JP3061372B2 - Ｇ−四量体を用いた核酸の検出 - Google Patents

Ｇ−四量体を用いた核酸の検出

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は核酸を検出するため
の物質と方法、特に２つの色素レベルの間の距離の変化
に由来する蛍光の測定可能な変化を用いる核酸を検出す
るための物質と方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】オリゴヌクレオチドプローブの配列特異
的ハイブリダイゼーションは特定のヌクレオチド配列を
検出し、同定するための手段として長い間用いられてお
り、蛍光ラベルによるこのようなプローブの標識はプロ
ーブハイブリダイゼーションの検出を促進するための比
較的敏感な非放射性手段を提供してきた。最近開発され
た検出方法は蛍光強度の直接検出ではなく、プローブハ
イブリダイゼーションの検出のために蛍光エネルギー転
移（ＦＥＴ）プロセスを用いている。一方（アクセプタ
ー(acceptor)）の吸収スペクトルが他方（ドナー(dono
r)）の放出スペクトルとオーバーラップし、これらの２
種類の色素(dye)が密接しているときに、ドナー発蛍光
団とアクセプター色素（発蛍光団(fluorophore)であっ
ても、なくてもよい）との間で蛍光エネルギー転移が生
ずる。ドナー発蛍光団の励起状態エネルギーが共鳴双極
子誘導双極子相互作用によって隣接アクセプターに転移
される。これはドナー蛍光の消光（quenching）を生じ
る。場合によっては、アクセプターも発蛍光団であるな
らば、その蛍光の強度が強化されうる。エネルギー転移
の効率はドナーとアクセプターとの間の距離に非常に依
存し、これらの関係を予測する式がＦｏｒｓｔｅｒ（１
９４８，Ａｎｎ Ｐｈｙｓ．２：５５〜７５）によって
開発されている。エネルギー転移効率が５０％であると
きのドナー色素とアクセプター色素との間の距離はＦｏ
ｓｔｅｒ距離（Ｒ0）と呼ばれる。例えば、ドナー及び
／又はアクセプターの蛍光寿命、蛍光偏光及び蛍光異方
性のような、他の蛍光特性もドナーとアクセプターとの
至近距離に依存する。
【０００３】密接した２つの色素の相互作用に依存し
て、蛍光特性の変化を生じるエネルギー転移及びその他
の機構は、ヌクレオチド配列を検出又は同定するための
魅力的な手段である、というのはこのような分析を均質
なフォーマット(format)中でおこなうことができるから
である。不均質な分析は一般にハイブリダイズしたラベ
ルを遊離ラベルから分離するための付加的な工程を一般
に必要とするので、均質な分析フォーマットは、単独の
発蛍光団ラベルの検出に依存する慣用的なプローブハイ
ブリダイゼーション分析よりも簡単である。典型的に、
ＦＥＴと関連方法は、色素ラベルが２つの相補的オリゴ
ヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって一緒に
なるときの色素ラベルの一方又は両方の蛍光特性の変化
をモニターすることに依存している。このフォーマット
では、蛍光特性の変化がエネルギー転移量の変化又は蛍
光消光量の変化として測定されることができる。この方
法では、ハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドとハ
イブリダイズしたオリゴヌクレオチドとを分離せずに、
問題のヌクレオチド配列を検出することができる。ハイ
ブリダイゼーションは２つの別々の相補的オリゴヌクレ
オチド（この１つはドナー発蛍光団で標識され、他の１
つはアクセプターによって標識される）の間で生じう
る。二本鎖形では、一本鎖オリゴヌクレオチドに比べ
て、ドナー蛍光が減少し（消光が増強する）、および／
またはエネルギー転移が増加する。ＦＥＴハイブリダイ
ゼーション分析のための幾つかのフォーマットは、「非
異方性ＤＮＡプローブ方法」（１９９２，Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，３１１〜３５２頁）にお
いて考察されている。或いは、ドナーとアクセプターと
を単独のオリゴヌクレオチドに連結して、オリゴヌクレ
オチドがハイブリダイズされていないとき、対、オリゴ
ヌクレオチドがその相補的配列にハイブリダイズされた
ときに、いずれか一方又は両方の蛍光特性に検出可能な
差異が存在するようにする。このフォーマットでは、オ
リゴヌクレオチドがハイブリダイズしたときに、ドナー
蛍光は通常増強し、消光は減少する。例えば、各末端に
おいて標識された自己−相補的オリゴヌクレオチドは、
エネルギー転移と消光とがおこりうるように、２つの発
蛍光団（即ち、５’末端と３’末端）を密接に接近させ
るヘアピンを形成する。自己−相補的オリゴヌクレオチ
ドが第２オリゴヌクレオチド上のその補体にハイブリダ
イズすると、ヘアピンは破壊され、２色素間の距離は増
大し、エネルギー転移および消光は減少する。ヘアピン
構造の欠点は、この構造が非常に安定であって、消光し
ないハイブリダイズされた形への転換がしばしば緩慢で
あり、あまり都合よくおこなわれず、一般に不良な性能
を生じることである。“二重ヘアピン”スキームはＢ．
Ｂａｇｗｅｌｌ等によって述べられている（１９９４，
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２４２４〜２４
２５）。ＫｒａｍｅｒとＴｙａｇｉ（１９９６，Ｎａｔ
ｕｒｅ １４：３０３〜３０８）はヘアピンのアーム間
にループ状のディテクター(detector)配列を含むヘアピ
ンを述べている。
【０００４】先行技術方法はエネルギー転移自体の効率
が低く、蛍光の有意義な変化を検出するために充分なス
ペクトル分解(spectral resolution)に達することがし
ばしば困難であった。蛍光消光をモニターする多くの方
法では、少量のハイブリダイゼーションが蛍光のごく小
さな減少を生じるにすぎず、これを高レベルのバックグ
ラウンドの存在下で検出しなければならない。これらの
方法は検出感度が不充分という欠点も有している。
【０００５】アプタマーは、特異的分子ターゲットに結
合するＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。ランダムに発生し
たオリゴヌクレオチドの大きな集団は、既知のインビト
ロ選択及び増幅プロセスによってアプタマーを多く含む
ことができる。トロンビンに結合する一本鎖ＤＮＡアプ
タマーが特に重要である（Ｌ．Ｃ．Ｂｏｃｋ等，１９９
２，Ｎａｔｕｒｅ，３５５：５６４〜５６６）。これら
のトロンビン結合アプタマーは保存共通配列(conserved
consensus sequence)ＧＧＮＴＧＧＮ2-5ＧＧＮＴＧＧ
（配列番号：１）を含有することが判明し、トロンビン
触媒フィブリン−凝血形成を阻害した。この分子の構造
の分析は３個のループによって結合された２個の四分子
(tetrad)グアノシン塩基対を含有する対称的構造を明ら
かにしている（１９９３，Ｋ．Ｙ．Ｗａｎｇ等，Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：１８９９〜１９０４；１９
９３，Ｒ．Ｆ．Ｍａｃａｙａ等，ＰＮＡＳ，９０：３７
４５〜３７４９；１９９４，Ｐ．Ｓｃｈｕｌｔｚｅ等，
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５：１５３２〜１５４７；
１９９６，Ｊ．Ａ．Ｋｅｌｌｙ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．２５６：４１７〜４２２）。この特徴的な構造は一
般に、“Ｇ−四量体”又は“Ｇ−四倍体(G-quadruple
x)”と呼ばれる。Ｅ．Ｄｉａｓ等（１９９４，Ｊ．Ａ
ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：４４７９〜４４８０）
は、Ｇ対の間のオリゴヌクレオチドの長さが増加すると
きにＧ−四量体が維持される同様な配列を報告してい
る。
【０００６】発蛍光団は、蛍光を発するように製造され
ることができる色素又は化学的部分である。これは化学
的処理、光による励起に反応して又は生物学的系におい
て蛍光を発する色素を包含する。
【０００７】ドナー又はドナー発蛍光団は、第２色素又
は化学的部分の吸収スペクトルとオーバーラップする蛍
光発光スペクトルを有する発蛍光団である。
【０００８】アクセプター又はアクセプター色素は、ド
ナー発蛍光団によって発せられる光を吸収する色素又は
他の化学的部分である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】Ｇ−四量体構造を形成
するオリゴヌクレオチドが、Ｇ−四量体オリゴヌクレオ
チドに結合した２つの色素ラベル間の距離の変化に由来
する蛍光の測定可能な変化（例えば、エネルギー転移又
は蛍光消光）を用いたヌクレオチド配列の検出又は同定
に有用であることが、今回判明した。Ｇ−四量体の１末
端をドナー発蛍光団で標識し、他方の末端を適当なアク
セプター色素で標識するときに、Ｇ−四量体の特徴的な
構造がドナー−アクセプター対を密接に接近させて、ラ
ベル間に相互作用を生じさせ、この相互作用がドナー蛍
光を消光させる。Ｇ−四量体構造は、相補的オリゴヌク
レオチドとのハイブリダイゼーション時に、アンフォー
ルドする(unfold)又は線状になる。これは２つの色素ラ
ベルの間の距離を増加させて、それらの相互作用を低下
させて、蛍光消光を減少させ（即ち、ドナー蛍光を増強
させ）、この変化は特定の核酸配列の存在の表示として
モニターすることができる。アクセプター色素も発蛍光
団であるならば、場合によっては、Ｇ−四量体が線状に
なり、ドナーとアクセプターとの距離が増加するとき
に、蛍光の低下を示すことになりうる。このような場合
には、アクセプターの蛍光の低下も特定核酸配列の存在
の表示として測定することができる。
【００１０】
【課題を解決するための手段】Ｇ−四量体オリゴヌクレ
オチド構造は、１末端をドナー発蛍光団で標識され、他
方の末端をアクセプター色素で標識される場合には、蛍
光消光が予想外に有効であるディテクター分子又はラベ
ルを与える。さらに、Ｇ−四量体構造が通常の実験室条
件下で高度に安定であるにも拘わらず、相補的配列の存
在中では迅速に破壊されることが予想外に判明した。ア
ンフォールディング(unfolding)又は線状化によるＧ−
四量体構造の破壊は、相補的配列の不存在下ではこの構
造のアンフォールディングも破壊も生じず、蛍光は有効
に消光した状態で留まるので、Ｇ−四量体オリゴヌクレ
オチドのその補体へのハイブリダイゼーションの高度に
特異的なインジケーターである。
【００１１】本発明の１実施態様によるＧ−四量体オリ
ゴヌクレオチドは配列：ＧＧＮxＧＧＮyＧＧＮzＧＧ
（配列番号：２）を有し、式中、ｘ、ｙ及びｚはヌクレ
オチドの可変な数を示す。ｘ、ｙ及びｚはそれぞれ典型
的に少なくとも約２、好ましくは約２〜１０であるが、
これらのセグメントは、以下に示すように折り畳み(fol
ded)Ｇ−四量体構造において５’末端と３’末端とを接
近させないように、必要に応じてさらに長くなることも
できる。Ｇ−四量体構造はオリゴヌクレオチドの５’末
端を３’末端に密接に接近させ、多くのドナー／アクセ
プター色素対にとって、Ｇ−四量体におけるそれらの距
離はＦｏｒｓｔｅｒ距離未満であるか、さもなくば、一
方又は両方の蛍光強度に影響を与える色素−色素相互作
用を可能にするほど充分に密接する。それ故、Ｇ−四量
体構造におけるオリゴヌクレオチドの５’末端と３’末
端との相対的位置はＧ−四量体オリゴヌクレオチドを蛍
光消光分析におけるディテクター分子又はラベルとして
用いるための重要な特徴であり、この近接はオリゴヌク
レオチド配列において不変である４対のＧに関連する。
可変な配列の領域（即ち、Ｎx、Ｎy、Ｎz）は本発明に
おいて決定的ではなく、これらの分子を本発明の分析に
有用性にする特徴的なＧ−四量体構造を破壊せずに、長
さ及び配列を変えることができる。一般原則として、可
変なＮ配列は自己−相補的であるべきではなく、分子内
で別のＧ−四量体構造を生じるようなＧ残基を含有すべ
きではない。本発明による代表的なＧ−四量体オリゴヌ
クレオチドは、長さ１５〜２０ヌクレオチドであり、実
施例に示すが、配列番号：２の一般式に従う任意の長さ
のＧ−四量体オリゴヌクレオチドも適切である。Ｇ−四
量体オリゴヌクレオチドは典型的に約１４〜３０ヌクレ
オチド長さである。
【００１２】各末端において標識されたＧ−四量体構造
のアンフォールディング、線状化又は破壊のモニターリ
ングは、先行技術の同様に標識されたオリゴヌクレオチ
ド（例えば、自己−相補的配列）の線状化のモニターリ
ングに比べて、幾つかの利点を有する。第一に、Ｇ−四
量体は自己−相補的ではないので、相補的オリゴヌクレ
オチドの存在下でより迅速にアンフォールドして、蛍光
のより迅速な変化を生じ、より迅速な分析結果を与え
る。さらに、複数個のＧ−四量体を単一オリゴヌクレオ
チドに組み入れて蛍光シグナルを増幅して、相補的配列
の存在下での蛍光強度の変化を増強することができる。
このようなマルチマー(multimeric)Ｇ−四量体分子で
は、アクセプターのドナー発蛍光団に対する比が増大し
て、ドナー消光を改良し、それによって、相補的配列の
存在下で蛍光強度のさらに大きい変化を与えることがで
きる。
【００１３】当該技術分野で知られた多くのドナー／ア
クセプター色素対が本発明に有用である。これらは例え
ばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）／テ
トラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴ
Ｃ）、ＦＩＴＣ／ＴｅｘａｓＲｅｄTM（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、ＦＩＴＣ／Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミジル １−ピレンブチレート（ＰＹＢ）、ＦＩ
ＴＣ／エオシン イソチオシアネート（ＥＩＴＣ）、Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミジル １−ピレンブチレート
（ＰＹＢ）／ＦＩＴＣ、ＦＩＴＣ／ローダミンＸ、ＦＩ
ＴＣ／テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）等を包含
する。特定のドナー／アクセプター対の選択は決定的で
はない。ドナー発蛍光団の発光波長がアクセプターの吸
収波長にオーバーラップすることのみが必要である、即
ち、蛍光消光を可能にするためには、ドナーとアクセプ
ターとの間に充分なスペクトルオーバーラップが存在し
なければならない。ｐ−（ジメチルアミノフェニルア
ゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）は隣接発蛍光団、例えば
フルオレセイン又は５−（２’−アミノエチル）アミノ
ナフタレン（ＥＤＡＮＳ）からの蛍光を効果的に消光さ
せる非蛍光性アクセプターである。ドナー又はアクセプ
ターのいずれがＧ−四量体オリゴヌクレオチドの５’又
は３’末端のいずれに存在することもできる。上記と以
下の実施例では、ある一定のドナー／アクセプター対を
例示するが、他のドナー／アクセプター対は当業者に明
らかであると考えられ、これらも本発明に有用である。
【００１４】５’末端標識方法及び３’末端標識方法も
当該技術分野において知られており、Ｇ−四量体オリゴ
ヌクレオチドの各末端にドナー色素及びアクセプター色
素を連結するために用いることができる。例えば、３’
末端標識方法は（ａ）３’末端リボヌクレオチドの過ヨ
ウ素酸酸化とその後のアミン含有ラベルとの反応、
（ｂ）末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
を用いた３’脂肪族アミン含有ヌクレオチドの酵素的添
加とその後のアミン反応性ラベルとの反応、及び（ｃ）
３’リボヌクレオチドの過ヨウ素酸酸化とその後の、ア
ミン反応性ラベルと反応することができる３’末端脂肪
族アミンを与えるための１，６−ヘキサンジアミンとの
反応を包含する。５’末端標識方法の例は（ａ）５’−
５’結合(5'-to-5'coupled)リボヌクレオチドの過ヨウ
素酸酸化とその後のアミン含有ラベルとの反応、（ｂ）
エチレンジアミンと５’−リン酸化(phosphorylated)ポ
リヌクレオチドとの縮合とその後のアミン反応性ラベル
との反応、及び（ｃ）固相ＤＮＡ合成にアミノヘキシル
ホスファイト試薬を用いる脂肪族アミン置換基の導入と
その後のアミン反応性ラベルとの反応を包含する。特定
の脂肪族アミン含有ヌクレオチドホスホルアミダイト(a
liphatic amine-containing nucleotide phosphoramidi
te)試薬を用いて、ラベルを合成ＤＮＡの特異的内部又
は末端位置に結合させることもできる。選択したラベル
をＧ−四量体オリゴヌクレオチドに結合させて、結合反
応をおこなうための適当な方法の選択は、当該技術分野
においてルーチンである。Ｇ−四量体構造の５’末端及
び３’末端におけるラベルに関する本明細書の説明は、
末端に近接するラベル、即ち、末端ヌクレオチドに結合
していないがＧ−四量体構造内で消光が生じるほど充分
に末端に近いラベルを包含するように意図される。ドナ
ーとアクセプターとの結合は典型的に末端ヌクレオチド
から約２〜４ヌクレオチドの範囲内でおこなわれる。Ｇ
−四量体オリゴヌクレオチドの５’末端及び３’末端近
くのどのドナー／アクセプター対結合が折り畳みＧ−四
量体構造においてドナー蛍光を消光させるかを知るに
は、ルーチンの試験が必要であるにすぎない。さらに、
Ｇ−四量体配列がディテクター分子又はラベルとして用
いられるためにより大きいオリゴヌクレオチドに含まれ
るか又は結合する場合には（実施例３におけるよう
に）、ドナー又はアクセプターのいずれか又は両方がＧ
−四量体構造を形成する配列の末端に又は末端近くに存
在するプローブの内部ヌクレオチドに結合することがで
きる。これらの結合はＧ−四量体構造を形成する配列内
に含まれるヌクレオチドに対しておこなわれるか、又は
オリゴヌクレオチドのプローブ部分内のＧ−四量体配列
の末端又は末端近くに存在するヌクレオチド（即ち、Ｇ
−四量体配列の外部）に対しておこなわれることができ
る。このような結合は全て、Ｇ−四量体配列又は構造の
末端又は末端近くに存在すると考えられる。このような
プローブにおいてドナー消光を達成させるようにドナー
発蛍光団とアクセプター色素とを結合させるために、Ｇ
−四量体の末端又は末端近くのどのヌクレオチドが適切
であるかを知るにはルーチンの試験を用いることができ
る。
【００１５】本発明によって標識されたＧ−四量体オリ
ゴヌクレオチドは特定の核酸配列の検出又は同定のため
の多様な分析に用いることができる。このような分析の
重要な特徴は、特定の核酸配列の存在に依存した形式で
Ｇ−四量体構造がアンフォールドされるか又は線状化さ
れることである。このプロセスは消光の減少のためにド
ナー蛍光の検出可能な増強を生じる。この分析は特定の
核酸配列の存在の表示として検出されるほどの充分な大
きさのドナー蛍光強度の変化のみに依存するので、Ｇ−
四量体の破壊の前にドナーが完全に消光されることを必
要としない。配列特異的にＧ−四量体構造を破壊する任
意の手段が本発明に有用であるが、ある一定の例を提供
する。Ｇ−四量体のＧ−四量体配列の補体へのハイブリ
ダイゼーションによってアンフォールディング又は線状
化による構造破壊が達成されうる。Ｇ−四量体の補体自
体が検出されるべき配列であるか、又は特定の核酸配列
がＧ−四量体の補体を含有する場合には、標識されたＧ
−四量体のハイブリダイゼーション時のドナー蛍光強度
の増強を用いて特定の核酸配列を検出することができ
る。しかし、検出すべき配列がＧ−四量体に相補的な配
列を含まない場合には、他の方法を用いて、Ｇ−四量体
を配列特異的な形式でアンフォールドしなければならな
い。例えば、標識されたＧ−四量体を、検出又は同定す
べき核酸配列の３’末端にハイブリダイズするディテク
タープローブの５’末端に、このＧ−四量体が５’オー
バーハングを形成するように結合させることができる。
ハイブリダイゼーション時に、特定の核酸配列のハイブ
リダイズされたセグメントをプライミング(priming)部
位として用いて、特定の核酸配列とディテクタープロー
ブとをポリメラーゼによって二本鎖にする。Ｇ−四量体
を含むディテクタープローブを鋳型として用いての特定
の核酸配列の伸長は、ディテクタープローブのセグメン
トによって相補的配列が合成されるので、Ｇ−四量体構
造をアンフォールド又は線状化させる。結果として生じ
るドナー蛍光の増強は、ディテクタープローブがハイブ
リダイズする配列の存在を実証する。或いは、公開され
たヨーロッパ特許出願第０６７８５８２号に述べられて
いるように、標識されたＧ−四量体オリゴヌクレオチド
をシグナルプライマーの５’末端に結合させることもで
きる。特定の核酸配列にシグナルプライマーをハイブリ
ダイズした後に、伸長と置換(displacement)とによっ
て、５’末端にＧ−四量体を含む一本鎖二次増幅生成物
が得られる。この二次増幅生成物を第２増幅プライマー
にハイブリダイズさせ、ポリメラーゼによってハイブリ
ダイズした第２増幅プライマーを伸長させると、Ｇ−四
量体を含む二次増幅生成物が二本鎖になる。即ち、結合
したＧ−四量体構造の領域によって二次増幅生成物の補
体が合成されるので、このＧ−四量体がアンフォールド
され、２つのラベル間の距離が増大する。ドナー発蛍光
団の蛍光強度の増強は二本鎖二次増幅生成物の存在と特
定核酸配列（即ち、増幅されたターゲット配列）の存在
とを実証する。もちろん、本発明の分析のいずれにおい
ても、アクセプターがドナーからの距離の増加にこのよ
うに反応する発蛍光団である場合には、ドナー蛍光の増
強の代わりに、アクセプター発蛍光団の蛍光の減少を特
定核酸配列の存在の表示としてモニターすることができ
る。
【００１６】本発明によるＧ−四量体構造のアンフォー
ルディング又は破壊を、ドナーとアクセプターとの近接
が変化するにつれて増減する他の蛍光特性を用いて検出
又はモニターすることができる。例えば、ドナーの消光
はその蛍光強度を低下させるが、その蛍光寿命（即ち、
励起と発光との間の時間）をも減少させうる。アンフォ
ールドされたＧ−四量体ではドナーの蛍光強度が増強す
るので、ドナー蛍光寿命も増加し、ドナー消光の減少
（蛍光強度の増強）を検出する代わりの手段として、検
出することができる。同様に、蛍光偏光も２つの色素間
の距離が変化すると変化しうる。一本鎖形から二本鎖形
へのＧ−四量体オリゴヌクレオチドの転換に付随する分
子量変化は蛍光偏光の変化に寄与するが、蛍光偏光は２
つの色素の近接の変化によっても影響される可能性があ
る。それ故、蛍光偏光又は異方性の変化もＧ−四量体の
破壊をモニター又は検出するための有用な代替え手段に
なることができる。
【００１７】
【実施例】
実施例１ １５マー（ＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧ、配列番
号：３）及び２０マー（ＧＧＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧ
ＴＴＴＴＧＧ、配列番号：４）Ｇ−四量体オリゴヌクレ
オチドとそれらの補体とを慣用的な方法によって合成し
た。１５マーと２０マーとの円二色性（ＣＤ）スペクト
ルの測定値は非常に類似するが、Ｇ−四量体構造をとら
ない、匹敵する長さの二本鎖と一本鎖の両方のＤＮＡか
らはかなり異なる（Ｌ．Ｂ．ＭｃＧｏｗｎ等，１９９５
年１１月１日，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６６３Ａ〜６６８
Ａ頁）。このことは、両方のオリゴヌクレオチドが効果
的に折り畳まれてＧ−四量体になることを実証した。オ
リゴヌクレオチドを５’末端においてはフルオレセイン
（ドナー）によって標識し、３’末端においてはテトラ
メチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）又はローダミンＸ（Ｒ
ＯＸ）のいずれかによって標識した。５’末端又は３’
末端のいずれかにおいてのみフルオレセインによって標
識したＧ−四量体オリゴヌクレオチドは非消光(unquenc
hed)対照として役立った。５’フルオレセインはオリゴ
ヌクレオチドの合成中に６−ＦＡＭ試薬（ＡＢＩ）を用
いて取り付けた。３’末端には、フルオレセインをＣＰ
Ｇカラム物質（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，バージニ
ア州，スターリング）上に固定されたフルオレセイン誘
導体を用いて結合させた。フルオレセイン以外の色素は
オリゴヌクレオチドの３’末端に同様なＣＰＧ手段を用
いてアミノアルキルリンカーへのＮＨＳエステルを介し
て結合させた。サイズ排除クロマトグラフィー（ＮＡＰ
−５カラム，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）による未反応色素の
除去と、ＯＰＣカートリッジ（ＡＢＩ）に通しての溶出
とによって、標識したオリゴヌクレオチドを精製した。
標識オリゴヌクレオチドの濃度は、２６０ｎｍにおける
色素吸光度に関して補正された同じ波長における算出吸
光度から得られた。蛍光スペクトルをＳＬＭ−Ａｍｉｎ
ｃｏ８１００研究等級分光蛍光光度計又はフルオレセイ
ン励起及び発光に対するフィルターを装備したＦＰＭ−
１蛍光光度計（ＪｏｌｌｅｙＣｏｎｓｕｌｔｉｎｇ）を
用いて分析した。
【００１８】色素標識したオリゴヌクレオチド（２〜１
０ｎＭ）を、２０ｍＭ ＴＲＩＳアセテート、１４０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ2及
び１ｍＭ ＭｇＣｌ2から成るｐＨ７．５の緩衝液に室
温（約２４〜２６℃）において加えた。相補的配列を
１．５倍以上のモル過剰で加え、蛍光スペクトルの変化
がもはや見られなくなったときに、最終測定をおこなっ
た。これは典型的に３０分間未満を要した。ドナー強度
の変化を４８５又は４８８ｎｍにおいて励起させて、フ
ルオレセインの発光波長（約５２０ｎｍ）において測定
した。消光％を５’末端においてフルオレセインによっ
てのみ標識した同様な配列との比較によって算出した。
結果は次の表に示す。
【００１９】
【表１】 アプタマー ５’ドナー ３’−アクセ 消光 強度増強長さ 色素 プター色素 （％） （ドナー発光） １５マー フルオレセイン ローダミンＸ ２５ ９Ｘ １５マー フルオレセイン ＴＡＭＲＡ ６０ ５Ｘ １５マー フルオレセイン フルオレセイン ＮＡ ２．５Ｘ ２０マー フルオレセイン ＴＡＭＲＡ ３０ ２．４Ｘ ２０マー フルオレセイン フルオレセイン ＮＡ １．７Ｘ ＮＡ：測定値得られず
【００２０】ハイブリダイゼーション時に、フルオレセ
イン蛍光の強度の容易に検出可能な増強が全てのドナー
／アクセプター色素対とハイブリダイゼーション時の両
方のオリゴヌクレオチドとにに関して観察された。１５
マーでのフルオレセインドナーとローダミンＸアクセプ
ターとは最大の増強（９倍）を生じたが、アクセプター
（ＲＯＸ）発光の予想された(expected)減少は予測値よ
りも小さかった（２倍未満）。このことは、蛍光消光の
一部がＦｏｒｓｔｅｒエネルギー転移以外の機構による
ものであることを示唆する。上記表に報告した結果はド
ナー発光の増強を示す。しかし、充分な変化があるなら
ば、アクセプター発光の減少もハイブリダイゼーション
時のＧ−四量体の破壊をモニターするために用いること
ができる。これは励起がドナー波長においてであるが、
発光はアクセプター波長でモニターされるので、大きな
有効Ｓｔｏｋｅｓシフトを生じる。この配置(configura
tion)はサンプルバックグラウンドからの妨害もあまり
生じない。
【００２１】配列番号：３（５’フルオレセイン、３’
ＴＡＭＲＡ）のハイブリダイゼーション時の蛍光偏光の
変化も同様な実験条件下でモニターした。４７５ｎｍに
おいてドナー励起させ、５８５ｎｍにおいて発光をモニ
ターすると、蛍光偏光は補体のハイブリダイゼーション
時に６２ｍＰから１３８ｍＰに増大した。
【００２２】実施例２ 実施例１と同様な実験において、増加する量の１５マー
相補的オリゴヌクレオチドを５’末端をフルオレセイン
で、３’末端をＲＯＸで標識した配列番号：３に加え
た。相補的配列は配列番号：３の０．５モル当量、１．
０モル当量、１０モル当量及び３０モル当量で加えた。
相補的オリゴヌクレオチドの不存在は基底蛍光読取り値
を与えた。相補的オリゴヌクレオチドの添加後に、サン
プルを室温において５分間インキュベートした。色素を
４８５ｎｍにおいて励起させ、発光スペクトルを記録し
た。結果は図１に示す。５２０ｎｍにおける発光は補体
量の増加（即ち、２倍（０．５当量）、５倍（１．０当
量）、８倍（１０当量）及び９倍（３０当量））と共に
増強した。それ故、より多くの相補的オリゴヌクレオチ
ドがハイブリダイズするにつれて、より多くのＧ−四量
体のアンフォールディングが生じ、消光のより大きな減
少が生ずる。このことは、この方法が半定量的又は恐ら
く定量的であることができ、サンプル中に存在する特定
ヌクレオチド配列量を算出する手段として又は異なるサ
ンプル中の特定配列の相対的量を比較する手段として有
用である可能性があることを示唆する。
【００２３】実施例３ クラミジア微生物を検出するためのプローブの５’末端
にＧ−四量体配列を加えた。この配列は５’末端におい
て６−ＦＡＭで、Ｔ−１６においてＲＯＸによって次の
ように標識された（配列番号：５）： Ｆ−ＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧＴ*ＣＴＡＧＡＧ
ＴＣＴＴＣＡＡＡＴＡＴＣＡＧＡＧＣＴＴＴＡＣＣＴＡ
ＡＣＡＡ Ｆ＝フルオレセイン Ｔ*＝ＲＯＸ（ローダミンＸ）へのアミノ−Ｃ６リンカ
ーを有するｄＴ このプローブをＡＢＩ ３８０Ｂ合成器においてＡＢＩ
の６−ＦＡＭ試薬を用いて合成し、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈからのｄＴ Ｃ６アミノリンカーを指定位置に
挿入した。脱保護後に、粗オリゴヌクレオチドを逆相Ｈ
ＰＬＣによって、Ｗａｔｅｒｓ Ｃ１８ Ｄｅｌｔａ
Ｐａｋ３００ÅＣ１８ ３．９ｘ１５０ｍｍカラム上で
５０ｍＭ ＴＥＡＡ中２％〜３０％アセトニトリルの線
状溶媒勾配(solvent gradient)を用いて３０分間にわた
って精製した。これの半分（０．５μｍｏｌｅ）を１０
０μｌの１００ｍＭ炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ８）中に溶解して、５ｍｇ／６０μｌの
ＲＯＸ ＮＨＳエステル（ＡＢＩ／Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌ
ｍｅｒ）のＤＭＳＯ溶液 ３０μｌを加えた。得られた
混合物を暗所に３７℃において２４時間放置してから、
Ｇ−２５ Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂（ＮＡＰ５、Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のカラムに通し、４ｍＭ
ＴＡＥ（４ｍＭ ＴＲＩＳアセテート、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）によって溶出した。この生成物
を上述したようにＨＰＬＣによって精製した。非標識オ
リゴヌクレオチド（配列番号：６）を慣用的方法によっ
て合成して、配列番号：５のハイブリダイゼーションの
ターゲットとして及び鋳型として配列番号：５を用いる
伸長のプライマーとして用いた。このオリゴヌクレオチ
ド（ＴＴＧＴＴＡＧＧＴＡＡＡＧＣＴＣＴＧＡＴＡＴＴ
ＴＧＡＡＧ）はプローブの３’末端に相補的であった。
【００２４】２０ｎＭ 蛍光プローブと、４０ｍＭ Ｋ
ｉＰＯ4と、５ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）2と、０．２ｍＭ
各デオキシヌクレオシドトリホスフェートと、１．４ｍ
Ｍα−チオ−ｄＣＴＰと、５％グリセロールと、０．０
２当量、１．０当量又は１０当量のいずれかのターゲッ
トオリゴヌクレオチドとを含有する４個の１００μｌキ
ュベット(cuvette)を用意して、５３℃に予熱したサン
プル室を有するＳＬＭ ８１００蛍光光度計に入れた。
Ｂｓｔポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ
ｌａｂｓ、２５単位／１００μｌ）を各サンプルに加え
て、全ての４サンプルの蛍光強度を経時的に測定した。
励起は４８４ｎｍ（４ｎｍ／４ｎｍにスリット）におい
て行い、発光は５２０ｎｍ（１０ｎｍ／１０ｎｍにスリ
ット）に設定した。
【００２５】結果は図２に示す。ターゲットの存在下で
のドナー蛍光の増強は、補体が合成され、Ｇ−四量体が
アンフォールドされ、線状化したときの２つの発蛍光団
の間の距離の増加に由来する非消光(unquenching)を実
証する。蛍光の変化の大きさはターゲット量の増加と共
に増大し、このことは少なくとも半定量的分析を暗示す
る。さらに、図２は、より多量のターゲットが存在する
場合により迅速な増強速度が生ずることを説明する。こ
のことは、ＳＤＡ反応又はハイブリダイズしたプライマ
ーの伸長に基づく他の分析においてプライマー伸長を用
いてＧ−四量体を破壊することによる、恐らく半定量的
な核酸のリアルタイム検出の有用性を実証する。
【００２６】実施例４ ５’末端においてＧ−四量体に結合したＭｙｃｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＩＳ６１１
０挿入要素(insertion element)を検出するためのプロ
ーブを実施例３と同様なプライマー伸長分析において試
験した。ディテクタープローブは５’末端において６−
ＦＡＭによって、Ｔ−１６においてＴＡＭＲＡによって
次のように標識した（配列番号：７）。
【００２７】Ｆ−ＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧＴ*
ＴＴＡＴＣＣＧＴＡＴＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＴＣＴＴ
ＴＣＡ Ｆ＝フルオレセイン Ｔ*＝ＴＡＭＲＡに結合したｄＴ ディテクタープローブの３’末端に相補的なオリゴヌク
レオチドは配列番号：８（ＧＡＣＧＴＴＡＴＣＣＡＣＣ
ＡＴＡＣＧＧ）であった。配列番号：８の０、０．１及
び１．１当量を存在させて、実験を実施例３におけるよ
うに５５℃においておこなった。図３はターゲットの存
在下でのドナー蛍光の増強を示す。これは、プライマー
としてハイブリダイズしたターゲットオリゴヌクレオチ
ドを用いて相補的配列を合成したときのディテクタープ
ローブのドナーとアクセプターとの間の距離の増大によ
る。存在するターゲット量が多くなればなるほど、蛍光
の増強の大きさも大きくなる。この場合にも、より多く
のターゲットが存在する場合に、より迅速な蛍光増強速
度が観察された。この実験では、ターゲットの１０倍増
加による蛍光変化の大きさは実施例３におけるよりも有
意に大きく、このことはこれがより敏感な分析系である
と考えられることを示唆する。
【００２８】実施例３と４は、ＳＤＡ及び他の増幅反応
におけるシグナルプライマーのラベル又はディテクター
分子としてのＧ−四量体の使用に関する重要な特徴(fea
ture)を実証する、即ち、増幅プライマーがシグナルプ
ライマーにその５’末端においてＧ−四量体によってハ
イブリダイズして、Ｇ−四量体を介して伸長することが
でき、それによってＧ−四量体構造を破壊し、ドナーと
アクセプターとの距離を増大させることができることを
実証する。２つのラベル間の近接依存性相互作用はラベ
ルの一方又は両方の蛍光の測定可能な変化を生じる。こ
のことは、一般にヨーロッパ特許出願第０６８４３１５
号に述べられた通りにおこなったＳＤＡ反応で実証され
た。制限エンドヌクレアーゼとしてＡｖａＩを、シグナ
ルプライマーとして配列番号：７を用いて、増幅反応を
５５℃においておこなった。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ
ｉｓのゲノムＤＮＡを増幅のターゲットとして加えた。
結果は図４に示す。ターゲットを含有しない対照反応で
はドナー蛍光は経時的に低濃度で一定に留まった。ター
ゲット（１０、１００又は１０００）を含有する増幅反
応では、ターゲットが増幅するにつれて、ドナー蛍光は
経時的に測定可能に増強した。これらの結果は、シグナ
ルプライマーがターゲット増幅の結果として伸長し、置
換され、二本鎖になったことと、このプロセスが生じた
ときにシグナルプライマーのＧ−四量体配列がアンフォ
ールドされたことを実証する。それ故、Ｇ−四量体構造
がターゲット増幅特異的な形式で破壊されるときの蛍光
の増強は、ターゲット増幅を検出するための有用な方法
である。さらに、ドナー蛍光強度の増強速度はターゲッ
トの初期量が増加するにつれて一層迅速になる。それ
故、ドナー蛍光強度の増強速度（即ち、ドナー消光の減
少速度）はサンプル中のターゲットの初期量の少なくと
も半定量的な表示であり、多重サンプル中に含まれるタ
ーゲットの相対的初期量を比較するためにも使用可能で
ある。
【００２９】
【配列表】
【００３０】配列番号： １ 配列の長さ： １３ 配列の型： 核酸 鎖の数： 一本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列の特徴 NAME/KEY： misc_feature 存在位置： ７ その他の情報： 標準名＝「Ｎは、Ｎ２−５を表す」 配列 GGNTGGNGGN TGG 13
【００３１】配列番号： ２ 配列の長さ： １１ 配列の型： 核酸 鎖の数： 一本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列の特徴： NAME/KEY： misc_feature 存在位置： ３ その他の情報： 標準名＝「Ｎは少なくとも２つのヌク
レオチドを表す」 NAME/KEY： misc_feature 存在位置： ６ その他の情報： 標準名＝「Ｎは少なくとも２つのヌク
レオチドを表す」 NAME/KEY： misc_feature 存在位置： ９その他の情報： 標準名＝「Ｎは少なく
とも２つのヌクレオチドを表す」 配列 GGNGGNGGNG G 11
【００３２】配列番号： ３ 配列の長さ： １５ 配列の型： 核酸 鎖の数： 一本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列 GGTTGGTGTG GTTGG 15
【００３３】配列番号： ４ 配列の長さ： ２０ 配列の型： 核酸 鎖の数： 一本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列 GGTTTTGGTT TTGGTTTTGG 20
【００３４】配列番号： ５ 配列の長さ： ５１ 配列の型： 核酸 鎖の数： 一本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列 GGTTGGTGTG GTTGGTCTAG AGTCTTCAAA TATCAGAGCT TTACCTAACA A 51
【００３５】配列番号： ６ 配列の長さ： ２８ 配列の型： 核酸 鎖の数： 一本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列 TTGTTAGGTA AAGCTCTGAT ATTTGAAG 28
【００３６】配列番号： ７ 配列の長さ： ４４ 配列の型： 核酸 鎖の数： 一本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列 GGTTGGTGTG GTTGGTTTAT CCGTATGGTG GATAACGTCT TTCA 44
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｇ−四量体がその相補的配列にハイブリダイズ
するときに観察されるドナー蛍光の増強を説明するグラ
フであり、実施例２の結果を示す。
【図２】ハイブリダイズしたプライマーがＧ−四量体を
介して伸長し、それによってＧ−四量体構造をアンフォ
ールディング又は線状化し、ドナー発蛍光団とアクセプ
ターとの間の距離を増大させるときのドナー蛍光の増強
を説明するグラフであり、実施例３の結果を示す。
【図３】ハイブリダイズしたプライマーがＧ−四量体を
介して伸長するときのドナー蛍光の増強を説明するグラ
フであり、実施例４の結果を示す。
【図４】ドナー発蛍光団とアクセプター色素とに結合し
たＧ−四量体をストランド置換増幅反応(Strand Displa
cement Amplification reaction)におけるターゲット増
幅を検出するためのシグナル上の検出可能なラベルとし
て用いる場合のドナー蛍光の増強を説明するグラフであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (73)特許権者 595117091 １ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲ ＡＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥＲＳＥＹ 07417−1880， ＵＮＩ ＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲ ＩＣＡ (72)発明者 グレン・ピー・ボンク アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27526，フキー−バリナ，パイニー−グ ローブ・ウィルボン・ロード 2717 (72)発明者 ジェームズ・ジー・ナデュー アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27514，チャペル・ヒル，クッカー・レ イン 710 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 C07H 21/04 C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Ｇ−四量体構造を形成するオリゴヌクレ
    オチドであって、ドナー発蛍光団によって標識された第
    １末端とアクセプターによって標識された第２末端とを
    有し、オリゴヌクレオチドがＧ−四量体構造を形成する
    ときにドナー発蛍光団の蛍光がアクセプターによって消
    光し、Ｇー四量体構造のアンフォールディング時にドナ
    ー発蛍光団の蛍光の消光が減少するオリゴヌクレオチ
    ド。
  2. 【請求項２】 ドナー発蛍光団とアクセプターとによっ
    て標識された、配列番号：２、配列番号：３、配列番
    号：４、配列番号：５又は配列番号：７から成る請求項
    １記載のオリゴヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 ドナー発蛍光団がフルオレセインであ
    り、アクセプターがテトラメチルローダミン、Ｔｅｘａ
    ｓ ＲｅｄTM、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル １−
    ピレンブチレート、エオシン、Ｎ−ヒドロキシスクシン
    イミジル １−ピレンスルホネート（ＰＹＳ）、ローダ
    ミンＸ、テトラメチルローダミン及びｐ−（ジメチルア
    ミノフェニルアゾ）安息香酸から成る群から選択され
    る、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 特定の核酸配列を検出又は同定する方法
    であって、次の工程： （ａ）ドナー発蛍光団によって標識された第１末端とア
    クセプターによって標識された第２末端とを有するＧ−
    四量体構造を形成するオリゴヌクレオチドであって、オ
    リゴヌクレオチドがＧ−四量体構造を形成するときにド
    ナー発蛍光団の蛍光がアクセプターによって消光し、Ｇ
    ー四量体構造のアンフォールディング時にドナー発蛍光
    団の蛍光の消光が減少するようなオリゴヌクレオチドを
    含むプローブを調製し； （ｂ）特定の核酸配列が存在する場合には、オリゴヌク
    レオチドが二本鎖になり、それによってＧ−四量体構造
    がアンフォールディングされ、ドナー発蛍光団の蛍光の
    消光が減少し；そして （ｃ）特定の核酸配列の存在の表示としてのドナー発蛍
    光団の蛍光の増強又はアクセプターの蛍光の減少を検出
    することを含む、前記方法。
  5. 【請求項５】 相補的配列へのハイブリダイゼーション
    によってオリゴヌクレオチドが二本鎖になる、請求項４
    記載の方法。
  6. 【請求項６】 鋳型としてのオリゴヌクレオチドを用い
    て相補的配列を合成することによって、オリゴヌクレオ
    チドを二本鎖にする、請求項４記載の方法。
  7. 【請求項７】 ドナー発蛍光団がフルオレセインであ
    り、アクセプターがテトラメチルローダミン、Ｔｅｘａ
    ｓ ＲｅｄTM、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル １−
    ピレンブチレート、エオシン、Ｎ−ヒドロキシスクシン
    イミジル １−ピレンスルホネート（ＰＹＳ）、ローダ
    ミンＸ、テトラメチルローダミン及びｐ−（ジメチルア
    ミノフェニルアゾ）安息香酸から成る群から選択され
    る、請求項４記載の方法。
  8. 【請求項８】 検出又は同定されるべき核酸配列が核酸
    増幅反応の生成物である、請求項４記載の方法。
  9. 【請求項９】 特定の核酸配列を検出又は同定する方法
    であって、次の工程： （ａ）ドナー発蛍光団によって標識された第１末端とア
    クセプターによって標識された第２末端とを有するＧ−
    四量体構造を形成するオリゴヌクレオチドを含むプロー
    ブを調製し； （ｂ）特定の核酸配列が存在する場合には、オリゴヌク
    レオチドが二本鎖になり、それによってＧ−四量体構造
    がアンフォールディングされ、ドナー発蛍光団とアクセ
    プターとの間の距離が長くなり；そして （ｃ）特定の核酸配列の存在の表示としての、ドナー発
    蛍光団とアクセプターとの間の距離が増加することに関
    連した蛍光特性の変化を検出することを含む、前記方
    法。
  10. 【請求項１０】 蛍光強度、蛍光寿命、蛍光偏光又は蛍
    光異方性の変化を検出する、請求項９記載の方法。
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