MXPA97005945A - Deteccion de acidos nucleicos utilizando cuartetas g - Google Patents
Deteccion de acidos nucleicos utilizando cuartetas gInfo
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Abstract
La presente invención se refiere a los oligonucleótidos que forman estructura de cuarteta G que se han encontradoútiles en ensayos de fluorescencia para detectar una secuencia seleccionada deácido nucléico- Cuando un extremo del oligonucleótido se marca con un fluoróforo donador y el otro extremo se marca con un colorante aceptor, el desdoblamiento de la molécula en la estructura de la cuarteta G lleva el par donador-aceptor a una proximidad cercana, permitiendo una interacción entre las dos marcas lo cual da como resultado la extinción de la fluorescencia del donador o un cambio en otras propiedades de fluorescencia las cuales son el resultado de la interacción de los dos colorantes en la proximidad cercana. La estructura de la cuarteta G se desdobla con la hibridación a su secuencia complementaria, incrementando la distancia entre las dos marcas colorantes. Esto da como resultado disminución en la extinción del donador o un cambio en otro parámetro de fluorescencia relacionado con la proximidad. El incremento asociado en la intensidad de la fluorescencia del donador o el cambio de otro parámetro de fluorescencia puede ser monitoreado como un indicio de la presencia de una secuencia seleccionada deácido nucléico. De manera alternativa, en algunos casos una disminución en la fluorescencia del aceptor puede ser monitoreada como un indicio de la presencia de la secuencia seleccionada delácido nucléico cuando el aceptor también es un fluoróforo.
Description
DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS UTILIZANDO CUARTETAS
Campo de la invención La presente invención se refiere a los materiales y métodos para detectar los ácidos nucleicos/ y en particular a los materiales y métodos para detectar ios ácidos nucleicos los cuales emplean un cambio medible en la florescencia resultante de un cambio en la distancia entre dos marcas coloridas.
A l l-.^l-.i l-.lM l. JCi ) ¡JE. .Urt. 11M V CJÍM ^ I W La hibridación especifica de la secuencia de las sondas de oligonucieótidos se ha utilizado durante algún tiempo como un medio para detectar e identificar secuencias seleccionadas de nucléotidos, y el etiquetado de estas sondas con marcas fluorescentes ha proporcionado un medio no radiactivo relativamente sensible para facilitar la detección de la hibridación de la sonda. Los métodos de detección recién desarrollados emplean el proceso de transferencia de energia fluorescente ( i'Hf) para la detección de la hibridación de la sondas en lugar de la detección directa de la intensidad de fluorescencia. La transferencia de energia fluorescente se presenta entre un fluoróforo donador y un colorante aceptor (que puede o no ser un fluoróforo) cuando el espectro de absorción de uno (el aceptor) se superpone al espectro de emisión del otro (el donador) y los dos colorantes se encuentran en proximidad cercana. La energia del estado exitado del fiuoróforo donador se transfiere por una interacción de resonancia dipolo-dipolo inducida hacia el aceptor vecino, listo da como resultado la extinción de la fluorescencia en el donador. En algunos casos, si el aceptor también es un fluoróforo se puede mejorar la intensidad de su fluorescencia. La eficiencia de la transferencia de energia depende en gran medida de la distancia entre donador y aceptar, y las ecuaciones que predicen estas relaciones han sido desarrolladas por Lorster (1948, Ann. Phys. , 2. 55-75) .
La ais Lancia entre ios colorantes donador y acepL?r a la cual la eficiencia de la transferencia de energia es 50% se conoce como la distancia t'orster (R,,) . otras propiedades de la fluorescencia también pueden depender de la proximidad de un donador y un aceptor, por ejemplo, la vida media de la fluorescencia del donador y/o aceptor, ia polarización de la fluorescencia y la anisotropia de la fluorescencia. La transferencia de energia y otros mecanismos que dependen de la interacción de dos colorantes en proximidad cercana para producir un cambio en una propiedad de la fluorescencia sori un medio atractivo para detectar o identificar secuencias de nucleotidos conforme estos ensayos puedan ser realizados en formatos homogéneos. Los formatos de ensayos homogéneos son más sencillos que los ensayos de hibridación de ia sonda, convencionales, ios cuales dependen de la detección de la fluorescencia de una sola marca fluorófora, cuando los ensayos heterogéneos por io general requieren pasos adicionales para separar marcas híbridas de marcas libres. For io común, ia TEE y ios métodos relacionados han dependido de la verificación de un cambio en las propiedades de fluorescencia de una o ambas marcas colorantes cuando se juntan mediante ia hibridación de dos oligonucieótidos complementarios. En este formato, el cambio en las propiedades de fluorescencia puede ser medido como un cambio en ia cantidad de transferencia de energia o como un cambio en la cantidad de extinción de ia fluorescencia. En este sentido, la secuencia de nucléotidos de interés puede se detectada sin separación de los oligonucleotidos no híbridos y los hibridos. La hibridación puede ocurrir entre dos oligonucleótidos complementarios individuales, uno de los cuales se marca con un fluoróforo donador y uno de los cuales se marca con el aceptor. En la forma de doble hebra hay fluorescencia disminuida del donador (se incrementa ia extinción) y/o transferencia de energia incrementada en comparación con los oligonucleótidos de una sola hebra. Diversos formatos para los ensayos de hibridación TEE se revisan en Non-isotopic UNA Probé Techniques (1992. Acade ic Press, inc, págs. 311-352) . De manera alternativa, el donador y aceptor pueden ser vinculados a un sólo oligonucieótido de manera que exista una diferencia detectabie en ias propiedades de fluorescencia de uno o ambos cuando ei oiigonucieótido no se hibrida en comparación de cuando se hibrida a su secuencia complementaria. En este formato, por io común se incrementa la fluorescencia dei donador y la transferencia de energia y se disminuyen la extinción cuando el oligonucleótido se hibrida. Por ejemplo, un oiigonucieótido autocompiementario marcado en cada extremo forma una horquilla que lleva los dos fluoróforos (es decir los extremos 5' y 3' ) en proximidad cercana en donde puede ocurrir la transferencia de energia y la extinción. La hibridación del oiigonucieótido autocomplementario a su complemento en un segundo oligonucleótido rompe la horquilla e incrementa la distancia entre los dos colorantes, reduciendo de esta manera la extinción, una desventaja de la estructura de horquilla es que es muy estable y la conversión a la forma hibrida no extinguida suele ser lenta y sólo moderadamente favorecida, dando como resultado un mal desempeño general. Un esquema "de doble horquilla" se describe en . tíagwell, et al. {1994. Nucí . Acids Res . 22 :2424 -2425) . Kramer y Tyagi (1996, Nature, 14:303-308) describe una horquilla con la secuencia detectora en un ciclo entre los brazos de la horquilla. os métodos de la técnica anterior pueden carecer de eficiencia en ia transferencia de energia, y con frecuencia ha sido dificii lograr ia resolución espectral adecuada para detectar cambios significativos en ia fluorescencia. En muchos métodos con extinción de ia fluorescencia del monitor una pequeña cantidad de hibridación produce sólo una pequeña disminución en la fluorescencia, la cual debe ser detectada en presencia de niveles elevados de fondo. Estos métodos también sufren la falta de sensibilidad de la detección. LOS aptámeros son moléculas de AU y AKJM que unen objetivos moleculares específicos. Las grandes poblaciones de oligonucleótidos aleatoriamente generados puede ser enriquecida en aptámeros mediante los procesos de selección y amplificación in vi tro bien conocidos, üe interés particular es un aptámero de ADN de una sola hebra que se une a la trombina (L. C. Bock, et al., 1992, Nature 355 : 564-566) . Se encontró que estos aptameros que se unen a la trombina contienen la secuencia conservada GGNTGGN.- ,GGNTGG (lü SEC NO: 1) e inhiben la formación de coágulo de fibrina catalizado por Lrombiiia. El análisis de la estructura de esta molécula ha manifestado una estructura simétrica que contiene dos tetradas de pares de bases guanosina conectadas por tres ciclos (1993. K. Y. Wang, et al., Biochemistry, 32: 1899-1904; 1993. R.F. Macaya, et ai., PNAS, 90: 3745-3749; 1994. P. Schultze et al., j. Mol . Biol . , 235: 1532-1547; 1996 J. A. Kelly, et al., J. Mol Biol 256: 41 7-422) . Esta estructura característica comunmente se conoce como una "cuarteta G'v o ,?cuadrupiex G". E. Días, et al., (1994. J. Am. Chem. Soc . 116 : 4479-4480) reporta una secuencia semejante en ia que se mantiene ia estructura de ia cuarteta G cuando se incrementa la longitud dei oligonucléotido entre los pares de G. Un fluoróforo es un colorante o porción química que puede hacerse fluorescer. Este incluye colorantes que fluorescen en respuesta a un tratamiento quimico, excitación por luz o sistemas biológicos. Un donador o fluoróforo donador es un fluoróforo que tiene un espectro de emisión de fluorescencia que se supersupone al espectro de absorción del segundo colorante o porción química. una aceptor o colorante aceptor es un colorante u otra porción quimica que absorbe ia luz emitida por un fluoróforo donador .
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN En ia actualidad se ha encontrado que los oligonuclcótidos que forman la estructura de la cuarteta C son útiles para la detección o idetificación de las secuencias nucléotidas utilizando cambios medibles en la fluorescencia resultante de un cambio en la distancia entre dos marcas de colorantes unidas al oligonucleótido, de la cuarteta G (por ejemplo, transferencia de energia o extinción de ia fluorescencia) . Cuando un extremo de ia cuarteta G se marca con un fluoróforo donador y el otro extremo se marca con un colorante aceptor adecuado, ia estructura característica de ia cuarteta G lleva al par donador-aceptor a una proximidad cercana, dando como resultado una interacción entre ias marcas que da origen a la extinción de la fluorescencia del donador. Con la hibridación a un oiigonucieótido complementario, ia estructura de la cuarteta G se desdobla o lineariza. Esto incrementa ia distancia entre ias dos marcas del colorante, dando origen a una disminución en su interacción y una disminución en la extinción de ia fluorescencia (es decir, un incremento en la fluorescencia del donador) lo cual se puede monitorear como un indicio de la presencia de una secuencia seleccionada del ácido nucleico. i el colorante a fonÍO i* 1" att?V-? i ón e» c pn f 1 n oró fn r? o a l- o on a l pnnpo r- a c n ? puede manifestar una disminución en la fluorescencia cuando la cuarteta G se lineariza y se incrementa la distancia entre el donador y el aceptor. si es asi, la disminución en la fluorescencia del aceptor también puede ser medida como un indicio de la presencia de la secuencia seleccionada del ácido nucleico.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura i es una gráfica que ilustra ei incremento en la fluorescencia del donador observada cuando una cuarteta G se hibrida a su secuencia complementaria. La figura 1 muestra los resultados del Ejemplo 2. La figura i es una gráfica que ilustra el incremento en la fluorescencia dei donador cuando un cebador híbrido se extiende a través de una cuarteta G, por medio de io cual se desdobla o lineariza la estructura de ia cuarteta G y se incrementa ia distancia entre ei fiuoróforo donador y ei aceptor. La figura 2 muestra los resultados del Ejemplo 3. La figura 3 también es una gráfica que ilustra el incremento en ia fluorescencia del donador cuando un cebador hibrido se extiende a través de una cuarteta G. La figura 3 muestra los resultados del Ejemplo 4. La figura 4 es una gráfica que ilustra el incremento en la fluorescencia del donador cuando la cuarteta G unida a un fluoróforo donador y un tinte aceptor, se utiliza como una marca detectable en un cebador señal para detectar ia amplificación blanco en una reacción de Amplificación por Desplazamiento de la hebra.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Cuando las estructuras oligonucléotidas de la cuarteta G se marcan en un extremo con un fluoróforo donador y en el otro extremo con un colorante aceptador, proporcionan moléculas detectoras o marcas en las que ia extinción de la fluorescencia es inesperadamente eficiente. Además, se encontró de manera inesperada que ia estructura de la cuarteta G rápidamente se rompió en presencia de la secuencia complementaria a pesar de su elevada estabilidad bajo condiciones normales de laboratorio. El rompimiento de la estructura de la cuarteta G mediante el desdoblamiento o linearización es un indicador altamente especifico de la hibridación dei oiigonucieótido de ia cuarteta G a su complemento, como ocurre en ausencia de ia secuencia complementaria, sin desdoblamiento ni ruptura de ia estructura y la fluorescencia sigue siendo eficientemente extinguida. LOS oligonucleótidos de la cuarteta G, de acuerdo con una modalidad de la invención, tienen la secuencia GGNX GGNY GG 2 GG (ID SEC NO: 2), en donde x, y, y z indican un número vapabxe de nucxsotidos. Mientras que x, y, y z por lo común cada uno son por lo menos cerca de 2, de preferencia alrededor de 2-10, estos segmentos pueden ser más grandes si se desea, cuando estos no afecten la proximidad de los extremos 5' y 3' cn la estructura de la cuarteta G doblada, como se describe a continuación. La estructura de la cuarteta G lleva al extremo 5' del oligonucleótido en proximidad cercana con el extremo 3', y para muchos pares donador y colorante aceptor la distancia entre éstos en la cuarteta G es menor que la distancia Eorster o de otra manera suficientemente cercanos para permitir interacciones colorante-colorante que afecten la intensidad de la fluorescencia de uno o ambos. La posición relativa de los extremos 5' y 3' del oligonucieótido en la estructura de la cuarteta G es, por tanto, la característica esencial para utilizar oiigonucleótidos de ia cuarteta G como moléculas detectoras o marcas en los ensayos de extinción de fluorescencia, y esta proximidad se relaciona con ios cuatro pares de G que son invariantes en ia secuencia oligonucleótid . Las regiones de secuencia variable (es decir, Nv, Ny, N no son cruciales en la presente invención y pueden variar en longitud y secuencia sin romper la estructura característica de la cuarteta G, la cual da a estas moléculas su utilidad en los ensayos de la inventiva. Como una regla general, ias secuencias N variables no deben ser autocomplemantarias y no deben contener residuos G que den como resultado estructuras cuartetas G alternativas dentro de la molécula, LOS oligonucleótidos de la cuarteta G representativos de acuerdo con la invención, de 15-20 nucléotido de longitud, se muestran en los Ejemplos, pero los oligonucleótidos de ia cuarteta G de cualquier longitud que conforme la fórmula general de la ID SEC NO: 2 también son adecuados. El oligonucleótido de la cuarteta G por lo común es de alrededor de 14-30 nucléotidos de longitud.
Ei monitero dei desdoblamiento, iinearización o ruptura de una estructura de cuarteta G marcada en cada extremo tiene algunas ventajas sobre ei monitereo de ia linearización de oligonucieótidos si iiarmente marcados, de 5 la técnica anterior (por ejemplo, las secuencias autocompiementarias) . Primero, como ia cuarteta G no es automcompiementaria, ésta se desdobla con mayor facilidad en presencia del oligonucieótido complementario, proporcionando un cambio más rápido en ia fluorescencia y un resultado dei 0 ensayo más rápido. Además, las cuartetas G múltiples pueden ser incorporadas en un sólo oligonucleótido para amplificar la sena! fluorescente y mejorar el cambio en la intensidad de ia fluorescencia en presencia de una secuencia complementaria. En estas moléculas de cuarteta G 5 multiméricas, la proporción del aceptor al fluoróforo donador puede ser incrementada para mejorar la extinción del donador, por medio de lo cual se proporciona un cambio mayor en la intensidad de la fluorescencia en presencia de la secuencia complementaria. U Muchos pares de colorantes donador/aceptor conocidos en la técnica son útiles en la presente invención. Estos incluyen, por ejemplo, isotiocianato de tluoresceina (FITC)/ isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC) , FITC/Texas Red™ (Sondas Moleculares), FITC/1-p?renbutirato de N-b hidroxisuccini idilo (PYB) , FITC/isotiocianato de eosina (EiTC) , i-pirensuifonato de N-hidroxisuccinimidilo (PYS)/FITC, FITC/Rodamma X, FITC/tetrametilrodamma (TAMRA) y otros. La selección de un par donador/aceptor particular no es crucial. ólo es necesario que las longitudes de onda 5 de emisión dei fluoróforo donador se superpongan con ias longitudes de onda de absorción del aceptor, es decir, debe haber suficiente superposición espectral entre el donador y el aceptor para permitir extinción de fluorescencia. El ácido p (dimetiiaminofeniiazo) benzoico (UABC?I) es un iü colorante aceptor no fluorescente que extingue efectivamente la fluorescencia de un fluoróforo adyacente, por ejemplo, fluoresceina o 5- (2'aminoetii) aminonaftaleno (EDANS) . El donador o el aceptor pueden estar en cualquier extremo 5' o 3' del oligonucleótido de la cuarteta G. Ciertos pares lb donador/aceptor se ejemplifican en lo anterior y en los siguientes Ejemplos, sin embargo, otros serán evidentes para los expertos en la técnica también son útiles en la invenció . Los métodos de marcado 5' -terminal y 3' -terminal 0 también son conocidos en la técnica y pueden utilizarse para unir los colorantes donador y aceptor a sus respectivos extremos del oiigonucleótido de la cuarteta G. Por ejemplo, los métodos dei marcado 3' -terminal incluyen: a) la oxidación con peryodato de un ribonucleótido 3' -terminal 5 seguida por la reacción con una marca que contiene amina, b) adición enzimatica de un nuciéotido que contiene amina 3'- aüfatica utilizando desoxinucleotidil transferasa terminal seguida por ia reacción con una marca reactiva a ia amina, y c) ia oxidación con peryodato de un ribonucleótido 3' seguido por la reacción con i, 6-hexanodiamina para proporcionar una amina alifática 3' -terminal que puede hacerse reaccionar con marca reactiva a ia amina. Los ejemplos de ios métodos de marcado 5' -terminal incluyen: a) la oxidación con peryodato de un ribonucieótido acopiado 5' a 5' seguido por ia reacción con una marca que contiene amina, b) la condensación de etilendiamina con un pclinucle?tido fosforilado en 5' seguido por la reacción con una marca reactiva a la amina, y e) la introducción de un sustituyente amina alifatica utilizando un reactivo fosfito de aminohexilo en la sintesis del ADN en fase sólida, seguido por la reacción con una marca reactiva a la amina. Las as t am i Ol1 de'r? S°r im i Ha s a l n c n i i ítnnn 1 oñl- ? Hnc ? I IM sintéticos en sitios internos o terminales específicos utilizando reactivos nuciéotido fosforamidita que contienen amina alifática. La selección de un método adecuado para unir las marcas seleccionadas al oligonucleótidos de la cuarteta G y realizar las reacciones de enlace son rutina en la técnica. También se debe entender que la presente descripción de marca en los extremos 5' y 3' de ia estructura de ia cuarteta G se propone para que incluya más marcas que estén cercanas a los extremos, es decir, no unidas a los nucléotidos extremos sino suficientemente cerca de ios extremos para que ocurra ia extinción en la estructura de la cuarteta G. El enlace de los aceptores y ei donador por io común es entre alrededor de ios nucléotidos 2-4 dei nuciéotido terminal. Solo se requiere ia verificación rutinaria para determinar que las uniones del par donador/aceptor cerca de ios extremos b' y 3' del oiigonucieótido de ia cuarteta G proporcionen extinción de ia fluorescencia del donador en ia estructura de ia cuarteta G doblada. Además, cuando la secuencia de la cuarteta G está contenida o unida a una sonda oiigonucieótida más grande para uso como una molécula o marca detectora (como en el Ejemplo 3) el donador o el aceptor o ambos pueden estar unidos a un nucleotido interno en la sonda, el cual se encuentre en o cerca del extremo de la secuencia que forma la estructura de la cuarteta G. Estos enlaces pueden ser nucleotidos que se encuentren dentro de la secuencia que forma la estructura de la cuarteta G o pueden ser nucleotidos que se encuentren en o cerca del extremo de la secuencia de la cuarteta G en la porción de la sonda del oligonucleótido (es decir, fuera de la secuencia de la cuarteta G) . Se considera que todos estos enlaces se encuentran en o cerca del extremo de la secuencia o estructura de la cuarteta G. Pueden emplearse pruebas de rutina para determinar qué nuciéotidos en o cerca de ios extremos de ia cuarteta G son adecuados para enlazar fiuoróforos donadores y colorantes aceptores para lograr ia extinción del donador en las sondas. Los oligonucleótidos de la cuarteta G marcados, de acuerdo con la invención, pueden utilizarse en una variedad de ensayos para la detección o identificación de las secuencias seleccionadas del ácido nucleico. La característica esencial de estos ensayos es que ia estructura de ia cuarteta G se desdobla o lineariza en una forma que depende de la presencia de la secuencia seleccionada del ácido nucleico. Este proceso da como resultado un incremento detectable en la fluorescencia del donador debido a la disminución de la extinción. No es necesario que el donador se extinga por completo antes de la ruptura de la cuarteta G, cuando el ensayo sólo depende de un cambio en la intensidad de la fluorescencia dei donador de magnitud suficiente para ser detectada como un indicio de la presencia de ia secuencia seleccionada del ácido nucleico. Aunque cualquier medio que rompa específicamente las secuencia de la estructura de la cuarteta G es útil en la invención, se proporcionan ciertos ejemplos. La ruptura de la estructura mediante el desdoblamiento o linearización puede lograrse mediante la hibridación de la cuarteta G al complemento de la secuencia de la cuarteta G. i el complemento de ia cuarteta G es ia secuencia que se va a detectar, o si la secuencia seccionada del ácido nucleico contiene ei complemento de la cuarteta G puede utilizarse un incremento en ia intensidad de ia fluorescencia del donador con la hibridación de ia cuarteta G marcada para detectar directamente ia secuencia seleccionada del ácido nucleico. Sin embargo, si la secuencia que se va a detectar no contiene- una secuencia complementaria para la cuarteta G, deben emplearse otros métodos para desdoblar ia cuarteta G en una forma especifica de ia secuencia. Por ejemplo, la cuarteta G marcada puede estar unida al extremo 5' de una sonda detectora que se hibrida al extremo 3' de ia secuencia del ácido nucleico que se va a detectar o identificar, de manera que la cuarteta G forma una saliente 5' . con la hibridación, la secuencia seleccionada del ácido nucleico y la sonda detectora se hacen en doble hebra mediante una poli erasa que utiliza el segmento híbrido de la secuencia seleccionada del ácido nucleico como un sitio cebador. La extensión de la secuencia seleccionada del ácido nucleico utilizando la sonda detectora con la cuarteta G como una plantilla hace que la estructura de la cuarteta G se desdoble y linearice conforme se sintetiza la secuencia complementaria por medio de este segmento de la sonda detectora. El incremento resultante en la fluorescencia del donador indica la presencia de la secuencia a la cual se hibrida la sonda detectora. De manera alternativa, ei oligonucieótido de ia cuarteta G marcada puede unirse al extremo 5' de un sólo cebador como se describe en ia solicitud de la Patente Europea 0 678 582 publicada. Después de la hibridación del cebador señal a la secuencia nucléotida seleccionada, la extensión y el desplazamiento producen un producto secundario de la amplificación, de una sola hebra, el cual comprende la cuarteta G en el extremo 5' . n.ste producto de amplificación secundario se hibrida a un segundo cebador de amplificación y la extensión del segundo cebador de amplificación hibrido por medio de ia polimerasa se convierte en el producto de amplificación secundario, que incluye la cuarteta G de doble hebra. Es decir, conforme se sintetiza el complemento del producto secundario de la amplificación a través de la región de la estructura de la cuarteta G unida, la cuarteta G se desdobla y oo incrementa la distancia entre las dos marcas . La intensidad de la fluorescencia mejorada del fluoróforo donador indica la presencia de los productos de amplificación secundarios de doble hebra y la presencia de la secuencia seleccionada del ácido nucleico (es decir, la secuencia blanco que se va a amplificar) . Por supuesto, en cualquiera de los ensayos de ia inventiva una disminución en la fluorescencia de un fluoróforo aceptor puede ser monitoreada como un indicio de la presencia de la secuencia seleccionada dei ácido nucleico en lugar de un incremento en ia fluorescencia del donador si ei aceptor es un fiuoróforo que responde en esta forma a la distancia incrementada del donador. El desdoblamiento de la ruptura de la estructura de la cuarteta G, de acuerdo con la invención, puede ser detectada o monitoreada por medios diferentes a las propiedades de fluorescencia que se incrementan o disminuyen conforme cambia ia proximidad del donador y ei aceptor. por ejemplo, ia extinción del donador disminuye su intensidad de fluorescencia pero también puede producir una disminución en la vida media de su fluorecencia (es decir, el tiempo entre la excitación y emisión) . conforme ia intensidad de fluorescencia del donador se incrementa en la cuarteta G desdoblada, ia vida media de fluorescencia del donador también puede incrementarse y ser detectada como una alternativa para detectar la extinción disminuida del donador (intensidad de fluorescencia incrementada) . De la misma manera, la polarización de fluorescencia puede cambiar conforme cambia la distancia entre ios dos colorantes. El cambio en el volumen molecular asociado con la conversión del oligonucleótido de la cuarteta G desde ia forma de una sola hebra a una doble hebra contribuye en los cambios en la polarización de fluorescencia, pero la polarización de fluorescencia también puede ser influida por el cambio en la proximidad de ios dos colorantes. Los cambios en ia polarización de la fluorescencia o anisotropia, por tanto, pueden ser también una alternativa útil para monitorear o detectar el rompimiento de ia cuarteta G.
EJEMPLO 1 Los 15-meros (GGTTGGTGTGGTTGG, ID SEC NO: 3) y ia secuencia de 20-meros- (GGTTTTGGTTTTGGTTTTGG, ID SEC NO: 4) de ios oligonucleótidos de la cuarteta G y sus complementos se sintetizaron mediante ios métodos convencionales. Las mediciones del espectro de dicroismo circular (DC) para la secuencia de los 15-meros y de 20-meros fueron muy semejantes y difirieron considerablemente de los ADN de doble hebra y de doble hebra de longitud comparable ios cuales no suponen la estructura de la cuarteta G (L. B. McGown, et al., nov 1, 1995, Anal . Chem. págs . 663A-668A) esto confirmó que ambos oiigonucieótidos se doblan de manera eficiente en cuartetas G. Los oiigonucleótidos se marcaron en el extremo 5' con fluoresceina (donador) y en el extremo 3' con tetrametil rodamina (TAMKA) o rodamina -x (ROX) . Los oligonucleótidos de la cuarteta G marcados solo en el extremo 5' o en el extrermo 3' con fluoresceina sirvieron como co troles no extinguidos, \ >e fi ?orescei na 5' se unió durante a sintesis del oligonucieótido utilizando el reactivo 6-EAM (ABI) . En el extremo 3' la fluoresceina se unió mediante ei uso de un derivado de fiuoresceina inmovilizado en el material de ia columna CPG (Glen Research, steriing, VA) . se unieron otros colorantes diferentes de la fluoresceina al extremo 3' dei oligonucleótido a través de sus esteres HS a los eniazadores aminoaiquiio utilizando una estrategia CPG semejante. Los oiigonucieótidos marcados fueron purificados eliminando ei colorante que no reaccionó con cromatografía para ia exclusión dei tamaño (columna de iM?r-5, Pharmacia) y mediante la emulsión a través de un cartucho de OPC (AB1) . Las concentraciones de los oligonucleótidos marcados se obtuvieron de la abssrbancia calculada a 260 nm corregida para la absorbancia del colorante a la misma longitud de onda. El espectro de fluorescencia se analizó utilizando un espectrofluorómetro grado investigación SLM-Aminco 8100 o un fluorómetro EPM-Í (Jolley Consulting) equipado con filtros para la excitación y emisión de ia fluoresceina. El oiigonucleótido marcado con el colorante (2-10 mM) se añadió a una solución amortiguadora que consiste en 20 mM de acetato de TRIS, 10 mM Nací, 5 mM ?cl, 1 mM cacl,, y 1 mM Mgcl, a pH 7.5, a temperatura ambiente (alrededor de 24-26°C) . La secuencia complementaria se añadió en un exceso molar de 1.5 veces más o mayor y las mediciones finales fueron tomadas cuando ya no hubo más cambio en el espectro de la fluorescencia. Esto por lo común tarda menos de 30 minutos. El cambio en la intensidad dei donador se determinó a ia longitud de onda de emisión de ia fiuoresceina (alrededor de 520 nm) con excitación a 485 o 488 nm. Ei porciento de extinción se determinó por comparación con una secuencia semejante marcada sólo con fluoresceina en el extremo 5' . Los resultados se muestran en la siguiente tabla: Longitud Colorante Colorante dei Extinción incremento dei dei donador aceptor en 3' (tt) de aptamero en 5' intensidad (emisión dei donador)
-mero fluoresceina rodamina-x 25 9x
-mero fluoresceina TAMRA 60 5X
-mero fluoresceina fluoresceina NA 2.5X
-mero fluoresceina TAMRA 30 2.4X
-mero fluoresceina fluoresceina NA 1.7X
Con la hibridación, los incrementos fácilmente detectables en la intensidad de la fluorescencia se observaron en todos ios pares colorante donador/aceptor y ambos oligonucleótidos después de la hibridación. El donador de fluoresceina y el aceptor de rodamina-X en el aptámero-15 dio como resultado el mayor incremento (9 veces), pero la disminución esperada en la emisión del aceptor (ROX) fue más pequeña que ia prevista (menos del doble) esto sugiere que algo de la extinción de la fluorescencia puede ser debida a mecanismos diferentes de ia transferencia de energia Eorster. Los resultados reportados en ia tabla anterior muestran ei incremento en la emisión dei donador. in embargo, con suficiente cambio, una disminución en ia emisión del aceptor bien puede utilizarse para monitorear la ruptura de ia cuarteta G después de la hibridación. Esto daria un gran desplazamiento stokes efectivo, si la excitación fuera a la longitud de onda del donador pero la emisión fuera monitoreada a ia longitud de onda del aceptor. Esta configuración también da como resultado menos inte ferencia dei fondo de la muestra. LOS cambios en ia polarización de fluorescencia con la hibridación de la ID SEC NO:3 (fluoreseina 5' , TAMRA 3') se monitorearon también bajo condiciones experimentales semejantes. Con la excitación del donador a 475nm y la emisión monitoreada a 585 nm, la polarización de fluorescencia se incrementó de 62 a 138 mP con la hibridación del complemento.
EJEMPLO 2 En un experimento semejante al ejemplo 1, se añadieron cantidades cada vez más grandes del oligonucleótido complementario del aptámero-15 a la lü SEC NO: 3 marcada en el extremo 5' con fluoreseina y en el extremo 3' con ROX. La secuencia complementaria se añadió en equivalente 0.5 molares, equivalente molar 1.0, equivalentes molares iO y equivalentes molares 30 de ia lü SEC No: 3. La ausencia del oligonucieótido complementario proporcionó ias lecturas de fluorescencia en ia linea base. Después de ia adición del oligonucieótido complementario, ias muestras fueron incubadas a temperatura ambiente durante 5 minutos. Los colorantes se excitaron a 485 nm y se registraron ios espectros de emisión. La emisión a 520 nm se incrementó con cantidades cada vez más grandes dei complemento: 2 veces (0.5 equivalentes), 5 veces (i.O equivalentes), 8 veces (10 equivalentes) y 9 veces (30 equivalentes) . El desdoblamiento de más cuartetas G y mayores reducciones en la extinción, por tanto, ocurre conforme más del oligonucleótido complementario se hibrida. Esto sugiere que el método puede ser semicuantitativo, o posiblemente cuantitativo, y útil como un medio para calcular ia cantidad de la secuencia de nucleótido seleccionada ^resente en una muestra o '^ar comparar cantidades relativas de la secuecia seleccionada en diferentes muestras.
EJEMPLO 3 e añadió una secuencia en la cuarteta G al extremo 5' de una sonda para detección de los organismos Chlamydia. La secuencia se marcó con 6-EAM en el extremo 5' y con ROX en TAMBIÉN-16 como sigue (ID SEC No:5): i - GTTGGTGTGGTTGGT*CTAGAGTCTTCAAATATCAGAGCTTTACCTAACAA
E=fluoreseina t*=dt con enlazador amino-Cb a ROX (Rodamina X) La sonda se sintetizó en un sintetizador ABI 380 tí con reactivo 6-EAM de ABI y ei enlazador amino en c6 dei di' de Gien Research se insertó en la posición indicada. Después de la desprotección, el oiigonucieótido impuro se purificó por HPLC (CLAP) en fase inversa utilizando una columna de Ci8 Delta Pak 300 A C18 3.9 X 150 mm utilizando un solvente con graviente lineal desde 2¿ hasta 30v¿ de acetonitriio en TEAA 5ümM durnate 30 in. La mitad de esto (0.5 µ mol) se disolvió en 100 µL de solución amortiguadora carbonato/bicarbonato de sodio 100 mM a pH 8 y 30 µL de una solución DMSO de ROX/ester NHS bmg/60 µL (ABI/Perkin El er) fue añadida. La mezcla resultante se dejó en reposo en la oscuridad durante 24 horas a 35°c y se pasó sobre una columna de G-25 SEPHAÜEX Resin (NAPS, Pharmacia tíiotech) eluyendo con TAE 4mM (acetato de TRIS 4mM, EUTA 0.1 mM pH 8.0). este producto se purificó por HPLC como se describió en lo anterior, se sintetizó un oligonucleótido no marcado ID SEC NO: 6 mediante los métodos convencionales para servir como un blanco para la hibridación de ia lü SEC NO: 5 y como cebador para la extinción utilizando la ID SEC NO: 5 como plantilla. Este oligonucleótido (TTGTTAGGTAAAGCTCTGATATTTGAAG) fue complementario para el extremo 3'" de ia sonda. Se prepararon 4 cubetas o celdas de 100 µL con ia sonda fluorescente 20 nM, 40 mM K?P0, 5 mM Mg(OAc)2, Ü .2 mM cada uno de trifosfato de desoxinucleosido, 1.4 mM de aifa-tio-dCTP, 5% de giiceroi y 0, 0.2, 1.0 o 10 equivalentes del oligonucleótido blanco y se colocaron en un fluorometro SLM 8100 con la cámara de muestreo precalentada a 53°C. Se añadió polimeraza Bst (New England BioLabs, 2b U/100 µL) a cada muestra y se midió ia intensidad de la fluorescencia durante el tiempo para las cuatro muestras. La excitación fue a 484 nm (rendija a 4 nm/4nm) y la emisión se estableció a b2ü nm (rendijas a lünm/lOnm) . Los resultados se muestran en la Figura 2. El incremento en la fluorescencia del donador en presencia de un blanco indica la no extinción resultante de un incremento en la distancia entre los dos fluoróforos conforme se sintetiza el complemento y la cuarteta G se desdobla y se lineariza. La magnitud del cambio en la fluorescencia incrementa con cantidades cada vez más grandes del blanco, lo cual indica por lo menos un ensayo semicuantitativo. Además, la Figura 2 ilustra que existe una velocidad más rápida de incremento cuando está presente más blanco. Esto inidica la utilidad para la detección en tiempo real de los ácidos nucleicos utilizando la extensión del cebador para la ruptura de la cuarteta G, posiblemente de una manera semicuantitativa, en reacciones de ia SÜA U otros ensayos basados en la extensión de un cebador hibrido.
EJEMPLO 4 una sonda para la detección del elemento de insersión lSfoiiÜ de Mycobacteri um tuberculosis unido a una cuarteta G en el extremo 5' se probó en un ensayo de extensión del cebador semejante al ejemplo 3. La sonda detectora se marcó en el extremo b' con 6-FAM y con TAMRA en TAMBIÉN-16 como sigue (lü SEC NO:7): F-GGTTGGTGTGGTTGGT*TTATCCGTATGGTGGATAACGTCTTTCA t-fluorescencia T*= dT unido a TAMRA El oligonucleótido complementario para el extremo 3' de la sonda detectora fue la lü SEC NO: 8 (GACGTTATCCACCATACGG) . El experimento se realizó a 55°c co o en el ejemplo 3, con 0, 0.1 y 1.0 equivalentes de la u SEC NO: 8 presentes. La Figura 3 muestra un incremento en la fluorescencia del donador en presencia de un blanco, -isto se debe al incremento en la distancia entre el donador y el aceptor de la sonda detectora conforme la secuencia complementaria se sintetiza utilizando el oligonucleótido blanco hibrido como un cebador, A mayor cantidad de blanco presente, mayor magnitud de incremento en la fluorescencia, ue nuevo, una velocidad más rápida de incremento en la fluorescencia se observó cuando estuvo presente más blanco. En este experimento, la magnitud del cambio en la fluorescencia con un incremento de 10 veces en ei blanco fue significativamente mayor que en ei ejemplo 3, lo cual sugiere que este puede ser un sistema de ensayo más sensible. Los ejemplos 3 y 4 muestran la característica esencial para el uso de las cuartetas G como marcas o moléculas detectoras sobre ios cebadores señal en ia SÜA y otras reacciones de amplificación, es decir, la capacidad de un cebador de amplificación para hibridar a un cebador señal con una cuarteta G en su extremo 5' y ser extendido a través de la cuarteta G por medio de lo cual se rompe la estructura de la cuarteta G y se incrementa la distancia entre donador y aceptor. La disminución en la interacción dependiente de la proximidad entre las dos marcas da origen a un cambio medible en la fluorescencia de una o ambas marcas. Esto se demostró en una relación SUA realizada en general como se describe en EP 0 684 315. Las reacciones de amplificación se realizaron a 55°c utilizando Aval como la endonucleasa de restricción y la lü SEC No: 7 como el cebador señal. El AUN Genómico del MÁS. Tuberculosis se añadió como el blanco para la amplificación, l,os resultados se muestran en la ig?ra 4, La fluorescencia del donador permaneció constante a ün nivel inferior duante el tiempo en la reacción de control que no contenia blanco. En ias reacciones de amplificación que contienen blanco (10, 100 o Í000), la fluorescencia del donador se incrementó en una forma medible duante el tiempo conforme se amplificó el blanco. Estos resultados indican que el cebador señal se extendió, se desplazó y se convirtió en una doble hebra como resultado de una amplificación del blanco y que la secuencia de la cuarteta G en el cebador señal fue desdoblada conforme este proceso ocurria. Un incremento en ia fluorescencia conforme ia estructura de la cuarteta G se rompe en una forma especifica de la amplificación del blanco es, por tanto, un método útil para detectar la amplificación del blanco. Además, la velocidad de incremento en la intensidad de fluorescencia del donador es más rápida conforme se incrementan las cantidades iniciales del blanco. La velocidad de incremento en la intensidad de fluorescencia del donador (es decir, la velocidad de disminución en la extinción del donador) es por tanto un indicio por lo menos semicuantitativo de la cantidad inicial de blanco en la muestra y también puede utilizarse para comparar las cantidades iniciales relativas del blanco contenido en muestras múltiples.
LISTA DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: Pitner, Bruce vonk, Glenn p. Nadeau, James G. (ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS UTILIZANDO CUARTETAS G. (iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 7. (iv) DOMICILIO POSTAL: (A) DESTINATARIO: Richard J. Rodrick, tíecton Dickinson and Company. (tí) CALLE: 1 tíecton urive. (C) CIUDAD: Franklin Lakes (u) STADO: NJ (E) PAÍS: E.U. (F) C.P: 07417 (V) FORMA LEGIBLE Dt\ COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco Flexible (tí) COMPUTADORA: PC compatible con itíM (C) SITEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patcntln Rclcasc # 1.0, versión ff 1.30. ( i) FEC1LA DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NÚMERO DE SOLICITUD: <B) FECHA DE PRESENTACIÓN (C) CLASIFICACIÓN: (viii) INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE : (A) NOMtíRE: Fugit, Donna R. (B) NÚMERO DE REGISTRO: 32, 135 (C) REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: P-3376
(2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 13 pares de bases (B) riPü: ácido nucleico (C) HEtíRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (XI) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 3: GGTTGGTGTG GTTGG (2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC NO: 4: (I) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (tí) TIPO: ácido nucleico (C) HEtíRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal ( i) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 4: GGTTTTGGTT TTGGTTTTGG (2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 51 pares de bases (tí) TIPO: ácido nucleico (C) HEtíRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 5: GGTTGGTGTG GTTGGTCTAG AGTCTTCAAA TATCAGAGCT TTACCTAACA A (2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 28 pares de bases (tí) IPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (Xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 6: TTGTTAGGTA AAGCTCTGAT ATTTGAAG (2) INFORMACIÓN DE LA ID SEC NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 44 pares de bases (tí) TIPO: ácido nucleico (O HEtíRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (Xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 7: GGTTGGTGTG GTTGGTTTAT CCGTATGGTG GATAACGTCT TTCA
Claims (10)
- REI I DICACIONES 1. un oligonucleótido que forma una estructura de cuarteta G, el oligonucleótido con un primer extremo marcado con un fluoróforo donador y un segundo extremo marcado con un aceptor, el fluoróforo donador y el aceptor se seleccionan de manera que la fluorescencia del fluoróforo donador se extinga por ei aceptor cuando el oligonucleótido forme la estructura de cuarteta G y la extinción de la fluorescencia dei fiuoróforo donador se reduce con ei desdoblamiento de la estructura de la cuarteta G. 2. El oligonucle?tido de la reivindicación 1 consiste en la
- ID SEC No: 2, lü SEC No:3, 1U SEC No:4, 1U SEC No : 5 O ID SEC
- No: marcadas con el fluoróforo donador y el aceptor. 3. El oligonucleótido de la reivindicación 1 en donde el fluoróforo donador el fluorescencia y el aceptor se selecciona del grupo que consiste en tetrametilrodamina, Texas Red1'14, 1-pirenbutirato de N-hidroxisuccinimidilo, eosina, 1-pirensulfonato de N-hidroxisuccinimidilo (PYS) , Rodamina x, tetrametilrodamina y ácido p- (dimetilaminofenilazo) benzoico.
- 4. Un método para detectar o identificar una secnancia de ácido nucleico seleccionada que comprende: a) proporcionar una sonda que consta de un oligonucleótido el cual forma una estructura de cuarteta G, teniendo la estructura de cuarteta G un primer extremo marcado con un fluoróforo donador y un segundo extremo marcado con un aceptor de manera que la fluorescencia del fluoróforo donador se extingue mediante el aceptor cuando el oligonucieótido forma la estructura de cuarteta G y la extinción de la fluorescencia del fluoróforo donador se reduce con el desdoblamiento de la estructura de la cuarteta G; b) si está presente en la secuencia seleccionada del ácido nucleico, ia conversión del oiigonucieótido en una doble hebra, por medio de lo cual el desdoblamiento de la estructura de la cuarteta G y la reducció de la extinción de la fluorescencia del fluoróforo donador; y c) la detección de la fluorescencia incrementada del fluoróforo donador o la fluorescencia disminuida del aceptor como un indicio de la presencia de la secuencia seleccionada del ácido nucleico.
- 5. El método de la reivindicación 4, en donde el oligonucleótido se convierte en una doble hebra mediante la hibridación a una secuencia complementaria.
- 6. El método de la reivindicación 4 en donde el oligonucleótido se convierte en una doble hebra mediante la síntesis de una secuencia complementaria utilizando el oligonucleótido como plantilla.
- 7. El método de la reivindicación 4 en donde el fluoróforo donador es fluorescencia y el aceptor se selecciona del grupo que consiste en tetrametil rodamina, Texas Redli, 1-pirenbutirato de N-hidroxisuccinimidiio, erosina, 1-pirensulfonato de N-hiroxisuccinimidiio (P?S) , Rodamina x, tetrametilrodamina y ácido p- (dimetilaminofenilazo) benzoico.
- 8. El método de la reivindicación 4, en donde la secuencia del ácido nucleico que se va a detectar o identificar es un producto de una reacción de amplificación del ácido nucleico.
- 9. un método para detectar o identificar una secuencia seleccionada de ácido nucleico que consta de: a) proporcionar una sonda que contenga un oligonucleótido el cual forme una estructura de cuarteta G, teniendo la estructura de la cuarteta G un primer extremo marcado con un fluoróforo donador y un segundo extremo marcado con un aceptor; b) si está presente la secuencia seleccionada del ácido nucleico, la conversión del oligonucleótido en doble hebra, mediante el desdoblamiento de la estructura de cuarteta G y el incremento en la distancia entre el fluoróforo donador y el aceptor; y c) la detección de un cambio en una propiedad de fluorescencia asociada con la distancia incrementada entre el fluoróforo donador y el aceptor como un indicio de la presencia de la secuencia seleccionada del ácido nucleico.
- 10. Ei método de la reivindicación 9, en donde se detecta un cambio en la intensidad de la fluorescencia, ia vida media de la fluorescencia, la polarización de la fluorescencia o anisotropia de fluorescencia. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a los oligonucleótidos que forman estructura de cuarteta G que se han encontrado útiles en ensayos de fluorescencia para detectar una secuencia seleccionada de ácido nucleico. Cuando un extremo del oligonucieótido se marca con un fluoróforo donador y el otro extremo se marca con un colorante aceptor, el desdoblamiento de la molécula en la estructura de la cuarteta G lleva al par donador-aceptor a una proximidad cercana, permitiendo una interacción entre las dos marcas lo cual da como resultado la extinción de la fluorescencia del donador o un cambio en otras propiedades de fluorescencia las cuales son el resultado de la interacción de los dos colorantes en la proximidad cercana. La estructura de la cuarteta G se desdobla con la hibridación a su secuencia complementaria, incrementando la distancia entre las dos marcas colorantes. Esto da como resultado disminución en la extinción del donador o un cambio en otro parámetro de fluorescencia relacionado con la proximidad. El incremento asociado en la intensidad de la fluorescencia del donador o el cambio en otro parámetro de fluorescencia puede ser onitoreado como un indicio de la presencia de una secuencia seleccionada de ácido nucleico. De manera alternativa, en algunos casos una disminución en la fluorescencia del aceptor puede ser monitoreada como un indicio de la presencia de la secuencia seleccionada del ácido nucleico cuando el aceptor también es un fluoróforo.
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