ejemplo, como se describe en
la patente de EE.UU. nº 4.469.863.
Para unir un engarce químico al grupo básico de
un polinucleótido, puede ser preferible unirlo a la base antes de la
formación del polinucleótido. Esto es debido a que las condiciones
de reacción que pueden ser necesarias para unir el engarce a la base
pueden causar reacciones secundarias indeseadas en un
polinucleótido. Además, la unión al nivel de polinucleótido puede
proporcionar rendimientos inconsistentes e irreproducibles. La unión
al nucleótido o al nivel de nucleótido permite purificar primero el
nucleósido o nucleótido modificado e incorporarlo después a un
polinucleótido. La incorporación puede ser mediante clonación, por
ejemplo en un vector M13, o mediante síntesis en un instrumento
sintetizador de polinucleótidos de manera convencional.
Cuando el engarce está unido al
1'-aldehído de un azúcar, el engarce se une
adecuadamente después de la formación de la porción polinucleotídica
de la sonda polinucleotídica. Esto es debido a que la unión del
azúcar requiere un aldehído libre en la posición 1' del azúcar. El
aldehído libre se forma mediante despurinación o despirimidación. Un
grupo que comprende un azúcar y un fosfato sin una base no es un
sustrato para las enzimas polimerasa. Por tanto, el engarce debe
unirse despurinando o despirimidando selectivamente primero la
secuencia polinucleotídica deseada, y uniendo después el engarce al
azúcar mediante el aldehído. Cuando el engarce está unido al grupo
2'-hidroxi de un azúcar ribosa, el engarce puede
estar unido al nivel de nucleósido, nucleótido o polinucleótido.
Esto es debido a que los nucleótidos modificados
por un engarce pueden incorporarse a un polinucleótido mediante un
instrumento sintetizador de polinucleótidos. Cuando el brazo de
engarce está unido al fosfato, el brazo de engarce se une
preferiblemente al nivel de nucleósido o nucleótido, de modo que la
unión no sea en posiciones distintas que en un fosfato. Puede
utilizarse la tecnología de fosforamidita en un sintetizador de
ácido nucleico para incorporar el engarce al extremo 5' ó 3' de un
polinucleótido.
En particular, los engarces comprenderán una
forma múltiple de etilenglicol, por ejemplo, hexaetilenglicol.
Dichos engarces pueden ser de estructura
-(CHOH-CHOH)_{n}-, en la que n es un entero
mayor de 1, por ejemplo 1-10, y adecuadamente 6.
La sondas que comprenden grupos de engarce pueden
obtenerse de Oswell Ltd., R.U.
El método de la invención es extremadamente
versátil en sus aplicaciones. El método puede utilizarse para
generar datos tanto cuantitativos como cualitativos respecto a la
secuencia de ácido nucleico diana en la muestra, como se discute con
más detalle a continuación en la presente memoria. En particular, la
invención no sólo proporciona una amplificación cuantitativa, sino
que también puede utilizarse, adicional o alternativamente, para
obtener datos característicos tales como las temperaturas de
desestabilización de dúplex o los puntos de fusión.
En el método de la invención, la sonda marcada
está integrada en un cebador de amplificación, y está así presente a
lo largo del transcurso de la reacción de amplificación. El proceso
permite efectuar la detección de manera homogénea, en la que la
amplificación y la monitorización pueden llevarse a cabo en un único
recipiente con todos los reactivos añadidos inicialmente. No son
necesarias etapas de adición de reactivo posteriores. Tampoco hay
necesidad de efectuar el método en presencia de soportes sólidos
(aunque ésta es una opción, como se discute a continuación en la
presente memoria).
Puesto que la sonda está presente a lo largo de
la reacción de amplificación, la señal fluorescente puede permitir
monitorizar la progresión de la reacción de amplificación. Esto
puede proporcionar un medio para cuantificar la cantidad de
secuencia diana presente en la muestra.
Durante cada ciclo de la reacción de
amplificación, las cadenas de amplicón que contienen la secuencia
diana y una región de sonda generan una señal aceptora. A medida que
aumenta la cantidad de dichos amplicones en la muestra, aumentará la
señal aceptora. Al representar la velocidad de aumento con los
ciclos, puede determinarse el punto de partida del aumento.
La sonda marcada puede comprender una molécula de
ácido nucleico tal como ADN o ARN, que hibridará con la secuencia de
ácido nucleico diana cuando esta última esté en forma monocatenaria.
En este caso, la etapa (b) implicará el uso de condiciones que
vuelvan monocatenario al ácido nucleico diana. Como alternativa, la
sonda puede comprender una molécula tal como un ácido nucleico
peptídico u otro análogo de ácido nucleico que se una también a la
secuencia diana en forma bicatenaria.
En particular, la reacción de amplificación
utilizada implicará la etapa de someter la muestra a condiciones en
las que cualquiera de las secuencias de ácido nucleico diana
presentes en la muestra se vuelva monocatenaria, tales como PCR o
LCR. Es posible entonces que la región de sonda hibride con la
región cadena abajo de la cadena de amplicón que la contiene durante
el transcurso de la reacción de amplificación, a condición de
encontrar condiciones de hibridación apropiadas.
En una realización preferida, la sonda puede
diseñarse de tal modo que se satisfagan estas condiciones durante
cada ciclo de la reacción de amplificación. Por tanto, en cierto
punto durante cada ciclo de la reacción de amplificación, la sonda
hibridará con la secuencia diana, y generará una señal como
resultado de la TEF o TEFR. A medida que prosigue la amplificación,
la región de sonda se separará o se fundirá de la secuencia cadena
abajo, y así la señal generada por el marcaje aceptor se reducirá o
aumentará dependiendo de si comprende la molécula donante o
aceptora. Por ejemplo, cuando hay un aceptor, en cada ciclo de
amplificación se genera un pico de fluorescencia por el marcaje
aceptor. La intensidad del pico aumentará a medida que prosiga la
amplificación, porque estarán disponibles más cadenas de amplicón
que incluyen sondas.
Al monitorizar la fluorescencia del marcaje
aceptor de la muestra durante cada ciclo, puede monitorizarse la
progresión de la reacción de amplificación de diversos modos. Por
ejemplo, los datos proporcionados por los picos de fusión pueden
analizarse, por ejemplo, calculando el área bajo los picos de
fusión, y representarse este dato frente al número de ciclos.
La fluorescencia se monitoriza adecuadamente
utilizando un fluorímetro conocido. Las señales de estos, por
ejemplo en forma de voltajes fotomultiplicadores, se envían a una
tarjeta procesadora de datos y se convierten en un espectro asociado
a cada tubo de muestra. Pueden evaluarse a la vez múltiples tubos,
por ejemplo 96 tubos. Los datos pueden recogerse de este modo a
intervalos frecuentes, por ejemplo, una vez cada 10 ms, a lo largo
de la reacción.
Los espectros generados de este modo pueden
resolverse, por ejemplo, utilizando "ajustes" de restos
fluorescentes preseleccionados tales como tintes, para formar picos
representativos de cada resto señalizador (concretamente, marcaje
nucleotídico y/o marcaje de sonda). Pueden determinarse las áreas
bajo los picos, que representan el valor de intensidad para cada
señal, y si es necesario, expresarse como cocientes entre sí. El
diferencial de intensidades de señal y/o relaciones permitirá
registrar los cambios en la TEF o TEFR a lo largo de la reacción o
en diferentes condiciones de reacción, tales como temperaturas. Los
cambios, como se destaca anteriormente, están relacionados con el
fenómeno de unión entre la sonda y la secuencia diana. La integral
del área bajo los picos diferenciales permitirá calcular los efectos
de la TEF o TERF sobre los valores de intensidad.
Estos datos proporcionan un medio para
cuantificar la cantidad de ácido nucleico diana presente en la
muestra.
El reactivo cebador/sonda marcada puede estar
libre en solución o inmovilizado sobre un soporte sólido, por
ejemplo sobre la superficie de una perla tal como una perla
magnética, útil en la separación de productos, o la superficie de un
dispositivo detector, tal como la guía de ondas de un detector de
resonancia de plasmón de superficie. La selección dependerá de la
naturaleza del ensayo particular que se esté considerando y del
medio de detección particular que se esté empleando.
La sonda puede diseñarse de tal modo que se
hidrolice por la ADN polimerasa utilizada en la reacción de
amplificación, liberando así la molécula aceptora. Esto proporciona
una señal acumulativa, aumentando con cada ciclo la cantidad de
marcaje de sonda libre presente en el sistema. Sin embargo, no es
necesario que en este ensayo se consuma la sonda de esta manera, ya
que la señal no depende de la hidrólisis de la sonda.
Adecuadamente, la sonda se diseña de tal modo que
se libera intacta de la secuencia diana, y es así capaz de unirse de
nuevo cuando se satisfacen las condiciones de hibridación adecuadas
durante la reacción de amplificación. Esto puede ser, por ejemplo,
durante la fase de extensión de la reacción de amplificación. Sin
embargo, puesto que la señal no depende de la hidrólisis de la
sonda, la sonda puede diseñarse para hibridar y fundirse con la
secuencia diana en cualquier etapa durante el ciclo de
amplificación. En particular, la sonda se diseñará para hibridar a
temperaturas por encima de la temperatura de extensión de la
reacción, ya que esto asegurará que se minimiza la interferencia con
la reacción de amplificación.
Esto proporciona una señal totalmente reversible
que está relacionada directamente con la cantidad de producto de
amplificación presente en cada etapa de la reacción. Además, es
ventajoso cuando la velocidad de reacción es de la mayor
importancia, por ejemplo en PCR rápida, puesto que una sonda que
esté integrada en la cadena de amplicón que se está detectando será
capaz de hibridar rápidamente con ella.
Los datos generados de este modo pueden
interpretarse de diversos modos. En su forma más simple, un aumento
de la fluorescencia de la molécula aceptora en el transcurso o el
final de la reacción de amplificación es indicativo de un aumento en
la cantidad de secuencia diana presente, lo que sugiere el hecho de
que la reacción de amplificación ha proseguido, y por lo tanto, la
secuencia diana estaba presente de hecho en la muestra. Sin embargo,
como se destacó anteriormente, también es posible la cuantificación
monitorizando la reacción de amplificación en su totalidad.
Finalmente, es posible obtener datos de caracterización, y en
particular el análisis de los puntos de fusión, en forma de una
medida de punto final o en su totalidad, para poder obtener
información sobre la secuencia como se discutirá con detalle a
continuación.
Por tanto, una realización preferida de la
invención comprende un método para detectar la amplificación de
ácido nucleico que se realiza como se describe anteriormente, pero
en el que se detecta cualquier cambio en la fluorescencia durante la
reacción de amplificación, y los resultados se utilizan para
detectar la aparición de una reacción de amplificación de ácido
nucleico. Preferiblemente, la señal fluorescente de la muestra se
monitoriza a lo largo de la reacción de amplificación, y los
resultados se utilizan para cuantificar la cantidad de secuencia
diana presente en la
muestra.
muestra.
La amplificación se lleva a cabo adecuadamente
utilizando un par de cebadores que se diseñan de modo que sólo se
amplifica la secuencia nucleotídica diana en la cadena de ADN, como
es bien entendido en la técnica. La polimerasa de ácido nucleico es
adecuadamente una polimerasa termoestable tal como polimerasa
Taq.
Las condiciones adecuadas en las que puede
llevarse a cabo la reacción de amplificación son bien conocidas en
la técnica. Las condiciones óptimas pueden ser variables en cada
caso, dependiendo del amplicón particular implicado, la naturaleza
de los cebadores utilizados y las enzimas empleadas. Las condiciones
óptimas pueden determinarse en cada caso por el experto. Las
temperaturas de desnaturalización típicas son del orden de 95ºC, las
temperaturas de apareamiento típicas son del orden de 55ºC, y las
temperaturas de extensión son del orden de 72ºC.
En una realización particular de la invención, la
sonda marcada puede utilizarse para cuantificar transcriptos de ARN,
por ejemplo, en experimentos de expresión, que pueden utilizarse en
el descubrimiento de fármacos. En particular, esta realización es
adecuada para estudios de expresión en tejidos de organismos
eucarióticos. El ADN que codifica proteínas en células eucarióticas
puede contener intrones, regiones no codificantes de secuencia de
ADN, y exones que codifican la secuencia proteínica. Las secuencias
de intrón no codificantes se retiran de las secuencias de ARN que
derivan de secuencias de ADN durante los procesos de "ayuste"
celular. Los cebadores de PCR están normalmente dirigidos a regiones
de codificación, y cuando se utiliza PCR de transcriptasa inversa en
extractos de ácido nucleico total, dará como resultado productos
tanto de amplificación dependiente de ADN como de amplificación
dependiente de ARN. Por tanto, la PCR sola, cuando se utiliza para
estudios de expresión, contendrá amplificación como resultado de ADN
genómico y ARN expresado.
Una sonda marcada que se diseña para unirse entre
intrones, a regiones terminales adyacentes de exones de
codificación, tendrá una interacción limitada debido a la región de
intrón. El ARN ayustado tiene estas regiones retiradas y, por lo
tanto, las regiones terminales adyacentes de los exones de
codificación forman una secuencia continua que permite una unión
eficaz de la región de sonda.
A la inversa, la región de sonda puede detectar
sólo un producto de amplificación de ADN genómico si se diseña de
tal modo que se una a una región de intrón. La señal generada por
dicha sonda se referiría sólo a la concentración de ADN y no a la
concentración de ARN de la muestra.
Por tanto, en una realización adicional, la
región de sonda es específica de una región de ayuste de ARN o de un
intrón en ADN, de modo que se detecta y/o cuantifica sólo uno de ARN
amplificado o ADN amplificado.
El método de la invención puede utilizarse en
ensayos de hibridación para determinar características de una
secuencia. Por tanto, en un aspecto adicional, la invención
proporciona un método que comprende (a) amplificar dicha secuencia
utilizando un conjunto de nucleótidos, al menos uno de los cuales
está marcado con un primer marcaje, y un reactivo que comprende un
cebador de amplificación unido, mediante un enlace químico que no es
reconocido por una ADN polimerasa, por su extremo 5' a una sonda que
comprende una secuencia que es similar a la de una región de la
secuencia diana, y que comprende adicionalmente un segundo marcaje,
en la que uno de dichos primer o segundo marcajes es un marcaje
donante y el otro es un marcaje aceptor, siendo capaz el marcaje
donante de donar energía fluorescente al marcaje aceptor; de modo
que forme un producto de amplificación unido, mediante un enlace
químico que no es reconocido por una ADN polimerasa, por su extremo
5' a una región de sonda, (b) someter el producto de amplificación a
condiciones en las que la región de sonda del mismo hibridará con la
región complementaria del producto de amplificación de tal modo que
la energía fluorescente pueda transferirse entre el primer y segundo
marcajes, y (c) monitorizar la fluorescencia de dicha muestra y
determinar una condición de reacción particular, característica de
dicha secuencia, en la que la fluorescencia cambie como resultado de
la hibridación de la región de sonda con la muestra o de la
desestabilización del dúplex formado entre la región de sonda y la
secuencia de ácido nucleico diana.
Las condiciones de reacción adecuadas incluyen
temperatura, electroquímica o la respuesta a la presencia de enzimas
o compuestos químicos particulares. Al monitorizar los cambios de
fluorescencia a medida que varían estas propiedades, puede
conseguirse información característica de la naturaleza precisa de
la secuencia. Por ejemplo, en el caso de la temperatura, puede
determinarse la temperatura a la que la sonda se separa de las
secuencias en la muestra como resultado de calentar. Esto puede ser
extremadamente útil, por ejemplo, para detectar, y si se desea
también cuantificar, polimorfismos y/o variaciones alélicas en
diagnóstico genético. Por "polimorfismo" se incluyen
transiciones, transversiones, inserciones, deleciones o inversiones
que pueden aparecer en secuencias, particularmente en la
naturaleza.
La histéresis de la fusión será diferente si la
secuencia diana varía en sólo un par de bases. Así, por ejemplo,
cuando una muestra contiene sólo una única variante alélica, la
temperatura de fusión de la región de sonda será un valor particular
que será diferente del encontrado en una muestra que contiene sólo
otra variante alélica. Una muestra que contiene ambas variantes
alélicas mostrará dos puntos de fusión correspondientes a cada una
de las variantes alélicas. Se aplican consideraciones similares con
respecto a las propiedades electroquímicas, o en presencia de
ciertas enzimas o compuestos químicos. La sonda marcada puede
inmovilizarse sobre una superficie sólida a la que puede aplicarse
un potencial electroquímico. La secuencia diana cadena abajo se
unirá a o será repelida por la sonda a valores electroquímicos
particulares dependiendo de la naturaleza precisa de la
secuencia.
Además, la cinética de la hibridación de sonda
permitirá la determinación, en términos absolutos, de la
concentración de secuencia diana. Los cambios en la fluorescencia de
la muestra pueden permitir calcular la velocidad de hibridación de
la región de sonda a la muestra. Un aumento de la velocidad de
hibridación se relacionará con un aumento de la secuencia diana
presente en la muestra. A medida que aumenta la concentración de la
secuencia diana cuando prosigue la reacción de amplificación, la
hibridación de la región de sonda aparecerá más rápidamente. Por
tanto, este parámetro puede utilizarse también como base para la
cuantificación. Este modo de procesamiento de datos es útil porque
no se basa directamente en la intensidad de señal para proporcionar
la información.
Aspectos adicionales de la invención incluyen
kits para uso en el método de la invención. Estos kits contendrán
una sonda específica para una secuencia nucleotídica diana que
contiene un marcaje, en particular un marcaje aceptor, unido al
extremo 5' de un cebador de amplificación mediante un engarce que no
es reconocido por una ADN polimerasa. Si se desea, la sonda puede
inmovilizarse sobre un soporte tal como una perla, por ejemplo una
perla magnética, o un soporte utilizando en un detector, tal como la
guía de ondas de un dispositivo detector de ondas evanescentes.
Adicionalmente, los kits pueden contener uno o
más nucleótidos marcados, en particular, nucleótidos marcados
fluorescentemente que son compatibles con dichos marcajes aceptores.
Otros componentes potenciales del kit incluyen reactivos utilizados
en reacciones de amplificación tales como una ADN polimerasa.
El uso de una molécula aceptora no fluorescente
puede utilizarse también en el ensayo descrito en la solicitud de
patente internacional en tramitación junto con la presente nº
PCT/GB990504.
En un ejemplo particular, la invención
proporciona un método para detectar la presencia de una secuencia de
ácido nucleico diana en una muestra, comprendiendo dicho método (a)
someter dicha muestra a una reacción de amplificación utilizando un
conjunto de nucleótidos, al menos uno de los cuales está marcado con
un primer marcaje, (b) poner en contacto el producto de
amplificación con una sonda en condiciones en que la sonda hibridará
con dicha secuencia diana, comprendiendo dicha sonda una segunda
molécula de marcaje, siendo fluorescente uno de dichos primer y
segundo marcajes y siendo el otro una molécula no fluorescente que
es capaz de aceptar energía fluorescente de la misma y (c)
monitorizar la fluorescencia de dicha muestra.
Adecuadamente, el marcaje no fluorescente es
DABCYL, Maruric (rojo de metilo) o un tinte de diarilrodamina
QSY-7. El marcaje no fluorescente es preferiblemente
el segundo marcaje, y se proporciona en la sonda.
La invención se describirá ahora particularmente
a modo de ejemplo con referencia a los dibujos de diagramas adjuntos
en los que
la Figura 1 muestra diagramas de las
interacciones que tienen lugar en el método de la invención.
En la reacción de amplificación ilustrada, se
prepara una molécula de ADN (1) para amplificación poniéndola en
contacto con un par de cebadores de amplificación (2), (3) y un
conjunto de nucleótidos (4), algunos de los cuales están marcados
con un marcaje fluorescente (5). Uno de los cebadores (2) está
ligado a una sonda (6) que incluye un marcaje aceptor (7) mediante
un enlace químico (8).
La molécula de ADN (1) se vuelve monocatenaria
(Figura 1B), tras de lo cual se unen los cebadores (2, 3) como
cebadores de codificación e inverso en una reacción de amplificación
como es bien conocida.
Durante el transcurso de la posterior reacción de
amplificación, se forma un producto amplicón (9) (Figura 1C). Se
incorporan nucleótidos tanto marcados como no marcados al producto a
medida que se forma. Una proporción significativa de las cadenas de
amplicón incluirá una región de sonda marcada (6, 7).
Cuando se funde este producto durante la
posterior fase de amplificación, la región de sonda (6) que
comprende una molécula aceptora (7) se une a la secuencia diana en
la cadena de amplicón (Figura 1D). La interacción de TERF entre los
nucleótidos fluorescentes y la molécula aceptora (7) genera una
señal a la longitud de onda característica del aceptor.
La señal de la molécula aceptora (7) puede
monitorizarse después utilizando dispositivos de detección de
fluorescencia convencionales.
Claims (16)
1. Un método para detectar la presencia de una
secuencia de ácido nucleico diana en una muestra, comprendiendo
dicho método someter dicha muestra a una reacción de amplificación
en la que dicho ácido nucleico diana puede amplificarse, utilizando
un conjunto de nucleótidos, al menos uno de los cuales está marcado
con un primer marcaje, y un reactivo que comprende un cebador de
amplificación que puede hibridar con dicha secuencia diana cuando
está en forma monocatenaria, y que está conectado, mediante un grupo
de engarce químico que no es reconocido por una ADN polimerasa, por
su extremo 5' con una sonda que porta un segundo marcaje, siendo
dicha sonda marcada de una secuencia que es similar a la de dicha
secuencia diana, de tal modo que puede hibridar con una región
complementaria en un producto de amplificación de tal modo que la
energía fluorescente puede transferirse entre el primer y segundo
marcajes, y en el que uno del primer o segundo marcajes comprende un
marcaje donante y el otro comprende un marcaje aceptor,
comprendiendo el marcaje donante una molécula fluorescente que es
capaz de donar energía fluorescente al marcaje aceptor; y
monitorizar la fluorescencia de dicha muestra.
2. Un método según la reivindicación 1, en el que
dicho primer marcaje comprende un marcaje donante y dicho segundo
marcaje comprende un marcaje aceptor.
3. Un método según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que el marcaje aceptor es una molécula
fluorescente que emite energía a una longitud de onda
característica.
4. Un método según la reivindicación 3, en el que
el marcaje aceptor es un tinte de rodamina u otros tintes tales como
Cy5.
5. Un método según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que el marcaje aceptor es un aceptor oscuro
tal como DABCYL, rojo de metilo o un tinte de diarilrodamina
QSY-7.
6. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el nucleótido marcado es un
nucleótido que contiene uracilo marcado.
7. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que todos los nucleótidos
utilizados en la reacción de amplificación están marcados.
8. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la reacción de amplificación
comprende la reacción en cadena con polimerasa (PCR).
9. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la molécula aceptora es una
molécula fluorescente, y en el que se monitoriza la fluorescencia
tanto de la molécula donante como aceptora, y se calcula la relación
entre las emisiones.
10. Un método según la reivindicación 1, en el
que se detecta cualquier cambio de fluorescencia durante la reacción
de amplificación, y los resultados se utilizan para detectar la
aparición de una reacción de amplificación de ácido nucleico.
11. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la señal fluorescente de la
muestra se monitoriza a lo largo de la reacción de amplificación y
los resultados se utilizan para cuantificar la cantidad de secuencia
diana presente en la muestra.
12. Un método según la reivindicación 11, en el
que la amplificación se lleva a cabo utilizando un par de cebadores
que se diseñan de modo que sólo se amplifica la secuencia
nucleotídica diana en una cadena de ADN.
13. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la sonda es específica de
una región de ayuste de ARN o un intrón de ADN, de modo que sólo se
detecta y/o cuantifica uno de ARN amplificado o ADN amplificado.
14. Un método para determinar una característica
de una secuencia, comprendiendo dicho método (a) amplificar dicha
secuencia utilizando un conjunto de nucleótidos, al menos uno de los
cuales está marcado con un primer marcaje, y un reactivo que
comprende un cebador de amplificación unido, mediante un enlace
químico que no es reconocido por una ADN polimerasa, por su extremo
5' a una sonda que comprende una secuencia que es similar a la de
una región de la secuencia diana, y que comprende adicionalmente un
segundo marcaje, siendo uno de dichos primer o segundo marcajes un
marcaje donante y siendo el otro un marcaje aceptor, siendo capaz el
marcaje donante de donar energía fluorescente al marcaje aceptor; de
modo que se forma un producto de amplificación unido, mediante un
enlace químico que no es reconocido por una ADN polimerasa, por su
extremo 5' a una región de sonda, (b) someter el producto de
amplificación a condiciones en las que la región de sonda del mismo
hibridará con la región complementaria del producto de amplificación
de tal modo que la energía fluorescente pueda transferirse entre el
primer y segundo marcajes, y (c) monitorizar la fluorescencia de
dicha muestra y determinar una condición de reacción particular,
característica
de dicha secuencia, en la que la fluorescencia cambie como resultado de la hibridación de la región de sonda con la muestra o de la desestabilización del dúplex formado entre la región de sonda y la secuencia de ácido nucleico diana.
de dicha secuencia, en la que la fluorescencia cambie como resultado de la hibridación de la región de sonda con la muestra o de la desestabilización del dúplex formado entre la región de sonda y la secuencia de ácido nucleico diana.
15. Un método según la reivindicación 14, en el
que la característica determinada es la presencia de un polimorfismo
y/o variación alélica, comprendiendo dicho método amplificar una
secuencia sospechosa de contener dicho polimorfismo o variación
alélica utilizando un método como se define en la reivindicación 14,
midiendo la temperatura a la que la región de sonda se funde de su
secuencia complementaria en el producto de amplificación utilizando
la señal fluorescente generada, y relacionar esto con la presencia
de un polimorfismo o variación alélica.
16. Un kit para uso en el método de una
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende un
reactivo que comprende un cebador de amplificación unido por su
extremo 5', mediante un enlace químico que no es reconocido por una
ADN polimerasa, a una sonda específica de una secuencia nucleotídica
diana, conteniendo dicha sonda un marcaje; y un nucleótido marcado
en el que el marcaje en el nucleótido es capaz de interaccionar con
el marcaje en la sonda.
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