JP4131749B2 - 自己消光性蛍光プローブと方法 - Google Patents
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Description
発明の背景
発明の分野
本発明は、一般に、蛍光報知分子と蛍光消光分子とを含む蛍光プローブに関する。より具体的には、本発明は、ハイブリダイゼーションアッセーおよび核酸増幅反応（特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））で用いることができる蛍光報知分子と蛍光消光分子とを含む蛍光プローブに関する。
関連分野の説明
生物学的事象をモニターするために、互いに分離されているか、または互いに最小の消光距離に配置された蛍光報知分子と消光分子を基本とする蛍光報知分子−消光分子対がオリゴヌクレオチドプローブに組み込まれた。例えば、報知分子の蛍光強度が該報知分子と該消光分子とを切り離すことによって高められるプローブが開発された。また、消光分子が報知分子の近傍に配置されることによって蛍光が消失するプローブも開発された。これらの報知−消光分子対プローブは、該報知分子が発生する蛍光シグナルの出現または消失のいずれかをモニターすることによって、ハイブリダイゼーションアッセーおよび核酸増幅反応（特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））の追跡に使用された。
本明細書で用いられるように、報知分子は蛍光シグナルを発生させることができる分子である。消光分子は、励起した報知分子の蛍光エネルギーを吸収し、それによって本来ならば励起した報知分子から遊離されるはずであった蛍光シグナルを消光させることができる分子である。消光分子が励起した発蛍光団を消光させるためには該消光分子は、蓄積された蛍光エネルギーを報知分子が遊離する前のある時期に励起報知分子について最小消光距離内に存在しなければならない。
報知分子−消光分子対を含むプローブがハイブリダイゼーションアッセー用に開発されたが、この場合該プローブはヘアピン構造を形成する。すなわちこの場合には、該プローブは、ヘアピン構造の形成を妨げる相補的核酸配列が存在しないときそれ自身とハイブリダイズし、該報知分子の近傍に消光分子が配置されるようなループを形成する（WO90/03446；欧州特許出願公開公報第0601889A2号）。相補的な標的配列が存在する場合、該相補的標的配列へのプローブのハイブリダイゼーションによってヘアピン構造が破壊され、該消光分子が該報知分子にもはや十分に接近できず該報知分子を消光することができない構造をこのプローブに受容させる。結果として、該プローブは、標的配列とハイブリダイズした場合はハイブリダイズしない場合よりも強い蛍光シグナルをもたらす。ヘアピン構造を含むプローブは、そのようなプローブはデザインが困難であるということ、さらに標的配列とプローブとのハイブリダイゼーションに干渉する可能性があるという欠点をもつ。
２つの別々のプローブ（１つは報知分子を含み、他方は消光分子を含む）を用いてヘアピン構造の存在を見分けるアッセーもまた開発された（Mergneyら、Nucleic Acids Research, 22:6 920-928(1994)）。これらのアッセーでは、報知分子の蛍光シグナルは、消光分子が報知分子の近傍に配置されるために標的配列にハイブリダイズしたとき減少する。
報知分子−消光分子対を含むプローブの特に重要な応用の１つは、核酸増幅反応（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））で標的核酸配列の存在および増幅を検出するためにそれらを使用することである。一般に、核酸増幅技術は遺伝学的検査およびＤＮＡ分析に通じる幅広い新規な研究方法を提供した（Arnheim & Erlich, Ann. Rev. Biochem., 61:131-156(1992)）。特にＰＣＲは、例えばクローニング、遺伝的発現の分析、ＤＮＡ配列決定、遺伝学地図の作製および薬剤の発見の分野で応用される極めて重要な研究手段となった（Arnheim & Erlich, Ann. Rev. Biochem., 61:131-156(1992);Gillilandら、Proc. Natl. Acad. Sci., 87:2725-2729(1990);Bevanら、PCR Methods and Applications, 1:222-228(1992);Greenら、PCR Methods and Applications, 1:77-90(1991);Blackwellら、Science, 250:1104-1110(1990)）。
核酸増幅技術の利用の広がりによって、様々な環境下で増幅反応を実施するための手段の開発が促進された。そのような機器の開発で重要なデザイン目標には、精密な温度制御、多サンプル用温度循環におけるサンプル間変動の最小化、反応前および反応後処理工程の自動化、高速温度循環、サンプル量の最小化、増幅生成物のリアタイム測定および交差夾雑の最小化（例えば“サンプルの持ち越し”のために生じる）が含まれる。特に、閉鎖反応チャンバーでの増幅の実施およびリアルタイムモニターを可能にする機器のデザインは、交差夾雑を防ぐために大いに望まれるところである（Higuchiら、Biotechnology, 10:413-417(1992)および11:1026-1030(1993);Hollandら、Proc. Natl. Acad. Sci., 88:7276-7280(1991)）。明らかに、そのようなデザイン目標の達成は、例えば“サンプル持ち越し”のために生じる高頻度の偽陽性および偽陰性が増幅処理の意義を大きく減退させる診断用サンプルの分析で特に望まれる。のみならず、増幅反応をリアルタイムでモニターすることによって多重標的増幅反応における出発標的ＤＮＡ濃度のはるかに正確な定量が可能になる。なぜならば、反応時の相対濃度値の流れを考慮することによって近似濃度の相対値を解析することができるからである。リアルタイムモニタリングはまた増幅反応効率の評価を可能にするが、これによって反応抑制物がサンプル中に存在するか否かが示される。
ホーランド（Holland）らの上掲書、米国特許第５２１００１５号（Gelfandら）および他の研究者らは、ＰＣＲ時の増幅生成物のリアルタイム測定を提供するために蛍光による手段を提唱した。そのような手段は、存在する二重鎖ＤＮＡ量の表示のために挿入染料（例えば臭化エチジウム）を用いるか、または蛍光−消光分子対を含むプローブ（また“Ｔａｑ−Ｍａｎ”アプローチと呼ぶ）を用いた。後者の場合、プローブは増幅時に切断され、その濃度が存在する二重鎖ＤＮＡ量に比例する蛍光分子を遊離する。増幅時に、このプローブは、標的配列にハイブリダイズするときポリメラーゼのヌクレアーゼ活性によって消化され、消光分子から蛍光分子を遊離させて、それによって報知分子に由来する蛍光が出現する。
図１に示すＴａｑ−Ｍａｎアプローチは、標的ポリヌクレオチドの“下流領域”（すなわちプライマー結合部位の伸長方向）に特異的にやきもどし（アニール）される報知分子−消光分子対を含むオリゴヌクレオチドプローブを用いる。この報知分子および消光分子は互いに十分接近して配置され、それによって報知分子が励起されると常にこの励起状態エネルギーは消光分子に非放射性に伝えられ、該エネルギーは非放射性に消失するか、または報知分子の発光周波数と異なる周波数で放出される。ＤＮＡポリメラーゼによって鎖が伸長している間プローブは鋳型とアニールし、このプローブはポリメラーゼの５’→３’エクソヌクレアーゼ活性によって消化される。プローブが消化される結果、この報知分子は効果的に消光分子から分離され、それによって消光分子はもはや報知分子の蛍光を消光できるほど十分に報知分子に接近することができない。したがって、増幅時にプローブが消化されればされるほど、溶液中の報知分子数は増加し、結果として非消光報知分子数が増す結果となり蛍光シグナルはますます強くなる。
ハイブリダイゼーションアッセーおよび増幅アッセーでは３つの主要な要因が報知分子−消光分子対プローブの有用性に影響を与える。第一の要因は、報知分子を消光するプローブ上の消光分子の有効性である。本明細書で“ＲＱ-”と称するこの第一の要因は、プローブが相補的ポリヌクレオチドとハイブリダイズしないときの消光分子に対する報知分子の蛍光放出比によって表すことができる。すなわち、ＲＱ-は、オリゴヌクレオチドプローブが一本鎖状態の場合の消光分子の蛍光に対する報知分子の蛍光放出の比である。ＲＱ-値に対する影響は、例えば、用いられる特定の報知分子および消光分子、報知分子と消光分子との間の間隔の取り方、ヌクレオチド配列特異的効果、報知分子と消光分子が結合している構造物（例えばリンカー）の可撓性の度合い、および不純物の存在を含む（Woら、Anal. Biochem., 218:1-13(1994);Clegg, Meth. Enzymol., 211:353-388(1992)）。相対量ＲＱ+は、オリゴヌクレオチドプローブが相補的ポリヌクレオチドとハイブリダイズしたときの消光分子に対する報知分子の蛍光放出比を指す。
第二の要因はプローブが相補的ポリヌクレオチドとハイブリダイズする効率である。この第二の要因は、プローブの融解温度（Ｔm）、プローブまたは標的ポリヌクレオチドの二次構造の有無、アニーリングの温度および他の反応条件に左右される。
第三の要因は、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エクソヌクレアーゼ活性が結合プローブを報知分子と消光分子との間で切断する効率である。この効率は、報知分子または消光分子のプローブの５’末端との近さ、報知分子または消光分子の“かさ（bulkiness）”およびプローブと標的ポリヌクレオチドとの相補性の度合いに左右される（Leeら、Nucleic Acids Research, 21:3761-3766(1993)）。
消光は報知分子と消光分子との物理的近さに左右されるので、以前は、該消光分子が報知分子を消光できる最大の距離（これは一般には約６−１６ヌクレオチド）を越えずに常に消光分子が存在するように、消光分子と報知分子がプローブに結合している必要があると考えられていた（Leeら、Nucleic Acids Research, 22:920-928(1994);Cardulloら、Proc. Natl. Acad. Sci., 85:8790-8794(1988);Cleggら、Proc. Natl. Acad. Sci., 90:2994-2998(1993);Ozakiら、Nucleic Acids Research, 20:5250-5214(1992)）。報知分子と消光分子との間のこの短い分離は、典型的には、１組の報知分子−消光分子対をプローブの３’または５’末端に結合させ、さらに他の組を６−１６ヌクレオチド離れた内部塩基に結合させることによって達成できる。
内部塩基に報知分子または消光分子を結合させることに付随する少なくとも２つの重大な短所が存在する。報知分子または消光分子を内部ヌクレオチドに結合させることは、末端ヌクレオチドに分子を結合させる場合に必要とされるよりももっと困難な化学操作を必要とする。さらに、報知分子または消光分子の内部ヌクレオチドとの結合はプローブのハイブリダイゼーション効率に悪影響を及ぼすであろう（Wardら、米国特許第5328824号;Ozakiら、Nucleic Acids Research, 20:5250-5214(1992)）。
現時点で、ハイブリダイゼーションアッセーおよび核酸増幅アッセーで使用できる蛍光報知分子と消光分子を含む有効なオリゴヌクレオチドプローブが希求される。したがって、標的核酸配列にハイブリダイズしたか、またはハイブリダイズしていない場合に識別可能な蛍光特性を表示するプローブが希求される。さらに、消光分子が報知分子の蛍光を効果的に消光できるように報知分子と消光分子がプローブ上に配置されたプローブもまた希求される。さらに、効率よく合成できるプローブもまた希求される。さらにまた、報知分子と消光分子がプローブのハイブリダイゼーション効率に悪影響を与えないようにプローブ上に配置させることが可能な報知分子および消光分子が希求される。上記の目的および更なる目的は本発明のプローブおよび方法によって提供される。
発明の要旨
本発明は、蛍光報知分子および該報知分子の蛍光を消光することができる消光分子を含むオリゴヌクレオチドプローブに関する。本発明にしたがえば、このオリゴヌクレオチドプローブは、ハイブリダイズしていない場合は該オリゴヌクレオチドが少なくとも一本鎖の形状で存在するように構築され、この場合該消光分子は報知分子の蛍光を消光することができるように該報知分子に十分近接して存在する。該オリゴヌクレオチドプローブはまた、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズした場合は少なくとも１つの構造で存在し、この構造では該消光分子の位置は報知分子の蛍光を消光することができるほど十分近接していない。これらのハイブリダイズ済み構造および未ハイブリダイズ構造をとることによって、プローブ上の報知分子および消光分子は、プローブがハイブリダイズした場合およびハイブリダイズしていない場合に異なる蛍光シグナル強度を示す。結果として、報知分子、消光分子またはその合体したものがもつ蛍光強度の変化を基にしてプローブがハイブリダイズしたか、またはハイブリダイズしていないかを決定することができる。さらに、プローブがハイブリダイズしていない場合、消光分子が報知分子を消光するようにプローブをデザインすることができるので、プローブがハイブリダイズするかまたは消化されるまで限定された蛍光を報知分子が表示するようにプローブをデザインすることが可能である。
本発明にしたがえば、プローブが標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするとき、報知分子の蛍光強度は好ましくは消光分子の蛍光強度よりも大きい。より好ましくは、プローブが標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするとき、報知分子の蛍光強度は消光分子の蛍光強度よりも少なくとも約３．５倍大きい。
好ましくはまた、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブの蛍光強度は、標的とハイブリダイズしないときのオリゴヌクレオチドプローブの蛍光強度より係数で少なくとも約６倍強い。
報知分子は、消光分子から好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１８ヌクレオチド離れている。報知分子は、好ましくは約１５から６０ヌクレオチド、より好ましくは約１８から３０ヌクレオチド消光分子から離れている。
報知分子は好ましくはプローブの３’または５’末端ヌクレオチドのいずれかと結合している。消光分子はまた好ましくはプローブの３’または５’末端ヌクレオチドのいずれかと結合している。より好ましくは、報知分子および消光分子は、プローブの３’および５末端または５’および３’末端ヌクレオチドにそれぞれ結合している。
報知分子は好ましくはフルオレセイン染料であり、消光分子は好ましくはローダミン染料である。
ある実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは固形支持体に固定されている。このオリゴヌクレオチドプローブは固形支持体に、例えば該固形支持体へのプローブの３’または５’末端ヌクレオチドの結合によって直接結合させてもよい。しかしながら、より好ましくは、プローブはリンカーによって固形支持体に結合される。このリンカーは固形支持体からプローブを遠ざけるために役立つ。最も好ましくは、リンカーは長さが少なくとも３０原子、より好ましくは長さが少なくとも５０原子である。
オリゴヌクレオチドプローブを固形支持体に結合させるために用いられる多様なリンカーが当該技術分野で知られている。最も好ましくは、該リンカーは官能基付加ポリエチレングリコールを含むが、その理由は、標的オリゴヌクレオチドとプローブとのハイブリダイゼーションに著しい干渉を示さないこと、市販されていること、有機および水性媒体の両方に可溶であること、官能基の付加が容易なこと、さらにオリゴヌクレオチド合成条件と合成後条件の下で全く安定であることである。
好ましくは、固形支持体、リンカーおよびプローブ間の連結は、高温の塩基性条件下での塩基保護基の除去時に切断されない。好ましい連結の例にはカルバメートおよびアミド連結が含まれる。
本発明はまた、標的ポリヌクレオチドを検出するためにハイブリダイゼーションプローブとしてオリゴヌクレオチドプローブを使用することに関する。したがって、本発明は、サンプル中の標的ポリヌクレオチドの有無を検出するハイブリダイゼーションアッセーに関する。本方法のある実施態様では、該ハイブリダイゼーションプローブは固形支持体に固定される。
本方法にしたがえば、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、ハイブリダイゼーションに都合のよい条件下でポリヌクレオチドサンプルと接触させられる。サンプルと接触させる前および後での報知分子の蛍光シグナルが比較される。プローブ上の報知分子は標的配列とハイブリダイズしたときにより強い蛍光シグナルを示すので、サンプルとプローブが接触した後蛍光シグナルの増加があれば、サンプル中の標的配列とプローブとのハイブリダイゼーションが示唆され、したがってサンプル中に標的配列が存在することが示唆される。サンプルとプローブとの接触の結果として、蛍光強度の変化の定量がサンプルに存在する標的配列の量を定量するために用いられる。
本発明はまた、核酸増幅をモニターするために該オリゴヌクレオチドプローブを使用することに関する。したがって、本発明は、５’→３’ヌクレアーゼ活性をもつ核酸ポリメラーゼ、標的配列とハイブリダイズすることができるプライマー、およびプライマーに対して３’側で標的配列とハイブリダイズすることができる本発明のオリゴヌクレオチドプローブを用いて標的配列で核酸増幅を実施することによって核酸増幅をモニターする方法に関する。本発明にしたがえば、この核酸ポリメラーゼは、オリゴヌクレオチドプローブが標的配列とハイブリダイズするとき、増幅時に該オリゴヌクレオチドプローブを消化し、それによって報知分子を消光分子から分離させる。増幅が進行している時に報知分子の蛍光がモニターされ、蛍光の発生は核酸増幅に対応する。したがって、実際の増幅量は観察された蛍光の変化によって定量できる。消光分子の蛍光もまた、別個にまたは報知分子と合わせて増幅検出のためにモニターできることを特記する。
【図面の簡単な説明】
図１は、核酸ポリメラーゼの５’→３’エクソヌクレアーゼ活性によって消化されるプローブを用いた核酸増幅をリアルタイムでモニターする方法を示す。
図２は、固形支持体に固定された本発明のプローブのハイブリダイズ済み構造および未ハイブリダイズ構造を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、蛍光報知分子および該報知分子の蛍光を消光できる消光分子を含むオリゴヌクレオチドプローブに関する。本発明にしたがえば、該オリゴヌクレオチドプローブは、ハイブリダイズしていないときはプローブが少なくとも一本鎖構造で存在できるように構築され、この場合、消光分子は該報知分子の蛍光を消光するように報知分子に十分近接している。オリゴヌクレオチドプローブはまた、標的ヌクレオチドとハイブリダイズしたときは、該消光分子の位置が該報知分子の蛍光を消光するために該報知分子に十分に近くない少なくとも１つの構造で存在する。これらのハイブリダイズ済み構造および未ハイブリダイズ構造をとることによって、プローブ上の報知分子および消光分子は、プローブがハイブリダイズした場合およびハイブリダイズしていない場合に異なる蛍光シグナルを示す。結果として、報知分子、消光分子またはそれらの蛍光強度の変化によってプローブがハイブリダイズしたか否かを決定することが可能である。さらに、プローブがハイブリダイズしていないときは消光分子は報知分子を消光することができるようにプローブをデザインすることができるので、プローブがハイブリダイズしない限りまたは消化されない限り報知分子が限定的蛍光を示すようにプローブをデザインすることができる。
本発明にしたがえば、プローブが標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするときは、好ましくは報知分子の蛍光強度は消光分子の蛍光強度よりも強い。より好ましくは、プローブが標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするときは、報知分子の蛍光強度は消光分子の蛍光強度より係数で少なくとも約3.５倍強い。
標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブの蛍光強度はまた、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズしていないときのオリゴヌクレオチドプローブの蛍光強度より係数で好ましくは少なくとも約６倍強い。
報知分子は、消光分子から好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１８ヌクレオチド離れている。報知分子は、好ましくは約１５から６０ヌクレオチド、より好ましくは約１８から３０ヌクレオチド消光分子から離れている。
報知分子は、好ましくは該プローブの３’または５’末端ヌクレオチドのどちらかに結合される。消光分子はまた、好ましくは該プローブの３’または５’末端ヌクレオチドのどちらかに結合される。より好ましくは、報知分子と消光分子は、プローブの３’および５’または５’および３’末端ヌクレオチドにそれぞれ結合される。
報知分子は好ましくはフルオレセイン染料で、消光分子は好ましくはローダミン染料である。
ある実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブは固形支持体に結合される。図２に示すように、プローブがハイブリダイズしていないときは、報知分子の蛍光を消光するために該消光分子は報知分子に十分近接できるように少なくとも１つの一本鎖構造をとることができる。さらに図２に示すように、プローブが標的配列とハイブリダイズしたときは、プローブは、報知分子の蛍光を消光するために消光分子が報知分子に十分近接した位置に存在しない少なくとも１つの構造をとる。結果として、プローブが標的配列とハイブリダイズするときは報知分子の蛍光強度は増加する。
図２に示すように、異なるプローブを固形支持体に結合させ、サンプル中の異なる標的配列を同時に検出するために用いることができる。異なる蛍光波長をもつ報知分子を異なるプローブ上で用いることができ、したがって異なるプローブとのハイブリダイゼーションを別々に検出することができる。
オリゴヌクレオチド固定用の好ましい固形支持体の種類の例には、孔制御ガラス、ガラス板、ポリスチレン、アビジン被覆ポリスチレンビーズ、セルロース、ナイロン、アクリルアミドゲルおよび活性化デキストラン、ＣＰＧ、ガラス板および高架橋ポリスチレンが含まれる。これらの固形支持体は、その化学的安定性、官能基付加が容易なことおよび輪郭の明瞭な表面領域のためにハイブリダイゼーション実験および診断実験に好ましい。孔制御ガラス（controlled pore glass(CPG)、５００Å、１０００Å）および非膨潤性高架橋ポリスチレン（１０００Å）のような固形支持体は、オリゴヌクレオチド合成との適合性という観点から特に好ましい。
このオリゴヌクレオチドプローブは種々の態様で固形支持体に結合させることができる。例えば、プローブは、固形支持体にその３’または５’末端ヌクレオチドを結合させることによって固形支持体に結合させることができる。しかしながら、より好ましくはこのプローブは、固形支持体からプローブを話す役割をはたすリンカーによって固形支持体と結合させる。このリンカーは、最も好ましくは長さが少なくとも３０原子、より好ましくは長さが少なくとも５０原子である。
固形支持体とオリゴヌクレオチドの最初の３’ユニットとの間のリンカーの長さおよび化学的安定性は、効率の良い合成と支持体に結合したオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに重要な役割を果たす。リンカーアームは、自動合成時に高収量（＞９７％）を達成できるように十分に長くあるべきである。リンカーに必要な長さは用いられる個々の固形支持体によって異なる。例えば、固形支持体として高架橋ポリスチレンを用いる場合は、自動合成時に＞９７％の収量を達成するために一般に６原子のリンカーで十分である。ＣＰＧが固形支持体として用いられる場合、自動合成時に高収量（＞９７％）を達成するためにはリンカーアームは少なくとも長さが２０原子であることが好ましい。
固形支持体に固定されたプローブのハイブリダイゼーションは、一般に、プローブが少なくとも３０原子、より好ましくは少なくとも５０原子固形支持体から離れていることを必要とする。この分離を達成するために、一般にリンカーは３’ヌクレオシドとリンカーとの間に配置されたスペーサーを含む。オリゴヌクレオチド合成のためには、リンカーアームは通常エステル結合によって３’ヌクレオシドの３’−ＯＨに結合される。このエステル結合は塩基性試薬で切断され、固形支持体からオリゴヌクレオチドを遊離させることができる。
固形支持体にオリゴヌクレオチドプローブを結合させるために用いることができる種々のリンカーが当該分野で知られている。リンカーは、固形支持体に結合させたプローブと標的配列とのハイブリダイゼーションを顕著に干渉しないいずれの物質からも生成することができる。リンカーは、自動合成によってリンカーに容易に付加できるホモポリマーオリゴヌクレオチドから生成できる。また別に、官能基付加ポリエチレングリコールのようなポリマーもリンカーとして用いることができる。そのようなポリマーは、標的オリゴヌクレオチドとプローブとのハイブリダイゼーションに顕著に干渉しないのでホモポリマーオリゴヌクレオチドよりも好ましい。ポリエチレングリコールは、市販されていること、有機媒体および水性媒体の両方に可溶であること、官能基付加が容易であること、並びにオリゴヌクレオチド合成および合成後条件下で完全に安定であることから特に好ましい。
好ましくは固形支持体、リンカーおよびプローブとの間の連結は、高温の塩基性条件下で塩基保護基の除去時に切断されない。好ましい連結の例にはカルバメート結合およびアミド結合が含まれる。
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、標的ポリヌクレオチドを検出するハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。したがって、本発明は、サンプル中の標的ポリヌクレオチドの存在を検出するハイブリダイゼーションアッセーに関する。本方法にしたがえば、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、ハイブリダイゼーションに都合のよい条件下で核酸サンプルと接触させられる。報知分子の蛍光シグナルはサンプルに接触させる前と後に測定される。プローブ上の報知分子は、標的配列とハイブリダイズしたときはより強い蛍光シグナルを示すので、サンプルとプローブを接触させた後の蛍光シグナルの増加は、サンプル中の標的配列とプローブとのハイブリダイゼーションを示唆し、したがってサンプル中の標的配列の存在が示される。さらに、プローブをサンプルと接触させた結果としての蛍光強度の変化を定量することによってサンプル中の標的配列の量を定量することができる。
本方法の一実施態様にしたがえば、ハイブリダイゼーションプローブは固形支持体に固定される。オリゴヌクレオチドプローブは、ハイブリダイゼーションに適した条件下で核酸サンプルと接触させられる。報知分子の蛍光シグナルはサンプルに接触させる前と後に測定される。プローブ上の報知分子は、標的配列とハイブリダイズしたときはより強い蛍光シグナルを示すので、サンプルとプローブを接触させた後の蛍光シグナルの増加は、サンプル中の標的配列とプローブとのハイブリダイゼーションを示唆する。固形支持体へのハイブリダイゼーションプローブの固定によって、プローブとハイブリダイズした標的配列を容易にサンプルから分離できる。以後の工程で、分離された標的配列を固形支持体から分離し、研究者の個々のニーズにしたがって当該分野で周知の方法によってさらに処理（例えば精製、増幅）することができる。
本発明のオリゴヌクレオチドプローブはまた、核酸増幅をモニターするプローブとして用いることができる。したがって、本発明は、増幅プライマーに対して３’側で標的配列とハイブリダイズできる本発明のオリゴヌクレオチドプローブを用いて核酸増幅をモニターする方法に関する。本方法にしたがえば、核酸増幅は、５’→３’ヌクレアーゼ活性をもつ核酸ポリメラーゼ、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズできるプライマー、およびプライマーに対して３’側で標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズできる本発明のオリゴヌクレオチドプローブを用いて標的ポリヌクレオチドについて実施される。増幅中に、この核酸ポリメラーゼは、オリゴヌクレオチドプローブが標的配列とハイブリダイズしたとき該オリゴヌクレオチドプローブを消化し、したがって消光分子から報知分子を分離する。増幅が進行しているとき報知分子の蛍光がモニターされ、蛍光の発生は核酸の増幅に対応する。
一般に標的ポリヌクレオチドの増幅（例えばＰＣＲによって）と組み合わせた報知分子−消光分子対の使用は多くの文献に記載されている（例えば、Innisら編、ＰＣＲプロトコル（PCR Protocols）、アカデミックプレス刊、ニューヨーク、（1989）：Sambrookら、分子クローニング、第２版、コールドスプリングハーバー研究所刊、ニューヨーク（1989）、これらは各々参照により本明細書に含まれる）。オリゴヌクレオチドプローブの結合部位は、標的ポリヌクレオチドを増幅するために用いられるＰＣＲプライマー間に位置する。好ましくは、ＰＣＲはＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（例えばAmplitaqTM（Perkin-Elmer製、Norwalk,コネチカット））または同様な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施され、ＰＣＲのアニーリング温度は用いたオリゴヌクレオチドプローブの融解温度より約５−１０℃低い。
核酸増幅をモニターする本発明のオリゴヌクレオチドプローブの使用によって従来の報知分子−消光分子対プローブの使用を越えるいくつかの利点が提供される。例えば、従来のプローブは、消光分子が報知分子の最小消光距離内に維持されるように報知分子と消光分子がプローブ上に配置される必要があった。しかしながら、消光分子が報知分子の最小消光距離内に存在するような構造をプローブがとることができるようにプローブをデザインしさえすればよいということが分かったので、はるかに様々なプローブが可能である。例えば、その５’および３’末端に報知分子と消光分子をもつ二重標識プローブをデザインすることができる。そのようなプローブは、報知分子または消光分子を内部ヌクレオチドに結合させたプローブよりもはるかに合成が容易である。末端ヌクレオチドに報知分子と消光分子を配置することによって、プローブのハイブリダイゼーション効率もまた強化される。
本出願で用いるように、“オリゴヌクレオチド”という用語は、天然または修飾モノマーまたは連合体（デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシドなどを含む）の直線状オリゴマーで、モノマー対モノマー相互作用の規則的なパターン（例えばワトソン−クリック型塩基対形成など）によって標的ポリヌクレオチドと結合できるものを含む。通常モノマーはホスホジエステル結合またはその類似体によって連結され、サイズが数モノマー単位（例えば３−４）から数十モノマー単位のオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチドが文字の配列（例えば“ＡＴＧＣＣＴＧ”）で表現される場合は、ヌクレオチドは左から右に５’→３’の方向であり、さらに特に記載がなければ“Ａ”はデオキシアデノシン、“Ｃ”はデオキシシチジン、“Ｇ”はデオキシグアノシン、“Ｔ”はデオキシチミジンを表すことは理解されよう。ホスホジエステル連結の類似体には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデートなどが含まれる。一般に、本発明のオリゴヌクレオチドプローブはその５’末端に隣接して十分な数のホスホジエステル結合を有し、それによって用いられた５’→３’エクソヌクレアーゼ活性が効果的に結合したプローブを分解して報知分子と消光分子を分離させることができる。
二本鎖体（デュープレックス）を指して“完全に適合”という場合は、二本鎖体を形成するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド鎖が、各鎖の各ヌクレオチドが他方の鎖のヌクレオチドとワトソン−クリック塩基対形成を経て互いに二本鎖構造を形成することを意味する。この用語はまた、ヌクレオシド類似体（例えばデオキシイノシン、２−アミノプリンをもつヌクレオシドなど利用可能なもの）による対形成も含む。逆に、標的ポリヌクレオチドとオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーとの二本鎖体についての“ミスマッチ（不適合）”は、二本鎖体のヌクレオチド対がワトソン−クリック結合を経ることができないことを意味する。
本出願で用いられるように、“ヌクレオシド”には、コーンバーグとベーカー著の「ＤＮＡ複製」（Kornberg & Baker, DNA Replication，第２版Freeman刊、サンフランシスコ、1992）に記載されているように２’−デオキシおよび２’−ヒドロキシル型を含む天然のヌクレオシドが含まれる。ヌクレオシドに関して“類似体”という場合は、例えば文献（Scheit，ヌクレオチド類似体（Nucleotide Analogs）、John Wiley刊、ニューヨーク、（1980）；Uhlman & Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)など）に記載された修飾塩基部分および／または修飾糖部分をもつ合成ヌクレオシドを含むが、ただしそれらが特異的なハイブリダイゼーションが可能であることを条件とする。そのような類似体には、結合特性を強化させ、縮退を減少させ、特性を強化させるようにデザインした合成ヌクレオシドが含まれる。
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは多数の手段（例えば、Ozakiら、Nucleic Acids Research, 20:5205-5214(1992);Agrawalら、Nucleic Acids Research, 18:5419-5423(1990)など）によって合成できる。本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、自動ＤＮＡ合成装置（例えばApplied Biosystems, Inc.製、モデル３９２または３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置（Foster City，カリフォルニア））で通常の化学操作（例えばホスホルアミダイト化学）を用いて例えば以下の文献に開示されたように都合よく合成できる（Beaucage & Iyer, Tetrahedron, 48:2223-2311(1992);Molkoら、米国特許第4980460号;Kosterら、米国特許第4725677号;Caruthersら、米国特許第4415732号;4458066号;4973679号など）。また別の化学操作（例えば非天然のバックボーン基（例えばホスホロチオエート、ホスホルアミデート）を生じるもの）もまた用いることができるが、生成されたオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション効率および／または用いるエクソヌクレアーゼの切段効率に悪影響を及ぼさないことを条件とする。
好ましくはオリゴヌクレオチドプローブは長さが１５−６０ヌクレオチドの範囲にある。より好ましくはオリゴヌクレオチドプローブは長さが１８−３０ヌクレオチドの範囲にある。本発明のオリゴヌクレオチドプローブの正確な配列および長さは、部分的には該プローブが結合する標的ポリヌクレオチドの性質に左右される。結合する場所および長さは、個々の実施態様で適切なアニーリング特性および融解特性を達成するために変動するであろう。そのようなデザインの選択を実施するための手引は“Ｔａｑ−ｍａｎ”型アッセーについて述べている上記の参考文献の多くで見出されるであろう。
好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブの３’末端ヌクレオチドは封鎖するか、または核酸ポリメラーゼによる伸長を不可能にさせる。そのような封鎖は、連結部分によってオリゴヌクレオチドプローブの末端３’炭素に報知分子または消光分子を結合させることによって都合よく実施できる。
好ましくは、報知分子は、プローブの末端３’炭素または末端５’炭素に連結部分を介して結合させるために誘導した蛍光有機染料である。好ましくは、消光分子もまた有機染料であるが、これは、本発明の実施態様にしたがって蛍光性であってもなくてもよい。例えば、本発明の好ましい実施態様では消光分子は蛍光性である。一般に、消光分子が蛍光性であるにせよ、または非放射性衰退によって報知分子の転移エネルギーを単に遊離させるにせよ、消光分子の吸収バンドは実質的に報知分子の蛍光放出バンドと重なるべきである。励起した報知分子（しかし放射性エネルギーを遊離しない）のエネルギーを吸収する非蛍光性消光分子を本出願では色原体分子と呼ぶ。
個々のプローブについて適切な報知分子−消光分子対を選択するために極めて多くの手引が文献から入手できる。例を挙げれば以下の通りである：Clegg（上記に引用）;Wuら（上記に引用）;Pesceら編、蛍光分光学（Fluorescence Spectroscopy）（Marcel Dekker刊、ニューヨーク(1971)）;Whiteら、蛍光分析：実技（Fluorescence Analysis:A Practical Approach）（Marcel Dekker刊、ニューヨーク(1970)）など。文献はまた、蛍光分子および色原体分子、並びに報知分子−消光分子対を選択するための関連するそれらの光学的特性の膨大なリストを提供する参考文献を含むが、これらは例えば以下のものである:Berlman，芳香族分子の蛍光スペクトルハンドブック（Handbook of Fluorescent Spectra of Aromatic Molecules）、第２版（Academic Press刊、ニューヨーク(1971)）;Griffiths，有機分子の色と組成（colour & Constitution of Organic Molecules）（Academic Press刊、ニューヨーク(1971)）;Bishop編、インジケーター（Indicators）（Pergamon Press刊、オックスフォード(1972);Haugland，蛍光プローブと研究用化学物質ハンドブック（Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals）（Molecular Probes刊、ユージーン(1992)）;Pringsheim，蛍光と燐光（Fluorescence and Phosphorescence）（Interscience Publishers刊、ニューヨーク(1949)）など。さらに、オリゴヌクレオチドに付加することができる一般的な反応基を介して共有結合によって結合させることができる報知分子および消光分子を誘導する様々な手引が文献にある。例を挙げれば以下のとおりである：Ullmanら、米国特許第3996345号;Khannaら、米国特許第4351760号など。
代表的な報知分子−消光分子対はザンセン染料（フルオレセインを含む）およびローダミン染料から選ぶことができる。これら化合物で多くの適切な型が広く市販されているが、それらは、オリゴヌクレオチドとの結合用部位としてまたはオリゴヌクレオチドとの結合のための結合官能性として用いることができる置換基をそれらフェニール部分にもつ。蛍光化合物の別の基はナフチルアミンであり、これはアルファまたはベータ位にアミノ基をもつ。そのようなナフチルアミン化合物に含まれるものはとりわけ、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルフォネート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルフォネートおよびトルイジニル−６−ナフタレンスルフォネートである。他の染料には３−フェニル−７−イソシアナトクマリン、アクリジン（例えば９−イソチオシアナトアクリジンおよびアクリジンオレンジ）、Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾキサゾリル）フェニル）マレイミド、ベンゾオキサジアゾール、スチルベン、ピレンなどが含まれる。
好ましくは、報知分子および消光分子はフルオレセインおよびローダミン染料から選ばれる。これらの染料およびオリゴヌクレオチドに結合させる適切な連結方法は多くの文献に記載されている。例えば以下の通りである:Khannaら（上記に引用）;Marshall, Histochemical J., 7:299-303(1975);Menchenら、米国特許第5188934号;Menchenら、欧州特許出願公開公報第87310256.0号;Bergotら、国際特許出願PCT/US90/05565号。後者の４つの文献は参照により本明細書に含まれる。
多くの連結用部分並びに報知分子および消光分子をオリゴヌクレオチドの５’または３’末端に結合させる方法があるが、例を挙げれば以下の通りである:Eckstein編、オリゴヌクレオチドと類似体：実際的手技（Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach）（IRL Press刊、オックスフォード(1991)）;Zuckermanら、Nucleic Acids Research, 15:5305-5321（1987）（オリゴヌクレオチドの３’チオール基）;Sharmaら、Nucleic Acids Research, 19:3019（1991）（３’スルフヒドリル）;Giustiら、PCR Methods and Applications, 2:223-227（1993）;Fungら、米国特許第4757141号（AminolinkTMII(Applied Biosystems(Foster City, CA)より市販）を介した５’ホスホアミノ基）;Stabinsky，米国特許第4739044号（３’アミノアルキルホスホリル基）;Agrawalら、Tetrahedron Letters, 31:1543-1546（1990）（ホスホルアミデート連結による結合）;Sproatら、Nucleic Acids Research, 15:4837（1987）（５’メルカプト基）;Nelsonら、Nucleic Acids Research, 17:7187-7194（1989）（３’アミノ基）など。
好ましくは、合成中にオリゴヌクレオチドに結合させることができる市販の連結部分（例えばClontech Laboratories（パロアルト、カリフォルニア）から入手できる）が用いられる。
ローダミンおよびフルオレセイン染料はまた、ホスホルアミダイト部分とともに誘導した染料を用いて固相合成の終了時にオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシルに都合よく結合させられる（例えば、Hobbs, Jr.,米国特許第4997928号;Wooら、米国特許第5231191号）。
以下の実施例は本発明のプローブおよび該プローブを用いる方法を説明する。これらの実施例で詳述する固有のプローブ、プローブ構築物および方法の工程は限定を意図するものではない。上記以外の本発明のさらなる目的および利点は、本発明の範囲を限定することを目的としない実施例から明らかになろう。
実施例
１．オリゴヌクレオチドプローブの合成
この実施例では表１に示すオリゴヌクレオチドの合成を説明する。リンカーアームヌクレオチド（“ＬＡＮ”）のホスホルアミダイトはグレンリサーチ（Glen Research）から入手した。標準ＤＮＡホスホルアミダイト、６−カルボキシフルオレセイン（“６−ＦＡＭ”）ホスホルアミダイト、６−カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル（“ＴＡＭＲＡＮＨＳエステル”）、および３’封鎖ホスフェートを結合させるためのホスファリンク（PhosphalinkTM）はパーキン・エルマーのアプライドバイオシステムズ部門（Perkin-Elmer, Applied Biosystems Division）から入手した。オリゴヌクレオチド合成はモデル３９４ＤＮＡ合成装置（Applied Biosystems）で実施した。プライマーおよび相補性オリゴヌクレオチドはオリゴピューリフィケーションカートリッジ（Oligo Purification Cartridges, Applied Biosystems）を用いて精製した。二重標識プローブは、５’末端の６−ＦＡＭ−標識ホスホルアミダイト、オリゴヌクレオチド配列内のＴの１つを置換したＬＡＮおよび３’末端のホスファリンクを用いて合成した。脱保護とエタノール沈澱に続いて、２５０ｍＭの重曹緩衝液（ｐＨ9.0）で室温でＬＡＮ−含有オリゴヌクレオチドとＴＡＭＲＡＮＨＳエステルを共役させた。未反応染料をＰＤ−１０セファデックスカラムに通して除去した。最後に、二重標識プローブを標準的プロトコルによって調製用ＨＰＬＣで精製した。下記に表１の配列とＬＡＮ−ＴＡＭＲＡ部分の位置を示すことによってプローブの名称を表示する。例えば、プローブＡ１−７は、５’末端から７位のヌクレオシドにＬＡＮ−ＴＡＭＲＡを有するＡ１配列をもつ。
２．固形支持体に結合させたオリゴヌクレオチドプローブの合成
高架橋ポリスチレン（１０００Å）および孔制御ガラス（ＣＰＧ）（５００Å）の両方を固形支持体マトリックスとして用いる。スペーサー（化合物５）の官能基付加は表２に示す。スペーサーのポリスチレンおよびＣＰＧ支持体への結合、および該固形支持体のＴＡＭＲＡ染料による標識は表３および表４にそれぞれ示す。
表２は、ＣＰＧおよびポリスチレン支持体を誘導するために用いられるスペーサー（化合物５）の合成の反応模式図を示す。表２に示すように、ＤＭＦ中のＨＯＢＴ／ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡの存在下でＮ−Ｆｍｏｃ−ε−アミノカプロン酸をＤＬ−ホモセリンと反応させ（Knorrら、Tetrahedron Lett.,30:1927(1989)）、６５％の収量で化合物２を生じた。ピリジン中のＤＭＡＰの存在下で化合物２を塩化ジメトキシトリチルと反応させ、クロマトグラフィー後に７２％の収量で化合物３を得た。ＤＭＦ中のＨＯＢＴ／ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡの存在下で化合物３を極めて過剰のＰＥＧ−ジアミンで処理し（Buckmannら、Biotech. Appl. Biochem., 9:258(1987)）、６０％の収量でアミン４を得た。続いてアミン４をＣＨ2Ｃｌ2中の無水コハク酸／Ｅｔ3Ｎ／ＤＭＡＰで処理してアミン４を９０％収量でスクシネート５に変換した。さらに、このスクシネート５をさらに精製することなくポリスチレンおよびＣＰＧ支持体に表３および表４にそれぞれ示したように結合させた。
表３および表４に示したように、ＤＭＦ中のＨＯＢＴ／ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡの存在下でスクシネート５をポリスチレンおよびＣＰＧ支持体と別々に反応させ、それぞれ官能基付加支持体６（５μｍｏｌ／ｇローディング）および官能基付加支持体８（１５μｍｏｌ／ｇローディング）を提供した。支持体６および８をＤＭＦに２０％のピペリジンで処理することによって支持体結合スペーサーからＦｍｏｃを除去した（Fieldsら、J. Peptide Res. 35:161(1990)）アミンを得、これをＴＡＭＲＡＮＨＳエステルで処理してそれぞれＴＡＭＲＡ標識支持体７および９を得た。トリチル陽イオン分析でポリスチレンおよびＣＰＧ支持体は最終ローディングがそれぞれ4.８μｍｏｌ／ｇおよび１４μｍｏｌ／ｇであることが分かった。
二重標識ＴａｑｍａｎプローブをＴＡＭＲＡ標識支持体７および９の両方、FastPhoramidite（ユーザーブリテン85号、Perkin Elmer Corporation 1994）並びにＦＡＭホスホルアミダイト（ユーザーブリテン78号、Perkin Elmer Corporation 1994）を４０ナノモルの規模で用いて合成した。６５℃で３時間、ＭｅＯＨ：ｔ−ＢｕＮＨ2：Ｈ2Ｏ（１：１：２）で処理して支持体結合オリゴヌクレオチドを脱保護した（Wooら、米国特許5231191号）。液体を除去し、プローブを含む支持体をＨ2Ｏ：ＭｅＯＨ（３：１）およびＭｅＯＨで洗浄した。続いて支持体を真空下で乾燥させハイブリダイゼーションアッセーに用いた。
実験例：
化合物２：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（1.１ｇ、1.４８ｍｌ、8.５２mmol）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾル（４２０ｍｇ、3.１mmol）および（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾル−１−イル）１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（1.１７ｇ、3.１mmol）をＤＭＦ（３０ｍｌ）中のＮｆｍｏｃ−ε−アミノカプロン酸（１ｇ、2.８４mmol）の攪拌溶液に室温で添加した。１５分後、ＤＬ−ホモセリン（1.３５ｇ、１1.３６mmol）を反応混合物に加えた。３時間後、減圧下でＤＭＦを除去した。残留物をＣＨＣｌ3（１００ｍｌ）に溶解し、５％塩酸（２×５０ｍｌ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ4上で乾燥させ、蒸発させて濃厚な油を得てエーテルで粉末化し無色の固形物を得た（８４０ｍｇ、６５％）。生成物を高圧下に２４時間放置し、さらに精製することなく次の工程に用いた。
化合物３：塩化４，４’−ジメトキシトリチル（４８４ｍｇ、1.４３mmol）および４−ジメチアミノピリジン（２５ｍｇ、0.２mmol）をピリジン（１５ｍｌ）中の化合物２（５００ｍｇ、1.１mmol）の攪拌溶液に窒素雰囲気下で室温で加えた。１４時間後、ピリジンを除去し、残留物をＣＨＣｌ3（７０ｍｌ）に溶解した。有機層を５％クエン酸（１×５０ｍｌ）、Ｈ2Ｏ（１×５０ｍｌ）および飽和ブライン（１×５０ｍｌ）で抽出した。有機層をＭｇＳＯ4上で乾燥させ、蒸発させて黄色の泡沫を得た。生成物をＣＨＣｌ3−ＭｅＯＨ勾配（０−１０％ＭｅＯＨ）で溶出させながらシリカゲルカラムで精製した。適切な分画を合わせて、蒸発させ無色泡沫として化合物３を得た（６００ｍｇ、７２％）。
化合物４：ポリ（エチレングリコール）ビス（２−アミノエチルエーテル）（3.１６ｇ、5.３mmol）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチレンアミン（２０５ｍｇ、0.２７ｍｌ、1.５９mmol）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾル（７８ｍｇ、0.５８mmol）および（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾル−１−イル）−１，１，３，３，−テトラメチルウノニウムヘキサフルオロホスフェート（２２０ｍｇ、0.５８mmol）を、ＤＭＦ（１０ｍｌ）中の化合物３（４００ｍｇ、0.５３mmol）の攪拌溶液に室温で添加した。減圧下でＤＭＦを除去し、残留物をＣＨＣｌ3（７０ｍｌ）に溶解し、有機層をＨ2Ｏ（１×５０ｍｌ）および飽和ブライン（２×５０ｍｌ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ4上で乾燥させ、蒸発させて濃厚な油を得た。化合物４をＣＨＣｌ3−ＭｅＯＨ勾配（５−１５％ＭｅＯＨ）で溶出させながらシリカゲルカラムで精製し無色ガラス（４２３ｍｇ、６０％）とした。
化合物５：無水コハク酸（２２ｍｇ、0.２２mmol）、Ｅｔ3Ｎ（２３ｍｇ、0.３μｌ、0.２２mmol）、４−ジメチルアミノピリジン（１４ｍｇ、0.１１mmol）をＣＨ2Ｃｌ2（１５ｍｌ）中の化合物４（３００ｍｇ、0.２２mmol）の溶液に添加した。反応混合物を室温で３時間攪拌した。この反応混合物をＣＨＣｌ3（３０ｍｌ）で希釈し、５％クエン酸（１×５０ｍｌ）および飽和ブライン（２×５０ｍｌ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ4上で乾燥させ、蒸発させて無色の泡沫（２８４ｍｇ、９０％）を得た。これをさらに精製することなく固形支持体の誘導に用いた。
ＴＡＭＲＡ染料によるポリスチレン支持体の誘導体形成：ＤＭＦ（１０ｍｌ）中の化合物５（１７ｍｇ、１２μｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾル（1.８ｍｇ、１２μｍｏｌ）、（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾル−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウオニウムヘキサフルオロホスフェート（4.８ｍｇ、１２μｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６μｌ、３０μｍｏｌ）で高架橋ポリスチレン（１０００Å、１０μｍｏｌ／ｇアミンローディング、１ｇ、１０μｍｏｌ）を室温で４時間リストアクションシェーカーで処理した。この支持体をＤＭＦ（３×１０ｍｌ）、ＣＨ3ＣＮ（２×１０ｍｌ）およびＣＨ2Ｃｌ2（１×１０ｍｌ）で洗浄し、強真空下で一晩乾燥させた。ニンヒドリンアッセーによって１μｍｏｌ／ｇのアミンが残っているのが分かった。トリチル陽イオンアッセーは化合物５の５μｍｏｌ／ｇローディングを示した。この支持体をＴＨＦ中の無水酢酸／ルチジン（１０％溶液、５ｍｌ）およびＴＨＦ中の１−メチルイミダゾル（１６％溶液、５ｍｌ）で２時間室温で処理した。支持体をＣＨ3ＣＮ（３×１０ｍｌ）およびＣＨ2Ｃｌ2（１×１０ｍｌ）で洗浄した。支持体をＤＭＦ中の２０％ピペリジン（３×１０ｍｌ）で処理しＦｍｏｃ保護基を除去した。Ｆｍｏｃ基の除去は３０２ｎｍで溶液のＵＶを測定することによってモニターした。支持体をＤＭＦ（３×１０ｍｌ）で洗浄し、続いてＴＡＭＲＡＮＨＳエステル（１５ｍｇ、２７μｍｏｌ）およびＤＭＦ（１０ｍｌ）中のＥｔ3Ｎ（５０μｍｏｌ）で４２時間シェーカー上で処理した。支持体をＤＭＦ（３×１０ｍｌ）、ＣＨ3ＣＮ（２×１０ｍｌ）およびＣＨ2Ｃｌ2（１×１０ｍｌ）で洗浄し、強真空下で２４時間乾燥させた。ニンヒドリンテストによって0.５μｍｏｌ／ｇ未満のアミンが残っているのが分かった。支持体をＴＨＦ中の無水酢酸／ルチジン（１０％溶液、５ｍｌ）およびＴＨＦ中の１−メチルイミダゾル（１６％溶液、５ｍｌ）で１時間室温で処理し、続いてＣＨ3ＣＮ（３×１０ｍｌ）およびＣＨ2Ｃｌ2（２×１０ｍｌ）で洗浄して強真空下で２４時間乾燥させた。トリチル陽イオンアッセーは4.８μｍｏｌ／ｇの最終ローディングを示した。
ＴＡＭＲＡ染料によるＣＰＧ支持体の誘導体形成：ＣＰＧ（５００Å、４０μｍｏｌ／ｇアミンローディング、５００ｍｇ、２０μｍｏｌ）、化合物５（３１ｍｇ、２２μｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾル（5.９ｍｇ、２２μｍｏｌ）、（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾル−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウオニウムヘキサフルオロホスフェート（8.４ｍｇ、２２μｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１0.４μｌ、６０μｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍｌ）中の混合物をリストアクションシェーカーで４時間室温で震盪した。この支持体をＤＭＦ（３×１０ｍｌ）、ＣＨ3ＣＮ（２×１０ｍｌ）およびＣＨ2Ｃｌ2（１×１０ｍｌ）で洗浄し、強真空下で一晩乾燥させた。ニンヒドリンアッセーによって４μｍｏｌ／ｇのアミンが残っているのが分かった。トリチル陽イオンアッセーは。ＣＰＧ上に化合物５の１５μｍｏｌ／ｇのローディングを示した。この支持体をＴＨＦ中の無水酢酸／ルチジン（１０％溶液、５ｍｌ）およびＴＨＦ中の１−メチルイミダゾル（１６％溶液、５ｍｌ）で２時間室温で処理した。支持体をＣＨ3ＣＮ（３×１０ｍｌ）およびＣＨ2Ｃｌ2（１×１０ｍｌ）で洗浄した。支持体をＤＭＦ中の２０％ピペリジン（３×１０ｍｌ）で処理しＦｍｏｃ保護基を除去した。Ｆｍｏｃ基の除去は３０２ｎｍで溶液のＵＶを測定することによってモニターした。支持体をＤＭＦ（３×１０ｍｌ）で洗浄した。支持体を続いてＴＡＭＲＡＮＨＳエステル（２５ｍｇ、４５μｍｏ１）およびＤＭＦ（５ｍｌ）中のＥｔ3Ｎ（９０μｍｏｌ）で４２時間シェーカー上で処理した。支持体をＤＭＦ（３×１０ｍｌ）、ＣＨ3ＣＮ（２×１０ｍｌ）およびＣＨ2Ｃｌ2（１×１０ｍｌ）で洗浄し、強真空下で２４時間乾燥させた。ニンヒドリンテストによって１μｍｏｌ／ｇ未満のアミンが残っているのが分かった。支持体をＴＨＦ中の無水酢酸／ルチジン（１０％溶液、５ｍｌ）およびＴＨＦ中の１−メチルイミダゾル（１６％溶液、５ｍｌ）で１時間室温で処理し、続いてＣＨ3ＣＮ（３×１０ｍｌ）およびＣＨ2Ｃｌ2（２×１０ｍｌ）で洗浄して強真空下で２４時間乾燥させた。トリチル陽イオンアッセーは１４μｍｏｌ／ｇの最終ローディングを示した。
ＦＡＭおよびＴＡＭＲＡ二重標識プローブの合成：ＴＡＭＲＡ標識支持体７および９、ＤＮＡFastPhosphoramiditeおよびＦＡＭを４０ｎｍｏｌ規模で用いて二重染料標識プローブを合成した。合成終了後、プローブを含む支持体を４ｍｌのガラスバイアルに移し、ＭｅＯＨ：ｔ−ＢｕＮＨ2：Ｈ2Ｏ（１：１：２）の混合物で３時間６５℃で処理した。注射筒で液体を除去し、支持体をＨ2Ｏ：ＭｅＯＨ（３：１）およびＭｅＯＨで洗浄した。真空下で支持体を乾燥させハイブリダイゼーションアッセーに用いた。
３．オリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションアッセー
ヒトβ−アクチン遺伝子のエクソン３の２９５塩基対セグメント（S. Nakajima-Iijima(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6133-6137(1985))が開示したヌクレオチド２１４１−２４３５）は、１０ｍＭトリスーＨＣｌ（ｐＨ8.３）、５０ｍＭＫＣｌ、４ｍＭＭｇＣｌ2、３００ｍＭのプライマーＡＦＰ（配列番号：７）、３００ｎＭのプライマービオチン−ＡＲＰ（５’末端にビオチンを結合させた配列番号：８）、２００μＭｄＡＴＰ、２００μＭｄＣＴＰ、２００μＭｄＧＴＰ、２００μＭｄＴＴＰおよび1.２５単位のＡｍｐｌｉＴａｑ（Perkin-Elmer）を含む５０μｌの反応物を用いて増幅できる。反応は２０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡの存在下（＋鋳型）または非存在下（−鋳型）で実施される。
５０℃（２分）；９５℃（１０分）；さらに９５℃（２０秒）続いて６０℃（１分）の４０サイクルという温度循環の後、各サンプルに２００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（５×ＳＳＣ、８％（ｖ／ｖ）ギ酸アミド、８％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００）を添加して希釈する。生じたサンプルをストレプトアビジン被覆９６穴（ウェル）のマイクロタイタープレート（Xenopore Corp.,サッドルブルック、ニュージャージー）に移し、増幅β−アクチンＤＮＡセグメントを捕捉するために３７℃で３０分保温した。続いて各ウェルを３５０μｌの燐酸緩衝食塩水／0.０５％トゥイーン−２０で洗浄した。一切の非ビオチン化ＤＮＡを１００μｌの0.１ＭＮａＯＨ／１ｍＭＥＤＴＡを添加することによって除去し、室温で５分保温し、３５０μｌの燐酸緩衝食塩水／0.０５％トゥイーン−２０で洗浄する。続いて、プローブＡ１−２６（配列番号：９、ヌクレオチド１−２６（Ａ１−２６）、報知分子ＦＡＭおよび消光分子ＴＡＭＲＡで標識）を１００ｎＭ含むハイブリダイゼーション緩衝液の５０μｌを加え、３７℃で３０分保温する。
続いて、パーキン・エルマータックマン（Perkin-Elmer TaqMan）ＬＳ−５０Ｂシステムを用いて５１８ｎｍおよび５８２ｎｍで蛍光を測定する。続いて実施例５で述べるようにΔＲＱを算出する。ΔＲＱの大きさはＡ１−２６プローブのハイブリダイゼーションのレベルを示し、したがって各ウェルに捕捉された増幅β−アクチンＤＮＡセグメント量の大きさである。
４．固形支持体に結合させたオリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼーションアッセー
３通りのプローブ／固形支持体組み合わせを調べた：Ａ１−ＰＳ：ポリスチレン支持体に結合させたＡ１（配列番号：９）；Ａ１−ＣＰＧ：ガラス支持体に結合させたＡ１（配列番号：９）；およびＧ１−ＰＳ：ポリスチレン支持体に結合させたＧ１（配列番号：１３）。
３つのプローブは全て当該配列の５’末端にＦＡＭが結合され、ＴＡＭＲＡは３’末端に結合されている。５０μｌの１×ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.３）、５０ｍＭＫＣｌ、3.５ｍＭＭｇＣｌ2）中に各プローブ／固形支持体を懸濁させることによって鋳型無し反応を調製した。鋳型＋反応のためには、Ａ１−ＰＳおよびＡ１−ＣＰＧを５０μｌの１×ＰＣＲ緩衝液＋１μＭのＡ１Ｃに懸濁し、Ｇ１−ＰＳを５０μｌの１×ＰＣＲ緩衝液＋１μＭのＧ１Ｃに懸濁した。
反応物を９５℃で１分保温し、続いて室温まで徐冷した。各懸濁物の一部を顕微鏡スライドに載せた。各サンプルを４８８ｎｍ光で励起し、５１８ｎｍまたは５８３干渉フィルターのいずれかを用いて蛍光像をＣＣＤアレー上で捕捉した。この像の分析は、５１８ｎｍ像の最大ピクセル値を見つけ、続いて同じピクセルについての５８３ｎｍ値を見つけることによって実施した。緩衝液で得られたバックグラウンドの読みを差し引くことによってピクセル値を修正した。表５は表示したプローブの蛍光測定値の結果を示す。
５．オリゴヌクレオチドプローブを用いたＰＣＲ増幅をモニターする方法
全てのＰＣＲ増幅はパーキン・エルマーサーモサイクラー９６００で実施し、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.３）、５０ｍＭＫＣｌ、２００μＭｄＡＴＰ、２００μＭｄＣＴＰ、２００μＭｄＧＴＰ、４００μＭｄＵＴＰ、0.５単位のAmpEraseTMウラシルＮ−グリコリアーゼ（Perkin-Elmer）および1.２５単位のAmpliTaqTM（Perkin-Elmer）を含む５０μｌ反応物を用いた。ヒトβ−アクチン遺伝子のエクソン３の２９５塩基対セグメント（S. Nakajima-Iijima(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6133-6137(1985))が開示したヌクレオチド２１４１−２４３５）を以下に挙げたＡＦＰおよびＡＲＰプライマーを用いて増幅した。増幅反応物は、４ｍＭＭｇＣｌ2、２０ｎｇヒトゲノムＤＮＡ、５０ｎＭＡ１またはＡ３プローブおよび各プライマー３００ｎＭを含んでいた。温度処理は以下の通りであった：５０℃（２分）；９５℃（１０分）；９５℃（２０秒）、６０℃（１分）の４０サイクルおよび７２℃での保持。５１５塩基対セグメントは、ベクターｐＵＣ１１９のＳｍａＩ部位に挿入されたλＤＮＡのセグメント（ヌクレオチド３２、２２０−３２、７４７）から成るプラスミドで増幅した。これらの反応物は3.５ｍＭＭｇＣｌ2、１ｎｇのプラスミドＤＮＡ、５０ｎＭのＰ２またはＰ５プローブ、２００ｎＭのプライマーＦ１１９および２００ｎＭのプライマーＲ１１９を含んでいた。温度処理は以下の通り：５０℃（２分）；９５℃（１０分）；９５℃（２０秒）、５７℃（１分）の２５サイクル；および７２℃での保持。
各増幅反応物について、４０μｌを９６ウェルの白色マイクロタイタープレート（Perkin-Elmer）の個々のウェルに移した。蛍光はパーキン・エルマータックマン（登録商標）ＬＳ−５０Ｂシステムで測定したが、このシステムは、プレート読み取り装置部、４８５ｎｍ励起フィルターおよび５１５ｎｍ発光フィルターをもつルミネッセンス分光計から成る。励起は、５ｎｍのスリット幅を用いて４８８ｎｍで実施した。発光は、６−ＦＡＭ（報知分子、またはＲバルブ）については５１８ｎｍで、ＴＡＭＲＡ（消光分子またはＱバルブ）については５８２ｎｍで１０ｎｍのスリット幅を用いて測定した。ＰＣＲ中の切断による報知分子発光の増加を求めるために、３つの標準化を未処理発光データに用いた。第一に、緩衝液ブランクの発光強度を各波長について差し引いた。第二に、報知分子の発光強度を消光分子の発光強度で割って、各反応試験管についてＲＱ比を出した。これによって、個々のウェルについてのプローブ濃度の変動と蛍光測定値の変動が標準化される。最後に、鋳型を含まないコントロールのＲＱ値（ＲＱ-）を鋳型を含む完全な反応物のＲＱ値（ＲＱ+）から差し引いてΔＲＱを算出する。
３組のプローブ対をＰＣＲアッセーでテストした。各対について、１方のプローブは内部ヌクレオチドに結合したＴＡＭＲＡをもち、他方は３’末端ヌクレオチドに結合したＴＡＭＲＡをもつ。結果は表６に示す。３組全てについて、３’消光分子をもつプローブは、内部消光分子をもつものよりも顕著に高いΔＲＱ値を示す。
表７は、一本鎖および二本鎖状態における表示プローブの蛍光測定の結果を示す。オリゴヌクレオチドの対立する末端に報知分子および消光分子をもつプローブでは、ハイブリダイゼーションはＲＱの劇的な増加をもたらす。
前述した本発明の好ましい実施態様は実例と説明のために提供し、開示した厳密な形態に限定することを目的とするものではない。当業者には多くの修飾および変形が明らかであろう。本発明の範囲は以下の請求の範囲およびその同等物によって範囲が定まる。
〔配列表〕
（2）配列番号：１：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：24ヌクレオチド
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：１；
（2）配列番号：２：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：26ヌクレオチド
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：２：
（2）配列番号：３：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：27ヌクレオチド
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：３：
（2）配列番号：４：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：31ヌクレオチド
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：４：
（2）配列番号：５：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：28ヌクレオチド
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：５：
（2）配列番号：６：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：31ヌクレオチド
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：６：
（2）配列番号：７：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：25ヌクレオチド
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：７：
（2）配列番号：８：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：25ヌクレオチド
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：８：
（2）配列番号：９：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：26ヌクレオチド
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：９：
（2）配列番号：１０：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：30ヌクレオチド
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：１０：
（2）配列番号：１１：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：24ヌクレオチド
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：１１：
（2）配列番号：１２：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：28ヌクレオチド
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：１２：
（2）配列番号：１３：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：ヌクレオチド
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：１３：
（2）配列番号：１４：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：30ヌクレオチド
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：１４：
発明の分野
本発明は、一般に、蛍光報知分子と蛍光消光分子とを含む蛍光プローブに関する。より具体的には、本発明は、ハイブリダイゼーションアッセーおよび核酸増幅反応（特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））で用いることができる蛍光報知分子と蛍光消光分子とを含む蛍光プローブに関する。
関連分野の説明
生物学的事象をモニターするために、互いに分離されているか、または互いに最小の消光距離に配置された蛍光報知分子と消光分子を基本とする蛍光報知分子−消光分子対がオリゴヌクレオチドプローブに組み込まれた。例えば、報知分子の蛍光強度が該報知分子と該消光分子とを切り離すことによって高められるプローブが開発された。また、消光分子が報知分子の近傍に配置されることによって蛍光が消失するプローブも開発された。これらの報知−消光分子対プローブは、該報知分子が発生する蛍光シグナルの出現または消失のいずれかをモニターすることによって、ハイブリダイゼーションアッセーおよび核酸増幅反応（特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））の追跡に使用された。
本明細書で用いられるように、報知分子は蛍光シグナルを発生させることができる分子である。消光分子は、励起した報知分子の蛍光エネルギーを吸収し、それによって本来ならば励起した報知分子から遊離されるはずであった蛍光シグナルを消光させることができる分子である。消光分子が励起した発蛍光団を消光させるためには該消光分子は、蓄積された蛍光エネルギーを報知分子が遊離する前のある時期に励起報知分子について最小消光距離内に存在しなければならない。
報知分子−消光分子対を含むプローブがハイブリダイゼーションアッセー用に開発されたが、この場合該プローブはヘアピン構造を形成する。すなわちこの場合には、該プローブは、ヘアピン構造の形成を妨げる相補的核酸配列が存在しないときそれ自身とハイブリダイズし、該報知分子の近傍に消光分子が配置されるようなループを形成する（WO90/03446；欧州特許出願公開公報第0601889A2号）。相補的な標的配列が存在する場合、該相補的標的配列へのプローブのハイブリダイゼーションによってヘアピン構造が破壊され、該消光分子が該報知分子にもはや十分に接近できず該報知分子を消光することができない構造をこのプローブに受容させる。結果として、該プローブは、標的配列とハイブリダイズした場合はハイブリダイズしない場合よりも強い蛍光シグナルをもたらす。ヘアピン構造を含むプローブは、そのようなプローブはデザインが困難であるということ、さらに標的配列とプローブとのハイブリダイゼーションに干渉する可能性があるという欠点をもつ。
２つの別々のプローブ（１つは報知分子を含み、他方は消光分子を含む）を用いてヘアピン構造の存在を見分けるアッセーもまた開発された（Mergneyら、Nucleic Acids Research, 22:6 920-928(1994)）。これらのアッセーでは、報知分子の蛍光シグナルは、消光分子が報知分子の近傍に配置されるために標的配列にハイブリダイズしたとき減少する。
報知分子−消光分子対を含むプローブの特に重要な応用の１つは、核酸増幅反応（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））で標的核酸配列の存在および増幅を検出するためにそれらを使用することである。一般に、核酸増幅技術は遺伝学的検査およびＤＮＡ分析に通じる幅広い新規な研究方法を提供した（Arnheim & Erlich, Ann. Rev. Biochem., 61:131-156(1992)）。特にＰＣＲは、例えばクローニング、遺伝的発現の分析、ＤＮＡ配列決定、遺伝学地図の作製および薬剤の発見の分野で応用される極めて重要な研究手段となった（Arnheim & Erlich, Ann. Rev. Biochem., 61:131-156(1992);Gillilandら、Proc. Natl. Acad. Sci., 87:2725-2729(1990);Bevanら、PCR Methods and Applications, 1:222-228(1992);Greenら、PCR Methods and Applications, 1:77-90(1991);Blackwellら、Science, 250:1104-1110(1990)）。
核酸増幅技術の利用の広がりによって、様々な環境下で増幅反応を実施するための手段の開発が促進された。そのような機器の開発で重要なデザイン目標には、精密な温度制御、多サンプル用温度循環におけるサンプル間変動の最小化、反応前および反応後処理工程の自動化、高速温度循環、サンプル量の最小化、増幅生成物のリアタイム測定および交差夾雑の最小化（例えば“サンプルの持ち越し”のために生じる）が含まれる。特に、閉鎖反応チャンバーでの増幅の実施およびリアルタイムモニターを可能にする機器のデザインは、交差夾雑を防ぐために大いに望まれるところである（Higuchiら、Biotechnology, 10:413-417(1992)および11:1026-1030(1993);Hollandら、Proc. Natl. Acad. Sci., 88:7276-7280(1991)）。明らかに、そのようなデザイン目標の達成は、例えば“サンプル持ち越し”のために生じる高頻度の偽陽性および偽陰性が増幅処理の意義を大きく減退させる診断用サンプルの分析で特に望まれる。のみならず、増幅反応をリアルタイムでモニターすることによって多重標的増幅反応における出発標的ＤＮＡ濃度のはるかに正確な定量が可能になる。なぜならば、反応時の相対濃度値の流れを考慮することによって近似濃度の相対値を解析することができるからである。リアルタイムモニタリングはまた増幅反応効率の評価を可能にするが、これによって反応抑制物がサンプル中に存在するか否かが示される。
ホーランド（Holland）らの上掲書、米国特許第５２１００１５号（Gelfandら）および他の研究者らは、ＰＣＲ時の増幅生成物のリアルタイム測定を提供するために蛍光による手段を提唱した。そのような手段は、存在する二重鎖ＤＮＡ量の表示のために挿入染料（例えば臭化エチジウム）を用いるか、または蛍光−消光分子対を含むプローブ（また“Ｔａｑ−Ｍａｎ”アプローチと呼ぶ）を用いた。後者の場合、プローブは増幅時に切断され、その濃度が存在する二重鎖ＤＮＡ量に比例する蛍光分子を遊離する。増幅時に、このプローブは、標的配列にハイブリダイズするときポリメラーゼのヌクレアーゼ活性によって消化され、消光分子から蛍光分子を遊離させて、それによって報知分子に由来する蛍光が出現する。
図１に示すＴａｑ−Ｍａｎアプローチは、標的ポリヌクレオチドの“下流領域”（すなわちプライマー結合部位の伸長方向）に特異的にやきもどし（アニール）される報知分子−消光分子対を含むオリゴヌクレオチドプローブを用いる。この報知分子および消光分子は互いに十分接近して配置され、それによって報知分子が励起されると常にこの励起状態エネルギーは消光分子に非放射性に伝えられ、該エネルギーは非放射性に消失するか、または報知分子の発光周波数と異なる周波数で放出される。ＤＮＡポリメラーゼによって鎖が伸長している間プローブは鋳型とアニールし、このプローブはポリメラーゼの５’→３’エクソヌクレアーゼ活性によって消化される。プローブが消化される結果、この報知分子は効果的に消光分子から分離され、それによって消光分子はもはや報知分子の蛍光を消光できるほど十分に報知分子に接近することができない。したがって、増幅時にプローブが消化されればされるほど、溶液中の報知分子数は増加し、結果として非消光報知分子数が増す結果となり蛍光シグナルはますます強くなる。
ハイブリダイゼーションアッセーおよび増幅アッセーでは３つの主要な要因が報知分子−消光分子対プローブの有用性に影響を与える。第一の要因は、報知分子を消光するプローブ上の消光分子の有効性である。本明細書で“ＲＱ-”と称するこの第一の要因は、プローブが相補的ポリヌクレオチドとハイブリダイズしないときの消光分子に対する報知分子の蛍光放出比によって表すことができる。すなわち、ＲＱ-は、オリゴヌクレオチドプローブが一本鎖状態の場合の消光分子の蛍光に対する報知分子の蛍光放出の比である。ＲＱ-値に対する影響は、例えば、用いられる特定の報知分子および消光分子、報知分子と消光分子との間の間隔の取り方、ヌクレオチド配列特異的効果、報知分子と消光分子が結合している構造物（例えばリンカー）の可撓性の度合い、および不純物の存在を含む（Woら、Anal. Biochem., 218:1-13(1994);Clegg, Meth. Enzymol., 211:353-388(1992)）。相対量ＲＱ+は、オリゴヌクレオチドプローブが相補的ポリヌクレオチドとハイブリダイズしたときの消光分子に対する報知分子の蛍光放出比を指す。
第二の要因はプローブが相補的ポリヌクレオチドとハイブリダイズする効率である。この第二の要因は、プローブの融解温度（Ｔm）、プローブまたは標的ポリヌクレオチドの二次構造の有無、アニーリングの温度および他の反応条件に左右される。
第三の要因は、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エクソヌクレアーゼ活性が結合プローブを報知分子と消光分子との間で切断する効率である。この効率は、報知分子または消光分子のプローブの５’末端との近さ、報知分子または消光分子の“かさ（bulkiness）”およびプローブと標的ポリヌクレオチドとの相補性の度合いに左右される（Leeら、Nucleic Acids Research, 21:3761-3766(1993)）。
消光は報知分子と消光分子との物理的近さに左右されるので、以前は、該消光分子が報知分子を消光できる最大の距離（これは一般には約６−１６ヌクレオチド）を越えずに常に消光分子が存在するように、消光分子と報知分子がプローブに結合している必要があると考えられていた（Leeら、Nucleic Acids Research, 22:920-928(1994);Cardulloら、Proc. Natl. Acad. Sci., 85:8790-8794(1988);Cleggら、Proc. Natl. Acad. Sci., 90:2994-2998(1993);Ozakiら、Nucleic Acids Research, 20:5250-5214(1992)）。報知分子と消光分子との間のこの短い分離は、典型的には、１組の報知分子−消光分子対をプローブの３’または５’末端に結合させ、さらに他の組を６−１６ヌクレオチド離れた内部塩基に結合させることによって達成できる。
内部塩基に報知分子または消光分子を結合させることに付随する少なくとも２つの重大な短所が存在する。報知分子または消光分子を内部ヌクレオチドに結合させることは、末端ヌクレオチドに分子を結合させる場合に必要とされるよりももっと困難な化学操作を必要とする。さらに、報知分子または消光分子の内部ヌクレオチドとの結合はプローブのハイブリダイゼーション効率に悪影響を及ぼすであろう（Wardら、米国特許第5328824号;Ozakiら、Nucleic Acids Research, 20:5250-5214(1992)）。
現時点で、ハイブリダイゼーションアッセーおよび核酸増幅アッセーで使用できる蛍光報知分子と消光分子を含む有効なオリゴヌクレオチドプローブが希求される。したがって、標的核酸配列にハイブリダイズしたか、またはハイブリダイズしていない場合に識別可能な蛍光特性を表示するプローブが希求される。さらに、消光分子が報知分子の蛍光を効果的に消光できるように報知分子と消光分子がプローブ上に配置されたプローブもまた希求される。さらに、効率よく合成できるプローブもまた希求される。さらにまた、報知分子と消光分子がプローブのハイブリダイゼーション効率に悪影響を与えないようにプローブ上に配置させることが可能な報知分子および消光分子が希求される。上記の目的および更なる目的は本発明のプローブおよび方法によって提供される。
発明の要旨
本発明は、蛍光報知分子および該報知分子の蛍光を消光することができる消光分子を含むオリゴヌクレオチドプローブに関する。本発明にしたがえば、このオリゴヌクレオチドプローブは、ハイブリダイズしていない場合は該オリゴヌクレオチドが少なくとも一本鎖の形状で存在するように構築され、この場合該消光分子は報知分子の蛍光を消光することができるように該報知分子に十分近接して存在する。該オリゴヌクレオチドプローブはまた、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズした場合は少なくとも１つの構造で存在し、この構造では該消光分子の位置は報知分子の蛍光を消光することができるほど十分近接していない。これらのハイブリダイズ済み構造および未ハイブリダイズ構造をとることによって、プローブ上の報知分子および消光分子は、プローブがハイブリダイズした場合およびハイブリダイズしていない場合に異なる蛍光シグナル強度を示す。結果として、報知分子、消光分子またはその合体したものがもつ蛍光強度の変化を基にしてプローブがハイブリダイズしたか、またはハイブリダイズしていないかを決定することができる。さらに、プローブがハイブリダイズしていない場合、消光分子が報知分子を消光するようにプローブをデザインすることができるので、プローブがハイブリダイズするかまたは消化されるまで限定された蛍光を報知分子が表示するようにプローブをデザインすることが可能である。
本発明にしたがえば、プローブが標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするとき、報知分子の蛍光強度は好ましくは消光分子の蛍光強度よりも大きい。より好ましくは、プローブが標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするとき、報知分子の蛍光強度は消光分子の蛍光強度よりも少なくとも約３．５倍大きい。
好ましくはまた、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブの蛍光強度は、標的とハイブリダイズしないときのオリゴヌクレオチドプローブの蛍光強度より係数で少なくとも約６倍強い。
報知分子は、消光分子から好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１８ヌクレオチド離れている。報知分子は、好ましくは約１５から６０ヌクレオチド、より好ましくは約１８から３０ヌクレオチド消光分子から離れている。
報知分子は好ましくはプローブの３’または５’末端ヌクレオチドのいずれかと結合している。消光分子はまた好ましくはプローブの３’または５’末端ヌクレオチドのいずれかと結合している。より好ましくは、報知分子および消光分子は、プローブの３’および５末端または５’および３’末端ヌクレオチドにそれぞれ結合している。
報知分子は好ましくはフルオレセイン染料であり、消光分子は好ましくはローダミン染料である。
ある実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは固形支持体に固定されている。このオリゴヌクレオチドプローブは固形支持体に、例えば該固形支持体へのプローブの３’または５’末端ヌクレオチドの結合によって直接結合させてもよい。しかしながら、より好ましくは、プローブはリンカーによって固形支持体に結合される。このリンカーは固形支持体からプローブを遠ざけるために役立つ。最も好ましくは、リンカーは長さが少なくとも３０原子、より好ましくは長さが少なくとも５０原子である。
オリゴヌクレオチドプローブを固形支持体に結合させるために用いられる多様なリンカーが当該技術分野で知られている。最も好ましくは、該リンカーは官能基付加ポリエチレングリコールを含むが、その理由は、標的オリゴヌクレオチドとプローブとのハイブリダイゼーションに著しい干渉を示さないこと、市販されていること、有機および水性媒体の両方に可溶であること、官能基の付加が容易なこと、さらにオリゴヌクレオチド合成条件と合成後条件の下で全く安定であることである。
好ましくは、固形支持体、リンカーおよびプローブ間の連結は、高温の塩基性条件下での塩基保護基の除去時に切断されない。好ましい連結の例にはカルバメートおよびアミド連結が含まれる。
本発明はまた、標的ポリヌクレオチドを検出するためにハイブリダイゼーションプローブとしてオリゴヌクレオチドプローブを使用することに関する。したがって、本発明は、サンプル中の標的ポリヌクレオチドの有無を検出するハイブリダイゼーションアッセーに関する。本方法のある実施態様では、該ハイブリダイゼーションプローブは固形支持体に固定される。
本方法にしたがえば、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、ハイブリダイゼーションに都合のよい条件下でポリヌクレオチドサンプルと接触させられる。サンプルと接触させる前および後での報知分子の蛍光シグナルが比較される。プローブ上の報知分子は標的配列とハイブリダイズしたときにより強い蛍光シグナルを示すので、サンプルとプローブが接触した後蛍光シグナルの増加があれば、サンプル中の標的配列とプローブとのハイブリダイゼーションが示唆され、したがってサンプル中に標的配列が存在することが示唆される。サンプルとプローブとの接触の結果として、蛍光強度の変化の定量がサンプルに存在する標的配列の量を定量するために用いられる。
本発明はまた、核酸増幅をモニターするために該オリゴヌクレオチドプローブを使用することに関する。したがって、本発明は、５’→３’ヌクレアーゼ活性をもつ核酸ポリメラーゼ、標的配列とハイブリダイズすることができるプライマー、およびプライマーに対して３’側で標的配列とハイブリダイズすることができる本発明のオリゴヌクレオチドプローブを用いて標的配列で核酸増幅を実施することによって核酸増幅をモニターする方法に関する。本発明にしたがえば、この核酸ポリメラーゼは、オリゴヌクレオチドプローブが標的配列とハイブリダイズするとき、増幅時に該オリゴヌクレオチドプローブを消化し、それによって報知分子を消光分子から分離させる。増幅が進行している時に報知分子の蛍光がモニターされ、蛍光の発生は核酸増幅に対応する。したがって、実際の増幅量は観察された蛍光の変化によって定量できる。消光分子の蛍光もまた、別個にまたは報知分子と合わせて増幅検出のためにモニターできることを特記する。
【図面の簡単な説明】
図１は、核酸ポリメラーゼの５’→３’エクソヌクレアーゼ活性によって消化されるプローブを用いた核酸増幅をリアルタイムでモニターする方法を示す。
図２は、固形支持体に固定された本発明のプローブのハイブリダイズ済み構造および未ハイブリダイズ構造を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、蛍光報知分子および該報知分子の蛍光を消光できる消光分子を含むオリゴヌクレオチドプローブに関する。本発明にしたがえば、該オリゴヌクレオチドプローブは、ハイブリダイズしていないときはプローブが少なくとも一本鎖構造で存在できるように構築され、この場合、消光分子は該報知分子の蛍光を消光するように報知分子に十分近接している。オリゴヌクレオチドプローブはまた、標的ヌクレオチドとハイブリダイズしたときは、該消光分子の位置が該報知分子の蛍光を消光するために該報知分子に十分に近くない少なくとも１つの構造で存在する。これらのハイブリダイズ済み構造および未ハイブリダイズ構造をとることによって、プローブ上の報知分子および消光分子は、プローブがハイブリダイズした場合およびハイブリダイズしていない場合に異なる蛍光シグナルを示す。結果として、報知分子、消光分子またはそれらの蛍光強度の変化によってプローブがハイブリダイズしたか否かを決定することが可能である。さらに、プローブがハイブリダイズしていないときは消光分子は報知分子を消光することができるようにプローブをデザインすることができるので、プローブがハイブリダイズしない限りまたは消化されない限り報知分子が限定的蛍光を示すようにプローブをデザインすることができる。
本発明にしたがえば、プローブが標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするときは、好ましくは報知分子の蛍光強度は消光分子の蛍光強度よりも強い。より好ましくは、プローブが標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするときは、報知分子の蛍光強度は消光分子の蛍光強度より係数で少なくとも約3.５倍強い。
標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブの蛍光強度はまた、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズしていないときのオリゴヌクレオチドプローブの蛍光強度より係数で好ましくは少なくとも約６倍強い。
報知分子は、消光分子から好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１８ヌクレオチド離れている。報知分子は、好ましくは約１５から６０ヌクレオチド、より好ましくは約１８から３０ヌクレオチド消光分子から離れている。
報知分子は、好ましくは該プローブの３’または５’末端ヌクレオチドのどちらかに結合される。消光分子はまた、好ましくは該プローブの３’または５’末端ヌクレオチドのどちらかに結合される。より好ましくは、報知分子と消光分子は、プローブの３’および５’または５’および３’末端ヌクレオチドにそれぞれ結合される。
報知分子は好ましくはフルオレセイン染料で、消光分子は好ましくはローダミン染料である。
ある実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブは固形支持体に結合される。図２に示すように、プローブがハイブリダイズしていないときは、報知分子の蛍光を消光するために該消光分子は報知分子に十分近接できるように少なくとも１つの一本鎖構造をとることができる。さらに図２に示すように、プローブが標的配列とハイブリダイズしたときは、プローブは、報知分子の蛍光を消光するために消光分子が報知分子に十分近接した位置に存在しない少なくとも１つの構造をとる。結果として、プローブが標的配列とハイブリダイズするときは報知分子の蛍光強度は増加する。
図２に示すように、異なるプローブを固形支持体に結合させ、サンプル中の異なる標的配列を同時に検出するために用いることができる。異なる蛍光波長をもつ報知分子を異なるプローブ上で用いることができ、したがって異なるプローブとのハイブリダイゼーションを別々に検出することができる。
オリゴヌクレオチド固定用の好ましい固形支持体の種類の例には、孔制御ガラス、ガラス板、ポリスチレン、アビジン被覆ポリスチレンビーズ、セルロース、ナイロン、アクリルアミドゲルおよび活性化デキストラン、ＣＰＧ、ガラス板および高架橋ポリスチレンが含まれる。これらの固形支持体は、その化学的安定性、官能基付加が容易なことおよび輪郭の明瞭な表面領域のためにハイブリダイゼーション実験および診断実験に好ましい。孔制御ガラス（controlled pore glass(CPG)、５００Å、１０００Å）および非膨潤性高架橋ポリスチレン（１０００Å）のような固形支持体は、オリゴヌクレオチド合成との適合性という観点から特に好ましい。
このオリゴヌクレオチドプローブは種々の態様で固形支持体に結合させることができる。例えば、プローブは、固形支持体にその３’または５’末端ヌクレオチドを結合させることによって固形支持体に結合させることができる。しかしながら、より好ましくはこのプローブは、固形支持体からプローブを話す役割をはたすリンカーによって固形支持体と結合させる。このリンカーは、最も好ましくは長さが少なくとも３０原子、より好ましくは長さが少なくとも５０原子である。
固形支持体とオリゴヌクレオチドの最初の３’ユニットとの間のリンカーの長さおよび化学的安定性は、効率の良い合成と支持体に結合したオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに重要な役割を果たす。リンカーアームは、自動合成時に高収量（＞９７％）を達成できるように十分に長くあるべきである。リンカーに必要な長さは用いられる個々の固形支持体によって異なる。例えば、固形支持体として高架橋ポリスチレンを用いる場合は、自動合成時に＞９７％の収量を達成するために一般に６原子のリンカーで十分である。ＣＰＧが固形支持体として用いられる場合、自動合成時に高収量（＞９７％）を達成するためにはリンカーアームは少なくとも長さが２０原子であることが好ましい。
固形支持体に固定されたプローブのハイブリダイゼーションは、一般に、プローブが少なくとも３０原子、より好ましくは少なくとも５０原子固形支持体から離れていることを必要とする。この分離を達成するために、一般にリンカーは３’ヌクレオシドとリンカーとの間に配置されたスペーサーを含む。オリゴヌクレオチド合成のためには、リンカーアームは通常エステル結合によって３’ヌクレオシドの３’−ＯＨに結合される。このエステル結合は塩基性試薬で切断され、固形支持体からオリゴヌクレオチドを遊離させることができる。
固形支持体にオリゴヌクレオチドプローブを結合させるために用いることができる種々のリンカーが当該分野で知られている。リンカーは、固形支持体に結合させたプローブと標的配列とのハイブリダイゼーションを顕著に干渉しないいずれの物質からも生成することができる。リンカーは、自動合成によってリンカーに容易に付加できるホモポリマーオリゴヌクレオチドから生成できる。また別に、官能基付加ポリエチレングリコールのようなポリマーもリンカーとして用いることができる。そのようなポリマーは、標的オリゴヌクレオチドとプローブとのハイブリダイゼーションに顕著に干渉しないのでホモポリマーオリゴヌクレオチドよりも好ましい。ポリエチレングリコールは、市販されていること、有機媒体および水性媒体の両方に可溶であること、官能基付加が容易であること、並びにオリゴヌクレオチド合成および合成後条件下で完全に安定であることから特に好ましい。
好ましくは固形支持体、リンカーおよびプローブとの間の連結は、高温の塩基性条件下で塩基保護基の除去時に切断されない。好ましい連結の例にはカルバメート結合およびアミド結合が含まれる。
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、標的ポリヌクレオチドを検出するハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。したがって、本発明は、サンプル中の標的ポリヌクレオチドの存在を検出するハイブリダイゼーションアッセーに関する。本方法にしたがえば、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、ハイブリダイゼーションに都合のよい条件下で核酸サンプルと接触させられる。報知分子の蛍光シグナルはサンプルに接触させる前と後に測定される。プローブ上の報知分子は、標的配列とハイブリダイズしたときはより強い蛍光シグナルを示すので、サンプルとプローブを接触させた後の蛍光シグナルの増加は、サンプル中の標的配列とプローブとのハイブリダイゼーションを示唆し、したがってサンプル中の標的配列の存在が示される。さらに、プローブをサンプルと接触させた結果としての蛍光強度の変化を定量することによってサンプル中の標的配列の量を定量することができる。
本方法の一実施態様にしたがえば、ハイブリダイゼーションプローブは固形支持体に固定される。オリゴヌクレオチドプローブは、ハイブリダイゼーションに適した条件下で核酸サンプルと接触させられる。報知分子の蛍光シグナルはサンプルに接触させる前と後に測定される。プローブ上の報知分子は、標的配列とハイブリダイズしたときはより強い蛍光シグナルを示すので、サンプルとプローブを接触させた後の蛍光シグナルの増加は、サンプル中の標的配列とプローブとのハイブリダイゼーションを示唆する。固形支持体へのハイブリダイゼーションプローブの固定によって、プローブとハイブリダイズした標的配列を容易にサンプルから分離できる。以後の工程で、分離された標的配列を固形支持体から分離し、研究者の個々のニーズにしたがって当該分野で周知の方法によってさらに処理（例えば精製、増幅）することができる。
本発明のオリゴヌクレオチドプローブはまた、核酸増幅をモニターするプローブとして用いることができる。したがって、本発明は、増幅プライマーに対して３’側で標的配列とハイブリダイズできる本発明のオリゴヌクレオチドプローブを用いて核酸増幅をモニターする方法に関する。本方法にしたがえば、核酸増幅は、５’→３’ヌクレアーゼ活性をもつ核酸ポリメラーゼ、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズできるプライマー、およびプライマーに対して３’側で標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズできる本発明のオリゴヌクレオチドプローブを用いて標的ポリヌクレオチドについて実施される。増幅中に、この核酸ポリメラーゼは、オリゴヌクレオチドプローブが標的配列とハイブリダイズしたとき該オリゴヌクレオチドプローブを消化し、したがって消光分子から報知分子を分離する。増幅が進行しているとき報知分子の蛍光がモニターされ、蛍光の発生は核酸の増幅に対応する。
一般に標的ポリヌクレオチドの増幅（例えばＰＣＲによって）と組み合わせた報知分子−消光分子対の使用は多くの文献に記載されている（例えば、Innisら編、ＰＣＲプロトコル（PCR Protocols）、アカデミックプレス刊、ニューヨーク、（1989）：Sambrookら、分子クローニング、第２版、コールドスプリングハーバー研究所刊、ニューヨーク（1989）、これらは各々参照により本明細書に含まれる）。オリゴヌクレオチドプローブの結合部位は、標的ポリヌクレオチドを増幅するために用いられるＰＣＲプライマー間に位置する。好ましくは、ＰＣＲはＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（例えばAmplitaqTM（Perkin-Elmer製、Norwalk,コネチカット））または同様な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施され、ＰＣＲのアニーリング温度は用いたオリゴヌクレオチドプローブの融解温度より約５−１０℃低い。
核酸増幅をモニターする本発明のオリゴヌクレオチドプローブの使用によって従来の報知分子−消光分子対プローブの使用を越えるいくつかの利点が提供される。例えば、従来のプローブは、消光分子が報知分子の最小消光距離内に維持されるように報知分子と消光分子がプローブ上に配置される必要があった。しかしながら、消光分子が報知分子の最小消光距離内に存在するような構造をプローブがとることができるようにプローブをデザインしさえすればよいということが分かったので、はるかに様々なプローブが可能である。例えば、その５’および３’末端に報知分子と消光分子をもつ二重標識プローブをデザインすることができる。そのようなプローブは、報知分子または消光分子を内部ヌクレオチドに結合させたプローブよりもはるかに合成が容易である。末端ヌクレオチドに報知分子と消光分子を配置することによって、プローブのハイブリダイゼーション効率もまた強化される。
本出願で用いるように、“オリゴヌクレオチド”という用語は、天然または修飾モノマーまたは連合体（デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシドなどを含む）の直線状オリゴマーで、モノマー対モノマー相互作用の規則的なパターン（例えばワトソン−クリック型塩基対形成など）によって標的ポリヌクレオチドと結合できるものを含む。通常モノマーはホスホジエステル結合またはその類似体によって連結され、サイズが数モノマー単位（例えば３−４）から数十モノマー単位のオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチドが文字の配列（例えば“ＡＴＧＣＣＴＧ”）で表現される場合は、ヌクレオチドは左から右に５’→３’の方向であり、さらに特に記載がなければ“Ａ”はデオキシアデノシン、“Ｃ”はデオキシシチジン、“Ｇ”はデオキシグアノシン、“Ｔ”はデオキシチミジンを表すことは理解されよう。ホスホジエステル連結の類似体には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデートなどが含まれる。一般に、本発明のオリゴヌクレオチドプローブはその５’末端に隣接して十分な数のホスホジエステル結合を有し、それによって用いられた５’→３’エクソヌクレアーゼ活性が効果的に結合したプローブを分解して報知分子と消光分子を分離させることができる。
二本鎖体（デュープレックス）を指して“完全に適合”という場合は、二本鎖体を形成するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド鎖が、各鎖の各ヌクレオチドが他方の鎖のヌクレオチドとワトソン−クリック塩基対形成を経て互いに二本鎖構造を形成することを意味する。この用語はまた、ヌクレオシド類似体（例えばデオキシイノシン、２−アミノプリンをもつヌクレオシドなど利用可能なもの）による対形成も含む。逆に、標的ポリヌクレオチドとオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーとの二本鎖体についての“ミスマッチ（不適合）”は、二本鎖体のヌクレオチド対がワトソン−クリック結合を経ることができないことを意味する。
本出願で用いられるように、“ヌクレオシド”には、コーンバーグとベーカー著の「ＤＮＡ複製」（Kornberg & Baker, DNA Replication，第２版Freeman刊、サンフランシスコ、1992）に記載されているように２’−デオキシおよび２’−ヒドロキシル型を含む天然のヌクレオシドが含まれる。ヌクレオシドに関して“類似体”という場合は、例えば文献（Scheit，ヌクレオチド類似体（Nucleotide Analogs）、John Wiley刊、ニューヨーク、（1980）；Uhlman & Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)など）に記載された修飾塩基部分および／または修飾糖部分をもつ合成ヌクレオシドを含むが、ただしそれらが特異的なハイブリダイゼーションが可能であることを条件とする。そのような類似体には、結合特性を強化させ、縮退を減少させ、特性を強化させるようにデザインした合成ヌクレオシドが含まれる。
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは多数の手段（例えば、Ozakiら、Nucleic Acids Research, 20:5205-5214(1992);Agrawalら、Nucleic Acids Research, 18:5419-5423(1990)など）によって合成できる。本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、自動ＤＮＡ合成装置（例えばApplied Biosystems, Inc.製、モデル３９２または３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置（Foster City，カリフォルニア））で通常の化学操作（例えばホスホルアミダイト化学）を用いて例えば以下の文献に開示されたように都合よく合成できる（Beaucage & Iyer, Tetrahedron, 48:2223-2311(1992);Molkoら、米国特許第4980460号;Kosterら、米国特許第4725677号;Caruthersら、米国特許第4415732号;4458066号;4973679号など）。また別の化学操作（例えば非天然のバックボーン基（例えばホスホロチオエート、ホスホルアミデート）を生じるもの）もまた用いることができるが、生成されたオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション効率および／または用いるエクソヌクレアーゼの切段効率に悪影響を及ぼさないことを条件とする。
好ましくはオリゴヌクレオチドプローブは長さが１５−６０ヌクレオチドの範囲にある。より好ましくはオリゴヌクレオチドプローブは長さが１８−３０ヌクレオチドの範囲にある。本発明のオリゴヌクレオチドプローブの正確な配列および長さは、部分的には該プローブが結合する標的ポリヌクレオチドの性質に左右される。結合する場所および長さは、個々の実施態様で適切なアニーリング特性および融解特性を達成するために変動するであろう。そのようなデザインの選択を実施するための手引は“Ｔａｑ−ｍａｎ”型アッセーについて述べている上記の参考文献の多くで見出されるであろう。
好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブの３’末端ヌクレオチドは封鎖するか、または核酸ポリメラーゼによる伸長を不可能にさせる。そのような封鎖は、連結部分によってオリゴヌクレオチドプローブの末端３’炭素に報知分子または消光分子を結合させることによって都合よく実施できる。
好ましくは、報知分子は、プローブの末端３’炭素または末端５’炭素に連結部分を介して結合させるために誘導した蛍光有機染料である。好ましくは、消光分子もまた有機染料であるが、これは、本発明の実施態様にしたがって蛍光性であってもなくてもよい。例えば、本発明の好ましい実施態様では消光分子は蛍光性である。一般に、消光分子が蛍光性であるにせよ、または非放射性衰退によって報知分子の転移エネルギーを単に遊離させるにせよ、消光分子の吸収バンドは実質的に報知分子の蛍光放出バンドと重なるべきである。励起した報知分子（しかし放射性エネルギーを遊離しない）のエネルギーを吸収する非蛍光性消光分子を本出願では色原体分子と呼ぶ。
個々のプローブについて適切な報知分子−消光分子対を選択するために極めて多くの手引が文献から入手できる。例を挙げれば以下の通りである：Clegg（上記に引用）;Wuら（上記に引用）;Pesceら編、蛍光分光学（Fluorescence Spectroscopy）（Marcel Dekker刊、ニューヨーク(1971)）;Whiteら、蛍光分析：実技（Fluorescence Analysis:A Practical Approach）（Marcel Dekker刊、ニューヨーク(1970)）など。文献はまた、蛍光分子および色原体分子、並びに報知分子−消光分子対を選択するための関連するそれらの光学的特性の膨大なリストを提供する参考文献を含むが、これらは例えば以下のものである:Berlman，芳香族分子の蛍光スペクトルハンドブック（Handbook of Fluorescent Spectra of Aromatic Molecules）、第２版（Academic Press刊、ニューヨーク(1971)）;Griffiths，有機分子の色と組成（colour & Constitution of Organic Molecules）（Academic Press刊、ニューヨーク(1971)）;Bishop編、インジケーター（Indicators）（Pergamon Press刊、オックスフォード(1972);Haugland，蛍光プローブと研究用化学物質ハンドブック（Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals）（Molecular Probes刊、ユージーン(1992)）;Pringsheim，蛍光と燐光（Fluorescence and Phosphorescence）（Interscience Publishers刊、ニューヨーク(1949)）など。さらに、オリゴヌクレオチドに付加することができる一般的な反応基を介して共有結合によって結合させることができる報知分子および消光分子を誘導する様々な手引が文献にある。例を挙げれば以下のとおりである：Ullmanら、米国特許第3996345号;Khannaら、米国特許第4351760号など。
代表的な報知分子−消光分子対はザンセン染料（フルオレセインを含む）およびローダミン染料から選ぶことができる。これら化合物で多くの適切な型が広く市販されているが、それらは、オリゴヌクレオチドとの結合用部位としてまたはオリゴヌクレオチドとの結合のための結合官能性として用いることができる置換基をそれらフェニール部分にもつ。蛍光化合物の別の基はナフチルアミンであり、これはアルファまたはベータ位にアミノ基をもつ。そのようなナフチルアミン化合物に含まれるものはとりわけ、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルフォネート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルフォネートおよびトルイジニル−６−ナフタレンスルフォネートである。他の染料には３−フェニル−７−イソシアナトクマリン、アクリジン（例えば９−イソチオシアナトアクリジンおよびアクリジンオレンジ）、Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾキサゾリル）フェニル）マレイミド、ベンゾオキサジアゾール、スチルベン、ピレンなどが含まれる。
好ましくは、報知分子および消光分子はフルオレセインおよびローダミン染料から選ばれる。これらの染料およびオリゴヌクレオチドに結合させる適切な連結方法は多くの文献に記載されている。例えば以下の通りである:Khannaら（上記に引用）;Marshall, Histochemical J., 7:299-303(1975);Menchenら、米国特許第5188934号;Menchenら、欧州特許出願公開公報第87310256.0号;Bergotら、国際特許出願PCT/US90/05565号。後者の４つの文献は参照により本明細書に含まれる。
多くの連結用部分並びに報知分子および消光分子をオリゴヌクレオチドの５’または３’末端に結合させる方法があるが、例を挙げれば以下の通りである:Eckstein編、オリゴヌクレオチドと類似体：実際的手技（Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach）（IRL Press刊、オックスフォード(1991)）;Zuckermanら、Nucleic Acids Research, 15:5305-5321（1987）（オリゴヌクレオチドの３’チオール基）;Sharmaら、Nucleic Acids Research, 19:3019（1991）（３’スルフヒドリル）;Giustiら、PCR Methods and Applications, 2:223-227（1993）;Fungら、米国特許第4757141号（AminolinkTMII(Applied Biosystems(Foster City, CA)より市販）を介した５’ホスホアミノ基）;Stabinsky，米国特許第4739044号（３’アミノアルキルホスホリル基）;Agrawalら、Tetrahedron Letters, 31:1543-1546（1990）（ホスホルアミデート連結による結合）;Sproatら、Nucleic Acids Research, 15:4837（1987）（５’メルカプト基）;Nelsonら、Nucleic Acids Research, 17:7187-7194（1989）（３’アミノ基）など。
好ましくは、合成中にオリゴヌクレオチドに結合させることができる市販の連結部分（例えばClontech Laboratories（パロアルト、カリフォルニア）から入手できる）が用いられる。
ローダミンおよびフルオレセイン染料はまた、ホスホルアミダイト部分とともに誘導した染料を用いて固相合成の終了時にオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシルに都合よく結合させられる（例えば、Hobbs, Jr.,米国特許第4997928号;Wooら、米国特許第5231191号）。
以下の実施例は本発明のプローブおよび該プローブを用いる方法を説明する。これらの実施例で詳述する固有のプローブ、プローブ構築物および方法の工程は限定を意図するものではない。上記以外の本発明のさらなる目的および利点は、本発明の範囲を限定することを目的としない実施例から明らかになろう。
実施例
１．オリゴヌクレオチドプローブの合成
この実施例では表１に示すオリゴヌクレオチドの合成を説明する。リンカーアームヌクレオチド（“ＬＡＮ”）のホスホルアミダイトはグレンリサーチ（Glen Research）から入手した。標準ＤＮＡホスホルアミダイト、６−カルボキシフルオレセイン（“６−ＦＡＭ”）ホスホルアミダイト、６−カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル（“ＴＡＭＲＡＮＨＳエステル”）、および３’封鎖ホスフェートを結合させるためのホスファリンク（PhosphalinkTM）はパーキン・エルマーのアプライドバイオシステムズ部門（Perkin-Elmer, Applied Biosystems Division）から入手した。オリゴヌクレオチド合成はモデル３９４ＤＮＡ合成装置（Applied Biosystems）で実施した。プライマーおよび相補性オリゴヌクレオチドはオリゴピューリフィケーションカートリッジ（Oligo Purification Cartridges, Applied Biosystems）を用いて精製した。二重標識プローブは、５’末端の６−ＦＡＭ−標識ホスホルアミダイト、オリゴヌクレオチド配列内のＴの１つを置換したＬＡＮおよび３’末端のホスファリンクを用いて合成した。脱保護とエタノール沈澱に続いて、２５０ｍＭの重曹緩衝液（ｐＨ9.0）で室温でＬＡＮ−含有オリゴヌクレオチドとＴＡＭＲＡＮＨＳエステルを共役させた。未反応染料をＰＤ−１０セファデックスカラムに通して除去した。最後に、二重標識プローブを標準的プロトコルによって調製用ＨＰＬＣで精製した。下記に表１の配列とＬＡＮ−ＴＡＭＲＡ部分の位置を示すことによってプローブの名称を表示する。例えば、プローブＡ１−７は、５’末端から７位のヌクレオシドにＬＡＮ−ＴＡＭＲＡを有するＡ１配列をもつ。
高架橋ポリスチレン（１０００Å）および孔制御ガラス（ＣＰＧ）（５００Å）の両方を固形支持体マトリックスとして用いる。スペーサー（化合物５）の官能基付加は表２に示す。スペーサーのポリスチレンおよびＣＰＧ支持体への結合、および該固形支持体のＴＡＭＲＡ染料による標識は表３および表４にそれぞれ示す。
表２は、ＣＰＧおよびポリスチレン支持体を誘導するために用いられるスペーサー（化合物５）の合成の反応模式図を示す。表２に示すように、ＤＭＦ中のＨＯＢＴ／ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡの存在下でＮ−Ｆｍｏｃ−ε−アミノカプロン酸をＤＬ−ホモセリンと反応させ（Knorrら、Tetrahedron Lett.,30:1927(1989)）、６５％の収量で化合物２を生じた。ピリジン中のＤＭＡＰの存在下で化合物２を塩化ジメトキシトリチルと反応させ、クロマトグラフィー後に７２％の収量で化合物３を得た。ＤＭＦ中のＨＯＢＴ／ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡの存在下で化合物３を極めて過剰のＰＥＧ−ジアミンで処理し（Buckmannら、Biotech. Appl. Biochem., 9:258(1987)）、６０％の収量でアミン４を得た。続いてアミン４をＣＨ2Ｃｌ2中の無水コハク酸／Ｅｔ3Ｎ／ＤＭＡＰで処理してアミン４を９０％収量でスクシネート５に変換した。さらに、このスクシネート５をさらに精製することなくポリスチレンおよびＣＰＧ支持体に表３および表４にそれぞれ示したように結合させた。
表３および表４に示したように、ＤＭＦ中のＨＯＢＴ／ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡの存在下でスクシネート５をポリスチレンおよびＣＰＧ支持体と別々に反応させ、それぞれ官能基付加支持体６（５μｍｏｌ／ｇローディング）および官能基付加支持体８（１５μｍｏｌ／ｇローディング）を提供した。支持体６および８をＤＭＦに２０％のピペリジンで処理することによって支持体結合スペーサーからＦｍｏｃを除去した（Fieldsら、J. Peptide Res. 35:161(1990)）アミンを得、これをＴＡＭＲＡＮＨＳエステルで処理してそれぞれＴＡＭＲＡ標識支持体７および９を得た。トリチル陽イオン分析でポリスチレンおよびＣＰＧ支持体は最終ローディングがそれぞれ4.８μｍｏｌ／ｇおよび１４μｍｏｌ／ｇであることが分かった。
二重標識ＴａｑｍａｎプローブをＴＡＭＲＡ標識支持体７および９の両方、FastPhoramidite（ユーザーブリテン85号、Perkin Elmer Corporation 1994）並びにＦＡＭホスホルアミダイト（ユーザーブリテン78号、Perkin Elmer Corporation 1994）を４０ナノモルの規模で用いて合成した。６５℃で３時間、ＭｅＯＨ：ｔ−ＢｕＮＨ2：Ｈ2Ｏ（１：１：２）で処理して支持体結合オリゴヌクレオチドを脱保護した（Wooら、米国特許5231191号）。液体を除去し、プローブを含む支持体をＨ2Ｏ：ＭｅＯＨ（３：１）およびＭｅＯＨで洗浄した。続いて支持体を真空下で乾燥させハイブリダイゼーションアッセーに用いた。
実験例：
化合物２：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（1.１ｇ、1.４８ｍｌ、8.５２mmol）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾル（４２０ｍｇ、3.１mmol）および（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾル−１−イル）１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（1.１７ｇ、3.１mmol）をＤＭＦ（３０ｍｌ）中のＮｆｍｏｃ−ε−アミノカプロン酸（１ｇ、2.８４mmol）の攪拌溶液に室温で添加した。１５分後、ＤＬ−ホモセリン（1.３５ｇ、１1.３６mmol）を反応混合物に加えた。３時間後、減圧下でＤＭＦを除去した。残留物をＣＨＣｌ3（１００ｍｌ）に溶解し、５％塩酸（２×５０ｍｌ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ4上で乾燥させ、蒸発させて濃厚な油を得てエーテルで粉末化し無色の固形物を得た（８４０ｍｇ、６５％）。生成物を高圧下に２４時間放置し、さらに精製することなく次の工程に用いた。
化合物３：塩化４，４’−ジメトキシトリチル（４８４ｍｇ、1.４３mmol）および４−ジメチアミノピリジン（２５ｍｇ、0.２mmol）をピリジン（１５ｍｌ）中の化合物２（５００ｍｇ、1.１mmol）の攪拌溶液に窒素雰囲気下で室温で加えた。１４時間後、ピリジンを除去し、残留物をＣＨＣｌ3（７０ｍｌ）に溶解した。有機層を５％クエン酸（１×５０ｍｌ）、Ｈ2Ｏ（１×５０ｍｌ）および飽和ブライン（１×５０ｍｌ）で抽出した。有機層をＭｇＳＯ4上で乾燥させ、蒸発させて黄色の泡沫を得た。生成物をＣＨＣｌ3−ＭｅＯＨ勾配（０−１０％ＭｅＯＨ）で溶出させながらシリカゲルカラムで精製した。適切な分画を合わせて、蒸発させ無色泡沫として化合物３を得た（６００ｍｇ、７２％）。
化合物４：ポリ（エチレングリコール）ビス（２−アミノエチルエーテル）（3.１６ｇ、5.３mmol）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチレンアミン（２０５ｍｇ、0.２７ｍｌ、1.５９mmol）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾル（７８ｍｇ、0.５８mmol）および（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾル−１−イル）−１，１，３，３，−テトラメチルウノニウムヘキサフルオロホスフェート（２２０ｍｇ、0.５８mmol）を、ＤＭＦ（１０ｍｌ）中の化合物３（４００ｍｇ、0.５３mmol）の攪拌溶液に室温で添加した。減圧下でＤＭＦを除去し、残留物をＣＨＣｌ3（７０ｍｌ）に溶解し、有機層をＨ2Ｏ（１×５０ｍｌ）および飽和ブライン（２×５０ｍｌ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ4上で乾燥させ、蒸発させて濃厚な油を得た。化合物４をＣＨＣｌ3−ＭｅＯＨ勾配（５−１５％ＭｅＯＨ）で溶出させながらシリカゲルカラムで精製し無色ガラス（４２３ｍｇ、６０％）とした。
化合物５：無水コハク酸（２２ｍｇ、0.２２mmol）、Ｅｔ3Ｎ（２３ｍｇ、0.３μｌ、0.２２mmol）、４−ジメチルアミノピリジン（１４ｍｇ、0.１１mmol）をＣＨ2Ｃｌ2（１５ｍｌ）中の化合物４（３００ｍｇ、0.２２mmol）の溶液に添加した。反応混合物を室温で３時間攪拌した。この反応混合物をＣＨＣｌ3（３０ｍｌ）で希釈し、５％クエン酸（１×５０ｍｌ）および飽和ブライン（２×５０ｍｌ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ4上で乾燥させ、蒸発させて無色の泡沫（２８４ｍｇ、９０％）を得た。これをさらに精製することなく固形支持体の誘導に用いた。
ＴＡＭＲＡ染料によるポリスチレン支持体の誘導体形成：ＤＭＦ（１０ｍｌ）中の化合物５（１７ｍｇ、１２μｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾル（1.８ｍｇ、１２μｍｏｌ）、（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾル−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウオニウムヘキサフルオロホスフェート（4.８ｍｇ、１２μｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６μｌ、３０μｍｏｌ）で高架橋ポリスチレン（１０００Å、１０μｍｏｌ／ｇアミンローディング、１ｇ、１０μｍｏｌ）を室温で４時間リストアクションシェーカーで処理した。この支持体をＤＭＦ（３×１０ｍｌ）、ＣＨ3ＣＮ（２×１０ｍｌ）およびＣＨ2Ｃｌ2（１×１０ｍｌ）で洗浄し、強真空下で一晩乾燥させた。ニンヒドリンアッセーによって１μｍｏｌ／ｇのアミンが残っているのが分かった。トリチル陽イオンアッセーは化合物５の５μｍｏｌ／ｇローディングを示した。この支持体をＴＨＦ中の無水酢酸／ルチジン（１０％溶液、５ｍｌ）およびＴＨＦ中の１−メチルイミダゾル（１６％溶液、５ｍｌ）で２時間室温で処理した。支持体をＣＨ3ＣＮ（３×１０ｍｌ）およびＣＨ2Ｃｌ2（１×１０ｍｌ）で洗浄した。支持体をＤＭＦ中の２０％ピペリジン（３×１０ｍｌ）で処理しＦｍｏｃ保護基を除去した。Ｆｍｏｃ基の除去は３０２ｎｍで溶液のＵＶを測定することによってモニターした。支持体をＤＭＦ（３×１０ｍｌ）で洗浄し、続いてＴＡＭＲＡＮＨＳエステル（１５ｍｇ、２７μｍｏｌ）およびＤＭＦ（１０ｍｌ）中のＥｔ3Ｎ（５０μｍｏｌ）で４２時間シェーカー上で処理した。支持体をＤＭＦ（３×１０ｍｌ）、ＣＨ3ＣＮ（２×１０ｍｌ）およびＣＨ2Ｃｌ2（１×１０ｍｌ）で洗浄し、強真空下で２４時間乾燥させた。ニンヒドリンテストによって0.５μｍｏｌ／ｇ未満のアミンが残っているのが分かった。支持体をＴＨＦ中の無水酢酸／ルチジン（１０％溶液、５ｍｌ）およびＴＨＦ中の１−メチルイミダゾル（１６％溶液、５ｍｌ）で１時間室温で処理し、続いてＣＨ3ＣＮ（３×１０ｍｌ）およびＣＨ2Ｃｌ2（２×１０ｍｌ）で洗浄して強真空下で２４時間乾燥させた。トリチル陽イオンアッセーは4.８μｍｏｌ／ｇの最終ローディングを示した。
ＴＡＭＲＡ染料によるＣＰＧ支持体の誘導体形成：ＣＰＧ（５００Å、４０μｍｏｌ／ｇアミンローディング、５００ｍｇ、２０μｍｏｌ）、化合物５（３１ｍｇ、２２μｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾル（5.９ｍｇ、２２μｍｏｌ）、（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾル−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウオニウムヘキサフルオロホスフェート（8.４ｍｇ、２２μｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１0.４μｌ、６０μｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍｌ）中の混合物をリストアクションシェーカーで４時間室温で震盪した。この支持体をＤＭＦ（３×１０ｍｌ）、ＣＨ3ＣＮ（２×１０ｍｌ）およびＣＨ2Ｃｌ2（１×１０ｍｌ）で洗浄し、強真空下で一晩乾燥させた。ニンヒドリンアッセーによって４μｍｏｌ／ｇのアミンが残っているのが分かった。トリチル陽イオンアッセーは。ＣＰＧ上に化合物５の１５μｍｏｌ／ｇのローディングを示した。この支持体をＴＨＦ中の無水酢酸／ルチジン（１０％溶液、５ｍｌ）およびＴＨＦ中の１−メチルイミダゾル（１６％溶液、５ｍｌ）で２時間室温で処理した。支持体をＣＨ3ＣＮ（３×１０ｍｌ）およびＣＨ2Ｃｌ2（１×１０ｍｌ）で洗浄した。支持体をＤＭＦ中の２０％ピペリジン（３×１０ｍｌ）で処理しＦｍｏｃ保護基を除去した。Ｆｍｏｃ基の除去は３０２ｎｍで溶液のＵＶを測定することによってモニターした。支持体をＤＭＦ（３×１０ｍｌ）で洗浄した。支持体を続いてＴＡＭＲＡＮＨＳエステル（２５ｍｇ、４５μｍｏ１）およびＤＭＦ（５ｍｌ）中のＥｔ3Ｎ（９０μｍｏｌ）で４２時間シェーカー上で処理した。支持体をＤＭＦ（３×１０ｍｌ）、ＣＨ3ＣＮ（２×１０ｍｌ）およびＣＨ2Ｃｌ2（１×１０ｍｌ）で洗浄し、強真空下で２４時間乾燥させた。ニンヒドリンテストによって１μｍｏｌ／ｇ未満のアミンが残っているのが分かった。支持体をＴＨＦ中の無水酢酸／ルチジン（１０％溶液、５ｍｌ）およびＴＨＦ中の１−メチルイミダゾル（１６％溶液、５ｍｌ）で１時間室温で処理し、続いてＣＨ3ＣＮ（３×１０ｍｌ）およびＣＨ2Ｃｌ2（２×１０ｍｌ）で洗浄して強真空下で２４時間乾燥させた。トリチル陽イオンアッセーは１４μｍｏｌ／ｇの最終ローディングを示した。
ＦＡＭおよびＴＡＭＲＡ二重標識プローブの合成：ＴＡＭＲＡ標識支持体７および９、ＤＮＡFastPhosphoramiditeおよびＦＡＭを４０ｎｍｏｌ規模で用いて二重染料標識プローブを合成した。合成終了後、プローブを含む支持体を４ｍｌのガラスバイアルに移し、ＭｅＯＨ：ｔ−ＢｕＮＨ2：Ｈ2Ｏ（１：１：２）の混合物で３時間６５℃で処理した。注射筒で液体を除去し、支持体をＨ2Ｏ：ＭｅＯＨ（３：１）およびＭｅＯＨで洗浄した。真空下で支持体を乾燥させハイブリダイゼーションアッセーに用いた。
３．オリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションアッセー
ヒトβ−アクチン遺伝子のエクソン３の２９５塩基対セグメント（S. Nakajima-Iijima(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6133-6137(1985))が開示したヌクレオチド２１４１−２４３５）は、１０ｍＭトリスーＨＣｌ（ｐＨ8.３）、５０ｍＭＫＣｌ、４ｍＭＭｇＣｌ2、３００ｍＭのプライマーＡＦＰ（配列番号：７）、３００ｎＭのプライマービオチン−ＡＲＰ（５’末端にビオチンを結合させた配列番号：８）、２００μＭｄＡＴＰ、２００μＭｄＣＴＰ、２００μＭｄＧＴＰ、２００μＭｄＴＴＰおよび1.２５単位のＡｍｐｌｉＴａｑ（Perkin-Elmer）を含む５０μｌの反応物を用いて増幅できる。反応は２０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡの存在下（＋鋳型）または非存在下（−鋳型）で実施される。
５０℃（２分）；９５℃（１０分）；さらに９５℃（２０秒）続いて６０℃（１分）の４０サイクルという温度循環の後、各サンプルに２００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（５×ＳＳＣ、８％（ｖ／ｖ）ギ酸アミド、８％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００）を添加して希釈する。生じたサンプルをストレプトアビジン被覆９６穴（ウェル）のマイクロタイタープレート（Xenopore Corp.,サッドルブルック、ニュージャージー）に移し、増幅β−アクチンＤＮＡセグメントを捕捉するために３７℃で３０分保温した。続いて各ウェルを３５０μｌの燐酸緩衝食塩水／0.０５％トゥイーン−２０で洗浄した。一切の非ビオチン化ＤＮＡを１００μｌの0.１ＭＮａＯＨ／１ｍＭＥＤＴＡを添加することによって除去し、室温で５分保温し、３５０μｌの燐酸緩衝食塩水／0.０５％トゥイーン−２０で洗浄する。続いて、プローブＡ１−２６（配列番号：９、ヌクレオチド１−２６（Ａ１−２６）、報知分子ＦＡＭおよび消光分子ＴＡＭＲＡで標識）を１００ｎＭ含むハイブリダイゼーション緩衝液の５０μｌを加え、３７℃で３０分保温する。
続いて、パーキン・エルマータックマン（Perkin-Elmer TaqMan）ＬＳ−５０Ｂシステムを用いて５１８ｎｍおよび５８２ｎｍで蛍光を測定する。続いて実施例５で述べるようにΔＲＱを算出する。ΔＲＱの大きさはＡ１−２６プローブのハイブリダイゼーションのレベルを示し、したがって各ウェルに捕捉された増幅β−アクチンＤＮＡセグメント量の大きさである。
４．固形支持体に結合させたオリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼーションアッセー
３通りのプローブ／固形支持体組み合わせを調べた：Ａ１−ＰＳ：ポリスチレン支持体に結合させたＡ１（配列番号：９）；Ａ１−ＣＰＧ：ガラス支持体に結合させたＡ１（配列番号：９）；およびＧ１−ＰＳ：ポリスチレン支持体に結合させたＧ１（配列番号：１３）。
３つのプローブは全て当該配列の５’末端にＦＡＭが結合され、ＴＡＭＲＡは３’末端に結合されている。５０μｌの１×ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.３）、５０ｍＭＫＣｌ、3.５ｍＭＭｇＣｌ2）中に各プローブ／固形支持体を懸濁させることによって鋳型無し反応を調製した。鋳型＋反応のためには、Ａ１−ＰＳおよびＡ１−ＣＰＧを５０μｌの１×ＰＣＲ緩衝液＋１μＭのＡ１Ｃに懸濁し、Ｇ１−ＰＳを５０μｌの１×ＰＣＲ緩衝液＋１μＭのＧ１Ｃに懸濁した。
反応物を９５℃で１分保温し、続いて室温まで徐冷した。各懸濁物の一部を顕微鏡スライドに載せた。各サンプルを４８８ｎｍ光で励起し、５１８ｎｍまたは５８３干渉フィルターのいずれかを用いて蛍光像をＣＣＤアレー上で捕捉した。この像の分析は、５１８ｎｍ像の最大ピクセル値を見つけ、続いて同じピクセルについての５８３ｎｍ値を見つけることによって実施した。緩衝液で得られたバックグラウンドの読みを差し引くことによってピクセル値を修正した。表５は表示したプローブの蛍光測定値の結果を示す。
全てのＰＣＲ増幅はパーキン・エルマーサーモサイクラー９６００で実施し、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.３）、５０ｍＭＫＣｌ、２００μＭｄＡＴＰ、２００μＭｄＣＴＰ、２００μＭｄＧＴＰ、４００μＭｄＵＴＰ、0.５単位のAmpEraseTMウラシルＮ−グリコリアーゼ（Perkin-Elmer）および1.２５単位のAmpliTaqTM（Perkin-Elmer）を含む５０μｌ反応物を用いた。ヒトβ−アクチン遺伝子のエクソン３の２９５塩基対セグメント（S. Nakajima-Iijima(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6133-6137(1985))が開示したヌクレオチド２１４１−２４３５）を以下に挙げたＡＦＰおよびＡＲＰプライマーを用いて増幅した。増幅反応物は、４ｍＭＭｇＣｌ2、２０ｎｇヒトゲノムＤＮＡ、５０ｎＭＡ１またはＡ３プローブおよび各プライマー３００ｎＭを含んでいた。温度処理は以下の通りであった：５０℃（２分）；９５℃（１０分）；９５℃（２０秒）、６０℃（１分）の４０サイクルおよび７２℃での保持。５１５塩基対セグメントは、ベクターｐＵＣ１１９のＳｍａＩ部位に挿入されたλＤＮＡのセグメント（ヌクレオチド３２、２２０−３２、７４７）から成るプラスミドで増幅した。これらの反応物は3.５ｍＭＭｇＣｌ2、１ｎｇのプラスミドＤＮＡ、５０ｎＭのＰ２またはＰ５プローブ、２００ｎＭのプライマーＦ１１９および２００ｎＭのプライマーＲ１１９を含んでいた。温度処理は以下の通り：５０℃（２分）；９５℃（１０分）；９５℃（２０秒）、５７℃（１分）の２５サイクル；および７２℃での保持。
各増幅反応物について、４０μｌを９６ウェルの白色マイクロタイタープレート（Perkin-Elmer）の個々のウェルに移した。蛍光はパーキン・エルマータックマン（登録商標）ＬＳ−５０Ｂシステムで測定したが、このシステムは、プレート読み取り装置部、４８５ｎｍ励起フィルターおよび５１５ｎｍ発光フィルターをもつルミネッセンス分光計から成る。励起は、５ｎｍのスリット幅を用いて４８８ｎｍで実施した。発光は、６−ＦＡＭ（報知分子、またはＲバルブ）については５１８ｎｍで、ＴＡＭＲＡ（消光分子またはＱバルブ）については５８２ｎｍで１０ｎｍのスリット幅を用いて測定した。ＰＣＲ中の切断による報知分子発光の増加を求めるために、３つの標準化を未処理発光データに用いた。第一に、緩衝液ブランクの発光強度を各波長について差し引いた。第二に、報知分子の発光強度を消光分子の発光強度で割って、各反応試験管についてＲＱ比を出した。これによって、個々のウェルについてのプローブ濃度の変動と蛍光測定値の変動が標準化される。最後に、鋳型を含まないコントロールのＲＱ値（ＲＱ-）を鋳型を含む完全な反応物のＲＱ値（ＲＱ+）から差し引いてΔＲＱを算出する。
３組のプローブ対をＰＣＲアッセーでテストした。各対について、１方のプローブは内部ヌクレオチドに結合したＴＡＭＲＡをもち、他方は３’末端ヌクレオチドに結合したＴＡＭＲＡをもつ。結果は表６に示す。３組全てについて、３’消光分子をもつプローブは、内部消光分子をもつものよりも顕著に高いΔＲＱ値を示す。
前述した本発明の好ましい実施態様は実例と説明のために提供し、開示した厳密な形態に限定することを目的とするものではない。当業者には多くの修飾および変形が明らかであろう。本発明の範囲は以下の請求の範囲およびその同等物によって範囲が定まる。
〔配列表〕
（2）配列番号：１：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：24ヌクレオチド
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：１；
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：26ヌクレオチド
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：２：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：27ヌクレオチド
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：３：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：31ヌクレオチド
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：４：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：28ヌクレオチド
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：５：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：31ヌクレオチド
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：６：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：25ヌクレオチド
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：７：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：25ヌクレオチド
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：８：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：26ヌクレオチド
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：９：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：30ヌクレオチド
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：１０：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：24ヌクレオチド
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：１１：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：28ヌクレオチド
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：１２：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：ヌクレオチド
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：１３：
（i）配列の特徴：
（A）配列の長さ：30ヌクレオチド
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号：１４：
Claims (9)
- 核酸増幅をモニターする方法であって、
標的ポリヌクレオチドの核酸増幅を、
５’→３’のヌクレアーゼ活性をもつ核酸ポリメラーゼ、
標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるプライマー、及び、
オリゴヌクレオチドプローブを用いて、
該オリゴヌクレオチドプローブが該プライマーに対して３’側で該標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズする増幅条件下で行う工程を含み、
該オリゴヌクレオチドプローブは、一方の末端に蛍光報知分子を有し、かつ、他方の末端には消光分子であって、該蛍光報知分子及び消光分子の両方が一本鎖状態の該オリゴヌクレオチドプローブに結合しているときに該蛍光報知分子の蛍光を消光する消光分子を有し、該オリゴヌクレオチドプローブは自分自身とハイブリダイズしてヘアピン構造を形成せず、
該オリゴヌクレオチドプローブは、１８〜３０ヌクレオチドの長さであり、
該増幅条件下において、該オリゴヌクレオチドプローブの消化により該蛍光報知分子が該消光分子から分離し、これにより、該消化前の一本鎖状態のオリゴヌクレオチドプローブの蛍光報知分子の蛍光シグナルに対する該消化後の蛍光報知分子の蛍光シグナルの増強を検出することを特徴とする方法。 - 前記蛍光報知分子が、前記オリゴヌクレオチドプローブの５’末端に結合している、請求項１に記載の方法。
- 前記蛍光報知分子が、前記オリゴヌクレオチドプローブの３’末端に結合している、請求項１に記載の方法。
- 前記蛍光報知分子又は消光分子がローダミン染料を含んでいる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
- 前記蛍光報知分子又は消光分子がフルオレセイン染料を含んでいる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
- 前記蛍光報知分子がフルオレセイン染料であり、かつ、前記消光分子がローダミン染料である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
- 前記蛍光報知分子又は消光分子がザンセン染料又はナフチルアミン染料である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
- 前記核酸ポリメラーゼが耐熱性ポリメラーゼである、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブが、前記核酸ポリメラーゼにより伸長することができない、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
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