KR100522361B1 - G-쿼테트를 사용한 핵산 검출 방법 - Google Patents

G-쿼테트를 사용한 핵산 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 선택된 핵산 서열을 검출하기 위하여 형광 검정법(fluorescence assay) 에 유용한 것으로 밝혀진 G-쿼테트 구조(G-quartet structure) 를 형성하는 올리고누클레오티드에 관한다. 상기 올리고누클레오티드중 한쪽 말단을 공여체 형광단 (fluorophore) 로 라벨링시키고 다른 한쪽의 말단은 수용체 염료로 라벨링 시키면, G- 퀴테트 구조인 상기 분자는 접혀져서 공여체 - 수용체 쌍은 매우 가깝게 접근하게 되며, 상기 2 개의 라벨 사이의 반응으로 공여체의 형광도를 소실시키거나 또는 상기 2 개의 염료가 가까이 접근하여 반응한 결과 기타 형광도에 변화를 가져오게 된다. 상기 G-쿼테트 구조는 이의 상보적인 서열에 잡종화되면 펴지게 되어, 상기 2 개의 염료 라벨 사이의 거리는 증가한다. 이로써 공여체의 발광 소실은 감소하게 되거나 또는 다른 근접성과 관련된 형광도 변수상에 변화가 발생한다. 선택된 핵산 서열 존재에 대한 지표로서 공여체 형광도 강도의 증가 또는 다른 형광도 변수의 변화가 관찰될 수 있다. 이와는 달리, 어떤 경우에 있어서는 상기 수용체가 또한 형광단일 경우 선택된 핵산 서열의 존부에 대한 지표로서 수용체 형광도의 감소가 관찰될 수 있다.

Description

G-쿼테트 (G-quartet) 를 사용한 핵산 검출 방법.
본 발명은 핵산 검출 방법 및 물질, 구체적으로 2 개의 염료 라벨 사이의 거리가 변함에 따른 측정 가능한 변화를 사용하는 핵산 검출 방법 및 물질에 관한다.
올리고누클레오티드 탐침의 서열 - 특이적 잡종화는 오래전부터 선택된 누클레오티드 서열을 검출 및 동정하는 수단으로서 사용되어 왔으며, 이러한 탐침을 형광성 라벨로 라벨링시키는 방법은 탐침 잡종화의 검출을 촉진시키는 비교적 민감하며, 비방사성인 수단이 되어 왔다. 최근들어 개발된 검출 방법은 형광도 강도를 직접 검출하기 보다는 탐침 잡종화를 검출하기 위하여 형광 에너지 전이 (FET) 과정을 이용하는 방법이다. 형광 에너지 전이는 하나 (수용체) 의 흡수 스펙트럼이 다른 하나 (공여체)의 방출 스펙트럼에 겹쳐질 때 공여체 형광단 및 수용체 염료 (형광단일 수 있거나 또는 형광단일 수 없는) 사이에서 발생한다. 상기 공여체 형광단의 여기 - 상태 에너지는 이중극자 - 유도성 이중극자 반응에 의한 공명 현상에 의하여 이웃하는 수용체에 전아된다. 그 결과 공여체의 형광도는 소실된다. 어떠한 경우, 상기 수용체가 또한 형광단일 경우, 형광도의 강도는 증가될 수 있다. 에너지 전이의 효율은 공여체 및 수용체 사이의 거리와 밀접하게 관련되어 있으며, 상기 관계들을 예견할 수 있는 등식이 Forster 에 의하여 발견되었다. (1948, Ann Phys. 2:55 - 75)
에너지 전이 효율이 50 % 일때의 공여체 염료 및 수용체 염료 사이의 거리를 Forster 거리 (R0)라고 한다. 다른 형광성 또한 공여체 및 수용체의 근접도, 예를 들어 공여체 및 / 또는 수용체의 형광도 수명, 형광 극성 및 형광 비등방성에 의존할 수 있다.
형광성을 변화시키기 위하여 근접하는 상기 2 개의 염료의 반응에 의한 에너지 전이 및 다른 메카니즘은 누틀레오티드 서열을 동정하거나 검출하는 매력적인 수단으로서, 이러한 검정법은 균일한 방식으로 수행될 수 있다. 일반적으로 불균일 검정법은 잡종화된 라벨을 잡종화되지 않은 라벨로부터 분리시키는 단계가 추가로 요구되므로, 균일한 검정 방법은 단일 형광단 라벨의 형광도를 검출함에 의한 종래의 탐침 잡종화 검정법보다 간단하다. 통상적으로, FET 및 관련 방법은 2 개의 상보적 올리고누클레오티드가 잡종화되어 염료 라벨 모두 또는 그중 하나가 합쳐질 때 염료 라벨 모두 또는 하나의 형광도의 변화를 관찰하는 것에 의한다. 상기 방법에서, 형광성 변화는 에너지 전이량의 변화 정도 또는 형광도 소실량 변화로써 측정될 수 있다. 이러한 방법에서, 잡종화되지 않은 올리고누클레오티드 또는 잡종화된 올리고누클레오티드를 분리시키지 않고 관심 있는 누클레오티드 서열을 검출할 수 있다. 상기 잡종화는 2 개의 분리된 상보적 올리고누클레오티드 사이에서 발생할 수 있는데, 하나는 공여체 형광단으로 라벨링될 수 있으며 다른 하나는 수용체로 라벨링될 수 있다. 1 본쇄 올리고누클레오티드에 비하여 2 본쇄 형태에서는 공여체 형광도는 감소되며 (소실도는 증가) / 또는 에너지 전이도는 증가한다. FET 잡종화 검정법에 대한 몇가지 방법은 Nonisotopic DNA Probe Techniques (1992, Academic Press, Inc., pgs. 311 - 352) 에 논평되어 있다. 이와는 달리, 공여체 및 수용체는 단일 올리고누클레오티드에 연결되었으므로, 올리고누클레오티드가 잡종화되지 않았을 때와 이의 상보적 서열에 잡종화되었을 때의 모든 경우 또는 하나의 경우, 형광성의 차이는 검출 가능하다. 상기 방법에서, 올리고누클레오티드가 잡종화되면 통상적으로 공여체 형광도는 증가하며 에너지 전이도 및 소실도는 감소한다. 예를 들어, 각각의 말단에 라벨링된 자가 - 상보적 올리고누클레오티드 (self - complmentary oligonucleotide) 는 에너지 전이 및 소실이 발생하는 경우 2 개의 형광단 (즉 5' 말단 및 3' 말단) 을 근접시키는 머리핀구조를 형성한다. 제 2 올리고누클레오티드상의 상보성 서열에 자가 - 상보적 올리고누클레오티드가 잡종화되면 상기 머리핀 구조는 파괴되며 상기 2 개의 염료 사이의 거리는 증가하게 되므로, 소실도를 감소시킬 수 있다. 머리핀 구조의 불리한 점은 그 구조가 매우 안정하여 종종 소실된 형태, 잡종화된 형태로의 변경이 느리게 서서히 진행되므로, 일반적으로 수행도가 좋지 못하다는 점이다. "이중 머리핀 (double hairpin)" 형성 과정은 B. Bagwell 와 그의 동료에 의하여 기술되었다. [1994. Nucl. Acids Res. 22:2424 - 2425] Kramer 와 Tyagi 는 상기 머리핀의 팔부위 사이의 루프에서 검출 서열과 머리핀 구조를 형성하는 것에 대하여 기술하였다. [1996, Nature 14 : 303 - 308]
선행 기술에 의한 방법은 에너지 전이 그 자체에 대한 효능이 존재하지 않기 때문에, 종종 의미가 큰 형광도 변화를 검출하기 위한 스펙트럼 해상도를 충분히 제공하기 어렵다. 형광도 소실을 관찰하는 많은 방법들중, 잡종화가 적게 이루어지면 기저치 (background) 의 수준이 높을 경우 검출되는 형광도는 조금밖에 감소되지 않는다. 상기 방법은 또한 검출에 대한 민감성이 존재하지 않는다.
앱타머 (aptamer) 란 특이 분자 타겟에 결합하는 DNA 또는 RNA 이다. 랜덤하게 생성된 다량의 올리고누클레오티드는 공지된 시험관내 선별 및 증폭 과정에 의하여 앱타머에서 증폭될 수 있다. 특히 관심 있는 것은 트롬빈에 결합된 1 본쇄 DNA 앱타머이다. [L.C. Bock 와 그의 동료, 1992, Nature 355 : 564 - 566] 상기 트롬빈 결합 앱타머는 보존된 (conserved) 하기 컨센서스 서열 (서열 1)을 포함하며 트롬빈 - 촉매화된 피브린 - 덩어리의 형성을 억제한다고 밝혀졌다.
[서열 1]
GGNTGGN2-5GGNTGG
상기 분자의 구조를 분석한 결과, 2 개의 구아노신 염기쌍 4 분자체를 포함하는 대칭적 구조는 3 개의 루프와 연결되어 있다고 밝혀졌다. [1993, K. Y. Wang 와 그의 동료, Biochemistry 32 : 1899 - 1904 ; 1993. R. F. Macaya 와 그의 동료, PNAS 90 : 3745 - 3749 ; 1994. P. Schultz 와 그의 동료, J. Mol. Biol 235 : 1532 - 1547 ; 1996. J. A. Kelly 와 그의 동료 J. Mol. Biol. 256 : 417 - 422] 보통 이러한 특징적인 구조를 "G-쿼테트 (G-quartet)" 또는 "G-퀀드루플렉스(G-quandruplex)" 라고 한다. E. Dias 와 그의 동료는 G 쌍 사이의 올리고누클레오티드 길이가 증가하는 경우 유지되는 G-쿼테트 구조와 유사한 서열에 관하여 보고하고 있다, [1994, J. Am. Chem. Soc. 116 : 4479 - 4480]
형광단 (fluorophore) 이란 형광성 입자에서 얻을 수 있는 염료 또는 화학적 일부분 (chemical moeity) 을 의미한다. 이는 화학적 처리에 따른 형광성 염료를 포함하며, 빛 또는 생물학적 시스템내에서 여기된다.
공여체 또는 공여체 형광단은 제 2 염료 또는 화학적 일부분의 흡수 스펙트럼과 겹쳐지는 형광 방출 스펙트럼을 갖는 형광단을 의미한다.
수용체 또는 수용체 염료란 공여체 형광단에 의하여 방사되는 빛을 흡수하는 염료 또는 기타 화학적 일부분을 의미한다.
G-쿼테트 구준를 형성하는 올리고누클레오티드는 G-쿼테트 올리고누클레오티드에 연결된 2 개의 염료 라벨 사이의 거리가 변함에 따라 형광도가 측정 가능하도록 변화된다는 사실을 사용하여 누클레오티드 서열을 검출하거나 또는 동정하는데에 유용하다는 것이 밝혀졌다. 상기 G-쿼테트가 공여체 형광단으로 라벨링되고 다른쪽 말단은 적당한 수용체염료로 라벨링된 경우, 상기 G-쿼테트의 특징적인 구조로 인하여 상기 공여체 - 수용체 쌍은 접근하게 되며, 그 결과 상기 라벨 사이의 반응으로 공여체 형광도는 소실된다. 상보적 올리고누클레오티드에 잡종화됨에 따라, 상기 G-쿼테트 구조는 펴지거나 또는 선형화된다. 이로써 상기 2 개의 염료 라벨 사이의 거리는 증가하며 그 결과 선별된 핵산 서열의 존부에 대한 지표로서 관찰될 수 있는 이들의 반응성 및 형광도 소실 정도는 감소 (즉, 공여체 형광도는 증가)하게 된다. 상기 수용체 염료가 또한 형광단일 경우, G-쿼테트가 선형화되어 상기 공여체 및 수용체 사이의 거리가 증가하면 어떠한 경우에는 형광도가 감소될 수 있다. 그러한 경우, 상기 수용체 형광도 감소는 또한 선별된 핵산 서열 존부에 대한 지표로서 측정될 수 있다.
한쪽 말단에는 공여체 형광단으로 라벨링시키고 다른쪽 말단에는 수용체 염료로 라벨링시키면, G-쿼테트 올리고누클레오티드 구조는 형광도 소실이 의외로 효율적인 검출 분자 또는 라벨을 제공한다. 더욱이, 보통의 실험실 조건하에서는 안정성이 매우 높음에도 불구하고 상기 G-쿼테트 구조는 상보성 서열이 존재하는 경우 급속하게 파괴된다. 상보성 서열이 존재하지 않는 경우 상기 구조는 파괴되거나 펴지지 않으며 형광도는 효과적으로 소실된다는 점에서, 펴짐 (unfolding) 또는 선형화 (linearization) 로 인하여 G-쿼테트 구조가 파괴되는 현상은 G-쿼테트 올리고누클레오티드가 이의 상보성 서열에 잡종화되었다는 것을 나타내는 매우 특이적인 지표가 된다.
본 발명의 하나의 구체예에 따른 G-쿼테트 올리고누클레오티드는하기 서열 2 의 서열을 갖는다.
[서열 2]
GGNXGGNYGGNZGG
상기 서열중 X, Y 및 Z 는 통상적으로 약 2 이상이며, 바람직하게는 약 2 - 10이며, 하기된 바와 같이, 상기 단편은 접혀진 G-쿼테트 구조의 5' 말단 및 3' 말단의 근접도에 영향을 끼치지 않으므로, 상기 단편은 원하는 경우 더욱 길 수 있다. 상기 G-쿼테트 구조는 상기 올리고누클레오티드의 5' 말단을 3' 말단과 가깝게 접근시키며, 다수의 공여체 및 수용체 염료쌍에서 G-쿼테트내 이들 사이의 거리는 Forster 거리 미만이거나 또는 그렇지 않으면 충분히 가까워서 한쪽 또는 양쪽 모두의 형광성 강도에 영향을 미치는 염료간 반응을 진행시킨다. 따라서 G-쿼테트 구조의 올리고누클레오티드 5' 말단 및 3' 말단의 상대적 위치는 형광도 소실 검정법에서 검출 분자 또는 라벨로서 G-쿼테트 올리고누클레오티드를 사용하는 방법에 있어서 필수적인 양상이며, 이러한 접근도는 올리고누클레오티드 서열에서 불변인 4 쌍의 G 와 관련되어 있다. 가변성 서열 (즉, NX, NY, NZ) 의 부위들은 본 발명에서는 중요하지 않으므로 본 발명의 검정법에서 상기 분자들의 유용성을 제공하는 특징적인 G-쿼테트 구조를 파괴시키지 않고 길이 및 서열을 다양하게 만들 수 있다. 일반적으로, 가변성 N 서열들은 자가 - 상보성 이어서는 안되며 상기 분자내에서 G-쿼테트 구조를 변경시키는 G 잔기들도 포함하여서는 안된다. 길이가 15 - 20 누클레오티드인, 본 발명에 따른 대표적인 G-쿼테트 올리고누클레오티드는 실시예에 나타내었으나, 서열 2 의 일반식과 부합하는 혹종의 길이를 가진 G-쿼테트 올리고누클레오티드 또한 적당하다. 상기 G-쿼테트 올리고누클레오티드의 길이는 통상적으로 약 14 - 30 누클레오티드이다.
각각의 말단을 라벨링시킨 G-쿼테트 구조의 펴진 상태, 선형화된 또는 파괴된 상태를 관찰하는 것은 선행 기술 (예를 들어, 자가-상보성 서열) 과 유사하게 라벨링시킨 올리고누클레오티드의 선형화된 상태를 관찰하는 것에 대하여 몇가지 이점이 존재한다. 첫째, 형광도가 더욱 급속하게 변화할수록 검정은 보다 신속하게 수행되는 것으로 보아, G-쿼테트가 자가 - 상보성이 아니므로 상보성 올리고누클레오티드가 존재하면 더욱 용이하게 펴진다. 뿐만아니라, 상보성 서열의 존재하 다수의 G-쿼테트가 단일 올리고누클레오티드에 결합하여 형광 시그널을 증폭시켜 형광도 세기의 변화를 더욱 촉진할 수 있다. 이와 같은 중합체성 G-쿼테트 분자들에서는 수용체와 공여체 형광단의 비율은 증가하므로 공여체의 형광도 소실을 개선시켜, 상보성 서열의 존재하 형광도 강도의 변화량을 더욱 증가시킨다.
업계에 공지된 다수의 공여체 / 수용체 염료 쌍은 본 발명에서 유용하다. 이와 같은 것들에는, 예를 들어, 플루오세인 이소티오시아네이트 (FITC) / 테트라메틸로드아민 이소티오시아네이트 (TRITC), FITC / Texas RedTM (Molecular Probes), FITC / n-하이드록시숙신이미딜 1-피렌부티레이트 (PYB), FITC / 에오신 이소티오시아네이트 (EITC), N-하이드록시숙신이미딜 1- 피렌설포네이트 (PYS) / FITC, FITC / Rhodamine X, FITC / 테트라메틸로드아민 (TAMRA) 등을 포함한다. 특정 공여체 / 수용체 쌍을 선택하는 것은 중요한 문제가 아니다. 공여체 형광단의 방출 파장이 수용체의 흡수 파장에 겹쳐지는 것만으로도 충분할 것인데, 즉 상기 공여체 및 수용체 스펙트럼이 겹쳐져서 형광도를 소실시키는 것만으로도 충분하다 할 것이다. P-(디메틸 아미노페닐아조) 벤조산 (DABCYL) 은 인접한 형광단의 형광도를 효과적으로 소실시키는 비형광성 수용체 염료로서, 예를 들어 플루오세인 또는 5-(2'-아미노에틸) 아미노나프탈레이트(EDANS) 이다. 공여체 또는 수용체는 G-쿼테트 올리고누클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단중의 어느 한쪽에 존재할 수 있다. 혹종의 공여체 / 수용체 쌍은 상기 및 하기 실시예에서 구체화되었으나, 기타사항은 업계의 숙련자들에 의하여 명확할 것이며 뿐만아니라 본 발명에 유용하다.
5'-말단 라벨링 및 3'-말단 라벨링 방법은 업계에 공지된 방법으로서 상기 공여체 및 수용체 염료들을 G-쿼테트 올리고누클레오티드의 각각의 말단에 연결시키는데에 사용될 수 있다. 예를 들어, 3'-말단 라벨링 방법은 a) 3'-말단 리보누클레오티드를 산화시킨후 아민 - 함유 라벨과 반응 시키는 단계, b) 말단 데옥시누클레오티드 전이 효소를 사용하여 3'-지방족 아민 - 함유 누클레오티드를 효소로써 첨가시키는 단계, c) 3'-리보누클레오티드를 산화시킨후 1,6-헥산디아민과 반응시켜 아민 - 반응성 라벨과 반응 가능한 3'-말단 지방족 아민을 제조하는 단계를 포함한다. 5' - 말단 라벨링 방법은 a) 5' - to - 5' - 커플링된 리보누클레오티드를 산화시킨후 아민 - 함유 라벨과 반응시키는 단계, b) 에틸렌디아민과 5'- 인산화된 폴리누클레오티드를 축합시킨후 아민 - 반응성 라벨과 반응시키는 단계, 및 c) 고체상 DNA 합성시 아미노헥실 포스파이트 시약을 사용하여 지방족 아민 치환체를 도입시킨후 아민 - 반응성 라벨과 반응시키는 단계를 포함한다. 라벨들은 또한 특정 지방족 아민 - 함유 누클레오티드 포스포아미디트 시약을 사용하여 특정의 내부 또는 말단 지역에서 합성 DNA 올리고누클레오티드에 연결될 수 있다. 선택된 라벨을 상기 G-쿼테트 올리고누클레오티드에 연결시키는 적당한 방법을 선택한후 상기 연결 반응을 수행시키는 것은 업계에서는 일상적인 방식이다. 뿐만아니라, 본원의 G-쿼테트 구조의 5' 말단 및 3' 말단에 존재하는 라벨은 말단과 가까운, 즉 누클레오티드 말단과는 연결되지 않았으나 상기 G-쿼테트 구조에 형광도가 소실되는 말단에 충분히 가까운 라벨을 포함하는 경향이 있다. 상기 공여체 및 수용체는 통상적으로 말단 누클레오티드의 2 - 4 누클레오티드 정도의 범위안에서 연결된다. G-쿼테트 올리고누클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단 근처에서 공여체 / 수용체 쌍이 연결되었을 경우 접혀진 G- 쿼테트 구조의 공여체 형광도가 소실되었는지를 측정하는데에는 일상적인 테스트 방법만이 필요하다. 뿐만아니라, 상기 G-쿼테트 서열이 검출 분자 또는 라벨로서 사용되는 (실시예 3 과 같이) 더욱 큰 올리고누클레오티드 탐침에 포함되었거나 또는 이것과 연결되었을 경우, 상기 공여체 또는 수용체, 또는 이들 모두는 G-쿼테트 구조를 형성하는 서열의 말단 근처 또는 말단에 존재하는 탐침내 내부 누클레오티드에 연결될 수 있다. 상기 분자들은 G-쿼테트 구조를 형성하는 서열 내부의 누클레오티드에 연결될 수 있거나 또는 상기 올리고누클레오티드 탐침 부위 (즉, G-쿼테트 구조의 외부) 의 G-쿼테트 서열의 말단 또는 그 근처에 존재하는 누클레오티드에 연결될 수 있다. 상기와 같은 연결 반응은 G-쿼테트 서열 또는 구조의 말단 또는 그 근처에서 발생할 것으로 사료된다. G-쿼테트 말단 또는 근처의 어느 누클레오티드가 공여체 형광단 및 수용체 염료를 연결시켜 공여체의 형광도를 소실시키는데에 적당한지 여부는 일상적인 테스트 방법을 사용하여 결정할 수 있다.
본 발명에 따라 라벨링된 G-쿼테트 올리고누클레오티드는 선택된 핵산 서열을 검출하거나 또는 동정하는 검정법에 많이 사용될 수 있다. 이러한 검정법에서 가장 중요 한 특징은 G-쿼테트 구조가 선택된 핵산의 존부에 달려있는 방식으로 펴지거나 선형화된다는 것이다. 상기 방법을 수행한 결과, 소실도가 감소함에 따라 공여체 형광도가 증가되었음을 확인할 수 있었다. 상기 검정법은 선택된 핵산 서열의 존부에 관한 지표로서 검출되기에 충분한 양만큼의 공여체 형광도 강도의 변화에만 관련되어 있으므로, 공여체 형광도를 완전히 소실시킨후 G-쿼테트를 파괴시킬 필요는 없다. 상기 G-쿼테트 구조를 서열 - 특이적으로 파괴시키는 혹종의 수단이 본 발명에 유용하므로, 혹종의 구체예가 제공될 수 있다. 상기 G-쿼테트 서열의 상보성 서열에 상기 G-쿼테트를 잡종화시켜 피거나 (unfolding) 또는 선형화시켜 상기 구조를 파괴시킬 수 있다. 상기 G-쿼테트에 상보적인 서열 자체가 검출될 서열인 경우, 또는 상기 선택된 핵산 서열이 상기 G-쿼테트 상보적 서열을 포함하는 경우, 라벨링된 G-쿼테트가 잡종화됨에 따라 공여체의 형광도는 증가되므로 선택된 핵산 서열을 직접 검출하는데에 사용될 수 있다. 그러나, 만일 검출될 서열이 상기 G- 쿼테트와 상보적인 서열을 포함하지 않으면, 다른 방법을 사용하여 서열 - 특이적 방식으로 상기 G-쿼테트를 펴야한다. 예를 들어, 라벨링된 G-쿼테트는 검출될 또는 동정될 핵산 서열의 3' 말단에 잡종화되어 G- 쿼테트가 5' 돌출부 (5' overhang) 를 형성하도록 하는 검출용 탐침의 5'-말단에 연결될 수 있다. 잡종화됨에 따라, 선택된 핵산 서열의 잡종화된 단편을 프라이밍 위치로서 사용하는 중합 효소를 사용하여 상기 선택된 핵산 서열 및 검출용 탐침은 2 본쇄로 된다. 상기 선택된 핵산 서열을 주형으로서 G-쿼테트를 사용하는 검출용 탐침으로 연장시켰더니 상기 상보적 서열이 검출용 탐침 단편을 통하여 합성됨에 따라 상기 G-쿼테트 구조는 펴져서 선형화된다. 공여체 형광도가 증가하면 검출용 탐침과 잡종화되는 서열이 존재한다는 것을 말해준다. 이와는 달리, 유럽 특허 출원 제 0 678 582 호에 기술된 바와 같이 상기 라벨링된 G-쿼테트 올리고누클레오티드는 시그널 프라이머의 5' 말단과 연결될 수 있다. 상기 시그널 프라이머가 선택된 누클레오티드 서열에 잡종화된 이후, 연장 및 치환 결과, 5' 말단에 G-쿼테트를 포함하는 1 본쇄 제 2 증폭 생성물이 생성된다. 상기 제 2 증폭 생성물은 제 2 증폭 프라이머에 잡종화되며 상기 잡종화된 제 2 증폭 프라이머는 중합 효소에 의하여 연장되어 G-쿼테트를 포함하는, 제 2 증폭 생성물을 2 본쇄로 만든다. 즉, 제 2 증폭 생성물의 상보성 서열이 상기 연결된 G-쿼테트 구조 부위를 통과하여 합성되는 경우, 상기 G-쿼테트는 펴지게 되므로 상기 2 개의 라벨 사이의 거리는 증가하게 된다. 상기 공여체 형광단의 형광도 세기가 증가되었다는 사실은 2 본쇄 제 2 증폭 생성물 및 선택된 핵산 서열 (즉, 증폭된 타겟 서열) 이 존재한다는 증거가 된다. 물론, 본 발명중 혹종의 검정법에서는 이와 같은 방식으로 상기 수용체가 만일 상기 공여체로부터 멀어지는 경우 반응하는 형광단인 경우, 공여체 형광도는 증가하지 않고 그 대신, 선택된 핵산 서열이 존재한다는 것으로써 상기 수용체 형광단의 형광도가 감소되었음을 나타낸다.
뿐만 아니라, 본 발명에 의한 G-쿼테트 구조가 파괴되어 펴진 상태는 공여체 및 수용체 근접도가 변함에 따라 증가 또는 감소되는 형광성과 관련된 다른 방법에 의하여 검출되거나 또는 관찰될 수 있다. 예를 들어, 상기 공여체의 소실도가 감소하면 이의 형광도 세기는 감소될뿐만 아니라 이의 형광도 수명도 감소하게 될 것이다. (즉, 방출 및 여기 상태간의 시간) 펴진 상태의 G-쿼테트에서 공여체의 형광도 세기가 증가하면, 공여체 소실도가 감소된 것을 검출하는 것과는 달리 공여체 형광도 수명은 또한 증가하게 되어 검출할 수 있다. 이와 유사하게, 상기 2 개의 염료 사이의 거리가 변화함에 따라 형광 편광도는 변화될 수 있다. G-쿼테트 올리고누클레오티드가 1 본쇄 형태에서 2 본쇄 형태로 변경됨에 따라 분자 부피가 변화하면 형광 편광도도 변하게 되지만, 형광 편광도는 또한 상기 2 개의 염료 사이의 거리 변화에 영향 받을 것이다. 따라서 형광 편광도 또는 비등방성이 변하면 G-쿼테트의 파괴를 관찰하거나 또는 검출하는 대응책으로서 유용하다.
실시예 1.
15-머 (서열 3 ; GGTTGGTGTGGTTGG) 및 20-머 (서열 4 ; GGTTTTGGTTTTGGTTTTGG), G-쿼테트 올리고누클레오티드 및 이들의 상보성 서열을 종래의 방법으로 합성하였다. 상기 15-머 및 상기 20-머에 대한 환형 이색성 스펙트럼은 매우 유사하였으며 G-쿼테트 구조가 아니라고 가정했을때 이와 상당한 길이의 2 본쇄 또는 1 본쇄 DNA 와 상당히 상이하였다. [L. B. McGown 와 그의 동료, Nov. 1, 1995, Anal. Chem. pgs. 663A - 668A] 이로써 두가지 경우 모두의 올리고누클레오티드가 효과적으로 G-쿼테트 형태로 접혔음을 확증하였다. 상기 올리고누클레오티드의 5' 말단은 플루오세인 (공여체) 으로 라벨링되었으며 3' 말단은 테트라메틸로드아민 (TAMRA) 또는 로드아민 - X (ROX) 으로 라벨링되었다. 5' 말단 또는 3' 말단중 어느 한쪽에만 라벨링시킨 G-쿼테트 올리고누클레오티드는 소실되지 않은 대조구 표본으로 사용되었다. 올리고누클레오티드 합성 과정중 6-FAM 시약 (ABI) 을 사용하여 5' 플루오세인을 부착시켰다. 3' 말단에는, CPG 칼럼 재료 [Glen Research, Stering, VA.] 상에서 고정화된 플루오세인 유도체를 사용하여 플루오세인을 연결시켰다. 아미노알킬 링커에 대한 NHS 에스테르를 매개로 하여 유사한 CPG 기술로써 올리고누클레오티드의 3' 말단에 플루오세인 이외의 염료를 연결시켰다. 크기별 배제성 크로마토그래피 (size exclusion chromatography) (NAP-5 칼럼, Pharmacia) 에서 반응하지 않은 염료를 제거하고 OPC 카트리지 (ABI) 를 통하여 용리시켜 라벨링된 올리고누클레오티드를 정제하였다. 상기 라벨링된 올리고누클레오티드의 농도는 260 nm 에서의 계산된 흡광도값을 동일한 파장에서의 염료의 흡광도값으로 보정하여 얻었다. 형광단 여기 및 방출용 필터가 장착된 SLM-Aminco 8100 리서치 등급 형광계 또는 FPM-1 형광계 (Jolley Consulting) 를 사용하여 형광 스펙트럼을 분석허였다.
염료 라벨링된 올리고누클레오티드 (2 - 10 nM) 를 pH 7.5 및 주위온도 (약 24 - 26 ℃)에서 20 mM TRIS 아세테이트, 140mM NaCl, 5mM KCl, 1mM CaCl2 및 1mM MgCl2 를 포함하는 완충액에 가하였다. 상보성 서열을 1.5배 이상의 몰 과량에 가한후 형광 스펙트럼이 더 이상 변하지 않을 때에 최종적으로 측정하였다. 이는 통상적으로 30 분 미만이 소모된다. 485 nm 또는 488 nm 에서 여기된 플루오세인의 방출 파장(약 520 nm)에서 공여체 세기의 변화를 측정하였다. 5' 말단만이 플루오세인으로 라벨링된 유사한 서열과 비교하여 소실 퍼센트를 측정하였다. 결과를 하기 표에 나타내었다.
Figure pat00002
잡종화됨에 따라, 모든 공여체 / 수용체 염료에서 관찰되는 플루오세인 형광도 세기 및 잡종화됨에 따른 2 개의 올리고누클레오티드 증가 정도는 용이하게 검출되었다. 15-머상의 플루오세인 공여체 및 로드아민-X 수용체는 가장 많이 증가 (9 - 배) 하였으나, 예상했던 수용체(ROX) 방출 정도는 예상보다 더욱 작았다. (2 - 배 미만) 이는 Forster 에너지 전이보다는 혹종의 메카니즘에 의하여 형광도가 소실될 수 있다는 것을 시사해 준다. 그러나, 변화가 충분한 경우, 수용체 방출이 감소된 정도 또한 잡종화됨에 따라 G-쿼테트가 파괴되는 것을 관찰하는 데에 사용될 수 있었다. 공여체 파장에서 여기되는 것과 같이, 이는 Stokes 이동에 매우 효과적이었으나 방출은 수용체 파장에서 관찰되었다. 이러한 형태는 또한 샘플 기저치 (sample background) 를 조금 방해하였다.
서열 3 (5' 플우로세인, 3' TAMRA) 이 잡종화됨에 다른 형광 편광도의 변화는 또한 유사한 실험 조건하에서 관찰될 수 있었다. 475nm 에서 공여체가 여기되었으며 585 nm 에서 방출되었으므로 상기 상보성 서열들이 잡종화됨에 따라서 형광 편광도는 62 mP 에서 138 mP 로 증가하였다.
실시예 2.
5' 말단은 플루오세인으로 라벨링시키고 3' 말단은 ROX 로 라벨링시킨 서열 3 에 15-머의 상보성 올리고누클레오티드 양을 증가시켜 가하였다는 점에서, 실시예 1 의 실험과 유사하였다. 서열 3 의 0.5 몰당량, 1.0 몰당량, 10 몰당량 및 30 몰당량에 상보성 서열을 가하였다. 상보성 올리고누클레오티드가 존재하지 않는 경우는 플루오세인 판독의 기준선을 제공하였다. 상보성 올리고누클레오티드 를 가한루 상기 샘플을 5 분 동안 실온에서 인큐베이팅시켯다. 485 nm에서 염료를 여기시킨후 방출 스펙트럼을 기록하였다. 결과를 도 1 에 나타내었다. 상보성 서열의 양이 증가하면 520 nm 에서의 방출 정도도 증가하였다. : 2-배 (0.5 당량), 5-배 (1.0 당량), 8-배 (10 당량) 및 9-배(30 당량) G-쿼테트를 펼수록 소실도는 더욱 많이 감소하였으므로 상보성 올리고누클레오티드는 더욱 많이 잡종화되었다. 이는 상기 방법이 반정량적 (semiquantative) 이거나, 또는 정량적일 가능성이 있거나 샘플내 존재하는 누클레오티드 서열의 양을 측정하거나 또는 상이한 샘플내 선택된 서열의 상대량을 비교하는 수단으로서 유용할 수 있음을 시사하였다.
실시예 3.
클라미디아 (Chlamydia) 유기체 검출용 탐침의 5' 말단에 G-쿼테트 서열을 가하였다. 상기 서열의 5' 말단은 6-FAM 로 라벨링시켰으며 T-6 에서는 하기와 같이 ROX 로 라벨링시켰다. (서열 5) :
F-GGTTGGTGTGGTTGGT*CTAGAGTCTTCAAATATCAGAGCTTTACCTAACAA
F = 플루오세인 (fluorescein)
T* = 아미노-C6 링커로 ROX (Rhodamine X) 와 연결된 dT
탐침을 ABI 380B 합성기상에서 ABI's 6-FAM 시약으로 합성한후 Glen Research 社의 dT C6 아미노 링커를 표시된 위치에 삽입시켰다. 탈보호 (deprotection) 과정후, 30 분에 걸쳐 용매 구배는 50 mM TEAA 내 아세토니트릴 2 % 에서 30 % 까지 걸어주며 Waters Delta Pak 300 Å C18 3.9 X 150 mm 칼럼을 사용하는 역상 HPLC 에 의하여 크루드한 올리고누클레오티드를 정제하였다. 이의 반 (0.5 μmole) 만큼을 pH 8 의 100 mM 소듐 카보네이트 / 비카보네이트 완충액 100 μL 에 용해시킨후 5 mg/60 μL ROX NHS 에스테르 (ABI / Perkin Elmer) 의 DMSO 용액 30 μL 를 가하였다. 결과로 생성된 혼합물을 압실에서 37 ℃ 에서 24 시간 동안 방치시킨후 4 mM TAE (4mM TRIS 아세테이트, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)를 용리시켜 G-25 SEPHADEX Resin (NAP5, Pharmacia Biotech) 칼럼을 통과시켰다. 상기된 바와 같이 HPLC 로써 상기 생성물을 정제하였다. 종래의 방법을 사용하여 서열 5 의 잡종화용 타겟 및 서열 5 를 주형으로서 사용하는 연장 반응용 프라이머로 사용되는 라벨링되지 않은 올리고누클레오티드 (서열 6) 를 합성하였다. 상기 올리고누클레오티드(TTGTTAGGTAAAGCTCTGATATTTGAAG) 는 상기 탐침의 3' 말단에 상보적이었다.
20 nM 형광성 탐침, 40 mM KiPO4, 5 mM Mg(OAC)2, 각각의 데옥시리보누클레오시드 트리포스페이트 0.2 mM, 1.4 mM 알파-티오-dCTP, 5 % 글리세롤 및 0, 0.2, 1.0 또는 10 당량의 타겟 올리고누클레오티드를 함유하는 100 μL 들이 큐베트 4 개를 마련한후 53 ℃ 로 예열시킨 샘플 챔버가 장착된 SLM 8100 형광계에 방치하다. Bst 중합 효소 (New England BioLabs, 25 U/100 μL) 를 각각의 샘플에 가한후 4 개의 샘플들 모두에 대하여 수시간에 걸쳐 형광도 세기를 측정하였다. 484 nm에서 여기되었으며 (4 nm / 4 nm 슬릿) 520 nm (10 nm/10 nm 슬릿) 에서 방출되었다.
결과를 도 3 에 나타내었다. 타겟의 존재하 공여체 형광도가 증가하였다는 사실은 상보성 서열이 합성되어 G-쿼테트가 펴져서 선형화 되어서 상기 2 개의 형광단 사이의 거리가 증가하게 되어 형광도가 소실되지 않았다는 것을 나타내는 것이다. 타겟의 양이 증가함에 따라 형광도의 변화량이 증가하였음은 상기 검정법이 적어도 반 - 정량적(semi-quantitative) 검정법이라는 것을 나타내는 것이다. 뿐만아니라, 도 2 는 타겟이 많이 존재할수록 증가율이 더욱 급속히 증가한다는 것을 나타낸다. 이는 잡종화된 프라이머를 연장시키는 것에 기초를 둔 SDA 반응 또는 다른 검정법에서, G-쿼테트를 파괴시키는 프라이머 연장 방법을 사용하는, 핵산의 실시간 (real - time) 검출법으로서, 반 - 정량적일 수 있는 방법의 유용성을 보여주는 것이다.
실시예 4.
5' 말단에서 G- 쿼테트에 연결된 미코박테리움 투베큘로시스(Mycobacterium tuberculosis) 의 IS6110 삽입 요소 검출용 탐침을 실시예 3 과 유사한 프라이머 연장 검정법에서 테스트하였다. 검출용 탐침의 5' 말단을 6-FAM 으로 라벨링시키고 하기와 같이 T-16 을 TAMRA 로 라벨링시켰다.
F-GGTTGGTGTGGTTGGT*TTATCCGTATGGTGGATAACGTCTTTCA
F = 플루오세인
T* = TAMRA 와 연결된 dT
검출용 탐침의 3' 말단에 상보적인 올리고누클레오티드는 서열 8 이었다. (GACGTTATCCACCATACGG) 55 ℃에서 0, 0.1 및 1.1 당량의 서열 8 의 존재하 실시예 3 에서와 같이 실험을 실시하였다. 도 3 은 타겟의 존재하 공여체 형광도가 증가되었음을 나타낸다. 이는 잡종화된 타겟 올리고누클레오티드를 프라이머로 사용하여 상보성 서열이 합성됨에 따라 검출용 탐침의 공여체 및 수용체 사이의 거리가 증가하기 때문이다. 타겟의 양이 많을수록, 형광도의 증가량도 많아진다. 다시 말해서, 타겟이 많이 존재하면 형광도의 형광도의 증가율은 더욱 빨라진다는 것이다. 상기 실험에서는 타겟이 10 배 증가하면 형광도의 변화량은 실시예 3 의 경우보다 상당히 증가하게 되는데, 이는 본 방법이 더욱 민감한 검정 시스템이라는 것을 시사해준다.
실시예 3 및 실시예 4 는 SDA 및 다른 증폭 반응에서 시그널 프라이머상의 G-쿼테트를 라벨 또는 검출용 분자로서 사용하는 것에 대한 본질적인 특징에 대하여 기술하는데, 즉, 증폭 프라이머가 5' 말단에 G-쿼테트가 존재하는 시그널 프라이머에 잡종화되는 능력 및 G-쿼테트를 통하여 연장된후 상기 G-쿼테트 구조를 파괴시켜 공여체 및 수용체 사이의 거리를 증가시키는 것이 그것이다. 상기 2 개의 라벨 사이의 근접도 - 의존성 반응에 의하여 상기 라벨의 한쪽 또는 양쪽 말단의 형광도가 측정 가능하도록 변화된다. 이에 관하여는 일반적으로 EP 0 684 315 호에 기술된 바와 같이 수행되는 SDA 반응에 나타내었다. AvaI 를 제한 엔도누클레아제로서, 그리고 서열 7 을 시그널 프라이머로서 사용하여, 55 ℃ 에서 상기 증폭 반응을 수행하였다. 엠. 튜버큘로시스 의 게놈형 DNA 를 증폭 타겟으로서 가하였다. 결과를 도4 에 나타내었다. 공여체 형광도는 타겟을 함유하지 않는 대조구 반응물에서 수시간에 걸쳐 낮은 수준으로 일정하게 유지되었다. 타겟 (10, 100 또는 1000) 을 함유하는 증폭 반응물내에서, 타겟이 증폭됨에 따라 수시간에 걸쳐 공여체 형광도는 측정 가능하도록 증가하였다. 상기 결과는 타겟이 증폭됨에 따라 시그널 프라이머가 연장되어, 치환된 후 2 본쇄로 되며 상기 과정이 발생함에 따라 시그널 프라이머내 G-쿼테트 서열은 펴진다는 것을 나타내는 것이다. 따라서 타겟 증폭 - 특이 방식으로 G-쿼테트 구조가 파괴되어 형광도가 증가하는 현상은 타겟 증폭을 검출하기에 유용한 방법이다. 뿐만아니라, 초기의 타겟량이 증가하면 공여체 형광도 세기의 증가율은 더욱 증가한다. 따라서 공여체 형광도 세기의 증가율 (즉, 공여체 소실의 감소율) 은 샘플내 타겟의 초기량을 나타내는 적어도 반 - 정량적이며 또한 복수개의 샘플내 함유된 타겟의 초기의 상대량을 비교하는데에 사용되는 지표이다.
Figure pat00013
Figure pat00004
Figure pat00005
Figure pat00006
Figure pat00007
Figure pat00008
G-쿼테트 구조를 형성하는 올리고누클레오티드는 G-쿼테트 올리고누클레오티드에 연결된 2 개의 염료 라벨 사이의 거리가 변함에 따라 형광도가 측정 가능하도록 변화된다는 사실을 사용하여 누클레오티드 서열을 검출하거나 또는 동정하는데에 유용하다는 것이 밝혀졌다. 상기 G-쿼테트가 공여체 형광단으로 라벨링되고 다른쪽 말단은 적당한 수용체 염료로 라벨링된 경우, 상기 G-쿼테트의 특징적인 구조로 인하여 상기 공여체 - 수용체 쌍은 접근하게 되며, 그 결과 상기 라벨 사이의 반응으로 공여체 형광도는 소실된다. 상보적 올리고누클레오티드에 잡종화됨에 따라, 상기 G-쿼테트 구조는 펴지거나 또는 선형화된다. 이로써 상기 2 개의 염료 라벨 사이의 거리는 증가하며 그 결과 선별된 핵산 서열의 존부에 대한 지표로서 관찰될 수 있는 이들의 반응성 및 형광도 소실 정도는 감소 (즉, 공여체 형광도는 증가) 하게 된다. 상기 수용체 염료가 또한 형광단일 경우, G-쿼테트가 선형화되어 상기 공여체 및 수용체 사이의 거리가 증가하면 어떠한 경우에는 형광도가 감소될 수 있다. 그러한 경우, 상기 수용체 형광도 감소는 또한 선별된 핵산 서열 존부에 대한 지표로서 측정될 수 있다.
도 1 은 G-쿼테트가 이의 상보성 서열에 잡종화되었을 때 관찰한 것으로서 공여체 형광도가 증가되었음을 나타내는 그래프이다. 도 1 은 실시예 2 의 결과를 나타낸다.
도 2 는 잡종화된 프라이머가 G-쿼테트를 통하여 연장되어, 상기 G-쿼테트 구조가 펴지거나 또는 선형화되어 상기 공여체 형광단 및 상기 수용체 사이의 거리가 증가되었을 때 공여체의 형광도가 증가되었음을 나타내는 그래프이다. 도 2 는 실시예 3 의 결과이다.
도 3 은 또한 잡종화된 프라이머가 G- 쿼테트를 통하여 연장되었을 때 공여체의 형광도가 증가되었음을 나타내는 그래프이다.
도 4 는 사슬 치환 증폭 반응 (Strand Displacement Amplification reaction) 에서 타겟 증폭 반응을 검출하기 위하여 공여체 형광단 및 수용체 염료와 연결된 G-쿼테트가 검출 가능한 라벨로서 시그널 프라이머 상에서 사용되었을 때, 공여체의 형광도가 증가되었음을 나타내는 그래프이다.

Claims (2)

  1. 공여체 형광단(donor fluorophore)으로 라벨링된 제 1 말단 및 수용체 (acceptor) 로 라벨링된 제 2 말단을 가지며, 올리고누클레오티드가 G-쿼테트 구조를 형성할 때 수용체에 의하여 공여체 형광단의 형광도가 소실되며, 상기 G-쿼테트 구조가 펴짐에 따라 공여체 형광단의 형광도 소실이 감소되도록, 상기 공여체 형광단 및 수용체가 선택되는, G-쿼테트 구조를 형성하는 올리고누클레오티드.
  2. a) 제 1 항에 따른 G-쿼테트 구조를 형성하는 올리고누클레오티드를 포함하는 탐침을 제공하는 단계,
    b) 선택된 핵산 서열이 존재하는 경우, 상기 올리고누클레오티드를 2 본쇄로 만들어, 상기 G-쿼테트 구조를 펴서 상기 공여체 형광단 및 수용체 사이의 거리를 증가시키는 단계; 및
    c) 상기 공여체 형광단 및 수용체 형광단 사이의 거리가 증가함에 따른 형광성의 변화를 선택된 핵산의 존부에 대한 지표로서 검출하는 단계
    를 포함하는 선택된 핵산 서열을 검출 또는 동정하는 방법.
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