JP2014515031A - 薬理学的特性が向上した金属製剤ならびにその製造方法および使用 - Google Patents

Abstract

本発明の目的は、低い親和性で標的と結合する分子（以下、「リガンド部分」と呼ぶ）を金属結合部分と結合させその分子の薬理学的特性を向上させることにより、一般に「金属製剤」または「金属治療薬」と呼ばれる複合分子を作製することである。金属製剤の金属結合ドメインは典型的には、酸化還元酵素反応を触媒するか、Ｌｅｗｉｓ酸触媒として働くことにより、リガンド部分とその標的との結合により接近したタンパク質および核酸の修飾をもたらす。
【選択図】なし

Description

本願は、２０１１年５月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／４８５，５２８号の優先権を主張するものであり、上記出願は表、図面および請求項のすべてを含めたその全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。

以下の本発明の背景に関する記述は、単に本発明の理解に役立つよう提供されるものであり、本発明の先行技術を記載することも構成することも認められるものではない。

薬物開発に共通する出発点の１つに、目的とする標的と結合する、あるいはその標的に対して阻害活性を示す化合物のスクリーニングまたは合理的設計による同定がある。薬様化合物の化合物空間は理論的には広大であるため、このような方法の「ヒット率」は比較的低いものとなり得る。さらに、「ヒット」の多くが、有用であるよりも、目的とする薬物標的と低い親和性で結合するものである。同定されたリード化合物は多くの場合、その標的とマイクロモル、時にはそれより弱い親和性で結合する。有効な薬物にするためには、このような化合物の結合親和性を３桁以上高めて最適化する必要がある。その結果、許容範囲内にある親和性を有するリード化合物を得るため、最適化に一層多くの労力を費やす必要があった。

例えば、分子が経口投与により生体内で利用されるためには分子質量が実質的に５００Ｄａを超えてはならない；化合物はしかるべき標的選択性、しかるべき膜透過性および十分な水溶性を示すものでなければならない；化合物は適切な薬物動態プロファイルを示し、毒性を示さないものでなければならないなど、他の厳しい制約をいくつか満たしながら実施しなければならないことを考えれば、この課題は些細なものではない。上に挙げた制約により、最適化という目標の達成に利用できる化学官能基の幅が大幅に狭まる。その結果、薬物開発の過程で固有の特性を有する低親和性のリード化合物が切り捨てられることが多い。

上に挙げた親和性による制限は小分子の薬物化合物に固有のものではない。現在臨床的に使用されている抗体ベースの薬物の多くがナノモル濃度ないしピコモル濃度の範囲の親和性を示すものである。しかし、リード化合物を生成するのに用いられるコンビナトリアルファージディスプレイ法では、通常は抗原刺激により生じる高親和性の結合物質を欠くナイーブな免疫グロブリンライブラリーに依存することが多い。その結果得られるのは通常、好ましい薬物となるために何ラウンドもの親和性成熟が必要な抗体リード化合物である。上で述べたように、リード化合物を最適化する戦略の多くが、有望な薬剤候補を見逃し創薬プログラムの失敗率を高めるという結果に終わる。当該技術分野では創薬の成功率を高める方法が依然必要とされている。

本発明の目的は、低い親和性で標的と結合する分子（以下、「リガンド部分」と呼ぶ）を金属結合部分と結合させてその分子の薬理学的特性を向上させることにより、一般に「金属製剤」または「金属治療薬」と呼ばれる複合分子を作製することである。金属製剤の金属結合ドメインは典型的には、酸化還元酵素反応を触媒するか、Ｌｅｗｉｓ酸触媒として働くことにより、リガンド部分とその標的との結合により接近したタンパク質および核酸の修飾をもたらす。

候補薬物が治療標的に対して高親和性であるが可逆性の結合を示すこれまでの創薬プログラムとは対照的に、本明細書に記載の触媒的金属製剤という概念では、リガンド部分の高い親和性結合が不要であり、望ましくないことさえある。

第一の態様では、本発明は、目的とする生化学的標的を触媒的に不活性化する組成物であって、約１０^４Ｍ^−１〜約５×１０^８Ｍ^−１の親和性で生化学的標的と結合するリガンド部分と、金属結合部分とを含み、リガンド部分と金属結合部分が共有結合している組成物を提供する。

関連する態様では、本発明は、目的とする生化学的標的を触媒的に不活性化する組成物であって、生化学的標的と結合するリガンド部分と、金属結合部分とを含み、リガンド部分と金属結合部分が共有結合し、かつリガンド部分が少なくとも金属結合部分の不活性化反応の速度定数（ｋ_ｃａｔ）と同等のｋ_ｏｆｆでその生化学的標的と最適に結合する組成物を提供する。

特定の実施形態では、金属結合部分はそれと結合した金属を含み、前記金属は酸化条件下での結合状態で酸化還元活性があり１種類以上の活性酸素種を発生させ、かつ／または金属結合部分はそれと結合した金属を含み、前記金属は加水分解条件下での結合状態でＬｅｗｉｓ酸触媒としての活性がある。

種々の実施形態では、金属結合部分と結合した金属は、アルカリ土類金属、不完全なｄ副殻をもつ陽イオンを生じる金属、ランタニド金属およびアクチニド金属からなる群より選択される金属の陽イオンである。好ましい実施形態では、遷移金属はＣｕ（II）、Ｃｕ（III）、Ｎｉ（II）、Ｎｉ（III）、Ｚｎ（II）、Ｆｅ（II）、Ｆｅ（III）、Ｃｏ（II）、Ｃｏ（III）、Ｃｒ（II）およびＣｒ（III）からなる群より選択される。

本発明のリガンド部分は、速度論的特性、特に好ましくは少なくとも不活性化反応の速度定数（ｋ_ｃａｔ）と同等のｋ_ｏｆｆ値で所望の生化学的標的と結合する任意の分子官能基であり得る。特定の実施形態では、リガンド部分のその標的に対する親和性が約１０^４Ｍ^−１〜約５×１０^８Ｍ^−１である。このような分子官能基は通常、有機モチーフを含むものとなる。特定の実施形態では、分子官能基はペプチド骨格、炭水化物骨格または核酸骨格のうちの１つ以上を含む。分子の例には二次代謝産物、抗体、タンパク質核酸、アプタマー、オリゴヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、細胞受容体に対する天然のリガンド部分などがある。ここに挙げたものは限定することを意図するものではない。好ましい実施形態では、リガンド部分はアプタマー、有機小分子、ペプチド模倣物、デンドリマー、抗生物質、二次代謝産物および抗体からなる群より選択される有機分子モチーフを含む。

本発明の金属結合部分は、触媒活性のある立体配座で金属と結合する任意の化学構造であり得る。特定の実施形態では、金属結合部分は、有機キレート配位子上のアミン官能基およびカルボン酸官能基を用いる当該技術分野で公知の有機キレート配位子などの有機キレート配位子を含む。例を挙げれば、このような有機キレート配位子は好ましくは、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、メルカプトアセチルグリシン（ＭＡＧ３）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（シクラム）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン、シクレン、１，４，７−トリアザシクロノナン（ＴＡＣＮ）およびヒドラジノニコチンアミド（ＨＹＮＩＣ）からなる群より選択される化合物の配位化学を用いて金属に配位するものである。

本発明の組成物は様々な生化学的標的、例えば細菌成分、ウイルス成分、真菌成分、ヒト細胞成分、原生動物成分、血清成分、細胞外基質成分、癌細胞成分および病原体由来毒素からなる群より選択される生化学的標的などに対して活性をもつものである。例を挙げれば、特定のある実施形態では、生化学的標的は細胞受容体、サイトカイン、ホルモン、酵素およびミスフォールドされたまたはポリマー形態の天然分子からなる群より選択される細胞成分または血清成分である。組成物が生化学的標的と結合したとき、金属触媒の反応速度を向上させるため金属結合部分が生化学的標的から２０ｎｍ以内の位置に来ることができる。

関連する態様では、本発明は、生化学的標的に対するリガンド部分となる現在用いられているまたは候補となる治療用分子の効果を向上させる方法を提供し、この方法は、金属結合ドメインを欠く前記現在用いられているまたは候補となる治療用分子を金属結合部分と共有結合させることを含み、好ましくは、現在用いられているまたは候補となる治療用分子は、その目的とする生化学的標的と約１０^４Ｍ^−１〜約５×１０^８Ｍ^−１の親和性で結合し、かつ／または最適には少なくとも金属結合部分の不活性化反応の速度定数（ｋ_ｃａｔ）と同等であるｋ_ｏｆｆでその目的とする生化学的標的と結合する。

他の関連する態様では、本発明は、生化学的標的を治療的に不活性化する方法を提供し、この方法は、本発明による組成物が生化学的標的と結合し、その近くで活性酸素種を発生する条件下で、本発明による組成物をそれを必要とする対象に投与し、発生した活性酸素種の集中により生化学的標的の立体配座および／または機能を変化させて治療効果をもたらすことを含む。

他の関連する態様では、本発明は、生化学的標的を治療的に不活性化する方法を提供し、この方法は、本発明による組成物が生化学的標的と結合し、その近くでＬｅｗｉｓ酸触媒としての活性をもつ条件下で、本発明による組成物をそれを必要とする対象に投与し、発生した反応種の集中により生化学的標的の立体配座および／または機能を変化させて治療効果をもたらすことを含む。

Ｃｕ−ＧＧＨＧＤｅＬＩ（Ｃｈａ）Ｃ錯体はＨＣＶプロテアーゼに対して比較的高い親和性結合（Ｋ_Ｉが約５００ｎＭ）を示す（左）が、触媒効率は低く、アスコルビン酸／Ｏ_２の存在下で不活性化の速度定数ｋ_{ｉｎａｃｔ}が０．０８３時間^−１未満であり（右）、このことは修飾され不活性化されたプロテアーゼからの触媒の律速的な解離を反映している可能性が高い。 Ｃｕ−ＧＧＨＧＤＥＭＥＥＣ錯体はＨＣＶプロテアーゼに対して比較的低い親和性結合（Ｋ_Ｉが約４８μＭ）を示す（左）が、触媒効率は図１で示されるものよりも向上しており、アスコルビン酸／Ｏ_２の存在下で不活性化の速度定数ｋ_{ｉｎａｃｔ}が約１．６時間^−１であり（右）、このことは修飾され不活性化されたプロテアーゼからの触媒の解離がより速いことと一致している。 ｓＡＣＥ−１を標的とする本発明のリシノプリル金属製剤の例を示す図である。 例示のリシノプリル金属製剤について、親和性に対してプロットした活性の変化を示すグラフであり、金属製剤の不活性化作用が増大するとその結合が弱くなることを示している。 ＨＩＶ ＲＲＥ ＲＮＡを標的とする本発明のＲＥＶペプチド金属製剤の例を示す図である。 ＨＣＶ ＩＲＥＳ ＲＮＡのステムループドメイン構造を示す図である。 ＧＧＨＹｒＦＫ−ＮＨ_２とＨＣＶ ＩＲＥＳ ＲＮＡのステムループIIｂとの結合曲線（上）ならびに金属製剤Ｃｕ−ＧＧＨＹｒＦＫ−ＮＨ_２（四角）およびそのＤ異性体Ｃｕ−ＧＧｈｙｒｆｋ−ＮＨ_２（丸）（下）のＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎプロットを示す図である。

本発明はその適用が、以下の説明に記載するあるいは図面に図示する構成の詳細および構成要素の配置に限定されないことを理解するべきである。本発明は、記載されているもの以外の実施形態をとることが可能であり、また様々な方法で実践および実施することが可能である。また、本明細書および要約で使用される語法および用語は説明を目的とするものであって、限定目的ではないと見なすべきものであることを理解するべきである。

したがって、本開示の基礎となる概念を本発明のいくつかの目的を実施するための他の構造、方法およびシステムを設計する基礎として容易に利用し得ることを当業者は理解するであろう。したがって、このような同等の構造が本発明の趣旨および範囲を逸脱しない限りにおいて、特許請求の範囲をこのような同等の構造を包含するものとして考えることが重要である。

（発明の詳細な説明）
本発明は、金属結合部分とリガンド部分を結合させる金属製剤に関する。このような金属製剤は、それと結合した金属種により、金属製剤の金属触媒要素を用いて所望の標的物を触媒的に分解するか不活性化する。リガンド部分を含むことにより、金属製剤を所望の標的生体分子に優先的に送達することが可能となる。このような金属製剤は核酸およびタンパク質の生体分子をともに標的とすることができ、治療および予防目的の医薬組成物に使用することができる。通常、核酸標的がリボースＨ原子引き抜きにより仲介される鎖切断反応の対象となるのに対し、タンパク質は酸化的損傷または主鎖の加水分解もしくは酸化的切断により不活性化される。

金属製剤のその標的生体分子に対する親和性を慎重に選択することにより、標的の触媒的不活性化の効率を向上させることができる。これは親和性と結合のｏｎ／ｏｆｆ速度定数（Ｋ_{ａｓｓｏｃ}＝ｋ_ｏｎ／ｋ_ｏｆｆ）との関係によるものである。ｋ_ｏｎ値が大きくなる、および／またはｋ_ｏｆｆ値が小さくなることにより、標的生体分子との高い親和性での結合が促進されるが、このことは当該技術分野では薬剤化合物にとって好ましいものであると考えらえている。本発明はこれに対し、効率的な触媒回転が、金属製剤触媒の新たな標的分子に対する利用可能性を得るためには最適には少なくとも不活性化反応の速度定数（ｋ_ｃａｔ）と同等のｋ_ｏｆｆ値を必要とし、比較的高いｋ_ｏｎ値およびｋ_ｏｆｆ値により最も促進されることを示すものである。これによりＫ_{ａｓｓｏｃ}値が小さくなる。実際、当該技術分野での教示とは逆に、このような結合親和性が低い金属製剤は標的生体分子のより効率的な不活性化を促進することが可能であり、このことは、標的を変化させた後に金属製剤触媒がより迅速に標的から解離することと一致する。さらに、本発明の金属製剤は、金属結合リガンドの結合親和性と良好な位置の両方によりその目的とする不活性化標的に対する選択性を獲得することから、標的外分子との結合に対する耐性が高い。

定義
ヒト、哺乳動物、哺乳動物対象、動物、獣医学対象、プラセボ対象、研究対象、実験対象、細胞、組織、器官または生体液に適用される「投与」は、特に限定されないが、外部のリガンド部分、試薬、プラセボ、小分子、医薬品、治療剤、診断剤または組成物を対象、細胞、組織、器官または生体液などに接触させることを指す。「投与」は、例えば治療法、薬物動態的方法、診断法、研究方法、プラセボ法および実験法を指すことがある。細胞の治療には、細胞に試薬を接触させることおよび細胞と接触している液体に試薬を接触させることが包含される。「投与」にはこのほか、試薬組成物、診断組成物、結合組成物による、または別の細胞による、例えば細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｅｘ ｖｉｖｏでの治療が包含される。

「精製された」および「単離された」は、それがＰＰＳ割合（ＰＰＳ ｆｒａｃｔｉｏｎ）に関するものである場合、特定の分子量の範囲が本発明のＰＰＳの少なくとも５０重量％、より多くの場合は少なくとも６０重量％、一般的には少なくとも７０重量％、より一般的には少なくとも７５重量％、最も一般的には少なくとも８０重量％、通常は少なくとも８５重量％、より通常には少なくとも９０重量％、最も通常には少なくとも９５重量％、従来通りには少なくとも９８重量％またはそれ以上を占めることを意味する。水、緩衝剤、塩、界面活性剤、還元剤、プロテアーゼ阻害剤、安定化剤（添加されたアルブミンのようなタンパク質を含む）および賦形剤ならびに分子量が１０００未満の分子の重量は一般に、純度の決定では使用されない。

「特異的に」または「選択的に」結合するは、それがリガンド／受容体、核酸／相補的核酸、抗体／抗原またはその他の結合ペア（例えば、サイトカインとサイトカイン受容体）（本明細書では、それぞれ一般に「標的生体分子」または「標的」と呼ぶ）に関するものである場合、タンパク質と他の生物製剤の不均一な集団内に標的が存在することに関連する結合反応を表す。特異的結合は、例えば、企図される方法の結合化合物、核酸リガンド、抗体または抗体の抗原結合部位由来の結合組成物が、非標的分子との親和性よりも、多くの場合少なくとも２５％高い、より多くの場合少なくとも５０％高い、最も多くの場合少なくとも１００％（２倍）高い、通常は少なくとも１０倍高い、より通常には少なくとも２０倍高い、最も通常には少なくとも１００倍高い親和性でその標的と結合することを意味し得る。

ｋ_ｃａｔとｋ_ｏｆｆのような２つの速度定数に関して、「少なくとも同等である」という語句は、互いの±１０倍、好ましくは互いの±５倍の値を指す。

「リガンド」は、標的生体分子と結合する小分子、核酸、ペプチド、ポリペプチド、糖、多糖、グリカン、糖タンパク質、糖脂質またはその組合せを指す。このようなリガンドは受容体のアゴニストまたはアンタゴニストであり得るが、リガンドにはほかにも、アゴニストでもアンタゴニストでもなく、アゴニストの特性もアンタゴニストの特性もない結合物質が包含される。リガンドがその同種標的と特異的に結合することを「親和性」という観点から表すことが多い。好ましい実施形態では、本発明のリガンドは約１０^４Ｍ^−１〜約５×１０^８Ｍ^−１の親和性で結合する。親和性は、Ｋ_ｄ＝ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ（ｋ_ｏｆｆは解離速度定数、ｋ_ｏｎは結合速度定数、Ｋ_ｄは平衡定数である）で計算される。

様々な濃度（ｃ）における標識したリガンドの結合比（ｒ）を測定することにより、平衡状態での親和性を求めることができる。Ｓｃａｔｃｈａｒｄの式：ｒ／ｃ＝Ｋ（ｎ−ｒ）（式中、ｒ＝平衡状態での結合リガンドのモル数／受容体のモル数；ｃ＝平衡状態での遊離リガンドの濃度；Ｋ＝平衡結合定数；ｎ＝受容体１分子当たりのリガンド結合部位数）を用いてデータをグラフに表す。グラフ解析によりｒ／ｃをＹ軸に、ｒをＸ軸にプロットし、Ｓｃａｔｃｈａｒｄプロットを作成する。Ｓｃａｔｃｈａｒｄ解析による親和性の評価は当該技術分野で周知である。例えば、ｖａｎ Ｅｒｐら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ １２：４２５−４３，１９９１；ＮｅｌｓｏｎおよびＧｒｉｓｗｏｌｄ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｐｒｏｇｒａｍｓ Ｂｉｏｍｅｄ．２７：６５−８，１９８８を参照されたい。別法では、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）により親和性を測定することができる。典型的なＩＴＣ実験では、リガンドの溶液をその同種標的の溶液中に滴定する。両溶液の相互作用により放出される熱（ΔＨ）を経時的にモニターする。ＩＴＣセルにリガンドを連続的に添加していくつれ、吸収または放出される熱の量が結合量と正比例するようになる。系が飽和に達すると熱シグナルが減少し、希釈熱のみが観察されるようになる。次いで、注入ごとに得られた熱をセル内のリガンドと結合パートナーの比に対してプロットしたものから結合曲線を得る。しかるべき結合モデルにより結合曲線を解析してＫ_Ａ、ｎおよびΔＨを求める。Ｋ_Ａ＝１／Ｋ_ｄであることに注意する。

本明細書で使用される「滅菌」および「滅菌する」という用語は、表面、液体、薬剤または生物培地のような培地などの無生物に存在する微生物の一部または全部、好ましくは伝染性微生物（特に限定されないが、真菌、細菌、ウイルス、胞子形態などを含む）の一部または全部を排除（除去）または殺滅するあらゆる過程を指す。この文脈における「表面」には、繊維製品、手袋、壁、天板などの対象物が含まれる。

本明細書で使用される「対象」という用語は、ヒトまたは非ヒト生物体を指す。したがって、本明細書に記載の方法および組成物は、ヒト疾患にも獣医学的疾患にも、また無生物の滅菌にも適用可能である。特定の実施形態では、対象とは「患者」、すなわち、疾患または状態で医療を受けている生存中のヒトのことである。これには、疾患が確定されておらず、病理の徴候を調査中の者が含まれる。既に炎症性疾患、鎌状赤血球症、細菌性疾患、ウイルス性疾患、癌、アテローム性動脈硬化症、末梢動脈閉塞性疾患、急性冠動脈症候群、その他の心血管疾患、急性肺傷害、全身性エリテマトーデスまたは多発性硬化症の診断が下されている対象が好ましい。

「治療有効量」は、患者ベネフィットを示す、すなわち、治療する状態の症状の軽減、予防または改善をもたらすのに十分な試薬または医薬組成物の量と定義される。薬剤または医薬組成物が診断剤を含む場合、「診断有効量」は、シグナル、画像またはその他の診断パラメータを得るのに十分な量と定義される。医薬製剤の有効量は、患者の感受性、患者の年齢、性別および体重ならびに患者の特異的反応などの因子によってことなる（例えば、Ｎｅｔｔｉらに対して発行された米国特許第５，８８８，５３０号を参照）。「有効量」には、特に限定されないが、医学的状態もしくは障害またはその原因となる過程の症状または徴候を改善する、元の状態に戻す、緩和する、予防する、あるいは診断することができる量が包含される。「有効量」は、明記により、または文脈からそうでないことが明らかでない限り、状態を改善するのに十分な最小量に限定されるわけではない。

「治療」（状態または疾患に関して）とは、好ましくは臨床結果を含む、有益なまたは所望の結果を得る方法のことである。本発明の目的においては、疾患に関する有益なまたは所望の結果には、特に限定されないが、疾患の予防、疾患に関連する状態、疾患の治癒、疾患の重症度の軽減、疾患の進行の遅延、疾患に関連する１つ以上の症状の軽減、疾患に罹患している者の生活の質の向上および／または生存期間の延長のうちの１つ以上が含まれる。同様に、本発明の目的においては、状態に関連する有益なまたは所望の結果には、特に限定されないが、状態の予防、状態の改善、状態の治癒、状態の重症度の軽減、状態の進行の遅延、状態に関連する１つ以上の症状の軽減、状態に罹患している者の生活の質の向上および／または生存期間の延長のうちの１つ以上が含まれる。例えば、本明細書に記載の組成物を癌の治療に用いる実施形態では、有益なまたは所望の結果には、特に限定されないが、腫瘍細胞もしくは癌細胞の増殖低下（または破壊）、癌にみられる腫瘍細胞の転移の減少、腫瘍の大きさの縮小、癌に起因する症状の軽減、癌患者の生活の質の向上、疾患の治療に必要な他の薬剤の用量の減少、癌の進行の遅延および／または癌患者の生存期間の延長のうちの１つ以上が含まれる。文脈によっては、対象の「治療」は、対象が治療を必要としている、例えば、対象が試薬の投与により改善が期待される障害を有する状況にあることを意味することがある。

本明細書で使用される「抗体」という用語は、１つないし複数の免疫グロブリン遺伝子またはそのフラグメントに由来するか、これをモデルとするか、実質的にこれにコードされ、抗原またはエピトープと特異的に結合することができるペプチドまたはポリペプチドを指す。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）；Ｗｉｌｓｏｎ（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １７５：２６７−２７３；Ｙａｒｍｕｓｈ（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５：８５−９７を参照されたい。抗体という用語には、抗原との結合能を保持する抗原結合部分、すなわち、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体単腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含めた「抗原結合部位」（例えば、フラグメント、部分配列、相補性決定領域（ＣＤＲ））が含まれる。「抗体」という用語にはこのほか、一本鎖抗体が言及により含まれる。

金属結合部分
適切な金属結合ドメインが例えば、米国特許第５，０５７，３０２号、同第５，３２６，８５６号、同第５，４８０，９７０号、同第６，００４，５３１号、同第６，４０３，７７７号および国際公開第０５／１１７９９７号に記載されており、上記特許文献はそれぞれ、すべての表、図および請求項を含めたその全体が本明細書に組み込まれる。本発明の金属製剤は、二官能性キレート剤を用いてリガンド部分と金属結合ドメインをカップリングさせることにより形成することができる。一連の金属結合基と、タンパク質基質と共有結合することができる部分とを含むこのようなキレート剤は当該技術分野で公知である。キレート化基上でアミン基およびカルボン酸基を用いて金属に配位するキレート化基が好ましい。例としては、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、メルカプトアセチルグリシン（ＭＡＧ３）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（シクラム）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン、シクレン、１，４，７−トリアザシクロノナン（ＴＡＣＮ）およびヒドラジノニコチンアミド（ＨＹＮＩＣ）ならびにこれらの誘導体などの化合物が挙げられる。

ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびその誘導体は、２本のエチレン鎖により連結された３個の窒素原子からなる骨格を含むものである。骨格上の窒素原子からは５つのカルボキシメチル部分が伸びている。カルボキシメチル基の１つを抗体またはその他のタンパク質分子上にあるアミノ酸残基と反応させてアミド結合を形成させ得る方法が記載されている。反応後、他の４つのカルボキシメチル部分は依然として、３個の窒素原子とともに金属との結合に利用可能な状態にある。

このような望ましくない架橋が起こる可能性を回避するために、固有のタンパク質基質反応部位を組み込む二官能性キレート剤が開発されている。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびその誘導体は、１本のエチレン鎖により連結された２個の窒素原子からなる骨格を含むものである。骨格上の窒素原子からは、窒素原子とともに金属に適した４つのカルボキシメチル部分が伸びている。ＥＤＴＡの二官能性キレート誘導体は、ポリアミン骨格のメチレン炭素に固有の反応機能が付加されていることを特徴とするものである。Ｓｕｎｄｂｅｒｇら（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１７，１３０４（１９７４））は、パラ−アミノフェニルタンパク質反応置換基を有するＥＤＴＡ誘導体の合成を開示している。この誘導体は次いで、アミンと化学修飾されたタンパク質の一部分との反応により、あるいは第一級アミンを処理し、穏やかな条件下でタンパク質基質と結合することができる他の置換基を形成することにより、穏やかな条件下でタンパク質基質とカップリングすることができる二官能性キレート剤に変換され得る。

Ｍｅａｒｅｓら（Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．，３，２１５−２２８（１９８４））は、パラ−アミノフェニル誘導体を亜硝酸処理によりジアゾニウム誘導体へ、チオホスゲン処理によりイソチオシアナート誘導体へ、ブロモアセチルブロミド処理によりブロモアセトアミド誘導体へ、塩化パルミトイル処理によりパルミタミドベンジル誘導体へ変換する方法を開示している。Ａｌｔｍａｎら（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ．，３６５，５９−６２（１９８３））は、数多くの上記ＥＤＴＡ化合物のフェネチル類似体を開示している。このほか、Ｓｕｎｄｂｅｒｇらの米国特許第３，９９４，９６６号を参照されたい。

環状キレート剤が当該技術分野で公知である。Ｋｒｏｌｌら（Ｎａｔｕｒｅ，１８０ ９１９−２０（１９５７））は、ヒト体内からの重金属イオンの除去にシクロヘキサン−１，２−トランス−ジアミン四酢酸を使用することを開示している。Ｍｏｉら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４８，２４９−２５３（１９８５））は、生理的条件下のヒト血清中できわめて安定な銅キレートを形成する、６−（ｐ−ニトロベンジル）−１，４，８，１１−テトラ−アザシクロテトラデカンＮ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ｐ−ニトロベンジル−ＴＥＴＡ）と称される大環状二官能性キレート剤前駆体を開示している。さらに、ＴＥＴＡのｐ−ブロモアセトアミドベンジル誘導体は、モノクローナル抗体とのコンジュゲーション後に高い安定性を示す。Ｍｏｉらによる参考文献にはほかにも、コンジュゲートがタンパク質とＴＥＴＡの間にスペーサ基を含むいくつかの場合に、金属との結合率が向上し得ることを開示している。

このほか、キレート剤を開示しているＧｒｅｅｎら（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，１２，３８１−８５（１９８５））およびＴａｌｉａｆｅｒｒｏら（Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２３ １１８８−９２（１９８４））による開示も本発明において有用である。Ｇｒｅｅｎらは、ガリウム６８およびインジウム１１１と錯体を形成した六座配位子のＮ，Ｎ’−ジピリドキシルエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸（ＰＬＥＤ）を開示している。Ｔａｌｉａｆｅｒｒｏらは、ＰＬＥＤキレートならびにＮ，Ｎ’−エチレン−ビス［２−（ｏ−ヒドロキシフェニル）グリシン］（ＥＨＰＧ）およびＮ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン−，Ｎ，Ｎ’−二酢酸（ＨＢＥＤ）のキレートを開示している。

既知のＤＴＰＡおよびＥＤＴＡ誘導体の他の変形物としては、パラ−アミノフェニル置換基をポリアミン骨格のメチレン炭素に結合させたＤＴＰＡの誘導体を開示しているＢｒｅｃｈｂｉｅｌら（Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２５，２７７２−８１（１９８６））のものが挙げられる。さらに、Ａｌｔｍａｎら（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ．，５９（１９８４））は、ＥＤＴＡの２−カルボキシエチルキレート誘導体を開示している。

他の例では、金属結合ドメインはアミノ末端Ｃｕ（II）／Ｎｉ（II）結合（「ＡＴＣＵＮ」）モチーフを含み得る。ＡＴＣＵＮモチーフは、（１）遊離ＮＨ２末端と、（２）２個の介在ペプチド窒素と、（３）３位のヒスチジン（Ｈ）残基とを有するペプチドを含む。ＡＴＣＵＮモチーフペプチドはＣｕ（II）、Ｎｉ（II）、Ｆｅ（III）、Ａｌ（III）、Ｃｏ（II）およびＣｏ（III）などの金属と結合することができる。ＡＴＣＵＮモチーフの具体例としては、特に限定されないが、ＧＧＨ、ＫＧＨＫ、ＶＩＨＮおよびＹＩＨＰＦが挙げられる。金属Ｍが結合したこれらの具体的なＡＴＣＵＮモチーフが図１に示されている。さらに別の例では、金属結合モチーフがペプチド配列の内部に存在し得る。

さらにほかの例では、金属結合ドメインは、金属結合基を含む非天然アミノ酸による修飾を有するＡＴＣＵＮモチーフを含み得る。この修飾は、ＡＴＣＵＮモチーフのＮ末端およびＣ末端における修飾に由来する非天然アミノ酸であり得る。例えば、環化リジンおよびピリジル／ピラゾリル末端第二級アミノ官能基を使用し得る。

さらに別の例では、ペプチドのＮ末端がＡＴＣＵＮモチーフを有し得る。適切なＮ末端修飾がＣｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００２，６，８０９−８１５に記載されている。ペプチドのＣ末端がＡＴＣＵＮモチーフを有し得る。このような金属結合ドメインのスキームの例が図２に示されている。この種類の金属結合ドメインはＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０００，１１，７６２−７７１で論じられている。別の適切な金属結合ドメインは、ペプチドの内部にＡＴＣＵＮモチーフを有するペプチドである。このようなドメインを調製するスキームがＡｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９９，３２（１０），８２７において図３に示され、論じられている。ペプチドは、任意の適切な長さの任意の適切なペプチドであり得ることが理解されよう。さらに、ＡＴＣＵＮモチーフは任意の適切なモチーフであり得ることが理解されよう。

別の例では、ＡＴＣＵＮモチーフを有する金属結合ドメインを修飾して、金属との反応性を増大させ得る。ＡＴＣＵＮモチーフのＮ末端を修飾して、第一級アミノ官能基を第二級アミノ官能基に置き換え得る。例えば、Ｓｃｈｉｆｆ塩基を用い得る。さらに、ＡＴＣＵＮモチーフ内の１つ以上のアミノ酸（第３位のＨｉｓを除く）に一点の変形を施し得る。例えば、Ｘａａ−Ｇ−ＨまたはＧ−Ｘａａ−Ｈ（Ｘａａは任意のアミノ酸を表す）を用い得る。さらに、ＡＴＣＵＮモチーフの１つ以上のアミノ酸のＤ型アミノ酸をＬ型アミノ酸に置換し得る。いずれの場合にも、このような修飾は、金属との反応性の調節をもたらすＡＴＣＵＮモチーフにおける立体構造および電子の変化を含み得る。

さらにほかの例では、金属結合ドメインは、一続きのＰＨＧＧＧＷＧＱを有するプリオンタンパク質の８反復モチーフを含み得る。さらなる例では、金属結合ドメインは、モチーフのＮ末端から数えて１番目の残基としてヒスチジン（Ｈ）および３番目の残基としてグリシン（Ｇ）を含むモチーフを含み得る。例えば、金属結合ドメインはＨＧＧ、ＨＧＧＧ、ＨＧＧＧＧ、ＨＧＧＣなどを含み得る。このドメインはペプチド配列内で反復されてもよく、またシステイン（Ｃ）残基を組み込んで金属との結合親和性を増大させてもよい。モチーフは金属結合ドメインの１つないし複数の部分のみを含み得ることが理解されよう。別の例では、金属結合ドメインは、Ｎ末端から３番目の残基としてヒスチジン（Ｈ）を有するモチーフを含み得る。例えば、金属結合ドメインは、Ｘａａが任意のアミノ酸であるＸａａ−Ｘａａ−Ｈを含み得る。モチーフは金属結合ドメイン内で反復されてもよく、またモチーフは金属結合ドメインの１つないし複数の部分のみを含み得る。１つの例では、金属結合ドメインは、３番目の残基としてＨを有するモチーフならびに／または１番目の残基としてＨおよび３番目の残基としてＧを有するモチーフを含む、あるいは配列内の任意の場所にＸａａ−Ｈ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−のモチーフを有する、約３０アミノ酸未満の短いペプチドを含み得る。

金属結合ドメインはこのほか、２つのシステイン（Ｃｙｓ）残基と２つのヒスチジン（Ｈｉｓ）残基とを含む亜鉛結合単位を有するジンクフィンガーペプチドを含み得る。適切なこのようなジンクフィンガーペプチドの１つが、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９２ Ｊｕｎ．１；８９（１１）：４７９６−８００に報告されているＬｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓである。金属結合ドメインは、低分子量の合成金属結合モチーフとの短いペプチドコンジュゲートを含み得る。小分子量の合成金属結合モチーフは、所望の金属と結合するように選択され得る。例えば、合成金属結合モチーフはシクラム、ビピリジル、テルピリジン、ポルフィリンおよびＴＲＥＮ（トリス（２−アミノエチル）アミン）を含み得る。金属結合ドメインは、Ｘａａ−Ｘａａ−シクラム／ビピリジルなどを含み得る。さらに、金属結合ドメインは、金属結合能を有するペプチド模倣物を含み得る。

別の例では、金属結合ドメインは、標的化ペプチドを標識するシクラムキレートモチーフであり得る。

金属結合ドメインは、金属と金属結合ドメインが結合して、金属−リガンド錯体が形成されるように所望の金属に曝露することが好ましい。金属結合ドメインを、標的化ドメインとのコンジュゲート形成前に金属に曝露しても、コンジュゲート形成後に金属に曝露してもよいことが理解されよう。任意の適切な金属を用い得る。適切な金属の例としては、Ｃｕ（II）、Ｃｕ（III）、Ｎｉ（II）、Ｎｉ（III）、Ｚｎ（II）、Ｆｅ（II）、Ｆｅ（III）、Ｃｏ（II）、Ｃｏ（III）、Ｃｒ（II）およびＣｒ（III）などの遷移金属ならびに他の２行目および３行目の遷移金属イオンならびにＡｌ（III）などの非遷移金属が挙げられる。金属は、任意の適切な方法で金属結合ドメインと結合させ得る。例えば、ペプチドを１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ＝７．４）に溶かした１ｍＭ溶液と、ＣｕＣｌ_２を１０ｍＭトリス緩衝液に溶かした０．９５ｍＭ溶液を１：１の比で混合し得る。他の任意の適切な方法を用い得ることが理解されよう。また、金属は細胞内または生理的環境からも補充され得る。

リガンド部分
本発明のリガンド部分は、所望の速度論的特性、特に好ましくは少なくとも不活性化反応の速度定数（ｋ_ｃａｔ）と同等のｋ_ｏｆｆ値で所望の生化学的標的と結合する任意の分子官能基であり得る。特定の実施形態では、リガンド部分のその標的に対する親和性が約１０^４Ｍ^−１〜約５×１０^８Ｍ^−１である。このような分子官能基は通常、有機モチーフを含む。特定の実施形態では、分子官能基はペプチド骨格、炭水化物骨格または核酸骨格のうちの１つ以上を含む。分子の例には二次代謝産物、抗体、タンパク質核酸、アプタマー、オリゴヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、細胞受容体に対する天然のリガンドなどがある。ここに挙げたものは限定することを意図するものではない。

抗体に関しては、ポリペプチドのライブラリーを作製し、選択された分析物と所望の親和性で結合するものをスクリーニングするファージディスプレイ技術の使用が数多くの刊行物で論じられている。例えば、Ｃｗｉｒｌａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，６３７８−８２，１９９０；Ｄｅｖｌｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，４０４−６，１９９０，ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，３８６−８８，１９９０；ならびにＬａｄｎｅｒら，米国特許第５，５７１，６９８号を参照されたい。ファージディスプレイ法の基本的概念は、スクリーニングの対象となるポリペプチドをコードするＤＮＡとそのポリペプチドとの間で物理的関係を構築することである。この物理的関係は、ポリペプチドをコードするファージゲノムを封入しているキャプシドの一部分としてそのポリペプチドを提示するファージ粒子によりもたらされる。ポリペプチドとその遺伝物質との間の物理的関係を構築することにより、様々なポリペプチドを保有する莫大な数のファージの大量スクリーニングが可能となる。標的との親和性を有するポリペプチドを提示するファージがその標的と結合し、結合したファージは、その標的に対する親和性スクリーニングにより濃縮される。このファージにより提示されるポリペプチドの正体アイデンティティは、それぞれのゲノムから決定することができる。このような方法を用いて所望の標的との結合親和性を有するものとして同定されたポリペプチドを、次いで従来の手段により大量に合成することができる。例えば、すべての表、図および請求項を含めたその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，０５７，０９８号を参照されたい。

次いで、対象となる精製ポリペプチドに対する親和性および特異性に関する最初のスクリーニングにより、さらに必要に応じて、その結果を、結合から排除することが望まれるポリペプチドに対する抗体の親和性および特異性と比較することにより、上に挙げた方法により作製された抗体を選択し得る。スクリーニングの手順には、マイクロタイタープレートの個々のウェルに精製ポリペプチドを固定化することが含まれ得る。次いで、可能性のある抗体または抗体のグループを含有する溶液を個々のマイクロタイターウェルに入れ、約３０分〜２時間インキュベートする。次いで、マイクロタイターウェルを洗浄し、このウェルに標識二次抗体（例えば、生じた抗体がマウス抗体であれば、アルカリホスファターゼとコンジュゲートされた抗マウス抗体）を加え、約３０分間インキュベートした後、洗浄する。ウェルに基質を加えると、固定化したポリペプチド（１つまたは複数）に対する抗体が存在するウェルに呈色反応が現れる。

アプタマーとは、特定の標的分子と結合するオリゴ核酸またはペプチド分子のことである。アプタマー通常、大きなランダム配列のプールから選択することにより作製されるが、天然のアプタマーも存在する。向上したｉｎ ｖｉｖｏ安定性や向上した送達性などの向上した特質をリガンドに付与する修飾ヌクレオチドを含む高親和性アプタマー。このような修飾の例としては、リボース位および／またはリン酸位および／または塩基位での化学的置換が挙げられ、またアミノ酸側鎖官能基を挙げ得る。例えば、Ｍｅｎｇｅｒら，Ｈａｎｄｂ Ｅｘｐ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１７３：３５９−７３（２００６）を参照されたい。

アプタマーには核酸アプタマー（すなわち、一本鎖ＤＮＡ分子または一本鎖ＲＮＡ分子）とペプチドアプタマーがある。アプタマーは、特異性が高くコンホメーションに依存した方法で標的分子と結合する。アプタマーは、メチル基またはヒドロキシル基の有無などのごくわずかな違いにより標的同士を識別することが示されており、あるアプタマーはＤ−鏡像異性体とＬ−鏡像異性体を識別することができる。特定のタンパク質、ＤＮＡ、アミノ酸およびヌクレオチドに対する親和性を有する数多くのアプタマーが記載されている（例えば、Ｋ．Ｙ．Ｗａｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：１８９９−１９０４（１９９３）；Ｐｉｔｎｅｒら，米国特許第５，６９１，１４５号；Ｇｏｌｄら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：７６３−７９７（１９９５）；Ｓｚｏｓｔａｋら，米国特許第５，６３１，１４６号）。アプタマーは、用いる選択方法に応じて平衡解離定数がマイクロモル〜ナノモル未満の範囲となり得る。

核酸アプタマーは、「指数関数的増幅によるリガンドの系統的進化（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）」（ＳＥＬＥＸ）として知られるｉｎ ｖｉｔｒｏ選択法により同定することができる。ＳＥＬＥＸ法では、例えば、多くの場合６０〜１００ヌクレオチドもの長さの配列が１０^１４〜１０^１５個含まれている巨大なオリゴヌクレオチドのコンビナトリアルライブラリーを、ｉｎ ｖｉｔｒｏの選択工程および増幅工程の反復作業によりルーチン的にスクリーニングする。ほとんどの標的が８〜１５サイクル以内に親和性により増幅されるが、この工程は自動化され、より迅速なアプタマーの単離が可能になっている。ペプチドアプタマーは通常、特に限定されないが、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、選択的に感染させたファージIを用いた技術（ＳＩＰ）などを含めた、当該技術分野で公知のいくつかの異なるタンパク質設計技術により同定される。アプタマーに関する詳細な記載は、関連するプロトコルも含め、特にＬ．Ｇｏｌｄ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０（２３）：１３５８１−８４（１９９５）；Ｌ．Ｇｏｌｄら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：７６３−９７（１９９５）；Ｓ．Ｊａｙａｓｈｅｎａ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４５：１６２８−５０（１９９９）；Ｖ．Ｓｉｅｂｅｒら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：９５５−６０（１９９８）；Ｌ．Ｊｅｒｍｕｔｕｓら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ．９：５３４−４８（１９９８）；Ｄ．ＷｉｌｓｏｎおよびＪ．Ｓｚｏｓｔａｋ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６８：６１１ ４７（１９９９）；Ｌ．Ｊｅｒｍｕｔｕｓら，Ｅｕｒ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，３１：１７９−８４（２００２）；Ｇ．Ｃｏｎｎｅｌｌら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３２：５４９７−５５０２（１９９３）；Ｍ．Ｆａｍｕｌｏｋら，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３３：５９１ ９９（２０００）；Ｗ．Ｊａｍｅｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１：５４０−４６（２００１）；Ｊ．Ｃｏｘら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３０（２０）：ｅ１８（２００２）；Ｓ．ＣｌａｒｋおよびＶ．Ｒｅｍｃｈｏ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｉ ２３：１３３５−４０，２００２；Ａ．Ｔａｈｉｒｉ−Ａｌａｏｕｉら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３０（１０）：ｅ４５（２００２）；Ａ．ＫｏｐｙｌｏｖおよびＶ．Ｓｐｉｒｉｄｏｎｏｖａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３４：９４０−５４（２０００）；Ｊ．Ｂｌｕｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９７：２２４１−４６（２０００）；Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｉ Ｃ．Ｂａｒｂａｓ，Ｄ．Ｂｕｒｔｏｎ，Ｊ．ＳｃｏｔｔおよびＧ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）；Ｓ．Ｊｕｎｇら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４：１６３−８０（１９９９）；Ｎ．Ｒａｆｆｌｅｒら，Ｃｈｅｍ．＆ Ｂｉｏｌ．，１０：６９−７９（２００３）；Ａ．Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎら，Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．５５：３６７−４０３（２０００）；Ａｍｓｔｕｔｚら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１２：４００−０５（２００１）；Ｊ．ＨａｎｅｓおよびＡ．Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４：４９３７−４２（１９９７）；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ，Ｅ．Ｇｏｌｅｍｉｓ，ｅａ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（２００１）；Ｃ．Ｋｒｅｂｂｅｒら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６８：６０７−１８（１９９７）；Ｓ．Ｓｐａｄａら，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７８：４４５−５６（１９９７）；Ｂ．Ｗｌｏｔｚｋａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｉ ９９：８８９８−８９０２（２００２）；Ｒ．ＲｏｂｅｒｔｓおよびＪ．Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４：１２２９７−１２３０２（１９９７）；Ｐ．Ｃｏｌａｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９７：１３７２０−２５（２０００）；ならびにＹ．Ｊｉａｎｇら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７５：２１１２−１６（２００３）にみることができる。

本明細書で使用される小分子は、分子量が４０００ダルトン以下または好ましくは３０００ダルトン以下、２０００ダルトン以下、１０００ダルトン以下、８００ダルトン以下もしくは６００ダルトン以下の有機分子足場を有する化合物を指す。「分子足場」は、１つ以上の新たな化学的部分と共有結合する、これで修飾する、あるいはこれを取り除いて、共通の構造要素をもつ複数の分子を形成することができる骨格構造を指す。このような部分としては、特に限定されないが、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、メチル基、ニトロ基、カルボキシル基またはその他の種類の分子基を挙げることができる。足場の好ましい性質としては、１つ以上の置換基が所望の標的分子結合部位の結合ポケットに位置するようその置換基を足場の適切な位置に置くことができる部位が利用可能である；コンビナトリアルライブラリーを容易に構築できるように、特に合成反応によって化学的に修飾可能な化学的に制御しやすい構造を有している；足場またはライブラリーのメンバーが修飾されて新たな望ましい性質、例えば金属製剤の細胞内および／または特定器官への能動的な輸送を可能にする性質が得られるように、足場と所望の結合部位との結合を阻害しない部分を付加することができる化学的位置を有することを挙げることができる。

小分子コンビナトリアルライブラリーは販売業者から購入から購入するか、あるいは特に限定されないが、コンビナトリアル化学技術、発酵法、植物および細胞抽出法など（例えば、Ｃｗｉｒｌａら，（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，８７，６３７８−６３８２；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５４，８４−８６；Ｌａｍら，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５４，８２−８４；Ｂｒｅｎｎｅｒら，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，５３８１−５３８３；Ｒ．Ａ．Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，９，２３５−２３９；Ｅ．Ｒ．Ｆｅｌｄｅｒ，（１９９４）Ｃｈｉｍｉａ，４８，５１２−５４１；Ｇａｌｌｏｐら，（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７，１２３３−１２５１；Ｇｏｒｄｏｎら，（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７，１３８５−１４０１；Ｃａｒｅｌｌら，（１９９５）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，３，１７１−１８３；Ｍａｄｄｅｎら，Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ ２，２６９−２８２；Ｌｅｂｌら，（１９９５）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，３７ １７７−１９８を参照されたい）；共通の分子構造の周囲に集めた小分子；様々な営利団体および非営利団体による集められた化学物質の収集物、天然物；海洋生物、真菌、細菌および植物の抽出物を含めた任意の手段により調製または入手することができる。

特に限定されないが、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，（２０００）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．４０：２７３−８２；Ｍｅｒｒｉｔｔ，（１９９８）Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ．１（２）：５７−７２；Ｃｏｅら，（１９９８−９９）Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓ．４（１）：３１−８；Ｓｕｎ，（１９９９）Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ．２（６）：２９９−３１８；Ｇｒａｖｅｒｔら，（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１（１）：１０７−１３；Ｄｏｌｌｅら，（１９９９）Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．１（４）：２３５−８２；Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ ＲＭ．，（１９９９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ；およびＫｕｎｄｕら，Ｐｒｏｇ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ，５３：８９−１５６に記載されているものを含めた様々な技術により調製でき、１つ以上の予め選択された特性を有するライブラリーのメンバーを入手するために、様々な種類の分子のライブラリーを調製する。炭水化物およびオリゴ糖を含むライブラリーのコンビナトリアル合成が記載されている（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒら，（１９９９）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ３（３）：２９１−８７）。天然物に基づくライブラリーの合成が記載されている（Ｗｅｓｓｊｏｈａｎｎ，（２０００）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ４（３）：３０３−９）。

核酸のライブラリーは、非限定的な例として本明細書ではアプタマーの単離と呼ぶ項目を含めた、様々な技術により調製することができる。並列サンプリングと連動させて、自動質量分析などの複雑な方法を実施せずにデコンボリューションを行うことができる核酸ライブラリーが知られている（Ｅｎｊａｌｂａｌ Ｃ．Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｊ．Ａｕｂａｇｎａｃ ＪＬ，（２０００）Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ．１９：１３９−６１；Ｐｅｒｒｉｎ ＤＭ．，Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ３：２４３−６９）。

ペプチド模倣物は、コンビナトリアル化学および固相合成を用いて同定することができる（Ｋｉｍ ＨＯ．Ｋａｈｎ Ｍ．，（２０００）Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ３：１６７−８３；ａｌ−Ｏｂｅｉｄｉ，（１９９８）Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ９（３）：２０５−２３）。

ポリペプチドライブラリーは、ウイルスを用いた技術に従って調製することができる。簡潔に述べれば、ファージディスプレイ技術を用いて、ペプチド模倣物の合成の土台として使用し得るポリペプチドリガンドを作製することができる（Ｇｒａｍ Ｈ．，（１９９９）Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．２：１９−２８）。ポリペプチド、コンストレインドペプチド（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）、タンパク質、タンパク質ドメイン、抗体、一本鎖抗体フラグメント、抗体フラグメントおよび抗体結合領域が繊維状ファージ上に提示され選択される。

様々な治療標的の例と結合させるためのペプチドリガンドの例（各配列にはＮ末端金属結合ＡＴＣＵＮモチーフ（ＧＧＨ、ＧＧｈ、ＫＧＨ、ＫＫＨ）が組み込まれている）としては、特に限定されないが以下のものが挙げられる（特に注記がない限り、Ｃ末端はアミド化されている）：
ＨＣＶ ＩＲＥＳ ＲＮＡを標的とする
ＧＧＨＧＫＹＫＥＴＤＬＬＩＬＦＫＤＤＹＦＡＫＫＮＥＥＲＫ
ＧＧＨＧＫＹＫＥＴＤＬＬＩＬＦＫＤＤＹＦＡＫＫＮＥＥＲＫＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ
ＧＧＨＧＫＹＫＥＴＤＬＬＩＬＦＫＤＤＹＦＡＫＫＮＥＥＲＫＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ
ＧＧＨＫＹＫＥＴＤＬＬＩＬＦＫＤＤＹＦＡＫＫＮＥＥＲＫＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ
ＧＧＨＫＹＫＥＴＤＬＬＩＬＦＫＤＤＹＦＡＫＫＮＥＥＲＫＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ
ＧＧＨＧＫＹＫＥＴＤＬＬＩＬＦＫＤＤＹＦＡＫＫＮＥＥＲＫＫＤＥＬ
ＧＧＨＧＫＹＫＥＴＤＬＬＩＬＦＫＤＤＹＦＡＫＫＮＥＥＲＫＧＧＧＫＤＥＬ
ＧＧＨＧＡＡＬＥＡＫＩＣＨＱＩＥＹＹＦＧＤＦ
ＧＧＨＡＡＬＥＡＫＩＣＨＱＩＥＹＹＦＧＤＦ
ＧＧＨＧＹｒＦＫ
ＧＧＨＧＹｒＦＫＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ
ＧＧＨＧＹｒＦＫＧＧＧＫＤＥＬ
ＧＧＨＹｒＦＫ
ＧＧｈｙｒｆｋ
ＧＧＨＹｒＦＫＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ
ＧＧＨＹｒＦＫＧＧＧＫＤＥＬ
ＧＧＨＧＫＹＫＥＴＤＬＬＩＬＦＫＤＤＹＦＡＫＫＮＥＥＲＫ
ＧＧＨＹｒＦＫ−カルボキシル
ＫＫＨＹｒＦＫ
ＧＧＨＫＹＫＥＴＤＬＬＩＬＦＫＤＤＹＦＡＫＫＮＥＥＲＫ
ＧＧＨＫＹＫＥＴＤＬＬＩＬＦＫＤＤＹＦＡＫＫＮＥＥＲＫＫＤＥＬ
ＧＧＨＫＹＫＥＴＤＬ
ＧＧＨＫＹＫＥＴＤＬ−ＮＨ２
ＧＧＨＹＲＦＫ−アミド

ＨＣＶプロテアーゼを標的とする
ＧＧＨＧＤＥＭＥＥＣＡＳ
ＧＧＨＧＤＥＭＥＥＣ（カルボキシル末端）
ＧＧＨＧＤｅＬＩ（Ｃｈａ）ＣＰ（Ｃｈａ）ＤＬ
ＧＧＨＧＤｅＬＩ（Ｃｈａ）Ｃ（カルボキシル末端）
ＧＧＨＧＤＥＭＥＥＣ
ＧＧＨＧＤＥＭＥＥＣＡＳＹＳＫＤＥＬ
ＧＧＨＧＤＬＥＶＶＴ
ＧＧＨＧＤＬＥＶＶＴＡＳＹＳＫＤＥＬ
ＧＧＨＧＤｅＬＩ（Ｃｈａ）Ｔ
ＧＧＨＧＤｅＬＩ（Ｃｈａ）ＴＡＳＹＳＫＤＥＬ

ＨＩＶプロテアーゼを標的とする
ＧＧＨＧＡＲＶＬＡＥＡＭ
ＧＧＨＶＬＱＮＹＰＩＶＱ
ＧＧＨＧＡＥＶＦＹＶＤＧＡ

ＨＩＶ ＲＲＥ ＲＮＡを標的とする
ＧＧＨＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ
ＫＧＨＫＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ

ＨＩＶ ＴＡＲ ＲＮＡを標的とする
ＧＧＨＧＦＴＴＫＡＬＧＩＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＳＱＴＨＱＶＳＬＳＫＱ
ＧＧＨＦＴＴＫＡＬＧＩＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＳＱＴＨＱＶＳＬＳＫＱ
ＧＧＨＧＲＲＲＤＲＲＬＲＱＲＡＲＲＲ

ソルターゼを標的とする（抗菌性）
ＧＧＨＬＰＥＴＧ
ＧＧＨＧＬＰＥＴＧ
ＧＧＨＬＰＥＴ
ＧＧＨＧＬＰＥＴ
ＧＧＨＬＰＥＴ（カルボキシル）

シャペロンタンパク質を標的とする（抗菌性）
ＧＧＨＩＫＮＹＰＡＲＶＫＣ
ＧＧＨＶＳＱＦＰＡＲＩＫＣ
ＧＧＨＶＳＱＦＰＡＲＩＫ
ＧＧＨＬＳＬＰＰＶＫＬＨＳ
ＧＧＨＧＱＲＫＬＦＦＮＬＲＫＴＫＱＲＬＧＷＦＮＱＣ
ＧＧＨＧＥＹＶＬＲＮＷＲＩＶＫＶＡＴＴＫＡＣ

心血管系（ｓＡＣＥ−１およびＥＣＥ−１）を標的とする
ＫＧＨＫ
ＧＧＨＧＧＣＨＰ
ＧＧＨＧＧＤＨＰ
ＧＧＨＧＩＥＰ
ＧＧＨＧＩＫＹ
ＧＧＨＧＩＫＷ
ＧＧＨＧＩＫＰ
ＧＧＨＧＧＤＦ
ＧＧＨＧＧＤＹ

抗微生物性（標的は不明であるが、ＭＩＣが有効である）
ＧＧＨＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ
ＧＧＨＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ
ＧＧＨＧＩＲＲＩＩＲＫＩＩＨＩＩＫＫ
ＧＧＨＧＶＲＲＦＰＷＷＷＰＦＬＲＲ
ＧＧＨＧＩＬＡＷＫＷＡＷＷＡＷＲＲ
ＧＧＨＧＲＬＡＲＩＶＶＩＲＶＡＲ
ＧＧＨＧＧＬＦＤＩＩＫＫＩＡＥＳＩ

１６Ｓ ｒＲＮＡを標的とする（抗微生物性）
ＧＧＨＨＰＶＨＨＹＱ
ＧＧＨＧＨＰＶＨＨＹＱ
ＧＧＨＧＧＨＰＶＨＨＹＱ
ＧＧＨＧＬＰＬＴＰＬＰ
ＧＧＨＧＧＬＰＬＴＰＬＰ

ＤＮＡのホリデイジャンクションを標的とする（抗微生物性）
ＧＧＨＧＷＲＷＹＣＲ
ＧＧＨＧＷＲＷＹＣＲ
ＧＧＨＧＧＷＲＷＹＣＲ

化学的カップリング
当該技術分野で周知の化学結合を用いて、本発明の金属結合部分とリガンド部分をカップリングさせ得る。化学架橋剤については数多くの書籍およびカタログに記載されている。例えば、Ｗｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，１９９１を参照されたい。このような試薬は多くの場合、ペプチドのアミノ酸側鎖とカップリングする官能基を用いるものである。架橋剤の設計では、用いる官能基の選択を行う。官能基の選択は、架橋する化学種上で利用可能な標的部位に完全に依存する。一部の種（例えば、タンパク質）には標的化に利用可能な部位が多数存在することがあり（例えば、リジンε−アミノ基、システインスルフィドリル基、グルタミン酸カルボキシル基など）、また目的とする生物学的特性（例えば、抗体の結合親和性、酵素の触媒活性など）を最もよく保存するために、ステロール内に包接するための特定の官能基の選択を実験的に行うことができる。

アミン基を介したカップリング：
アミン特異的官能基としてイミドエステルおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（「ＮＨＳ」）エステルが通常用いられる。ＮＨＳエステルは、第一級または第二級アミンと反応して安定な生成物を生じる。カップリングは生理的ｐＨにおいて効率的であり、溶液中ではＮＨＳエステル架橋剤の方がイミダート対応物より安定である。アミン含有タンパク質を１段階または２段階の反応で架橋するのにホモ二官能性ＮＨＳエステル結合がよく用いられる。第一級アミンがＮＨＳエステルの原理となる標的である。タンパク質のＮ末端に存在する接触可能なα−アミン基がＮＨＳエステルと反応してアミドを形成する。しかし、タンパク質のα−アミンが常に利用可能なわけではないことから、アミノ酸の側鎖との反応が重要となる。５つのアミノ酸がその側鎖に窒素を有していても、実質的にはリジンのε−アミノ基だけがＮＨＳエステルと反応する。ＮＨＳエステル架橋剤が第一級アミンと反応すると共有アミド結合が形成されて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドが放出される。

スルフィドリル基を介したカップリング：
スルフィドリル特異的官能基としてマレイミド、アルキルおよびアリールハロゲン化物、α−ハロアシルならびにピリジルジスルフィドが通常用いられる。マレイミド基は、反応混合物のｐＨがｐＨ６．５〜７．５に維持された場合にスルフィドリルに対して特異的となる。ｐＨ７では、マレイミドとスルフィドリルの反応速度がマレイミドとアミンの反応より１０００倍速くなる。マレイミドはチロシン、ヒスチジンおよびメチオニンとは反応しない。十分な量の遊離スルフィドリルが存在しなければ、多くの場合、利用可能なジスルフィド結合の還元により遊離スルフィドリルが生成され得る。

カルボキシル基を介したカップリング：
カルボジイミドによりカルボキシルが第一級アミンまたはヒドラジドとカップリングし、アミド結合またはヒドラゾン結合が形成される。カルボジイミドは、カルボジイミドとそれとカップリングさせる分子との間に架橋が形成されるのではなく、利用可能なカルボキシル基と利用可能なアミン基との間でペプチド結合が形成されるという点で、他の結合反応とは異なるものである。タンパク質のカルボキシ末端ならびにグルタミン酸およびアスパラギン酸側鎖が標的となり得る。タンパク質はカルボキシルとアミンをともに含むため、過剰な架橋剤の存在下では重合が起こり得る。架橋が形成されず、またアミド結合がペプチド結合と同じものであるため、タンパク質を破壊せず架橋を逆転させることは不可能である。

非選択性反応基：
光親和性試薬とは、化学的に不活性であるが、紫外線または可視光を当てると反応性になる化合物のことである。アリールアジドは、２５０〜４６０ｎｍの波長で光分解されて反応性のアリールニトレンを形成する光親和性試薬である。アリールニトレンは非選択的に反応して共有結合を形成する。還元剤はアジド基を還元することがあるため、慎重に用いなければならない。

アルギニンを介したカップリング：
グリオキサールは、アルギニン残基のグアニジニル部分を標的とするのに有用な化合物である。グリオキサールは弱アルカリ性のｐＨでアルギニンを標的とする。リジンとの交差反応性（高ｐＨで最も高い）がいくらかみられる。

カルボニル基を介したカップリング：
カルボニル（アルデヒドおよびケトン）はｐＨ５〜７でアミンおよびヒドラジドと反応する。ヒドラジドとの反応の方がアミンとの反応よりも速く、このことがカルボニルを特異的架橋に有用なものとしている。カルボニルがタンパク質中に存在するのは容易ではないが、メタ過ヨウ素酸ナトリウムを用いて糖部分を穏やかに酸化すれば、隣接するヒドロキシルがアルデヒドまたはケトンに変換される。還元末端（１つまたは複数）をもつ炭水化物では、カルボニル基（１つまたは複数）がヒドラジン部分に対して反応性となり、ヒドラゾン結合を形成し得る。Ｓ‐ＨｙＮｉｃは、活性エステル（すなわち、ＮＨＳ）を介して遊離アミノ基によりＨｙＮｉｃ（６‐ヒドラジノニコチンアミド）部分を分子内に組み込むために用いられるヘテロ二官能性リンカーである。ＨｙＮｉｃヒドラジンリンカーを加えることにより、弱酸性緩衝液（１００ｍＭ ＮａＰＯ_４、ｐＨ６）中でコンジュゲートを形成させることができる。還元末端をもたない炭水化物では、ＣＤＡＰ特異的活性化を用い得る。１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸（「ＣＤＡＰ」）は穏やかな条件下（活性化にはｐＨ９．５、結合にはｐＨ７）で、ヒドロキシル基をシアニルエステルに変換し、次いで、このエステルがアミン基の存在下でカルバミン酸エステルを形成する。

結合化学に、および／または結合させる官能基の１つに任意選択でポリマー物質が含まれ得る。１つの例では、このようなポリマー物質は、好ましくはポリ（アルキレンオキシド）である。本明細書で使用される「アルキレンオキシド」という用語は、構造−Ｘ−Ｏ−を指し（式中、Ｘは酸素と共有結合したアルキレン部分である）、したがって、ポリ（アルキレンオキシド）は構造−（Ｘ−Ｏ−）_ｍ−を指す。ポリ（アルキレンオキシド）ポリマーは、エチレングリコールから誘導されるポリ（エチレンオキシド）などの非分岐ホモポリマー（すなわち、ｎが変化しない構造−（（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−）_ｍ）−のポリマー）であることが好ましい。このほか、他のポリアルキレンオキシドホモポリマー（例えば、メチレンオキシド、プロピレンオキシド、イソプロピレンオキシドおよびブチレンオキシドポリマー）およびポリ（アルキレンオキシド）のコポリマーまたはブロックコポリマーなどの別のポリマーを用いてもよい。ＰＥＧ系ポリマーを用いる本発明の態様では、ＰＥＧ系ポリマーは平均の長さ（「ｍ」）が５〜１０００モノマー単位であることが好ましい。当業者が他のアルキレンオキシドのモル当量を決定し、他のホモポリマーおよびコポリマーの好ましい平均分子量を決定することは容易であろう。

本発明の平均分子量は「数平均」法を用いて測定される。異なる分子量のポリマー分子の混合物において、特定の分子量Ｍ_Ｉをもつ分子の数をＮ_Ｉとすると、所与の質量が存在する「数平均」による確率は

となり、数平均分子量は式

で与えられる。数平均は、存在する分子の総質量を総分子数で除したものを表す単純な算術平均である。ポリマーの数平均分子量は、当業者に公知の方法および装置を用いて蒸気圧浸透圧法により測定し得る。

ポリ（アルキレンオキシド）の代わりに使用し得る別のポリマー物質としては、デキストラン、ポリビニルピロリドン、多糖、デンプン、グリカン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミドまたはその他の同様のポリマーなどの物質が挙げられる。上に挙げたものは単に例示的なものであり、本明細書での使用に適した種類の非抗原性ポリマー物質を限定することを意図するものではないことが当業者には理解されよう。

生化学的標的
本発明の生化学的標的とはリガンド部分の所望の標的のことである。例えば、種々の実施形態では、リガンド部分が細胞成分に特異的であるか、細胞成分と結合し、このような細胞成分としては、特に限定されないが、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−１、ＨＥＲｌ）、ＥｒｂＢ−２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＥｒｂＢ−３／ＨＥＲ３、ＥｒｂＢ−４／ＨＥＲ４、ＥＧＦＲリガンドファミリー；インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）ファミリー、ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）、ＩＧＦＲリガンドファミリー；血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）ファミリー、ＰＤＧＦＲリガンドファミリー；線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）ファミリー、ＦＧＦＲリガンドファミリー、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）ファミリー、ＶＥＧＦファミリー；ＨＧＦ受容体ファミリー；ＴＲＫ受容体ファミリー；エフリン（ＥＰＨ）受容体ファミリー；ＡＸＬ受容体ファミリー；白血球チロシンキナーゼ（ＬＴＫ）受容体ファミリー；ＴＩＥ受容体ファミリー、アンジオポエチン１、２；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体（ＲＯＲ）受容体ファミリー；ディスコイジンドメイン受容体（ＤＤＲ）ファミリー；ＲＥＴ受容体ファミリー；ＫＬＧ受容体ファミリー；ＲＹＫ受容体ファミリー；ＭｕＳＫ受容体ファミリー；トランスフォーミング増殖因子α受容体、ＴＧＦβ；サイトカイン受容体、クラスI（ヘマトポエチンファミリー）およびクラスII（インターフェロン／ＩＬ−１０ファミリー）受容体、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）、細胞死受容体ファミリー；癌・精巣（ＣＴ）抗原、系列特異的抗原、分化抗原、αアクチニン−４、ＡＲＴＣｌ、切断点クラスター領域−Ａｂｅｌｓｏｎ（Ｂｃｒ−ａｂｌ）融合産物、Ｂ−ＲＡＦ、カスパーゼ−５（ＣＡＳＰ−５）、カスパーゼ−８（ＣＡＳＰ−８）、β−カテニン（ＣＴＮＮＢｌ）、細胞分裂周期２７（ＣＤＣ２７）、サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＯＡ−I、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、ＥＦＴＵＤ−２、伸長因子２（ＥＬＦ２）、Ｅｔｓ変異体遺伝子６／急性骨髄性白血病１遺伝子ＥＴＳ（ＥＴＣ６−ＡＭＬ１）融合タンパク質、フィブロネクチン（ＦＮ）、ＧＰＮＭＢ、低密度脂質受容体／ＧＤＰ−Ｌフコース：β−Ｄ−ガラクトース２−α−Ｌ−フコシルトランスフェラーゼ（ＬＤＬＲ／ＦＵＴ）融合タンパク質、ＨＬＡ−Ａ１１、熱ショックタンパク質７０−２変異型（ＨＳＰ７０−２Ｍ）、Ｋ１ＡＡ０２０５、ＭＡＲＴ２、メラノーマ遍在突然変異１、２、３（ＭＵＭ−１、２、３）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、ｎｅｏ−ＰＡＰ、ミオシンクラスI、ＮＦＹＣ、ＯＧＴ、ＯＳ−９、ｐｍｌ−ＲＡＲα融合タンパク質、ＰＲＤＸ５、ＰＴＰＲＫ、Ｋ−ｒａｓ（ＫＲＡＳ２）、Ｎ−ｒａｓ（ＮＲＡＳ）、ＨＲＡＳ、ＲＢＡＦ６００、ＳＩＲＴ２、ＳＮＲＰＤ１、ＳＹＴ−ＳＳＸ１またはＳＳＸ２融合タンパク質、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＢＡＧＥ、ＢＡＧＫ−１、ＢＡＧＥ−２、３、４、５、ＧＡＧＥ−１、２、３、４、５、６、７、８、ＧｎＴ−Ｖ（異常なＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ、ＭＧＡＴ５）、ＨＥＲＶ−Ｋ−ＭＥＬ、ＫＫ−ＬＣ、ＫＭ−ＨＮ−I、ＬＡＧＥ、ＬＡＧＥ−I、メラノーマ上のＣＴＬ認識抗原（ＣＡＭＥＬ）、ＭＡＧＥ−Ａ１（ＭＡＧＥ−I）、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１ｌ、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−Ｂ１、ＭＡＧＥ−Ｂ２、ＭＡＧＥ−Ｂ５、ＭＡＧＥ−Ｂ６、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ（ＭＬＡＮＡ）、ｇｐ１００、ｇｐ１００／Ｐｍｅｌｌ７（ＳＩＬＶ）、チロシナーゼ（ＴＹＲ）、ＴＲＰ−I、ＨＡＧＥ、ＮＡ−８８、ＮＹ−ＥＳＯ−I、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２、ＳＡＧＥ、Ｓｐｌ７、ＳＳＸ−１、２、３、４、ＴＲＰ２−ＩＮＴ２、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、カリクレイン４、マンマグロビン−Ａ、ＯＡ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＴＲＰ−１／ｇｐ７５、ＴＲＰ−２、アディポフィリン、メラノーマに存在しないインターフェロン誘導タンパク質２（ＡＩＭ−２）、ＢＩＮＧ−４、ＣＰＳＦ、サイクリンＤ１、上皮細胞接着分子（Ｅｐ−ＣＡＭ）、ＥｐｈＡ３、線維芽細胞増殖因子−５（ＦＧＦ−５）、糖タンパク質２５０（ｇｐ２５０）、ＥＧＦＲ（ＥＲＢＢ１）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（ＥＲＢＢ２）、インターロイキン１３受容体α２鎖（ＩＬ１３Ｒａｌｐｈａ２）、ＩＬ−６受容体、腸カルボキシルエステラーゼ（ｉＣＥ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｍ−ＣＳＦ、ｍｄｍ−２、ＭＵＣ１、ｐ５３（ＴＰ５３）、ＰＢＦ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ−I、ＲＮＦ４３、ＲＵ２ＡＳ、ＳＯＸ１０、ＳＴＥＡＰ１、サバイビン（ＢＩＲＣ５）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、テロメラーゼ、ウイルムス腫瘍遺伝子（ＷＴｌ）、ＳＹＣＰ１、ＢＲＤＴ、ＳＰＡＮＸ、ＸＡＧＥ、ＡＤＡＭ２、ＰＡＧＥ−５、ＬＩＰ１、ＣＴＡＧＥ−I、ＣＳＡＧＥ、ＭＭＡ１、ＣＡＧＥ、ＢＯＲＩＳ、ＨＯＭ−ＴＥＳ−８５、ＡＦ１５ｑ１４、ＨＣＡ６６１、ＬＤＨＣ、ＭＯＲＣ、ＳＧＹ−I、ＳＰＯ１１、ＴＰＸ１、ＮＹ−ＳＡＲ−３５、ＦＴＨＬ１７、ＮＸＦ２、ＴＤＲＤ１、ＴＥＸ１５、ＦＡＴＥ、ＴＰＴＥ、免疫グロブリンイディオタイプ、Ｂｅｎｃｅ−Ｊｏｎｅｓタンパク質、エストロゲン受容体（ＥＲ）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ３３、癌抗原７２−４（ＣＡ７２−４）、癌抗原１５−３（ＣＡ１５−３）、癌抗原２７−２９（ＣＡ２７−２９）、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）、癌抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、β−２ミクログロブリン、扁平上皮癌抗原、ニューロン特異的エノラーゼ、熱ショックタンパク質ｇｐ９６、ＧＭ２、サルグラモスチム、ＣＴＬＡ−４、７０７アラニンプロリン（７０７−ＡＰ）、Ｔ細胞により認識される腺癌抗原４（ＡＲＴ−４）、癌胎児性抗原ペプチド−１（ＣＡＰ−I）、カルシウム活性化型塩化物イオンチャネル−２（ＣＬＣＡ２）、シクロフィリンＢ（Ｃｙｐ−Ｂ）、ヒト印環腫瘍−２（ＨＳＴ−２）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質（ＨＰＶ−Ｅ６、ＨＰＶ−Ｅ７、メジャーまたはマイナーキャプシド抗原、その他）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）タンパク質（ＥＢＶ潜在性膜タンパク質−ＬＭＰ１、ＬＭＰ２；その他）、Ｂ型またはＣ型肝炎ウイルスタンパク質およびＨＩＶタンパク質；あるいは各場合、任意の上記タンパク質をコードする、または上記タンパク質の発現を調節するＲＮＡまたはＤＮＡ。

本明細書に記載されているように、種々の実施形態では、本発明の金属製剤は感染病原体の成分と結合するリガンド部分を含み、このような化合物は生物学的に活性な物質と結合し、このような化合物は対象の免疫刺激応答を（直接的に／間接的に）誘導する。このような感染病原体は一般に、特に限定されないが、細菌、酵母、真菌、ウイルス、真核寄生生物などを含めた任意の病原体であり得る。種々の実施形態では、本発明の化合物は、病原体／感染病原体上に存在する成分に対するリガンド部分を含み、このような病原体／感染病原体としては、特に限定されないが以下のものが挙げられる：レトロウイルス科（例えば、ＨＩＶ−I（ＨＴＬＶ−III、ＬＡＶもしくはＨＴＬＶ−III／ＬＡＶまたはＨＩＶ−ＩＩＩとも呼ばれる）などのヒト免疫不全ウイルスおよびＨｌＶ−ＬＰなどの他の分離株）；ピコマウイルス科（Ｐｉｃｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カルシウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、胃腸炎の原因となる株）；トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラウイルス科（Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロノウイルス科（Ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器多核体ウイルス）；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；ブンガウイルス科（Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ハンタンウイルス、ブンガウイルス（ｂｕｎｇａ ｖｉｒｕｓ）、フレボウイルスおよびナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス）；ビマウイルス科（Ｂｉｍａｖｉｒｉｄａｅ）；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（ほとんどのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）およびトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ））およびＣ型Ｂグループ（ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、脾臓壊死ウイルス（ＳＮＶ）、細網内皮症ウイルス（ＲＶ）およびサル肉腫ウイルス（ＳＳＶ）を含む）、メイソン−ファイザーサルウイルス（ＭＰＭＶ）およびサルレトロウイルス１型（ＳＲＶ−I）を含めたＤ型レトロウイルス、レンチウイルスのサブグループ、Ｔ細胞白血病ウイルスおよび泡沫状ウイルスを含めたレトロウイルス複合体、ＨＩＶ−I、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ビスナウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、サルＴ細胞白血病ウイルス（ＳＴＬＶ）およびウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）を含めたレンチウイルス、ヒト泡沫状ウイルス（ＨＦＶ）、サル泡沫状ウイルス（ＳＦＶ）およびウシ泡沫状ウイルス（ＢＦＶ）を含めた泡沫状ウイルス、ポックスウイルス科（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびイリドウイルス科（例えば、アフリカブタ熱ウイルス）；および未分類ウイルス（例えば、海綿状脳症の病原体、デルタ肝炎の病原体（Ｂ型肝炎ウイルスの欠陥サテライトであると考えられている）、非Ａ型、非Ｂ型肝炎（すなわち、Ｃ型肝炎）の病原体；ノーウォークウイルスとその関連ウイルスおよびアストロウイルス）、マイコバクテリウム（結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、Ｍ．アビウムイントラセルラーレ（Ｍ．ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ライ菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ））、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、スタフィルコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｃｏｃｏｃｃｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、エリシペロスリクス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（例えば、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ））、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）（例えば、破傷風菌（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）、ウェルシュ菌（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ））、混合性嫌気性菌、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ヘモフィルス（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）（例えば、野兎病菌（Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ））、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）（例えば、コレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ））、バルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、スピロヘータ（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ）（トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ））、真菌、放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、リケッチア、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、原生動物（エントアメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）、マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）、ニューモシスチス（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）、バベシア（Ｂａｂａｓｉａ）、ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）を含む）、蠕虫（旋毛虫（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ）、ウケレリア（Ｗｕｃｈｅｒａｒｉａ）、回旋糸状虫（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ）、住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）、センチュウ（Ｎｅｍａｔｏｄｅｓ）、Ｃｅｓｔｏｄｅｓ（条虫）、吸虫（Ｔｒｅｍａｔｏｄｅｓ）。

先のリストおよびそれに続くリストは例示的なものであり、限定的なものではない。

医薬組成物
本明細書で使用される「医薬品」という用語は、医療用医薬品または一般用医薬品として米国食品医薬品局（または米国以外のその同等機関）による承認手続きの対象となり、疾患の治癒、治療または予防で使用することを目的とした化学物質を指す。このような組成物の製剤化および投与の技術に関する詳細をＴｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ 第２１版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）ならびにＮｉｅｌｌｏｕｄおよびＭａｒｔｉ−Ｍｅｓｔｒｅｓ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ ａｎｄ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ：第２版（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）にみることができる。

本発明の目的のために、医薬組成物を薬学的に許容される担体、アジュバントおよび溶剤を含有する薬学的に許容される担体、アジュバントおよび溶剤を含有する製剤として、経口手段、非経口手段、吸入スプレーによる手段、局所手段または直腸内手段を含めた様々な手段により投与し得る。本明細書で使用される非経口という用語は、特に限定されないが、様々な注入技術を用いた皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、真皮内、髄腔内および硬膜外注射を包含する。本明細書で使用される動脈内および静脈内注射はカテーテルを介した投与を包含する。ほかにも、冠動脈内ステントおよび冠動脈内リザーバが考慮される。本明細書で使用される経口という用語は、特に限定されないが、経口摂取または舌下もしくはバッカル経路による送達を包含する。経口投与には、液体飲料、エネルギーバーおよび丸剤が含まれる。

医薬組成物は、意図する投与方法に適した任意の形態であり得る。経口使用に使用する場合、例えば、錠剤、トローチ剤（ｔｒｏｃｈｅｓ／ｌｚｅｎｇｅｓ）、水性もしくは油性懸濁剤、分散性散剤もしくは顆粒剤、乳剤、硬カプセルもしくは軟カプセル剤、シロップ剤またはエリキシル剤を調製し得る。経口使用のための組成物は、医薬組成物を製造する当該技術分野で公知の任意の方法に従って調製することができ、このような組成物は、味の良い製剤にするため甘味剤、香味剤、着色剤および保存剤を含めた１つ以上の物質を含有し得る。錠剤の製造に適した無毒性の薬学的に許容される添加剤との混合物中に薬剤化合物を含有する錠剤が許容される。このような添加剤は、例えば、炭酸カルシウムまたは炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤；トウモロコシデンプンまたはアルギン酸などの造粒剤および崩壊剤；デンプン、ゼラチンまたはアラビアゴムなどの結合剤；およびステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクなどの滑沢剤であり得る。錠剤は未コーティングのものであってもよく、また腸溶性コーティング、大腸溶解性コーティングまたは消化管での崩壊および吸着を遅らせる、および／または長時間にわたる作用を持続させるマイクロカプセル化を含めた既知の技術によってコーティングされたものであってもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンなどの時間遅延物質を単独で、あるいはロウとともに用い得る。

ほかにも経口使用のための製剤を、薬剤化合物が例えばリン酸カルシウムもしくはカオリンのような不活性固体希釈剤と混合されている硬ゼラチンカプセル剤として、あるいは有効成分が水またはラッカセイ油、流動パラフィンもしくはオリーブ油などの油性媒体と混合されている軟ゼラチンカプセル剤として提供し得る。

医薬組成物を水性懸濁剤の製造に適した添加剤との混合物の形の水性懸濁液として製剤化し得る。このような添加剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントゴムおよびアラビアゴムなどの懸濁化剤ならびに天然のリン脂質（例えば、レシチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸の縮合物（例えば、ポリオキシエチレンステアラート）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと、脂肪酸と無水ヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）などの分散剤または湿潤剤が挙げられる。水性懸濁液はこのほか、ｐ−ヒドロキシ−安息香酸エチルまたはｎ−プロピルなどの１つ以上の保存剤、１つ以上の着色剤、１つ以上の香味剤およびショ糖またはサッカリンなどの１つ以上の甘味剤を含有し得る。

有効成分をラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油もしくはヤシ油などの植物油または流動パラフィンなどの鉱油中に懸濁させることにより、油性懸濁剤を製剤化し得る。経口懸濁剤は、ミツロウ、硬パラフィンまたはセチルアルコールなどの増粘剤を含有し得る。上に記載したような甘味剤および香味剤を添加して、味の良い経口製剤を作製し得る。これらの組成物は、アスコルビン酸などの抗酸化剤の添加により保存され得る。

水の添加による水性懸濁剤の調製に適した本開示の分散性散剤および顆粒剤では、分有効成分が散剤または湿潤剤、懸濁化剤および１つ以上の保存剤との混合物として提供される。適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤は上に開示されているものにより例示されている。ほかの添加剤、例えば甘味料、香味剤および着色剤が存在していてもよい。

本開示の医薬組成物はこのほか、水中油型乳剤形態であってもよい。油相はオリーブ油もしくはラッカセイ油などの植物油、流動パラフィンなどの鉱油またはその混合物であり得る。適切な乳化剤としては、アラビアゴムおよびトラガントゴムなどの天然のゴム、ダイズレシチンなどの天然のリン脂質、ソルビタンモノオレアートなどの脂肪酸と無水ヘキシトールから誘導されるエステルまたは部分エステルならびにポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートなどの上記部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物が挙げられる。乳剤はほかにも、甘味料および香味剤を含有し得る。

グリセロール、ソルビトールまたはショ糖などの甘味剤を用いて、シロップ剤およびエリキシル剤を製剤化し得る。このような製剤はほかにも、粘滑剤、保存剤、香味剤または着色剤を含有し得る。

本開示の医薬組成物は、滅菌注射用水性懸濁液または油性懸濁液などの滅菌注射用製剤の形態であり得る。このような懸濁液は、既知の技術に従い、上に挙げた適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いて製剤化することができる。滅菌注射用製剤はこのほか、１，３−ブタン−ジオール溶液のような無毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶剤中の滅菌注射用溶液または懸濁液であっても、凍結乾燥粉末として調製されたものであってもよい。使用し得る許容される溶剤および溶媒には、リンガー溶液および等張塩化ナトリウム溶液が挙げられる。さらに、従来通りに滅菌不揮発性油を溶媒または懸濁媒として用い得る。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含めた任意の無刺激性の不揮発性油を使用し得る。さらに、注射剤の調製にオレイン酸などの脂肪酸も同様に使用し得る。

単一の剤形を作製するのに担体物質と組み合わせ得る有効成分の量は、治療対象となる宿主および具体的な投与形式によって異なる。例えば、ヒトへの経口投与を目的とした徐放製剤は、組成物全体の約５〜約９５％となり得るしかるべき適宜な量の担体物質と混合された約２０〜５００ｍｇの活性物質を含有し得る。投与量の測定が容易な医薬組成物を作製するのが好ましい。通常、全身投与に有効な量は約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇであり、例えば対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）の年齢および体重、治療を必要とする正確な状態およびその重症度、投与経路を含めた数多くの因子によって左右されるが、最終的には担当の医師または獣医の判断によって決まる。しかし、任意の特定の患者に対する具体的な用量レベルは、当業者によってよく理解されている、使用する具体的な化合物の活性；治療の対象となる患者の体重、全般的健康状態、性別および食事；投与の時間および経路；排泄の速度；これまでに投与された他の薬物；ならびに治療中の特定の状態の重症度を含めた様々な因子によって左右されることが理解されよう。

上で述べたように、経口投与に適した本開示の製剤を、それぞれが所定量の有効成分を含有するカプセル剤、カシェ剤もしくは錠剤などの個々の単位として、散剤もしくは顆粒剤として、水性もしくは非水性の液剤もしくは懸濁剤として、または水中油型乳剤または油中水型乳剤として提供し得る。医薬組成物をこのほか、巨丸剤、舐剤またはパスタ剤として投与してもよい。

錠剤は、任意選択で１つ以上の補助成分とともに圧縮または成形により製造することができる。任意選択で結合剤（例えば、ポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルエチルセルロース）、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム、架橋ポビドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）界面活性剤または分散剤と混合した粉末または顆粒などの自由流動形態の有効成分を適切な機械で圧縮することにより、圧縮錠剤を調製することができる。不活性な液体希釈剤で湿潤させた粉末状の化合物の混合物を適切な機械で成形することにより、成形錠剤を製造することができる。任意選択で錠剤をコーティングしても、あるいは刻み目を入れてもよく、また錠剤中の有効成分が徐放または制御放出されるように、例えば様々な割合のヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いて製剤化し、所望の放出プロファイルを得てもよい。任意選択で、消化管の胃以外の部分で放出が生じるよう錠剤に腸溶性または大腸溶解性のコーティングを施してもよい。これは式１のような化合物が酸加水分解を受けやすい場合に特に有利である。

口腔での局所投与に適した製剤としては、香味を付けた基剤（通常はショ糖とアラビアゴムまたはトラガント）中に有効成分を含むトローチ剤；ゼラチンとグリセリンまたはショ糖とアラビアゴムなどの不活性な基剤中に有効成分を含む香錠剤；ならびに適切な液体担体中に有効成分を含む口腔洗浄剤が挙げられる。

直腸内投与のための製剤は、例えば、カカオ脂またはサリチル酸を含む適切な基剤を用いた坐剤として提供され得る。

膣内投与に適した製剤は、有効成分のほかに当該技術分野で適切であることが知られている担体を含有する膣坐剤、タンポン剤、クリーム剤、ゲル剤、パスタ剤、泡状剤またはスプレー剤として提供され得る。

非経口投与に適した製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および製剤に投与対象の血液との等張性を付与する溶質を含有し得る水性および非水性の等張滅菌注射用液剤；ならびに懸濁化剤および増粘剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁剤が挙げられる。製剤は、単位用量または複数用量の密閉容器、例えばアンプルおよびバイアルで提供することができ、また使用前に滅菌液体担体、例えば注射用水の添加のみが必要な凍結乾燥条件下で保存することができる。既に記載されているような滅菌散剤、顆粒剤および錠剤から注射用液剤および懸濁剤を調製することができる。

本明細書で使用される薬学的に許容される塩は、特に限定されないが、酢酸塩、ピリジン塩、アンモニウム塩、ピペラジン塩、ジエチルアミン塩、ニコチンアミド塩、ギ酸塩、尿素塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩、リチウム塩、桂皮酸塩、メチルアミノ塩、メタンスルホン酸塩、ピクリン酸塩、酒石酸塩、トリエチルアミノ塩、ジメチルアミノ塩およびトリス（ヒドキシメチル）アミノメタン（ｔｒｉｓ（ｈｙｄｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）を包含する。ほかの薬学的に許容される塩も当業者に知られている。

特定の患者に対する有効量は、治療の対象となる状態、患者の全般的な健康状態、投与の経路および用量ならびに副作用の重症度などの因子によって左右され得る。治療方法および診断方法の指針が入手可能である（例えば、Ｍａｙｎａｒｄら（１９９６）Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ＳＯＰｓ ｆｏｒ Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ；Ｄｅｎｔ（２００１）Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｕｒｃｈ Ｐｕｂｌ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫを参照されたい）。

有効量を１回の投与で投与してもよいが、１回の投与に限定されるわけではない。したがって、投与は２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回またはそれ以上の医薬組成物の投与であり得る。本発明の方法で医薬組成物を２回以上投与する場合、投与の間隔を１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、７分間、８分間、９分間、１０分間もしくはそれ以上の時間間隔で、約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間などの間隔で空け得る。時間という文脈において、「約」という用語は±３０分以内の任意の時間間隔を意味する。このほか投与の間隔を、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日およびその組合せの時間間隔で空け得る。本発明は等しい時間で空けられた投与間隔に限定されるわけではなく、等しくない間隔での投与を包含するものである。

本発明では、例えば、週１回、週２回、週３回、週４回、週５回、週６回、週７回、２週間に１回、２週間に１回、４週間に１回、５週間に１回などの投与スケジュールを用いることができる。投与スケジュールは、例えば、総投与期間を１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月および１２か月とする投与を包含する。

上記投与スケジュールを数サイクル実施する。サイクルを例えば、約７日ごと、１４日ごと、２１日ごと、２８日ごと、３５日ごと、４２日ごと、４９日ごと、５６日ごと、６３日ごと、７０日ごとなどに繰り返し得る。１サイクルの間に投与しない期間を設けてもよく、この場合その期間は例えば、約７日、１４日、２１日、２８日、３５日、４２日、４９日、５６日、６３日、７０日などであり得る。この文脈において、「約」という用語は±１日、±２日、±３日、±４日、±５日、±６日または±７日を意味する。

ほかの治療剤との共投与の方法が当該技術分野で周知である（Ｈａｒｄｍａｎら（編）（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第１０版，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；ＰｏｏｌｅおよびＰｅｔｅｒｓｏｎ（編）（２００１）Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ．，ＰＡ；ＣｈａｂｎｅｒおよびＬｏｎｇｏ（編）（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ．，ＰＡ）。

実施例
以下の実施例は本発明を説明する役割を果たすものである。これらの実施例は本発明の範囲を限定することを一切意図するものではない。

実施例１：金属製剤の触媒効率の制御における速度論的データと熱力学的データとの関係
１０ｎＭ（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｃｈａ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ）〜４８μＭ（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ）の親和性を有する様々な金属ペプチド誘導体を試験した。ＨＣＶプロテアーゼ不活性化に対する相対的結合親和性と触媒効率を比較することにより、両パラメータ間の逆相関関係が明らかになる。これは、ｋ_ｏｎ値が大きく、かつ／またはｋ_ｏｆｆ値が小さいほど親和性結合が高くなる促進されるという親和性と結合のｏｎ／ｏｆｆ速度定数（Ｋ_{ａｓｓｏｃ}＝ｋ_ｏｎ／ｋ_ｏｆｆ）との間の関係に由来するものである。一方、新たな標的分子に対して金属製剤触媒が利用可能となるために、効率的な触媒回転は好ましくは不活性化反応の速度定数（ｋ_ｃａｔ）と同等のｋ_ｏｆｆ値を必要とし、またｋ_ｏｎ、ｋ_ｏｆｆがともに比較的高い値になることにより最も促進されるが、このときＫ_{ａｓｓｏｃ}値が低くなる。実際、金属製剤の結合親和性が弱いほどＨＣＶプロテアーゼの効率的な不活性化が促進されることが観察され（図１および２）、このことは、アミノ酸を酸化修飾した後の金属製剤触媒のＨＣＶプロテアーゼからの解離が迅速になることと一致している。図１は、親和性が５００ｎｍであるが触媒効率が０．０８３ｈ^−１と低いペプチドの結果を図示したものであり、これに対し、親和性が４８μＭと低い第二のペプチド（図２）は比較的高い触媒効率１．６ｈ^−１を示している。

従来の薬物モデルでは通常、同時に副次的な他の生体成分との非選択的結合をもたらし副作用および／または毒性を増大させ得る高い薬物濃度を必要とせずに薬物標的との飽和結合を得るためには低いｎＭ〜ｐＭ程度の結合親和性が必要である。例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｐｈａｒｍａ社により開発されたＨＣＶプロテアーゼ阻害剤ＢＩＬＮ２０６１（ＢＩＬＮ２０６１）は阻害定数０．３ｎＭを示した。この分子を設計する努力は、弱いヘキサペプチド阻害剤Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ｋ_１が７９μＭ）に基づくものであった。Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社の開発事業では、比較的低い親和性のペプチドが合理的な再設計の基礎となり、Ｋ_１が７９μＭから０．３ｎＭにまで増加することにより、さらに強力な従来型の阻害剤がもたらされた。ペプチド分子の合成の方が、ペプチドを高親和性結合リガンドに変換するのに必要な複雑な多段階合成よりもはるかに単純であることは明らかである。さらに、比較的高いμＭの範囲では複数のＨＣＶプロテアーゼ候補が一様に「弱い」結合親和性を示すが、実際にはこれらは最も高いレベルの標的ＨＣＶプロテアーゼの触媒的不活性化を示している（図１および２）。

実施例２：ブホリンII金属製剤
ブホリンIIは、グラム陽性およびグラム陰性細菌ならびに真菌を含めた広範な微生物に対して抗微生物活性をもつ２１アミノ酸抗微生物ペプチドである。ブホリンペプチドは疎水環境下で両親媒性ヘリックス構造をとり、また標的細胞の膜を透過して細胞内の核酸とマイクロモル濃度で結合することが示されている。

銅ＡＴＣＵＮ誘導体ブホリンII（ＣｕＧＧＨ−ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ）を合成し、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を確立して測定された様々な細菌種の感受性を評価することにより、その誘導体の活性を元のブホリンII配列の活性と比較した。

普通ブイヨンおよび体積２００μ当たり１０^５のコロニー形成単位に相当する細胞密度を用いた標準的な液体希釈法により、相対的ＭＩＣ決定法を確立した。１２時間のインキュベーション後に可視的な増殖が見られなくなる薬物の最小濃度としてＭＩＣ値を決定した。金属製剤の誘導体化により、次の細菌株：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＡＴＣＣ２５９２２）；Ｐ．エルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＡＴＣＣ ２７５８３）；肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＡＴＣＣ ００６０３）；黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ ＡＴＣＣ４３３００）に対して、ＭＩＣが抗微生物性ブホリンIIペプチドより少なくとも１００倍増大した。

実施例３：アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）を標的とするリシノプリル金属製剤
リシノプリルをＣａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ社から購入し、粉末形態で−２０℃で保管し、ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析により予測質量が４０４ａｍｕであることを確認した。元はＮＳ０由来マウス骨髄腫細胞系から単離された組換えヒト体細胞ＡＣＥ（ｓＡＣＥ−１：Ｌｅｕ３０−Ｌｅｕ１２６１、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付加、還元性条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度が９５％超）を１２．５ｍＭトリス、７５ｍＭ ＮａＣｌ、０．５μＭ ＺｎＣｌ_２および４０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有し、ｐＨ７．５、［ｓＡＣＥ−１］＝０．４３４ｍｇ／ｍＬであるストック溶液としてＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から購入し、１回分のアリコートに分けてから−２０℃で保管した。蛍光発生基質Ｍｃａ−ＲＰＰＧＦＳＡＦＫ（Ｄｎｐ）−ＯＨをＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から購入し、ＤＭＳＯに溶解させて、１回分のアリコートに分け、−２０℃で保管した。二官能性化合物ＮＨＳ−ＤＯＴＡをＭａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ社から購入し、粉末形態で−２０℃で保管した。ＧｅＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）をｎＳｃｒｉｐｔ社から購入し、また１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）をＰｉｅｒｃｅ社から購入し、−２０℃で保管した。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）をＡｌｄｒｉｃｈ社から購入した。ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）をＳｉｇｍａ社から購入した。トリペプチドＧＧＨ−ＯＨ（ＧＧＨ）およびＺ−ＧＧＨ−ＯＨ（Ｚ−ＧＧＨ；Ｚ＝カルボキシベンジル）をＢａｃｈｅｍから入手し、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）をＭａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ社から購入した。硫酸Ｆｅ（II）七水和物、塩化Ｃｏ（II）六水和物、酢酸Ｎｉ（II）四水和物、塩化Ｃｕ（II）二水和物および塩化Ｚｎ（II）の各塩をそれぞれＡＣＲＯＳ社、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社、Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社およびＭＣＢ Ｒｅａｇｅｎｔｓ社から購入した。塩化ナトリウム、水酸化ナトリウムおよび過硫酸アンモニウムをＦｉｓｈｅｒ社から購入した。ＨＥＰＥＳをＳｉｇｍａ社から購入した。アセトニトリル、ＳＤＳおよびＮａ_２ＨＰＯ_４をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入し、ＮａＨＣＯ_３をＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ社から購入し、４０％アクリルアミド／ビス溶液（１９：１）をＢｉｏ−Ｒａｄ社から購入し、ＴＦＡをＡＣＲＯＳ社から購入した。銀染色キットをＰｉｅｒｃｅ社から購入した。ＲＰ−ＨＰＬＣに使用するＣ１８調製カラムおよび分析カラムをＶｙｄａｃ社から購入し、陰イオン交換ＨＰＬＣに使用するＰｏｌｙＷＡＸ ＬＰカラムをＰｏｌｙＬＣ社から購入した。^１Ｈ−ＮＭＲ用のＤ_２Ｏ（９９．９６％）をＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社から購入した。

ＤＭＳＯ中に５００ｍＭ ＥＤＴＡ、５００ｍＭ ＮＨＳ、５００ｍＭ ＥＤＣを含有する溶液を作製し、外界温度で２０分間反応させることにより、ＥＤＴＡ−リシノプリルを調製した。２０分後、この反応混合物４８μＬと、１００ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、ｐＨ８．０中に２２ｍＭリシノプリルを含有する溶液５５２μＬとを混合した。室温、暗所で一晩反応を進行させた後、直接、陰イオン交換ＨＰＬＣにより精製した。陰イオン交換溶出条件には、移動相Ａ＝１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ５．７；およびＢ＝１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ５．７であり、０〜１００％のＢを０〜５０分、１００％のＢを５０〜５５分に流す勾配法を用いた。生成物ＥＤＴＡ−リシノプリルの陰イオン交換ＨＰＬＣ画分を収集し、ＲＰ−ＨＰＬＣによりさらに分離した。ＲＰ−ＨＰＬＣ溶出条件では、移動相Ａ＝Ｈ_２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；Ｂ＝アセトニトリル、０．１％ＴＦＡであり、１５〜６５％のＢを０〜４５分、６５〜９５％のＢを４５〜５０分、９５％のＢを５０〜５５分に流す勾配法を用いた。生成物ＥＤＴＡ−リシノプリルのＲＰ−ＨＰＬＣ画分を収集し、凍結乾燥させ、水に再懸濁させ、ＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析により６７８ａｍｕの予測質量（ネガティブモード）および７００ａｍｕの＋Ｎａ^＋−１Ｈ^＋付加物が得られ、カップリングしていないリシノプリル反応物（４０４ａｍｕ）の証拠はみられなかった。既知の濃度の塩化銅（II）溶液を用いたＵＶ／Ｖｉｓ（２７０ｎｍ）滴定によりＥＤＴＡ−リシノプリルの濃度を定量した。

ＤＭＳＯ中に５００ｍＭ ＮＴＡ、５００ｍＭ ＮＨＳおよび５００ｍＭ ＥＤＣを含有する溶液を作製して２０分間反応させることによりＮＴＡ−リシノプリルを調製した後、この反応物４８μＬと、１００ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、ｐＨ８．０中に２２ｍＭリシノプリルを含有する溶液５５２μＬとを混合した。室温、暗所で一晩反応を進行させた後、ＥＤＴＡ−リシノプリルに用いた溶出条件と同じ溶出条件を用いて、ＨＰＬＣにより連続的に精製した（最初に陰イオン交換、次いでＲＰ−ＨＰＬＣ）。生成物ＮＴＡ−リシノプリルのＲＰ−ＨＰＬＣ画分を収集し、凍結乾燥させ、水に再懸濁させ、ＥＳＩ−ＬＣＱ ＭＳ分析により５７８ａｍｕの予測質量（ネガティブモード）が得られ、カップリングしていないリシノプリル反応物の証拠はみられなかった。既知の濃度の硫酸鉄（II）溶液を用いたＵＶ／Ｖｉｓ（２５０ｎｍ）滴定によりＮＴＡ−リシノプリルの濃度を定量した。

１００ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、ｐＨ８．０中に４０ｍＭ ＮＨＳ−ＤＯＴＡ（ＤＭＳＯで作製した１０×ストック）および２０ｍＭリシノプリルを含有する溶液を作製することにより、ＤＯＴＡ−リシノプリルを調製した。室温、暗所で一晩反応を進行させた後、ＥＤＴＡ−リシノプリルに用いた溶出条件と同じ溶出条件を用いて、ＨＰＬＣにより連続的に精製した（最初に陰イオン交換、次いでＲＰ−ＨＰＬＣ）。生成物ＤＯＴＡ−リシノプリルのＲＰ−ＨＰＬＣ画分を収集し、凍結乾燥させ、水に再懸濁させ、ＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析により７９１ａｍｕの予測質量（ネガティブモード）が得られ、カップリングしていないリシノプリル反応物の証拠はみられなかった。既知の濃度の酢酸ニッケル（II）溶液を用いたＵＶ／Ｖｉｓ（２４０ｎｍ）滴定によりＤＯＴＡ−リシノプリルの濃度を定量した。

ＤＭＳＯ中に２００ｍＭ Ｚ−ＧＧＨ（Ｚ＝カルボキシベンジル）、２００ｍＭ ＮＨＳ、２００ｍＭ ＥＤＣを含有する溶液を作製して２０分間反応させることによりＧＧＨ−リシノプリルを調製した後、この反応物５４μＬと、ＤＭＳＯ中２００ｍＭのリシノプリル３０μＬとを混合した。室温、暗所で一晩反応を進行させた後、ＥＤＴＡ−リシノプリルに用いた溶出条件と同じ溶出条件を用いて、ＨＰＬＣにより連続的に精製した（最初に陰イオン交換、次いでＲＰ−ＨＰＬＣ）。生成物Ｚ−ＧＧＨ−リシノプリルのＲＰ−ＨＰＬＣ画分を収集し、凍結乾燥させた。ＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析によりＺ−ＧＧＨ−リシノプリルの予測質量７８９ａｍｕが得られ、カップリングしていないリシノプリル反応物の証拠はみられなかった。凍結乾燥したＺ−ＧＧＨ−リシノプリルをＴＦＡ１ｍＬに溶解させることにより脱保護し、木炭上２０％Ｐｄ（ＯＨ）_２５ｍｇを加え、攪拌してスラリー状にした。混合物にＡｒパージを行い、無酸素溶液をＨ_２の陽圧下で約６時間反応させた。混合物を真空下で乾燥させ、水に再び溶解させ、遠心分離して固体触媒を除去し、得られた脱保護ＧＧＨ−リシノプリルを、ＥＤＴＡ−リシノプリルに用いたＲＰ−ＨＰＬＣ条件と同じＲＰ−ＨＰＬＣ条件を用いてＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。生成物ＧＧＨ−リシノプリルのＲＰ−ＨＰＬＣ画分を収集し、凍結乾燥させ、水に再懸濁させ、ＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析により６５５ａｍｕ（ネガティブモード）の予測質量および６７７ａｍｕの＋Ｎａ^＋−１Ｈ^＋付加物が得られ、カップリングしていないリシノプリル反応物の証拠はみられなかった。既知の濃度の酢酸ニッケル（II）溶液を用いたＵＶ／Ｖｉｓ（２４５ｎｍ）滴定により生成物ＧＧＨ−リシノプリルの濃度を定量した。

金属キレート錯体およびそのリシノプリルのリジン側鎖との結合を図３にまとめて示す（Ｍ＝Ｆｅ^３＋、Ｃｏ^２＋、Ｎｉ^２＋、Ｃｕ^２＋；Ｒ＝Ｎ（Ｈ）−リシノプリル）。^１Ｈ−ＮＭＲ分析、分析ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＥＳＩ−ＭＳにより合成キレート−リシノプリル化合物のアイデンティティおよび異性体純度を確認した。各測定前に、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌを含有するｐＨ７．４の緩衝液中で二価の鉄、コバルト、ニッケルおよび銅の各金属塩とＤＯＴＡ−リシノプリル、ＥＤＴＡ−リシノプリル、ＮＴＡ−リシノプリルおよびＧＧＨ−リシノプリルとを混合し、室温で３０分間混ぜることにより、キレート−リシノプリル種の各金属錯体を調製した。ＵＶ／Ｖｉｓによってモニターする金属イオン滴定によりＭ−キレート錯体の形成を確認した。濃度依存的および時間依存的不活性化の実験に、それぞれ１：１および１：１．１の金属：キレート比（基本的にすべての金属がキレートされるように）を用いた。Ｆｅ^２＋とＧＧＨ−リシノプリルとの錯体は錯体形成が不十分なため、のちの実験には使用しなかった。

ＩＣ_５０値の決定
ｓＡＣＥ−１（１ｎＭ）および濃度を変化させた各Ｍ−キレート−リシノプリル錯体（Ｚｎ^２＋の非存在下で調製）を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０μＭ ＺｎＣｌ_２、０．０５％Ｂｒｉｊ３５を含有するｐＨ７．４の緩衝液中、３７℃で２０分間インキュベートした。２０分後、プレインキュベートしたｓＡＣＥ−１と阻害剤の混合物各６８．６μＬを蛍光キュベット中、０．５ｍＭの蛍光発生基質１．４μＬと混合し、直ちに３７℃、励起３２０ｎｍ、発光４０５ｎｍでのリアルタイム蛍光定量法により、ｓＡＣＥ−１による基質切断をモニターした。各濃度のＭ−キレート−リシノプリルについて蛍光増加の初速度を求め、その初速度をＭ−キレート−リシノプリル錯体の非存在下でｓＡＣＥ−１による基質切断が阻害されていない場合の複数の初速度の平均値の百分率（％最大活性）で表した。Ｍ−キレート−リシノプリル濃度に対する％最大活性のプロットは方程式（１）
Ａ＝（１００％）／［１＋（［Ｉ］／［ＩＣ_５０］）^ｎ］ （１）
（式中、Ａ、［Ｉ］、ｎおよび［ＩＣ_５０］はそれぞれ、％最大活性、阻害剤の濃度、適合した協同性および適合したＩＣ_５０である）に適合するものであった。各種のＭ−キレート−リシノプリル、キレート−リシノプリル、Ｍ−キレートおよびキレート剤のＩＣ_５０値を決定した。

ｓＡＣＥ−１の時間依存的不活性化
ｓＡＣＥ−１および各Ｍ−キレート−リシノプリル錯体（Ｚｎ^２＋の非存在下で調製）を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０μＭ ＺｎＣｌ_２、０．０５％Ｂｒｉｊ３５を含有するｐＨ７．４の緩衝液中、３７℃で２０分間プレインキュベートし、２０分後、共反応物であるアスコルビン酸および／またはＨ_２Ｏ_２を加えて（あるいは共反応物を加えずに）各反応を開始させた。反応濃度はｓＡＣＥ−１が１ｎＭ、Ｍ−キレート−リシノプリルが約８０％の活性をもたらす濃度（方程式（１）を用いてＡ＝８０％で算出；段落［００１３２］の表に記載の濃度）、アスコルビン酸および／またはＨ_２Ｏ_２が１ｍＭ（または共反応物なし）であった。各時間依存的ＡＣＥ−不活性化反応を３７℃で２時間進行させ、途中の特定の各時点でｓＡＣＥ−１を含有する反応混合物６８．６μＬのアリコートを蛍光キュベット中、０．５ｍＭの蛍光発生基質１．４μＬと混合した。直ちに３７℃、励起３２０ｎｍ、発光４０５ｎｍでのリアルタイム蛍光定量法により、ｓＡＣＥ−１による基質切断をモニターした。ｓＡＣＥ−１の時間依存的不活性化について、各時点の初速度を求め、その初速度を、Ｍ−キレート−リシノプリル錯体と共反応物の非存在下で決定したｓＡＣＥ−１による基質切断が阻害されていない場合の複数の初速度の平均値の百分率（％最大活性）で表した。時間に対する％最大活性のプロットは一次指数関数的減衰モデルに適合するものであり、Ｍ−キレート−リシノプリル錯体によるｓＡＣＥ−１不活性化の初速度が決定された。方程式（２）
ｋ_２＝Ｒ／［Ｉ］／［Ｅ］ （２）
（式中、ｋ_２は二次速度定数（Ｍ^−１分^−１）、Ｒは、Ｍ−キレート−リシノプリル錯体は存在しないが同じ共反応物が存在する場合の対応するバックグラウンド速度を減じた後の酵素不活性化の初速度（Ｍ／分）、［Ｉ］は使用したＭ−キレート−リシノプリル錯体の濃度（Ｍ）、［Ｅ］は使用したｓＡＣＥ−１の濃度（１×１０^−９Ｍ）である）を用いてｓＡＣＥ−１不活性化の二次速度定数を決定した。それぞれのＭ−キレート−リシノプリル錯体に用いたものと同じ方法および条件で、リシノプリルが結合していないＭ−キレート錯体を用いた対照実験を実施した。

いくつかのＭ−キレート−リシノプリル錯体による完全長ｓＡＣＥ−１の不活性化および切断の両方の二次速度定数、リシノプリルを欠く対応するＭ−キレートの対照実験の二次速度定数ならびに金属キレート−リシノプリル錯体によるｓＡＣＥ−１阻害のＩＣ_５０を下の表に記載する。

ｓＡＣＥ−１標的化
異なる還元電位の金属キレートを有するＣｕ−ＧＧＨ−リシノプリルコンジュゲートを除く錯体はすべて、親和性を増加させながら活性を減少させる一般的傾向を示す（図４）。ばらつきは、同様に活性を左右するのに何らかの役割を果たす他の因子（立体構造、電子、切断されやすい結合に対する金属と会合した活性酸素種の位置）が優勢であることを反映しており、高い親和性結合それ自体が効率的な反応性を促進するものではないことを強調するものである。

実施例４：ＨＩＶ ＲＲＥ ＲＮＡを標的とするビリオン発現調節因子（ＲＥＶ）金属製剤
カスタムＲＮＡをＤｈａｒｍａｃｏｎ社から購入し、このＲＮＡには配列５’−ＧＧＵＣＵＧＧＧＣＧＣＡＧＣＧＣＡＡＧＣＵＧＡＣＧＧ（２−ＡＰ）ＡＣＡＧＧＣＣ−３’を有するＡＰ−ＲＲＥ ＲＮＡおよび配列５’−フルオレセイン−ＵＵＧＧＵＣＵＧＧＧＣＧＣＡＧＣＧＣＡＡＧＣＵＧＡＣＧＧＵＡＣＡＧＧ−ＣＣ−３’を有するＦｌ−ＲＲＥ ＲＮＡが含まれていた。カップリング反応に使用する配列Ａｃ−ＫＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ−ＮＨ_２を有するＮ末端アセチル化／Ｃ末端アミド化ペプチド（Ｋ−Ｒｅｖ）をＮｅｏ Ｐｅｐｔｉｄｅ社から購入した。配列ＧＧＨＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ−ＮＨ_２を有するペプチドＧＧＨ−Ｒｅｖおよび配列ＫＧＨＫＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ−ＮＨ_２を有するペプチドＫＧＨＫ−ＲｅｖをＧｅｎｅｍｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ社から購入した。ＲＮＡおよびペプチド種を直ちに１回分の容器に等分して−２０℃で保管し、凍結融解サイクルを最小限に抑えた。二官能性化合物ＮＨＳ−ＤＯＴＡおよびｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＴＰＡをＭａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ社から購入し、−２０℃で保管した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社から購入し、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）をＰｉｅｒｃｅ社から購入し、−２０℃で保管した。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）をＡｌｄｒｉｃｈ社から購入した。ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）およびジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）をＳｉｇｍａ社から購入した。トリペプチドＧＧＨ−ＯＨ（ＧＧＨ）およびテトラペプチドＫＧＨＫ−ＮＨ_２（ＫＧＨＫ）をＢａｃｈｅｍ社から入手し、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）をＭａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ社から購入した。硫酸Ｆｅ（II）七水和物、塩化Ｃｏ（II）六水和物、Ｎｉ（II）四水和物および塩化Ｃｕ（II）二水和物の各塩をそれぞれのＡＣＲＯＳ社、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社、Ａｌｄｒｉｃｈ社およびＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社から購入した。塩化ナトリウムおよび水酸化ナトリウムをＦｉｓｈｅｒ社から購入し、ＨＥＰＥＳをＳｉｇｍａ社から購入した。

１００ｍＭ ＮａＨＣＯ_３を含有するｐＨ８．０の緩衝液中、３．８ｍＭ ＮＨＳ−ＤＯＴＡ（ＤＭＳＯで作製した１０×ストック）および７５７μＭ Ｋ−Ｒｅｖを含有する溶液を作製することにより、ＤＯＴＡ−Ｒｅｖを調製した。室温、室温で２時間反応を進行させた後、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。溶出条件は、１５〜３５％のＢ、０〜５０分；３５〜１００％のＢ、５０〜５５分；１００％のＢ、５５〜６０分で、移動相Ａ＝Ｈ_２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；Ｂ＝アセトニトリル、０．１％ＴＦＡであった。生成物ＤＯＴＡ−ＲｅｖのＨＰＬＣ画分を収集し、凍結乾燥させ、水に再懸濁させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析により予測質量２９９２．３ａｍｕが得られ、カップリングしていないＫ−Ｒｅｖ反応物の証拠はみられなかった。既知の濃度の酢酸ニッケル（II）溶液を用いたＵＶ／Ｖｉｓ（２４０ｎｍ）滴定によりＤＯＴＡ−Ｒｅｖの濃度を定量した。

２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌを含有するｐＨ５．７の緩衝液に３８ｍＭ ＥＤＴＡ（またはＮＴＡ）、３８ｍＭ ＮＨＳ、１５．６ｍＭ ＥＤＣを溶かした溶液を最初に調製することにより、最初にＥＤＴＡ−ＲｅｖおよびＮＴＡ−Ｒｅｖを別々に作製し、１分間反応させた。１分後、Ｋ−Ｒｅｖを最終濃度７５７μＭになるまで加えた。室温、暗所で２〜４時間反応を進行させた後、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。溶出条件は、１５〜２０％のＢ、０〜５０分；２０〜１００％のＢ、５０〜５５分；１００％のＢ、５５〜６０分で、移動相Ａ＝Ｈ_２Ｏ、０．１％ＴＦＡ；Ｂ＝アセトニトリル、０．１％ＴＦＡであった。分離が十分ではなく、カップリングが１００％未満であったため、カップリングしたＫ−ＲｅｖとカップリングしていないＫ−Ｒｅｖの混合物を含有する収集したＨＰＬＣ画分を凍結乾燥させ、水に再懸濁させ、収率を上げるためにＥＤＴＡ（またはＮＴＡ）をさらに加えて上記の手順により再利用し、ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製を再び行った。凍結乾燥ＨＰＬＣ画分を水に再懸濁させ、既知の濃度のＣｕＣｌ_２（２７０ｎｍ）およびＦｅＳＯ_４（２５０ｎｍ）の溶液を用いたＵＶ／Ｖｉｓ滴定により、それぞれＥＤＴＡ−ＲｅｖおよびＮＴＡ−Ｒｅｖの濃度を決定した。金属イオン滴定により決定されたカップリングしたＥＤＴＡ（またはＮＴＡ）の濃度と２８０ｎｍでの吸光度により別々に決定されたＥＤＴＡ−Ｒｅｖ／Ｋ−Ｒｅｖ（またはＮＴＡ−Ｒｅｖ／Ｋ−Ｒｅｖ）の内部Ｔｒｐ残基の濃度を比較することにより、カップリングしたＫ−Ｒｅｖ生成物の純度（カップリングの程度の尺度でもある）を決定した。カップリング効率は８３％（ＥＤＴＡ−Ｒｅｖ）および１３７％（ＮＴＡ−Ｒｅｖ）であったが、見かけの程度が１００％を超えた理由は不明であり、データ適合のアーチファクトである可能性が考えられる。ＭＡＬＤＩ分析によりＥＤＴＡ−ＲｅｖおよびＮＴＡ−Ｒｅｖでそれぞれ２８８０．７ａｍｕおよび２７７９．７ａｍｕの予測質量ならびに残存するカップリングしていないＫ−Ｒｅｖ（２６０６．９ａｍｕ）反応物が得られた。

１００ｍＭ ＮａＨＣＯ_３を含有するｐＨ９．０の緩衝液中に３．８ｍＭ ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＴＰＡ（ＤＭＳＯで作製した１０×ストック）および７５７μＭ Ｋ−Ｒｅを含有する溶液からＤＴＰＡ−Ｒｅｖを調製した。室温、暗所で２時間反応を進行させた後、ＤＯＴＡ−Ｒｅｖに用いた溶出条件と同じ溶出条件を用いてＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。ＤＴＰＡ−ＲｅｖのＨＰＬＣ画分を収集し、凍結乾燥させ、水に再懸濁させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析によりＤＴＰＡ−Ｒｅｖで３１４６．４ａｍｕの予測質量およびこれよりはるかに少ない残存Ｋ−Ｒｅｖが２６０６．９ａｍｕで得られた。ＤＴＰＡ−Ｒｅｖ生成物とＫ−Ｒｅｖ生成物はともにＨＰＬＣによって容易に分離できたため、２６０６．９ａｍｕで観察されたＫ−ＲｅｖはＭＡＬＤＩ分析によるアーチファクトである可能性が考えられる。既知の濃度のＣｕＣｌ_２溶液を用いたＵＶ／Ｖｉｓ（２９０ｎｍ）滴定によりＤＴＰＡ−Ｒｅｖの濃度を定量した。

各測定前に、二価の鉄、コバルト、ニッケルおよび銅の各金属塩とＤＯＴＡ−Ｒｅｖ、ＤＴＰＡ−Ｒｅｖ、ＥＤＴＡ−Ｒｅｖ、ＮＴＡ−Ｒｅｖ、ＧＧＨ−ＲｅｖおよびＫＧＨＫ−Ｒｅｖとを１：１．２の比（基本的にすべての金属がキレートされるように）で混合し、室温で３０分間混ぜることにより、キレート−Ｒｅｖ種の各金属錯体を調製した。ＵＶ／Ｖｉｓ滴定により金属キレート錯体の形成を確認した。キレート剤ＧＧＨ−ＲｅｖおよびＫＧＨＫ−Ｒｅｖを用いたＦｅ^２＋錯体は錯体形成が不十分なため、のちの実験には使用しなかった。金属キレート錯体とそのＲｅｖペプチドとの結合様式をまとめて図５に示す（Ｍ＝Ｆｅ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｎｉ^２＋、Ｃｕ^２＋；Ｒ_１＝Ｎ（Ｈ）−Ｋ−Ｒｅｖ；Ｒ_２＝ｐ−Ｂｎ−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）−Ｋ−Ｒｅｖ；Ｒ_３＝Ｎ（Ｈ）−Ｒｅｖ）。

解離定数の決定
Ｖａｒｉａｎ Ｃａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光分光光度計で、３１０ｎｍでの励起（ＳＷ＝１０ｎｍ）および３７１ｎｍでの発光（ＳＷ＝１０ｎｍ）を用いての蛍光定量法により解離定数（Ｋ_Ｄ）を決定した。最初に１００ｎＭ ＡＰ−ＲＲＥ ＲＮＡ６６０μＬを９０℃に５分間加熱し、次いで、滴定温度（３７℃）までそれを下回らないよう冷却した。この試料６５０μＬを予めサーモスタットで温度調節したキュベットに加えた。１０分間温度を平衡状態にした後、この溶液に５μＭのＭ−キレート−Ｒｅｖ錯体溶液を滴定した。添加ごとに、完全に混合されるように溶液１００μＬをピペッティングにより穏やかに混ぜた。ペプチド結合後にアミノプリン標識の環境の変化による蛍光の変化をモニターした。滴定反応曲線に希釈補正およびバックグラウンド補正を施し、初期強度値に正規化した。曲線は２つの独立した結合部位の二相方程式（４）
Ｆ_ｏｂｓ＝Ｆ_０＋｛（Ｋ_Ｄ１＋Ｒ_０＋Ｐ_０−［（（Ｋ_Ｄ１＋Ｒ_０＋Ｐ_０）^２）−（４Ｒ_０Ｐ_０）］^１／２）／（２Ｒ_０）．（Ｆ_１−Ｆ_０）｝＋｛（Ｋ_Ｄ２＋Ｒ_０＋Ｐ_０−［（（Ｋ_Ｄ２＋Ｒ_０＋Ｐ_０）^２）−（４Ｒ_０Ｐ_０）］^１／２）／（２Ｒ_０）．（Ｆ_２−Ｆ_１）｝ （４）
に適合するものであり、式中、Ｆ_ｏｂｓは観察された蛍光の総強度であり、Ｐ_０は加えたＭ−キレート−Ｒｅｖの総濃度であり、Ｆ_０、Ｆ_１およびＦ_２はそれぞれ、未結合のＡＰ−ＲＮＡ、１つ結合したＡＰ−ＲＮＡおよび２つ結合したＡＰ−ＲＮＡの強度に対応する適合パラメータであり、Ｒ_０はＡＰ−ＲＮＡの初期濃度であり、Ｋ_Ｄ１およびＫ_Ｄ２はそれぞれ、高親和性部位および低親和性部位における結合の解離定数である。結合実験はすべて、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌからなるｐＨ７．４の結合緩衝液中で実施した。

ＲＲＥ ＲＮＡ切断速度のＰＡＧＥ分析
１つのチューブが１つのゲルレーンに対応し、それぞれ２０μＬの総反応体積を含む別々のチューブ内で、１００ｎＭ金属キレート−Ｒｅｖ（１：１．２のＭ：キレート比）、１ｍＭ Ｈ_２Ｏ_２、１ｍＭアスコルビン酸および１００ｎＭ５’フルオレセイン末端標識ＲＲＥステムIIＢ ＲＮＡ（Ｆｌ−ＲＮＡ）の反応を３７℃で行った。いずれの実験にも、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌからなるｐＨ７．４の緩衝液を使用した。反応前、Ｆｌ−ＲＮＡを９０℃に加熱し、３７℃までそれを下回らないよう冷却し、プレインキュベートした各チューブにＦｌ−ＲＮＡを直ちに加えた。各反応の開始に相当する時点で、プレインキュベートしたチューブに反応物を加えたが、この操作は暗い恒温器内で行った。反応開始時間をずらし、標準的な１×トリス−ＥＤＴＡ−酢酸緩衝液、８Ｍ尿素、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌからなる反応停止／ゲルローディング緩衝液溶液（８０μＬ／チューブ）の添加によりすべての反応を同時に停止させた。次いでチューブを５分間、９０℃に加熱した後、各チューブから５μＬのアリコートを１０％ポリアクリルアミド８Ｍ尿素ゲルの対応するレーンに負荷し、１レーン当たり１ｐｍｏｌｅのＦｌ−ＲＮＡとした。ゲル電気泳動を２５０Ｖで１．５時間実施した。ＧＥ Ｔｙｐｈｏｏｎ可変モード撮像装置で４８８ｎｍの励起波長および５２６ｎｍの単一パス発光フィルターを用いてゲルを分析した。プログラムＩｍａｇｅＱｕａｎｔによりバンドを定量化した。最初のＦｌ−ＲＮＡ反応物のバンドの消失は、ソフトウェアＯｒｉｇｉｎを用いた一次反応方程式に適合するものであり、観察された速度定数および初速度が決定された。Ｒｅｖドメインを欠くそれぞれの金属キレートを用いた対照反応を同じ方法で実施した。

リアルタイム蛍光定量法によりモニターされる反応速度
１００ｎＭ金属キレート−Ｒｅｖ（１：１．２のＭ：キレート比）、１ｍＭ Ｈ_２Ｏ_２、１ｍＭアスコルビン酸および１００ｎＭ ＡＰ−ＲＮＡの反応をＶａｒｉａｎ Ｃａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光分光光度計内の蛍光キュベット中、３７℃で実施した。３１０ｎｍの励起波長（ＳＷ＝１０ｎｍ）および３７１ｎｍの発光波長（ＳＷ＝１０ｎｍ）を用いて反応をモニターした。反応前、ＡＰ−ＲＮＡを５分間、９０℃に加熱し、次いで予め加温した３７℃のキュベットに加えた。５分後に金属キレート−Ｒｅｖ錯体を加え、さらに１０分経過した後に、Ｈ_２Ｏ_２およびアスコルビン酸の添加により反応を開始させた。得られた各蛍光トレースは、ソフトウェアＯｒｉｇｉｎを用いた一次反応方程式に適合するものであり、観察された速度定数および初速度を決定した；完全に反応したことがわかっている数多くの試験から得られた蛍光の変化の大きさの平均値を求めることにより、完全な反応に対応する蛍光の変化の大きさを明らかにした。濃度および緩衝液はすべて、Ｆｌ−ＲＮＡのＰＡＧＥ分析アッセイで使用したものと同じものであった。Ｒｅｖドメインを欠くそれぞれの金属キレートを用いた対照反応を同じ方法で実施した。

Ｆｌ−ＲＮＡ（フルオレセイン標識ＲＮＡ）およびＡＰ−ＲＮＡ（アミノプリン標識ＲＮＡ）切断の初速度ならびに高親和性（Ｋ_Ｄ１）および低親和性（Ｋ_Ｄ２）のＲＲＥ ＲＮＡ部位について決定された解離定数（Ｋ_Ｄ）を下の表に示す。結合定数（Ｋ_Ａ）も示す。

解離定数（Ｋ_Ｄ）および結合定数（Ｋ_Ａ）、相対蛍光単位（ＲＦＵ）、最大速度（Ｖ_ｍａｘ）

アスコルビン酸／ペルオキシド試薬の存在下でのＤＮＡに対する活性について、ＨＩＶ ＲＲＥ ＲＮＡ標的化ペプチドの金属キレートコンジュゲートの反応性を評価した。以下に示すように、親和性は１０^４Ｍ^−１〜５×１０^８Ｍ^−１の範囲内にあった。

^ａ濃度の単位はｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡのμＭ塩基対である。

ｓＡＣＥ−１とのリシノプリル金属製剤およびＲＲＥ ＲＮＡ−金属ペプチド錯体の構造モデリングは一般に、反応性の金属中心をそれぞれ標的タンパク質または標的ＲＮＡに接近した位置（１０Å未満）に置くものである。ＳｐａｒｔａｎソフトウェアとＧａｕｓｓｉａｎソフトウェアを組み合わせて用い、ｓＡＣＥ−１のＮ、Ｃの両ドメインとＭ−キレート−リシノプリル錯体との間の相互作用をモデル化した。阻害剤リシノプリルとの錯体（ＰＤＢ ＩＤ：２Ｃ６Ｎ）中のｓＡＣＥ−１のＮドメインのＸ線結晶構造から、Ｇａｕｓｓｉａｎでリシノプリルリジン側鎖のＮ原子を中心とする半径１５Åの球状体が得られ、これを活性部位のモデル化に用いた。リシノプリルとの錯体（ＰＤＢ ＩＤ：１Ｏ８６）中のＡＣＥ（ｔＡＣＥ）のＣドメインのＸ線結晶構造を用いてこの方法を繰り返した。構造のエネルギー最小化が溶媒と関係なく行われるＭｅｒｃｋ分子力場ＭＭＦＦａｑを用い、Ｓｐａｒｔａｎで分子力学エネルギー最小化を行った。モデルの幾何学的構造をＸ線結晶構造に束縛したのに対し、リシノプリルリジン側鎖およびリジン−キレートリンカーの幾何学的構造はエネルギー最小化の際に変化させた。１０ラウンド連続してエネルギー最小化を行ってエネルギーが０．１ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下に下がった時点で構造を受け入れた。モデリングパラメータは、基底状態での平衡構造、原子の凍結および対称という条件、多重度＝一重項、総電荷＝０（電荷の一部をＭＭＦＦａｑにより操作）とした。

ＲＲＥ ＲＮＡ−金属ペプチド錯体の場合、ほとんどＳｐａｒｔａｎソフトウェアを用いて上記相互作用をモデル化した。構造のエネルギー最小化が溶媒と関係なく行われるＭｅｒｃｋ分子力場ＭＭＦＦａｑを用いて分子力学エネルギー最小化を行った。モデルの幾何学的構造をＲＮＡ−Ｒｅｖペプチド錯体（ＰＤＢ ＩＤ：１ＥＴＦ）の平均的構造およびＭ−キレートのＸ線結晶構造に束縛したのに対し、Ｎ末端リジン（ＧＧＨ−ＲｅｖおよびＫＧＨＫ−Ｒｅｖのトレオニン）およびリジン−キレートリンカーの幾何学的構造はエネルギー最小化の際に変化させた。１０ラウンド連続してエネルギー最小化を行ってエネルギーが０．１ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下に下がった時点で構造を受け入れた。モデリングパラメータは、基底状態での平衡構造、原子の凍結および対称という条件、多重度＝一重項とした。各錯体について、エネルギー最小化の際に用いた総電荷は、ｐＨ７．４において予測される総電荷に相当するものであった。

実施例５．ＨＣＶ配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）ＲＮＡを標的とするペプチド金属製剤
ＲＮＡをＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）の一部であるＤｈａｒｍａｃｏｎから購入した。Ｃ末端をアミド化したペプチドをＧｅｎｅｍｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ社（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）から購入した。ステムループ（ＳＬ）構造（Ｌｙｔｌｅら，ＲＮＡ １３：５３９−４８，２００２による）を図６に示す。使用したＩＲＥＳ ＳＬ IIｂ ＲＮＡの配列は５’−フルオレセイン−ＧＧＣＡＧＡＡＡＧＣＧＵＣＵＡＧＣＣＡＵＧＧＣＧＵＵＡＧＵＡＵＧＣＣ−３’、ＩＲＥＳ ＳＬ IＶ ＲＮＡの配列は５’−フルオレセイン−ＧＧＡＣＣＧＵＧＣＡＣＣＡＵＧＡＧＣＡＣＧＡＡＵＣＣ−３’であった。ＲＮＡはすべて、使用前に９５℃まで加熱してから室温まで冷却した。

２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ ＮａＣｌ中８４ｎＭのＧＧＨＹｒＦＫ−アミドの存在下で、ＲＮＡ結合実験を実施した。ＧＧＨＹｒＦＫ−アミドに一続きの未標識ＩＲＥＳ ＲＮＡ付加物を加え、チロシン発光をモニターした（λ_ｅｘ＝２８０ｎｍ、λ_ｅｍ＝３１３ｎｍ）。一連のペプチド付加物を５’−フルオレセイン標識ＩＲＥＳ ＳＬIIｂに加えて５１８ｎｍでモニターすることにより（Ｅｘ＝４８５ｎｍ）、ＧＧＨＹｒＦＫＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−アミドおよびＧＧＨＹｒＦＫＧＧＧＫＤＥＬ−アミドの結合データを得た。次いで、データを一部位結合モデルに当てはめた。

励起波長および発光波長がそれぞれ４８５ｎｍおよび５１８ｎｍの５’フルオレセイン末端標識ＲＮＡを用いた蛍光により、ＨＣＶ ＩＲＥＳ ＲＮＡ切断をｉｎ ｖｉｔｒｏでモニターした。触媒１００ｎＭを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）、１００ｍＭ ＮａＣｌ中、１ｍＭアスコルビン酸および１ｍＭ Ｈ_２Ｏ_２の存在下、１００μｌの反応体積で反応を実施し、反応が起こったときに観察される蛍光の変化により分析した。ＲＮＡ基質の時間依存性および濃度依存性の両方を観察した。初速度はＯｒｉｇｉｎ７．０ソフトウェアを用いた直線に適合するものであり、ｋ_ｏｂｓを得た。次いでこの値を用いてＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎパラメータを得た。

ＨＣＶ細胞レプリコンアッセイ
このアッセイには安定な細胞系ＥＴ（ｌｕｃ−ｕｂｉ−ｎｅｏ／ＥＴ）を用いた。ＥＴは、安定なルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）レポーターと３つの細胞培養適応変異とを有するＨＣＶ ＲＮＡレプリコンを含むＨｕｈ７ヒト肝細胞癌細胞系である。ＨＣＶ ＲＮＡレプリコン抗ウイルス評価アッセイにより、それぞれ６種類の半対数濃度における化合物の効果を検討した。実施ごとにヒトインターフェロン‐α−２ｂを陽性対照化合物として含めた。細胞数（細胞毒性）または抗ウイルス活性の分析に供する９６ウェルプレートにコンフルエント未満のＥＴ系培養物を移し、翌日、各種濃度の金属製剤および対照化合物をしかるべきウェルに加えた。細胞が依然としてコンフルエント未満である７２時間後に細胞を処理した。化合物の６種類の半対数段階希釈を行い、ＩＣ_５０（ウイルス複製を５０％阻害する濃度）、ＴＣ_５０（細胞生存率を５０％低下させる濃度）およびＴＩ（選択指数：ＴＣ_５０／ＩＣ_５０）の値を求めた。ＨＣＶ ＲＮＡレプリコンレベルをレプリコン由来のＬｕｃ活性として評価した。ＣｙｔｏＴｏｘ−１細胞増殖比色アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）により、細胞数を減少させる薬物の毒性濃度（細胞毒性）を評価した。

例示のＩＲＥＳ標的化ペプチドには、ＨＣＶ ＩＲＥＳ ＲＮＡを標的とするペプチドとカップリングしたＮ末端金属結合ＡＴＣＵＮモチーフが組み込まれている。下の表は、ＩＲＥＳ ＲＮＡ上の異なるステムループモチーフを標的とするよう設計された金属製剤の種々のファミリー（特に注記がない限り、Ｃ末端はアミド化されている）ならびにＰＥＧ２４およびＰＥＧ４８がそれぞれ２４個および４８個のエチレン単位を含むペグ化形態の代表的なものをまとめたものである。ここに挙げた短いペプチド配列は、金属結合ＡＴＣＵＮモチーフ（ＧＧＨ、ＧＧｈ、ＫＧＨ、ＫＫＨ）と、ＩＲＥＳ ＲＮＡのドメインIIＢ、IIIおよびIＶのステムループ構造を認識する短いペプチド結合モチーフとを含むものである。小文字で書かれたアミノ酸の一文字略号はＤ立体配置の残基を表し、ＰＥＧはポリエチレングリコールを表す。
ＧＧＨＧＫＹＫＥＴＤＬＬＩＬＦＫＤＤＹＦＡＫＫＮＥＥＲＫ
ＧＧＨＧＫＹＫＥＴＤＬＬＩＬＦＫＤＤＹＦＡＫＫＮＥＥＲＫＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ
ＧＧＨＧＫＹＫＥＴＤＬＬＩＬＦＫＤＤＹＦＡＫＫＮＥＥＲＫＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ
ＧＧＨＫＹＫＥＴＤＬＬＩＬＦＫＤＤＹＦＡＫＫＮＥＥＲＫＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ
ＧＧＨＫＹＫＥＴＤＬＬＩＬＦＫＤＤＹＦＡＫＫＮＥＥＲＫＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ
ＧＧＨＧＫＹＫＥＴＤＬＬＩＬＦＫＤＤＹＦＡＫＫＮＥＥＲＫＫＤＥＬ
ＧＧＨＧＫＹＫＥＴＤＬＬＩＬＦＫＤＤＹＦＡＫＫＮＥＥＲＫＧＧＧＫＤＥＬ
ＧＧＨＧＡＡＬＥＡＫＩＣＨＱＩＥＹＹＦＧＤＦ
ＧＧＨＡＡＬＥＡＫＩＣＨＱＩＥＹＹＦＧＤＦ
ＧＧＨＧＹｒＦＫ
ＧＧＨＧＹｒＦＫＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ
ＧＧＨＧＹｒＦＫＧＧＧＫＤＥＬ
ＧＧＨＹｒＦＫ
ＧＧｈｙｒｆｋ
ＧＧＨＹｒＦＫＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ
ＧＧＨＹｒＦＫＧＧＧＫＤＥＬ
ＧＧＨＧＫＹＫＥＴＤＬＬＩＬＦＫＤＤＹＦＡＫＫＮＥＥＲＫ
ＧＧＨＹｒＦＫ−カルボキシル
ＫＫＨＹｒＦＫ
ＧＧＨＫＹＫＥＴＤＬＬＩＬＦＫＤＤＹＦＡＫＫＮＥＥＲＫ
ＧＧＨＫＹＫＥＴＤＬＬＩＬＦＫＤＤＹＦＡＫＫＮＥＥＲＫＫＤＥＬ
ＧＧＨＫＹＫＥＴＤＬ
ＧＧＨＫＹＫＥＴＤＬ
ＧＧＨＹＲＦＫ
ＧＧＨＹｒＦＫＧＧＣ−ＰＥＧ２４
ＧＧＨＹｒＦＫＧＧＣ−ＰＥＰ４８

選抜されたＨＣＶ ＩＲＥＳステムループIIｂ標的化ペプチドの金属キレート（Ｃｕ−ＧＧＨまたはＣｕ−ＧＧｈ）コンジュゲートを調製し、アスコルビン酸／ペルオキシド試薬の存在下でそのＲＮＡモチーフに対する親和性および反応性を評価した。下の表に、Ｃｕ−ＧＧＨまたはＣｕ−ＧＧｈ金属結合ドメインとＣ末端ＲＮＡ結合ドメインとを組み込んだ数種類の金属ペプチド誘導体によるステムループIIｂ ＨＣＶ ＩＲＥＳ ＲＮＡドメイン切断の見かけの活性速度（Ｖ_ｍａｘ）を示す。小文字で書かれたアミノ酸の一文字略記はＤ立体配置の残基を表す。解離定数と結合定数をともに記載する。親和性は１０^４Ｍ^−１〜５×１０^８Ｍ^−１の範囲内にあった。

Ｃｕ−ＧＧＨ金属結合ドメインとＣ末端ＲＮＡ結合ドメインとを組み込んだ数種類の金属ペプチド誘導体によるステムループIＶ ＨＣＶ ＩＲＥＳ ＲＮＡドメイン切断の見かけの活性速度（Ｖ_ｍａｘ）を下の表に示す。解離定数と結合定数をともに記載する。

Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎプロファイルにより、選抜された触媒性金属製剤の反応性を検討した。５’−フルオレセイン標識ＲＮＡの蛍光の変化を時間の関数としてモニターすることにより、反応を追跡した。初速度を基質（ＲＮＡ）濃度の関数として測定し、標準的なＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎプロットを作成した（図２）。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の内部リボソーム進入（ＩＲＥＳ）ＲＮＡのステムループIIｂを選択的に標的とする金属製剤ＧＧＨＹｒＦＫは酵素様の代謝回転を示し、Ｋ_ｍが０．８５μＭ、ｋ_ｃａｔが０．５３分^−１、代謝回転数が３２であり、ｋ_ｃａｔが天然のリボザイムよりわずか４倍だけ低く、ｋ_ｃａｔ／Ｋ_ｍがＲＮアーゼＡの２桁以内である。ＢｉａＣｏｒｅおよび滴定熱量測定の使用は結合実験には問題があるのに対し、金属製剤のＴｙｒ残基による内因性の発光のモニタリングが結合を定量化するのに有効な方法であることがわかった。ＲＮＡとの結合後の３１３ｎｍにおけるチロシン発光の変化をモニターすることにより、ＧＧＨＹｒＦＫとステムループIIｂドメインとの結合のＫ_Ｄが４４±２ｎＭであることが明らかとなった（図７）。

ＨＣＶ ＲＮＡレプリコン抗ウイルス活性アッセイを用いて、ＨＣＶ ＩＲＥＳ ＲＮＡのドメインIIＢ、IIIおよびIＶステムループ構造を標的とする数種類の金属製剤を試験した。さらに、ＰＥＧ２４およびＰＥＧ４８がそれぞれ２４個および４８個のエチレン単位を含むＧＧＨＧＹｒＦＫＧＧＣ−ＰＥＧ２４とＣｕ−ＧＧＨＧＹｒＦＫＧＧＣ−ＰＥＧ４８の２種類のペグ化形態がほぼ同じ溶液反応性および抗ウイルス活性を示した。下の表はそれぞれの候補物質のパラメータに関するものである。

細胞抗ウイルス活性試験の結果が金属製剤による結合および切断反応と一致することが示された。ＨＣＶ ＩＲＥＳを認識するプライマー−プローブの組合せを使用して、５’エキソヌクレアーゼ逆転写酵素の使用によりＨＣＶレプリコンＲＮＡがリアルタイムで定量されるＲＴ−ＰＣＲ増幅実験を用いることにより細胞試験でのＩＲＥＳの切断を確認し、反応の「直線」相において定量化した。金属製剤Ｃｕ−ＧＧＨＹｒＦＫ−ＮＨ_２は最も高いＳＩ_５０（＞１７２）を示し、抗ウイルス活性（ＩＣ_５０）が０．５８μＭであり、細胞毒性閾値が１００μＭを上回っていた。

実施例６：Ｃｕ−ＡＴＣＵＮ金属結合ドメインとＣ末端プロテアーゼ結合ドメインとを組み込んだ金属ペプチドによるメタロプロテイナーゼＥＣＥ−１プロテアーゼに対する見かけの結合親和性および不活性化速度。

実施例７
Ｃｕ−ＧＧＨ金属結合ドメインとＣ末端ＨＣＶプロテアーゼ標的化ペプチドとを組み込んだ数種類の金属ペプチド誘導体によるＨＣＶプロテアーゼに対する見かけの結合親和性および不活性化速度を調製し、種々の酸化還元試薬の存在下でその親和性および反応性を評価した。親和性は１０^４Ｍ^−１〜５×１０^８Ｍ^−１範囲の範囲内にあった。

ＨＣＶプロテアーゼに対して比較的高い親和性結合（Ｋ_Ａが約２×１０^６Ｍ^−１）を示すＣｕ−ＧＧＨＧＤｅＬＩ（Ｃｈａ）Ｃ−ＣＯ_２ ⁻錯体などの比較的高い親和性のリガンドは比較的低い触媒効率を示し、修飾されたプロテアーゼからの触媒の律速的な解離を反映して不活性化の速度定数が比較的小さい。一般的には親和性が減少すると活性が減少するが、同様に他の因子（立体構造、電子、切断されやすい結合に対する金属と会合した活性酸素種の位置）も活性を左右するのに一層重要な役割を果たすようになり、このことは、高い親和性結合それ自体が効率的な反応性を促進するものではないことを強調するものである。

実施例８：炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）致死因子の標的化
数種類の金属ペプチド誘導体および銅結合カプトプリル−シクラムコンジュゲートによる炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）致死因子に対する見かけの結合親和性および不活性化速度を評価した。このほか、銅錯体である銅結合カプトプリル−シクラムコンジュゲート（Ｃｕ−ｃａｐｃｌａｍ）を評価した。１０^４Ｍ^−１〜５×１０^８Ｍ^−１親和性は範囲内にあった。

実施例９：黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ソルターゼＡの標的化
数種類の金属ペプチド誘導体による黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ソルターゼＡに対する見かけの結合親和性および不活性化速度を評価した。親和性は１０^４Ｍ^−１〜５×１０^８Ｍ^−１の範囲内にあった。

当業者は、本発明に固有のものに限らず、諸目的を実行し、ここに挙げた結果および利点を得るのに本発明が十分に適合されることを容易に理解するであろう。本明細書に記載した実施例は、好ましい実施形態の代表的なものであり、例示的なものであるが、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

ここまで、当業者が本発明を実施および利用できるよう本発明の詳細を十分に記載および例示してきたが、本発明の趣旨と範囲から逸脱することなく、様々な代替、修正および改善が容易にわかるはずである。本明細書に記載した実施例は、好ましい実施形態の代表的なものであり、例示的なものであるが、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者にはその修正および他の使用が思いつくであろう。このような修正は本発明の趣旨に包含され、請求項の範囲によって定めされるものである。

当業者には、本発明の範囲と趣旨を逸脱することなく、本明細書に開示される本発明に様々な置換および修正を施し得ることが容易にわかるであろう。

本明細書で言及される特許および刊行物はすべて、本発明に関連する分野の当業者のレベル示すものである。特許および刊行物はすべて、個々の刊行物が具体的かつ個別に参照により組み込まれることを明示した場合と同様に参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書に具体例を挙げて記載した本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の１つないし複数の要素、制限がなくても実施することができる。したがって、例えば、本明細書の事例ごとに、用語「〜を含む」、「〜から実質的になる」および「〜からなる」のうちの１つを他の２つの用語のいずれとも置き換えることができる。ここまで用いてきた用語および表現は、限定ではなく説明のための用語であり、またこのような用語および表現を使用することにより、示され説明されている特徴またはその一部分のいかなる均等物も除外する意図はなく、特許請求される本発明の範囲内で様々な修正が可能であることが認識される。したがって、好ましい実施形態および任意の特徴によって本発明が具体的に開示されているが、本明細書に開示されている概念の修正および変更が当業者により採用され得ること、ならびにこのような修正および変更は添付の特許請求の範囲により定められる本発明の範囲内にあると見なされることを理解するべきである。

他の実施形態が以下の特許請求の範囲内に示されている。

Claims (48)

1. 目的とする生化学的標的を触媒的に不活性化する組成物であって、
   前記生化学的標的と約１０^４Ｍ^−１〜約５×１０^８Ｍ^−１の親和性で結合するリガンド部分と、
   金属結合部分と
   を含み、前記リガンド部分と前記金属結合部分が共有結合している組成物。
2. 前記金属結合部分がそれと結合した金属を含み、前記金属が酸化条件下での結合状態において酸化還元活性をもち１種類以上の活性酸素種を発生させる、請求項１に記載の組成物。
3. 前記金属結合部分がそれと結合した金属を含み、前記金属が加水分解条件下での結合状態においてＬｅｗｉｓ酸触媒としての活性をもつ、請求項１に記載の組成物。
4. 前記リガンド部分が、そのリガンドに対して前記金属結合部分の触媒回転のオフ速度（ｋ_ｃａｔ）と同等のオフ速度（ｋ_ｏｆｆ）を有する、請求項１〜３に記載の組成物。
5. 前記金属結合部分がそれと結合した金属を含み、前記金属が、アルカリ土類金属、不完全なｄ副殻をもつ陽イオンを生じる金属、ランタニド金属およびアクチニド金属からなる群より選択される金属の陽イオンである、請求項１〜４に記載の組成物。
6. 前記遷移金属が、Ｃｕ（II）、Ｃｕ（III）、Ｎｉ（II）、Ｎｉ（III）、Ｚｎ（II）、Ｆｅ（II）、Ｆｅ（III）、Ｃｏ（II）、Ｃｏ（III）、Ｃｒ（II）およびＣｒ（III）ならびに他の２行目および３行目の遷移金属イオンならびにＡｌ（III）などの非遷移金属からなる群より選択される、請求項５に記載の組成物。
7. 前記リガンド部分が、ペプチド骨格、タンパク質骨格またはそのペグ化形態を含む、請求項１に記載の組成物。
8. 前記リガンド部分が、炭水化物骨格またはそのペグ化形態を含む、請求項１に記載の組成物。
9. 前記リガンド部分が、二次代謝産物またはそのペグ化形態を含む、請求項１に記載の組成物。
10. 前記リガンド部分が、核酸骨格またはそのペグ化形態を含む、請求項１に記載の組成物。
11. 前記リガンド部分が、タンパク質核酸骨格またはそのペグ化形態を含む、請求項１に記載の組成物。
12. 前記リガンド部分が、アプタマー、有機小分子、ペプチド模倣物、デンドリマー、抗生物質、二次代謝産物および抗体（もしくは抗体フラグメント）またはそのペグ化形態からなる群より選択される有機分子モチーフを含む、請求項１に記載の組成物。
13. 前記金属結合部分が有機キレート配位子を含む、請求項１に記載の組成物。
14. 前記有機キレート配位子が、前記有機キレート配位子上のアミン官能基およびカルボン酸官能基を用いて金属に配位する、請求項１３に記載の組成物。
15. 前記有機キレート配位子が、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、メルカプトアセチルグリシン（ＭＡＧ３）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（シクラム）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン、シクレン、１，４，７−トリアザシクロノナン（ＴＡＣＮ）およびヒドラジノニコチンアミド（ＨＹＮＩＣ）からなる群より選択される化合物の配位化学を用いて金属に配位する、請求項１３に記載の組成物。
16. 前記金属結合部分がペプチドキレート配位子を含む、請求項１に記載の組成物。
17. 前記ペプチドキレート配位子が、前記ペプチドキレート配位子上の末端アミン側鎖および／またはアミノ酸側鎖ならびに／あるいは脱保護された骨格アミド官能基および／または骨格カルボニル官能基を用いて金属に配位する、請求項１６に記載の組成物。
18. 前記ペプチドキレート配位子がＡＴＣＵＮモチーフである、請求項１６に記載の組成物。
19. 前記生化学的標的が、細菌成分、ウイルス成分、真菌成分、哺乳動物細胞成分、原生動物成分、血清成分、細胞外基質成分、癌細胞成分および病原体由来毒素からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
20. 前記生化学的標的が、細胞受容体、サイトカイン、ホルモン、酵素およびミスフォールドされた天然分子またはポリマー形態の天然分子からなる群より選択される細胞成分または血清成分である、請求項１に記載の組成物。
21. 前記組成物が前記生化学的標的と結合したとき、前記金属結合部分が前記生化学的標的の２０ｎｍ以内、好ましくは２０Å以内にある、請求項１に記載の組成物。
22. 生化学的標的に対するリガンドであり現在用いられている治療用分子または候補となる治療用分子の効果を向上させる方法であって、金属結合ドメインを欠く前記現在用いられている治療用分子または候補となる治療用分子と金属結合部分とを共有結合させることを含む方法。
23. 前記金属結合部分がそれと結合した金属を含み、前記金属が酸化条件下での結合状態において酸化還元活性をもち１種類以上の活性酸素種を生じる、請求項２２に記載の方法。
24. 前記金属結合部分がそれと結合した金属を有し、前記金属が加水分解条件下での結合状態においてＬｅｗｉｓ酸触媒としての活性をもつ、請求項２２に記載の組成物。
25. 前記現在用いられている治療用分子または候補となる治療用分子が、そのリガンドに対して前記金属結合部分の触媒回転のオフ速度（ｋ_ｃａｔ）と同等のオフ速度（ｋ_ｏｆｆ）を有する、請求項２２〜２４に記載の方法。
26. 目的とする生化学的標的を触媒的に不活性化する方法であって、前記生化学的標的と約１０^４Ｍ^−１〜約５×１０^８Ｍ^−１の親和性で結合するリガンド部分を含む方法。
27. 前記金属結合部分がそれと結合した金属を有し、前記金属が加水分解条件下での結合状態においてＬｅｗｉｓ酸触媒としての活性をもつ、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
28. 前記金属結合部分がそれと結合した金属を含み、前記金属が、アルカリ土類金属、不完全なｄ副殻をもつ陽イオンを生じる金属およびアクチニド金属からなる群より選択される金属の陽イオンである、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の方法。
29. 前記遷移金属が、Ｃｕ（II）、Ｃｕ（III）、Ｎｉ（II）、Ｎｉ（III）、Ｚｎ（II）、Ｆｅ（II）、Ｆｅ（III）、Ｃｏ（II）、Ｃｏ（III）、Ｃｒ（II）およびＣｒ（III）ならびに他の２行目および３行目の遷移金属イオンならびにＡｌ（III）などの非遷移金属からなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
30. 前記リガンド部分が、ペプチド骨格、タンパク質骨格またはそのペグ化形態を含む、請求項２２に記載の方法。
31. 前記リガンド部分が、炭水化物骨格またはそのペグ化形態を含む、請求項２２に記載の方法。
32. 前記リガンド部分が、二次代謝産物またはそのペグ化形態を含む、請求項２２に記載の方法。
33. 前記リガンド部分が、核酸骨格またはそのペグ化形態を含む、請求項２２に記載の方法。
34. 前記リガンド部分が、タンパク質核酸骨格またはそのペグ化形態を含む、請求項２２に記載の方法。
35. 前記リガンド部分が、アプタマー、有機小分子、ペプチド模倣物、デンドリマー、抗生物質、二次代謝産物および抗体またはそのペグ化形態からなる群より選択される有機分子モチーフを含む、請求項２２に記載の方法。
36. 前記金属結合部分が有機キレート配位子を含む、請求項２２に記載の方法。
37. 前記有機キレート配位子が、前記有機キレート配位子上のアミン官能基およびカルボン酸官能基を用いて金属に配位する、請求項３６に記載の方法。
38. 前記有機キレート配位子が、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、メルカプトアセチルグリシン（ＭＡＧ３）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（シクラム）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン、シクレン、１，４，７−トリアザシクロノナン（ＴＡＣＮ）およびヒドラジノニコチンアミド（ＨＹＮＩＣ）からなる群より選択される化合物の配位化学を用いて金属に配位する、請求項３６に記載の方法。
39. 前記金属結合部分がペプチドキレート配位子を含む、請求項２２に記載の方法。
40. 前記ペプチドキレート配位子が、前記ペプチドキレート配位子上の末端アミン側鎖および／またはアミノ酸側鎖ならびに／あるいは脱保護された骨格アミド官能基および／または骨格カルボニル官能基を用いて金属に配位する、請求項３９に記載の方法。
41. 前記ペプチドキレート配位子がＡＴＣＵＮモチーフである、請求項３９に記載の方法。
42. 前記生化学的標的が、細菌成分、ウイルス成分、真菌成分、ヒト細胞成分、原生動物成分、血清成分、細胞外基質成分、癌細胞成分および病原体由来毒素からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
43. 前記生化学的標的が、細胞受容体、サイトカイン、ホルモン、酵素およびミスフォールドされた天然分子またはポリマー形態の天然分子からなる群より選択される細胞成分または血清成分である、請求項２２に記載の方法。
44. 前記組成物が前記生化学的標的と結合したとき、前記金属結合部分が前記生化学的標的の２０ｎｍ以内、好ましくは２０Å以内にある、請求項２２に記載の方法。
45. 生化学的標的を治療的に不活性化する方法であって、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組成物が前記生化学的標的と結合し、前記生化学的標的の近くで活性酸素種を発生する条件下で、前記組成物をそれを必要とする対象に投与し、発生した活性酸素種の集中により前記生化学的標的の立体配座および／または機能を変化させて治療効果をもたらすことを含む方法。
46. 生化学的標的を治療的に不活性化する方法であって、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組成物が加水分解条件下での結合状態において結合し、Ｌｅｗｉｓ酸触媒としての活性をもつ条件下で、前記組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む方法。
47. 生化学的標的を不活性化することにより滅菌する方法であって、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組成物が前記生化学的標的と結合し、前記生化学的標的の近くで活性酸素種を発生する条件下で、前記組成物をそれを必要とする対象に投与し、発生した活性酸素種の集中により前記生化学的標的の立体配座および／または機能を変化させて治療効果をもたらすことを含む方法。
48. 生化学的標的を不活性化することにより滅菌する方法であって、本発明による組成物が前記生化学的標的と結合し、前記生化学的標的の近くでＬｅｗｉｓ酸触媒としての活性をもつ条件下で、前記組成物をそれを必要とする対象に投与し、発生した反応種の集中により前記生化学的標的の立体配座および／または機能を変化させて治療効果をもたらすことを含む方法。
    

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