MD4589C1 - Compoziţie farmaceutică cu conţinut de sofosbuvir şi utilizarea acesteia în tratamentul hepatitei virale C - Google Patents

Compoziţie farmaceutică cu conţinut de sofosbuvir şi utilizarea acesteia în tratamentul hepatitei virale C Download PDF

Info

Publication number
MD4589C1
MD4589C1 MDA20140035A MD20140035A MD4589C1 MD 4589 C1 MD4589 C1 MD 4589C1 MD A20140035 A MDA20140035 A MD A20140035A MD 20140035 A MD20140035 A MD 20140035A MD 4589 C1 MD4589 C1 MD 4589C1
Authority
MD
Moldova
Prior art keywords
compound
hcv
combination
mmol
mixture
Prior art date
Application number
MDA20140035A
Other languages
English (en)
Russian (ru)
Other versions
MD4589B1 (ro
MD20140035A2 (ro
Inventor
Адриан С. Рэй
Уильям Дж. Уоткинс
Джон О. Линк
Дэвид О. ОЛДАЧ
IV Уильям Е. ДЕЛЭНИ
Original Assignee
Gilead Pharmasset Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=46970425&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=MD4589(C1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Gilead Pharmasset Llc filed Critical Gilead Pharmasset Llc
Publication of MD20140035A2 publication Critical patent/MD20140035A2/ro
Publication of MD4589B1 publication Critical patent/MD4589B1/ro
Publication of MD4589C1 publication Critical patent/MD4589C1/ro

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A61K31/7072—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid having two oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. uridine, uridylic acid, thymidine, zidovudine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/38—Heterocyclic compounds having sulfur as a ring hetero atom
    • A61K31/381—Heterocyclic compounds having sulfur as a ring hetero atom having five-membered rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4184—1,3-Diazoles condensed with carbocyclic rings, e.g. benzimidazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4196—1,2,4-Triazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/7056—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing five-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/06—Tripeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/212—IFN-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Treating Waste Gases (AREA)
  • Exhaust Gas After Treatment (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Invenţia se referă la medicină, şi anume la o compoziţie farmaceutică cu conţinut de sofosbuvir şi la utilizarea acesteia pentru tratamentul hepatitei virale C.

Description

Această cerere revendică prioritatea Cererii Provizorii din Statele Unite Cererea № 61/535, 885, depusă la 16 septembrie 2011; şi la Cererea Provizorie № 61/561,753, depusă la 18 noiembrie 2011. Întregul conţinut al fiecăreia dintre aceste cereri provizorii este încorporat aici prin referinţă.
Prezenta invenţie se referă la combinaţii de molecule terapeutice utile pentru tratarea infecţiei cu virusul hepatitei C. Prezenta invenţie se referă la metode, utilizări, scheme de dozare şi compoziţii.
Hepatita este o boală care apare în întreaga lume. Hepatita este, în general, de natură virală, deşi, dacă se consideră că o stare de inflamaţie cronică a ficatului, există alte cauze cunoscute, neinfecţioase. Hepatita virală este cea mai frecventă formă de hepatită. Centrele pentru Controlul Bolilor din SUA a estimat că cel puţin 1,8% din populaţia SUA are dovezi serologice de infecţie VHC, în majoritatea cazurilor asociate cu infecţia cronică activă. VHC este un virus ARN pozitiv catenar din familia Flaviviridae şi are cea mai apropiată relaţie cu pestivirusurile care includ virusul holerei porcine şi virusul diareei virale bovine.
Genomul VHC este un ARN monocatenar, de sens pozitiv de aproximativ 9,600 bp codificare pentru o poliproteină din 3009-3030 de aminoacizi, care este despicat co- şi post-translaţional de proteinaze celulare şi două proteinaze virale în proteinele virale mature (de înveliş, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B). Proteinele structurale de înveliş E1 şi E2 sunt considerate a fi încorporate într-un înveliş lipidic viral şi formează heterodimeri stabili. Proteina structurală de înveliş se crede că interacţionează cu genomul ARN viral pentru a forma nucleocapsida. Proteinele nestructurale desemnate de la NS2 până la NS5 includ proteine cu funcţii enzimatice implicate în replicarea virusului şi procesarea proteinei incluzând o polimerază, protează şi helicază. VHC se replică prin producerea unei matrice complementare a ARN cu polaritate negativă.
HCV este un virus genetic divers. La un singur pacient infectat, pot fi identificate multe variante de virusuri, ceea ce duce la descrierea „roiului viral” sau pseudotipurilor virale. În cadrul populaţiei umane globale, VHC este de asemenea genetic divers, cu cel puţin 6 „genotipuri” majore identificate (genotipurile 1-6) şi numeroase subtipuri (de exemplu, genotipul VHC 1a şi 1b). Genotipurile VHC sunt definite prin analiză filogenetică genomică şi diagnosticate (într-un anumit pacient) de analiza de diagnostic pe baza secvenţei ARN VHC.
Principala cale de infectare cu VHC este transfuzia de sânge. Amploarea infecţiei HCV ca o problemă de sănătate este ilustrată de prevalenţa în rândul grupurilor de risc. De exemplu, în ţările occidentale, conform unor sondaje, au avut infectie cronică cu VHC de la 60% la 90% din hemofilici şi mai mult de 80% din narcomanii care-şi administrează drogurile intravenos . Pentru narcomanii care-şi administrează drogurile intravenos, prevalenţa variază de la aproximativ 28% până la 80% în funcţie de populaţia studiată. Proporţia noilor infecţii cu VHC asociate transfuziei de sânge sau produselor din sânge a fost redusă semnificativ datorită progreselor farmaceutice şi utilizării pe scară largă a analizelor serologic sensibile şi de detectare a ARN-ului utilizate pentru a examina donatorii de sânge, cu toate acestea, este deja stabilită o mare cohortă de persoane în vârstă infectate cronic.
Un tratament disponibil pentru infecţia cu VHC este interferonul-α (PEG-IFN α1a sau PEG-IFN α1b), care, în conformitate cu directivele actuale de tratament, în funcţie de genotipul viral VHC tratat, este administrat săptămânal prin injecţie subcutanată timp de 24 până la 48 de săptămâni. Cu toate că la mai mult de 50% dintre pacienţii infecaţi cu VHC genotipul 1 la finalizarea terapiei de 48 săptămâni se poate aştepa supresiunea viremiei VHC, un procent semnificativ din aceşti pacienţi vor avea recidivă virală. În consecinţă, un Răspuns Virusologic Susţinut (RVS, definit ca ARN VHC nedetectabil la 24 săptămâni după încetarea tratamentului şi considerat echivalent cu o „cură”) este atins doar în 30-40% din infecţiile cu VHC genotipul 1 tratate doar cu PEG-IFN. În plus, tratamentul cu PEG IFN + RBV nu este bine tolerat, cu un profil de eveniment advers care include simptome asemănătoare gripei, trombocitopenie, anemie şi efecte psihiatrice grave secundare. În timp ce tratamentul cu standardul actual de asistenţă medicală este suboptimal, multi pacienti sunt preîntâmpinaţi să înceapă cândva terapia din cauza comorbidităţii comune în randul populaţiei infectate cu VHC, inclusiv cu tulburari psihice, boli hepatice avansate şi abuzul de substanţe.
Ribavirina este un preparat antiviral analog nucleozidic. Ribavirina este de obicei administrată pe cale orală (prin gură) de două ori pe zi. Mecanismul acţiunii exacte pentru ribavirină este necunoscut. Cu toate acestea, se crede că, atunci când ribavirina intră într-o celulă ea este fosforilată; apoi ea acţionează ca un inhibitor al inozin 5'-monofosfat dehidrogenazei (IMFDH). Inhibitorii IMFDH, cum ar fi ribavirina reduc sinteza intracelulară şi depozitarea guaninei, unui „bloc de construire” a nucleotidelor necesare pentru producerea ADN şi ARN, astfel inhibând replicarea virală. Inhibitorii IMFDH interfera, de asemenea, cu reproducerea celulelor cu proliferare rapidă şi celulelor cu o intensitate mare de reînnoire a proteinelor. Tratamentul cu ribavirinomonoterapie are un efect redus asupra nivelelor de ARN VHC, dar este asociat cu o scădere a alanintransferazei serice (ALT). Această observaţie sugerează că ribavirina nu poate acţiona ca un agent antiviral, ci mai degrabă ca un modulator al funcţiei sistemului imun. Ribavirina este aprobată doar pentru utilizare, pentru infecţia cu VHC în combinaţie cu IFN.
Tratamentul cu o combinaţie de PEG-IFN plus ribavirină îmbunătăţeşte ratele RVS peste cele observate cu numai PEG-IFN, în mare parte datorită reducerii frecvenţei recidivei virale la încetarea tratamentului. Indicii majori ai RVS, conform studiului clinic pentru pacienţii cu infectie VHC genotipul 1 trataţi cu PEG-IFN/ribavirină , au variat de la 40-55%. La momentul actual, drept terapie PEG-IFN/ribavirină este considerat tratamentul „standard-de-asistenţă medicală” pentru infecţia cronică cu VHC. Cu toate acestea, este de aşteptat, ca standardul de asistenţă medicală să se schimbe rapid în viitorul apropiat, odată cu aprobarea agenţilor antivirali cu acţiune directă, care iniţial, vor fi utilizaţi în combinaţie cu PEG-IFN/ribavirina.
Din păcate, diferite genotipuri ale VHC răspund diferit la terapia PEG-IFN/ribavirină; de exemplu, genotipul 1 VHC este mai rezistent la terapie decât tipurile 2 şi 3. În plus, multe tratamente actuale pentru VHC produc efecte secundare nedorite. Astfel, în prezent există o necesitate de noi terapii antivirale. În special, există o necesitate de noi terapii antivirale care ar produce mai puţine efecte secundare nedorite, care ar fi mai eficiente împotriva unei game de genotipuri VHC, sau care vor avea scheme de administrarte mai puţin complicate, adică ar necesita administrarea agenţilor de mai rar pe durata unei zile.
Esenţa invenţiei
Prezenta invenţie se referă la compoziţii şi metode terapeutice care sunt utile pentru tratarea infecţiilor virale (de exemplu, VHC). Anumite compoziţii şi metode ale invenţiei produc mai puţine efecte secundare nedorite, sunt mai eficiente împotriva unei game de genotipuri ale VHC, reduc posibilitatea recăderii virale datorită selecţiei rezistenţei şi au scheme de administrare scurtate mai puţin complicate decât terapiile disponibile în prezent.
Prin urmare, într-un exemplu de realizare invenţia se referă la o compoziţie care conţine doi sau mai mulţi compuşi selectaţi dintre Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16 şi sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora.
Într-un alt exemplu de realizare, invenţia se referă la o metodă pentru tratarea unei infecţii VHC la om, care include administrarea a doi sau mai mulţi compuşi selectaţi dintre Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16 şi sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora pentru om.
Într-un alt exemplu de realizare invenţia se referă la o metodă pentru ameliorarea uneia sau a mai multor simptome ale unei infecţii cu VHC la om, care include administrarea a doi sau mai mulţi compuşi selectaţi dintre Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16 şi sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora la om.
Într-un alt exemplu de realizare invenţia se referă la o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la om cu VHC, care include administrarea a doi sau mai mulţi compuşi selectaţi din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16 şi sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora la om.
Într-un alt exemplu de realizare invenţia se referă la o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor de VHC cu rezistenţă la agenţii antivirali coadministraţi oral la om, care include administrarea a doi sau mai mulţi compuşi selectaţi dintre Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16 şi sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora la om.
Într-un alt exemplu de realizare invenţia se referă la utilizarea a doi sau mai mulţi compuşi selectaţi dintre Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16 şi sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora în terapia medicală.
Într-un alt exemplu de realizare invenţia se referă la utilizarea a doi sau mai mulţi compuşi selectaţi dintre Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16 şi sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora pentru tratamentul profilactic sau terapeutic al unei infecţii virale (de exemplu, VHC).
Într-un alt exemplu de realizare invenţia se referă la utilizarea unei compoziţii a invenţiei pentru tratamentul profilactic sau terapeutic al unei infecţii virale (de exemplu, VHC).
Într-un alt exemplu de realizare invenţia se referă la utilizarea a doi sau mai mulţi compuşi selectaţi dintre Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16 şi sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora pentru a prepara un medicament pentru tratarea unei infecţii virale (de exemplu, VHC) la om.
Într-un alt exemplu de realizare invenţia se referă la utilizarea unei compoziţii a invenţiei pentru a prepara un medicament pentru tratarea unei infecţii virale (de exemplu, VHC) la om.
Într-un alt exemplu de realizare invenţia se referă la utilizarea a doi sau mai mulţi compuşi selectaţi dintre Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16 şi sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora pentru a prepara un medicament pentru ameliorarea uneia sau a mai multor simptome ale unei infecţii virale (de exemplu, VHC) la om.
Într-un alt exemplu de realizare invenţia se referă la utilizarea unei compoziţii a invenţiei pentru prepararea unui medicament pentru ameliorarea uneia sau a mai multor simptome ale unei infecţii virale (VHC) la om.
Într-un alt exemplu de realizare invenţia se referă la utilizarea a doi sau mai mulţi compuşi selectaţi dintre Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16 şi sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora pentru a prepara un medicament pentru reducerea încărcăturii virale la om.
Într-un alt exemplu de realizare invenţia se referă la utilizarea unei compoziţii a invenţiei pentru prepararea unui medicament pentru reducerea încărcăturii virale la om.
Într-un alt exemplu de realizare invenţia se referă la utilizarea a doi sau mai mulţi compuşi selectaţi dintre Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16 şi sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora pentru a prepara un medicament pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţii antivirali coadministraţi oral la om.
Într-un alt exemplu de realizare invenţia se referă la utilizarea unei compoziţii a invenţiei pentru prepararea unui medicament pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţii antivirali coadministraţi oral la om.
Compoziţiile şi metodele invenţiei pot furniza „sinergie” şi „efecte sinergice”, adică efectul obţinut atunci când ingredientele active (inclusiv doi sau mai mulţi Compuşi Combinaţi) sunt utilizate împreună este mai mare decât suma efectelor care rezultă din utilizarea separată a compuşilor.
Compoziţiile şi metodele invenţiei sunt benefice, deoarece acestea oferă tratamente pentru o gama larga de genotipuri ale VHC şi pentru că acestea provoacă efecte secundare mai puţine sau mai puţin grave decât terapiile VHC curente (de exemplu, tratamente care includ administrarea interferonului). În plus, anumite combinaţii de compuşi (de exemplu, Compuşii 10 şi 5, Compuşii 10 şi 6 şi Compuşii 10, 5 şi 6) pot oferi un Raspuns Virusologic Sustinut (RVS), care este semnificativ mai mare decât cel realizat de terapiile curente (ex. terapiile VHC). De exemplu, unele combinaţii de compuşi pot oferi un RVS, care este cel puţin de aproximativ 70% sau cel puţin aproximativ 80%.
Descrierea detaliată a invenţiei
Definiţii
Dacă nu se prevede altfel, următorii termeni şi expresii utilizate în prezenta descriere sunt destinate a avea următoarele semnificaţii. Faptul că un anumit termen sau o expresie nu este definită în mod specific nu trebuie să fie corelat cu imprecizia sau să fie lipsit de claritate, ci mai degrabă termenii din prezenta descriere sunt utilizaţi în sensul lor obişnuit. Când denumiri comerciale se utilizează în prezenta descriere, solicitanţii intenţionează să includă în mod independent produsul cu denumirea comercială şi ingredientul(ele) farmaceutic(e) activ(e) al(e) produsului cu denumirea comercială.
Astfel cum este utilizat în prezenta descriere, termenul „Compuşi combinaţi” se referă la Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16.
După cum este utilizat în prezenta descriere, Compusul 1 este:
1.
Compusul 1 poate fi, de asemenea, menţionat ca 5-((6-(2,4-bis(trifluorometil)fenil)piridazin-3-il)metil)-2-(2-fluorofenil)-5H-imidazo[4,5-c]piridină sau 5H-imidazo[4,5-c]piridină, 5-[[6-[2,4-bis(trifluorometil)fenil]piridazin-3-il]metil]-2-(2-fluorofenil).
După cum este utilizat în prezenta descriere, Compusul 2 este:
2.
Compusul 2 poate fi, de asemenea, menţionat ca acid (2R,6S,13aR,14aS,16aS)-2-(8-cloro-2-(2-(izopropilamino)tiazol-4-il)-7-metoxichinolin-4-iloxi)-6-(ciclopentiloxicarbonilamino)-5,16-dioxooctadecahidrociclopropa[e]pirolo[1,2-a][1,4]diazaciclopentadecin-14a-il(2,6-diflurobenzil)fosfinic.
După cum este utilizat în prezenta descriere, Compusul 3 este:
3.
După cum este utilizat în prezenta descriere, Compusul 4 este:
4.
După cum este utilizat în prezenta descriere, Compusul 5 este:
5.
După cum este utilizat în prezenta descriere, Compusul 6 este:
6.
După cum este utilizat în prezenta descriere, Compusul 7 este:
7.
După cum este utilizat în prezenta descriere, Compusul 8 este:
8.
După cum este utilizat în prezenta descriere Compusul 9 (diastereomer la P) este:
9.
Referitor la Compusul 9, în ce priveşte fabricarea şi purificarea lui, referirea se face la [1] şi [2].
După cum este utilizat în prezenta descriere, Compusul 10 (S-izomerul Compusului 9) este:
10.
Referitor la Compusul 10, în ce priveşte fabricarea şi purificarea lui, referirea se face la [1] şi [2].
După cum este utilizat în prezenta descriere, Compusul 11 este:
11.
Referitor la Compusul 9, în ce priveşte fabricarea şi purificarea lui, referirea se face la US 2010081628 A1 2010.04.01.
După cum este utilizat în prezenta descriere, Compusul 12 (diastereomer la P) este:
12.
Referitor la Compusul 12, în ce priveşte fabricarea şi purificarea lui, referirea se face la US 2011015146 A1 2011.01.20.
După cum este utilizat în prezenta descriere, Compusul 13 (S-diastereomerul Compusului 12 la P) este:
13.
Referitor la Compusul 13, în ce priveşte fabricarea şi purificarea lui, referirea se face la US 2011015146 A1 2011.01.20.
După cum este utilizat în prezenta descriere, Compusul 14 este:
14.
Referitor la Compusul 14, în ce priveşte fabricarea şi purificarea lui, referirea se face la [1].
După cum este utilizat în prezenta descriere, Compusul 15 este:
15.
Referitor la Compusul 15, în ce priveşte fabricarea şi purificarea lui, referirea se face la [1].
După cum este utilizat în prezenta descriere, Compusul 16 este:
16.
Referitor la Compusul 16, în ce priveşte fabricarea şi purificarea lui, referirea se face la US 7429572 B2 2008.09.30.
Referitor la ribavirină, în legătură cu procedeul de fabricare, precum şi privitor la nomenclatura ei, referirea se face la EP 0093401 B1 1986.12.30.
După cum este utilizată în prezenta descriere, ribavirina se referă la:
Ribavirină.
Ribavirina este, de asemenea, menţionată ca 1-β-D-ribofuranozil-1H-1,2,4-Triazol-3-carboxamide, 1-β-D-ribofuranozil-1,2,4-triazol-3-carboxiamidă; 1-β-D-Ribofuranozil-1,2,4-triazol-3-carboxamidă; COPEGUS (Roche); DRG-0028; HSDB 6513; ICN 1229; MegaRibavirină (de exemplu în formulări de 100 mg de ribavirină/mL); CNVM 163039; RAVANEX (BioPartners); REBETOL (Schering-Plough; Aesca; Bayer Schering Pharma; Essex; Pfizer; Trading Pharma; Zuellig Pharma); Ribamidă; RIBAMIDIL (BioPharma, Rusia); RIBASPHERE (Three Rivers Pharmaceuticals); Ribavarină; Ribavirină; Tribavirină; VILONA (Valeant Pharmaceuticals; ICN Pharmaceuticals); VIRAMID (ICN Pharmaceuticals; Alfa Wassermann); VIRAZOLE (Valeant Pharmaceuticals); şi VIRIZADOLE (Uci-farma, Sao Bernardo do Campo, Sao Paulo, Brazilia). În plus, astfel cum este utilizat în prezenta descriere ribavirina include analogi ai ribavirinei, inclusiv taribavirina (viramidina, ICN 3142).
Termenul „interferon” include 1) interferoni, de exemplu, rIFN-alfa 2b pegilat (PEG-Intron, Merck & Co., Inc.), rIFN-alfa 2a pegilat (PEGASYS, Hoffmann-La Roche Inc.), rIFN-alfa 2b (INTRON®A, Merck & Co., Inc.), rIFN-alfa 2a (Roferon®-A, Hoffmann-La Roche Inc.), interferon alfa (Multiferon® Viranative AB Corporation, OPC-18, Alfaferone, Alfanative, subalin), interferon alfacon-1 (Valeant), interferon alfa-n1 (Wellferon™, Glaxo Wellcome), interferon alfa-n3 (ALFERON®-Hemispherx BioPharma, Inc.), interferon-beta-1a (AVONEX® Biogen Idec, DL-8234 Daiichi Pharmaceutical Co. Ltd), interferon-omega (omega Duros®, Alza Corporation, Intarcia Therapeutics, Inc.; Biomed 510, Intarcia Therapeutics, Inc.), albinterferon alfa-2b (ALBUFERON®, Human Genome Sciences, INC.), IFN alfa-2b XL, BLX-883 (LOSTERON®, Biolexs Therapeutics, INC.), DA-3021, interferon alfa-2b glicozilat (AVI-005), PEG-INFERGEN®, Amgen, Inc., interferon lambda-1 pegilat (tip III) (IL-29 PEGilat) şi BELEROFON®, Nautilus Biotech.
Termenul „terapie combinată” înseamnă compoziţii sau metode sau utilizări sau altele asemenea care încorporează doi sau mai mulţi Compuşi Combinaţi. Terapia combinată poate încorpora şi alte ingrediente active pe lângă doi sau mai mulţi Compuşi Combinaţi incluzând, dar nelimitându-se la: ribavirină, un interferon, un inhibitor al alfa-glucozidazei 1, un hepatoprotectant, un agonist al receptorului Toll (TLR)-7, un inhibitor al ciclofilinei, un inhibitor al intrării virale a VHC, un inhibitor al maturării VHC şi un inhibitor al IRES VHC.
Termenul „ingredient activ” înseamnă o componentă a unei terapii combinate care exercită sau poate exercita un efect farmaceutic incluzând oricare dintre Compuşii Combinaţi, ribavirină, un interferon, un inhibitor al alfa-glucozidazei 1, un hepatoprotectant, un agonist al TLR-7, un inhibitor al ciclofilinei, un inhibitor al intrării virale a VHC, un inhibitor al maturării VHC şi un inhibitor al IRES VHC.
Termenul „tratare” şi echivalentele gramaticale ale acestuia, atunci când este utilizat în contextul de tratare a unei boli, înseamnă încetinirea sau stoparea evoluţiei unei boli sau ameliorarea cel puţin a unui simptom al unei boli, mai preferabil ameliorarea a mai mult de un simptom al unei boli. De exemplu, un pacient cu VHC poate experimenta o îmbunătăţire în una sau toate dintre următoarele simptome care pot fi asociate cu infectia cu VHC: creşterea nivelelor alanin-aminotransferazei (ALT), febră, dureri de cap, dureri musculare, icter, oboseală, pierderea poftei de mâncare, greaţă, vărsături şi diaree. Tratamentul unei infecţii cu virusul hepatitei C poate include reducerea încărcăturii virale VHC într-o fiinţă umană infectată cu VHC.
Anumiţi compuşi descrişi în prezenta descriere conţin unul sau mai mulţi centri chirali, sau altfel pot fi capabili să existe ca stereoizomeri multipli. Domeniul de aplicare al prezentei invenţii include amestecuri de stereoizomeri, precum şi enantiomeri purificaţi sau amestecuri îmbogăţite enantiomeric/diastereomeric. De asemenea incluşi în domeniul de aplicare al invenţiei sunt izomerii individuali ai compuşilor reprezentaţi prin formulele prezentate în prezenta descriere, precum şi orice amestecuri echilibrate în întregime sau parţial ale acestora. Prezenta invenţie include de asemenea izomerii individuali ai compuşilor reprezentaţi prin formula prezentată în prezenta descriere ca amestecuri cu izomeri ai acestora în care unul sau mai mulţi centri chirali sunt inversaţi. Definiţiile şi convenţiile stereochimice utilizate aici urmează, în general, (S. P. Parker. Dictionary of Chemical Terms, 1984, McGraw-Hill Book Company, New York; Eliel E. şi Wilen S. Stereochemistry of Organic Compounds, 1994, John Wiley & Sons Inc., New York).
Mulţi compuşi organici există în forme active optic, adică, aceştia au capacitatea de a roti planul luminii cu polarizare plană. În descrierea unui compus optic activ, prefixele D şi L sau R şi S sunt utilizate pentru a desemna configuraţia absolută a moleculei raportată la centrul(ii) său(i) chiral(i). Prefixele d şi l sau (+) şi (-) sunt utilizate pentru a desemna semnul rotirii luminii cu polarizare plană de către compus, semnul (-) sau l este desemnat compusului levogir. Un compus prefixat cu (+) sau d este dextrogir.
Un stereoizomer specific poate fi, de asemenea, menţionat ca un enantiomer, şi un amestec de astfel de izomeri este deseori denumit amestec enantiomeric. Un amestec 50:50 de enantiomeri este menţionat ca un amestec racemic sau un racemat, care poate avea loc în cazul în care nu a existat nici o stereoselecţie sau stereospecificitate într-o reacţie chimică sau un proces chimic. Termenii „amestec racemic” şi „racemat” se referă la un amestec echimolar de două specii enantiomere, lipsit de activitate optică.
Combinaţii
Prezenta invenţie cuprinde combinaţii de doi sau mai mulţi dintre Compuşii Combinaţi. Tabelul I prezintă combinaţiile posibile bi-componente (Combinaţiile 1-21), tri-componente (Combinaţiile 22-56), quadri-componente (Combinaţiile 57-92) şi penta-componente (Combinaţiile 93-113) ale Compusului 1, Compusului 2, Compusului 3, Compusului 4, Compusului 5, Compusului 6, Compusului 7, Compusului 9, Compusului 10, Compusului 11, Compusului 12, Compusului 13, Compusului 14, Compusului 15 şi Compusului 16 ale invenţiei prezentate mai jos. Compusul 4, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16 sunt inhibitori nucleozidici ai polimerazei VHC NS5B iar combinaţiile de Compuşi Combinaţi vor include de cele mai multe ori numai unul dintre Compusul 4, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16 (vezi Coloana 6 din Tabelul I).
Tabelul I
Compusul 1 Compusul 2 Compusul 3 Compusul 4 sau Compusul 9 sau Compusul 10 sau Compusul 11 sau Compusul 12 sau Compusul 13 sau Compusul 14 sau Compusul 15 sau Compusul 16 Compusul 5 Compusul 6 Compusul 7 Combinaţia 1 X X Combinaţia 2 X X Combinaţia 3 X X Combinaţia 4 X X Combinaţia 5 X X Combinaţia 6 X X Combinaţia 7 X X Combinaţia 8 X X Combination 9 X X Combinaţia 10 X X Combinaţia 11 X X Combinaţia 12 X X Combinaaţia 13 X X Combinaţia 14 X X Combinaţia 15 X X Combinaţia 16 X X Combinaţia 17 X X Combinaţia 18 X X Combinaţia 19 X X Combinaţia 20 X X Combinaţia 21 X X Combinaţia 22 X X X Combinaţia 23 X X X Combinaţia 24 X X X Combinaţia 25 X X X Combinaţia 26 X X X Combinaţia 27 X X X Combinaţia 28 X X X Combinaţia 29 X X X Combinaţia 30 X X X Combinaţia 31 X X X Combinaţia 32 X X X Combinaţia 33 X X X Combinaţia 34 X X X Combinaţia 35 X X X Combinaţia 36 X X X Combinaţia 37 X X X Combinaţia 38 X X X Combinaţia 39 X X X Combinaţia 40 X X X Combinaţia 41 X X X Combinaţia 42 X X X Combinaţia 43 X X X Combinaţia 44 X X X Combinaţia 45 X X X Combinaţia 46 X X X Combinaţia 47 X X X Combinaţia 48 X X X Combinaţia 49 X X X Combinaţia 50 X X X Combinaţia 51 X X X Combinaţia 52 X X X Combinaţia 53 X X X Combinaţia 54 X X X Combinaţia 55 X X X Combinaţia 56 X X X Combinaţia 57 X X X X Combinaţia 58 X X X X Combinaţia 59 X X X X Combinaţia 60 X X X X Combinaţia 61 X X X X Combinaţia 62 X X X X Combinaţia 63 X X X X Combinaţia 64 X X X X Combinaţia 65 X X X X Combinaţia 66 X X X X Combinaţia 67 X X X X Combinaţia 68 X X X X Combinaţia 69 X X X X Combinaţia 70 X X X X Combinaţia 71 X X X X Combinaţia 72 X X X X Combinaţia 73 X X X X Combinaţia 74 X X X X Combinaţia 75 X X X X Combinaţia 76 X X X X Combinaţia 77 X X X X Combinaţia 78 X X X X Combinaţia 79 X X X X Combinaţia 80 X X X X Combinaţia 81 X X X X Combinaţia 82 X X X X Combinaţia 83 X X X X Combinaţia 84 X X X X Combinaţia 85 X X X X Combinaţia 86 X X X X Combinaţia 87 X X X X Combinaţia 88 X X X X Combinaţia 89 X X X X Combinaţia 90 X X X X Combinaţia 91 X X X X Combinaţia 92 Combinaţia 93 X X X X X Combinaţia 94 X X X X X Combinaţia 95 X X X X X Combinaţia 96 X X X X X Combinaţia 97 X X X X X Combinaţia 98 X X X X X Combinaţia 99 X X X X X Combinaţia 100 X X X X X Combinaţia 101 X X X X X Combinaţia 102 X X X X X Combinaţia 103 X X X X X Combinaţia 104 X X X X X Combinaţia 105 X X X X X Combinaţia 106 X X X X X Combinaţia 107 X X X X X Combinaţia 108 X X X X X Combinaţia 109 X X X X X Combinaţia 110 X X X X X Combinaţia 111 X X X X X Combinaţia 112 X X X X X Combinaţia 113 X X X X X
Compoziţii
Un aspect al prezentei invenţii include o compoziţie, de exemplu, o compoziţie farmaceutică, compoziţia conţinând Compusul 1 şi conţinând suplimentar un al doilea compus selectat din grupul constând din Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Într-un exemplu de realizare specifică a invenţiei, al doilea compus poate fi Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5 sau Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie, de exemplu, o compoziţie farmaceutică, compoziţia conţinând Compusul 2 şi conţinând suplimentar un al doilea compus selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Într-un exemplu de realizare specifică a invenţiei, al doilea compus poate fi Compusul 4. Într-un exemplu de realizare specifică a invenţiei, al doilea compus poate fi Compusul 3. Într-un exemplu de realizare specifică a invenţiei, al doilea compus poate fi Compusul 5.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie, de exemplu, o compoziţie farmaceutică, compoziţia conţinând Compusul 3 şi conţinând suplimentar un al doilea compus selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Într-un exemplu de realizare specifică a invenţiei, al doilea compus poate fi Compusul 1. Într-un exemplu de realizare specifică a invenţiei, al doilea compus poate fi Compusul 4. Într-un exemplu de realizare specifică a invenţiei, al doilea compus poate fi Compusul 5. Într-un exemplu de realizare specifică a invenţiei, al doilea compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie, de exemplu, o compoziţie farmaceutică, compoziţia conţinând un prim compus selectat din grupul constând din Compusul 4 şi conţinând suplimentar un al doilea compus selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7. Într-un exemplu de realizare specifică a invenţiei, al doilea compus poate fi Compusul 1 sau Compusul 2 sau Compusul 3 sau Compusul 6. Într-un exemplu de realizare specifică a invenţiei, al doilea compus poate fi Compusul 1. Într-un exemplu de realizare specifică a invenţiei, al doilea compus poate fi Compusul 2. Într-un exemplu de realizare specifică a invenţiei, al doilea compus poate fi Compusul 3. Într-un exemplu de realizare specifică a invenţiei, al doilea compus poate fi Compusul 5. Într-un exemplu de realizare specifică a invenţiei, al doilea compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie, de exemplu, o compoziţie farmaceutică, compoziţia conţinând Compusul 5 şi conţinând suplimentar un al doilea compus selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Într-un exemplu de realizare specifică a invenţiei, al doilea compus poate fi Compus 1. Într-un exemplu de realizare specifică a invenţiei, al doilea compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie, de exemplu, o compoziţie farmaceutică, compoziţia conţinând Compusul 6 şi conţinând suplimentar un al doilea compus selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Într-un exemplu de realizare specifică a invenţiei, al doilea compus poate fi Compusul 1. Într-un exemplu de realizare specifică a invenţiei, al doilea compus poate fi Compusul 2. Într-un exemplu de realizare specifică a invenţiei, al doilea compus poate fi Compusul 3. Într-un exemplu de realizare specifică a invenţiei, al doilea compus poate fi Compusul 4.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie, de exemplu, o compoziţie farmaceutică, compoziţia conţinând Compusul 7 şi conţinând suplimentar un al doilea compus selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie, de exemplu, o compoziţie farmaceutică, compoziţia conţinând un prim compus selectat din grupul constând din Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi compusul 16 şi conţinând suplimentar un al doilea compus selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie, de exemplu, o compoziţie farmaceutică, compoziţia conţinând Compusul 1 şi conţinând suplimentar un al doilea compus şi un al treilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 3, sau Compusul 4, sau Compusul 5 sau Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compus 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 3. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 5. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 5.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie, de exemplu, o compoziţie farmaceutică, compoziţia conţinând Compusul 2 şi conţinând suplimentar un al doilea compus şi un al treilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 5. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie, de exemplu, o compoziţie farmaceutică, compoziţia conţinând Compusul 3 şi conţinând suplimentar un al doilea compus şi un al treilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 1 sau Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 5.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie, de exemplu, o compoziţie farmaceutică, compoziţia conţinând un prim compus selectat din grupul constând din Compusul 4 şi conţinând suplimentar un al doilea compus şi un al treilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7. Al doilea compus poate fi Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3 sau Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 2. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 3. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 5. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 5.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie, de exemplu, o compoziţie farmaceutică, compoziţia conţinând Compusul 5 şi conţinând suplimentar un al doilea compus şi un al treilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 1.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie, de exemplu, o compoziţie farmaceutică, compoziţia conţinând Compusul 6 şi conţinând suplimentar un al doilea compus şi un al treilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3 sau Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 2. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 3. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 5. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 5. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 5.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie, de exemplu, o compoziţie farmaceutică, compoziţia conţinând Compusul 7 şi conţinând suplimentar un al doilea compus şi un al treilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie, de exemplu, o compoziţie farmaceutică, compoziţia conţinând un prim compus selectat din grupul constând din Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16 şi conţinând suplimentar un al doilea compus şi un al treilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie, de exemplu, o compoziţie farmaceutică, compoziţia conţinând Compusul 1 şi conţinând suplimentar un al doilea compus, un al treilea compus şi un al patrulea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5 sau Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi compusul 3 şi al treilea compus poate fie Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 2, al treilea compus poate fi Compusul 4, iar al patrulea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 3, al treilea compus poate fi Compusul 4, iar al patrulea compul poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie, de exemplu, o compoziţie farmaceutică, compoziţia conţinând Compusul 2 şi conţinând suplimentar un al doilea compus, un al treilea compus şi un al patrulea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie, de exemplu, o compoziţie farmaceutică, compoziţia conţinând Compusul 3 conţinând suplimentar un al doilea compus, un al treilea compus şi un al patrulea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 1 sau Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 4, al treilea compus poate fi Compusul 5, iar al patrulea compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie, de exemplu, o compoziţie farmaceutică, compoziţia conţinând un prim compus selectat din grupul constând din Compusul 4 şi conţinând suplimentar un al doilea compus, un al treilea compus şi un al patrulea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7. Al doilea compus poate fi Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3 sau Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 2. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 3. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie, de exemplu, o compoziţie farmaceutică, compoziţia conţinând Compusul 5 şi conbţinând suplimentar un al doilea compus, un al treilea compus şi un al patrulea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 1.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie, de exemplu, o compoziţie farmaceutică, compoziţia conţinând Compusul 6 şi conţinând suplimentar un al doilea compus, un al treilea compus şi un al patrulea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3 sau Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 2. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 3. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 4.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie, de exemplu, o compoziţie farmaceutică, compoziţia conţinând Compusul 7 şi conţinând suplimentar un al doilea compus, un al treilea compus şi un al patrulea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie, de exemplu, o compoziţie farmaceutică, compoziţia conţinând un prim compus selectat din grupul constând din Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16 şi conţinând suplimentar un al doilea compus, un al treilea compus şi un al patrulea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie, de exemplu, o compoziţie farmaceutică, compoziţia conţinând Compusul 1 şi conţinând suplimentar un al doilea compus, un al treilea compus, un al patrulea compus şi un al cincilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5 sau Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie, de exemplu, o compoziţie farmaceutică, compoziţia conţinând Compusul 2 şi conţinând suplimentar un al doilea compus, un al treilea compus, un al patrulea şi un al cincilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie, de exemplu, o compoziţie farmaceutică, compoziţia conţinând Compusul 3 şi conţinând suplimentar un al doilea compus, un al treilea compus, un al patrulea şi un al cincilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 1 sau Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie, de exemplu, o compoziţie farmaceutică, compoziţia conţinând un prim compus selectat din grupul constând din Compusul 4 şi conţinând suplimentar un al doilea compus, un al treilea compus, un al patrulea şi un al cincilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7. Al doilea compus poate fi Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3 sau Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 2. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 3. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie, de exemplu, o compoziţie farmaceutică, compoziţia conţinând Compusul 5 şi conţinând suplimentar un al doilea compus, un al treilea compus, un al patrulea şi un al cincilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 1.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie, de exemplu, o compoziţie farmaceutică, compoziţia conţinând Compusul 6 şi conţinând suplimentar un al doilea compus, un al treilea compus, un al patrulea şi un al cincilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3 şi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 2. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 3. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 4.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie, de exemplu, o compoziţie farmaceutică, compoziţia conţinând Compusul 7 şi conţinând suplimentar un al doilea compus, un al treilea compus, un al patrulea şi un al cincilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie, de exemplu, o compoziţie farmaceutică, compoziţia conţinând un prim compus selectat din grupul constând din Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16 şi conţinând suplimentar un al doilea compus, un al treilea compus, un al patrulea compus şi un al cincilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7.
Săruri
Compuşii Combinaţi şi alte ingrediente active pot fi sub formă de o sare. De obicei, dar nu absolut, sărurile Compuşilor Combinaţi şi alte ingrediente active sunt săruri acceptabile farmaceutic. Sărurile cuprinse în termenul „săruri acceptabile farmaceutic” se referă la săruri netoxice ale Compuşilor Combinaţi şi/sau alte ingrediente active. Exemplele de săruri acceptabile farmaceutic potrivite includ săruri de adiţie de acizi anorganici, cum ar fi clorura, bromura, sulfatul, fosfatul şi nitratul; săruri de adiţie de acizie organici, cum ar fi acetatul, galactaratul, propionatul, succinatul, lactatul, glicolatul, malatul, tartratul, citratul, maleatul, fumaratul, metansulfonatul, p-toluensulfonatul şi ascorbatul; săruri cu aminoacizi acidici, cum ar fi aspartatul şi glutamatul; săruri de metale alcaline, cum ar fi sarea de sodiu şi sarea de potasiu; săruri de metale alcalino-pământoase, cum ar fi sarea de magneziu şi sarea de calciu; sarea de amoniu; săruri bazice organice, cum ar fi sare de trimetilamină, sare de trietilamină, sare de piridină, sarea de picolină, sarea de diciclohexilamină şi sarea de N,N'-dibenziletilendiamină; şi săruri cu aminoacizi bazici, cum ar fi sarea de lizină şi sarea de arginină. Sărurile pot fi în unele cazuri hidraţi sau solvaţi de etanol.
Formulări farmaceutice
Compuşii Combinaţi şi/sau alte ingrediente active pot fi formulate cu purtători sau excipienţi convenţionali, care pot fi selectaţi în conformitate cu practica obişnuită. Tabletele conţin de obicei excipienţi, glidanţi, umpluturi, lianţi şi alte asemănătoare. Formulările apoase pot fi preparate sub formă sterilă, şi atunci când sunt destinate livrării alta decât administrarea orală vor fi, în general, izotonice. Toate formulările vor conţine opţional excipienţi, cum ar fi cei prezentaţi în Handbook of Pharmaceutical Excipients (Handbook of pharmaceutical excipients. Front Cover. Academy of Pharmaceutical Sciences. American Pharmaceutical Association, 1986 - Medical), încorporat în părezenta descriere în întregime prin referinţă. Excipienţii includ acid ascorbic şi alţi antioxidanţi, agenţi de chelatizare, cum ar fi EDTA, carbohidraţi cum ar fi dextrina, hidroxialchilceluloza, hidroxialchilmetilceluloza, acidul stearic şi altele asemănătoare.
PH-ul formulărilor variază de la aproximativ 3 la aproximativ 11, dar este de obicei în jur de la 7 până la 10.
Deoarece este posibil ca un ingredient activ să fie administrat singur, ar fi preferabil ca unul sau mai multe ingrediente active să fie prezentate ca formulări farmaceutice. Formulările invenţiei, atât pentru uz veterinar, cât şi pentru uz uman, cuprind cel puţin un ingredient activ, împreună cu unul sau mai mulţi purtători acceptabili şi opţional alte ingrediente terapeutice. Purtătorul(ii ) trebuie să fie „acceptabil(i)” în sensul de a fi compatibil(i) cu celelalte ingrediente ale formulării şi fiziologic inofensiv(i) pentru recipient.
Formulările le includ pe cele potrivite pentru căile de administrare descrise mai jos. Formulările pot fi prezentate comod sub formă medicamentoasă standartizată şi pot fi preparate prin oricare dintre metodele bine cunoscute în domeniul farmaceutic. Tehnicile şi formulările pot fi găsite, în general, în: Remington's pharmaceutical sciences, 17th ed. Edited by Alfonso R. Gennaro. Mack Publishing Co., 20th and Northampton Streets, Easton, PA 18042. 1985. Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, Pa.), încorporată aici în întregime prin referinţă. Astfel de metode includ etapa de aducere în asociere a unui ingredient activ cu purtătorul care constituie unul sau mai multe ingrediente suplimentare. În general, formulările pot fi preparate prin aducerea în asociere uniformă şi foarte apropiată a unuia sau a mai multor ingrediente active cu purtătorii lichizi sau purtătorii solizi divizaţi fin sau cu ambii, şi apoi, dacă este necesar, se formează produsul.
Formulările prezentei invenţii indicate pentru administrare orală pot fi prezentate ca unităţi discrete cum ar fi capsulele, caşetele sau tabletele, fiecare conţinând o cantitate predeterminată de un ingredient activ; după cum o pulbere sau granule; după cum o soluţie sau o suspensie într-un lichid apos sau neapos; sau ca o emulsie lichidă ulei-în-apă sau o emulsie lichidă apă-în-ulei. Un ingredient activ poate fi, de asemenea, administrat sub formă de bolus, excipient sau pastă.
O tabletă poate fi preparată prin comprimare sau turnare, opţional cu unul sau mai multe ingrediente suplimentare. Tabletele comprimate pot fi preparate prin comprimarea într-o maşină corespunzătoare a unui ingredient activ într-o formă cu curgere liberă, cum ar fi o pulbere sau granule, opţional amestecate cu un liant, lubrifiant, diluant inert, conservant, agent tensoactiv sau dispersant. Tabletele turnate pot fi preparate prin turnarea într-o maşină corespunzătoare a unui amestec de ingredient activ pulverulent umectat cu un diluant lichid inert. Tabletele pot fi opţional acoperite sau marcate şi opţional pot fi formulate astfel încât să asigure o eliberare lentă sau controlată a ingredientului activ.
Pentru administrare la ochi sau alte ţesuturi externe de exemplu, gură şi piele, formulările pot fi aplicate preferabil ca un unguent sau cremă de uz extern care conţine un ingredient(e) activ(e) într-o cantitate, de exemplu, de 0,075 la 20% m/m (inclusiv ingredient(e) activ(e) într-un interval cuprins între 0,1% şi 20% în incremente de 0,1% m/m, cum ar fi 0,6% m/m, 0,7% m/m, etc.), preferabil 0,2 la 15% m/m şi cel mai preferabil 0,5 la 10% m/m. Când formulatele sunt un unguent, un ingredient activ poate fi folosit fie cu o bază parafinică sau fie cu unguent miscibil cu apa. Alternativ, un ingredient activ poate fi formulat într-o cremă bazată pe cremă ulei-în-apă.
Dacă se doreşte, faza apoasă a bazei de cremă poate include, de exemplu, cel puţin 30% m/m de un alcool polihidric, adică un alcool având două sau mai multe grupări hidroxil, cum ar fi propilenglicolul, butan 1,3-diolul, manitolul, sorbitolul, gliceroluk şi polietilenglicolul (inclusiv PEG 400) şi amestecurile acestora. Formulările de uz extern pot include de preferinţă un compus care intensifică absorbţia sau penetrarea ingredientului activ prin piele sau alte zone afectate. Exemplele de astfel de intensificatori ai penetrării dermice includ dimetilsulfoxidul şi analogii săi înrudiţi.
Faza uleioasă ale emulsiilor de Compuşi Combinaţi şi/sau alte ingrediente active poate fi constituită din ingrediente cunoscute şi într-un mod cunoscut. În timp ce faza poate cuprinde doar o substanţă chmică folosită la obţinerea emulsiilor (altfel cunoscut ca un emulgator), aceasta cuprinde, de preferinţă, un amestec de cel puţin un emulgator cu o grăsime sau un ulei sau atât cu o grăsime, cât şi cu un ulei. De preferinţă, un emulgator hidrofilic este inclus împreună cu un emulgator lipofilic, care acţionează ca un stabilizator. De asemenea, este de preferat să se includă atât un ulei, cât şi o grăsime. Împreună, emulgatorul(ii) cu sau fără stabilizator(i) constituie aşa-zisa ceară emulsionantă, iar ceara împreună cu uleiul şi grăsimea constituie aşa-zisa bază emulsionantă de unguent, care formează faza uleioasă dispersată a formulărilor cremoase.
Emulgatorii şi stabilizatorii de emulsie potriviţi pentru utilizare în formularea invenţiei includ Tween®60 (ICI Americas Inc.), Span 80, alcool cetostearilic, alcool benzilic, alcool miristilic, monostearat de gliceril şi lauril sulfat de sodiu.
Alegerea uleiurilor sau grăsimilor potrivite pentru formulare se bazează pe atingerea proprietăţilor cosmetice dorite. Crema trebuie să fie, de preferinţă, un produs lavabil non-gras şi non-colorant cu consistenţă potrivită pentru a evita scurgerea din tuburi sau alte containere. Catena liniară sau ramificată ale alchil esterilor mono- sau dibazici, cum ar fi di-izoadipatul, stearatul de izocetil, diesterul propilenglicol al acizilor graşi de cocos, miristatul de izopropil, oleatul de decil, palmitatul de izopropil, stearatul de butil, palmitatul de 2-etilhexil sau un amestec de esteri cu catenă ramificată cunoscuţi ca Crodamol CAP poate fi utilizată, ultimii trei esteri fiind preferaţi. În funcţie de proprietăţile necesare aceştia pot fi utilizaţi aparte sau în combinaţie. Alternativ pot fi utilizate lipidele cu punct de topire ridicat cum ar fi parafina moale albă şi/sau parafina lichidă sau alte uleiuri minerale.
Formulările farmaceutice conform prezentei invenţii conţin unul sau mai multe ingrediente active, împreună cu unul sau mai mulţi purtători sau excipienţi acceptabili farmaceutic şi, opţional, alţi agenţi terapeutici. Formulările farmaceutice care conţin ingrediente active pot fi sub orice formă potrivită pentru metoda de administrare dorită. Atunci când sunt utilizate pentru uz oral, pot fi preparate, de exemplu, tablete, pastile, comprimate, suspensii apoase sau uleioase, pulberi sau granule dispersabile, emulsii, capsule tari sau moi, siropuri sau elixiruri. Compoziţiile destinate utilizării orale pot fi preparate conform oricărei metode cunoscute în domeniul tehnicii pentru fabricarea compoziţiilor farmaceutice şi aceste compoziţii pot conţine unul sau mai mulţi agenţi, inclusiv agenţi de îndulcire, agenţi de aromatizare, agenţi de colorare şi agenţi de conservare, pentru a oferi un preparat gustos. Tabletele care conţin un ingredient activ în amestec cu un excipient acceptabil farmaceutic netoxic, care sunt potriviţi pentru fabricarea tabletelor la fel sunt acceptabile. Aceşti excipienţi pot fi, de exemplu, diluanţi inerţi, cum ar fi carbonatul de calciu sau de sodiu, lactoză, lactoză monohidrată, croscarmeloza sodică, povidona, fosfatul de calciu sau de sodiu; agenţii de granulare şi dezintegrare, cum ar fi amidonul de porumb sau acidul alginic; agenţii de legare, cum ar fi celuloza, celuloza microcristalină, amidonul, gelatina sau acacia; şi agenţi lubrifianţi, cum ar fi stearatul de magneziu, acidul stearic sau talcul. Tabletele pot fi neacoperite sau pot fi acoperite prin tehnici cunoscute, inclusiv microîncapsulare pentru a întârzia dezintegrarea şi adsorbţia în tractul gastrointestinal şi astfel să asigure o acţiune prelungită pentru o perioadă mai lungă. De exemplu, un material cu acţiune întârziată, cum ar fi glicerilmonostearatul sau glicerildistearatul care pot fi utilizate aparte sau cu o ceară.
Formulările pentru utilizare orală pot fi, de asemenea, prezentate sub formă de capsule gelatinoase tari în care un (unele) ingredient(e) activ(e) este(sunt) amestecat(e) cu un diluant solid inert, de exemplu, fosfatul de calciu sau caolina, sau capsule gelatinoase moi în care un ingredient activ este amestecat cu apă sau un mediu uleios, cum ar fi uleiul de arahide, parafina lichidă sau uleiul de măsline.
Suspensiile apoase conform invenţiei conţin materialele active în amestec cu excipienţi potriviţi pentru fabricarea suspensiilor apoase. Astfel de excipienţi includ un agent de suspendare, cum ar fi carboximetilceluloza de sodiu, metilceluloza, hidroxipropilmetilceluoza, alginatul de sodiu, polivinilpirolidona, guma tragacantă şi guma acacia şi agenţi de dispersare sau umectare, cum ar fi o fosfatida produsă în mod natural (de exemplu, lecitina), un produs de condensare al unui alchilenoxid cu un acid gras (de exemplu, stearatul de polioxietilen), un produs de condensare al etilenoxidului cu un alcool alifatic cu lanţ lung (de exemplu, heptadecaetilenoxicetanolul), un produs de condensare al etilenoxidului cu un ester parţial derivat dintr-un acid gras şi o hexitolanhidridă (de exemplu, polioxietilensorbitanmonooleatul). Suspensia apoasă poate conţine, de asemenea, unul sau mai mulţi agenţi de conservare precum etilul sau n-propil p-hidroxi-benzoatul, unul sau mai mulţi agenţi de colorare, unul sau mai mulţi agenţi aromatizanţi şi unul sau mai mulţi agenţi de îndulcire, precum zaharoza sau zaharina.
Suspensiile uleioase pot fi formulate prin suspensionarea unui ingredient activ într-un ulei vegetal, cum ar fi uleiul de arahide, uleiul de măsline, uleiul de susan sau uleiul de cocos, sau într-un ulei mineral, cum ar fi parafina lichidă. Suspensiile orale pot conţine un agent de îngroşare, cum ar fi ceara de albine, parafina tare sau alcoolul cetilic. Pot fi adăugaţi agenţi de îndulcire, cum ar fi cei prezentaţi în prezenta descriere, şi agenţi de aromatizare, pentru a pregăti un preparat oral gustos. Aceste compoziţii pot fi conservate prin adăugarea unui antioxidant, cum ar fi acidul ascorbic.
Pulberile şi granulele dispersabile din invenţie potrivite pentru prepararea unei suspensii apoase prin adăugarea apei furnizează un ingredient activ în amestec cu un agent de dispersare sau umectare, cu un agent de suspendare şi cu unul sau mai mulţi conservanţi. Agenţii de dispersare sau umectare potriviti şi agenţii de suspendare sunt exemplificaţi de cei descrişi mai sus. Excipienţii suplimentari, de exemplu agenţii de îndulcire, aromatizare şi colorare, pot fi de asemenea prezenţi.
Compoziţiile farmaceutice ale invenţiei pot fi de asemenea sub formă de emulsii ulei-în-apă. Faza uleioasă poate fi un ulei vegetal, cum ar fi uleiul de măsline sau uleiul de arahide, un ulei mineral, cum ar fi parafina lichidă, sau un amestec al acestora. Agenţii de emulsionare potriviţi includ gume produse natural, cum ar fi guma acacia şi guma tragacant, fosfatide produse în mod natural, cum ar fi lecitina de soia, esterii sau esterii parţiali derivaţi din acizi graşi şi hexitolanhidridă, de exemplu sorbitanul şi produse de condensare ale acestor esteri parţiali cu etilenoxida, cum ar fi polioxietilensorbitana. Emulsia poate conţine de asemenea agenţi îndulcitori şi aromatizanţi. Siropurile şi elixirele pot fi formulate cu agenţi de îndulcire, cum ar fi glicerolul, sorbitolul sau zaharoza. Astfel de formulări pot conţine de asemenea un agent emolient, conservant, aromatizant sau colorant.
Compoziţiile farmaceutice ale invenţiei pot fi sub forma unui preparat injectabil steril, cum ar fi o suspensie apoasă sau oleaginoasă injectabilă sterilă. Această suspensie poate fi formulată conform stadiului cunoscut al tehnicii folosind agenţii potriviţi de dispersare sau umectare şi agenţi de suspendare care au fost menţionaţi în prezenta invenţie. Preparatul injectabil steril poate fi de asemenea o soluţie sau suspensie injectabilă sterilă într-un diluant sau solvent acceptabil parenteral netoxic, cum ar fi o soluţie în 1,3-butan-diol sau preparat sub formă de pulbere liofilizată. Printre vehiculele şi solvenţii acceptabili care pot fi folosiţi sunt apa, soluţia Ringer şi soluţia izotonică de clorură de sodiu. În plus, uleiurile fixe sterile pot fi în mod convenţional utilizate ca solvent sau mediu de suspensionare. În acest scop, poate fi utilizat orice ulei stabil neiritant, inclusiv mono - sau digliceridele sintetice. În plus, la prepararea produselor injectabile, de asemenea, pot fi utilizaţi acizii graşi precum acidul oleic.
Cantitatea de ingredient activ care poate fi combinată cu materialul purtător pentru a produce o singură formă medicamentoasă va varia în funcţie de modul particular de administrare şi de pacientul tratat. De exemplu, o formulare cu eliberare în timp destinată administrării pe cale orală la oameni poate conţine aproximativ de la 1 la 1000 mg de material activ compus cu o cantitate corespunzătoare şi convenabilă de material purtător care poate varia de la circa 5 la circa 95% din totalul compoziţiilor (masă:masă). Compoziţia farmaceutică poate fi preparată pentru a asigura cantităţi uşor măsurabile pentru administrare. De exemplu, o soluţie apoasă destinată pentru injecţie intravenoasă poate conţine aproximativ de la 3 la 500 µg dintr-un ingredient activ per mililitru de soluţie pentru injecţia unui volum corespunzător la un debit de aproximativ 30 mL/oră.
Formulările potrivite pentru administrare la ochi includ picături de ochi în care un ingredient activ este dizolvat sau suspensionat într-un purtător potrivit, în special un solvent apos pentru un ingredient activ. Un ingredient activ este de preferinţă prezent în astfel de formulări într- o concentraţie de la 0,5 până la 20%, în mod avantajos 0,5 la 10% în particular aproximativ 1,5% m/m.
Formulările potrivite pentru administrare locală în gură includ pastile de subt conţinând un ingredient activ într-o bază aromată, de obicei zaharoză şi acacie sau tragacant; pastile conţinând un ingredient activ într-o bază inertă, cum ar fi gelatina şi glicerina sau sucroza şi acacia; şi gargare care conţin un ingredient activ într-un purtător lichid potrivit.
Formulările pentru administrare rectală pot fi prezentate ca un supozitor cu o bază potrivită conţinând, de exemplu, unt de cacao sau un salicilat.
Formulările potrivite pentru administrare intrapulmonară sau nazală o dimensiune a particulelor de exemplu în intervalul de la 0,1 la 500 µm (inclusdiv dimensiuni ale particulelor într-un interval cuprins între 0,1 şi 500 µm în incremente, cum ar fi 0,5 µm, 1 µm, 30 µm, 35 µm etc.), acestea fiind administrate prin inhalare rapidă prin canalul nazal sau prin inhalare pe gură, astfel încât să se ajungă la sacii alveolari. Formulările potrivite includ soluţii apoase sau uleioase de un ingredient activ. Formulările potrivite pentru administrarea aerosolilor sau pulberilor uscate pot fi preparate conform metodelor tradiţionale şi pot fi livrate cu alţi agenţi terapeutici, cum ar fi compuşii utilizaţi până acum în tratamentul sau profilaxia infecţiilor descrise în prezenta invenţie.
Formulările potrivite pentru administrarea vaginală pot fi prezentate ca pesare, tampoane, creme, geluri, paste, spume sau formulări de pulverizare care mai conţin în afară de ingredientul activ asemenea purtători care sunt cunoscuţi în nivelul tehnicii ca fiind corespunzători.
Formulările potrivite pentru administrare parenterală includ soluţii apoase şi neapoase injectabile sterile care pot conţine antioxidanţi, soluţii-tampoan, substanţe bacteriostatice şi dizolvate care oferă formularea izotonică cu sângele viitorului recipient; şi suspensii apoase şi neapoase sterile care pot include agenţi de suspensionare şi agenţi de îngroşare.
Formulările pot fi prezentate în containere cu doză unitară sau multi-doză, de exemplu fiole şi flacoane sigilate, şi pot fi depozitate într-o stare liofilizată care necesită doar adăugarea purtătorului lichid steril, de exemplu apă pentru injecţie, imediat înainte de utilizare. Soluţiile şi suspensiile injectabile extemporanee pot fi preparate din pulberi sterile, granule şi tablete de tipul descris anterior. Unitatea de dozaj preferenţială a formulării poate fi aceia care conţine o doză zilnică sau o unitate sub-doză zilnică, aşa cum s-a menţionat mai sus, sau o fracţiune potrivită a acesteia, a unui ingredient activ.
Se va înţelege că, pe lângă ingredientele menţionate în particular mai sus, formulările de Compuşi Combinaţi şi/sau alte ingrediente active, pot include alţi agenţi tradiţionali în nivelul tehnicii având în vedere tipul formulării în cauză, de exemplu cele potrivite pentru administrare orală pot include agenţi de aromatizare.
Compuşii Combinaţi şi alte ingrediente active pot fi de asemenea formulate pentru a asigura eliberarea controlată a unui ingredient activ pentru a permite administrarea dozei mai rară sau pentru a îmbunătăţi profilul farmacocinetic sau de toxicitate al ingredientului activ. În consecinţă, invenţia prevede de asemenea compoziţii care conţin doi sau mai mulţi dintre Compuşii Combinaţi formulaţi pentru eliberarea prelungită sau controlată.
Dozarea
Doza eficientă a unui ingredient activ depinde cel puţin de natura afecţiunii de tratat, de toxicitate, dacă compusul este utilizat în scop profilactic (doze mai mici) sau împotriva unei boli sau stări active, de metoda de administrate şi formularea farmaceutică, sau poate fi determinată de clinician folosind studiile tradiţionale de creştere a dozei.
Prin exemplu, compoziţiile invenţiei (de exemplu, tabletele) pot fi formulate pentru a asigura dozele efective. De exemplu, în ceea ce priveşte Compusul 1, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, compoziţia poate conţine de la 1,0 mg până la 100 mg, de la 5 mg până la 40 mg, de la 30 mg până la 50 mg, sau 20 mg sau 40 mg şi poate fi adaptată pentru a fi administrată o dată sau de mai multe ori pe zi la o fiinţă umană care necesită aceasta, în combinaţie cu unul sau mai mulţi dintre Compusul 2, Compusul 3, Compusul 6, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Referitor la Compusul 2 sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, compoziţia poate conţine de la 25 mg până la 800 mg, de la 50 mg până la 400 mg, sau de la 60 mg până la 300 mg sau de la 70 mg până la 200 mg sau poate fi de 150 mg şi poate fi adaptată pentru a fi administrată o dată sau de mai multe ori pe zi la o fiinţă umană care necesită aceasta, în combinaţie cu unul sau mai mulţi dintre Compusul 1, Compusul 3, Compusul 6, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Referitor la Compusul 3 sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, compoziţia poate conţine de la 10 mg până la 1000 mg sau 50 la 400 mg, sau 100 mg la 400 mg sau 200 mg la 400 mg şi poate fi adaptată pentru a fi administrată o dată sau de mai multe ori pe zi la o fiinţă umană care necesită aceasta, în combinaţie cu unul sau mai mulţi dintre Compusul 1, Compusul 2, Compusul 6, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Referitor la Compusul 4 sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, compoziţia poate conţine de la 25 mg la 400 mg sau de la 25 mg la 200 mg şi poae fi adaptată pentru a fi administrată o dată sau de mai multe ori pe zi la o fiinţă umană care necesită aceasta, în combinaţie cu unul sau mai mulţi dintre Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 6, Compusul 5 şi Compusul 7. Referitor la Compusul 5 sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, compoziţia poate conţine de la 50 mg până la 1000 mg sau 100 mg la 750 mg şi poate fi adaptată pentru a fi administrată o dată sau mai multe ori pe zi la un om care necesită aceasta, în combinaţie cu unul sau mai mulţi dintre Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 6, Compusul 4, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Referitor la Compusul 6 sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, compoziţia poate conţine de la 1 mg la 500 mg sau de la 3 mg până la 300 mg, sau de la 3 mg până la 200 mg, sau de la 3 mg până la 100 mg, sau de la 10 mg până la 90 mg, sau de 30 mg până la 90 mg şi poate fi adaptată pentru a fi administrată o dată sau de mai multe ori pe zi la o fiinţă umană care necesită aceasta, în combinaţie cu unul sau mai mulţi dintre Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Referitor la Compusul 7 sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, compoziţia poate conţine de la 100 micrograme până la 3000 mg, de la 25 mg până la 2000 mg, sau de la 50 mg până la 1000 mg şi poate fi adaptată pentru a fi administrată o dată sau mai multe ori pe zi (de exemplu, patru ori pe zi) la o fiinţă umană care necesită aceasta, în combinaţie cu unul sau mai mulţi dintre Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Referitor la Compuşii 9 şi 10, sau sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora, compoziţia poate conţine 10 mg până la 1000 mg pe zi [2]. Referitor la Compusul 11, sau sărurile acceptabile farmaceutic ale acestuia, compoziţia poate conţine 1 mg până la 1000 mg pe zi (US 20100143301 A1 2010.06.10). Pentru a ţine cont de interacţiunile medicament-medicament posiblile, dozele pentru Compuşii 1-7, care sunt coadministrate, ar fi necesar să fie ajustate. De exemplu, cu toate că aparent Compusul 1 nu afectează sistemele de metabolizare a medicamentelor, Compusul 2 pare să aibă efectul creşterii expunerii Compusului 1 de aproximativ 2-3 ori. Prin urmare, o reducere anticipată a dozei (de exemplu, de 2-3 ori) a Compusului 1 ar fi dorită în cazul când Compusul 1 este combinat cu Compusul 2. În combinaţie cu Compusul 16, Compusul 2 pare să aibă efectul creşterii expunerii Compusului 6 de aproximativ 5 ori, deci reducerea anticipată a dozei (de exemplu, de 3-5 ori) a Compusului 16 ar fi dorită când Compusul 16 este dozat cu Compusul 2. Prin urmare, o doză de 10 mg de Compusul 6 când este coadministrată cu Compusul 2 corespunde aproximativ unei doze de 30 mg.
Doi sau mai mulţi Compuşi Combinaţi pot fi administraţi în asociere cu Ribavirina în cantităţi de circa 800 mg, 1000 mg sau 1200 mg pe zi în doze unice sau multiple (de exemplu, circa 400 mg, 500 mg sau 600 mg de două ori pe zi).
Utilizarea Combinaţiilor invenţiei
În practica acestui aspect al invenţiei, Compuşii Combinaţi pot fi utilizaţi în dozele indicate mai sus.
Un aspect al prezentei invenţii include Compusul 1 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 1 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus selectat din grupul constând din Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5 sau Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 2 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 2 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 4.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 3 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 3 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 1 sau Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 4 pentru utilizare întro metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 4 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7. Al doilea compus poate fi Compusul 1 sau Compusul 2, sau Compusul 3, sau Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 5 pentru utilizare într o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 5 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 1.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 6 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 6 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3 sau Compusul 4.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 7 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 7 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 9 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 9 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 10 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 10 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 11 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 11 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 12 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 12 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 13 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 13 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 14 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 14 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 15 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 15 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 16 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 16 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 1 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 1 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus şi un al treilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 3 sau Compusul 4, sau Compusul 5 sau Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 2 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 2 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus şi un al treilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 3 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 3 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus şi un al treilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 1 sau Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 4.. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 4 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 4 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus şi un al treilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7. Al doilea compus poate fi Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3 sau Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 2. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 3. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 5 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 5 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus şi un al treilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 1.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 6 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 6 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus şi un al treilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3 sau Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 2. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 3. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 4.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 7 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 7 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus şi un al treilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 9 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 9 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus şi un al treilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7.
Un alt aspect alprezentei invenţii include compusul 10 pentru utilizare într-o metodă de tratare a VHC, în care Compusul 10 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus şi un al treilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 11 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 11 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus şi un al treilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 1 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 1 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus, un al treilea compus şi un al patrulea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5 sau Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 2 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 2 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus, un al treilea compus şi un al patrulea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 3 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 3 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus, un al treilea compus şi un al patrulea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 1 sau Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 4 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 4 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus, un al treilea compus şi un al patrulea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7. Al doilea compus poate fi Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3 sau Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 2. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 3. Al doilea compus poate fi Compus 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 5 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 5 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus, un al treilea compus şi un al patrulea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 1.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 6 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 6 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus, un al treilea compus şi un al patrulea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3 sau Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 2. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 3. Al doilea compus poate fi compus 4 şial treilea compus poate fi compusul 6 .Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 4.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 7 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 7 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus, un al treilea compus şi un al patrulea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 9 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 9 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus, un al treilea compus şi un al patrulea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 10 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 10 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus, un al treilea compus şi un al patrulea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 11 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 11 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus, un al treilea compus şi un al patrulea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 1 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 1 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus, un al treilea compus, un al patrulea compus şi un al cincilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5 sau Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 2 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 2 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus, un al treilea compus, un al patulea compus şi un al cincilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 3 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 3 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus, un al treilea compus, un al patrulea compus şi un al cincilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 1 sau Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 4 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 4 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus, un al treilea compus, un al patrulea compus şi un al cincilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7. Al doilea compus poate fi Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3 sau Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 2. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 3. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 5 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 5 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus, un al treilea compus, un al patrulea compus şi un al cincilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 1.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 6 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 6 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus, un al treilea compus, un al patrulea compus şi un al cincilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3 sau Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 2. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 3. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 4.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 7 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 7 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus, un al treilea compus, un al patrulea compus şi un al cincilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 9 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 9 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus, un al treilea compus, un al patrulea compus şi un al cincilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 10 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 10 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus, un al treilea compus, un al patrulea compus şi un al cincilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7.
Un alt aspect al prezentei invenţii include Compusul 11 pentru utilizare într-o metodă de tratare a infecţiilor VHC, în care Compusul 11 este utilizat în combinaţie cu un al doilea compus, un al treilea compus, un al patrulea compus şi un al cincilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7.
Un aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 1 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus selectat din grupul constând Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5 sau Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 2 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 4.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 3 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 1 sau Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 4 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7. Al doilea compus poate fi Compusul 1 sau Compusul 2, sau Compusul 3, sau Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 5 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 1.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 6 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3 sau Compusul 4.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 7 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 9 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 10 şi incluzând suplimentart administrarea unui al doilea compus selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uma şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea compusului 11 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 1 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus şi un al treilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 3 sau Compusul 4, sau Compusul 5, sau Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treia compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 2 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus şi unui al treilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16 Al .doilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 3 şi incluzând suplimerntar administrarea unui al doilea compus şi unui al treilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 1 sau Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 4 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus şi unui al treilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7. Al doilea compus poate fi Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3 sau Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 2. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 3. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 5 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus şi unui al treilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 1.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 6 şi incluyzând suplimentar administrarea unui al doilea compus şi unui al treilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3 sau Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 2. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 3. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 4.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 7 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus şi unui al treilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 9 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus şi unui al treilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 10 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus şi unui al treilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 11 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus şi unui al treilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 1 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus, unui al treilea compus şi unui al patrulea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5 sau Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 2 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus, unui al treilea compus şi unui al patrulea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 3 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus, unui al treilea compus şi unui al patrulea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 1 sau Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 4 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus, unui al treilea compus şi unui al patrulea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7. Al doilea compus poate fi Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3 sau Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 2. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 3. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 5 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus,unui al treilea compus şi unui al patrulea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 1.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 6 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus, unui al treilea compus şi unui al patrulea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3 sau Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 2. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 3. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 4.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 7 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus, unui al treilea compus şi unui al patrulea compus fiecare selectat din grupul constând Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 9 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus, unui al treilea compus şi unui al patrulea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei HCV la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 10 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus, unui al treilea compus şi unui al patrulea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 11 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus, unui al treilea compus şi unui al patrulea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 1 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus, unui al treilea compus, unui al patrulea compus şi unui al cincilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5 sau Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 2 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus, unui al treilea compus, unui al patrulea compus şi unui al cincilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 3 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus, unui al treilea compus, unui al patrulea compus şi unui al cincilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 1 sau Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 4 şi incluyzând suplimentar administrarea unui al doilea compus, unui al treilea compus, unui al patrulea compus şi unui al cincilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7. Al doilea compus poate fi Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3 sau Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 2. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 3. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 6.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzâîînd administrarea Compusului 5 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus, unui al treilea compus, unui al patrulea compus şi unui al cincilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 1.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 6 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus, unui al treilea compus, unui al patrulea compus şi unui al cincilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16. Al doilea compus poate fi Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3 şi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 2. Al doilea compus poate fi Compusul 1 şi al treilea compus poate fi Compusul 3. Al doilea compus poate fi Compusul 4 şi al treilea compus poate fi Compusul 6. Al doilea compus poate fi Compusul 2 şi al treilea compus poate fi Compusul 4. Al doilea compus poate fi Compusul 3 şi al treilea compus poate fi Compusul 4.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 7 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus, unui al treilea compus, unui al patrulea compus şi unui al cincilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 9 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus, unui al treilea compus, unui al patrulea compus şi unui al cincilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzîând administrarea Compusului 10 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus, unui al treilea compus, unui al patrulea compus şi unui al cincilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om, o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC, o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman şi o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral, fiecare metodă incluzând administrarea Compusului 11 şi incluzând suplimentar administrarea unui al doilea compus, unui al treilea compus, unui al patrulea compus şi unui al cincilea compus fiecare selectat din grupul constând din Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 5, Compusul 6 şi Compusul 7.
Căi şi moduri de administrare
Doi sau mai mulţi dintre Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16 şi orice alte componente ale unei terapii combinate pot fi adaptate pentru a fi administrate pe orice cale potrivită stării care urmează să fie tratată. Căile potrivite includ pe cele orală, rectală, nazală, topică (inclusiv bucală şi sublinguală), vaginală şi parenterală (inclusiv subcutanată, intramusculară, intravenoasă, intradermică, intratecală şi epidurală) şi altele asemănătoare. În funcţie de starea pacientului, se va înţelege că, calea preferată poate varia
Un efect sinergetic poate fi atins atunci când ingredientele active sunt: (1) coformulate (de exemplu, într-o formă de dozare unitară) şi administrate sau distribuit simultan într-o formulare combinată; (2) distribuite prin alternanţă sau în paralel ca formulări separate; sau (3) printr-o altă metodă. Când sunt distribuiţi în terapia alternantă, efectul sinergetic poate fi atins atunci când compuşii sunt administraţi sau distribuiţi secvenţial, de exemplu, sub formă de tablete, pilule sau capsule separate sau prin injecţii diferite în seringi separate. În general, în timpul terapiei alternante, o doză eficientă de fiecare ingredient activ este administrată secvenţial, adică serial, în timp ce în terapia combinată, dozele eficiente de două sau mai multe ingrediente active sunt administrate împreună.
Coadministrarea unui Compus Combinat cu unul sau cu mai mulţi Compuşi Combinaţi se referă, în general, la administrarea simultană sau secvenţială a unuia sau a mai multor Compuşi Combinaţi, astfel încât cantităţile eficiente terapeutic a doi sau a mai multor Compuşi Combinaţi să fie prezente în corpul pacientului. În unele cazuri, Compuşii Combinaţi (de exemplu, doi, trei sau patru Compuşi Combinaţi) vor fi coformulaţi pentru a permite administrarea simultană. În unele cazuri, Compuşii Combinaţi coformulaţi pot fi coadministraţi cu unul sau mai mulţi Compuşi Combinaţi suplimentari.
Coadministrarea include, de asemenea, administrarea dozelor unice ale Compuşilor Combinaţi înainte sau după administrarea dozelor unice a unuia sau a mai multe alte ingrediente active, de exemplu, administrarea a doi sau a mai mulţi Compuşi Combinaţi în decurs câteva secunde, minute sau ore de la administrarea a unui sau a mai multor alte ingrediente active. De exemplu, o doză unitară de un Compus Combinat poate fi administrată prima, urmată în câteva secunde sau minute de administrarea unei doze unitare de un al doilea Compus Combinat, urmată în câteva secunde sau minute de administrarea unei doze unitare a unuia sau a mai multe alte ingrediente active. Alternativ, o doză unitară a unuia sau a mai multe alte ingrediente active poate fi administrată prima, urmată în câteva secunde sau minute de administrarea unei doze unitare a unui Compus Combinat, urmată în câteva secunde sau minute de administrarea unei doze unitare a unui al doilea Compus Combinat. În unele cazuri, poate fi de dorit să se administreze o doză unitară de un Compus Combinat ca prima, urmată, după o perioadă de ore (de exemplu, 1-12 ore), de administrarea unei doze unitare a unui al doilea Compus Combinat, urmată, după o perioadă de ore (de exemplu, 1-12 ore), de administrarea unei doze unitare a unuia sau a mai multe alte ingrediente active. În alte cazuri, poate fi de dorit să se administreze o doză unitară a unuia sau a mai multe alte ingrediente active ca prima, urmată, după o perioadă de ore (de exemplu, 1-12 ore), de administrarea unei doze unitare de un Compus Combinat, urmată, după o perioadă de ore (de exemplu, 1-12 ore), de administrarea unei doze unitare a unui al doilea Compus Combinat. În cazul în care trei sau mai mulţi Compuşi Combinaţi sunt administraţi cu unul sau mai multe ingrediente active suplimentare, Compuşii Combinaţi pot fi administraţi unul după altul în interval de secunde, minute sau ore (de exemplu, 1-12 ore) unul de la altul, precum unul sau mai multe ingrediente active suplimentare pot fi administrate înainte, în timpul sau după administrarea Compuşilor Combinaţi. În cazul în care Compuşii Combinaţi sunt coformulaţi, aceştia pot fi administraţi simultan, înainte sau după administrarea unuia sau a mai multor ingrediente active.
Dacă nu se specifică altfel, terapia combinată poate fi administrată ca forme medicamentoase separate cu fiecare ingredient activ, administrate împreună sau separat, secvenţial sau concurent, şi aproape sau la distanţă una de alta.
Seria de tratament se poate extinde, de exemplu, de la aproximativ 12 săptămâni la aproximativ 24 săptămâni sau mai mult, de exemplu, de la aproximativ 12 săptămâni până la aproximativ 48 săptămâni.
Prezenta invenţie include o combinaţie de componente eficiente terapeutic pentru a ameliora cel puţin un simptom al infecţiei VHC la o fiinţă umană, inclusiv, dar nelimitat la, greaţă, vărsături, pierderea poftei de mâncare, oboseală, icter, diaree, deshidratare, durere abdominală, ciroză hepatică. În plus, la unele persoane infectate cu VHC utilizarea terapiei combinate este eficientă pentru reducerea încărcăturii virale de particule virale VHC prezente în corpul persoanei infectate cu o cantitate semnificativă statistic. Încărcătură virală poate fi măsurată, de exemplu, prin măsurarea nivelelor de ARN VHC în plasmă folosind, de exemplu, analiza VHC COBAS TaqMan (Roche Molecular Systems). De obicei, o persoană infectată cu VHC care este tratată cu Compuşi Combinaţi în conformitate cu prezenta invenţie resimte o îmbunătăţire în una sau toate simptomele asociate cu infecţia VHC.
Combinaţii de doi sau mai mulţi dintre Compuşii Combinaţi cu Ribavirină, dar nu Interferon
După cum s-a discutat mai sus, unele tratamente VHC curente includ administrarea interferonului, dar acest tratament produce de obicei efecte secundare nedorite. Prin urmare, ar fi de dorit găsirea tratamentelor VHC eficiente care nu ar necesita administrarea interferonului.
Un aspect al prezentei invenţii prevede compoziţii, metode, utilizări şi alte asemănătoare pentru tratamentul VHC incluzând administrarea a doi sau a mai mulţi Compuşi Combinaţi sau sărurilor acceptabile farmaceutic ale acestora şi ribavirinei, fără administrarea unuia sau a mai multor interferoni. Acest aspect al invenţiei poate fi deosebit de util deoarece permite tratamentul eficient al VHC fara efecte secundare asociate cu administrarea unuia sau a mai multor interferoni.
Într-un exemplu de realizare a prezentei invenţii, cantitatea combinată de ribavirină şi Compuşi Combinaţi sau săruri acceptabile farmaceutic ale acestora, opţional cu unul sau mai mulţi agenţi, este eficientă pentru tratarea infecţiei VHC.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau a mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om care include: administrarea a doi sau a mai mulţi Compuşi Combinaţi sau sărurilor acceptabile farmaceutic ale acestora şi ribavirinei, fără administrarea concomitentă a unui sau a mai mulţi interferoni. În acest sens, prezenta invenţie nu exclude potenţial dozarea a unui sau mai mulţi interferoni. Mai degrabă, prezenta invenţie poate fi utilizată în asociere cu o altă terapie, care, de fapt, include unul sau mai mulţi interferoni. Un aspect al prezentei invenţii include un tratament al VHC eficace cu ribavirina fără necesitatea unuia sau a mai multor interferoni.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC incluzând: administrarea a doi sau a mai mulţi Compuşi Combinaţi sau sărurilor acceptabile farmaceutic ale acestora şi ribavirinei, dar nu a unui sau mai mulţi interferoni.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru tratarea VHC la un subiect uman, care constă esenţial din administrarea ribavirinei în asociere cu doi sau cu mai mulţi dintre Compuşii Combinaţi sau sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţii antivirali coadministraţi oral incluzând: administrarea a doi sau a mai mulţi Compuşi Combinaţi sau a sărurilor acceptabile farmaceutic ale acestora şi ribavirinei, fără administrarea concomitentă a unui sau a mai multor interferoni.
În mod similar, un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie, de exemplu, o compoziţie farmaceutică pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la om, conţinând doi sau mai mulţi dintre Compuşii Combinaţi sau sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora şi ribavirină, fără unul sau mai mulţi interferoni. Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC conţinând doi sau mai mulţi dintre Compuşii Combinaţi sau sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora şi ribavirină, dar nu şi unul sau mai mulţi interferoni. Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie pentru tratarea VHC la un subiect uman, care constă în mod esenţial din ribavirină în asociere cu doi sau mai mulţi dintre Compuşii Combinaţi sau sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora. Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie pentru terapia VHC pe baza de ribavirină conţinând doi sau mai mulţi dintre Compuşii Combinaţi sau sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora, cu condiţia ca respectiva compoziţie să nu includă unul sau mai mulţi interferoni. Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţii antivirali coadministraţi oral conţinând doi sau mai mulţi dintre Compuşii Combinaţi sau sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora şi ribavirină, fără unul sau mai mulţi interferoni.
În mod similar, un alt aspect al prezentei invenţii include utilizarea a: doi sau mai mulţi dintre Compuşii Combinaţi sau a sărurilor acceptabile farmaceutic ale acestora şi ribavirinei, fără unul sau mai mulţi interferoni, la fabricarea unui medicament pentru ameliorarea unuia sau mai multor simptome ale infecţiei VHC la un om; precum şi utilizarea: a doi sau mai mulţi dintre Compuşii Combinaţi sau a sărurilor acceptabile farmaceutic ale acestora şi ribavirinei, dar nu şi a unui sau a mai mulţi interferoni, la fabricarea medicamentului pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC; precum şi utilizarea ribavirinei în asociere cu doi sau mai mulţi dintre Compuşii Combinaţi sau sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora pentru fabricarea unui medicament pentru tratarea VHC la un subiect uman, în care respectiva utilizare nu include utilizarea unui sau a mai mulţi interferoni; precum şi utilizarea a doi sau mai mulţi Compuşi Combinaţi sau a sărurilor acceptabile farmaceutic ale acestora, la fabricarea unui medicament pentru terapia VHC pe baza ribavirinei, în care respectiva utilizare evită administrarea unui sau a mai multor interferoni; precum şi utilizarea a doi sau mai mulţi Compuşi Combinaţi sau a sărurilor acceptabile farmaceutic ale acestora şi ribavirinei, fără unul sau mai mulţi interferoni în fabricarea unui medicament pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţii antivirali coadministraţi oral.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o combinaţie care conţine ribavirină şi doi sau mai mulţi Compuşi Combinaţi sau sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora, combinaţia fiind substanţial lipsită de unul sau de mai mulţi interferoni. Într-un exemplu de realizare, combinaţia poate să fie produsă ca forme medicamentoase separate cu fiecare ingredient activ, administrate împreună sau separat, secvenţial sau concurent, şi aproape sau la distanţă unele de altele.
Un alt aspect al prezentei invenţii include un set care include: ribavirină, doi sau mai mulţi Compuşi Combinaţi şi instrucţiunea cu privire la o schemă de tratament pentru a trata, a reduce încărcătura virală sau a întârzia apariţia sau progresia VHC, în care schema de tratament include administrarea a doi sau mai mulţi Compuşi Combinaţi şi a ribavirinei fără administrarea unui sau a mai mulţi interferoni. Într-un exemplu de realizare, un astfel de set poate include, de asemenea, un ambalaj, cum ar fi un pachet blister. Alternativ, un astfel de set poate prevedea prescripţia şi dozarea individuală a fiecărei componente ca preparat ambalat separat, dar atunci când este combinat conform instrucţiunii cu privire la schema de tratament destinată tratării, reducerii încărcăturii virale sau întârzierii apariţiei sau progresiei HCV, acesta se propune să fie în domeniul de aplicare al prezentei invenţii.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie farmaceutică care conţine: ribavirină; doi sau mai mulţi Compuşi Combinaţi sau sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora şi unul sau mai mulţi purtători acceptabili farmaceutic. Într-un erxempălu de realizare, compoziţia farmaceutică poate fi o formă medicamentoasă unitară.
Dacă nu se specifică altfel, terapia combinată cu ribavirină poate fi administrată ca forme medicamentoase separate cu fiecare ingredient activ administrat (inclusiv Compuşii Combinaţi), poate fi administrată împreună (de exemplu, sub forma unei doze standartizate, cum ar fi o tabletă) sau separat, secvenţial sau concurent, şi aproape sau la distanţă una de alta. Dacă se administrează separat, fiecare compus poate fi administrat cu altul(altele) simultan, sau fie înainte sau după o astfel de administrare a altui(tora). Ingredientele active pot fi administrate zilnic. Într-un exemplu de realizare, o doză zilnică de ingrediente active este administrată în subdoze separate, cum ar fi una, două, trei sau patru ori pe zi. În mod avantajos, doza zilnică de Compuşi Combinaţi sau săruri acceptabile farmaceutic ale acestora şi ribavirină poate fi administrată o dată pe zi.
Deşi prezenta invenţie include compoziţii, metode, utilizările şi alte asemănătoare, pentru tratamentul VHC incluzând administrarea a doi sau mai mulţi Compuşi Combinaţi sau unei sări acceptabile farmaceutic a acestuia; şi a ribavirinei, dar nu a unui sau a mai multor interferoni, prezenta invenţie nu exclude potenţial dozarea a unui sau mai multor interferoni la om. Mai degrabă, prezenta invenţie poate fi utilizată în asociere cu o altă terapie sau pentru o altă indicaţie care, de fapt, include unul sau mai mulţi interferoni.
Combinaţii de doi sau mai mulţi dintre Compuşii Combinaţi cu ribavirină şi interferon
Un alt aspect al prezentei invenţii prevede compoziţii, metode, utilizări şi alte asemănătoare incluzând administrarea a doi sau a mai mulţi Compuşi Combinaţi sau sărurilor acceptabile farmaceutic ale acestora şi ribavirinei, şi a unui sau a mai multor interferoni pentru tratamentul VHC. Administrarea mai multor interferoni poate fi in relatie temporară cu administrarea Compuşilor Combinaţi şi ribavirinaei.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru ameliorarea unuia sau a mai multor simptome ale infecţiei VHC la om, incluzând administrarea a doi sau a mai mulţi Compuşi Combinaţi sau a sărurilor acceptabile farmaceutic ale acestora, ribavirinei, şi unui sau mai mulţi interferoni. Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC incluzând: administrarea a doi sau a mai mulţi Compuşi Combinaţi sau a sărurilor acceptabile farmaceutic ale acestora împreună cu ribavirina şi a unui sau a mai multor interferoni.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă de terapie VHC în baza ribavirinei incluzând administrarea a doi sau a mai mulţi Compuşi Combinaţi sau a sărurilor acceptabile farmaceutic ale acestora împreună cu ribavirina şi a unui sau a mai mulţi interferoni.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o metodă pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţii antivirali coadministraţi oral incluzând: administrarea a doi sau a mai mulţi Compuşi Combinaţi sau sărurilor acceptabile farmaceutic ale acestora împreună cu ribavirina şi a unui sau a mai mulţi interferoni.
Un alt aspect al prezentei invenţii, include utilizarea a doi sau mai mulţi Compuşi Combinaţi sau a sărurilor acceptabile farmaceutic ale acestora împreună cu ribavirina şi a unui sau a mai mulţi interferoni, la fabricarea unui medicament pentru ameliorarea unuia sau a mai multor simptome ale infecţiei VHC la om. Un alt aspect al prezentei invenţii include utilizarea a doi sau mai mulţi Compuşi Combinaţi sau a sărurilor acceptabile farmaceutic ale acestora împreună cu ribavirina şi a unui sau a mai mulţi interferoni, la fabricarea medicamentului pentru reducerea încărcăturii virale la un om diagnosticat cu VHC. Un alt aspect al prezentei invenţii include utilizarea ribavirinei în asociere cu doi sau mai mulţi dintre Compuşii Combinaţi sau sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora pentru fabricarea unui medicament pentru tratarea VHC la un subiect uman, în care respectiva utilizare cuprinde utilizarea unui sau a mai multor interferoni. Un alt aspect al prezentei invenţii include utilizarea a doi sau a mai mulţi Compuşi Combinaţi sau a sărurilor acceptabile farmaceutic ale acestora, la fabricarea unui medicament pentru terapia VHC în baza ribavirinei, în care respectiva utilizare cuprinde administrarea unui sau a mai multor interferoni. Un alt aspect al prezentei invenţii, include utilizarea a doi sau a mai mulţi Compuşi Combinaţi sau a sărurilor acestora acceptabile farmaceutic, ribavirinei şi a unui sau a mai mulţi interferoni, la fabricarea unui medicament pentru reducerea apariţiei pseudotipurilor VHC cu rezistenţă la agenţi antivirali coadministraţi oral.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o combinaţie care conţine ribavirină şi doi sau mai mulţi Compuşi Combinaţi sau sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora, combinaţia conţinând unul sau mai mulţi interferoni.
Un alt aspect al prezentei invenţii include un set care conţine: ribavirină, doi sau mai mulţi Compuşi Combinaţi şi unul sau mai mulţi interferoni; şi instrucţiuni privind o schemă de tratament pentru tratarea, reducerea încărcăturii virale sau întârzierea apariţiei sau progresării VHC, şi în care schema de tratament include administrarea a doi sau a mai mulţi Compuşi Combinaţi şi ribavirinei şi administrarea unui sau a mai multor interferoni. Într-un exemplu de realizare, un astfel de set poate conţine, de asemenea, un ambalaj, cum ar fi un pachet blister. Alternativ, un astfel de set poate prevedea prescripţia şi dozarea individuală a fiecărei componente ca preparat ambalat separat, dar atunci când este combinat conform instrucţiunii cu privire la schema de tratament destinată tratării, reducerii încărcăturii virale sau întârzierii apariţiei sau progresării HCV, acesta se propune să fie în domeniul de aplicare al prezentei invenţii.
Un alt aspect al prezentei invenţii include o compoziţie farmaceutică care conţine: doi sau mai mulţi dintre Compuşii Combinaţi sau sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora, ribavirina şi unul sau mai mulţi interferoni; şi unul sau mai mulţi purtători acceptabili farmaceutic. Într-un exemplu de realizare, compoziţia farmaceutică poate fi o formă medicamentoasă unitară.
Dacă nu se specifică altfel, terapia combinată cu ribavirină şi cu unul sau cu mai mulţi interferoni poate fi administrată ca forme medicamentoase separate cu unul sau cu mai mulţi interferoni administraţi pacientului şi fiecare dintre ingredientele active rămase şi care urmează să fie utilizate în terapia combinată (inclusiv Compuşii Combinaţi) pot fi administrate împreună (de exemplu, sub forma unei doze standartizate, cum ar fi o tabletă) sau separat, secvenţial sau concurent şi aproape sau la distanţă una de alta. Dacă se administrează separat, fiecare ingredient activ poate fi administrat cu altul(altele) în acelaşi timp sau înainte sau după o astfel de administrare a altui(altora). Ingredientele active pot fi administrate zilnic. Într-un exemplu de realizare, o doză zilnică se administrează în subdoze separate, cum ar fi una, două, trei sau patru ori pe zi.
Terapia combinată, inclusiv terapiile suplimentare
Într-un alt exemplu de realizare, exemplele nelimitative de combinaţii potrivite includ combinaţiile de doi sau mai mulţi dintre Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5, Compusul 6, Compusul 7, Compusul 9, Compusul 10, Compusul 11, Compusul 12, Compusul 13, Compusul 14, Compusul 15 şi Compusul 16 cu unul sau mai multe ingrediente active suplimentare, inclusiv inhibitori ai VHC NS3 proteazei, inhibitori ai alfa-glucozidazei 1, hepatoprotectanţi, inhibitori nucleozidici sau nucleotidici ai VHC NS5B polimerazei, inhibitori nonnucleozidici ai VHC NS5B polimerazei, inhibitorii ai VHC NS5A, agonişti ai TLR-7, inhibitori ai ciclofilinei, inhibitori ai IRES VHC, inhibitori de intrăre a VHC, inhibitori de maturare a VHC, inhibitori de asamblare a VHC, inhibitori de infecţiozitate cu VHC şi intensificatori farmacocinetici, precum şi alte medicamente pentru tratarea VHC. Mai specific, unul sau mai mulţi compuşi ai prezentei invenţii pot fi combinaţi cu unul sau mai mulţi compuşi selectaţi din grupul constând din:
inhibitori ai VHC NS3 proteazei, de exemplu, boceprevir (SCH-503034, SCH-7), telaprevir (VX-950), TMC-435 (IUPAC N-(2R,3aR,10Z,11aS,12aR,14aR)-2-[2-(4-Izopropiltiazol-2-il)-7-metoxi-8-metilchinolin-4-iloxi]-5-metil-4,14-dioxo-1,2,3,3a,4,5,6,7,8,9,11a,12,12a,13,14,14a-hexadecahidrociclopenta[c]ciclopropa[g][1,6]diazaciclotetradecin-12a-ilcarbonil]ciclopropansulfonamidă], ABT-450, ACH-1625, ACH-2684, BI-201335, BI-1230, MK-5172, MK-7009, SCH-900518, VBY-376, VX-500, GS-9256, GS-9451, BMS-605339, PHX-1766, AS-101, YH-5258, YH-5530, YH-5531 şi ITMN-191 (R-7227);
inhibitori ai alfa-glucozidazei 1, de exemplu, celgosivir (MX-3253), UT-231B, miglitol;
hepatoprotectanţi, de exemplu, emericasan (IND-6556), ME-3738, silibilin şi MitoQ;
inhibitori nucleozidici sau nucleotidici ai VHC NS5B polimerazei, de exemplu, R1626, R7128 (R4048), IDX184, IDX-102, PSI-661, PSI-938, PSI-7851, PSI-7977, BCX-4678, valopicitabină (NM-283), MK-0608 şi TMC649128;
inhibitori nonnucleozidici ai VHC NS5B polimerazei, de exemplu, filibuvir (PF-868554), ABT-333, ABT-072, BI-207127, VCH-759, VCH-916, JTK-652, MK-3281, VBY-708, VCH-222, A848837, ANA-598, GL60667, GL59728, A-63890, A-48773, A-48547, BC-2329, VCH-796 (nesbuvir), GSK625433, BILN-1941 şi XTL-2125;
inhibitori ai VHC NS5A, de exemplu, ACH-2928, AZD-2836 ( A-831), AZD-7295 (A-689), BMS-766, BMS-790052, BMS-824393 şi PPI-461;
agonişti ai TLR-7, de exemplu, imichimod, 852A, ANA-773, ANA-975, AZD-8848 (DSP-3025), PF-04878691 şi SM-360320 şi Compusul 8;
inhibitori ai ciclofilinei, de exemplu, DEBIO-025, SCY-635 şi NIM811;
inhibitori ai VHC IRES, de exemplu, MCI-067;
intensificatori farmacocinetici, de exemplu, roxitromicină, BAS-100, SPI-452, PF-4194477, TMC-41629;
inhibitori de intrare a VHC;
inhibitori de asamblare a VHC;
inhibitori de maturare a VHC;
inhibitori de infecţiozitate cu VHC; şi
alte medicamente pentru tratarea VHC, de exemplu, timozină alfa 1 (Zadaxin), nitazoxanidă (ALINEA, NTZ), BIVN-401 (virostat), PYN-17 (altirex), KPE02003002, Actilon CPG-10101), KRN-7000, civacir, GI-5005, XTL-6865, BIT225, PTX-111, ITX2865, TT-033i, ANA 971, NOV-205, Tarvacină, EHC-18, VGX-410C, EMZ-702, AVI 4065, BMS-650032, BMS-79132 , Bavituximab, MDX-1106 (ONO-4538), Oglufanidă, FK-788 şi VX-497 (merimepodib).
Exemple de sinteză
Protocoalele de sinteză pentru prepararea Compuşilor 1, 2, 3, 6, 7 şi 8 sunt cunoscute în literatura de specialitate. În plus, un protocol de sinteză pentru prepararea fiecaruia dintre Compuşii Combinaţi este prezentat în exemplele de mai jos.
Compusul 1 poate fi preparat utilizând metode de sinteză şi intermediari asemănător celor descrişi în brevetul US 7754720 B2 2010.07.13. Compusul 1 poate fi de asemenea preparat astfel cum este descris în Exemplul care urmează.
Exemplul 1: 5-({6-[2,4-bis(trifluorometil)fenil]piridazin-3-il}metil)-2-(2-fluorofenil)-5H-imidazo[4,5-c]piridină 1.
1
Compus GM Cantitate Moli Echivalenţi 104 453,79 95mg 0,209 1 DME 500µL 2N aq. Na2CO3 313µL 0,626 3 105 257,93 80,9mg 0,313 1,5 Pd(PPh3)4 1155 12mg 0,0104 0,05
Compusul 103 a fost dizolvat în dimetoxietan (DME). La această soluţie s-a adăugat acid 2,4-bis(trifluormetil)fenilboronic 105 şi o soluţie apoasîă 2N de Na2CO3. La amestecul bifazic rezultat s-a adăugat Pd(PPh3)4 şi amestecul de reacţie a fost apoi încălzit la 80°C timp de 72 ore. Reacţia s-a răcit la temperatura camerei şi s-a filtrat prin Celită, iar Celita s-a spălat cu EtOAc. Filtratul s-a concentraz în vid. Reziduul s-a purificat pe 6g SiO2 folosind MeOH/CH2Cl2 pentru a elua compusul. Compusul astfel obţinut a fost contaminat cu PPh3(O). Produsul a fost repurificat pe o placă de 1 mm Chromatotron cu 0 până la 5% MeOH/CH2Cl2 în 1% de paşi. Fracţiunile pure au fost combinate şi concentrate în vid, apoi uscate în vid înalt timp de 12 ore. 11,8 mg de bază liberă a compusului 1 au fost obţinute fără vreo contaminare cu PPh3. 1H RMN (300MHz, CD3OD) δ 6,20 (s, 2), 7,32 (m, 3), 7,52 (m, 1), 7,78 (d, 1), 7,89 (d, 1), 7,95 (s, 2), 8,15 (m, 3), 8,35 (d, 1), 9,12 (s, 1); CL/SM M+H = 518.
Compusul intermediar 104 a fost preparat după cum urmează.
Prepararea Compusului 102.
101 102
Compus GM Cantitate Mmoli Echivalenţi 101 128,56 5 g 38,9 1 TCCA 232,41 3,62 g 15,6 0,4 CHCl3 130 mL
La o soluţie de materie primă iniţială disponibilă comercial 101 în CHCl3, s-a adăugat acid tricloroizocianuric (TCCA) la 60°C. Apoi soluţia s-a agitat timp de 1,5 ore, s-a răcit şi s-a filtrat cu HiFlo-Celită. Filtratul s-a concentrat şi s-a uscat cu vid. Randamentul a fost de 5,037 g de compus 102.
Prepararea Compusului 104.
102 104
Compus GM Cantitate Mmoli Echivalenţi 102 163 5,073 g 31,12 1 103 213,2 6,635 g 31,12 1 NaOH (10%) 40 1,245 g 31,12 1 DMF 320 mL
La o soluţie de compus 103 în DMF (dimetilformamidă) s-a adăugat NaOH. Compusul 102 s-a dizolvat în DMF (20 mL) şi s-a adăugat lent la soluţie. Reacţia s-a agitat timp de 3 ore, s-a diluat cu apă şi s-a extras cu EtOAc. Stratul organic s-a uscat cu Na2SO4. Solventul s-a îndepărtat şi produsul s-a recristalizat cu diclormetan. Randamentul a fost de 5,7 g de compus 103.
Compusul 2 poate fi preparat prin metode de sinteză şi intermediari, cum ar fi cei descrişi în US 2010051763 A1 2010.03.04. Compusul 2 poate fi de asemenea preparat astfel cum este descris în Exemplul următor.
Exemplul 2: Prepararea Compusului 2.
Fosfinat ester 206 (23,7 g, 24,05 mmol) s-a dizolvat în CH3CN (240 mL) şi s-a răcit la 0°C. Iodotrimetilsilan (17,4 mL, 122,3 mmol) s-a adăugat într-un ritm rapid în picături, urmat, după 10 min, de 2,6- lutidină (17,0 mL, 146,4 mmol). Amestecul de reacţie s-a încălzit lent la temperatura camerei şi s-a agitat timp de 1 h, apoi răcit din nou la 0°C şi s-a adăugat 2,6-lutidină (11,1 mL, 95,6 mmol), urmată de MeOH (24 mL). Soluţia s-a concentrat în vid şi reziduul brut a fost purificat prin HPLC pentru a se obţine 12,68 g de compus 2 într-un randament de 55%. 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,35 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 8,28 (s, 1H), 7,85 (s, 1H), 7,64 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 7,35-7,22 (m, 1H), 7,02-6,89 (m, 2H), 5,85 (bs, 1H), 4,82-4,71 (m, 2H), 4,33 (bs, 1H), 4,28-3,99 (m, 3H), 4,16 (s, 3H), 3,57-3,28 (m, 2H), 2,90-2,78m , 1H), 2,63-2,50 (m, 1H), 2,08-1,91 (m, 1H), 1,91-1,70 (m, 2H), 1,70-1,13 (m, 22H), 1,37 (d, J = 6,9 Hz, 6H); 31P RMN (121,4 MHz, CD3OD) δ 42,4; LCMS (M+1): 957,35 g.
Compusul intermediar 206 a fost preparat după cum urmează.
Prepararea Compusului 203.
Compusul 201 (17,42 g, 28,30 mmol) s-a dizolvat în THF (136 mL) şi s-a răcit la 0°C. La soluţie s-a adăugat N-metilmorfolină (4,7 mL, 42,7 mmol). După 10 min la 0°C s-a adăugat prin picurare i-butilcloroformiat (4,05 mL, 30,96 mmol). După 1 oră suplimentară, ester etilic al acidului (1-amino-2-vinil-ciclopropil)-(2,6-difluoro-benzil)-fosfinic 202 (8,94 g, 29,70 mmol) s-a adăugat treptat sub formă de soluţie în THF (20 mL). Suspensia s-a încălzit la temperatura camerei şi după 2 ore s-a repartizat între H2O (400 mL) şi acetat de etil (200 mL). Stratul apos s-a extras cu acetat de etil (200 ml x 2) şi straturile organice combinate s-au spălat cu acid clorhidric (1N, 225 mL) şi H2O (200 mL). Spălarea acidă şi spălarea apoasă au fost combinate şi extrase cu acetat de etil (175 ml x 2, 100 mL x 2). Straturile organice combinate s-au spălat cu soluţie salină (400 mL), uscat pe Na2SO4 şi s-au concentrat în vid furnizând 25,06 g de dienă 203 în 98,5% de produs brut. LCMS (M+1): 898,06.
Prepararea Compusului 204.
Compusul 203 (12,91 g, 14,36 mmol) s-a dizolvat în CH2Cl2 (1440 mL) şi soluţia s-a degazat timp de 30 minute. Soluţia s-a încălzit la 40°C şi s-a adăugat catalizator Grubb G1 (2,95 g, 3,59 mmol). Reacţia s-a refluxat timp de 17 ore după care s-a adăugat tris-hidroximetilfosfină (22,3 g, 18,0 mmol), TEA (50 mL, 35,9 mmol) şi H2O (400 mL) şi amestecul de reacţie s-a încălzit la reflux timp de încă 16 ore. Amestecul de reacţie s-a răcit la temperatura camerei şi cele două straturi au fost separate. Stratul organic s-a spălat cu H2O (400 mL) şi soluţie salină (300 mL), s-a uscat pe MgSO4 şi s-a concentrat. Reziduul brut a fost purificat prin cromatografie pe silicagel pentru a se obţine 8,30 g de olefină macrociclică 204 într-un randament de 66%. LCMS (M+1): 870,09.
Prepararea Compusului 205.
Olefină macrociclică 204 (7,34 g, 8,42 mmol) s-a dizolvat în acetat de etil (105 mL) şi s-a adăugat rodiu pe alumină (5% de masă, 2,945 g, 0,40% de masă). Sistemul a fost evacuat şi purjat cu H2 (1 atm, de 3 ori). La sistem, după 3 ore, s-a adăugat mai mult rodiu pe alumină (5% de masă, 842 mg, 0,10% de masă) şi s-a evacuat şi curăţat cu H2 (1 atm, de 3 ori). După 1 oră suplimentartă, suspensia a fost filtrată şi concentrată în vid furnizând 6,49 g de macrociclu redus 205 în 88% de produs brut. LCMS (M+1): 872,04.
Prepararea Compusului 206.
Macrociclu brosilat 205 (6,49 g, 7,67 mmol) s-a dizolvat în N-metilpirolidinonă (25,0 mL) şi s-a adăugat 8-cloro-2-(2-izopropilamino-tiazol-4-il)-7-metoxi-chinolin-4-ol 207 (2,564 g 7,33 mmol) urmat de CS2CO3 (4,40 g, 13,50 mmol). Amestecul s-a încălzit la 65°C timp de 6 ore, apoi s-a diluat cu acetat de etil (200 mL) şi s-a spălat cu LiCI (5%, 250 ml). Stratul apos s-a extras cu acetat de etil (100 ml x 2) şi straturile organice combinate s-au spălat cu soluţie salină (150 mL), s-au uscat pe Na2SO4/MgSO4 şi s-au concentrat în vid. Reziduul brut s-a purificat prin cromatografie pe silicagel (acetat de etil-metanol) producând 4,39 g de aminotiazol 206 cu un randament de 58%. LCMS (M+1): 985,28.
Compusul intermediar 201 poate fi preparat după cum urmează.
Prepararea Compusului 209.
Compusul 208 (7,00 g, 28,55 mmol) şi DABCO (5,13 g, 45,94mmol) s-au dizolvat în toluen (30 mL). S-a adăugat o soluţie de toluen (11 mL), chlorură de brosil (10,22 g, 40,01 mmol). Amestecul de reacţie s-a agitat la temperatura camerei peste noapte. Reacţia s-a diluat cu EtOAc (210 mL) şi 0,5 N HCl (200 mL). Cele două straturi au fost separate şi stratul apos s-a extras cu EtOAc (2 x 200 mL). Straturile organice combinate s-au spălat cu soluţie salină (200 mL), s-au uscat cu Na2S04, s-au filtrat şi s-au concentrat. Produsul brut s-a purificat prin cromatografie rapidă cu obţinerea a 12,23 g de compus 209 într-un randament de 92%.
Prepararea compuşilor 210 şi 212.
Compusul 209 (12,2 g, 26,3 mmol) s-a tratat cu 4 N HCl / 1,4-dioxan (60 mL) şi s-a agitat timp de 1 oră. Amestecul de reacţie s-a concentrat şi s-a uscat sub vid timp de 20 minute. Sarea aminei brute HCI a compusului 210 s-a dizolvat în DMF (150 mL) şi s-a adăugat acidul 211 (14,2 g, 52,6 mmol). S-a adăugat HATU (20,0 g, 52,6 mmol) şi NMM (13,5 g, 131,5 mmol). Amestecul de reacţie s-a agitat la temperatura camerei peste noapte. Reacţia s-a diluat cu EtOAc (300 mL), s-a spălat cu 1N HCl (200 mL), NaHCO3 saturat, soluţie salină, uscat cu Na2SO4 şi concentrat. Produsul brut s-a purifică prin cromatografie rapidă cu obţinerea a 15,1 g de compus 212 într-un randament de 93%.
Prepararea Compusului 213.
La o soluţie de 212 ( 12,8 g, 20,7 mmol) în CH2Cl2 (50 mL) s-a adăugat 4 N HCl în 1,4-dioxan (50 mL, 200 mmol). Amestecul de reacţie s-a agitat la temperatura camerei timp de 2 ore, concentrat, uscat sub vid timp de 20 minute şi apoi dizolvat în CH3CN (50 mL). NaHCO3 saturat în H20 (50 mL) sd-a adăugat şi s-a agitat timp de 5 minute. S-a adăugat ciclopentilcloroformat preparat proaspăt în THF (50 mL). Reacţia s-a completat în decurs de 1 oră. Solventul s-a îndepărtat sub presiune redusă şi reziduul s-a diluat cu acetat de etil. Amestecul s-a adus la pH = 2 cu 1N HCl şi cele două straturi au fost separate. Straturile organice s-au spălat cu soluţie salină, uscat cu Na2SO4, filtrat şi concentrat pentru a da compusul brut 213 (3,18 g).
Prepararea Compusului 201.
Ester brut 213 (3,18 g, 5,07 mmol) s-a dizolvat în THF (25 mL), H2O (25 mL) şi apoi s-a adăugat MeOH (6 mL) şi LiOH (660 mg, 25,4 mmol). Amestecul de reacţie s-a agitat la temperatura camerei timp de 1 oră şi s-a diluat cu acetat de etil. Amestecul de reacţie s-a acidulat la pH 2 cu 1N HCl şi cele două straturi au fost separate. Stratul apos s-a extras cu EtOAc (de 2 ori). Straturile organice combinate au fost spălate cu soluţie salină, uscate cu Na2SO4, concentrate şi uscate sub vid pentru a da 3,09 g de acid 201.
8-Cloro-2-(2-izopropilamino-tiazol-4-il)-7-metoxi-chinolin-4-olul intermediar 207 poate fi preparat după cum urmează.
Prepararea acidului 8-cloro-4-hidroxi-7-metoxichinolin-2-carboxilic 215.
La o soluţie de metil-8-cloro-4-hidroxi-7-metoxichinolin-2-carboxilat 214 (36,5 g, 0,145 mol) într-un amestec de 1:1 de MeOH : THF (160 mL total) s-a adăugat o soluţie de LiOH (30,5 g, 0,725 mol) în H20 (80 mL). Amestecul s-a agitat la temperatura camerei timp de o oră când analiza LCMS a indicat conversia completă în acid carboxilic. Reacţia a fost întreruptă prin îndepărtarea produselor volatile şi ajustarea pH-ului soluţiei la 6 folosind soluţie apoasă de 6N HCl. Reziduul gumos rezultat a fost filtrat şi uscat pe liofilizator timp de 2 zile pentru a da 34,4 g (99,6%) de compus 215 sub forma unui solid alb. IE SM (mlz) 253,9 [M+H].
Prepararea 2-(2-diazo-l-oxo)-8-cloro-7-metoxichinolin-4-il izobutil carbonatului 216.
La o soluţie de acid 8-cloro-4-hidroxi-7-metoxichinolin-2-carboxilic 215 (10,2 g, 0,04 mol) în THF (400 mL) s-a adăugat trietilamină (12,3 mL, 0,088 mol) şi i-butilcloroformiat (11,6 mL, 0,088 mol) la 0°C în atmosferă de argon. Amestecul s-a agitat la 0°C timp de 1 oră, atunci când analizele LCMS au demonstrat terminarea reacţiei pentru a furniza anhidrida mixtă dorită. IE SM (mlz) 454,0 [M+H]. La amestecul de reacţie de anhidridă s-a adăugat o soluţie 1M de diazometan (121 mL, 0,121 mol) în eter dietilic printr-o pâlnie de plastic la 0°C. Acest amestec s-a lăsat sub agitare încălzindu-se până la temperatura camerei timp de încă 2 ore. Analiza amestecului prin LCMS a demonstrat terminarea reacţiei. Septul a fost îndepărtat şi reacţia a fost agitată timp de încă 20 minute înainte de îndepărtarea solventului. Reziduul a fost uscat în continuare sub vid ridicat pentru a da compusul 216, care a fost utilizat mai departe în etapa următoare. IE SM (m/z) 377,9 [M+H].
Prepararea 8-cloro-2-(2-(izopropilamino)tiazol-4-il)-7-metoxichinolin-4-olului 207.
La o soluţie răcită de 2-(2-diazo-l-oxo)-8-cloro-7-metoxichinolin-4-il isobutil carbonat 216 (15,2 g, 0,040 mol) la 0°C în THF (268 mL) s-a adăugat 48% HBr (23 mL, 0,201 mol) lent timp de 15 minute. Soluţia s-a agitat la 0°C timp de încă 40 minute, când analiza LCMS a demonstrat că reacţia este completă. Reacţia a fost întreruptă prin adăugarea soluţiei apoase de 1N NaOH (180 mL) la 0°C pentru a ajusta pH-ul stratului apos la 9. Straturile au fost separate şi stratul apos s-a spălat cu EtOAc (2 x 200 mL). Extractele organice combinate s-au spălat cu soluţie salină şi s-au uscat pe MgS04. Solventul s-a îndepărtat în vid pentru a furniza 17,7 g de produs solid de culoare galbenă. IE SM (m/z) 431,9 [M+H].
Soluţie de bromocetonă obţinută din reacţia anterioară s-a suspendat în i-propanol (270 mL) şi izopropilizouree (9,4 g, 0,080 mol). Amestecul de reacţie s-a încălzit la 72°C timp de 32 ore. Analiza LCMS a reacţiei a demonstrat conversia completă în produsul dorit. Reacţia s-a lăsat să se răcească la temperatura camerei pentru a permite precipitarea produsulului din soluţie. Reacţia s-a răcit la 0°C timp de 12 ore înainte de filtrare. Filtratul s-a spălat cu eter şi s-a uscat pe un dispozitiv de liofolizare pentru a da 8,03 g de compus 207 ca un solid portocaliu. 1H RMN (500 MHz, CDCl3): δ 8,21 (d, J=9 Hz, 1H), 7,74 (s, 1H), 7,44 (d, J=10 Hz), 1H), 7,07 (s, 1H), 4,05 (s, 3H), 3,92 (cvintet, J=6 Hz, 1H), 1,25 (d, J=7 Hz, 6H): IE SM (m/z) 350,0 [M+H].
Compusul 3 poate fi preparat prin metode de sinteză şi intermediari, cum ar fi cei descrişi în US 2009257978 A1 2009.10.15. Compusul 3 poate fi, de asemenea, preparat astfel cum este descris în Exemplul următor.
Exemplul 3: Prepararea Compusului 3
Compusul 315 (12 g, 13 mmol) s-a dizolvat în THF (200 mL), s-a adăugat LiOH (11 g, 260 mmol) în H2O (200 mL), urmat de MeOH (200 mL). Amestecul s-a menţinut sub agitare la temperatura camerei timp de 20 ore. După terminarea reacţiei, s-a adăugat 4N HCl în H2O pentru a ajusta pH-ul la 7 la 0°C. Amestecul s-a extras cu EtOAc (2 x 400 mL). Stratul organic combinat s-a spălat cu soluţie salină, uscat (Na2SO4) şi concentrat în vid pentru a da compusul 3 ca un solid galben (11 g, 93%). CL/SM = 911,52 (M++1). 1H RMN (300MHz, CD3OD) δ 7,95 (d, 1H), 7,90 (s, 1H), 7,48 (s, 1H), 7,31 (d, 1H), 5,42 (s, 1H), 4,37 (dd, 1H), 4,20 (m, 2H), 3,83-3,56 (m, 7H), 3,50 (m, 2H), 3,39 (m, 2H), 2,45 (m, 1H), 2,27 (m, 1H), 1,62 (m, 2H), 1,50 (m, 1H), 1,33 (m, 2H), 1,18 (m, 1H), 1,05 (m, 8H), 0,90 (m, 3H), 0,76 (m, 11H), 0,14-0,04 (m, 2H)
Compusul intermediar 315 a fost preparat după cum urmează.
Prepararea Compusului 301.
La un balon cu trei gâturi, purjat cu argon cu fund rotund uscat (1000 mL) s-au adăugat diclormetan anhidru (100 mL) şi Et2Zn (28 mL, 273 mmol) la 0°C. (ATENŢIE: Sursa de argon nu poate fi de la ac. Utilizaţi doar adaptorul de sticlă potrivit. Un al doilea barbotor poate fi, de asemenea, ataşat la vas pentru a preveni creşterea presiunii excesive). Ciclopenten-3-ol (10,0 mL, 119 mmol) s-a adăugat apoi prin picurare (s-a produs o cantitate mare de gaz etan) la balon şi amestecul de reacţie s-a lăsat sub agitare până când degajarea de gaz a încetat. Diiodometan (22 mL, 242 mmol) s-a adăugat apoi în picături timp de 30 minute. Reacţia s-a lăsat să se încălzească la temperatura camerei şi a continuat să se agite peste noapte sub un flux pozitiv de argon, în punctul căreia analiza TLC a indicat dispariţia completă a alcoolului iniţial. Reacţia s-a diluat apoi cu CH2Cl2 şi s-a stins cu 2M HCl (precipitatul alb trebuie să fie dizolvat complet). Amestecul bifazic s-a turnat într-o pâlnie de separare şi stratul organic a fost colectat. Solventul s-a îndepărtat sub presiune redusă până la 100 mL de material care conţine compusul rămas 301.
Prepararea Compusului 302.
Diclormetan anhidru (525 mL) s-a adăugat la balon, după care a urmat adăugarea în picături a trietilaminei (34 mL, 245 mmol). Reacţia a continuat să se agite la temperatura camerei sub un flux pozitiv de azot, în acest moment disuccinimidilcarbonat (40,7 g, 159 mmol) s-a adăugat în porţii la balon. Reacţia s-a lăsat sub agitare până când analiza TLC a indicat dispariţia completă a materiei prime iniţiale (2-3 zile). După completare, amestecul de reacţie s-a stins cu 1M HCl (200 mL x 2 ) şi spălat cu H20 (200 mL x 2). Materialul dorit s-a extras utilizând CH2Cl2 şi straturile organice combinate au fost uscate folosind MgSO4 anhidru şi trecute printr-un strat de silice. Solventul a fost îndepărtat sub presiune redusă şi materialul brut a fost purificat utilizând cromatografia rapidă (Rf=0,33, 1:1 Hex/EtOAc) pentru a da compusul 302 (22 g, 75%): 1H RMN (300 MHz, CDCl3): δ 5,24 (t, 1H), 3,82 (s, 4H), 2,24 (m, 2H), 2,03 (d, 2H), 1,38 (m, 2H), 0,48 (m, 1H), 0,40 (m, 1H).
Prepararea Compusului 304.
Ester metilic al N-t-Boc-cis-4-Hidroxi-L-prolinei 303 (100,0 g, 407,7 mmol) şi DABCO (1,5 echiv, 68,6 g, 611,6 mmol) s-au dizolvat în toluen anhidru (200 mL) într-un balon cu trei gâturi cu fund rotund de 2 L cu un agitator mecanic şi o pâlnie de adiţie. După răcirea soluţiei la 0°C sub N2, o soluţie de clorură de 4-bromo-benzensulfonil (1,3 echiv, 135,6 g, 530,0 mmol) în 300 mL de toluen s-a adăugat prin pâlnia de adiţie timp de 60 minute. Amestecul de reacţie s-a agitat şi s-a încălzit la temperatura camerei peste noapte (16 ore). Amestecul s-a turnat lent în 2L de 1M Na2CO3 (apos) şi produsul s-a extras cu EtOAc (2 L). După ce faza organică s-a spălat cu 0,5 N HCl (2L), H2O (1L) şi soluţie salină (1 L), acesta a fost uscat (MgSO4), concentrat pentru a obţine 195,45 g de produs brosilat uleios de culoare galbenă.
La o soluţie de brosilat sus-menţionat (407,7 mmol) în diclormetan (300 mL) s-a adăugat lent 4,0 M HCl în dioxan (500 mL, 5 echiv) şi soluţia rezultată s-a lăsat sub agitare la temperatura camerei timp de 2 ore. După aceasrta eter (500 mL) s-a adăugat la amestecul de reacţie, amestecul s-a agitat timp de 15 minute şi precipitatul alb a fost colectat prin filtrare. Solidul s-a spălat cu eter şi hexan şi apoi uscat sub vid peste noapte pentru a se obţine 153,0 g de sare de hidroclorură a aminei a compusului 304, 381,8 mmol, randament 94% pentru două etape.
Prepararea Compusului 305.
La o soluţie de Boc-terţ-butil-glicină (97,0 g, 420,0 mmol) în DMF (200 mL) şi clorură de metilen (200 mL) s-au adăugat HATU (217,76 g, 572,7 mmol) şi bază Hunig (126 mL, 1145,4 mmol) la temperatura camerei. După ce amestecul a fost agitat timp de 20 minute la temperatura camerei, o soluţie de sare HCl (153,0 g, 381,8 mmol) şi bază Hunig (126 mL, 1145,4 mmol) menţionate mai sus în DMF (200 mL) şi diclormetan (200 mL) s-a adăugat la amestecul de acid menţionat într-o porţie. Amestecul de reacţie s-a agitat la temperatura camerei timp de 3 ore, cu monitorizare prin LCMS. Amestecul de reacţie a fost concentrat pentru a îndepărta diclormetanul sub presiune redusă şi solidul alb care s-a format s-a filtrat. Soluţia DMF rămasă s-a diluat cu acetat de etil (1L), s-a spălat succesiv cu 3% LiCl (apoasă) (3x650mL), soluţie saturată de NH4Cl (2x500 mL), 0,5 N HCl (apoasă) ( 2x600mL), soluţie salină (500 mL), soluţie saturată de NaHCO3 (3x500mL) şi soluţie salină (500 mL). Fracţiunea organică rezultată a fost uscată (MgSO4) şi concentrată pentru a obţine compusul 305 (111 g).
Prepararea Compusului 306.
La o soluţie de ester metilic 305 (120 g, 207,8 mmol) în THF (300 mL), MeOH (75 mL) s-a adăugat o soluţie de LiOH (26,18 g, 623,4 mmol) în H2O (150 mL). Soluţia s-a lăsat sub agitare la temperatura camerei timp de 4 ore. Amestecul s-a răcit într-o baie de gheaţă acidulându-l cu 3N HCl până la un pH de aproximativ 5,5, s-a agitat timp de 10 minute, iar solidele albe rezultate au fost colectate prin filtrare. Solidele s-au spălat cu mai multă apă, eter şi hexan. Solidele s-au uscat sub vid la 40°C peste noapte pentru a da 95,78 g (82%) de acid 306.
Prepararea Compusului 307.
La o soluţie de acid carboxilic 306 (81,4 g, 144,27 mmol) în DMF (200 mL) şi diclormetan (200 mL) s-a adăugat HATU (82,3 g, 216,4 mmol) şi bază Hunig (47,5 mL, 432,8 mmol) la temperatura camerei. După ce amestecul a fost agitat timp de 20 minute la temperatura camerei, o soluţie de amină (158,7 mmol) şi bază Hunig (47,5 mL, 1145,4 mmol) în DMF (200 mL) şi diclormetan (200 mL) s-a adăugat la amestecul de acid de mai sus într-o singură porţie. Amestecul de reacţie s-a agitat la temperatura camerei timp de 3 ore şi s-a monitorizat prin LCMS. După ce amestecul a fost concentrat sub presiune redusă pentru a îndepărta diclormetanul, solidele albe care s-au format au fost filtrate. Soluţia DMF s-a diluat cu acetat de etil (600 mL) şi spălat succesiv cu 3 % LiCl (apoasă) (2x550mL), soluţie saturată de NH4Cl (500 mL), 1N HCl (apoasă) (500 mL), soluţie saturată de NaHCO3 (500 mL) şi soluţie dsalină (300 mL). Fracţiunea organică rezultată a fost uscată (Na2SO4) şi concentrată pentru a obţine compusul 307 (111 g).
Prepararea compusului 308.
Compusul 307 a fost dizolvat în 4N HCl în dioxan (300 mL) la temperatura camerei şi s-a agitat timp de 2 ore. Acesta a fost apoi concentrat sub vid şi coevaporat cu diclormetan (2 x 200 mL) până la uscare. Reziduul s-a dizolvat în acetat de etil (600 mL) şi soluţie apoasă saturată de NaHCO3 (1L). Acesta a fost agitat puternic. Peste 10 minute, biciclo[3.1.0]hex-3-il 2,5-dioxo-pirolidin-1-il ester al acidului carbonic 302 (41,4 g, 173,1 mmol) s-a adăugat într-o porţie. După ce amestecul rezultat a fost agitat timp de încă 30 min, stratul organic a fost colectat şi spălat cu soluţie salină (500 mL), uscat (Na2SO4) şi concentrat. Produsul brut s-a purificat prin cromatografie rapidă pe silicagel cu acetat de etil / hexan pentru a se obţine 94,44 g (92% de compus 308.
Prepararea compusului 310.
1-(2-Amino-3-cloro-4-hidroxi-fenil)-etanonă 309 (70,7 g, 354 mmol) s-a agitat în 48% HBr ap. (500 mL) la 110°C timp de 72 ore. După ce amestecul a fost răcit la 0°C cu agitare, solidele s-au filtrat şi s-au spălat cu apă. Solidele rezultate au fost triturate cu o soluţie saturată de NaHCO3 (~350 mL), filtrate, spălate cu apă şi uscate sub vid pentru a da ~40 g (61%) de produs brut 310 ca un solid cafeniu închis. CL/SM = 186 (M++1).
Prepararea compusului 311.
1-(2-Amino-3-cloro-4-hidroxi-fenil)-etanonă 310 (40 g, 215 mmol) s-a dizolvat în DMF (360 mL). S-a adăugat carbonat de cesiu (140 g, 430 mmol), urmat de dimetil acetal al bromoacetaldehidei (54,5 g, 323 mmol). Amestecul s-a agitat apoi puternic la 65°C timp de 24 ore. După răcire la temperatura camerei, EtOAc (1 L) şi H2O (1 L) s-au adăugat la amestec. Stratul organic a fost extras cu acetat de etil (1 x 400 mL). Stratul organic combinat s-a spălat cu soluţie apoasă de 3% LiCl (2 x 1L), soluţie salină, s-a uscat (Na2SO4) şi s-a concentrat în vid. Reziduul s-a purificat prin cromatografie pe silicagel pentru a da compusul 311 ca un solid alb (39 g, 67%).
Prepararea compusului 312.
La un amestec de 1-[2-Amino-3-cloro-4-(2,2-dimetoxi-etoxi)-fenil]-etanonă 311 (13 g, 47,5 mmol) şi hidrobromură de acid izopropilaminotiazol-4-carboxilic (12,64 g, 47,5 mmol) în piridină (150 mL) s-a adăugat lent oxiclorură de fosfor (9,47 g, 61,8 mmol) la -40°C. Amestecul s-a agitat apoi la 0°C timp de 4 ore. După completarea reacţiei, H2O (30 mL) s-a adăugat prin picurare la amestec. Amestecul s-a agitat apoi la 0°C timp de încă 15 minute. Amestecul a fost concentrat în vid. Reziduul s-a diluat cu acetat de etil, s-a spălat cu o soluţie apoasă saturată de NaHCO3. Stratul organic s-a uscat (Na2SO4) şi s-a concentrat în vid. Reziduul s-a dizolvat în CH2Cl2, hexan s-a adăugat încet la soluţie şi un solid de culoare galbenă a început să se prevadă. Mai mult hexan s-a adăugat până când puţin produs a rămas în lichidul mamă pentru a obţine compusul 312 (18 g, 85%).
Prepararea compusului 313.
[6-Acetil-2-cloro-3-(2,2-dimetoxi-etoxi)-fenil]-amida acidului 2-izopropilamino-tiazol-4-carboxilic şi 312 (18 g, 40,7 mmol) a fost suspendată în toluen (400 mL). NaH (2,4 g, 61 mmol) s-a adăugat la amestecul agitat puternic monitorizând în acelaşi timp evoluţia H2. Amestecul a devenit o soluţie clară în timpul încălzirii la reflux. Reacţia a fost completă după reflux timp de 3 ore. Amestecul s-a răcit la temperatura camerei. O soluţie de AcOH (69,2 mmol) în H2O (3 vol.) s-a adăugat la amestec. După agitare puternică timp de 1 oră la 0°C, solidele au fost colectate prin filtrare, clătite cu H2O. Precipitatul umed s-a uscată sub vid înalt la o greutate constantă pentru a obţine compusul 313 (15 g, 86%).
Prepararea compusului 314.
La un amestec de brosilat intermediar 303 (15 g, 35 mmol) şi compus 313 (27,5 g, 38,5 mmol) în NMP (200 mL) s-a adăugat carbonat de cesiu (25,1 g, 77 mmol). Amestecul s-a agitat la 65°C timp de 5 ore. Reacţia s-a răcit la temperatura camerei şi EtOAc (600 mL) şi o soluţie apoasă de 3% LiCl (600 mL) s-au adăugat la amestec. Stratul organic s-a spălat cu soluţie apoasă de 3% LiCl (1 x 600 mL), soluţie salină, s-a uscat (Na2SO4) şi s-a concentrat în vid. Reziduul s-a purificat prin cromatografie pe silicagel pentru a se obţine esterul metilic dorit ca un solid galben (23,6 g, 75%). CL/SM = 900,13 (M++1).
Prepararea compusului 315.
Ester metilic 314 (23,6 g, 26 mmol) s-a dizolvat în acid acetic glacial (200 mL), 1,4 N HCL în H2O (75 mL) s-a fadăugat la soluţie. Amestecul s-a agitat la 60°C timp de 1 oră. După completarea reacţiei, amestecul a fost concentrat pentru a îndepărta solvenţii, coevaporat cu toluen (x 2) pentru a îndepărta acidul acetic rezidual. Reziduul a fost apoi dizolvat în EtOAc (500 mL) şi soluţie apoasă saturată de NaHCO3 (suficient pentru a neutraliza amestecul) monitorizînd în acelaşi timp evoluţia CO2. Stratul organic s-a spălat cu soluţie salină, s-a uscat (Na2SO4) şi s-a concentrat în vid. Reziduul s-a uscat în continuare sub vid înalt timp de 1 oră şi s-a utilizat ca atare în etapa următoare. Produsul brut a fost dizolvat în CH2Cl2 (360 mL), morfolină (3,4 g, 39 mmol) şi triacetoxiborohidrură de sodiu (7,2 g, 34 mmol) s-au adăugat la amestec la 0°C. Apoi acid acetic glacial (0,47 g, 7,8 mmol) s-a adăugat prin picurare la amestec. Reacţia a fost completă în 10 minute la 0°C. Soluţie apoasă saturată de NaHCO3 s-a adăugat pentru a stinge reacţia. După agitare timp de 20 de minute, stratul organic s-a spălat cu soluţie salină, s-a uscat (Na2SO4) şi s-a concentrat în vid. Reziduul s-a purificat prin cromatografie pe silicagel pentru a se obţine produsul dorit amina 315 ca un solid galben (12 g, 50%). CL/SM = 924,63 (M++1).
Compusul 4 poate fi preparat astfel cum este descris în Exemplul următor.
Exemplul 4: Prepararea Compusului 4.
Amestecul diastereomeric 414 s-a dizolvat în heptan şi izopropanol (70%: 30%, 230 mg în 4,5 mL de amestec de solvenţi) şi s-a supus separării pe coloană chirală în următoarele condiţii:
Coloană: Chiralcel OD-H, 2 x 25 cm
Sistem de solvenţi: 70% heptan şi 30% izopropanol
Debit: 6 mL/min.
Volum de încărcare per experiment: 2,5 mL
Compusul 4 a avut un timp de retenţie de 20 de minute. 1H RMN (300 MHz, CDCl3): δ 8,00 (s, 1H), 7,1-7,3 (m, 5H), 6,83 (d, 1H), 6,71 (d, 1H), 6,09 (br s, 2H), 5,95 (s, 1H), 5,04 (m, 2H), 4,67 (q, 1H), 4,35-4,52 (m, 2H), 4,00 (m, 2H), 2,74 (m, 1H), 1,40 (d, 3H), 1,2-1,3 (12H), 0,98 (s, 3H). 31P RMN (121,4 MHz, CDCl3): δ 2,72 (s). Compusul 4 a fost ulterior recristalizat din MTBE pentru cristale de calitate cu raze Roentgen.
Compusul 4a avut un timp de retenţie de 50 min. 1H RMN (300 MHz, CDCl3): δ 7,98 (s, 1H), 7,1-7,3 (m, 5H), 6,83 (d, 1H), 6,73 (d, 1H), 6,02 (br s, 2H), 5,95 (s, 1H), 5,08 (d, 1H), 5,00 (m, 1H), 4,68 (q, 1H), 4,38-4,56 (m, 2H), 3,98 (m, 2H), 2,74 (m, 1H), 1,40 (d, 3H), 1,2-1,3 (12H), 0,99 (s, 3H). 31P RMN (121,4 MHz, CDCl3): δ 2,61 (s).
Amestecul diastereomeric intermediar 414 a fost preparat după cum urmează.
Prepararea Compusului 402.
La o soluţie de compus 401 (22,0 g, 54,9 mmol, preparat în conformitate cu procedurile descrise în J.O.C., 2004, 6257) în metanol (300 mL) s-a adăugat prin picurare clorura de acetil (22 mL) la 0°C folosind o pâlnie de picurare timp de o perioadă de 30 minute şi apoi s-a agitat la temperatura camerei timp de 16 ore. Amestecul s-a concentrat, redizolvat în acetat de etil (400 mL), s-a spălat cu soluţie rece ca gheaţa de 2 N NaOH şi s-a concentrat până la uscare, obţinându-se eterul metilic brut 402 sub forma unui ulei. SM = 437,2 (M+Na+).
Prepararea Compusului 403.
La o soluţie de compus 402 în metanol (300 mL) s-a adăugat soluţie de 0,5 M metoxid de sodiu în metanol (20 mL, 10 mmol) şi s-a agitat timp de 16 ore la temperatura camerei. Reacţia s-a stins cu soluţie de 4,0 N HCl în dioxan (2,5 mL, 10 mmol). Amestecul a fost apoi concentrat, obţinându-se compusul brut 403. SM = 201,0 (M+Na+).
Prepararea Compusului 404.
Un amestec de compus 403, Tritron X-405 (70% în apă, 6,0 g), 50% KOH (în apă, 85 g) în toluen (500 mL) s-a încălzit la reflux cu un captator Dean-Stark ataşat. După 1 oră de colectare 25 mL de apă, s-a adăugat clorură de benzil (33 g, 260 mmol) şi a continuat la reflux cu agitare timp de 16 ore. Amestecul s-a răcit apoi şi s-a separat între acetat de etil (400 mL) şi apă (300 mL). Stratul organic s-a spălat cu apă (300 mL) şi s-a concentrat. Reziduul s-a purificat prin cromatografie în coloană pe silicagel (20% EtOAc/hexan), obţinându-se eterul metilic 404 sub forma unui ulei (22,0 g, 89% în trei etape). 1H RMN (300 MHz, CDCl3): δ 7,3 (m, 15H), 4,5-4,9 (m, 7H), 4,37 (m, 1H), 3,87 (d, 1H), 3,56 (m, 2H), 3,52 (s, 3H), 1,40 (s, 3H).
Prepararea Compusului 405.
La o soluţie de 404 (22,0 g, 49,0 mmol) în acid acetic (110 mL) s-a adăugat 3 M acid sulfuric (preparat prin amestecarea a 4,8 g de acid sulfuric concentrat cu 24 mL de apă) şi s-a agitat la 70°C timp de 8 ore. Amestecul a fost concentrat la un volum de 20 mL şi separat între acetat de etil şi NaOH 2N rece ca gheaţa. Stratul de acetat de etil a fost concentrat şi purificat prin cromatografie în coloană pe silicagel (~35% EtOAc/hexan), obţinând compusul 405 sub forma unui ulei (17,0 g, 80%). SM = 457,2 (M+Na+).
Prepararea Compusului 406.
La o soluţie de compus 405 (45 g, 104 mmol) în DMSO (135 mL) s-a adăugat prin picurare anhidridă acetică (90 mL, 815 mmol) la temperatura camerei sub argon. Amestecul s-a agitat timp de 16 ore la temperatura camerei şi apoi s-a turnat în apă cu gheaţă (1 L) sub agitare. După ce gheaţa s-a topit complet (30 minute), s-a adăugat acetat de etil (500 mL). Stratul organic s-a separat. Acest proces de extracţie a fost repetat de trei ori (3x500 mL). Extractele organice au fost combinate şi concentrate. Reziduul s-a purificat prin cromatografie în coloană pe silicagel (20% EtOAc/hexan), obţinând compusul 406 sub forma unui ulei (39 g, 88%). 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ 7,3 (m, 15H), 4,4-4,8 (m, 7H), 4,08 (d, J=7,5 Hz, 1H), 3,75 (dd , J=2,4, 11,4 Hz, 1H), 3,64 (dd, J=5,4, 11,4 Hz, 1H), 1,51 (s, 3H).
Prepararea Compusului 407.
La un balon purjat cu argon cu fund rotund uscat (100 mL) s-au adăugat 7-bromo-pirolo[2,1-f][1,2,4]triazin-4-ilamină (234 mg, 1,10 mmol) (preparată conform […] WO2007056170) şi THF anhidru (1,5 mL). TMSCl (276 µL, 2,2 mmol) s-a adăugat apoi şi amestecul de reacţie s-a agitat timp de 2 ore. Balonul a fost plasat într-o baie de gheaţă/acetonă uscată (-78°C) şi BuLi (2,5 mL, 4,0 mmol, 1,6 M în hexan) s-a adăugat prin picurare. După 1 oră, o soluţie de compus 406 (432,5 mg, 1,0 mmol) în THF s-a răcit la 0°C şi apoi s-a adăugat prin picurare la balonul de reacţie. După 1 oră de agitare la -78°C, balonul a fost încălzit la 0°C şi soluţie saturată de NH4Cl (5 mL) s-a adăugat pentru a stinge reacţia. Substanţele organice au fost extrase utilizând EtOAc (3 x 10 mL) şi straturile organice combinate au fost uscate utilizând MgSO4. Solventul a fost îndepărtat sub presiune redusă şi materialul brut a fost purificat utilizând cromatografia rapidă (hexan/acetat de etil). 560 mg (90%) de compus 407 au fost izolate ca un amestec de doi anomeri. CL/ SM= 567,2 (M+H+). 1H RMN (300 MHz, CDCl3): δ 7,85 (m, 1H), 7,27 (m, 15H), 7,01 (m, 1H), 6,51 (m, 1H), 4,66 (m, 8H), 4,40 (m, 2H), 3,79 (m, 3H), 1,62 (s, 2'-CH3 dintr-un anomer), 1,18 (s, 2'-CH3 din celălalt anomer).
Prepararea Compusului 408.
La o soluţie de compus 407 (1 g, 1,77 mmol) în CH2Cl2 (20 mL) la 0°Cs-a adăugat TMSCN (1,4 mL, 10,5 mmol) şi BF3-Et2O (1 mL, 8,1 mmol). Amestecul de reacţie s-a agitat la 0°C timp de 0,5 oră, apoi la temperatura camerei timp de încă 0,5 oră. Reacţia s-a stins cu NaHCO3 la 0°C şi s-a diluat cu CH3CO2Et. Faza organică s-a separat, s-a spălat cu soluţie salină, s-a uscat pe Na2SO4, s-a filtrat şi s-a concentrat. Reziduul s-a purificat prin cromatografie pe silicagel, s-a eluat cu CH3CO2Et-hexan (1:1 la 2:01), pentru a se obţine compusul 408 (620 mg, 61%) ca un amestec izomeric. SM = 576,1 (M+H+).
Prepararea Compusului 409.
La o soluţie de compus 408 (150 mg, 0,26 mmol) în CH2Cl2 (4 mL) la -78°C s-a adăugat BCl3 (2 mL, 1M în CH2Cl2). Amestecul de reacţie s-a agitat la -78°C timp de 1 oră. Reacţia a fost stinsă la -78°C adăugând prin picurare TEA (2 mL) şi MeOH (5 mL). Amestecul a fost lăsat să se încălzească până la temperatura camerei, evaporat şi coevaporat cu MeOH de câteva ori. Reziduul a fost tratat cu NaHCO3 (1 g în 10 mL de H2O), concentrat şi purificat prin HPLC pentru a se obţine produsul dorit compusul 409 (48 mg, 60%). 1H RMN (300 MHz, D2O): δ 7,74 (s, 1H), 6,76 (d, J=5 Hz, 1H), 6,73 (d, J=5 Hz, 1H), 4,1 (m, 1H), 3,9 (m, 1H), 3,8 (m, 2H), 0,84 (s, 3H). SM = 305,9 (M+H+). Alt alfa-anomer a fost de asemenea obţinut (9 mg, 11%): 1H RMN (300 MHz, D2O): δ 7,70 (s, 1H), 6,8 (d, J=5 Hz, 1H), 6,7 (d, J=5 Hz, 1H), 4,25 (d, J=9 Hz, 1H), 4,07 (m, 1H), 3,85 (m, 1H), 3,7 (m, 1H), 1,6 (s, 3H). SM = 306,1 (M+H+).
Prepararea Compusului 412.
Compusul 410 (disponibil comercial, 4,99 g, 23,8 mmol) a fost dizolvat în diclormetan (100 mL) şi s-a adăugat hidroclorură a esterului izopropilic al alaninei 411 (3,98 g, 23,8 mmol). Soluţia limpede rezultată a fost răcită la -78°C timp de 30 min. Trietilamină (6,63 mL, 47,5 mmol) s-a adăugat prin picurare peste 15 minute. Amestecul a fost apoi lăsat să se încălzească la temperatura camerei. După 16 ore, solventul a fost îndepărtat prin curent de argon. Reziduul a fost redizolvat în MTBE (25 mL) şi substanţa insolubilă a fost îndepărtată prin filtrare sub argon. Filtratul a fost condensat prin curent de argon şi produsul brut 412 a fost utilizat în reacţia următoare fără purificare suplimentară. 1H RMN (300 MHz, CDCl3): 7,1-7,4 (m, 5H), 5,1 (m, 1H), 4,35 (m, 1H), 4,15 (m, 1H), 1,5 (d, 3H), 1,2 (m, 6H). 31P RMN (121,4 MHz, CDCl3): δ 7,8 şi 8,4 (2s).
Prepararea Compusului 413.
La o soluţie de compus 409 (1,03 g, 3,37 mmol) în trimetilfosfat (2,0 mL) şi THF (20 mL) s-a adăugat N-metil imidazol (1,5 g, 18,3 mmol) la 0°C. O soluţie de compus 412 (2,5 g, 8,18 mmol) în THF (3 mL) s-a adăugat prin picurare. Amestecul rezultat s-a lăsat să se încălzească la temperatura camerei timp de 1,5 ore. Amestecul a fost împărţit între acetat de etil şi apă. Stratul de acetatde etil a fost concentrat şi reziduul a fost purificat prin cromatografie pe silicagel (acetat de etil până la 10% etanol/acetat de etil), obţinându-se 1,15 g (59%) de compus 413 ca amestec diastereoizomeric 1:1 la fosfor. 1H RMN (300 MHz, CDCl3): δ 8,02 (s, 1H), 7,1-7,4 (m, 5H), 6,8 (2d, 1H), 6,7 (2d, 1H), 6,08 (br s, 2H), 5,03 (m, 1H), 4,6 (m, 1H), 4,4 (m, 2H), 3,9-4,1 (m, 3H), 1,31 (d, 3H), 1,2 (m, 6H), 0,83 (s, 3H). 31P RMN (121,4 MHz, CDCl3): δ 2,78 (s). SM = 575,1 (M+H+).
Prepararea Compusului 414.
La o soluţie de compus 413 (175 mg, 0,305 mmol) în acetonitril (2 mL) s-a adăugat dimetil acetal al N,N-dimetilformamidei (41 µL, 0,34 mmol, 1,1 echiv.) şi s-a agitat la temperatura camerei timp de 1 oră. Reacţia a fost completă (prin LCMS). Amestecul a fost apoi concentrat până la uscare. La reziduu s-a adăugat DCC (250 mg, 1,21 mmol, 4 echiv.), acetonitril (5 mL) şi acid izobutiric (55 mg, 58 µL, 2 echiv.). Amestecul s-a agitat la temperatura camerei timp de 48 ore. Apă (0,2 mL) şi acid trifluoracetic (0,1 mL) s-au adăugat la 0°C şi s-au agitat la temperatura camerei timp de 64 ore. Bicarbonat de sodiu (500 mg) s-a adăugat la 0°C. Amestecul s-a agitat la temperatura camerei timp de 0,5 oră şi s-a filtrat. Filtratul s-a concentrat şi reziduul s-a purificat prin cromatografie în coloană pe silicagel (5% metanol/diclormetan), obţinându-se 144 mg (73%) de compus 414 ca amestec diastereoizomeric 1:1 la fosfor. 1H RMN (300 MHz CDCl3): δ 8,00 (s, 1H), 7,1-7,4 (m, 5H), 6,83 (d, 1H), 6,71 (2d, 1H), 5,97 (br s, 2H), 5,94 (d, 1H), 5,07 (2d, 1H), 5,01 (m, 1H), 4,68 (m, 1H), 4,4 (m, 2H), 4,0 (m, 2H), 2,74 (m, 1H), 1,4 (2d, 3H), 1,2-1,3 (12H), 0,98 şi 0,99 (2s, 3H). 31P RMN (121,4 MHz, CDCl3): δ 2,56 şi 2,65 (2s). SM = 645,1 (M+H+).
Compusul 5 poate fi preparat astfel cum este descris în Exemplul următor.
Exemplul 5: Prepararea 5: Acid 5-(3,3-dimetilbut-1-in-1-il)-3-[(cis-4-hidroxi-4-{[(3S)-tetrahidrofuran-3-iloxi]metil}ciclohexil){[(1R)-4-metilciclohex-3-en-1-il]carbonil}amino]tiofen-2-carboxylic 5.
Ester metilic al acidului i5-(3,3-dimetil-but-1-inil)-3-[((1R)-4-metil-ciclohex-3-enecarbonil)-(1-oxa-spiro[2.5]oct-6-il)-amino]-tiofen-2-carboxilic 508 (132 mg, 0,28 mmol) şi (S)-tetrahidro-furan-3-ol 509 (247 mg, 2,8 mmol) în 1-metil-pirolidin-2-onă (3 mL) au fost trataţi cu terţ-butoxid de potasiu (251 mg, 2,24 mmol), sigilat la încălzire la 40°C timp de 16 ore. După răcire, amestecul s-a tratat cu HCl 2 M până la pH 3, împărţit între acetat de etil şi apă şi s-a separat. Stratul organic s-a spălat cu soluţie de 5% de clorură de litiu, apă, soluţie salină şi s-a uscat pe sulfat de sodiu. După filtrare şi concentrare reziduul s-a purificat prin HPLC cu CH3CN (0,1% TFA)/H2O (0,1% TFA) pentru a se obşine 107 mg (70% randament) de compus 5 sub formă de pulbere de culoare albă: SM (m/z): 544,0 [M+H]+; Timp de retenţie HPLC 4,22 min (2-98% acetonitril: apă cu 0,05% acid trifluoracetic).
Compusul intermediar 508 a fost preparat după cum urmează.
Prepararea Compusului 502.
(S)-3-hidroxi-4,4-dimetildihidrofuran-2(3H)-onă (2,60 g, 20 mmol) şi diizopropiletilamină (5,2 mL, 30 mmol) în diclormetan (25 mL) a fost răcită la -10°C şi tratată prin picurare cu clorură de acriloil (2,03 mL, 25 mmol) şi s-a agitat timp de 2 ore. HCl 1M (20 mL) s-a adăugat şi stratul organic s-a spălat cu bicarbonat de sodiu şi apă. Stratul organic s-a uscat pe sulfat de sodiu, s-a filtrat şi s-a concentrat. Cromatografia rapidă (10-40% EtOAc, hexan) a dat 2,09 g (57% randament) de (S)-4,4-dimetil-2-oxotetrahidrofuran-3-il acrilat dorit 501 sub forma unui ulei limpede.
(S)-4,4-dimetil-2-oxotetrahidrofuran-3- il acrilat 501 (2,05 g, 11,1 mmol) în diclormetan (17,5 mL) şi hexan (2,5 mL) a fost răcită la -10°C şi s-a tratat cu tetraclorură de titan (2,2 mL, 1 M în diclormetan, 2,2 mmol). Soluţia galbenă s-a agitat timp de 15 min şi s-a tratat cu izopren (1,67 mL, 16,7 mmol) prin picurare timp de 5 minute. După agitare timp de 2 ore, s-a adăugat o porţie suplimentară de izopren (1,67 mL, 16,7 mmol) şi amestecul de reacţie s-a agitat la -10 până la 0°C timp de 3,5 ore. Amestecul de reacţie a fost stins cu clorură de amoniu (soluţie apoasă saturată). Apă şi acetat de etil: hexani (1:1) s-au adăugat. Stratul organic s-a separat şi stratul apos s-a extras din nou cu acetat de etil:hexani (1:1). Straturile organice combinate s-au uscat pe sulfat de sodiu, s-au filtrat şi s-au concentrat. Reziduul s-a purificat prin cromatografie rapidă (10-50% EtOAc:Hex, 80 g coloană) pentru a se obţine 1,30 g (46% randament) de (R)-((S)-4,4-dimetil-2-oxotetrahidrofuran-3-il) 4-metilciclohex-3-enecarboxilatul 502 ca un ulei limpede.
Prepararea Compusului 503.
(R)-((S)-4,4-dimetil-2-oxotetrahidrofuran-3-il) 4-metilciclohex-3-enecarboxilat 502 (1,30 g, 5,15 mmol) în THF (10 mL), apă (1 mL) şi metanol (1 mL) s-au tratat cu hidroxid monohidrat de litiu (2,16 g, 51,5 mmol) şi s-au încălzit la 50°C cu agitare. După o oră, amestecul de reacţie s-a tratat cu HCL 1M. Amestecul s-a extras cu hexani: THF (10:1), s-a uscat pe sulfat de sodiu, s-a filtrat şi s-a concentrat până la 0,738 g (randament cantitativ) de acid (R)-4-metilciclohex-3-encarboxilic 503 ca o pulbere albă.
Prepararea Compusului 504.
Acid (R)-4-metilciclohex-3-encarboxilic 503 (371 mg, 2,65 mmol) s-a uscat azeotropic prin evaporare din toluen, s-a tratat cu fosfat de potasiu tribazic (1,13 g, 7,94 mmol), s-a suspendat în diclormetan (7,6 mL) şi s-a tratat cu dimetilformamidă (4 picături). Amestecul de reacţie s-a răcit la 0°C şi s-a tratat prin picurare cu clorură de oxalil (0,75 mL, 7,9 mmol). Amestecul de reacţie s-a lăsat să se încălzească la temperatura ambiantă sub agitare timp de 2 ore. După filtrarea solidelor, soluţia a fost concentrată, tratată cu hexani şi concentrată din nou pentru a se obţine clorura de (R)-4-metilciclohex-3-encarbonil 504 ca un ulei galben-deschis care a fost folosit imediat în etapa următoare.
Prepararea Compusului 506.
Clorură de (R)-4-metilciclohex-3-encarbonil 504 (2,65 mmol), ester metilic al acidului 5-(3,3-dimetil-but-1-inil)-3-(1,4-dioxa-spiro[4.5]dec-8-ilamino)-tiofen-2-carboxilic 505 (250 mg, 0,66 mmol) şi fosfat de potasiu tribazic (562 mg, 2,65 mmol) au fost suspendate în dicloretan (1,7 mL), sigilate cu un capac şi încălzite la 90°C. După 16 ore, amestecul de reacţie s-a răcit şi s-a repartizat între acetat de etil şi apă. Stratul organic s-a separat, iar stratul apos s-a extras din nou cu acetat de etil. Straturile organice combinate s-au uscat pe sulfat de sodiu, s-au filtrat şi s-au concentrat. Cromatografia rapidă (10-40% EtOAc:hexani) a dat 220 mg (67% randament) de ester metilic al acidului 5-(3,3-dimetil-but-1-inil)-3-[(1,4-dioxa-spiro[4.5]dec-8-il)-((1R)-4-metil-ciclohex-3-encarbonil)-amino]-tiofen-2-carboxilic 506 dorit sub formă de spumă bej.
Prepararea Compusului 507.
Esterul metilic al acidului 5-(3,3-dimetil-but-1-inil)-3-[(1,4-dioxa-spiro[4.5]dec-8-il)-((1R)-4-metil-ciclohex-3-encarbonil)-amino]-tiofen-2-carboxilic 506 (219 mg, 0,438 mmol) a fost dizolvat în THF (3,5 mL) şi tratat cu HCl 4M (1,75 mL, 7,01 mmol). Amestecul de reacţie s-a încălit la 45°C şi s-a agitat timp de 2 ore. Acetat de etil s-a adăugat şi stratul organic s-a separat, apoi s-a spălat cu apă, bicarbonat de sodiu (soluţie apoasă saturată), apă şi soluţie salină. Stratul organic s-a uscat pe sulfat de sodiu, s-a filtrat şi s-a concentrat până la 0,190 g (95% randament) de Ester metilic al acidului 5-(3,3-dimetil-but-1-inil)-3-[((1R)-4-metil-ciclohex-3-encarbonil)-(4-oxo-ciclohexil)-amino]-tiofen-2-carboxilic 507 dorit sub formă de spumă albă.
Prepararea Compusului 508.
Clorură de trimetilsulfoxoniu (79 mg, 0,62 mmol ) în DMSO (1,5 mL) s-a tratat cu hidrură de sodiu (21 mg, 60% dispersie în ulei, 0,53 mmol) şi s-a agitat la temperatura ambiantă timp de 10 minute. Ester metilic al acidului 5-(3,3-dimetil-but-1-inil)-3-[((1R)-4-metil-ciclohex-3-encarbonil)-(4-oxo-ciclohexil)-amino]-tiofen-2-carboxilic 507 în THF (1 mL + 0,5 mL) s-a adăugat în picături şi amestecul de reacţie s-a agitat timp de 45 min. Soluţia portocalie s-a tratat cu acid citric 5% până la pH 3 şi s-a împărţit între apă şi acetat de etil. Stratul organic s-a separat, iar stratul apos s-a extras din nou cu acetat de etil. Substanţele organice combinate au fost spălate cu 5% LiCl, apă şi soluţie salină şi uscate pe sulfat de sodiu. După filtrare şşi concentrare, reziduul s-a purificat prin cromatografie rapidă (20-75% EtOAc:hexani) pentru a se obţine 0,134 g (70% randament) de Ester metilic al acidului 5-(3,3-dimetil-but-1-inil)-3-[((1R)-4-metil-ciclohex-3-encarbonil)-(1-oxa-spiro[2.5]oct-6-il)-amino]-tiofen-2-carboxilic 508 ca o pulbere albă.
Compusul 6 poate fi preparat folosind metode de sinteză şi intermediari, cum ar fi cei descrişi în US 2010310512 A1 2010.12.09. Compusul 6 poate, de asemenea, fi preparat astfel cum este descris în Exemplul următor.
Exemplul 6: Prepararea esterului metilic al acidului (1-{3-[6-(9,9-difluoro-7-{2-[5-(2-metoxicarbonilamino-3-metil-butiril)-5-aza-spiro[2.4]hept-6-il]-3H-imidazol-4-il}-9H-fluoren-2-il)-1H-benzoimidazol-2-il]-2-aza-biciclo[2.2.1]heptan-2-carbonil}-2-metil-propil)-carbamic 6.
Esterul terţ-butilic al acidului 3-[6-(9,9-difluoro-7-{2-[5-(2-metoxicarbonilamino-3-metil-butiril)-5-aza-spiro[2.4]hept-6-il]-3H-imidazol-4-il}-9H-fluoren-2-il)-1H-benzoimidazol-2-il]-2-aza-biciclo[2.2.1]heptan-2-carboxilic 614 (115 mg, 0,138 mmol) a fost dizolvat în clorură de metilen (2 mL) şi HCl în dioxan (4M, 2 mL) şi agitarea la temperatura camerei a fost continuată. După 20 de minute, toate substanţele volatile s-au îndepărtat în vid. Materialul brut a fost utilizat în etapa următoare fără purificare suplimentară. Materialul brut a fost dizolvat în DMF (1,5 mL) şi s-a adăugat DIEA (53,4 mg, 0,414 mmol). S-a adăugat o soluţie de acid (L)-3-metoxicarbonilamino-metil-butiric 611 (24,2 mg, 0,138 mmol), HATU (52,4 mg, 0,138 mmol) şi DIEA (17,8 mg, 0,138 mmol) în DMF (1 mL). Reacţia a fost agitată la temperatura camerei. După 20 minute, reacţia a fost diluată cu EtOAc şi spălată cu soluţie apoasă de bicarbonat, soluţie apoasă de LiCl (5%), soluţie salină şi uscată pe sulfat de sodiu. Filtrarea şi îndepărtarea solvenţilor în vid a dat produsul brut, care a fost purificat prin RP-HPLC (eluent: apă / MeCN m / 0,1% TFA) pentru a se obţine compusul 6 (76 mg). LCMS-IEP+: calculată pentru C49H54F2N8O6: 888,9 (M+); Depistată: 890,0 (M+H+). 1H-RMN: 300 MHz, (DMSO-d6) δ: 8,20-7,99 (m, 8H), 7,73 (s, 2H), 7,37-7,27 (m, 2H), 5,25 (dd, J=7,2 Hz, 1H), 4,78 (s, 1H), 4,54 (s, 1H), 4,16 (m, 1H), 4,02 (m, 1H), 3,87 (m, 1H), 3,74 (m, 1H), 3,55 (s, 3H), 3,53 (s, 3H), 2,75 (m, 1H), 2,25 (m, 2H), 2,09-2,04 (m, 2H), 1,88-1,79 (m, 2H), 1,54 (m, 1H), 0,94-0,77 (m, 15H), 0,63 (m, 4H) ppm. 19F-RMN: 282 MHz, (DMSO-d6) δ: -109,1 ppm [-74,8 ppm TFA].
Compusul intermediar 614 a fost preparat după cum urmează.
Prepararea compusului ester 1-benzilic 2-metilic al acidului 4-metilen-pirolidin-1,2-dicarboxilic 602.
Esterul 1-terţ-butilic al acidului 4-metilen-pirolidin-1,2-dicarboxilic 601 (10,0 g, 44 mmol) s-a dizolvat în MeOH (75 mL) la temperatura camerei şi s-a adăugat HCl (4M în dioxan, 75 mL). Agitarea la temperatura camerei a fost continuată timp de 4 ore. Toate substanţele volatile au fost îndepărtate sub vid şi s-a obţinut un solid de culoare bej. Materialul brut a fost suspendat în clorură de metilen (100 mL) şi s-a adăugat N-metil morfolină (13,3 g, 132 mmol). Amestecul s-a răcit la 0°C şi s-a adăugat cloroformiat de benzil (8,26 g, 48,4 mmol) sub agitare. După 30 minute, reacţia a fost încălzită la temperatura camerei şi soluţia a fost spălată cu apă şi soluţie apoasă de acid clorhidric (1M). Soluţia a fost uscată pe sulfat de sodiu. Filtrarea şi evaporarea solvenţilor a dat produsul brut, care s-a purificat prin cromatografie pe silicagel (eluant: EtOAc/hexani) pentru a se obţine compusul 602 (10,2 g). LCMS-IEP+: calculată pentru C15H17NO4: 275,3 (M+); Depistată: 276,4 (M+H+).
Prepararea unui amestec de Compuşi 603 şi 604.
Un balon cu 3 gâturi cu fund rotund uscat în cuptor a fost dotat cu un adaptor de admisie a azotului şi o pâlnie de adiţie de 250 mL. Al treilea gât a fost sigilat cu un sept. Balonul a fost încărcat cu o baghetă de amestecare, diclormetan (120 mL) şi dietil zinc (1,0 M în hexan, 118 mL, 118 mmol), apoi răcit la 0°C într-o baie de gheaţă. Pâlnia de adiţie a fost încărcată cu diclormetan (40 mL) şi acid trifluoracetic (9,1 mL, 118 mmol). După ce soluţia de dietil zinc s-a răcit la 0°C (aproximativ 25 minute), soluţie de acid trifluoracetic s-a adăugat prin picurare timp de 20 min la amestecul de reacţie agitat. După agitare pentru încă 20 min la 0°C, diiodmetan (9,5 mL, 118 mmol) s-a adăugat încet timp de 4 minute. După încă 20 min, ester 1-benzilic 2-metilic al acidului 4-metilen-pirolidin-1,2-dicarboxilic 602 (8,10 g, 29,4 mmol) s-a adăugat în 30 mL de diclormetan prin canulă. Balonul care conţine esterul 1-benzilic 2-metilic al acidului 4-metilen-pirolidin-1,2-dicarboxilic a fost apoi clătit cu inca 10 mL de diclormetan şi această soluţie a fost transferată la amestecul de reacţie prin canulă. Amestecul de reacţie s-a lăsat să se încălzească la temperatura camerei şi s-a agitat timp de 110 ore (aproximativ 5 zile), după care reactivii au fost stinşi cu soluţie saturată de clorură de amoniu (~150 mL). Conţinutul balonului s-a turnat lent într-o pâlnie de separare de 2 L conţinând bicarbonat de sodiu apos saturat (800 mL). Faza apoasă s-a extras de trei ori cu 300 mL de acetat de etil. Amestecul organic a fost uscat pe sulfat de magneziu şi concentrat pentru a da un amestec de Compuşi 603 şi 604.
Prepararea Compusului 603.
Materialul brut din sub-partea b s-a dizolvat în 3:1:1 THF/apă/acetonă (165 mL), apoi s-a tratat cu N-metilmorfolin-N-oxid (3,45 g, 29,4 mmol) şi tetroxid de osmiu (4% de masă în apă, 5 mL, 0,818 mmol). După agitare la temperatura camerei timp de 7 ore, reactivii au fost stinşi cu tiosulfat de sodiu 1M (~100 mL). Conţinutul balonului s-a turnat apoi într-o pâlnie de separare de 1 L conţinând apă (~300 mL). Faza apoasă s-a extras de trei ori cu 300 mL de diclormetan. Amestecul organic s-a uscat pe sulfat de magneziu şi s-a concentrat. Reziduul brut s-a purificat prin cromatografie în coloană pe silice (5% până la 45% EtOAc/hexan) pentru a se obţine esterul 5-benzilic 6-metilic al acidului 5-aza-spiro[2.4]heptan-5,6-dicarboxilic 603 sub formă de ulei limpede (5,54g, 19,15 mmol, 65%). 1H RMN (CDCl3) δ 7,36-7,29 (m, 5H), 5,21-5,04 (m, 2H), 4,56-4,47 (m, 1H), 3,75 (s, 1,5 H), 3,60 (m, 1,5 H), 3,51-3,37 (m, 2H), 2,32-2,25 (m, 1H), 1,87-1,80 (m, 1H), 0,64 - 0,51 (m, 4H).
Prepararea esterului 5-benzilic al acidului 5-aza-spiro[2.4 ]heptan-5,6-icarboxilic 606.
Esterul 5- benzilic 6-metilic al acidului 5-aza-spiro[2.4]heptan-5,6-dicarboxilic 603 (244 mg, 0,840 mmol) s-a dizolvat în THF (2,0 mL) / MeOH (1,5 mL). O soluţie apoasă de LiOH (35,5 mg, 0,84 mmol) s-a adăugat şi agitarea la temperatura camerei a fost continuată. După 3 ore, reacţia a fost neutralizată cu soluţie apoasă de HCl (1M) şi solvenţii organici s-au îndepărtat în vid. Amestecul brut s-a diluat cu apă şi acetat de etil şi s-a colectat stratul organic. Toate substanţele volatile au fost îndepărtate în vid şi acidul brut 606 a fost utilizat fără purificare suplimentară. LCMS-IEP+: calculată pentru C15H17NO4: 275,3 (M+); Depistată: 276,3 (M+H+).
Prepararea unei 2,7-Dibromo-9,9-difluoro-9H-fluorene 608.
2,7-Dibromo-fluoren-9-onă 607 (4,0 g, 11,8 mmol) s-a suspendat în deoxofluor (12 mL) la temperatura camerei şi s-a adăugat EtOH (4 picături). Suspensia agitată a fost încălzită la T = 90°C timp de 24 ore (ATENŢIE: Utilizarea deoxofluorului la temperaturi ridicate, astfel cum este descris mai sus, este avertizată deoarece pot aparea exoterme rapide şi violente). Reacţia s-a răcit la temperatura camerei şi s-s turnat pe gheaţă conţinând bicarbonat de sodiu. S-a format un solid care s-a colectat prin filtrare. Materialul brut s-a preluat în acetat de etil şi s-a spălat cu soluţie apoasă de HCţ (1M) şi soluţie salină. Soluţia a fost uscată pe sulfat de sodiu. Filtrarea şi evaporarea solvenţilor a dat produs brut, care s-a purificat prin cromatografie pe silicagel (eluant: EtOAc/hexani) pentru a se obţine 608 (3,2 g). 19F-RMN: 282 MHz, (DMSO-d6) δ: -111,6 ppm. Înainte de a utiliza materialul în etapa următoare, acesta a fost expus ca o soluţie în EtOAc la carbune.
Prepararea esterului 6-[2-(7-bromo-9,9-difluoro-9H-fluoren-2-il)-2-oxo-etil] 5-benzilic al acidului 5-Aza-spiro[2.4]heptan-5,6-dicarboxilic 609.
2,7-Dibromo-9,9-difluoro-9H-fluorenă 608 (372 mg, 1,04 mmol), Pd (PPh3)4 (30,0 mg, 0,026 mmol), PdCl2(PPh3)2 (18,2 mg, 0,026 mmol), As(PPh3)3 (5,0 mg) s-au dizolvat în dioxan (10 mL) în atmosferă de argon. S-a adăugat etoxiviniltributilstaniu (376,4 mg, 1,04 mmol). Amestecul s-a încălzit pentru 140 minute la 85°C (baie de ulei). Reacţia a fost răcită la temperatura camerei. S-a adăugat N-bromosuccinimidă (177 mg, 1,0 mmol), urmată de apă (2 mL). Reacţia s-a agitat la temperatura camerei timp de 3 ore, după care majoritatea dioxanului a fost îndepărtat în vid. Amestecul de reacţie brut a fost diluat cu acetat de etil şi spălat cu apă. Toate substanţele volatile s-au îndepărtat în vid. S-a adăugat toluen şi toate substanţele volatile s-au îndepărtat în vid pentru a doua oară. Materialul brut s-a izolvat în DMF / MeCN (2 mL, 1:1) la temperatura camerei. O soluţie de N-Cbz-4-ciclopropil (L) prolină 606 (0,84 mmol) şi DIEA (268 mg, 2,08 mmol) în MeCN (2 mL) s-a adăugat şi agitarea la temperatura camerei a fost continuată. După 14 ore, cea mai mare parte de MeCN a fost îndepărtată în vid şi amestecul de reacţie brut a fost diluat cu acetat de etil. Amestecul s-a spălat cu soluţie apoasă de HCl (1M), soluţie apoasă de clorură de litiu (5%), soluţie salină şi s-a uscat pe sulfat de sodiu. Filtrarea şi evaporarea solvenţilor au dat produsul brut de reacţie, care a fost purificat prin cromatografie pe silicagel (eluant: EtOAc / hexani) pentru a se obţine compusul 609 (176 mg). LCMS-IEP+: calculată pentru C30H24BrF2NO5: 596,4 (M+); Depistată: 595,2 / 597,2 (M+H+).
Prepararea esterului benzilic al acidului 6-[5-(7-Bromo-9,9-difluoro-9H-fluoren-2-il)-1H-imidazol-2-il]-5-aza-spiro[2.4]heptan-5-carboxilic 610.
Esterul 6-[2-(7-bromo-9,9-difluoro-9H-fluoren-2-il)-2-oxo-etil] 5- benzilic al acidului 5-aza-spiro[2.4]heptan-5,6-dicarboxilic 609 (172 mg, 0,293 mmol ) s-a dizolvat în m-xilen (6,0 mL). Acetat de amoniu (226 mg, 2,93 mmol ) s-a adăugat şi reacţia s-a agitat la 140°C timp de 60 minute în condiţii de microunde. Reacţia s-a răcit la temperatura camerei şi substanţele volatile s-au îndepărtat în vid. Materialul brut s-a purificat prin cromatografie pe silicagel (eluant: EtOAc / hexan) pentru a da compusul 610 (80,3 mg). LCMS-IEP+: calculată pentru C30H24BrF2N3O2: 576,4 (M+); Depistată: 575,2 / 577,2 (M+H+).
Prepararea esterului metilic al acidului (1-{6-[5-(7-Bromo-9,9-difluoro-9H-fluoren-2-il)-1H-imidazol-2-il]-5-aza-spiro[2.4]heptan-5-carbonil}-2-metil-propil)-carbamic 612.
Esterul benzilic al acidului 6-[5-(7-bromo-9,9-difluoro-9H-fluoren-2-il)-1H-imidazol-2-il]-5-aza-spiro[2.4]heptan-5-carboxilic 610 (800 mg, 1,38 mmol) s-a dizolvat în clorură de metilen (15 mL) şi s-a adăugat HBr în AcOH (37%, 2 mL) şi agitarea la temperatura camerei a fost continuată. După 180 minute, suspensia s-a diluat cu hexani şi solidul s-a colectat prin filtrare şi s-a spălat cu hexan şi s-a supus la vid. Materialul brut a fost utilizat în etapa următoare fără purificare suplimentară. Materialul brut a fost dizolvat în DMF (4,0 mL) şi DIEA (356 mg, 2,76 mmol). O soluţie de acid 2-(L)-metoxicarbonilamino-3-metil-butiric 611 (242 mg, 1,38 mmol), HATU (524 mg, 1,38 mmol) şi DIEA (178 mg, 1,38 mmol) în DMF (1 mL) s-a adăugat. Reacţia s-a agitat la temperatura camerei. După 50 de minute, reacţia s-a diluat cu EtOAc şi s-a spălat cu soluţie apoasă de bicarbonat, soluţie apoasă de clorură de litiu (5%), soluţie salină şi s-a uscat pe sulfat de sodiu. Filtrarea şi îndepărtarea solvenţilor în vid a dat produsul brut, care a fost purificat prin cromatografie pe silicagel (eluant: EtOAc / hexan) pentru a da compusul puţin impur 612 (878 mg). LCMS-IEP+: calculată pentru C29H29BrF2N4O3: 599,5 (M+); Depistată: 598,5 / 600,5 (M+H+).
Prepararea esterului terţ-butilic al acidului 3-[6-(9,9-Difluoro-7-{2-[5-(2-metoxicarbonilamino-3-metil-butiril)-5-aza-spiro[2.4]hept-6-il]-3H-imidazol-4-il}-9H-fluoren-2-il)-1H-benzoimidazol-2-il]-2-aza-biciclo[2.2.1]heptan-2-carboxilic 614.
Esterul metilic al acidului (1-{6-[5-(7-Bromo-9,9-difluoro-9H-fluoren-2-il)-1H-imidazol-2-il]-5-aza-spiro[2.4]heptan-5-carbonil}-2-metil-propil)-carbamic 612 (840 mg, 1,4 mmol), esterul terţ-butilic al acidului 3-[6-(4,4,5,5-Tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-1H-benzoimidazol-2-il]-2-aza-biciclo[2.2.1]heptan-2-carboxilic 613 (615 mg, 1,4 mmol), Pd(PPh3)4 (161 mg, 0,14 mmol), K2CO3 (579 mg, 4,2 mmol) s-au dizolvat în DME (15 mL) / apă (3 mL) în atmosferă de argon. Amestecul s-a încălzit timp de 120 de minute la 85-90°C (baie de ulei). După 120 minute ester boronat suplimentar (61 mg, 0,14 mmol) s-a adăugat şi încălzirea a fost continuată. După 3 ore, reacţia a fost răcită la temperatura camerei. Cea mai mare parte din DME a fost îndepărtată în vid şi amestecul de reacţie brut a fost diluat cu acetat de etil. Amestecul s-a spălat cu soluţie salină şi s-a uscat pe sulfat de sodiu. Filtrarea şşi evaporarea solvenţilor au dat produsul brut de reacţie, care a fost purificat prin cromatografie pe silicagel (eluant: EtOAc / hexan) pentru a se obţine compusul 614 (878 mg). LCMS-IEP+: calculată pentru C47H51F2N7O5: 831,9 (M+); Depistată: 832,7 (M+H+).
Compusul intermediar 613 poate fi preparat după cum urmează.
Prepararea esterului terţ-butilic al acidului 3-(2-Amino-4-bromo-fenilcarbamoil)-2-aza-biciclo[2.2.1]heptan-2-carboxilic 617.
La o soluţie de ester 2-terţ-butilic al acidului 2-aza-biciclo[2.2.1]heptan-2,3-dicarboxilic 616 (0,327 g, 1,36 mmol, 1 echiv.), 4-bromo-benzen-1,2-diamină 615 (0,507 g, 2,71 mmol, 2 echiv.) şi 4-metilmorfolină (0,299 mL, 2 echiv.) în 10 mL DMF s-a adăugat HATU (0,543g, 1,05 echiv.). Amestecul de reacţie s-a agitat la temperatura camerei timp de 1 oră, apoi concentrat. Amestecul de reacţie a fost diluat cu acetat de etil şi spălat cu soluţie apoasă de NaHCO3 diluat şi soluţie salină. Stratul organic a fost concentrat şi purificat prin cromatografie rapidă încoloană (silicagel, 20 până la 80% acetat de etil/hexan) pentru a da un amestec de regioizomer esterul terţ-butilic al acidului 3-(2-Amino-4-bromo-fenilcarbamoil)-2-aza-biciclo[2.2.1]heptan-2-carboxilic 617.
Prepararea esterului terţ-butilic al acidului 3-(6-Bromo-1H-benzoimidazol-2-il)-2-aza-biciclo[2.2.1]heptan-2-carboxilic 618.
Amestecul de mai sus de regioizomer ester terţ-butilic al acidului 3-(2-Amino-4-bromo-fenilcarbamoil)-2-aza-biciclo[2.2.1]heptan-2-carboxilic 617 a fost dizolvat în etanol şi încălzit la 130°C într-un tub sigilat peste noapte şi încălzirea a continuat la 170°C timp de 3 zile. CL- S Ma arătat produsul dorit şi produsul descompus Boc (aproximativ 1:1). Amestecul a fost concentrat şi dizolvat în HCl. Bicarbonat di-terţ-butilic (0,6 echiv.) s-a adăugat şi reacşia s-a agitat peste noapte la temperatura camerei. Amestecul de reacţie a fost concentrat şi purificat prin cromatografie rapidă încoloană (silicagel, 20 până la 80% acetat de etil/hexan) pentru a da esterul terţ-butilic al acidului 3-(6-Bromo-1H-benzoimidazol-2-il)-2-aza-biciclo[2.2.1]heptan-2-carboxilic 618 (0,383 g, 72%) sub forma unei spume portocalii.
Prepararea Compusului 613.
Un amestec de ester terţ-butilic al acidului 3-(6-Bromo-1H-benzoimidazol-2-il)-2-aza-biciclo[2.2.1]heptan-2-carboxilic 618 (264 mg, 0,673 mmol), ester dipinocal al acidului benzen-1,4-diboronic (5 echiv., 3,36 g, 6,95 mmol), tetrakis(trifenilfosfin)paladiu (5%, 39 mg) şi soluţie apoasă de carbonat de potasiu 2M (3 echiv., 1,01 mL) în 5 mL de DME a fost încălzit la 90°C sub Ar timp de 4 ore. Amestecul de reacţie a fost răcit şi diluat în acetat de etil şi spălat cu soluţie saturată de bicarbonat de sodiu. Stratul organic s-a uscat (MgSO4), concentrat şi purificat prin cromatografie în coloană (silicagel, 20 până la 60% acetat de etil/hexan) pentru a da esterul terţ-butilic al acidului 3-{6-[4-(4,4,5,5-Tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-fenil]-1H-benzoimidazol-2-il}-2-aza-biciclo[2.2.1]heptan-2-carboxilic 613 (295 mg, 85% randament). LCMS-IEP-: calculată pentru C30H38BN3O4: 515,45; Depistată: 516,1 (M+H+).
Compusul 7 poate fi preparat folosind metode de sinteză şi intermediari, cum ar fi cei descrişi în brevetul US 7429572 B2 2008.09.30. Compusul 7 poate fi, de asemenea, preparat astfel cum este descris în Exemplul următor.
Exemplul 7: Prepararea Compusului 7.
La o suspensie răcită cu gheaţă de compus 701 (970 g, 3,74 mol) şi DMAP (50 g, 0,412 mol) în THF (10 L) s-a adăugat TEA (2,3 kg, 16,5 mol) şi apă (7 L) care a produs o soluţie limpede. Clorură de izobutiril (3 echivalenţi) s-a adăugat încet la amestecul agitat, menţinând temperatura la aproximativ 0°C. O cantitate suplimentară de 1,2 apoi 0,7 echivalenţi ai clorurii de izobutil s-a adăugat până când HPLC a indicat că reacţia a procedat în mod esenţial la completare (un total de aproximativ 1,95 kg). Amestecul de reacţie s-a acidulat cu acid clorhidric concentrat la un pH de aproximativ 6,4 şi faza organică s-a spălat cu EtOAc (2 x 10 L). Extractele combinate s-au spălat cu apă (1 x 15 L). Faza organică s-a filtrat şi s-a concentrat în vid. Reziduul s-a dizolvat în IPA (cca. 20 kg) şi s-a adăugat heptan (4,2 kg). Soluţia s-a încălzit la aproximativ 74-75°C pentru a produce o soluţie limpede, apoi aproximartiv 5L s-a îndepărtat prin distilare. Soluţia rezultată a fost răcită lent la temperatura camerei. S-a format un precipitat la aproximativ 42-43°C. Răcirea a fost continuată lent la 5°C, apoi s-a agitat peste noapte. Solidul rezultat s-a filtrat şi filtratul s-a spălat cu amestec (1:8) de IPA/heptan (3,4 kg) şi s-a uscat în vid la circa 60-70°C pentru a se obţine 1,295 kg (86,65%) de compus 7, care este de 99,45% pur prin HPLC.
Compusul intermediar 706 poate fi preparat după cum urmează.
Prepararea Compusului 701.
La o suspensie de citidină (100 g, 0,411 mol) în DMF (2,06 L) s-a adăugat anhidridă benzoică (102,4 g, 0,452 mol). Amestecul a fost agitat la temperatura camerei timp de 20 ore. DMF a fost îndepărtat în vid şi reziduul a fost triturat cu dietil eter. Solidul rezultat a fost colecta prin filtrare cu aspirare şi spălă cu eter dietilic (2 x 200 mL). Uscarea suplimentară în vid la temperatura camerei a dat N4 benzamida (140,6 g, 98,3%). O porţiune din acest material (139,3 g, 0,401 mol) a fost dizolvată în piridină anhidră (1,2 L) şi a fost tratată cu 1,3-dicloro-1,1,3,3-tetraizopropil-disiloxan (141,4 mL, 0,441 mol) la temperatura camerei. Soluţia s-a agitat la temperatura camerei peste noapte. Amestecul a fost concentrat până la uscare în vid şi coevaporat cu toluen (3 x 200 mL). Reziduul a fost tratat cu EtOAc (1,8 L ) şi spălat cu HCl (2 x 200 mL, 0,05 N), NaHCO3 (5%, 2 x 400 mL). Stratul organic s-a spălat şi uscat (Na2SO4), filtrat şi evaport până la uscare. Compusul 701 (256,5 g, >100%) a fost izolat ca o spumă albă şi utilizat fără purificare suplimentară.
b. Prepararea Compusului 702.
Compusul 701 (236,5 g, 0,40 mol) a fost dizolvat în THF uscat (1,22 L). DMSO anhidru (180,8 mL, 2,1 mol) s-a adăugat şi soluţia rezultată a fost răcită între -20°C şi -15°C. Anhidridă trifluoracetică (90,6 mL, 0,64 mol) s-a adăugat prin picurare timp de 45 min şi soluţia s-a agitat între -20°C şi -15C timp de 2 ore după care s-a adăugat trietilamină anhidră (223,5 mL, 1,6 mol) timp de 20 minute. Reacţia brută conţinând cetonă 702 s-a dizolvat în EtOAc (500 mL) şi soluţia rezultată s-a spălat cu H2O (3 x 400 mL), s-a uscat (Na2SO4) şi solvenţii s-au îndepărtat în vid pentru a da un solid galben care a fost purificat pe o coloană de silicagel eluND cu un gradient treptat de Et2O (0-60%) în hexanI urmat de un gradient treptat de EtOAc (50-100%) în hexani. Cetona brută astfel obţinută (~192 g) s-a cristalizat din eter de petrol pentru a da cetona 702 (138,91 g, 57,5% din citidină) sub forma unui solid alb şi 22 g de materie primă iniţială nereacţionată 701, sub forma unui solid de culoare galbenă.
c. Prepararea Compusului 703.
Compusul 702 (48,57 g, 8,26 mmol) s-a dizolvat în toluen anhidru (~400 mL) şi s-a înlăturat solventul în vid, cu excluderea umidităţii. Reziduul a fost apoi uscat suplimentar în vid (pompă de ulei) timp de încă 2 ore. Cu excluderea strictă a umidităţii, spuma reziduală s-a dizolvat în eter dietilic anhidru (1,03 L) sub argon. Soluţia rezultată a fost răcită la -78°C sub argon şi MeLi (1,6 M, 258,0 mL, 0,413 mol) s-a adăugat prin picurare printr-o pâlnie suplimentară. După ce adăugarea a fost completă, amestecul s-a agitat timp de 2 ore la -78°C. Soluţir apoasă de NH4Cl 1M (500 mL) s-a adăugată încet. După încălzire la temperatura camerei, amestecul s-a spălat cu H2O (2 x 500 mL), s-a uscat (Na2SO4) şi apoi s-a concentrat până la uscare pentru a da o spumă cafenie (~60 g, >100%).
Reacţia a fost realizată de încă două ori folosind 37,62 g şi 56,4 g de compus 702. Produsele brute combinate (128,0 g, 0,212 mol) au fost dizolvate în THF (1,28 L) şi tratate cu HOAc concentr. (23 mL, 0,402 mol). La soluţie s-a adăugat TBAF (384,0 mL, 1M în THF). Soluţia s-a agitat la temperatura camerei timp de 0,75 ore, iar amestecul s-a tratat cu silicagel (750 g) şi s-a concentrat până la uscare. Pulberea s-a plasat într-o coloană pe silicagel ambalate în CH2Cl2. Eluţia cu 1:7 EtOH-CH2Cl2 a dat un solid ceros de culoare închisă, care s-a pre-adsorbit pe silicagel (300 g) şi s-a cromatografiat ca înainte. Compusul 703 (46,4 g, 53,0% din 702) a fost izolat ca un solid alb-cenuşiu. 1H RMN (DMSO-d6): δ 1,20 (s, 3H, CH3), 3,62-3,69 (m, 2H), 3,73-3,78 (m, 2H), 5,19 (t, 1H, J=5,4 Hz, OH -5'), 5,25 (s, 1H, OH-2'), 5,52 (d, 1H, J=5,0 Hz, OH-3'), 5,99 (s, 1H, H-1'), 7,32 (d, 1H, J=5,8 Hz), 7,50 (ψt, 2H, J=7,7 Hz), 7,62 (ψ, 1H, J=7,3 Hz), 8,00 (d, 2H, J=7,3 Hz), 8,14 (d, 1H, J=6,9 Hz), 11,22 (s, 1H, NH). Calculată anal. pentru C17H19N3O6 · 0,5 H2O: C, 55,13; H, 5,44; N, 11,35. Depistată: C, 55,21; H, 5,47; N, 11,33.
d. Prepararea Compusului 704.
Compusul 703 (46,0 g, 0,13 mol) s-a dizolvat în piridină anhidră şi s-a concentrat până la uscare în vid. Siropul rezultat s-a dizolvat în piridină anhidră sub argon şi s-a răcit la 0°C cu agitare. Soluţia brună a fost tratată cu clorură de benzoil (30 mL, 0,250 mol) prin picurare timp de 10 minute. Baia de gheaţă a fost îndepărtată şi agitarea a continuat timp de 1,5 ore, în acest moment TLC a arătat lipsa materiei prime rămasă. Amestecul s-a stins prin adăugarea apei (5 mL) şi s-a concentrat până la uscare. Reziduul a fost dizolvat într-o cantitate minimă de CH2Cl2 şi spălat cu soluţie saturată de NaHCO3 (1 x 500 mL) şi H2O (1 x 500 mL). Faza organică a fost uscată (Na2SO4) şi filtrată, concentrată până la uscare şi cromatografiată pe silicagel, eluaând cu un gradient treptat de EtOAc-hexani (25-60%) pentru a se obţine compusul 704 sub formă de spumă galbenă (48,5 g, 67%). 1H RMN (CDCl3): δ 1,64 (s, 3H, CH3), 4,50 (m, 1H, H-4), 4,78-4,85 (m, 2H, H-5', 5a'), 5,50 (d, 1H, J=3,4 Hz, H-3'), 6,42 (s, 1H, H-1'), 7,44-7,54 (m, 7H, Ar), 7,57-7,66 (m, 3H, Ar), 7,94 (d, 2H, J=7,8 Hz), 8,05-8,09 (m, 4H, Ar), 8,21 (d, 1H, J=7,3 Hz). Calculată anal. pentru C31H27NO8: C, 65,37; H=4,78; N, 7,38. Depistată: C, 65,59; H, 4,79; N, 7,16.
e. Prepararea Compusului 705.
Compusul 704 (7,50 g, 0,013 mol) s-a dizolvat în toluen anhidru (150 mL) sub argon şi răcit la -20°C. DAST (2,5 mL, 18,9 mmol) s-a adăugat încet şi baia de răcire a fost îndepărtată după complşetarea adăugării. S-a continuat agitarea timp de 1 oră şi amestecul s-a turnat în soluţie saturată de NaHCO3 (100 mL) şi s-a spălat până când degajarea gazului a încetat. Faza organică a fost uscată (Na2SO4), concentrată şi purificată prin cromatografie pe silicagel eluând cu 1:1 EtOAc: hexani. Randamentul a fost de 1,22 g (16,3%) de 705 pur sub forma unui solid alb. Punctul de topire 241°C (CH2Cl2-hexani); 1H RMN (CDCl3)): δ 1,49 (d, 3H, J=22,4 Hz, CH3), 4,64 (dd, 1H, J=3,44, 12,9 Hz, H-5'), 4,73 (d, 1H, J=9,5 Hz, H-4'), 4,90 (dd, 1H, J=2,4, 12,7 Hz, H-5a'), 5,56 (dd, 1H, J=8,6, 20,7 Hz, H-3'), 6,52 (d, 1H, J=18,0 Hz, H-1'), 7,47-7,57 (m, 7H, Ar), 7,62-7,71 (m, 3H, Ar), 7,89 (d, 2H, J=6,9 Hz), 8,07-8,11 (m, 5H, Ar), 8,67 (bs, 1H, NH). 19F RMN (CDCl3)): δ 3,3 (m). Calculată anal. pentru C31H26FN3O7 · 0,7 H20: C, 63,74; H, 4,72; N, 7,20. Depistaită: C, 63,71; H, 4,54; N, 7,20.
f. Prepararea Compusului 706.
Compusul 705 (6,30 g, 0,011 mol) a fost suspendat în amoniac metanolic (cca 7N, 150 mL) şi s-a agitat la temperatura camerei peste noapte. Solventul s-a îndepărtat în vid, coevaporat cu metanol (1 x 20 mL) şi preadsorbit pe silicagel. Pulberea albă a fost plasată într-o coloană pe silicagel (ambalată în CHCl3) şi coloana a fost eluată cu 9% EtOH în CHCl3), apoi cu 17% EtOH şi în final cu 25% EtOH în CH Cl3). Concentrarea fracţiilor care conţin produsul, filtrarea printr-un disc de 0,4 µm şi liofilizarea din apă au oferit compusul 706, 2,18 g (76%). 1H RMN (DMSO-d6): δ 1,17 (d, 3H, J=22,3 Hz, CH3), 3,63 (dd, 1H, J=2,7, 13,7 Hz, H-5'), 3,70-3,84 (m, 3H, H-3', H-4', H-5a'), 5,24 (app s, 1H, OH-3'), 5,60 (d, 1H, J=5,4 Hz, H-5'), 5,74 (d, 1H, J=7,71 Hz, H-5), 6,07 (d, 1H, J=18,9 Hz, H-1'), 7,31 (s, 1H, NH2), 7,42 (s, 1H, NH2), 7,90 (d, 1H, J=7,3 Hz, H-6). 19F RMN (DMSO-d6): δ 2,60 (m). Calculată anal. pentru C10H14FN3O4 · 1,4 H2O: C, 44,22; H, 5,95; N, 14,77. Depistată: C, 42,24; H, 5,63; N, 14,54. Compusul 706 (0,10 g, 0,386 mmol) a fost transformat în sare de hidroclorură prin dizolvare în apă (2 mL) şi ajustarea pH-ului la aproximativ 3,0 cu HCL 1M. Apa a fost îndepărtată în vid şi reziduul cristalizat din EtOH apos pentru a da Compusul 706 ca sare de hidroclorură (71,0 mg). Punctul de topire 243°C (dec); 1H RMN (DMSO-d6): δ 1,29 (d, 3H, J=22,6 Hz, CH3), 3,65 (dd, 1H, J=2,3, 12,7 Hz, H-5'), 3,76-3,90 (m, 3H, H-3', H-4', H-5a'), 5,96 (d, 1H, J=17,3 Hz, H-1'), 6,15 (d, 1H, J=7,9 Hz, H-5), 8,33 (d, 1H, J=7,9 Hz, H-6), 8,69 (s, 1,5 H, NH), 9,78 (s, 1,5 H, NH). 19F RMN (DMSO-d6): δ 1,69 (m). Calculată anal. pentru C10H14FN3O4 · HCl: C, 40,62; H, 5,11; N, 14,21. Depistată: C, 40,80; H, 5,09; N, 14,23.
Compusul 8 poate fi preparat prin metode de sinteză şi intermediari, cum ar fi cei descrişi în US 20100143301 A1 2010.06.10. Compusul 8 poate fi de asemenea preparat ca în Exemplul următor.
Exemplul 8: Prepararea 4-amino-2-n-butoxi-8-[3′-(pirolidin-1′′-ilmetil)-benzil]-5,6,7,8-tetrahidropteridin-6-onei 8 (R = n-butil)
La o soluţie de compus nitro 807 (730 mg, 1,5 mmol) în MeOH (10 mL) s-a adăugată un Nichel Raney (~200 µL, suspensie în H2O). Vasul de reacţie a fost purjat cu H2 şi apoi agitat sub o atmosferă de H2 timp de 1,5 ore. Amestecul s-a filtrat prin celită cu CH2Cl2 şi MeOH (1:1) Filtratul s-a concentrat sub vid şi lăsat pe liofilizator peste noapte. Baza liberă a compusului 8 a fost obţinută ca un solid alb. Pentru a obţine sarea de hidroclorură 8, o probă de filtrat indicat mai sus a fost îmbogăţită cu HCl 1,0 M la pH = 1-2 şi liofilizată. 1H RMN (CD3OD, 300 MHz): δ 7,65 (s, 1H), 7,50 (m, 3H), 4,96 (s, 2H), 4,44 (t, J=7 Hz, 2H), 4,40 (s, 2H), 4,16 (s, 2H), 3,48 (m, 2H), 3,19 (m, 2H), 2,02-2,17 (m, 4H), 1,74 (m, 2H), 1,45 (m, 2H), 0,94 (t, J=7 Hz, 3H) - [sarea HCl]. LCMS-IEP+: calculată pentru C22H31N6O2: 411,5 (M+H+); Depistată: 411,3 (M+H+).
Compusul intermediar 807 a fost preparat după cum urmează.
a. Prepararea compusului 802.
La o soluţie de compus 801 (2,46 g, 10,2 mmol) în THF (34 mL) la -20°C s-a adăugat Et3N (3,14 mL, 22,5 mmol) urmat de o soluţie de NH3 (2,0 M în metanol, 5,4 mL, 11 mmol). Amestecul a fost agitat cu încălzire la 0°C timp de 1,5 ore (CL/SM a indicat consumarea materiilor prime iniţiale). Amestecul de reacţie care conţine compusul 802 a fost utilizat ulterior fără prelucrare.
b. Prepararea Compusului 803.
La o soluţie de 3-((1-pirolidinilmetil)fenil)metanamină 806 (1,95 g, 10,2 mmol) în THF (34 mL) la 0°C s-a adaugat Et3N (3,14 mmol, 22,5 mmol) urmat de bromacetat de metil (1,04 mL, 22,3 mmol) prin picurare. Amestecul de reacţie s-a agitat până când CL/SM a indicat consumul de materii prime iniţiale, aproximativ 2 ore. Amestecul conţinând compusul 803 a fost utilizat ulterior fără prelucrare.
c. Prepararea Compusului 804.
Amestecul de reacţie care conţine compusul 803 a fost adăugat la amestecul de reacţie care conţine compusul 802 la 0°C. Amestecul de reacţie s-a agitat până când CL/SM a indicat consumul de compus 802, aproximativ 45 de minute. S-a adăugat o soluţie saturată de NH4Cl (50 mL). Straturile au fost separate, iar stratul apos s-a extras cu EtOAc (2 x 30 mL). Straturile organice combinate s-au uscat pe MgSO4, s-au filtrat şi s-au concentray sub vid. Purificarea prin cromatografie pe silicagel a dat 2,11 g de compus 804. 1H RMN (CD3OD, 300 MHz): δ (ppm) 7,32-7,16 (m, 4H), 4,69 (s, 2H), 4,19 (q, J=7 Hz, 2H), 4,07 (s, 2H), 3,60 (s, 2H), 2,49 (m, 4H), 2,40 (s, 3H), 1,78 (m, 4H), 1,23 (t, 3H, J=7 Hz). LCMS-IEP+: calculată pentru C21H29N6O4S: 461,2 (M+H+); Depistată: 461,0 (M+H+).
d. Prepararea Etil-Nα-[4-amino-2-metanesulfonil-5-nitropirimidin-6-il],Nα-[3′-(pirolidin-1″-ilmetil)-benzil]-glicinatului 805.
La o soluţie-suspensie de sulfură 804 (3,68 g, 8,00 mmol) în EtOH (40 mL) la 0°C s-a adăugat secvenţial tungstat dihidrat de sodiu (792 mg, 2,40 mmol), acid acetic (4,6 mL, 80 mmol) şi peroxid de hidrogen (3,4 mL, ~40 mmol, 35% masă/masă în H2O). După 3 ore, s-a adăugat suplimentar acid acetic (4,6 mL) şi peroxid de hidrogen (3,4 mL). Reacţia s-a menţinut la 0°C timp de 16 ore. O soluţie saturată de Na2SO3 (50 mL) s-a adăugat minuţios urmat la temperatura de 0°C de CH2Cl2 (75 mL). Straturile au fost separate, iar stratul apos s-a extras cu CH2Cl2 (4 x 50 mL). Straturile organice combinate s-au uscat pe MgSO4, s-au filtrat şi s-au concentrat sub vid pentru a obţine un material care conţine compusul 805, care a fost utilizat fără purificare suplimentară.
e. Prepararea Compusului 807. (R = n-butil)
La o soluţie de sulfonă 805 (1,0 g, 2,0 mmol) în n-butanol (10 mL) s-a adăugat TFA (470 µL, 6,1 mmol). Reacţia s-a agitat la 100°C timp de 1 oră. Amestecul de reacţie s-a turnat peste o soluţie saturată de NaHCO3 (20 mL) şi CH2Cl2 (30 mL). Straturile au fost separate, iar stratul apos s-a extras cu CH2Cl2 (30 mL). Straturile organice combinate s-au uscat pe MgSO4, s-au filtrat şi s-au concentrat sub vid. Purificarea a fost realizată prin cromatografie pe silicagel (1 g substrate/10 g SiO2) (2-15% MeOH/CH2Cl2) pentru a se obţine compusul 807.
Exemplul 9: Prepararea Compusului 9 [2].
9
Prepararea esterului izopropilic al acidului (S)-2-{[(1R,4R,5R)-5-(2,4-Dioxo-3,4-dihidro-2H-pirimidin-1-il)-4-(R)-fluoro-3-hidroxi-4-metil-tetrahidro-furan-2-il-metoxi]-fenoxifosforilamino}-propionic ([2],Exemplul 2)
Sinonim: amestecul diastereomeric de 5'-O-(izopropil-L-alanat, fenil fosforamidil)-2'-deoxi-2'-fluoro-2'-C-metil-uridină.
Un balon cu 3 gâturi de 5 L a fost echipat cu un agitator mecanic, baie de soluţie salină pe gheaţă, termometru intern şi o atmosferă de azot. Balonul a fost încărcat cu hidroclorură de ester izopropilic al L-alaninei (82,0 g, 0,490 mol) şi diclormetan anhidru (0,80 L). Sub agitare s-a adăugat fenil diclorfosfat (85,0 g, 0,40 mol) într-un singur lot şi agitat. Menţinând temperatura internă între -5 şi 5°C, o soluţie de N-metilimidazol (NMI, 250 g, 3,07 mol) în diclormetan (250 mL) s-a adăugat timp de o jumătate de oră. Soluţia s-a lăsat sub agitare timp de 1 oră în acest interval de temperatură. 2'-Deoxi-2'-fluoro-2'-C-metil-uridină (3,800 g, 0,307 mol) s-a adăugat la 0°C într-o porţie şi apoi vasul de reacţie s-a lăsat să se încălzească încet în baie de soluţie salină. La 1 oră, temperatura internă a fost de până la -2°C. TLC (5% metanol în HCL) la 1 oră a arătat că mai mult de 50% de nucleozidă fost consumată. S-a îndepărtat baia şi balonul de reacţie a atins temperatura camerei timp de încă 1 oră. TLC după 3 ore şi la 5 ore total a arătat că 95% de nucleozidă iniţială a fost consumată. Amestecul de reacţie a fost stins prin adăugarea metanolului (100 mL) şi agitarea amestecului de reacţie timp de 5 minute.
Amestecul de reacţie a fost spălat cu HCl 1N (2x500 mL) urmată de soluţie saturată de bicarbonat de sodiu (2x500 mL). Stratul organic separat s-a uscat pe sulfat de sodiu anhidru (50 g) şi s-a filtrat. Soluţia a fost evaporată sub presiune redusă şi apoi sub vid înalt până la uscare pentru a obţine produsul brut sub formă de ulei vâscos (170 g). Au fost luate RMNe ale produsului brut (31P şi 1H). 31P-RMN a indicat că aproximativ 1% din integrarea totală a fosforului s-a datorat prezenţei 3' izomerului 5.
La produsul brut s-a adăugat piridină anhidră (1,700 mL). Solventul s-a evaporat la presiune redusă şi apoi sub vid înalt pentru a reduce conţinutul de apă al amestecului brut prin coevaporare. Uleiul rezultat a fost redizolvat în piridină anhidră (500 mL) şi apoi s-a adăugat exces de clorură de t-butildimetilsilil (9,0 g, 60 mM). Reacţia a fost agitată la temperatura ambiantă. Mersul reacţiei a fost monitorizat prin CLPÎ/SM. După 3 ore, 3' impuritatea 5 nu a mai putut fi detectată şi reacţia a fost stinsă prin adăugarea metanolului (50 mL).
Reacţia a fost evaporată sub presiune redusă la un ulei. Reziduul s-a dizolvat în acetat de etil (1,5 L) şi spălat cu HCl 1N (2x500 mL), urmat de soluţie saturată de bicarbonat de sodiu (2x500 mL). Stratul organic s-a uscat pe sulfat de sodiu anhidru (50 g), filtrat şi evaporat sub presiune redusă pentru a da produsul brut ca un ulei galben pal.
Uleiul brut a fost diluat cu acelaşi volum de diclormetan şi încărcat pe un cartuş de silicagel 2.5 Kg n cu un modul de compresie radială la 100 psi de presiune a aerului. Folosind o pompă cu gradient la 60 psi şi un debit de 400 mL/min, cartuşul s-a spălat cu clorura de metilen (4L), după care a urmat un gradient de metanol 1-4% în clorură de metilen (48 L). Cele mai multe dintre impurităţile majore (di-(izopropilalanil) fenil fosfat, 3',5'-bis fosforamidat,3'-fosforamidat-5'-TBDMS aductul (7)) a eluat cu un gradient de ~3%. Produsul dorit a eluat între 3 şi 4% metanol. Fracţiunile conţinând produsul au fost sortate în două loturi. Primul a conţinut cantităţi mici de impurităţi superioare şi acesta din urmă a fost produsul pur. Primul set de fracţiuni a conţinut cantităţi mici de impurităţi mai puţin polare (impurităţi superiore), cum ar fi 3',5'-bis fosforamidatul şi di-alanilfenlfosfatul şi o mare parte diastereomerul Rp şi a necesitat o a doua purificare în coloană. (Terminologia relativă, superioară vs inferioară se referă la eluarea pe cromatografia pe silicagel cu fază normală, în care „izomer superior” înseamnă primul izomer de eluare). Al doilea set de fracţiuni nu au avut o cantitate semnificativă de impurităţi - pur şi simplu restul Rp şi cea mai mare parte a diasterereomerilor Sp. Mai tarziu a fost recombinat cu fracţiunile eluate de două ori în coloane. Solventul s-a evaporat sub presiune redusă şi spuma albă rezultată a fost uscată suplimentar (0,20mmHg) timp de 1 oră pentru a se obţine 42 g de lot impur (04:01 izomer superior vs inferior pe baza 31P-RMN) şi 38 g de lot pur (01:03 izomer superior vs inferior). Lotul impur a fost recolumnat în mod similar pentru a da 3,8 g de 97% izomer superior pur (fracţie lăsată la o parte) şi 36 g de produs pur într-un raport de 4:1. Cele două loturi principale au fost dizolvate în HCL, combinate, evaporate sub presiune redusă şi uscate (50°C, 0,2 mm Hg, 24 ore) pentru a obţine 74 g (45,7%) de produs pur (Compusul 9) cu un raport diastereomeric de 48:51, sub formă de spumă albă, cu punctul de topire de aproximatuiv 75-85°C.
Pentru a produce un solid amorf al amestecului diastereomeric, 74 g de spumă albă a fost agitată cu eter metil t-butil (750 mL) rezultând într-o soluţie parţială şi un reziduu solid cleios. Sub agitare, heptan (750 mL) s-a adăugat încet şi suspensia s-a agitat mecanic timp de 1 oră până la transformarea majorităţii gumei într-un solid alb. Solidul a fost răzuit cu o spatulă şi suspensia rezultată a fost filtrată. Solidul a fost spălat cu heptan (4x50mL) şi uscat sub vid (50°C, 0,2mmHg, 24 ore) pentru a se obţine o pulbere amorfă albă (64 g) cu un interval larg de topire de circa 70-80°C. 1H şi 31P RMN s-a conformat structurii şi HPLC a arătat o puritate de 99,8% cu un raport diastereomeric de 46:54 (de asemenea confirmat prin 31P RMN).
Metoda altemativă pentru producerea unui amestec solid de Compus 9. După cromatografie, reziduul a fost coevaporat de două ori cu diclormetan (5 mL/g) şi uscat timp de 24 ore la 35-40°C, la 35-45 mTorr. Reziduul spumă a fost cernut printr-o sită de 250 microni şi uscat în continuare în aceleaşi condiţii până când diclormetanul rezidual a scăzut sub 400 ppm, măsurat prin spaţiul superior GC. Pulberea amorfă fină cenuşiu-albă până la albă rezultată are un interval de temperatură de vitrificare de la 53,7 până la 63,5°C.
Caracterizarea Compusului 9 (amestec de izomeri):
1H-RMN (CDCl3) 010,05 (br s, 1H, NH, Sp), 10,00 (br s, 1H, NH, Rp), 7,49 (d, 1H, C6-H, Sp), 7,36 (m, 5H, C6-H, Rp, aromatic), 7,23-7,14 (m, 6H, Rp/Sp, aromatic), 6,18 (br d, 2H, Cl'-H, Rp/Sp), 5,63 (d, 1H, C5-H, Sp), 5,58 (d, 1H, C5-H, Rp), 5,01 (m, 2H, CH-(CH3)2 Rp/Sp), 4,46-4,33 (m, 8H, C-5'-H2, ala-NH, C3'-OH, Rp/Sp), 4,12 (m, 2H, ala-CHCH3, Rp/Sp), 4,01-3,85 (m, 4H, C3'-H, C4'-H, Rp/Sp), 1,39-1,22 (m, 12H, tot CH3, Rp/Sp).
31P-RMN (CDCl3) 03,60 (Rp), 3,20 Sp faţă de trifenilfosfat la -17,80 ppm. SE-SM M+1 530,2. Analiza elementară: % calculat (inclusiv 0,29% apă astfel cum este depistat prin analiza Karl Fisher) C, 49,75; H, 5,54; N, 7,90, F, 3,58, P, 5,84. % depistat: C, 49,50; H, 5,44; N, 7,85; F, 3,62; P, 6,05.
Prepararea 2'-deoxi-2'-fluoro-2'-C-metiluridinei [2] Exemplul 1)
Într-un balon de 10 L, s-a adăugat 3',5'-O-dibenozil-2'deoxi-2'-fluoro-2'-C-metil-N4-benzoilcitidină (500 g, 0,874 mol) şi 70% acid acetic apos (7,5 L). Soluţia s-a încălzit la reflux (110°C) timp de 20 ore. CSS a indicat o reacţie completă (Rf 0,6 în 5% metanol în diclormetan (HCL)). Amestecul s-a răcit la temperatura ambiantă şi diluat cu apă (2 L). După agitare timp de 2 ore, precipitatul rezultat a fost colectat prin filtrare şi solidul a fost spălat cu apă (5 L) şi uscat în atmosferă la temperatura ambiantă timp de 12 ore pentru a obţine 360 g (88%). Această dibenzoiluridină intermediară a fost utilizată direct în etapa următoare, prin adăugarea la amoniacul metanolic proaspăt preparat (5,4 L, cca 25%) la 0°C. Această temperatură s-a menţinut timp de 3 ore şi apoi s-a lăsat să se încălzească la 15°C, timp de 24 de ore. CSS a indicat o reacţie completă (Rf 0,4 în 10% metanol în HCL). Amestecul de reacţie s-a filtrat printr-un strat de Celită şi s-a concentrat sub presiune redusă pentru a da produsul brut (216 g). Produsul brut s-a agitat cu acetat de etil (325 mL) timp de 3 ore la temperatura ambiantă. Solidul rezultat s-a colectat prin filtrare şi s-a spălat cu acetat de etil (216 mL). Solidul a fost uscat sub vid la temperatura ambiantă timp de 4 ore pentru a obţine 160 g (78%) de produs dorit în HPLC de 98,7% puritate. 1H-RMN (DMSO-d6) 011,44 (br s, 1H, NH), 7,95 (d, 1H, C-6H), 5,97 (d, 1H, C-1'), 5,64 (d, 1H, C-5H), 3,.84-3,77 (m, 3H, C-5'-Ha, C-3'H. C-4′H), 3,63-3,60 (m, 1H, C5'-Hb), 1,23 (d, 3H, C-2'-CH3). SE-SM M-I 259.
Exemplul 10: Prepararea Compusului 10 [2].
10
Precipitarea directă a Compusului 10 [2], Exemplul 4: La o soluţie agitată de hidroclorură de ester izopropilic al L-alaninei (10,5 g, 61,5 mmol, uscat azeotropic, de două ori, cu 50 mL de toluen de fiecare dată) în diclormetan (100 mL) s-a adăugat fenidiclorofosfat (7,5 mL, 50 mmol) la temperatura camerei. Amestecul s-a răcit la -10°C şi apoi s-a adăugat o soluţie de N-metilimidazol (30,5 mL, 384,3 mmol) în 30 mL de diclormetan, timp de 30 de minute. După terminarea adăugării, amestecul s-a agitat între -10 şi -15°C, timp de 1 oră. La amestecul de mai sus s-a adăugat 2'-deoxi-2'-fluoro-2'-C-metiluridină (10 g, 38,4 mmol) (vezi exemplul US2010/0298257 1) într-un singur lot şi amestecul a fost agitat sub -10°C timp de 3 ore şi apoi lăsat să se încălzească încet până la 20°C. (6 ore). Amestecul s-a agitat la această temperatură peste noapte (15 ore) şi apoi stins cu 10 mL de metanol. Solventul s-a evaporat şi reziduul s-a redizolvat în acetat de etil (200 mL). Stratul de EtOAc a fost spălat cu apă (100 mL), HCl 1N (3x75 mL), soluţie apoasă de 2% NaHCO3 (50 mL) şi soluţie salină (50 mL). Stratul organic a fost uscat pe Na2SO4, filtrat şi concentrat. Reziduul a fost uscat sub vid înalt timp de 2 ore pentru a se obţine spumă albă (22 g ).
Spuma de mai sus a fost dizolvată în 33 mL de HCl şi apoi s-au adăugat 65 mL de eter izopropilic pentru a da o soluţie saturată. Soluţia a fost filtrată printr-un strat subţire de Celită şi filtratul a fost agitat cu seminţe de Compus 10 timp de 72 ore la temperatura ambiantă (circa 22°C - notaţi că răcirea suspensiei la 0°C a condus la impregnarea cu ulei a produsului brut). Solidul alb a fost filtrat, spălat cu eter izopropilic (20 mL) şi uscat pentru a obţine 4,58 g (~85:15 amestec de Compus 10 : izomer R la P, respectiv, astfel cum este determinat prin 31P RMN) de pulbere albă. Solidul de mai sus a fost suspendat în 23 mL de HCL şi apoi refluxat timp de 3 ore. Amestecul s-a răcit la temperatura camerei şi s-a agitat timp de 15 ore. Solidul alb a fost filtrat, spălat cu 4,5 mL de HCl rece şi uscat sub vid la 45°C pentru a se obţine Compusul pur 10, pt 93,9 la 104,7°C puritate HPLC 99,74% (3,11 g, 15,2% din nucleozida uridinei).
Compusul 10: 1H-RMN (CDCl3) δ 8,63 (br s, 1H, NH), 7,47 (d, 1H, C6-H), 7,30 (m, 2H, o-aromatic), 7,26-7,18 (m, 3H, m,p-aromatic), 6,18 (br d, H, Cl'-H), 5,70 (d, H, C5-H), 5,02 (sept, CH-(CH3)2), 4,53 (m, 2H, C-5'-H2), 4,11 (d, H, C3'-H), 3,97 (m, 3H, C3'-OH, C4'-H, ala-CH-CH3), 3,77 (br s, H, ala-NH), 1,39 (d, 3H, C2'-CH3), 1,37 (d, 3H, ala-CH3), 1,24 (d, 6H, CH-(CH3)2).
Exemplul 11: Prepararea Compusului 11 (US 2010081628 A1 2010.04.01).
Sinteza 6-Etoxi-9-((4aR,6R,7R,7aR)-7-f1uoro-2-izopropoxi-7-metil-2-oxo-tetrahidro-2,5-furo[3,2-d][1 ,3,2]dioxafosfinin-6-il)-9H-purin-2-il-aminei (Compusul 11) (Compusul 19, (US 2010081628 A1 2010.04.01))
(2R,3R,4R,5R)-5-(2-Amino-6-etoxi-purin-9-il)-4-f1uoro-2-hidroximetil-4-metil-tetrahidro-furan-3-ol (150 mg, 0,46 mmol) s-a dizolvat în piridină anhidră (2 mL) la 0°C. O soluţie de 0,45 M 1H-tetrazol în acetonitril (2,55 mL), urmat de bis (N,N-diizopropilamino) ispropilfosforamidit (0,16 mL, 0,55 mmol, 1,2 echiv.). Amestecul s-a lăsat să se încălzească lent la temperatura ambiantă timp de 3 ore. CSS a indicat o reacţie completă. Reacţia a fost stinsă prin adăugarea apei (0,1 mL). Soluţia de reacţie a fost concentrată sub presiune redusă şi apoi reziduul a fost triturat cu acetat de etil (5 mL). Precipitatul alb rezultat a fost eliminat prin filtrare şi filtratul a fost concentrat sub presiune redusă.
Reziduul rezultat de fosfită ciclică intermediară a fost dizolvat în acetonitril (2 mL) şi apoi tratat cu hidroperoxid de t-butil (70% în apă, 0,19 mL) timp de 5 ore la temperatura ambiantă. CSS a indicat o reacţie completă. Soluţia de reacţie s-a concentrat sub presiune redusă şi reziduul s-a purificat prin cromatografie în coloană (Analogix folosind un gradient de la 0 la 5% IPA în HCL). Cei doi diastereomeri (Compusul 11 şi R-izomerul la P) au fost separaţi. Fracţiunile conţinând fiecare diastereomer au fost combinate separat şi concentrate sub presiune redusă până la solide albe pentru a da 20 mg de fiecare diastereomer (randament combinat de 20%).
Compusul 11
31P_NMR (162 MHz, DMSO): δ - 6,49;
1H-RMN (400 MHz, DMSO): δ = 8,17 (s, 1H), 6,47 (bs, 2H), 6,27 (d, J=21,2 Hz, 1H), 4,73-4,62 (m, 4H), 4,45 (q, J=7,0 Hz, 2H), 4,27-4,21 (m, 1H), 1,39-1,34 (m, 9H), 1,20 (d, J=22,8 Hz, 3H).
SM (IEP): m/z 432,4 [M+H]+
R-izomer la P
31P_NMR (162 MHz, DMSO): δ = -4,68;
1H-RMN (400 MHz, DMSO): δ = 8,15 (s, 1H), 6,63 (s, 2H), 6,27 (d, J=21,2 Hz, 1H), 4,74-4,58 (m, 4H), 4,45 (q, J=6,4 Hz, 2H), 4,42-4,37 (m, 1H), 1,36 (t, J=7,2 Hz, 3H), 1,32 (d, J=3,6 Hz, 3H), 1,30 (d, J=3,6 Hz, 3H), 1,22 (d, J=22,8 Hz, 3H).
SM (IEP): m/z 432,4 [M+H]+
Structurile pentru Compusul 11 şi R-Izomer la P sunt reprezentate mai jos.
11 R - izomer la P
Sinteza (2R,3R,4R,5R)-5-(2-amino-6-etoxi-9H-purin-9-il)-4-f1uoro-2-(hidroximetil)-4-metiltetrahidro-furan-3-olului (Compusul 16, (US 2010081628 A1 2010.04.01))
Un balon uscat cu fund rotund de 500 mL a fost încărcat cu (2R,3R,4R,5R)-5-(2-amino-6-cloro-9H-purin-9-il)-2-(benzoiloximetil)-4-fluoro-4-metiltetrahidrofuran-3-il benzoat (11 g, 20,92 mmol). Etanol anhidru absolut (210 mL) s-a adăugat, urmat de K2CO3 anhidru (28,91 g, 209,2 mmol). Suspensia a fost agitată şi încălzită la 75°C sub azot timp de 5,5 ore. Toată materia primă iniţială a fost consumată în acel moment prin testul CSS. Amestecul a fost răcit la temperatura camerei şi solidul a fost filtrat. Filtratul a fost neutralizat prin adăugarea acidului acetic glacial (2,52 g) la pH~7 şi concentrat sub presiune redusă. Reziduul a fost dizolvat în metanol şi amestecat cu silicagel (15 g). Amestecul uscat de produs brut şi silicagel a fost transferat într-un cartuş gol şi separat prin cromatografie în coloană (Analogix 220 g, gradient de 0 la 15% MeOH în DCM) pentru a se obţine produsul (5% MeOH în DCM) sub formă de spumă albă solidă (3,73 g, 54,5%). Un al doilea solid alb a fost izolat din coloană (10% MeOH în DCM, 1,44 g) şi a fost un amestec de doi dimeri de nucleozidă. Un polar suplimentar, al treilea solid alb a fost colectat din coloană (15% MeOH în DCM, 0,47 g) şi a fost un amestec de trimeri de nucleozidă. Puritatea HPLC a produs 99,94%.
1H-RMN (DMSO-d6): δ 8,16 (s, H, 8-H), 6,55 (s, 2H, NH2), 6,04 (d, H, C1'-H), 5,66 (d, H, 3'-OH), 5,24 (m, H, 5'-OH), 4,44 (q, 2H, 6-0CH2), 4,23-4,08 (m, H, C3'-H), 3,91-3,82 (m, 2H, C4'H- şi C5'-Ha), 3,71-3,66 (m, H, C5'-Hb), 1,36 (t, 3H, CH3 de etil), 1,06 (d, 3H, C2'-CH3).
Sinteza (2R,3R,4R,5R)-5-(2-amino-6-cloro-9H-purin-9-il)-2-(benzoiloximetil)-4-fluoro-4-metiltetrahidrofuran-3-il benzoatului (Compusul 12, (US 2010081628 A1 2010.04.01))
Un balon cu trei gâturi cu fund rotund de 12 L a fost încărcat cu 6-cloro-2-aminopurină (225,4 g, 1,329 mol). Terţ-BuOH anhidru (4,5 L) s-a adăugat şi soluţia a fost agitată cu un agitator mecanic la temperatura ambiantă. Terţ-butoxid de potasiu (solid, 151,6 g, 1,35 mol) s-a adăugat în porţiuni sub un curent de azot gazos sub agitare. Amestecul a fost agitat la temperatura camerei timp de încă 30 min. Un balon cu fund rotund de 5 L a fost încărcat cu α-bromura (10, 197 g, 0,451 mol) şi 3 L de acetonitril anhidru la temperatura ambiantă. Soluţie de bromură a fost adăugată la suspensia de bază purinică timp de 1 min la temperatura ambiantă. Balonul de 5 L s-a clătit cu acetonitril (2x1 L) pentru a transfera bromura complet la amestecul de reacţie. Amestecul s-a încălzit treptat la 50°C timp de 2 ore cu o manta de încălzire şi un controler, şi agitat timp de 20 ore. Reacţia a fost aproape completă după cum s-a demonstrat prin CSS beta (Rf 0,28, 30% acetat de etil în hexan). Reacţia a fost stinsă prin adăugarea. NH4Cl saturate (200 mL) pentru a forma o suspensie. Solidul suspendat a fost îndepărtat prin filtrare printr-un strat de Celită de 3 cm într-o pâlnie Buchner de porţelan de 2,5 L. Solidul a fost spălat cu toluen (3x100 mL). Filtratul combinat a fost neutralizat prin adăugarea soluţiei de HCl 6 N până la pH 7 (aproximativ 220 mL). Amestecul a fost concentrat sub presiune redusă. Când volumul amestecului a fost redus la aproximativ o treime volum, solidul precipitat suplimentar a fost îndepărtat prin filtrare într-o manieră similară. Filtratul a fost concentrat în continuare până la un volum de aproximativ 800 mL. Reziduul a fost încărcat pe o coloană cu obturator (1,6 kg silicagel de grad flash, într-o pâlnie Buchner de sticlă sinterizată de 6 L) şi eluat (prin aspiraţie) cu un gradient de 10% acetat de etil în hexani (6 L) pentru a îndepărta impurităţile nepolare, 30% acetat de etil în hexani pentru a se obţine o cantitate mică de lactol (6 L), şi apoi 40% -45% acetat de etil în hexani (4 L) pentru a elua cantitatea principală de produs. Fracţiunile conţinând produsul au fost combinate, concentrate sub presiune redusă şi uscate sub vid (0,2 mm Hg, 24 ore, temp. ambiantă) până la o spumă albă solidă (150,7 g, β/α=14:1 prin RMN. 1H-RMN. (CDCl3)beta: δ=1,33 (d, 22,4 Hz, 2'-C-CH3), alfa: 1,55 (d, 22 Hz, 2'-C-CH3).
Spuma produsă a fost dizolvată în metanol (700 mL) la temperatura ambiantă. La maturare, un solid s-a format lent timp de 2 ore. Suspensia a fost răcită într-un congelator până la -5°C, timp de 17 ore. Solidul alb rezultat a fost colectat prin filtrare şi spălat cu MeOH rece (-5°C 3x60 mL) şi eter etilic (3x100 mL). Solidul a fost uscat sub vid (0,2 mm Hg, 24 ore, temp. ambiantă) pentru a se obţine 110,5 g de β-produs excelent (β/α 99,8:1 prin HPLC). Filtratul a fost parţial concentrat (cca. 400 mL) şi apoi diluat cu mai mult metanol (400 mL) cu încălzire la 60°C. Soluţia a fost răcită la temperatura ambiantă, cristalizată şi răcită la -5°C. A doua recoltă a fost colectată, spălată şi uscată într-un mod similar pentru a da mai mult produs ca un solid alb (12,26 g) cu puritate diastereomerică similară. Lichidul mamă a fost concentrat până la uscare sub presiune redusă (cca. 25 g). Reziduul a fost un amestec de β şi α-izomeri. Acesta a fost supus cromatografiei automatizate în coloană pe silicagel (Analogix, cartuş de 240 g, 40% până la 50% acetat de etil în hexani) pentru a se obţine 14,52 g de produs spumă care a fost recristalizat din MeOH, spălat şi uscat într-un mod similar pentru a se obţine 8,46 g suplimentare de produs cu puritate mare.
Cele trei substanţe solide au fost considerate a fi de puritate similară şi au fost combinate pentru a da 131,2 g de produs cristalin alb (55% din bromosugar, 49% din lactol). Pt 160,5 la 162,0°C. Puritate prin HPLC de 99,5%, inclusiv 0,20% alfa.
1H-RMN (β-anomer pur, CDCl3): δ=8,03 (m, 2H, arom.), 7,93 (m, 2H, arom.), 7,88 (s, 1H, C8-H), 7,60 (m, 1H, arom.), 7,50 (m, 1H, arom.), 7,44 (m, 2H, arom.), 7,33 (m, 2H, arom.), 6,44 (dd, 1H, CIl'-H), 6,12 (d, 1H, C3'-H), 5,35 (s, 2H, NH2), 5,00 (dd, 1H, C5'-Ha), 4,76 (m, 1H, C4'- H), 4,59 (dd, 1H, C5'-Hb), 1,33 (d, 3H, CH3).
Exemplul 12: Prepararea Compusului 12 (US 2011015146 A1 2011.01.20).
12
Sinteza (2S)-izopropil2-((((2R,3R,4R,5R)-5(2-amino-6-metoxi-9H-purin-9-il)-4-fluoro-3hidroxi-4-metiltetrahidrofuran-2-il)metoxi) (fenoxi) fosforilaminoacid)propanoatului
Un balon uscat cu fund rotund de 250 mL a fost încărcat cu fenildiclorfosfat (2,66 g, 12,61 mmol) şi diclormetan anhidru (40 mL). Sare a aminoesterului (2,60 g, 15,53 mmol) s-a adăugat la soluţie şi amestecul s-a răcit la -5°C. N-Metil imidazol (7,7 mL, 97 mmol) s-a adăugat apoi rapid prin intermediul unei seringi uscate la -5°C şi soluţia s-a agitat la -5°C, timp de 1 oră. Nucleozidă ((2R,3R,4R,5R)-5-(2-amino-6-metoxi-9H-purin-9-il)-4-fluoro-2-(hidroximetil)-4-metiltetrahidrofuran-3-ol), 3,04 g, 9,7 mmol) s-a adăugat dintr-o fiolă într-o porţie la -5°C şi solidul s-a dizolvat lent timp de 20 de minute. Temperatura de reacţie a fost lăsată să se încălzească până la temperatura ambiantă timp de 2 ore. După 17 ore, reacţia nu a fost completă. Mai mulţi reactivi au fost produşi (de la fosfat (2,66 g), aminoester (2,60 g) şi N-metil imidazol (3,8 mL, 48 mmol)) şi s-au adăugat la amestecul de reacţie la -5°C. Amestecul de reacţie s-a agitat la temperatura camerei timp de încă 2 ore. Reacţia a fost aproape completă după cum s-a demonstrat prin rezultatul CSS şi s-a diluat cu 70 mL de diclormetan. S-a adăugat soluţie de HCl (1N, 70 mL). Stratul apos s-a separat şi s-a extras cu diclormetan. Stratul organic s-a spălat cu soluţie saturată de NaHCO3, apă, soluţie salină şi s-a uscat pe MgSO4. După îndepărtarea solventului sub presiune redusă, reziduul lipicios s-a purificat prin cromatografie în coloană automatizată folosind un cartuş de 240 g şi un gradient de 0-8% 2-PrOH în diclormetan pentru a se obţine produsul sub formă de spumă solidă (4,16 g, 7,14 mmol, 73% randament). Puritate HPLC de 97,4%. Spectrele RMN a produsului a arătat că este un amestec de doi diastereoizomeri cu un raport de 1,2:1.
1H-RMN (DMSO-d6): δ=7,98 (1H, s, H-8 al unui izomer), 7,95 (1H, s, H-8 al unui alt izomer), 7,37-7,32 (2H, m, arom-H) , 7,22-7,15 (3H, m arom-H), 6,6 (2H, s, NH2), 6,11 (1H, d, Cl'-H al unui izomer), 6,09 (1H, d, H-CI' al altui izomer), 6,09-5,98 (1H, m, amidă NH), 5,88 (1H, d, 3'-OH al unui izomer), 5,81 (1H, d, 3'-H al altui izomer), 4,85-4,75 (1H, hepta, metina H a izopropilului), 4,46-4,27 (2H, m, C4'-H, α-H a aminoesterului), 4,15-4,07 (1H, m, C3'-H), 3,96 (3H, s, OCH3), 3,82-3,72 (2H, m, C5'-Ha şi C5'-Hb), 1,23-1,06 (9H, m, CH3 a aminoesterului), 1,03 (3H, d, C2'-CH3).
31P-RMN (DMSO-d6): 0=4,91 (un izomer), 4,72 (un alt izomer).
O metodă alternativă de purificare este de a modifica chimic produsul secundar minor 3' fosforamidatul, în scopul de a simplifica separarea cromatografică. Produsul fosforamidat brut este dizolvat în piridină anhidră (5 mL/g) şi tratat cu 0,5 echivalenţi molari ai clorurii de t-butildimetilsilil la temperatura ambiantă pentru a reacţiona selectiv cu 5' hidroxilul primar liber al impurităţii 3" izomerului. Mersul reacţiei poate fi monitorizat prin CL/SM. După convertirea 3' izomerului într-un derivat de 5'-tBDMS-3'-fosforamidat, reacţia este stinsă cu metanol (3 echiv.), concentrat sub presiune redusă, împărţit între acetat de etil şi 5%acid citric şi apoi stratul organic este concentrat. Reziduul este apoi supus cromatografiei care poate fi realizată acum cu o încărcare mai mare şi un gradient mai rapid şi pentru a atinge o puritate mai mare.
Exemplul 13: Prepararea Compusului 13 (US 2011015146 A1 2011.01.20).
13
Exemplul 14: Prepararea Compusului 14 (din [1], Exemplul 5)
14
Prepararea 2'-deoxi-2'-fluoro-2'-C-metiluridin-5'-fenil metoxi-alanil fosfatului
Fenil metoxialaninil fosforocloridat (1 g, 6,5 echiv.) dizolvat în 3 mL de THF s-a adăugat la un amestec de 2'-Deoxi-2'-fluoro-2'-C-metiluridină (0,15 g, 1 echiv.) şi N-metilimidazol (0,3 g, 8 echiv.) în 3 mL de THF cu agitare puternică la temperatura camerei, apoi amestecul de reacţie s-a agitat peste noapte. Solventul a fost îndepărtat prin presiune redusa. Produsul brut rezultat a fost dizolvat în metanol purificat prin HPLC preparativă pe o coloană YMC 25x30x2 mm, folosind o fază mobilă a gradientului de eluţie apă/acetonitril. Acetonitrilul şi apa s-au îndepărtat sub presiune redusă pentru a da produsul dorit (50,1 mg, 15,6%). 1H RMN (DMSO-d6) δ 1,20-1,27 (m, 6H), 3,58 (d, J=16,0 Hz, 3H), 3,75-3,92 (m, 2H), 4,015-4,379 (m, 2H), 5,54 (t, J=10,2 Hz, 1H), 5,83-5,91 (m, 1H), 6,00-616 (m, 1H), 7,18 (d, J=8,0 Hz, 2H), 7,22 (s, 1H), 7,35 (t, J=4,4 Hz, 2H), 7,55 (s, 1H), 11,52 (s, 1H); SM, m/e 502 (M+1)+.
Exemplul 15: Prepararea Compusului 15 (Exemplul 55, din [1]).
15
1H RMN (DMSO-d6) δ >1,20-1,44 (m, 12H), 1,60-1,71 (m, 4H), 3,75-4,02 (m, 2H), 3,94-4,02 (m, 1H), 4,19-4,26 (m, 2H), 4,59-4,61 (m, 1H), 5,57 (t, J=8,4 Hz, 1H), 5,85-6,06 (m, 3H), 7,17-7,23 (m, 4H), 7,54 (d, J=8,4 Hz, 1H), 11,50 (s, 1H); SM, m/e 587,92 (M+1)+
O procedură generală pentru derivaţii nucleozidici de fosforamidat este raportata la coloana 461 din [1]. O soluţie de fosforocloridat potrivit (6,5 echivalenţi) în tetrahidrofuran anhidru (THF) poate fi adăugată la un amestec de nucleozidă (1 echivalent) şi N-metilimidazol (8 echivalenţi) în THF anhidru cu agitare puternică la temperatura camerei, cu amestecul de reacţie agitat peste noapte. Solventul poate fi îndepărtat sub vid şi produsul brut purificat prin cromatografie în coloană şi/sau cromatografie preparativă în strat subţire pentru a obţine compusul dorit.
Exemplul 16: Prepararea Compusului 16 (US 7429572 B2 2008.09.30)
16.
Sinteza (2'R)-2'-Deoxi-2'-Fluoro-2'-C-Metilcitidinei pornind de la Citidină
Etapa 1: La o suspensie de citidină (100 g, 0,411 mol) în DMF (2,06 L) s-a adăugat anhidridă benzoică (102,4 g, 0,452mol). Amestecul a fost agitat la temperatura camerei timp de 20 ore. DMF a fost îndepărtat în vid şi reziduul a fost triturat cu eter dietilic. Solidul rezultat a fost colectat prin filtrare cu aspirare şi spălat cu eter dietilic (2x200 mL). Uscarea ulterioară în vid la temperatura camerei a dat N4 benzamida (140,6 g, 98,3%). O porţiune din acest material (139,3 g, 0,401 mol) a fost dizolvată în piridină anhidră (1,2 L) şi a fost tratată cu 1,3-dicloro-1,1,3,3-tetraizopropil-disiloxan (141,4 mL, 0,441 mol la temperatura camerei. Soluţia a fost agitată la temperatura camerei peste noapte. Amestecul a fost concentrat aproximativ până la uscare în vid şi coevaporat cu toluen (3x200 mL). Reziduul a fost tratat cu EtOAc (1,8 L) şi spălat cu HCl (2x200 mL, 0,05 N), NaHCO3 (5%, 2x400 mL). Stratul organic a fost spălat, uscat (Na2SO4), filtrat şi evaporat până la uscare. Compusul 16-1 (Compusul 4-1 din US 7429572 B2 2008.09.30) (256,5 g, >100%) a fost izolat ca o spumă albă şi utilizat fără purificare suplimentară.
Etapa 2: Compusul 16-1 (236,5 g, 0,40 mol) a fost dizolvat în THF uscat (1,22 L). DMSO anhidru (180,8 mL, 2,1 mol) s-a adăugat şi soluţia rezultată a fost răcită la între -20°C şi -15°C. Anhidridă trifluoracetică (90,6 mL, 0,64 mol) s-a adăugat prin picurare timp de 45 min şi soluţia s-a agitat între -20°C şi -15°C timp de 2 ore, după care trietilamină anhidră ( 223,5 mL, 1,6 mol) s-a adăugat timp de 20 min. Reacţia brută conţinând cetonă 16-2 a fost dizolvată în EtOAc (500 mL), iar soluţia rezultată a fost spălată cu H2O (3x400 mL), uscată (Na2SO4) şi solvenţii s-au îndepărtat în vid pentru a da un solid galben care a fost purificat într-o coloană pe silicagel, eluând cu un gradient treptat de Et2O (0-60%) în hexani urmat de un gradient treptat de EtOAc (50-100%) în hexani. Cetona brută astfel obţinută (~192 g) a fost cristalizată din eter de petrol pentru a da cetona 16-2 (Compusul 4-2 din US 7429572 B2 2008.09.30) (138,91 g, 57,5% din citidină) sub forma unui solid alb g şi 22 g de materie primă iniţială nereacţionată, 16-1, ca un solid galben.
Etapa 3: Compusul 16-2 (48,57 g, 8,26 mmol) a fost dizolvat în toluen anhidru (~400 mL) şi solventul a fosty îândepăărtat în vid cu excluderea umidităţii. Reziduul a fost apoi uscat suplimentar în vid (pompă de ulei) timp de încă 2 ore. Cu excluderea strictă a umidităţii, spuma reziduală a fost dizolvată în eter dietilic anhidru (1,03 L) sub argon. Soluţia rezultată a fost răcită la -78°C sub argon şi MeLi (1,6 M, 258,0 mL, 0,413 mol) a fost adăugat prin picurare printr-o pâlnie suplimentară. După ce adăugarea a fost completă, amestecul a fost agitat timp de 2 ore la -78°C. NH4Cl 1M apoasă (500 mL) a fost adăugată încet. După încălzire la temperatura camerei, amestecul a fost spălat cu H2O (2x500 mL), uscat (Na2SO4) şi apoi concentrat pânăî la uscare pentru a da o spumă cafenier (~60 g, >100%).
Reacţia a fost realizată de încă două ori folosind 37,62 g şi 56,4 g de compus 16-2. Produsele brute combinate (128,0 g, 0,212 mol) au fost dizolvate în THF (1,28 L) şi tratate cu HOAc concentr. (23 mL, 0,402 mol). La soluţie s-a adăugat TBAF (384,0 mL, 1M în THF). Soluţia s-a agitat la temperatura camerei timp de 0,75 orăh şi amestecul a fost tratat cu silicagel (750 g) şi concentrat până la uscare. Pulberea a fost plasată într-o coloană pe silicagel ambalată în CH2Cl2. Eluţia cu 1:7 EtOH-CH2Cl2 a oferit un solid ceros de culoare închisă, care a fost preadsorbit pe silicagel (300 g) şi cromatografiat ca înainte. Compusul 16-3 (Compusul 4-3 din US 7429572) (46,4 g, 53,0% 16-2) a fost izolat ca un solid alb-cenuşiu. 1H RMN (DMSO-d6): δ 1,20 (s, 3H, CH3), 3,62-3,69 (m, 2H), 3,73-3,78 (m, 2H), 5,19 (t, 1H, J=5,4 Hz, OH-5'), 5,25 (s, 1H, OH-2'), 5,52 (d, 1H, J=5,0 Hz, OH-3'), 5,99 (s, 1H, H-1'), 7,32 (d, 1H, J=5,8 Hz), 7,05 (ψt, 2H, J=7,7 Hz), 7,62 (ψt, 1H, J=7,3 Hz), 8,00 (d, 2H, J=7,3 Hz), 8,14 (d, 1H, J=6,9 Hz), 11,22 (s, 1H, NH). Calculată anal. pentru C17H19N3O6.0,5 H2O: C, 55,13; H, 5,44; N, 11,35. Depistată: C, 55,21; H, 5,47; N, 11,33.
Etapa 4: Compusul 16-3 (46,0 g, 0,13 mol) a fost dizolvat în piridină anhidră şi concentrat până la scare în vid. Siropul rezultat s-a dizolvat în piridină anhidră sub argon şi răcit la 0°C cu agitare. Soluţia brună a fost tratată cu clorură de benzoil (30 mL, 0,250 mol) prin picurare timp de 10 min. Baia de gheaţă a fost îndepărtată şi agitarea a continuat timp de 1,5 ore, îprin care CSS a arătat absenţa materiei prime iniţiale rămase. Amestecul a fost stins prin adăugarea apei (5 mL) şi concentrat până la uscare. Reziduul a fost dizolvat într-o cantitate minimă de CH2Cl2 şi spălat cu soluţie saturată de NaHCO3 (1x500 mL) şi H2O (1x500 mL). Faza organică a fost uscată (Na2SO4) şi filtrată, concentrată până la uscare se cromatografiată pe silicagel, eluând cu un gradient treptat de EtOAc-hexani (25-60%) pentru a furniza compusul 16-4 sub formă de spumă galbenă (Compusul 4-4 din US 7429572) (48,5 g, 67%). 1H RMN (CDCl3): δ 1,64 (s, 3H, CH3), 4,50 (m, 1H, H-4), 4,78-4,85 (m, 2H, H-5',5a'), 5,50 (d, H, J=3,4 Hz, H-3'), 6,42 (s, H, H-1), 7,44-7,54 (m, 7H, Ar), 7,57-7,66 (m, 3H, Ar), 7,94 (d, 2H, J=7,8 Hz), 8,05-8,09 (m, 4H, Ar), 8,21 (d, 1H, J=7,3 Hz). Calculată anal. pentru C31H27N3O8: C, 65,37; H, 4,78; N, 7,38. Depistată: C, 65,59; H, 4,79; N, 7,16.
Etapa 5: Compusul 16-4 (7,50 g, 0,013 mol) a fost dizolvat în toluen anhidru (150 mL) sub argon şi răcit la -20°C. DAST (2,5 mL, 18,9 mmol) s-a adăugat încet şi baia de răcire a fost îndepărtată după ce adăugarea a fost completă.
Agitarea a fost continuată timp de 1 oră şi amestecul a fost turnat în soluţie saturată de NaHCO3 (100 mL) şi spălat până când degajarea gazului a încetat. Faza organică a fost uscată (Na2SO4), concentrată şi purificată prin cromatografie pe silicagel eluând cu 1:1 EtOAc-hexani. Randamentul a fost de 1,22 g (16,3%) de 16-5 pur (Compusul 4-5 din US 7429572 B2 2008.09.30) ca un solid alb cu punctul de topire 241°C. (CH2Cl2-hexani); 1H RMN (CDCl3): δ 1,49 (d, 3H, J=22,4 Hz, CH3), 4,64 (dd, 1H, J=3,44, 12,9 Hz, H-5' , 4,73 (d, 1H, J=9,5 Hz, H-4'), 4,90 (dd, 1H, J=2,4, 12,7 Hz, H-5a'), 5,56 (dd, 1H, J=8,6, 20,7 Hz, H-3'), 6,52 (d, 1H, J=18,0 Hz, H-1'), 7,47-7,57 (m, 7H, Ar), 7,62-7,71 (m, 3H, Ar), 7,89 (d, 2H, J=6,9 Hz), 8,07-8,11 (m, 5H, Ar), 8,67 (bs, 1H, NH) 19F RMN (CDCl3): 3,3 δ (m) calculată anal. Pantru C31H26FN3O7.0,7 H2O: C, 63,74, H, 4,72, N, 7,20. Depistată: C, 63,71, H, 4,54, N, 7,20.
Etapa 6: Compusul 16-5 (6,30 g, 0,011 mol) a fost suspendat în amoniac metanolic (cca 7 N, 150 mnL) şi agitat la temperatura camerei peste noapte. Solventul a fost îndepărtat în vid, coevaporat cu metanol (1x20 mL) şi preadsorbit pe silicagel. Pulberea albă a fost plasată într-o coloană pe silicagel (ambalată în CHCl3) şi coloana a fost eluată cu 9% EtOH în CHCl3, apoi 17% EtOH şi în final cu 25% etanol în CHCl3. Concentrarea fracţiilor care conţin produsul, filtrarea printr-un disc de 0,4 1am şi liofilizarea din apă au dat compusul 16-6 (Compusul 4-6 din US 7429572), 2,18 g (76%). 1H RMN (DMSO-d6): δ 1,17 (d, 3H, J=22,3 Hz, CH3), 3,63 (dd, 1H, J=2,7, 13,7 Hz, H-5'), 3,70-3,84 (m, 3H, H-3', H-4', H-5a'), 5,24 (app s, 1H, OH-3'), 5,60 (d, 1H, J=5,4 Hz, H-5'), 5,74 (d, 1H, J=7,71 Hz, H-5), 6,07 (d, 1H, J=18,9 Hz, H-1'), 7,31 (s, 1H, NH2), 7,42 (s, 1H, NH2), 7,90 (d, 1H, J=7,3 Hz, H-6). 19F RMN (DMSO-d6): δ 2,60 (m). Calculată anal. pentru C10H14FN3O4.4.1.4 H20: C, 44,22; H, 5,95; N, 14,77. Depistată: C, 42,24; H, 5,63; N, 14,54. Compusul 16-6 (0,10 g, 0,386 mmol) a fost transformat în sare de hidroclorură prin dizolvare în apă (2 mL) şi ajustarea pH-ului la aproximativ 3,0 cu HCl 1M. Apa a fost îndepărtată în vid şi reziduul s-a cristalizat din EtOH apos pentru a da 16-6 sub formă de sare de hidroclorură (71,0 mg). Punctul de topire 24°C (desc); 1H RMN (DMSO-d6): δ 1,29 (d, 3H, J=22,6 Hz, CH3), 3,65 (dd, 1H, J=2,3, 12,7 Hz, H-5'), 3,76-3,90 (m, 3H, H-3', H-4', H-5a'), 5,96 (d, 1H, J=17,3 Hz, H-1'), 6,15 (d, 1H, J=7,9 Hz, H-5), 8,33 (d, 1H, J=7,9 Hz, H-6), 8,69 (s, 1,5 H, NH), 9,78 (s, 1,5 H, NH). 19F RMN (DMSO-d4): δ 1,69 (m). Calculată anal. pentru C10H14FN3O4.HCl: C, 40,62; H, 5,11; N, 14,21. Depistată: C, 40,80; H, 5,09; N, 14,23.
Exemple biologice
Protocolul testului
Test replicon de mare proiductivitate (HTBS)
Celule replicon care adăpostesc H77 (genotipul 1a) sau Con1 (genotipul 1b) ARN VHC şi reporterul luciferazei Renilla au fost însămânţate în planşete negre cu 384 godeuri la o densitate de 1,6 × 103 celule per godeu în 90 µl de mediu de cultură DMEM, cu excepţia G 418. Compuşii au fost diluaţi în serie în 100%DMSO şi adăugaţi la celule la o diluţie 1:225, atingând o concentraţie finală de 0,44% DMSO într-un volum total de 90 µL cu o Biotek µFlow Workstation. Planşetele cu celure au fost incubate la 37°C cu 5% CO2 timp de 3 zile, după care mediile de cultură au fost îndepărtate şi celulele au fost testate pentru activitatea luciferazei ca un marker pentru nivelul de replicare. Expresia luciferazei a fost măsurată folosind reactivi chimici Dual-Glo pentru analiza activităţii luciferazei (Promega, Madison, WI). Pe scurt, 20 µL de tampon Dual-Glo pentru ianalizaivităţii luciferazei s-a adăugat pentru liza celulelor timp de 10 minute şi ulterior 20 µL dintr-un substrat Duial-Glo Stop & Glo diluat (1:100) s-a adăugat la fiecare godeu. Semnalul de luminescenţă a fost măsurat pe un spectrofotometru pt. citirea planşetelor Perkin Elmer Envision Plate Reader după incubare timp de 10 minute. Nivelele de luciferază au fost convertite în procente în raport cu martorii netrataţi (definite ca 100%) şi datele au fost potrivite pentru ecuaţia logistică a reacţiei la doză y = a/(1+(x/b)c) utilizând software-ul XLFit4 (IDBS, Emeryville, CA). Valorile EC50 au fost calculate din ecuaţiile rezultate. Alternativ, activitatea antivirală poate fi analizată prin Determinarea IC50 ale proteazei NS3 VHC. Activitatea proteazei NS3 VHC a fost monitorizată folosind un substrat de depsipeptidă pentru transferul energiei rezonanţei fluorescente (FRET) (RET S1, AnaSpec, San Jose, CA) bazat pe metoda Taliani, Taliani M, Bianchi E, F Narjes, Fossatelli M, Urbani A, Steinkuhler C, et al. Un test continuu al proteazei virusului hepatitei C pe baza substraturilor de depsipeptidă pentru transferul energiei rezonanţei (MarinaTaliani et al. A Continuous Assay of Hepatitis C Virus Protease Based on Resonance Energy Transfer Depsipeptide Substrates. Analytical Biochemistry, 1996, vol. 240, nr. 1, p. 60-67), încorporată aici prin referinţă în ceea ce priveşte efectuarea acestui test.
Pe scurt, 2-10 nM de domenii ale proteazei NS3 purificate au fost preincubate la 37°C timp de 10 minute cu 20 µM de cofactori peptidici NS4A izogenici (Sigma, St. Louis, MO), în 40% de tampon glicerol, cu 50 mM HEPES pH 7,5 şi 10 mM DTT. Compuşii au fost diluaţi în serie 1:3 în DMSO, incubaţi cu amestec enzimă/cofactor timp de 10 minute şi reacţiile au fost iniţiate prin adăugarea a 2 µM de substrat RET S1 (concentraţie finală). Creşterea fluorescenţei a fost măsurată în mod continuu timp de o oră utilizând un spectrofotometru pt. citirea planşetelor de fluorescenţă Victor3 V (Perkin Elmer, Waltham, MA). Vitezele iniţiale au fost calculate pentru fiecare concentraţie a inhibitorului, folosind software-ul Workout 1,5 (DAZDAQ, East Sussex, UK) cu algoritmul de înclinare maximă. Datele de viteză au fost convertite în procente în raport cu grupul de control netratat (definite ca 100%) şi regresia neliniară a fost efectuată pentru a calcula concentraţiile inhibitoare de 50% (valorile IC50).
Potenţa enzimatică a NS3: Proteaza NS3 purificată este complexată cu peptida NS4A şi apoi incubată cu diluţii seriale ale compuşilor (DMSO folosit ca solvent). Reacţiile sunt iniţiate prin adiţia substratului peptidic marcat dublu şi creşterea cinetică rezultată în fluorescenţă este măsurată. Regresie neliniară a datelor de viteză este efectuată pentru a calcula IC50. Activitatea este iniţial testată împotriva proteazei genotipului 1b. În funcţie de potenţa obţinută împotriva genotipului 1b, genotipuri suplimentare (1a, 2a, 3) şi/sau enzime rezistente la inhibitorul proteazei (mutanţii D168Y, D168V sau A156T) pot fi testate. BILN-2061 este utilizat ca un martor pe parcursul tuturor testele. Compuşii din Exemple au fost evaluaţi în acest test şi s-au dovedit a avea valori IC50 mai mici de aproximativ 1 µM.
Potenţa şi citotoxicitatea repliconului: celule Huh-luc (replicând stabil repliconul genotipului 1b Bartenschlager's I389luc-ubi-neo/NS3-3'/ET) sunt tratate cu diluţii seriale ale compusului (DMSO este folosit ca solvent) timp de 72 ore. Numărul de copii replicon este măsurat prin bioluminiscenţă şi regresia neliniară se efectuează pentru a calcula valorile EC50. Planşete paralele tratate cu aceleaşi diluţii de medicament sunt testate pentru citotoxicitate utilizând testul viabilităţii celulare Promega CellTiter-Glo. În funcţie de potenţa obţinută împotriva repliconului 1b, compuşii pot fi testaţi împotriva unui replicon al genotipului 1a şi/sau repliconilor rezistenţi la inhibitor codificând mutaţiile D168Y sau A156T. BILN-2061 este folosit ca un martor pa partcursul tuturor testelor. Compuşii din Exemple au fost evaluaţi în acest test şi s-au dovedit a avea valori EC50 mai mici de aproximativ 5 µM.
Efectul proteinelor serice asupra potenţei repliconului
Testele repliconului sunt efectuate în mediu normal de cultură celulară (DMEM + 10% FBS ) suplimentat cu concentraţii fiziologice ale albuminei serice umane (40 mg/mL) sau glicoproteinei α-acide (1 mg/mL). EC50 în prezenţa proteinelor serice umane sunt comparate cu EC50 în mediu normal pentru a determina modificarea conformaţională a potenţei.
Selectivitatea enzimatică: inhibarea proteazelor de la mamifere inclusiv a elastazei pancreatice porcine, elastazei leucocitelor umane, proteazei 3 şi catepsinei D este măsurată la Km pentru substraturile respective pentru fiecare enzimă. IC50 pentru fiecare enzimă este comparată cu IC50 obţinută cu NS3 proteaza 1b pentru a calcula selectivitatea.
Citotoxicitatea celulelor MT-4: celulele MT4 sunt tratate cu diluţii seriale de compuşi pentru o perioadă de cinci zile. Viabilitatea celulară este măsurată la sfârşitul perioadei de tratament utilizând testul Promega CellTiter-Glo şi regresia neliniară este realizata pentru a calcula CC50.
Concentraţia compusului asociat cu celulele la EC50: culturile Huh-Luc sunt incubate cu compus la concentraţii egale cu EC50. La mai multe momente de timp (0-72 ore), celulele sunt spălate de 2 ori cu mediu rece şi extrase cu 85% de acetonitril; un eşantion al mediului la fiecare moment de timp este de asemenea extras. Extractele celulare şi de medii sunt analizate prin CL/SM/SM pentru a determina concentraţia molară a compuşilor din fiecare fracţie.
Solubilitatea şi stabilitatea: Solubilitatea este determinat prin luarea unei probe alicvote de 10 mM de soluţie-mamă de DMSO şi prepararea compusului la o concentraţie finală de 100 µM în soluţiile-test de medii (PBS, pH 7,4 şi HCl 1N, pH 1,5) cu o total concentraţie de DMSO de 1%. Soluţiile-test de medii sunt incubate la temperatura camerei cu agitare timp de 1 oră. Soluţiile sunt apoi centrifugate şi supernatanţii recuperaţi sunt analizate pe HPLC/UV. Solubilitatea poate fi calculată prin compararea cantităţii de compus detectat în soluţia-test definită comparată cu cantitatea detectată în DMSO la aceeaşi concentraţie. Stabilitatea compuşilor după 1 oră de incubare în mediile testate la 37°C este de asemenea determinată.
Stabilitatea hepatocitelor umane, canine şi de şobolan crioconservate: Fiecare compus este incubat timp de până la 1 oră în suspensii de hepatocite (100 µl, 80,000 de celule per godeu) la 37°C. Hepatocitele crioconservate sunt reconstituite în mediul de incubare fără ser. Suspensia este transferată în planşete cu 96 de godeuri (50 µL/godeu). Compuşii sunt diluaţi la 2 µM în mediul de incubare şi apoi sunt adăugaţi la suspensii de hepatocite pentru a începe incubarea. Probele sunt prelevate la 0, 10, 30 şi 60 de minute de la începutul incubării şi reacţia poate fi stinsă cu un amestec format din 0,3% acid formic în 90% acetonitril/10% apă. Concentraţia compusului în fiecare eşantion este analizată folosind CL/SM/SM. Perioada de înjumătăţire a dispariţiei compusului în suspensia de hepatocite este determinată prin ajustarea datelor asupra dependenţei dintre concentraţie şi timp cu o ecuaţie exponenţială monofazică. Datele sunt, de asemenea, extinse pentru a reprezenta clearance-ul hepatic intrinsec şi/sau clearance-ul hepatic total.
Stabilitatea fracţiunii S9 hepatice prelevată de la om, câine şi şobolan: Fiecare compus este incubat timp de până la 1 oră în suspensie S9 (500 µl, 3 mg proteină/mL) la 37°C (n = 3 ). Compuşii sunt adăugaţi la suspensia S9 pentru a începe incubarea. Probele sunt prelevate la 0, 10, 30 şi 60 de minute de la începutul incubării. Concentraţia compusului în fiecare eşantion este analizată folosind CL/SM/SM. Perioada de înjumătăţire a dispariţiei a compusului în suspensia S9 este determinată prin ajustaREA datelor asupra dependenţei dintre concentraţie şi timp cu o ecuaţie exponenţială monofazică.
Permeabilitatea Caco-2: Atât permeabilitatea directă (A-la-B), cât şi permeabilitatea inversă (B-la-A) este măsurată. Monostraturile Caco-2 sunt crescute la confluenţă pe membrane microporoase, de policarbonat, acoperite cu colagen în planşete Costar Transwell® cu 12 godeuri. Compuşii sunt dozaţi pe partea apicală pentru permeabilitatea directă (A-la-B) şi sunt dozaţi pe partea bazolaterală pentru permeabilitatea inversă (B-la-A). Celulele sunt incubate la 37°C cu 5% CO2 într-un incubator umidificat. La începutul incubării, la 1 oră şi 2 ore după incubare, o probă alicvotă de 200 µL este preluată din camera receptoare şi înlocuită cu tampon de analiză proaspăt. Concentraţia compusului în fiecare probă este determinată prin CL/SM/SM. Permeabilitatea aparentă, Papp, este calculată.
Fixarea proteinelor plasmatice: Legarea proteinelor plasmatice este măsurată prin dializa de echilibru. Fiecare compus este adăugat plasma de control la o concentraţie finală de 2 µM. Plasma îmbogăţită cu compus şi tamponul fosfat sunte plasate în părţile opuse ale celulelor de dializă asamblate, care sunt apoi rotite încet într-o baie de apă de 37C°. La sfârşitul incubării, concentraţia compusului în plasmă şi tamponul fosfat este determinată. Procentul nelegat este calculat folosind următoarea ecuaţie:
% Nelegat =
Unde Cf şi Cb sunt concentraţiile libere şi legate determinate ca concentraţii plasmatice şi ale tamponului post-dializă, respectiv.
Analiza profilului CYP450: Fiecare compus este incubat cu fiecare din 5 enzime P450 recombinante uman, inclusiv CYP1A2, CYP2C9, CYP3A4, CYP2D6 şi CYP2C19 în prezenţa şi absenţa NADPH. Probe seriale pot fi luate din amestecul de incubare la începutul incubării şi la 5, 15, 30, 45 şi 60 min după începerea incubării. Concentraţia compusului în amestecul de incubare este determinată prin CL/SM/SM. Procentajul compusului rămas după incubare la fiecare momentl de timp este calculat prin comparare cu prelevarea probelor la începutul incubării.
Stabilitatea plasmei umane, de maimuţă, câine şi şobolan: Compuşii sunt incubaţi timp de până la 2 ore in plasmă (de şobolan, câine, maimuţă sau umană) la 37°C. Compuşii sunt adăugaţi la plasma la concentraţii finale de 1 şi 10 µg/mL. Probele alivote sunt luate la 0, 5, 15, 30, 60 şi 120 min după adăugarea compusului. Concentraţiile compuşilor şi metaboliţilor majori la fiecare moment de timp sunt măsurate prin CL/SM/SM. Datele biologice (potenţa antivirală [EC50] este determinată utilizând analiza reporterului repliconului HCV pe baza luciferazei Renilla (RLuc) - VHC 1b RLuc).
Exemplul biologic 1: Activitatea anti-VHC a combinaţiei de Compus 1 şi Compus 2
Materiale şi metode
Compusul 1 şi Compusul 2 au fost sintetizaţi prin Gilead Sciences (Foster City, CA).
Linii celulare
Celulele replicon ale VHC genotipul 1b (Huh-luc) au fost obţinute de la Reblikon (Mainz, Germania). Repliconul în aceste celule este desemnat I389luc-ubi-neo/NS3-3'/ET şi codifică un marker cu rezistenţă selectabilă (neomicin fosfotransferaza), precum şi gena reporter a luciferazei extrase din licurici. Celulele Huh-luc au fost menţinute în Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; GIBCO, Carlsbad, CA) suplimentat cu 10% de ser fetal bovin (FBS; Hyclone, Logan, UT) şi 0,5 mg/mL G-418 (GIBCO). Celulele au fost reînsămânţate de două ori pe săptămână şi menţinute la niveluri subconfluente.
Determinările EC50
Celulele replicon au fost însămânţate în planşete cu 96 godeuri la o densitate de 5 × 103 celule per godeu în 100 µL de mediu de cultură DMEM, cu excepţia G-418. Compuşii 1 şi 2 au fost diluaţi în serie 1:3 în 100% DMSO (Sigma). Aceste diluţii în serie s-au adăugat la celule la o diluţie de 1:200 pentru a atinge o concentraţie finală de 0,5% DMSO într-un volum total de 200 µL. Planşetele au fost incubate la 37°C timp de 3 zile, după care mediile de cultură au fost îndepărtate şi celulele au fost lizate şi testate pentru activitatea luciferazei utilizând o analiză a luciferazei disponibilă comercial (Promega, Madison, WI). Nivelurile de replicare VHC în probele tratate cu medicament au fost exprimate ca un procentaj al celor din martorii netrataţi (definit ca 100%), iar datele au fost potrivite pentru ecuaţia logistică a reacţiei de răspuns la doză y=a/(1+(x/b)c) utilizând software-ul XLFit4 (IDBS, Emeryville, CA). Valorile EC50 au fost calculate din ecuaţiile rezultate asdtfel cum a fost descris anterior (William E. Delaney IV et al. Cross-Resistance Testing of Antihepadnaviral Compounds Using Novel Recombinant Baculoviruses Which Encode Drug-Resistant Strains of Hepatitis B Virus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2001, vol. 45, nr. 6, p. 1705-1713).
Studii combinate antivirale
Celulele replicon au fost însămânţate în planşete cu 96 godeuri la o densitate de 5 × 103 celule per godeu în 100 µL de mediu de cultură. Compuşii 1 şi 2 au fost diluaţi în serie în 100% DMSO astfel cum este descris mai sus şi adăugaţi într-un format de matrice la planşetele cu 96 godeuri, atingând unui set definit de concentraţii şi raporturi diferite ale medicamentului într-un volum final de 200 µL şi o concentraţie finală de DMSO de 0,5%. Pentru fiecare medicament în parte, valoarea EC50 a fost selectată ca punctul median pentru intervalul de concentraţii testat. Celulele au fost incubate timp de trei zile şi analizate pentru expresia luciferazei astfel cum este indicat mai sus. Pentru acest studiu combinat, două experimente independente au fost realizate în trei exemplare.
Analiza combinată a datelor
Datele au fost analizate cu ajutorul programului II MacSynergy dezvoltat de Prichard şi Shipman (Prichard MN, Aseltine KR, Shipman C, Jr., MacSynergyTM II, Version 1.0. University of Michigan, Ann Arbor, Michigan, 1993; Prichard M.N., Shipman C., Jr., Antiviral Res 14 (4-5):181-205 (1990); Prichard M.N., Shipman C, Jr., Antivir Ther 1 (1):9-20 (1996); Prichard M.N., et al., Antimicrob Agents Chemother 37 (3):540-5 (1993). Software-ul calculează inhibarea teoretică presupunând o interacţiune aditivă între medicamente (pe baza modelului Bliss Independence) şi cuantifică diferenţele statistic semnificative între valorile inhibiţiei teoretice şi cele observate. Trasarea aceste diferenţe în trei dimensiuni rezultă într-o suprafaţă în care creşterile în planul Z reprezintă sinergia antivirală, iar scăderile reprezintă antagonismul antiviral dintre compuşi. Volumele calculate ale devierilor de suprafaţă sunt exprimate în nM2%, Per Prichard şi Shipman, efectele combinate sunt definite ca:
- Foarte sinergice dacă volumele >100 nM2.
- Slab sinergice dacă volumele sunt >50 şi ≤100 nM2.
- Aditive dacă volumele sunt > -50 nM2 şi ≤50 nM2.
- Slab antagoniste dacă volumele sunt > -100 nM2 şi ≤ -50 nM2.
- Antagoniste dacă volumele sunt ≤ -100 nM2.
Rezultate
Înainte de a începe experimentele combinate, valorile EC50 în celulele replicon Huh-luc au fost determinate pentru Compusul 1 şi Compusul 2, iar rezultatele sunt prezentate în Tabelul II. Ambii compuşi au avut un efect antiviral.
Tabelul II
EC50 individuale pentru Compuşii 1 şi 2 anti-VHC în celulele replicon Huh-Luc
Compus EC50 (nM)a Compusul 1 3 ± 2 Compusul 2 11 ± 3
a EC50 indică deviaţia medie ± standardă pentru două sau mai multe experimente independente.
Efectul antiviral al combinaţiei de Compus 1 şi Compus 2 a fost măsurat, iar datele rezultate au fost analizate cu ajutorul MacSynergy II, care prevede parcele de suprafaţă care prezintă deviaţii semnificative de la aditivitate. Cuantificarea deviaţiilor statistic semnificative de la aditivitate a indicat că combinaţia de Compuşi 1 şi 2 a avut volume de sinergie/antagonism între -50 nM2 şi 50 nM2 indicând efecte antivirale aditive astfel cum se arată în Tabelul III.
Tabelul III
Cuantificarea antagonismului şi sinergiei antivirale şi interacţiunile substanţelor medicamentoase pentru Combinaţia de Compus 1 şi Compus 2
Substanţa (ele) medicamentoasă(e) utiliată(e) in Combinaţie with Compusul 2 Volumul de sinergie (nM2)a Volumul de antagonismu(nM2)a Interacţiunea Compusul 1 13.5 ± 10.5 0.07 ± 0.07 Additivă
a Valorile reprezintă deviaţia medie ± standardă a două experimente independente efectuate în trei exemplare.
Rezultatele experimentelor in vitro prezentate în Tabelul III indică faptul că Compusul 2 are activitate antivirală aditivă când este combinat cu Compusul 1.
Exemplul biologic 2: Combinaţii cu Compusul 3
Materiale şi metode
Compuşi antivirali
Compusul 1 şi Compusul 3 au fost sintetizaţi prin Gilead Sciences (Foster City, CA). Ribavirina şi IFN-α au fost procurate de la Sigma (St. Louis, MO).
Linii celulare
Celulele replicon ale genotipului 1b VHC (Huh-luc) au fost obţinute de la Reblikon (Mainz, Germania). Repliconul în aceste celule este desemnat I389luc-ubi-neo/NS3-3'/ET şi codifică un marker cu rezistenţă selectabilă (neomicin-fosfotransferaza), precum şi gena reporterului luciferazei extrase din licurici. Celulele Huh-luc au fost menţinute în Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM) cu GlutaMAX™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplimentat cu 10% de ser fetal bovin (FBS, Hyclone, Logan, UT) şi 0,5 mg/mL de G 418 (Invitrogen). Celulele au fost reînsămânţate de două ori pe săptămână şi menţinute la niveluri subconfluente.
Determinările EC50
Celulele replicon au fost însămânţate în planşete cu 96 godeuri la o densitate de 5 × 103 celule per godeu în 100 µL DMEM plus 10% de mediu de cultură FBS, cu excepţia G-418. Compuşii au fost diluaţi în serie 1:3 în 100% de DMSO (Sigma). Aceste diluţii în serie s-au adăugat la celule la o diluţie de 1:200 pentru a atinge o concentraţie finală de 0,5% de DMSO într-un volum total de 200 µL. Planşetele au fost incubate la 37°C timp de 3 zile, după care mediile de cultură au fost îndepărtate şi celulele au fost lizate şi testate pentru activitatea luciferazei utilizând o analiză a luciferazei disponibilă comercial (Promega, Madison, WI). Nivelurile de replicare VHC în probele tratate cu medicament au fost exprimate într-un procentaj al celor în martorii netrataţi (definit ca 100%), iar datele au fost potrivite pentru ecuaţia logistică a reacţiei de răspuns la doză y=a/(1+(x/b)c) uitilizând software-ul XLFit4 (IDBS, Emeryville, CA). Valorile EC50 au fost calculate din ecuaţiile rezultate astfel cum este descris anterior.
Studii combinate antivirale
Celulele replicon au fost însămânţate în planşete cu 96 godeuri la o densitate de 5 = 103 celule per godeu în 100 µL de mediu de cultură, cu excepţia G-418. Compusul 3 şi alţi compuşi au fost diluaţi în serie în 100% DMSO astfel cum este descris mai sus şi adăugaţi într-un format de matrice pentru planşetele cu 96 godeuri, atingând unui set definit de concentraţii şi raporturi ale medicamentelor diferite într-un volum final de 200 µL şi o concentraţie finală de DMSO de 0,5%. Pentru fiecare medicament în parte (cu excepţia Ribavirinei), valoarea EC50 a fost selectată ca punctul median pentru intervalul de concentraţii testat. Pentru Ribavirină, care nu a avut un efect antiviral selectiv, o doza maxima de 6,2 µM a fost selectată deoarece aceasta a fost de aproximativ 3 ori mai mică decât concentraţia la care citotoxicitatea a început să fie observată. Celulele au fost incubate cu medicamente timp de trei zile şi analizate pentru expresia luciferazei astfel cum este indicat mai sus. Pentru fiecare studiu combinat, două experimente independente au fost realizate în trei exemplare.
Analiza combinată a datelor
Datele au fost analizate cu ajutorul programului MacSynergy II dezvoltat de Prichard şi Shipman. Software-ul calculează inhibarea teoretică presupunând o interacţiune aditivă între medicamente (pe baza modelului Bliss Independence) şi cuantifică diferenţele statistic semnificative între valorile inhibiţiei teoretice şi observate. Trasarea aceste diferenţe în trei dimensiuni rezultată într-o suprafaţă în care creşterile în planul Z reprezintă sinergia antivirală, iar scăderile reprezintă antagonismul antiviral dintre compuşi. Volumele calculate ale deviaţiilor de suprafaţă sunt exprimate în nM2%. Per Prichard şi Shipman, efectele combinate sunt definite după cum urmează:
- Sinergie puternică dacă volumele >100 nM2; această cantitate de sinergie este probabil importantă in vivo
- Sinergie moderată dacă volumele sunt >50 şi ≤100 nM2; această cantitate de sinergie poate fi importantă in vivo
- Sinergie minoră dacă volumele sunt >25 şi <50 nM2
- Aditivitate dacă volumele sunt > -25 nM2 şi ≤25 nM2
- Antagonism minor dacă volumele sunt < -25 şi > -50 nM2
- Antagonism moderat dacă volumele sunt > -100 nM2 şi > -50 nM2; această cantitate de antagonism poate fi importantă in vivo
- Antagonism puternic dacă volumele sunt ≤ -100 nM2; această cantitate de antagonism este probabil importantă in vivo
Rezultate
Valorile EC50 pentru compuşii individuali în celulele replicon Huh-luc.
Înainte de a începe experimentele combinate, valorile EC50 în celulele replicon Huh-luc au fost determinate pentru fiecare compus astfel cum se arată în Tabelul IV. Toţi compuşii au avut un efect antiviral cu excepţia ribavirinei, care nu a avut activitate antivirală până la concentraţiile care au început să arate citotoxicitate.
Tabelul IV
EC50 individuale pentru Compuşii anti-VHC în celulele replicon Huh-uc
Compus EC50 (nM)a Compusul 3 2.3 ± 2.6 IFN-α 0.105 ± .003 (U/mL)b Ribavirina > 12,500 Compusul 1 0.4 ± 0.14
a EC50 indică deviaţia medie ± standardă pentru două sau mai multe experimente independente.
b EC50 INF-α este exprimată în unităţi (U) per mililitru (mL) în loc de o concentraţie nanomolară.
Efectele antivirale combinate şi interacţiunile medicamentelor
Efectele antivirale ale Compusului 3, când sunt combinate cu IFN-α, ribavirină, şi Compusului 1 au fost testate. Datele rezultate au fost analizate cu ajutorul MacSynergy II, care prevede diagrame de suprafaţă care prezintă deviaţiile semnificative de la aditivitate. Cuantificarea deviaţiilor statistic semnificative de la aditivitate au indicat că combinaţiile de Compus 3 cu IFN-α au rezultat în sinergie minoră (volume de sinergie de 32 şi 36,5 nM2, respectiv, Tabelul V). Combinaţia Compusului 3 cu inhibitorul NS5B noenucleozidic Compusul 1 a rezultat într-un volum de sinergie de 14,5 nM2 care indică o interacţiune antivirală aditivă. Nici unul dintre compuşi nu a produs volume de antagonism antiviral în afara intervalului aditiv (> -25 nM2) atunci când sunt combinaţi cu Compusul 3 astfel cum este prezentat în Tabelul V.
Tabelul V
Cuantificarea antagonismului şi sinergiei antivirale şi interacţiunile medicamentelor pentru Combinaţiile cu Compusul 3
Medicamentul(ele) utilizat(e) in Combinaţie cu Compusul 2 Volumul de sinergie (nM2)a Volumul de antagonism(nM2)a Interacţiunea IFN-α 32 ± 4,2 0,15 ± 0,2 Sinergie minoră Ribavirina 54 ± 14,1 1,6 ± 2.3 Sinergie moderată Compusul 1 14,5 ± 0,7 4,22 ± 5,0 Aditivă
a Valorile reprezintă deviaţia medie ± standardă a două experimente independente efectuate în trei exemplare
Aceste experimente combinate antivirale in vitro indică faptul că noul inhibitor al proteazei VHC NS3 Compusul 3 posedă sinergie minoră atunci cand este combinat cu IFN-α şi sinergie moderată atunci când este combinat cu Ribavirina. Aceste rezultate sugerează că Compusul 3 ar putea fi folosit în combinaţie cu standardul actual de ingrijire (PEG-IFN-α plus ribavirină) la pacientii cu VHC pentru a atinge creştertea suprimării încărcăturii virale fără a reduce eficacitatea oricărui dintre medicamentele individuale. Combinaţiile Compusului 3 cu inhibitoriai polimerazei NS5B nenucleozidici (Compusul 1) a rezultat în aditivitate. Aceste rezultate indică faptul că Compusul 3 poate fi, de asemenea, potrivit pentru explorarea combinaţiilor de medicamente care constau din mai multe clase de inhibitori specifici ai VHC la pacienţi.
Exemplul biologic 3: Combinaţii ale Compusului 4
Materiale şi metode
Agenţi anti-VHC
Compusul 1, Compus 2, Compusul 3, Compusul 4, Compusul 5 şi Compusul 6 au fost sintetizaţi prin Gilead Sciences (Foster City, CA). Puromicina, IFN-α şi ribavirina au fost procurate de la Sigma (St. Louis, MO). Calcein AM a fost procurat de la AnaSpec (Fremont, CA).
Linia de celule şi cultura de celule
Linia de celule replicon ale genotipului 1a VHC utilizată în acest studiu a fost descrisă anterior. Celulele au fost crescute în mediu de cultură celulară conţinând Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) cu GlutaMAX (Gibco, Carlsbad, CA, Cat#10569-044), suplimentat cu 10% de FBS (HyClone, Logan, UT, Cat#SH30071.03), 100 Unităţi/mL de penicilină, 100 µg/mL de streptomicină (Gibco, Carlsbad, CA, Cat#15140-122) şi 0,1 mM de aminoacizi neesenţiali (Gibco, Carlsbad, CA, Cat#11140-050). Celulele replicon au fost menţinute în 0,5 mg/mL de geneticină (Invitrogen, Carlsbad, CA, Cat#10131-035) pentru a preveni pierderea repliconului VHC. Celulele au fost reînsămânţate la fiecare 3-4 zile înainte de a ajunge la confluenţă.
Testul repliconului VHC pentru EC50, determinările CC50 şi studiile combinate
Toţi compuşii au fost furnizaţi în 100% DMSO cu excepţia IFN-α, care a fost furnizat în soluţie tampon specificată prin fabricare (Sigma, St Louis, MO, Cat#I4276). Diluţii seriale de compus au fost efectuate în 100% DMSO cu excepţia IFN-α , care a fost diluat în serie în mediu de cultură celulară descris în secţiunea 3.2. Toate diluţii seriale au fost efectuate în planşete de polipropilenă cu 384 de godeuri (Thermo Scientific, Hudson, NH, Cat#4341) utilizând o Biomek FX Workstation. Pentru determinările EC50 şi CC50, compuşii de testat au fost diluaţi în serie în zece etape de 1:3 diluţii în coloanele 3-20 ale planşetelor cu 384 de godeuri. Pentru studiile combinaţionale, un compus a fost diluat serial în nouă etape de 1:2 diluţii în direcţia orizontală cu alţi compuşi diluaţi în serie în şapte etape de 1:2 diluţii în direcţia verticală. Prin aceasta s-a realizat un set definit de concentraţii şi rapoarte diferite ale medicamentelor. Pentru fiecare medicament în parte, valoarea EC50 a fost selectată ca punctul median pentru intervalul de concentraţii testat. Toate diluţiile seriale au fost efectuate în patru exemplare per compus în aceeaşi planşetă cu 384 de godeuri. 100% DMSO s-a adăugat în coloana 1-2 a fiecărei planşete cu 384 de godeuri cu diluţie în serie. Un inhibitor al proteazei VHC ITMN-191 la 100 µM s-a adăugat în coloana 23 ca un control al 100% inhibiţie a replicării VHC în timp ce puromicina la 10 µM s-a adăugat în coloana 24 ca un control al 100% citotoxicitate.
La fiecare godeu al unei planşete de polistiren negru cu 384 de godeuri (Greiner Bio-one, Monroe, NC, Cat#781086, cultură de celule tratate), 90 µL de mediu de cultură celulară (fără geneticină) conţinând 2,000 de celule replicon VHC suspendate s-au adăugat cu o Biotek µFlow Workstation. Pentru transferul compusului în planşetele de cultură celulară, 0,4 µL de soluţie de compus de la planşeta cu diluţie în serie a compusului s-a transferat la planşeta de cultură celulară pe o Biomek FX Workstation. Concentraţia DMSO în godeurile finale de analiză a fost de 0,44%. Planşetele au fost incubate timp de 3 zile la 37°C cu 5% CO2 şi 85% umiditate.
Testul repliconului VHC a fost un test multiplex care poate evalua atât citotoxicitatea, cât şi activitatea anti-replicon din acelaşi godeu. Testul CC50 a fost efectuat primul. Mediile dinn planşeta de cultură celulară cu 384 godeuri au fost aspirate şi godeurile au fost spălate de patru ori cu 100 µL 1 X PBS fiecare, folosind un dispozitiv de spălat planşetele Biotek ELx405. Un volum de 50 µL de soluţie conţinând 400 nM calceină AM (AnaSpec, Fremont, CA, Cat#25200-056) în 1 X PBS s-a adăugat la fiecare godeu al planşetei cu o Biotek µFlow Workstation. Planşeta a fost incubată timp de 30 minute la temperatura camerei înainte de măsurarea semnalului de fluorescenţă (excitaţie 490 nm, emisie 520 nm) cu un spectrofotometru pt. citirea planşetelor Perkin Elmer Envision Plate Reader.
Testul EC50 a fost efectuat în aceleaşi godeuri ca şi testul CC50. Soluţia de calceină-PBS din planşeta de cultură celulară cu 384 de godeuri a fost aspirată cu un dispozitiv de spălat planşetele Biotek ELx405. Un volum de 20 µL de tampon luciferază Dual-Glo (Promega, Madison, WI, Cat#E298B) a fost adăugat la fiecare godeu al planşetei cu o Biotek µFlow Workstation. Planşeta a fost incubată timp de 10 minute la temperatura camerei. Un volum de 20 µL de soluţie conţinând 1:100 amestec de substrat Dual-Glo Stop & Glo (Promega, Madison, WI, Cat#E313B) şi tampon Dual-Glo Stop & Glo (Promega, Madison, WI, Cat#E314B) s-a adăugat apoi la fiecare godeu al plnşetei cu o Biotek µFlow Workstation. Planşeta a fost apoi incubată la temperatura camerei timp de 10 minute înainte de măsurarea semnalului de luminescenţă cu un spectrofotometru pt. citirea planşetelor Perkin Elmer Envision Plate Reader.
Analiza datelor
Efectul citotoxicităţii a fost determinat prin conversia AM calceinei în produs fluorescent. Citotoxicitatea procentuală a fost calculată prin ecuaţia 1:
% citotoxicitate sau % inhibiţie = ( 1 )
unde XC este semnalul de fluorescenţă din godeul tratat cu compus; MB este semnalul de fluorescenţă medie din godeurile tratate cu puromicină; MD este semnalul de fluorescenţă medie din godeurile tratate cu DMSO. Activitatea de replicare anti-VHC a fost determinată de semnalul de luminescenţă generat din luciferaza Renilla reporterului repliconului VHC. Inhibarea procentuală pe repliconul VHC a fost calculată folosind ecuaţia 1, unde XC este semnalul de luminiscenţă din godeul tratat cu compus; MB este semnalul de luminescenţă medie din godeurile tratate cu ITMN-191; MD este semnalul de luminiscenţă medie din godeurile tratate cu DMSO.
Valorile CC50 au fost determinate ca fiind concentraţia compusului de testare care a produs o scădere de 50% a viabilităţii celulare. Valorile EC50 au fost determinate ca fiind concentraţia compusului de testare care a produs o scădere de 50% a replicării VHC. Atât valorile CC50, cât şi valorile EC50 au fost obţinute utilizând pachetul de software Pipeline Pilot 5.0 (Accelrys, San Diego, CA) prin ajustarea regresiei neliniare a datelor experimentale la ecuaţia 2:
(2)
unde y este inhibarea % observată a repliconului VHC la concentraţia x a compusului; d este răspunsul estimat la concentraţia zero a compusului; a este răspunsul estimat la concentraţia infinită a compusului; c este concentraţia medie (CC50 sau EC50); b este coeficientul de înclinare Hill.
Datele experimentale ale studiului combinat au fost analizate cu ajutorul programului MacSynergy II dezvoltat de Prichard şi Shipman. Software-ul (MacSynergyTM II, University of Michigan, MI) calculează inhibarea teoretică presupunând o interacţiune aditivă între medicamente (pe baza modelului Bliss Independence) şi cuantifică diferenţele statistic semnificative între valorile de inhibiţie teoretice şi observate. Trasarea grafică a acestor diferenţe în trei dimensiuni rezultă într-o suprafaţă în care creşterile în planul Z reprezintă sinergia antivirală, iar scăderile reprezintă antagonismul antiviral între compuşi. Volumele calculate ale deviaţiilor de suprafaţă sunt exprimate în nM2%. Per Prichard şi Shipman, efectele combinaţiei sunt definite ca:
- Sinergie puternică: > 100 nM2%
- Sinergie moderată: > 50 şi ≤ 100 nM2%
- Sinergie minoră: > 25 şi ≤ 50 nM2%
- Aditivitate: ≤ 25 şi > -25 nM2%
- Antagonism minor: ≤ -25 şi > -50 nM2%
- Antagonism moderat: ≤ -50 şi > -100 nM2%
- Antagonism puternic: ≤ -100 nM2%
Pentru fiecare studiu combinat, trei experimente independente au fost realizate cu patru probe identice în fiecare experiment.
Rezultate
Activitatea antivirală şi citotoxicitatea compuşilor individuali în genotipul VHC 1a testul repliconului.
Activitatea anti-VHC şi citotoxicitatea Compusului 4 şi altor compuşi au fost testate în celulele Huh-7 care poartă un replicon 1a al genotipului VHC. Valorile EC50 şi CC50 sunt prezentate în Tabelul VI. Nu există nici o citotoxicitate semnificativă observată pentru toţi compuşii până la cele mai mari concentraţii testate.
Tabelul VI
EC50 şi CC50 ale compuşilor utilizaţi în acest studiu împotriva repliconului VHC genotipul1a
Compuşi EC50 a (nM) CC50 a (nM) Compusul 1 19 ± 8 >44400 Compusul 2 496 ± 135 >22200 Compusul 3 49 ± 18 >22200 Compusul 4 201 ± 74 >44400 Compusul 5 15 ± 2,4 >44400 Compusul 6 0,033 ± 0,011 >44400 IFN-α 1,4 ± 0,3b >50b Ribavirina 36482 ± 17507 >88800
a Valorile sunt deviaţia medie ± standardă pentru trei sau mai multe experimente independente
b Valorile IFN-α sunt exprimate în unităţi (U) per mililitru (mL) în loc de o concentraţie nanomolară
Activitatea antivirală şi citotoxicitatea Compusului 4 în combinaţie cu alte clase de agenţi anti-VHC.
Efectele antivirale ale Compusului 4 în combinaţie cu alţi compuşi anti-VHC au fost evaluate cu ajutorul repliconului 1a al genotipului VHC. Rezultatele au fost analizate cu ajutorul MacSynergy II, care prevede diagrame de suprafaţă care prezintă deviaţii semnificative de aditivitate. Volumele de sinergie şi antagonism (nM2%) calculate din deviaţiile de la suprafaţa aditivă sunt rezumate în Tabelul VII. La intervalul de încredere de 95%, volumele medii de sinergie şi antagonism sunt între 25 şi -25 nM2% când Compusul 4 a fost combinat cu IFN-α, Compusul 2 şi Compusul 6, indicând interacţiunea aditivă cu aceşti compuşi. Mai mult, Compusul 4 prezintă volumele de sinergie în intervalul de la 25 până la 50 nM2% cand este combinat cu Compusul 1, Compusul 5 sau Compusul 3, sugerând o interacţiune sinergică minoră.
Tabelul VII
Cuantificarea antagonismului şi sinergiei antivirale şi interacţiunile medicamentelor pentru Combinaţiile medicamentoase cu Compusul 4
Medicamentul(ele) utilizat(e) in Combinaţie cu Compusul 4 Volumul de sinergie (nM2)a Volumul de antagonism (nM2)a Interacţiunea Compusul 1 34 ± 26 -1 ± 2 Sinergie minoră Compusul 2 22 ± 14 -2 ± 3 Aditivite Compusul 3 26 ± 6 -3 ± 2 Siergie minoră Compusul 5 26 ± 28 -1 ± 3 Sinergie minoră Compusul 6 19 ± 17 -7 ± 7 Aditivitate IFN-α 12 ± 6 0 ± 0 Aditivitate Ribavirina 1 ± 1 -43 ± 20 Antagonism minor
Valorile reprezintă deviaţia medie ± standardă a trei experimente independente efectuate în patru exemplare
În toate studiile combinate, viabilitatea celulară este mai mare de 85% la toate raporturile de concentrţie şi toate combinaţiile de medicamente prezintă efecte aditive asupra citotoxicităţii astfel cum este arătat în Tabelul VIII.
Tabelul VIII
Cuantificarea sinergiei şi antagonismului citotoxicităţii şi interacţiunile medicamentelor pentru Combinaţiile medicamentoase cu Compusul 4
Medicamentul(ele) utilizat(e) in Combinaţie cu Compusul 4 Volumul de sinergie (nM2%)a Volumul de antagonism (nM2%)a Interacţiunea Compusul 1 13 ± 11 0 ± 1 Aditivitate Compusul 2 17 ± 14 0 ± 0 Aditivitate Compusul 3 3 ± 5 0 ± 0 Aditivitate Compusul 5 15 ± 8 -10 ± 7 Aditivitate Compusul 6 8 ± 4 0 ± 0 Aditivitate IFN-α 8 ± 12 -7 ± 13 Aditivitate Ribavirina 4 ± 3 -1 ± 2 Aditivitate
a Valorile reprezintă deviaţia medie ± standardă a trei experimente independente efectuate în patru exemplare
Cu toate acestea, Compusul 4 prezintă un volum de antagonism de -43 nM2% atunci când este combinat cu ribavirină, sugerând o interacţiune antagonistă minoră.
Tabelul IX
Cuantificarea sinergiei şi antagonismului citotoxicităţii şi interacţiunile medicamentelor pentru Combinaţiile medicamentoase cu ribavirină
Medicamentul(ele) utilizat(e) in Combinaţie cu ribavirina Volumul de sinergie (nM2%)a Volumul de antagonism (nM2%)a Interacţiunea Compusul 4 4 ± 3 -1 ± 2 Aditivitate
a Valorile reprezintă deviaţia medie ± standard a trei experimente independente efectuate în patru exemplare
Concentraţia ribavirinei care prezintă cel mai mare antagonism cu Compusul 4 este de aproximativ 0,5 până la 1 µM, care este de aproximativ 10 ori mai mică decât concentraţia plasmatică staţionară a ribavirinei (6-11 µM) observată la om la o doză de 800 mg/zi. La această concentraţie fiziologică a ribavirinei (6-11 µM), interacţiunea antagonistă dintre ribavirină şi Compusul 4 este minimă într-un interval larg de concentraţii ale Compusului 4 (0-0,44 µM). Prin urmare, antagonismul minor observat între ribavirină şi Compusul 4 în sistemul de replicon in vitro este puţin probabil să aibă semnificaţie clinică.
Concluzii
Activitatea antivirală a Compusului 4 (într-un amestec diastereomeric) a fost testată în combinaţie cu standardul actual de ingrijire (IFN-α/Ribavirină), precum şi candidaţii interni în curs de dezvoltare a Gilead Sciences Compusul 1 şi Compusul i 5 (inhibitori ai NS5B nenucleozidici), Compusul 2 şi Compusul 3 (inhibitori ai proteazei NS3) şi Compusul 6 (inhibitor al NS5A). Astfel cum este rezumat în Tabelul VIII, Compusul 4 a prezentat activitate antivirală aditivă în conmbinaţie cu IFN-α, Compusul 2 şi Compusul 6 şi sinergie minoră cu Compusul 1, Compusul 5 şi Compusul 3.
Combinaţia Compusului 4 cu ribavirină a rezultat într-un antagonism minor la concentraţiile ribavirinei între 0,5 până la 1 µM, care sunt de aproximativ 10 ori mai mici decât concentraţia fiziologică staţionară a acesteia (6-11 µM) în plasma umană. La concentraţia relevantă clinic a Ribavirinei, interacţiunea antagonistă dintre cei doi compuşi a devenit neglijabilă.
Exemplul biologic 4: Combinaţii ale Compusului 5
Activitatea antivirală a Compusului 5 a fost testată în celulele Huh-lunet GT-1b (folosind substanţial aceleaşi metode ca şi în testele pentru Compusul 4) în combinaţie cu compuşi interni în curs de dezvoltare Compusul 1, Compusul 2 şi Compusul 3 (inhibitori ai proteazei NS3), Compusul 6 (inhibitor al NS5A), Compusul 4 (inhibitor al C-nuc NS5B) şi, de asemenea, tratamentul VHC aprobat PEG-IFN-α şi Ribavirină. Datele combinaţiilor au fost analizate pe baza modelului Bliss Independence cu ajutorul software-ului MacSynergy II. Rezultatele testelor combinate au fost exprimate ca volume medii de sinergie şi antagonism (nM2) calculate la încrederea de 95% de la două experimente independente efectuate în trei exemplare. Efectele combinate sunt definite ca:
- Sinergie puternică dacă volumele >100 nM2; această cantitate de sinergie este probabil importantă in vivo
- Sinergie moderată dacă volumele sunt >50 şi ≤100 nM2; această cantitate de sinergie poate fi importantă in vivo
- Sinergie minoră dacă volumele sunt >25 şi <50 nM2
- Aditivitate dacă volumele sunt > -25 nM2 şi ≤25 nM2
- Antagonism minor dacă volumele sunt < -25 şi > -50 nM2
- Antagonism moderat dacă volumele sunt > -100 nM2 şi > -50 nM2; această cantitate de antagonism poate fi importantă in vivo
- Antagonism puternic dacă volumele sunt ≤ -100 nM2; această cantitate de antagonism este probabil importantă in vivo.
Combinaţia inhibitorilor NS5B alosterici Compusul 1 şi Compusul 5 a rezultat într-o sinergie moderată în testul repliconului. Studiile cu alţi inhibitori ai VHC, inclusiv PEG-IFN-α şi ribavirină, au dezvăluit interacţiuni aditive până la sinergice minore.
Tabelul X
Efectele antivirale ale Compusului 5 în combinaţie cu alte medicamente anti-VHC în celulele replicon 1b Huh-luc
Medicamentul utilizat în combinaţie cu Compusul 5 Volumul de sinergie (nM2)a Volumul de antagonism (nM2)a Interacţiunea Compusul 1 70 ± 26 0 ± 0 Sinergie moderată Compusul 2 22 ± 12 -7 ± 7 Aditivă Compusul 3 19 ± 13 -2 ± 2 Aditivă Compusul 4 26 ± 28 -1 ± 3 Sinergie minoră Compusul 6 34 ± 19 0 ± 0 Sinergie minoră PEG-IFN-α 31 ± 23 -2 ± 4 Sinergie minoră Ribavirina 12 ± 8 -12 ± 9 Aditivă
a Valorile reprezintă deviaţia medie ± standardă a două experimente independente efectuate în trei exemplare
Exemplul biologic 5: Compusul 6, combinaţii
Materiale şi metode
Compuşi
Compusul 1, Compusul 2, Compusul 3, Compusul 6 şi Compusul 7 au fost sintetizaţi prin Gilead Sciences (Foster City, CA). IFN-α şi ribavirina au fost procurate de la Sigma (St. Louis, MO).
Linii celulare
Celulele replicon 1b ale genotipului VHC (Huh-luc) au fost obţinute de la Reblikon (Mainz, Germania). Repliconul în aceste celule este desemnat I389luc-ubi-neo/NS3-3'/ET şi codifică un marker cu rezistenţă selectabilă (neomicin-fosfotransferaza), precum şi gena reporter a luciferazei extrase din licurici. Celulele Huh-luc au fost menţinute în Dulbecco's Modified Eagle's Medium GlutaMax (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA) suplimentat 10% de cu ser fetal bovin (FBS; Hyclone, Logan, UT), 1X penicilină/streptomicină, 1X aminoacizi neesenţiali şi 0,5 mg/mL de G-418 (toate de la Invitrogen, Carlsbad, CA). Celulele au fost reînsămânţate de două ori pe săptămână şi menţinute la niveluri subconfluente.
Teste
Testul activităţii antivirale în celulele replicon Huh-luc VHC
Celulele replicon au fost însămânţate în planşete cu 96 godeuri la o densitate de 7 × 103 celule per godeu în 100 µL de mediu de cultură DMEM, cu excepţia G-418. Compuşii au fost diluaţi în serie 1:2 în 100% DMSO. Diluţiile seriale s-au adăugat la celule la o diluţie de 1:200 pentru a atinge o concentraţie finală de 0,5% de DMSO într-un volum total de 200 µL. Planşetele au fost incubate la 37°C timp de 3 zile, după care mediile de cultură au fost îndepărtate şi celulele au fost lizate şi testate pentru activitatea luciferazei utilizând un test al luciferazei disponibil comercial (Promega, Madison, WI).
Studii combinate antivirale
Celulele replicon au fost însămânţate în planşete cu 96 godeuri la o densitate de 7 × 103 celule per godeu în 100 µL mediu de cultură, cu excepţia G-418. Compusul 6 şi alţi compuşi au fost diluaţi în serie 1:2 în 100% DMSO şi adăugaţi într-un format de matrice la planşetele cu 96 godeuri, atingând unui set definit de concentraţii şi raporturi diferite ale medicamentelor într-un volum final de 200 µL şi o concentraţie finală de DMSO de 0,5%. Pentru fiecare medicament în parte, valoarea EC50 a fost selectată ca punctul median pentru intervalul de concentraţii testat. Celulele au fost incubate timp de 3 zile şi analizate pentru expresia luciferazei utilizând un test al luciferazei disponoibil comercial (Promega). Pentru fiecare studiu combinat, două experimente independente au fost realizate în trei exemplare.
Determinarea citotoxicităţii celulare
Celulele replicon au fost însămânţate şi tratate cu medicamente astfel cum este descris pentru studiile combinate antivirale de mai sus. După trei zile de incubare la 37°C, mediul de cultură a fost îndepărtat şi celulele au fost lizate şi testate pentru citotoxicitate utilizând un test al viabilităţii celulare luminescente CellTiter-Glo (Promega) în conformitate cu instrucţiunile producătorului. Unităţile de lumină relative au fost convertite în procente în raport cu grupele de control netratate (definite ca 100%).
Analiza datelor
Calculele EC50
Conform testelor EC50, nivelele de luciferază în probele tratate cu medicament au fost exprimate ca un procentaj al celolr din grupele de control netratate (definit ca 100%). Valorile EC50 au fost calculate prin analiza regresiei neliniare a seturilor de date replicate utilizând software-ul XLfit 4 (IDBS, Emeryville, CA).
Calcularea antagonismului şi sinergiei antivirale
Conform testelor combinaţiei, nivelele de luciferază în probele tratate cu medicament au fost exprimate ca un procentaj al celor din grupele de control netratate (definit ca 100%). Seturile de date replicate au fost apoi analizate cu ajutorul programului MacSynergy II dezvoltate de Prichard şi Shipman. Software-ul (MacSynergyTM II, University of Michigan, MI) calculează inhibarea teoretică presupunând o interacţiune aditivă între medicamente (pe baza modelului Bliss Independence) şi cuantifică diferenţele statistic semnificative între valorile inhibiţiei teoretice şi observate. Trasarea grafică a acestor diferenţe în trei dimensiuni rezultă într-o suprafaţă în care creşterile în planul Z reprezintă sinergia antivirală, iar scăderile reprezintă antagonismul antiviral între compuşi. Volumele calculate ale deviaţiilor de suprafaţă sunt exprimate în nM2%. Per Prichard şi Shipman, efectele combinate sunt definite ca:
- Sinergie puternică dacă volumele >100 nM2; această cantitate de sinergie este probabil importantă in vivo
- Sinergie moderată dacă volumele sunt >50 şi ≤100 nM2; această cantitate de sinergie poate fi importantă in vivo
- Sinergie minoră dacă volumele sunt >25 şi <50 nM2
- Aditivitate dacă volumele sunt > -25 nM2 şi ≤25 nM2
- Antagonism minor dacă volumele sunt < -25 şi > -50 nM2
- Antagonism moderat dacă volumele sunt > -100 nM2 şi > -50 nM2; această cantitate de antagonism poate fi importantă in vivo
- Antagonism puternic dacă volumele sunt ≤ -100 nM2; această cantitate de antagonism este probabil importantă in vivo
Rezultate
Activitatea antivirală a compuşilor individuale în celulele replicon Huh-luc.
Înainte de a începe experimentele combinate, activitatea antivirală a compuşilor individuali a fost determinată în celulele replicon Huh-luc. Valorile EC50 corespunzătoare cu rezultatele istorice au fost observate cu toţi cei şapte compuşi.
Tabelul XI
Valorile EC50 individuale pentru Compuşii anti-VHC în celulele replicon Huh-luc
Compus EC50 (nM)a IFN-αb 0,05 U/ml ± 0,04 Ribavirina > 12 ± 2,4 Compusul 1 0,96 ± 0,39 Compusul 2 5,0 ± 0,0 Compusul 3 3,0 ± 1,2 Compusul 6 0,0018 ± 0,0007 Compusul 7 1245 ± 341
a EC50 indică deviaţia aritmetică medie ± standardă a trei sau mai multor experimente independente.
b EC50 IFN-α este exprimată în unităţi (U) per mililitru (mL) în loc de o concentraţie nanomolară.
Efectele antivirale combinate şi interacţiunile medicamentelor
Efectele antivirale ale Compusului 6 în combinaţie cu alţi inhibitori ai VHC au fost evaluate folosind sistemul replicon 1b VHC. Datele rezultate au fost analizate cu ajutorul MacSynergy II, care prevede diagramele de suprafaţă care prezintă deviaţii semnificative de la aditivitate. Cuantificarea deviaţiilor statistic semnificative de la aditivitate din două experimente independente este rezumată în Tabelul XII. Combinaţiile de Compus 6 cu IFN-α sau Compus 1 au rezultat în volume de sinergie de 32 şi 34 nM2, respectiv, indicând sinergie minoră. Ribavirina, Compusul 2 şi Compusul 7 au produs volume de sinergie de 61, 52 şi 51 atunci când au fost combinate cu Compusul 6, respectiv, indicând o interacţiune sinergică moderată între Compusul 6 şi aceşti trei inhibitori ai VHC. Combinaţia Compusului 6 cu Compusul 3 a rezultat într-un un volum de sinergie de 132 nM2% semnificând o interacţiune sinergică antivirală puternică. Nici unul dintre compuşi nu a produs volume de antagonism antiviral în afara intervalului aditiv (> -25 nM) atunci când au fost combinaţi cu Compusul 6.
Tabelul XII
Cuantificarea antagonismului şi sinergiei antivirale and interacţiunile medicamentelor pentru Combinaţiile de medicamente cu Compusul 6
Medicamentul(ele) utilizat(e) în combinaţie cu Compusul 6 Volumul de sinergie (nM2)a Volumul de antagonism (nM2)a Interacţiunea IFN-α 32 ± 1,4 0,0 ± 0,0 Sinergie minoră Ribavirina 61 ± 0,5 -0,5 ± 0,1 Sinergie moderată Compusul 1 34 ± 9,9 -17 ± 0,7 Sinergie minoră Compusul 2 52 ± 5,1 -0,7 ± 0,7 Sinergie moderată Compusul 3 132 ± 44 -0,1 ± 0,2 Sinergie puternică Compusul 7 51 ± 7,8 -0,2 ± 0,1 Sinergie moderată
a Valorile reprezintă deviaţia aritmetică medie ± standardă a două experimente independente efectuate în trei exemplare.
Procentajele viabilităţii celulelor pentru Compusul 6 în combinaţie cu alţi inhibitori ai VHC
Pentru a se asigura că rezultatele combinaţiilor antivirale nu au fost afectate de citotoxicitatea combinaţiilor, citotoxicitatea a fost investigată în paralel, folosind aceleaşi concentraţii de compus testate în testele antivirale (Tabelul XIII). Pentru toţi compuşii, viabilitatea celulelor a fost de cel puţin 98% din grupele de control netratate pentru combinaţii la cele mai ridicate concentraţii testate. Prin urmare, nici o citotoxicitate semnificativă in vitro nu a fost observată la testarea Compusului 6 singur, sau în combinaţie cu acete medicamente.
Tabelul XIII
Procentajele viabilităţii celulare pentru Compusul 6, Combinaţiile în celulele replicon Huh-Luc
Compuşi Concentraţia(iile) (nM) Viabilitatea celulară %a Compusul 6 0,014 99 ± 1 Compusul 6 + IFN-αb 0,014 + 0,8 102 ± 3 Compusul 6 + Ribavirină 0,014 + 8000 105 ± 4 Compusul 6 + Compusul 1 0,014 + 4,0 99 ± 3 Compusul 6 + Compusul 2 0,014 + 24,0 103 ± 3 Compusul 6 + Compusul 3 0,014 + 12,8 104 ± 4 Compusul 6 + Compusul 7 0,014 + 8800 103 ± 3
a % viabilităţii celulare indică deviaţia aritmetică medie ± standardă a cel puţin două experimente independente efectuate în trei exemplaret.
b IFN-α este exprimat în unităţi (U) per mililitru (mL) în loc de o concentraţie nanomolară.
Concluzii
Rezultatele acestor experimente in vitro indică faptul că Compusul 6 are sinergie antivirală minoră în combinaţie cu IFN-α sau inhibitorul polimerazei NS5B nenucleozidic Compusul 1. Combinaţiile de Compus 6 cu ribavirină, inhibitor al proteazei NS3 Compusul 2 sau inhibitor al polimerazei NS5B nucleozidic Compusul 7 a rezultat într-o sinergie antivirală moderată. A fost observată sinergie antivirală puternică între Compusul 6 şi inhibitorul proteazei NS3 Compusul 3. Nici o citotoxicitate semnificativă in vitro nu a fost identificată la testarea acestor combinatii de medicamente. Aceste rezultate sugereaza că Compusul 6 ar putea fi raţional combinat cu standardul actual de asistenţă medicală.
Exemplul biologic 6:
Compuşi
Compusul 1, Compusul 3, Compusul 4 şi Compusul 6 au fost sintetizaţi prin Gilead Sciences (Foster City, CA)
Linii celulare
Celulele replicon ale VHC genotipul 1b (Huh-luc) au fost obţinute de la Reblikon (Mainz, Germania). Repliconul în aceste celule este desemnat I389luc-ubi-neo/NS3-3'/ET şi codifică un marker cu rezistenţă selectabilă (neomicin-fosfotransferaza), precum şi gena reporter a luciferazei extrase din licurici. Celulele Huh-luc au fost menţinute în Dulbecco's Modified Eagle's Medium GlutaMax (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA) suplimentat cu 10% de ser fetal bovin (FBS; Hyclone, Logan, UT), 1X penicilină/streptomicină, 1X aminoacizi neesenţiali şi 0,5 mg/mL de G-418 (toate de la Invitrogen, Carlsbad, CA). Celulele au fost reînsămânţate de două ori pe săptămână şi menţinute la niveluri subconfluente.
Teste
Determinarea concentraţiei compusului necesară pentru suprimarea repliconului ARN de către 1-1,5 log peste 6 zile de tratament
Celulele replicon ale genotipului 1b au fost însămânţate în baloane T-75 la o densitate celulară de 2,5x105 celule/balon, cu excepţia G418. Compuşii au fost adăugaţi individual la celule în concentraţii variabile: Compusul 6 s-a adăugat în concentraţii de fie 1pM, 2pM, 6pM, 8pM sau 12pM , Compusul 4 s-a adăugat la 125 nM, 250 nM, 375 nM, 500 nM sau 1000 nM, Compusul 1 s-a adăugat la 1,25 nM , 2,5 nM, 5 nM, 2,75 nM sau 10 nM, şi Compusul 3 s-a adăugat în concentraţii de 3,75 nM , 7,5 nM , 11,25 nM, 15 nM, 30 nM sau 60 nM. Baloanele au fost incubate la 37°C, mediile şi compuşii au fost împrospătaţi la fiecare două zile. După 6 zile de incubare celulele replicon au fost colectate pentru extracţia ARN şi analiza repliconului ARN QRT-PCR.
Test de tratare a celulelor replicon cu compuşi combinaţi
Celule replicon ale genotipului 1b au fost însămânţate în baloane T-75 la o densitate de 2,5x105 celule/balon. Compuşii s-au adăugat la flacoanele T- 5 în următoarele concentraţii: Compusul 6 la4 pM, Compusul 4 la 1000 nM, Compusul 1 la 10 nM şi Compusul 3 la 26,25 nM. Baloanele au fost incubate la 37°C, iar compuşii şi mediile au fost împrospătate la fiecare două zile. Toate experimentele au fost realizate în două exemplare şi vor fi notat ca balonul 1 şi balonul 2. În ziua a 6-a toate celulele au fost colectate din balonul 1 pentru extracţia ARN urmată de analiza specifică QRT-PCR a repliconului VHC şi celulele din balonul 2 au fost reamplasate pe plăci de cultură tisulară de 10cm, în prezenţa G418 timp de 14 zile pentru a înregistra formarea coloniei de celule replicon netratate.
Test QRT-PCR
ARN-ul total a fost extras cu setul RiboPure (AM1924 Life Technologies Corporation Carlsbad, CA) urmând protocolul producătorului. Probe de ARN extrase au fost depozitate la -80°C până la utilizare. Pentru testul RT-PCR cantitativ setul Qiagen One-step QRT-PCR a fost utilizat în conformitate cu protocolul producătorului (Qiagen, Valencia CA). Primerii specifici ai genei NS3 a genotipul 1b VHC, primerul direct NS3_180FL 5'-CGGCGGACTGTCTATCATGGTGC[FAM]G-'3 (SEQ ID NO:1) şi invers NS3_180 5'- GGTCCTGGTCCACATTGGTGT-'3 (SEQ ID NO:2) şi setul de primeri endogeni de control (115HM-01) 18S rRNA LUX™ [FAM] au fost produse de către Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA). Pentru etapa reverstranscriptazei, reacţiile au fost incubate la 44°C timp de 30 min, enzima reverstranscriptaza a fost apoi degradată prin încălzirea probei la 94°C timp de 10 min. Etapa Q-PCR a inclus 38 de cicluri la 94°C timp de 15 s şi 58°C timp de 30 s.
Rezultate
Înainte de iniţierea experimentelor combinate de tratare a celulelor replicon concentraţia compusului necesară pentru a suprima repliconul ARN genotipului 1b prin 1-1,5 log a fost determinată pentru Compusul 6, Compusul 4, Compusul 1 şi compusul 3. Scăderea logului repliconului ARN se datorează nivelelor de ARN în celule replicon tratate cu grupul de control DMSO menţinute timp de 6 zile.
Tabelul XIV
Doza compusului individual capabilă să inducă scăderea 1-1,5log a repliconului ARN într-un test de şase zile
Compus Scăderea log repliconului RNA Concentraţia compusului (nM) Compusul 1 -1,0 10 Compusul 3 -0,9 26,25 Compusul 4 -1,2 1000 Compusul 6 -1,4 0,004
Test de tratare combinată a repliconului genotipului 1b
Suprimarea repliconului ARN de compuşii Compusul 6, Compusul 4, Compusul 1 şi Compusul 3 a fost determinată într-un test de şase zile sub formă de compuşi individuali şi în diferite combinaţii duble, triple şi cvadruple. Scăderea log-ului repliconului ARN corespunde cu nivelele de ARN din celulele replicon tratate cu grupa de control DMSO menţinute timp de 6 zile împreună cu baloanele de tratament. Capacitatea diferitelor combinaţii de compuşi pentru a trata celulele din repliconul VHC a fost determinată prin formarea coloniei. Formarea coloniei a apărut după ce tratamentul cu compuşi a fost înlăturat şi presiunea G418 a fost returnată timp de 14 zile. Dacă o combinaţie de compus tratează complet populaţia de celule din repliconul VHC nici o colonie nu se va dezvolta deoarece celulele sunt lipsite de rezistenţă la G418.
Tabelul XV
Cuantificarea combinaţiei de compuşi în testul de tratare a repliconului
Compuşi Scăderea log repliconului RNA Numărul de colonii netratate Compusul 6 -1,4 634 Compusul 4 -1,2 1054 Compusul 1 -1,0 657 Compusul 3 -0,9 989 Compusul 4+Compusul 6 -2,67 15 Compusul 1+Compusul 4 -2,022 14 Compusul 3+Compusul 4 -2,26 23 Compusul 1+Compusul 6 -2,3 148 Compusul 3+Compusul 6 -2,62 13 Compusul 1+Compusul 3 -1,8 113 Compusul 1+Compusul 4+Compusul 6 -2,66 0 Compusul 3+Compusul 4+Compusul 6 -2,71 0 Compusul 1+Compusul 3+Compusul 4 -2,69 0 Compusul 1+Compusul 3+Compusul 6 -2,69 0 Compusul 1+Compusul 3+Compusul 4+Compusul 6 -2,71 0 DMSO (0,2% pentru a selecta combinaţia cvadruplă) 0 6330
Concluzii
Rezultatele acestor experimente in vitro indică faptul că combinaţia de doi compuşi creşte scăderea log-ului ARN-ului viral peste 6 zile de tratament şi creşte rata celulelor replicon tratate. Cele două combinaţii de Compus 6 cu Compus 4 sau Compus 3 rezultă într-o suprimare mai mare a log-ului repliconului ARN şi cel mai mic număr de colonii netratate comparativ cu toate celelalte combinaţii de compuşi duble. Combinaţia de trei sau patru compuşi vindecă toate celulele replicon, iar tratamentele combinate suprimă nivelele de replicon ARN la limita de detecţie a testului.
Exemplul biologic 7: Rezistenţa încrucişată a Compusului 10 şi Compusului 6
Acest studiu a fost efectuat pentru a determina profilurile rezistenţei încrucişate in vitro ale Compusului 10 şi Compusului 6. Un grup de repliconi mutanţi ai VHC care poartă signatura mutaţiei S282T asociate cu rezistenţa VHC la inhibitorii nucleozidici ai polimerazei NS5B sau mai frecvent mutaţiile NS5A in vitro şi in vivo asociate cu rezistenţa VHC la medicament a fost investigat prin testul repliconului tranzitoriu pentru a determina dacă există o rezistenţă încrucişată între mutaţii ce conferă sensibilitate redusă la Compusul 10 sau Compusul 6. Nici o rezistenţă încrucişată nu s-a observat între aceşti compuşi cu repliconi mutanţi S282T rămaşi pe deplin sensibili la Compusul 6 şi mutanţi NS5A care nu prezintă sensibilitate redusă la Compusul 10.
Materiale şi metode
Reactivi
Compuşi
Compusul 6 şi Compusul 10 au fost sintetizaţi la Gilead Sciences, Inc. în Foster City, CA.
Linii celulare
Huh-lunet, o clonă Huh-7 care este extrem de permisivă pentru replicarea VHC, a fost obţinută de la ReBLikon GmbH (Mainz, Germania). Celulele Huh-lunet au fost menţinute în Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; GIBCO, Carlsbad, CA) suplimentat cu 10% de ser fetal bovin (FBS; Hyclone, Logan, UT). Celulele au fost menţinute la 37°C în incubatoare umidificate (85% umiditate) şi în atmosferă de 5% CO2.
PI-hRluc, un replicon bicistronic care codifică gena luciferazei Renilla în aval de genele nestructurale ale VHC de genotipul 1b (tulpina Con-1 şi polio IRES (NS3 - NS5B) în aval de EMCV IRES, a fost utilizat pentru studiile transfecţiei tranzitorii. Plasmida pPI-hRluc a fost generată din plasmida pFKI341 PI-Luc/NS3-3'/ET, care codifică un replicon subgenomic (tulpina Con-1) al genotipului 1b şi a fost obţinut de la ReBLikon (Friebe et al., J Virol 2001; 75 (24):12047-57). Gena hRluc a fost PCR amplificată din pF9 CMV hRluc neo Flexi(R) (Promega, Madison, WI) prin PCR folosind Accuprime Super Mix I (Invitrogen, Carlsbad, CA) şi primerii PV_Rluc_Top şi 3'-Rluc (Notl). Aceşti doi primeri au următoarele secvenţe şi transporta situsuri de restricţie pentru clonarea ulterioară: PV_Rluc_Top: 5' ATC AGA TTG CAA TAT CAT AAT GGC TTC CAA GGT GTA CG 3' (SEQ ID NR: 3); 3'-Rluc(Notl): 5' ACG TCA CTA TCT ACG CGG CCG CTT ACT GCT CGT TCT TC3′(sit Notl subliniat) (SEQ ID NR:4). Promotorul T7, 5'UTR şi Polio Virus IRES au fost PCR amplificaţi din plasmida pFKI341 PI-Luc/NS3-3'/ET utilizând primerii 5'-P7(SbfI) şi PV_Rluc_Bottom. Aceşti doi primeri au următoarele secvenţe şi transporta situsuri de restricţie pentru clonarea ulterioară: 5'-P7(SbfI): 5' GCT CAA AAG CTG CCT GCA GG T 3' (sit SbfI subliniat) (SEQ ID NR:5); PV_Rluc_Bottom: 5' CGT ACA CCT TGG AAG CCA TGA TTA TAC AAT TGT CTG AT (SEQ ID NR:6). Fragmentele PCR ulterioare din cele două reacţii de mai sus au fost apoi unite prin suprapunerea PCR şi primerilor 5'-P7(SbfI) şi 3'-Rluc(Notl). Produsul de amplificare completat P7-5'UTR-Polio Virus IRES-hRluc a fost subclonat în pCR2.1-TOPO. Plasmida rezultată a fost digerată cu Notl şi SbfI, iar fragmentul excizat (P7-5'UTR-Polio Virus IRES-hRluc) a fost ligat folosind ligaza ADN T4 în pFKI341 PI-Luc/NS3-3'/ET digerat cu acelelaşi enzime. Vectorul rezultat, pPI-hRluc, a fost secvenţializat pentru a confirma orientarea corectă şi secvenţa regiunii P75'UTR-Polio Virus IRES-hRluc a plasmidei.
Repliconii GT 1a şi 2a conţinând hRluc au fost descrişi anterior (Robinson M. et al. Novel hepatitis C virus reporter replicon cell lines enable efficient antiviral screening against genotype 1a. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2010, vol. 54, nr. 8, p. 3099-3106).
Repliconul PI-hRluc a fost utilizat ca o carcasă pentru construcţia himerei. O ştergere internă a fost efectuată în NS5B făcând-o deficientă la replicare. Ultimele perechi bazice 413 (care codifică ultimii aminoacizi 137 NS5A) de 1b-con-1 NS5A au fost sintetizate în cadrul secvenţelor NS5B din genotipurile 2b, 3a, 4a, 5a şi 6a (Genscript Inc. Piscataway NJ). Secvenţele consens NS5B pentru fiecare dintre aceste genotipuri au fost derivate prin alinierea secvenţelor depozitate în baza de date European HCV şi extragerea unui consens. Aceste secvenţe consens noi pentru NS5B, precum şi secvenţele derivate din izolate clinice individuale (Koleen J. Herlihy et al. Development of Intergenotypic Chimeric Replicons To Determine the Broad-Spectrum Antiviral Activities of Hepatitis C Virus Polymerase Inhibitors. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2008, vol. 52, nr. 10, p. 3523-3531) au fost utilizate pentru a construi repliconii himerici NS5B. Un sit Xhol unic a fost utilizat la capătul 5' şi un sit Asel unic la capătul 3' pentru a clona direcţional în vectorul 1b-hRLuc/NeoR NS5B prin tehnici standard de biologie moleculară.
Mutaţiile NS5B S282T au fost introduse în plasmidele replicon folosind setul de mutageneză QuikChange II XL în conformitate cu instrucţiunile producătorului (Stratagene, La Jolla, CA). Întregul replicon mutant a fost secvenat pentru a confirma prezenţa mutaţiei S282T şi absenţa oricăror mutaţii secundare.
Repliconii mutanţi NS5A au fost creaţi prin sintetizarea unei secvenţe care codifică primii 149 aminoacizi ai NS5A conţinând mutaţia dorită flancată de un sit 5' şi respectiv, 3' BsrGI şi EcoRI (Genscript, Piscataway, NJ). Fragmentele sintetizate au fost apoi clonate prin tehnici standard de biologie moleculară într-o plasmidă replicon 1a Rluc modificată pentru a permite clonarea în situri de restricţie BsrGI şi EcoRI unice. Mutaţiile au fost confirmate prin secvenarea ADN-ului.
Repliconii au fost liniarizaţi folosind următoarele enzime: Spe I (repliconi pe baza 1b PI-Rluc), Hpa I (repliconi pe baza 1a-Rluc) şi Xbal/Hpal (repliconul 2a Rluc). ARN replicon au fost transcrişi in vitro din plasmide care codifică repliconii utilizând un set de transcriere vitro Ribomax T7 (Promega; Madison, WI), după care a urmat purificarea utilizând o coloană RNAeasy (Qiagen; Valencia, CA).
Teste
Determinarea sensibilităţii la medicament utilizând Testul de determinare a repliconului transfecţiei tranzitorii
ARN-ul a fost transfectat în celule Huh-lunet folosind metoda lui Lohmann et al. (Lohmann V et al. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science, 1999, vol. 285, nr. 5424, p. 110-113). Pe scurt, celulele au fost tripsinizate şi spălate de două ori cu PBS. O suspensie de 4 x 106 celule în 400 µL de PBS au fost amestecate cu 5 µg de ARN şi supusă la electroporare folosind setările de 960 µF şi 270 V. Celulele au fost transferate în 40 mL de mediu de cultură preîncălzit şi apoi însămânţate în planşete cu 96 sau 384 de godeuri. Compuşii au fost diluaţi în serie de 3 ori în 100% DMSO şi adăugaţi la celule pentru a obţine o concentraţie finală de DMSO de 0,5%. Celulele au fost tratate timp de trei zile, după care mediul de cultură a fost eliminat, celulele au fost lizate, iar activitatea luciferazei Renilla a fost cuantificată folosind reactivi disponibili comercial (Promega) şi un instrument Victor sau Envision (Perkin Elmer, Waltham, MA).
Analiza datelor
Datele au fost convertite în procentaje faţă de controalele netratate (definite ca 100%), iar valorile EC50 au fost calculate prin regresia neliniară a două seturi de date replicate folosind software-ul GraphPad Prism sau Pipeline Pilot. Modificările multiple ale rezistenţei au fost calculate ca raport dintre EC50 a repliconului salbatic şi mutant.
Rezultate
Activitatea Compusului 10 şi Compusului 6 împotriva S282T
Selecţia rezistenţei in vitro anterioară cu Compusul 10 a identificat în mod constant S282T în NS5B ca mutaţie primară în mai multe genotipuri (GT 1b, 1a şi 2a). Mutaţia S282T NS5B a fost introdusă ulterior în repliconii primari GT 1a, 1b şi 2a şi repliconii himerici conţinând o secvenţă NS5B 2b, 3a sau 4a clonată într-o carcasă GT1b. Sensibilitatea la Compusul 10, Compusul 6 şi ribavirină (RBV) a fost evaluată utilizând un test de replicare tranzitorie. Mutaţia S282T a prezentat o sensibilitate redusă la Compusul 10 cu valori EC50 în toate cele cinci genotipuri în limitele de la 117,1 nM până la 346,1 nM. Creşterea multiplă a EC50 pentru S282T a variat de la 2,4 până la 16,0 comparativ cu tipul sălbatic de la genotipurile corespunzătoare care demonstrează sensibilitatea scăzută a repliconului la Compusul 10 cand mutaţia S282T NS5B este prezentă.
Pentru repliconul de tip sălbatic, valorile EC50 pentru RBV au fost, de asemenea, similare în cele cinci genotipuri testate cu cea mai mică EC50 împotriva GT 2b. Interesant, valorile EC50 pentru repliconii S282T au fost de 5 până la 10 ori mai sensibili la tratamentul cu RBV decât tipul lor sălbatic corespunzător pentru toate cele cinci genotipuri. Nu au fost observate diferenţe semnificative în EC50 de Compus 6 între repliconii S282T şi de tip sălbatic indicând că această mutaţie nu alterează sensibilitatea la Compusul 6. În concluzie, în timp ce repliconul S282T a conferit sensibilitate redusă la Compusul 10, repliconul mutant a demonstrat sensibilitate sălbatică la Compusul 6 şi o sensibilitate crescută la inhibarea prin RBV a celui de tip sălbatic.
Tabelul 7.1. Activitatea antivirală a Compusului 10 şi RBV împotriva repliconului mutant S282T şi de tip sălbatic de GT1b, 2a, 2b, 3a şi 4a
Replicon Compusul 10 RBV Compusul 6 EC50 nMa Modificarea conformaţionalăb EC50 nMa Modificarea conformaţionalăb EC50 nMa Modificarea conformaţionalăb WT S282T TS S282T TS S282T GT1b 21,5 189,2 8,8 6,6 1,6 0,2 0,5 0,4 0,8 GT2a 146,8 346,1 2,4 8,3 0,6 0,1 5165 2336 0,5 GT2b 13,3 215,6 16,2 2,6 0,6 0,2 0,5 0,5 0,9 GT3a 33,9 117,1 3,5 6,7 1,0 0,2 0,4 0,2 0,6 GT4a 35,8 217,5 6,1 6,2 0,6 0,1 0,5 0,4 0,8
a EC50 indică media pentru două sau mai multe experimente independente.
b Modoficarea conformaţională de la tipul sălbatic corespunzător.
Activitatea Compusului 10 şi Compusului 6 împotriva repliconilor mutanţi NS5A
Pentru a determina dacă mutaţiile NS5A rezistente la medicamente sunt rezistente încrucişat la Compusul 10, un grup de repliconi mutanţi NS5A a fost testat pentru sensibilitatea atît la Compusul 6, câr şi la Compusul 10. Toţi cei şapte repliconi mutanţi NS5A au demonstrat o sensibilitate redusă la Compusul 6 cu o creştere a EC50 de la 25 până la 3029 de ori. În contrast, nu s-a observat nici o schimbare semnificativă în EC50 pentru repliconii mutanţi NS5A la Compusul 10 sau la un control cu RBV.
Tabelul 7.2. Activitatea in vitro a Compusului 10 sau Compusului 6 împotriva repliconilor mutanţi NS5A în genotipul 1a
Compus Modificarea conformaţională a EC50 (EC50 DRM / EC501a-H77) M28T Q30H Q30R Q30E L31M Y93C Y93H Compusul 6 25 73 170 997 140 327 3029 Compusul 10 0,9 1,0 0,8 1,0 1,1 ND 0,7 RBV 0,4 0,7 0,8 0,8 0,5 1,0
Concluzii
În acest exemplu, profilurile de rezistenţă încrucişată ale Compusului 10 şi Compusului 6 au fost evaluate utilizând repliconi VHC tranzitorii care codifică mutaţiile rezistente cunoscute în NS5A şi NS5B care conferă sensibilitate redusă la Compusul 6 şi Compusul 10, respectiv. Repliconii NS5B S282T au conferit sensibilitate redusă la Compusul 10, în timp ce nu au existat diferenţe semnificative în EC50 a Compusului 6 măsurată de la repliconii sălbatic şi S282T. Reciproc, mutaţiile ce conferă sensibilitate redusă la Compusul 6 au rămas sensibile la tratamentul cu Compusul 10.
În general, aceste rezultate indică faptul că mutaţiile de rezistenţă pentru Compusul 10 şi Compusul 6 nu demonstrează rezistenţă încrucişată şi susţin utilizarea acestor compuşi în terapia combinată viitoare pentru tratamentul VHC.
Exemplul biologic 8: Activitatea combinată
Datele studiului combinat al Compusului 10 cu inhibitorul NS5A Compusul 6, inhibitorii non-nucleozidici Compusul 1 sau Compusul 5, inhibitorul proteazei Compusul 3 sau ribavirină (RBV) sunt prezentate pentru un test in vitro de replicon care ramane standard pentru evaluarea activităţii antivirale pe baza celulelor a inhibitorilor VHC. Aceste rezultate au indicat faptul că Compusul 10 are activitate antivirală aditivă când este combinat cu Compusul 6, Compusul 1, Compusul 5 sau Compusul 3. Suplimentar, Compusul 10 a demonstrat sinergie minoră în combinaţie cu RBV in vitro.
Materiale şi metode
Linia celulară şi cultura celulară
Linia de celule replicon ale genotipului 1a VHC utilizată în acest studiu a fost descrisă anterior (Robinson M. et al. Novel hepatitis C virus reporter replicon cell lines enable efficient antiviral screening against genotype 1a. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2010, vol. 54, nr. 8, p. 3099-3106). Celulele au fost crescute în mediu de cultură celulară conţinând Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) cu GlutaMAX (Gibco, Carlsbad, CA, Cat#10569-044), suplimentat cu 10% FBS (HyClone, Logan, UT, Cat#SH30071.03), 100 unităţi/mL penicilină, 100 µg/mL streptomicină (Gibco, Carlsbad, CA, Cat#15140-122) şi 0,1 mM aminoacizi neesenţiali (Gibco, Carlsbad, CA, Cat#11140-050). Celulele replicon au fost menţinute în 0,5 mg/mL geneticină (Invitrogen, Carlsbad, CA, Cat#10131-035) pentru a preveni pierderea repliconului VHC. Celulele au fost reînsămânţate la fiecare 3-4 zile înainte de a ajunge la confluenţă.
Test cu repliconi ai VHC pentru determinările EC50, CC50 şi studii combinate
Toţi compuşii au fost furnizaţi în 100% DMSO. Diluţiile seriale de compuşi au fost efectuate în 100% DMSO. Toate diluţii seriale au fost efectuate în planşete de polipropilenă cu 384 de godeuri (Thermo Scientific, Hudson, NH, Cat#4341) utilizând o Biomek FX Workstation. Pentru determinările EC50 şi CC50, compuşii de testat au fost diluaţi în serie în zece etape de 1:3 diluţii în coloanele 3-20 ale planşetelor cu 384 de godeuri. Pentru studiile combinaţionale, un compus a fost diluat în serie în nouă etape de 1:2 diluţii în direcţia orizontală cu alt compus diluat în serie în şapte etape de 1:2 diluţii în direcţia verticală. Aceasta a realizat un set definit de diferite concentraţii şi rapoarte medicamentoase. Pentru fiecare medicament individual, valoarea EC50 a fost selectată ca punctul median pentru intervalul de concentraţii testat. Toate diluţiile seriale au fost efectuate în patru copii per compus în aceeaşi planşetă cu 384 de godeuri. 100% DMSO s-a adăugat în coloana 1-2 a fiecărei planşete cu 384 de godeuri cu diluţie în serie. Un inhibitor al proteazei VHC ITMN-191 la 100 µM s-a adăugat în coloana 23 ca un control al 100% inhibiţie a replicării VHC în timp ce puromicină la 10 mM s-a adăugat în coloana 24 ca un control al 100% citotoxicitate.
La fiecare godeu al unei planşete de polistiren negru cu 384 de godeuri (Greiner Bio-one, Monroe, NC, Cat#781086, cultură celulară tratată), 90 µL de mediu de cultură celulară (fără geneticină) conţinând 2000 de celule replicon VHC suspendate s-au adăugat cu o Biotek µFlow Workstation. Pentru transferul compusului în planşete de cultură celulară, 0,4 µL de soluţie de compus de la planşeta cu diluţie serială a compusului s-a transferat la planşeta de cultură celulară pe o Biomek FX Workstation. Concentraţia de DMSO în godeurile analitice finale a fost de 0,44%. Planşetele au fost incubate timp de 3 zile la 37°C cu 5% CO2 şi 85% umiditate.
Testul cu repliconi ai VHC a fost un test multiplex care poate evalua atât citotoxicitatea, cât şi activitatea anti-replicon din acelaşi godeu. Testul CC50 a fost efectuat primul. Mediile din planşeta de cultură celulară cu 384 godeuri au fost aspirate şi godeurile au fost spălate de patru ori cu 100 µL 1 X PBS fiecare, folosind un dispozitiv de spălat planşetele Biotek ELx405. Un volum de 50 µL de o soluţie conţinând 400 nM calceină AM (AnaSpec, Fremont, CA, Cat# 5200-056) în 1 X PBS s-a adăugat la fiecare godeu al planşetei cu o Biotek µFlow Workstation. Planşeeta s-a incubat timp de 30 minute la temperatura camerei înainte de măsurarea semnalului de fluorescenţă (excitaţie 490 nm, emisie 520 nm) cu un spectrofotometru pt. citirea planşetelor Perkin Elmer Envision.
Testul EC50 a fost efectuat în aceleaşi godeuri ca testul CC50. Soluţia de calceină-PBS în planşeta de cultură celulară cu 384 de godeuri a fost aspirată cu un dispozitiv de spălat planşetele Biotek ELx405. Un volum de 20 µL de tampon luciferază Dual-Glo (Promega, Madison, WI, Cat#E298B) s-a adăugat la fiecare godeu al planşetei cu oBiotek µFlow Workstation. Planşeta s-a incubat timp de 10 minute la temperatura camerei. Un volum de 20 µL de soluţie conţinând 1:100 amestec de substrat Dual-Glo Stop & Glo (Promega, Madison, WI, Cat#E313B) şi tampon Dual-Glo Stop & Glo (Promega, Madison, WI, Cat#E314B) s-a adăugat apoi la fiecare godeu al planşeetei cu o Biotek µFlow Workstation. Planşeta s-a incubat apoi la temperatura camerei timp de 10 minute înainte de măsurarea semnalului de luminiscenţă cu un spectrofotometru pt. citirea planşetelor Perkin Elmer Envision.
Analiza datelor
Efectul citotoxicităţii a fost determinat prin conversia calceinei AM în produs fluorescent. Citotoxicitatea procentuală a fost calculată prin ecuaţia 1:
% citotoxicitate sau % inhibiţie = (1)
unde XC este semnalul de fluorescenţă din godeul tratat cu compus; MB este semnalul de fluorescenţă medie din godeurile tratate cu puromicină; MD este semnalul de fluorescenţă medie din godeurile tratate cu DMSO. Activitatea de replicare anti-VHC a fost determinată de semnalul de luminescenţă generat de luciferaza renilla reporter a repliconului VHC. Inhibarea procentuală pe repliconul VHC a fost calculată folosind ecuaţia 1, unde XC este semnalul de luminiscenţă din godeul tratat cu compus; MB este semnalul de luminescenţă medie din godeurile tratate cu ITMN-191; MD este semnalul de luminiscenţă medie din godeurile tratate cu DMSO.
Valorile CC50 au fost determinate ca fiind concentraţia compusului de testare care a produs o scădere de 50% a viabilităţii celulare. Valorile EC50 au fost determinate ca fiind concentraţia compusului de testare care a produs o scădere de 50% a replicării VHC. Atât valorile CC50, cât şi valorile EC50 au fost obţinute utilizând pachetul software Pipeline Ppilot 5.0 (Accelrys, San Diego, CA) prin ajustarea regresiei neliniare a datelor experimentale la ecuaţia 2:
(2)
unde y este inhibarea % observată a repliconului VHC la concentraţia x a compusului; d este răspunsul estimat la concentraţia zero a compusului; a este răspunsul estimat la concentraţia infinită a compusului; c este concentraţia medie (CC50 sau EC50); b este coeficientul de înclinare Hill.
Datele experimentale ale studiului combinat au fost analizate cu ajutorul programului MacSynergy II dezvoltat de Prichard şi Shipman (Prichard MN, Aseltine KR, Shipman C, Jr. MacSynergyTM II, Version 1.0. University of Michigan, Ann Arbor, Michigan, 1993). Software-ul (MacSynergyTM II, University of Michigan, MI) calculează inhibarea teoretică presupunând o interacţiune aditivă între medicamente (pe baza modelului Bliss Independence) şi cuantifică diferenţele statistic semnificative între valorile inhibiţiei teoretice şi observate. Trasarea grafică a acestor diferenţe în trei dimensiuni rezultă într-o suprafaţă în care creşterile în planul Z reprezintă sinergia antivirală, iar scăderile reprezintă antagonismul antiviral între compuşi. Volumele calculate ale deviaţiilor de suprafaţă sunt exprimate în µM2%. Per Prichard şi Shipman, efectelee combinate sunt definite ca:
- Sinergie puternică: > 100 µM2%
- Sinergie moderată: > 50 ≤ 100 µM2%
- Sinergie minoră: > 25 şi ≤ 50 µM2%
- Aditivitate: ≤ 25 şi > -25 µM2%
- Antagonism minor: ≤ -25 şi > -50 µM2%
- Antagonism moderat: ≤ -50 şi > -100 µM2%
- Antagonism puternic: ≤ -100 µM2%
Pentru fiecare studiu combinat, trei experimente independente au fost efectuate cu patru exemplare identice în fiecare experiment.
Rezultate
Activitatea antivirală şi citotoxicitatea compuşilor individuali în testul cu repliconi ai genotipului VHC 1a
Activitatea anti-VHC şi citotoxicitatea Compusului 10 combinat cu alţi compuşi anti-VHC au fost testate în celule Huh-7 purtând un replicon al VHC de genotipul 1a. Valorile EC50 şi CC50 pentru toţi compuşii sunt listate în Tabelul următor. Nu există nici o citotoxicitate semnificativă observată pentru toţi compuşii individuali până la cele mai mari concentraţii testate în testul combinat.
Tabelul 8.1. EC50 şi CC50 ale Compuşilor utilizaţi în acest studiu împotriva repliconului VHC de genotipul 1a
Compuşi Clasa EC50 a (nM) CC50 a (nM) Compusul 10 Promedicament nucleozidic al NS5B 39 >82446 Compusul 6 Inhibitor al NS5A 0.032 >44400 Compusul 1 Inhibitor non-nucleozidic al NS5B 18 >44400 Compusul 5 Inhibitor non-nucleozidic al NS5B 14 >44400 Compusul 3 Inhibitor al proteazei NS3 46 >22200 RBV Analog nucleozidic 33626 >88800
a Valorile sunt medii geometrice pentru trei sau mai multe experimente independente
Activitatea antivirală şi citotoxicitatea Compusului 10 în combinaţie cu alte clase de medicamente anti-VHC.
Efectele antivirale ale Compusului 10 în combinaţie cu alţi compuşi anti-VHC au fost evaluate cu ajutorulrepliconului VHC de genotipul 1a. Rezultatele au fost analizate cu ajutorul MacSynergy II, care prevede diagrame de suprafaţă care prezintă devieri semnificative de la aditivitate. Volumele de sinergie şi antagonism (µM2%), calculate din devierile de la suprafaţa aditivă, sunt prezentate în Tabelul următor. La un interval de încredere de 95%, volumele medii de sinergie şi antagonism au fost între 25 şi -25 µM2% atunci când Compusul 10 a fost combinat cu Compusul 6, Compusul 1, Compusul 5 sau Compusul 3 indicând interacţiunea aditivă cu Compusul 10. Mai mult decât atât, Compusul 10 prezintă un volum de sinergie în intervalul de 25 până la 50 µM2% atunci când este combinat cu RBV, sugerând o interacţiune sinergică minoră. În studiile combinate utilizând antivirale cu acţiune directă cu Compusul 10, viabilitatea celulară a fost mai mare de 93% la cele mai mari concentraţii de combinaţii de compuşi testaţi în timp ce studiile care analizează efectele combinate ale Compusului 10 şi RBV au demonstrat viabilitate celulară mai mare de 85% la cele mai mari concentraţii de medicamente combinate.
Tabelul 8.2. Cuantificarea antagonismului şi sinergiei antivirale şi interacţiunile medicameentelor pentru combinaţiile de medicamente cu Compusul 10
Compusul utilizat în combinaţie cu Compusul 10 Clasa Volumul de sinergie (nM2)a Volumul de antagonism (nM2)a Interacţiunea Compusul 6 Inhibitor al NS5A 3,3 ± 4,2 -7,7 ± 13,3 Aditivă Compusul 1 Inhibitor non-nucleozidic al NS5B 4,7 ± 8,1 -11,7 ± 10,0 Aditivă Compusul 5 Inhibitor non-nucleozidic al NS5B 1,3 ± 2,3 -5,7 ± 9,0 Aditivă Compusul 3 Inhibitor al proteazei NS3 1,0 ± 1,7 -3,0 ± 4,4 Aditivă RBV Analog nucleozidic 35,3 ± 3,2 -2,0 ± 2,0 Sinergie minoră
a Valorile reprezintă deviaţia medie ± standardă a trei experimente independente efectuate în patru exemplare
Tabelul 8.3. Cuantificarea citotoxicităţii în combinaţiile de compuşi
Compusul utilizat în combinaţie cu Compusul 10 Cea mai mare concentraţie a Compusului utilizat cu cea mai mare concentraţie (320 nM) a Compusului 10 Citotoxicitatea la cea mai mare concentraţie a combinaţiilor de compuşi (inhibiţia % asupra creşterii celulelor) Compusul 6 0,16 nM 5,0 + 5,0 Compusul 1 120 nM 7,0 + 4,6 Compusul 5 64 nM 4,3 + 2,9 Compusul 3 240 nM 2,0 + 3,5 RBV 16000 nM 14,0 + 4,4
a Valorile reprezintă deviaţia medie ± standard a trei experimente independente efectuate în patru exemplare
Concluzii
Activitatea antivirală a Compusului 10 a fost testată în combinaţie cu Compusul 6, Compusul 1, Compusul 5, Compusul 3 sau RBV. Compusul 10 a demonstrat o activitate antivirală aditivă în combinaţie cu Compusul 6, Compusul 1, Compusul 5 sau Compusul 3 şi sinergie minoră cu RBV.
Pe scurt, aceste rezultate susţin potenţialul Compusului 10 de a fi utilizat în combinaţie cu Compusul 6, Compusul 1, Compusul 5, Compusul 3 sau RBV pentru a realiza suprimarea virală îmbunătăţită fără a reduce eficacitatea oricărei dintre medicamentele individuale.
Exemplul clinic 1: Testarea clinica a activităţii anti-VHC a combinaţiei de Compus 1 şi Compus 2
Acest Exemplu Clinic arată că o combinaţie de Compus 1 şi Compus 2 plus ribavirină este mai eficace în reducerea încărcăturii virale VHC şi suprimarea recăderii virale VHC, decât o combinaţie de Compus 1 şi Compus 2 fără ribavirină.
Schema studiului clinic:
Un studiu de faza 2 randomizat, deschis al Compusului 2 plus Compusul 1 singur şi în combinaţie cu ribavirina timp de 28 de zile la subiecţi cu infecţia cronică VHC genotipul 1 netrataţi anterior. Subiecţilor din Braţul 1 li s-a administrat Compusul 2 la 75 mg + Compusul 1 la 40 mg, ambii administraţi de două ori pe zi (BID) (schemă dublă) şi subiecţilor din Braţul 2 li s-a administrat Compusul 2 la 75 mg + Compusul 1 la 40 mg, ambii administraţi de două ori, şi plus ribavirina, de asemenea, administrată BID (schemă triplă) timp de 28 de zile.
În Ziua 28, la toţi subiecţii s-a iniţiat administrarea PEG/ribavirinei. În plus, protocolul numit pentru subiecţii cu un răspuns virusologic insuficient (reducerea < 2 log10 UI/mL din ARN VHC iniţial la Ziua 5) sau recidivă virologică (creşterea ARN VHC de > 0,5 log10 UI/mL din nivelul inferior a confirmat peste două momente de timp care apar după Ziua 5 cu o valoare absolută > 1000 UI/mL) pentru a iniţia administrarea PEG/RIBA înainte de Ziua 28.
Pentru subiecţii cu răspuns virologic insuficient, administrarea combinaţiei de interferon pegilat (PEG) şi ribavirină (RIBA) a fost iniţiată înainte de Ziua 28 cu sau fără continuarea administrării Compusului 2 + Compusul 1. Drept rezultat, până la Ziua 28 a studiului, subiecţii au primit unul din cele patru tratamente:
Compus 2 + Compus 1,
Compus 2 + Compus 1 + RIBA,
Compus 2 + Compus 1 + PEG/RIBA, sau
PEG/RIBA.
Un total de 31 de subiecti au fost inrolati şi dozarea a inceput (16 subiecţi au primit o schemă dublă în Braţul 1 şi 15 subiecţi au primit o schemă triplă în Braţul 2). Datele demografice preliminare ale subiecţilor şi caracteristicile de bază (Tabelul XVI) au fost în general comparabile între Braţele 1 şi 2, în afară de un număr mai mare de subiecţi cu genotipul 1b din Braţul 2. Patru subiecţi au fost identificaţi ca având VHC de genotipul 1b la examinare (un subiect pe schema dublă şi trei subiecţi pe schema triplă), dar nu au fost confirmaţi ca având genotipul 1a sau 1b la o analiză mai aprofundată, cu continuarea evaluării suplimentare.
Nici un subiect nu s-au prezentat cu evenimente adverse grave. Medicamentele de studiu au fost in general bine tolerate, cu toate evenimentele adverse fiind de gradul 1-2 în severitate, cu excepţia oboselii de gradul 3, care a fost singurul eveniment advers emergent din tratament care a condus la întreruperea administrării medicamentului de studiu. Înainte de iniţierea administrării PEG/ribavirinei, cele mai frecvente evenimente adverse emergente din tratament care au apărut la mai mult de un subiect au fost cefalee (n=5) şi diaree sau greaţă (n=3 fiecare) în Braţul 1 şi cefalee (n=7), diaree sau oboseală (n=3 fiecare), greaţă, astenie, prurit sau insomnie (n=2 fiecare) în Braţul 2. Când Compusul 2 + Compusul 1 s-au administrat în combinaţie cu PEG/RIBA, singurele evenimente adverse care au apărut la mai mult de un subiect au fost boli asemanatoare gripei (n=5) şi mialgie (n=3), ambele evenimente adverse comune cu terapia PEG/RIBA. În ceea ce priveşte anomaliile de laborator, nu au existat evenimente de Gradul 4 în timpul perioadei de tratament de 28 de zile. Printre subiecţii care au primit medicamente de studiu, au existat două cresteri de Gradul 3 emergente din tratament ale bilirubinei totale în ribavirina din Braţul 2 (care au apărut în Ziua 7, dar rezolvate cu dozarea continuată a medicamentului de studiu). Au fost, de asemenea, 2 creşteri de Gradul 1 şi o singură creştere de Gradul 2 a bilirubinei totale printre alţi subiecţi din acest Braţ de dozare (cu ribavirină). Printre subiecţii din Braţul - 1 (fără ribavirină), au existat patru creşteri de Gradul 1 ale bilirubinei totale. Valorile ALT s-au redus cu aproximativ 40 U/L de la valoarea iniţiala in ambele brate până la Ziua 14. Mediana QTcF nu s-a modificat semnificativ de la valoarea iniţială în fiecare braţ de studiu şi nici un subiect nu a intrerupt administrarea medicamentelor de studiu din cauza anomaliilor QTc. Datele de siguranţă preliminare sunt prezentate în Tabelul XVIII.
ARN VHC plasmatic a fost monitorizat de aproximativ doua ori pe săptămână pentru a evalua răspunsul virusologic în raport cu criteriile specificate în protocol pentru iniţierea precoce a PEG/RIBA. Din analiză preliminară a valorilor ARN VHC, declinul maximal median al ARN VHC a fost de 3,9 log10 UI/mL pentru schema dublă şi 5,0 log10 UI/mL pentru schema triplă. Timpul median de scădere maximă a ARN VHC a fost de 7 zile pentru schema dublă şi 14 zile pentru schema triplă, cu diferenţa atribuită incidenţei întârziate şi debutulului progresiei virale în braţul care conţine ribavirină. Trei din 15 (20%) subiecţi care au primit schema dublă şi 10 din 13 (77%) subiectii care au primit schema triplă au avut valori inferioare ale ARN VHC ≤ 30 UI/mL (cu excepţia subiecţilor non-GT1). 13/16 (81%) subiecţi care au primit Compusul 2/Compusul 1 şi 6/15 (40%) subiecţi care au primit Compusul 2/Compusul1/Ribavirină au iniţiat administrarea PEG sau PEG/ribavirinei înainte de începerea programată in Ziua 28 a studiului. Detalii suplimentare ale rezultatelor virologice sunt prevăzute în:
Rezultate. Compusul 2 + Compusul 1 singur şi în combinaţie cu RIBA au fost bine toleraţi până la 28 zile de subiecţii cu VHC în acest studiu, atât înainte cât şi după adăugarea PEG sau PEG/ribavirinei. Ambele regimuri au produs supresiunea puternică a ARN VHC, cu activitate mai mare şi mai susţinută în trei scheme de tratament medicamentos.
Tabelul XVI Datele demografice preliminare şi caracteristicile de bază
Braţul #1 Compusul 2 la 75 mg BID + Compusul 1 la 40 mg BID (n=16) Braţul #2: Compusul 2 la 75 mg BID + Compusul 1 la 40 mg BID + RIBA (n=15) Vârsta în ani - Medie 47 (30,66) 55 (27, 63) Sex 14 masculin 2 feminin 11 masculin 4 feminin Etnicitate 16 non-ispanic/Latino 15 non-ispanic/Latino Rasă 13 albă 2 neagră 1 asiatică 13 albă 2 neagră 0 asiatică Greutatea corporală iniţială în kg - Medie 86,1 (57,8, 110,5) 79,0 (51, 127,5) BMI iniţial în kg/M2 - Medie 27,1 (21,5, 34,1) 24,7 (19,9, 37,6) Log10 RNA VHC iniţial (IU/mL) din Lab central- Mediu Lab central 6,17 (5,25, 7,26) 6,34 (5,41, 7,19) Genotipul VHC iniţial 8 1a 8 1b 3 1a 12 1b
Tabelul XVII Rezultatele preliminare privind siguranţa
Braţul 1: Compusul 2 la 75 mg BID + Compusul 1 la 40 mg BID (n=16) Braţul 2: Compusul 2 la 75 mg BID + Compusul 1 la 40 mg BID + RIBA (n=15) Evenimente adverse de Gradul 3 (EA): Oboseală 1 0 Gradul 1/Gradul 2 (EA): Cefalee Diaree Greaţă Oboseală Astenie Prurit Insomnie 5 (31%) 3 (19%) 3 (19%) 0 0 1 (6%) 0 7 (47%) 3 (20%) 2 (13%) 3 (20%) 2 (13%) 2 (13%) 2 (13%) Anomalii de baborator de Gradul 3: Bilirubină 0 2 Anomalii de baborator de Gradul 1/Gradul 2: Bilirubină Hemoglobină Glucoză (nu pe stomacul gol) 4 0 8 3 2 5
Tabelul XVIII Rezultate virologice preliminare
Braţul 1: Compusul 2 la 75 mg BID + Compusul 1 la 40 mg BID (n=16) Braţul 1: Compusul 2 la 75 mg BID + Compusul 1 la 40 mg BID GT1 neconfirmat Subiecţii excluşi (n=15)* Braţul 2: Compusul 2 la 75 mg BID + Compusul 1 la 40 mg BID + Ribavirină (n=15) Braţul 2: Compusul 2 la 75 mg BID + Compusul 1 la 40 mg BID + Ribavirină GT1 neconfirmat Subiecţii excluşi (n=13) Scăderea mediană maximă a RNA VHC Scăderea medie maximă a RNA VHC -3.9 log10 UI/mL -3.4 log10 UI/mL -4.0 log10 UI/mL -3.6 log10 UI/mL -5.0 log10 UI/mL -4.5 log10 UI/mL -5.0 log10 UI/mL -4.9 log10 UI/mL Timpul mediu până la progresie 16 zile 16 zile 23 zile 23 zile Subiecţii cu un nivel inferior al RNA VHC <50 UI/mL 3/16 (19%) 3/15 (20%) 10/15 (63%) 10/13 (77%) Subiecţii cu progresie** 12 (75%) 12/15 (80%) 6/15 (40%) 6/13 (46%) Răspunsul în Ziua 28: RVR la < 25 UI/mL RVR la < 50 UI/mL 1/16 (6%) 1/16 (6%) 1/15 (7%) 1/15 (7%) 5/15 (33%) 6/15 (40%) 5/13 (38%) 6/13 (46%)
* GT1 este o abreviere pentru VHC de genotipul 1.
Subiecţii 1011, 1012 şi 1043 la un Centru de studiu francez au fost excluşi;
Subiectul 1004 nu a fost exclus
** Progresia definită ca creştere > 1 log a valorii inferioare a ARN VHC menţionate mai sus sau ARN VHC > 25 UI/mL, după un nivel inferior de < 25 UI/mL
Datele prezentate în Tabelul XVIII arată că a existat o scădere de aproximativ 10 ori mai mare atât a nivelului median maxim de ARN VHC, cât şi nivelul mediu maxim de ARN VHC ca răspuns la combinaţia de Compus 2 + Compus 1 în prezenţa ribavirinei comparativ cu lipsa ribavirinei. De asemenea, numărul de subiecţi de studiu având un nivel inferior de ARN VHC sub 50 UI/mL este mai mare în prezenţa ribavirinei decât în absenţa ribavirinei. Aceste rezultate arată că ribavirina, în absenţa interferonului, potenţează în mod semnificativ activitatea antivirală a combinaţiei de Compus 1 şi Compus 2.
În plus, timpul mediu până la progresia VHC, care este o măsură a creşterii eventualde a încărcăturii virale VHC deoarece virusul mutează şi devine mai puţin sensibil la medicamentele antivirale, este mai mare în prezenţa ribavirinei decât în absenţa ribavirinei. Mai mult decât atât, numărul de subiecţi care prezintă progresia virală este substanţial mai mic în prezenţa ribavirinei decât în absenţa ribavirinei. Aceste rezultate arată că virusul VHC este mai puţin capabil să dezvolte rezistenţă la combinaţia de Compus 1 şi Compus 2 în prezenţa ribavirinei.
Mai mult, datele prezentate în Tabelul XVIII arată că numărul de pacienţi care au obţinut un răspuns virologic rapid (RVR) în prezenţa ribavirinei este semnificativ mai mare decât în absenţa ribavirinei. Atingerea RVR corelează pozitiv cu vindecarea infecţiei VHC.
Luate împreună datele prezentate în Tabelul XVIII arată că o combinaţie a Compusului 1, Compusului 2 şi ribavirinei produce o reducere rapidă şi semnificativă clinic a incarcaturii virale VHC, cu o recădere virală redusă, chiar şi în absenţa administrării interferonului.
Deşi exemplele de realizare specifice ale prezentei invenţii sunt ilustrate aici şi descrise în detaliu, invenţia nu este limitată la acestea. Descrierile detaliate de mai sus sunt oferite ca exemplu de realizare a prezentei invenţii şi nu trebuie să fie construite ca reprezentând orice limitare a invenţiei. Modificările vor fi evidente pentru specialiştii în domeniu, iar toate modificările care nu se îndepărtează de esenţa invenţiei sunt destinate a fi incluse în domeniul de aplicare al revendicărilor anexate.
1. US 7964580 B2 2011.06.21
2. US 2010298257 A1 2010.11.25

Claims (9)

1. Compoziţie care conţine: 1) compusul 10 (10) sau o sare farmaceutic acceptabilă a acestuia şi 2) compusul 6 (6) sau o sare farmaceutic acceptabilă a acestuia.
2. Compoziţie conform revendicării 1, care conţine suplimentar compusul 5 (5) sau o sare farmaceutic acceptabilă a acestuia.
3. Compoziţie conform revendicării 1 sau 2, care conţine suplimentar unul sau mai mulţi diluanţi sau purtători farmaceutic acceptabili.
4. Compoziţie conform revendicării 3, care este formulată ca o formă medicamentoasă standardizată pentru administrare o dată pe zi.
5. Compoziţie conform revendicării 3 sau 4, care este formulată pentru administrare orală.
6. Compoziţie conform revendicării 5, care este formulată ca tabletă.
7. Compoziţie, astfel cum este descrisă în oricare dintre revendicările 1-6, pentru utilizare în tratamentul profilactic sau terapeutic al unei infecţii VHC.
8. Compoziţie utilizată conform revendicării 7, care nu este destinată administrării cu un interferon.
9. Compoziţie utilizată conform revendicării 7 sau 8, care este destinată administrării cu ribavirină.
MDA20140035A 2011-09-16 2012-09-14 Compoziţie farmaceutică cu conţinut de sofosbuvir şi utilizarea acesteia în tratamentul hepatitei virale C MD4589C1 (ro)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161535885P 2011-09-16 2011-09-16
US201161561753P 2011-11-18 2011-11-18
PCT/US2012/055621 WO2013040492A2 (en) 2011-09-16 2012-09-14 Methods for treating hcv

Publications (3)

Publication Number Publication Date
MD20140035A2 MD20140035A2 (ro) 2014-08-31
MD4589B1 MD4589B1 (ro) 2018-08-31
MD4589C1 true MD4589C1 (ro) 2019-03-31

Family

ID=46970425

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MDA20140035A MD4589C1 (ro) 2011-09-16 2012-09-14 Compoziţie farmaceutică cu conţinut de sofosbuvir şi utilizarea acesteia în tratamentul hepatitei virale C

Country Status (38)

Country Link
US (3) US9393256B2 (ro)
EP (1) EP2709613B2 (ro)
JP (2) JP6073897B2 (ro)
KR (2) KR101991298B1 (ro)
CN (2) CN106166160A (ro)
AP (1) AP2014007575A0 (ro)
AU (1) AU2012308295B2 (ro)
BR (1) BR112014006324B8 (ro)
CA (1) CA2840242C (ro)
CL (1) CL2014000630A1 (ro)
CO (1) CO6930366A2 (ro)
CR (1) CR20140177A (ro)
CY (1) CY1119896T1 (ro)
DE (2) DE202012013074U1 (ro)
DK (1) DK2709613T4 (ro)
EA (1) EA026667B9 (ro)
EC (1) ECSP14013312A (ro)
ES (1) ES2659216T5 (ro)
HK (1) HK1231378A1 (ro)
HR (1) HRP20180237T4 (ro)
HU (1) HUE036588T2 (ro)
IL (1) IL231515A (ro)
LT (1) LT2709613T (ro)
MD (1) MD4589C1 (ro)
ME (1) ME03009B (ro)
MX (2) MX354958B (ro)
NZ (1) NZ623396A (ro)
PE (1) PE20141056A1 (ro)
PH (1) PH12014500557A1 (ro)
PL (1) PL2709613T5 (ro)
PT (1) PT2709613T (ro)
RS (1) RS56975B1 (ro)
SG (2) SG11201400664WA (ro)
SI (1) SI2709613T2 (ro)
SM (1) SMT201800087T1 (ro)
TR (1) TR201802537T4 (ro)
UA (1) UA116087C2 (ro)
WO (1) WO2013040492A2 (ro)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL3521297T3 (pl) 2003-05-30 2022-04-04 Gilead Pharmasset Llc Zmodyfikowane fluorowane analogi nukleozydów
CA2745295C (en) 2008-12-09 2017-01-10 Gilead Sciences, Inc. Modulators of toll-like receptors
BRPI1010795B1 (pt) * 2009-05-13 2018-12-11 Gilead Pharmasset Llc compostos antivirais, seu uso e composição farmacêutica compreendendo os mesmos
BR112012006180A2 (pt) 2009-09-21 2015-09-08 Gilead Sciences Inc processos e intermediários para a preparação de análogos de 1'-substituido carba-nucleosídeo
SG186830A1 (en) 2010-07-22 2013-02-28 Gilead Sciences Inc Methods and compounds for treating paramyxoviridae virus infections
AU2011349844B2 (en) 2010-12-20 2017-06-01 Gilead Sciences, Inc. Combinations for treating HCV
AP2014007575A0 (en) 2011-09-16 2012-04-30 Gilead Pharmasset Llc Methods for treating HCV
CH707030B1 (de) * 2011-10-21 2015-03-13 Abbvie Inc Kombinationsbehandlung von DAAs zur Verwendung in der Behandlung von HCV
US8466159B2 (en) 2011-10-21 2013-06-18 Abbvie Inc. Methods for treating HCV
ES2529143B1 (es) * 2011-10-21 2015-10-26 Abbvie Inc. Combinación de al menos dos agentes antivirales de acción directa, ribavirina pero no interferón para uso de tratamiento del vhc
US8492386B2 (en) 2011-10-21 2013-07-23 Abbvie Inc. Methods for treating HCV
AU2015100283B4 (en) * 2011-10-21 2015-06-18 Abbvie Ireland Unlimited Company Methods for treating HCV
AU2015200715A1 (en) * 2011-10-21 2015-03-05 Abbvie Ireland Unlimited Company Methods for treating HCV
SG11201506021XA (en) 2013-01-31 2015-08-28 Gilead Pharmasset Llc Combination formulation of two antiviral compounds
US20140343008A1 (en) * 2013-05-16 2014-11-20 Gilead Pharmasset Llc Hepatitis c treatment
CN104211565A (zh) * 2013-05-31 2014-12-17 浙江九洲药业股份有限公司 一种抗丙型肝炎药物中间体的制备方法
JP2016529293A (ja) 2013-08-27 2016-09-23 ギリアド ファーマセット エルエルシー ２つの抗ウイルス化合物の組合せ製剤
MA40238A (fr) 2014-07-11 2017-05-17 Gilead Sciences Inc Modulateurs de récepteurs de type toll pour le traitement du vih
CN104130302B (zh) * 2014-08-08 2017-02-15 乳源东阳光药业有限公司 一种核苷药物的晶型及其制备方法
BR102015023450A2 (pt) 2014-09-16 2016-04-12 Gilead Sciences Inc formas sólidas de um modulador do receptor semelhante a toll
TWI687432B (zh) 2014-10-29 2020-03-11 美商基利科學股份有限公司 絲狀病毒科病毒感染之治療
JP7381190B2 (ja) 2014-12-26 2023-11-15 エモリー・ユニバーシテイ Ｎ４－ヒドロキシシチジン及び誘導体並びにそれに関連する抗ウイルス用途
CN106138080A (zh) * 2015-04-03 2016-11-23 南开大学 核苷类化合物在制备治疗丙型肝炎病毒(hcv)感染疾病药物的应用
CN106146585B (zh) * 2015-04-10 2019-05-28 正大天晴药业集团股份有限公司 氘修饰的脲苷衍生物
BR122020020217B1 (pt) 2015-09-16 2021-08-17 Gilead Sciences, Inc Uso de um composto antiviral ou sal do mesmo para o tratamento de uma infecção por arenaviridae
EP3448392A4 (en) 2016-04-28 2020-01-15 Emory University ALKYNOUS THERAPEUTIC NUCLEOTIDE AND NUCLEOSIDE COMPOSITIONS AND RELATED APPLICATIONS
WO2017195147A1 (en) * 2016-05-12 2017-11-16 Lupin Limited Process for the preparation of ledipasvir and intermediates thereof
CN105968040B (zh) * 2016-06-29 2019-02-05 爱斯特（成都）生物制药股份有限公司 一种雷迪帕韦中间体的制备方法
CN106432197B (zh) * 2016-09-07 2019-12-10 上海众强药业有限公司 一种雷迪帕韦中间体单对甲苯磺酸盐、其晶型及其制备方法
EP4331677A3 (en) 2017-03-14 2024-05-29 Gilead Sciences, Inc. Methods of treating feline coronavirus infections
CA3178212A1 (en) * 2017-05-01 2018-11-08 Gilead Sciences, Inc. Crystalline forms of (s)-2-ethylbutyl 2-(((s)-(((2r,3s,4r,5r)-5-(4-aminopyrrolo[2,1-f] [1,2,4]triazin-7-yl)-5-cyano-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methoxy)(phenoxy) phosphoryl)amino)propanoate
PL3651734T3 (pl) 2017-07-11 2025-03-31 Gilead Sciences, Inc. Kompozycje zawierające inhibitor polimerazy rna i cyklodekstrynę do leczenia infekcji wirusowych
CN107629099B (zh) * 2017-07-26 2020-05-26 江苏科本药业有限公司 一种索非布韦中间体的制备工艺
SG11202002431SA (en) * 2017-09-21 2020-04-29 Riboscience Llc 4'-fluoro-2'-methyl substituted nucleoside derivatives as inhibitors of hcv rna replication
KR102626210B1 (ko) 2017-12-07 2024-01-18 에모리 유니버시티 N4-하이드록시사이티딘 및 유도체 및 이와 관련된 항-바이러스 용도
CN109651472B (zh) * 2018-12-29 2020-08-18 湖南千金湘江药业股份有限公司 合成索非布韦关键中间体的方法
CN110531023B (zh) * 2019-10-08 2024-06-14 安徽理工大学 一种薄层色谱分析仪
CN111990544A (zh) * 2019-10-16 2020-11-27 长沙绿叶生物科技有限公司 一种用于阻断和干扰非洲猪瘟病毒与猪的特异受体结合的生物饲料及其应用
US11660307B2 (en) 2020-01-27 2023-05-30 Gilead Sciences, Inc. Methods for treating SARS CoV-2 infections
TWI883391B (zh) 2020-02-18 2025-05-11 美商基利科學股份有限公司 抗病毒化合物
CN115135383B (zh) 2020-02-18 2024-06-11 吉利德科学公司 抗病毒化合物
TWI775313B (zh) 2020-02-18 2022-08-21 美商基利科學股份有限公司 抗病毒化合物
TWI785528B (zh) 2020-03-12 2022-12-01 美商基利科學股份有限公司 1’-氰基核苷之製備方法
EP4132651A1 (en) 2020-04-06 2023-02-15 Gilead Sciences, Inc. Inhalation formulations of 1'-cyano substituted carbanucleoside analogs
TW202532084A (zh) 2020-05-29 2025-08-16 美商基利科學股份有限公司 瑞德西韋之治療方法
WO2021262826A2 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Gilead Sciences, Inc. 1'-cyano nucleoside analogs and uses thereof
PT4204421T (pt) 2020-08-27 2024-06-25 Gilead Sciences Inc Compostos e métodos para o tratamento de infeções virais
JP7688152B2 (ja) 2021-04-16 2025-06-03 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド アミドを使用してカルバヌクレオシドを調製する方法
CN117460734A (zh) 2021-05-21 2024-01-26 吉利德科学公司 作为寨卡病毒抑制剂的五环衍生物
CN117321059A (zh) 2021-05-21 2023-12-29 吉利德科学公司 用于治疗寨卡病毒感染的四环化合物
KR20240049311A (ko) 2021-08-18 2024-04-16 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 인지질 화합물 및 이의 제조 및 사용 방법
JP2025508942A (ja) 2022-03-02 2025-04-10 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド ウイルス感染症の治療のための化合物及び方法
US12357577B1 (en) 2024-02-02 2025-07-15 Gilead Sciences, Inc. Pharmaceutical formulations and uses thereof

Family Cites Families (327)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE29835E (en) 1971-06-01 1978-11-14 Icn Pharmaceuticals 1,2,4-Triazole nucleosides
US3798209A (en) 1971-06-01 1974-03-19 Icn Pharmaceuticals 1,2,4-triazole nucleosides
JPS5238939A (en) 1975-09-23 1977-03-25 Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> Optical coupler
US4614719A (en) * 1982-04-30 1986-09-30 Yamasa Shoyu Kabushiki Kaisha Process for producing ribavirin
US5223263A (en) 1988-07-07 1993-06-29 Vical, Inc. Liponucleotide-containing liposomes
US5194654A (en) 1989-11-22 1993-03-16 Vical, Inc. Lipid derivatives of phosphonoacids for liposomal incorporation and method of use
US5463092A (en) 1989-11-22 1995-10-31 Vestar, Inc. Lipid derivatives of phosphonacids for liposomal incorporation and method of use
US5026687A (en) 1990-01-03 1991-06-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Treatment of human retroviral infections with 2',3'-dideoxyinosine alone and in combination with other antiviral compounds
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
EP0594677A4 (en) 1991-07-12 1997-09-17 Vical Inc Antiviral liponucleosides: treatment of hepatitis b
US5538848A (en) 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
US6391859B1 (en) 1995-01-27 2002-05-21 Emory University [5-Carboxamido or 5-fluoro]-[2′,3′-unsaturated or 3′-modified]-pyrimidine nucleosides
US5703058A (en) 1995-01-27 1997-12-30 Emory University Compositions containing 5-fluoro-2',3'-didehydro-2',3'-dideoxycytidine or a mono-, di-, or triphosphate thereof and a second antiviral agent
ATE222765T1 (de) 1995-02-01 2002-09-15 Resprotect Gmbh Verwendung von 5' substituierten nukleosiden zur hemmung von resistenzbildung bei der zytostatikabehandlung
GB9505025D0 (en) 1995-03-13 1995-05-03 Medical Res Council Chemical compounds
DE19514523A1 (de) 1995-04-12 1996-10-17 Schering Ag Neue Cytosin- und Cytidinderivate
US7875733B2 (en) 2003-09-18 2011-01-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising 4′-thionucleosides for use in gene modulation
US5858389A (en) 1996-08-28 1999-01-12 Shaker H. Elsherbini Squalene is an antiviral compound for treating hepatitis C virus carriers
US6509320B1 (en) 1996-10-16 2003-01-21 Icn Pharmaceuticals, Inc. Purine L-nucleosides, analogs and uses thereof
ES2195970T3 (es) 1996-10-16 2003-12-16 Ribapharm Inc L-ribavirina y usos de la misma.
DE69729887T2 (de) 1996-10-16 2005-07-28 ICN Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa Purin-L-Nukleoside, Analoga und deren Verwendung
EP1317929A3 (en) 1997-09-21 2003-07-02 Schering Corporation Combination therapy for eradicating detectable HCV-RNA in patients having chronic hepatitis c infection
US6201262B1 (en) 1997-10-07 2001-03-13 Cree, Inc. Group III nitride photonic devices on silicon carbide substrates with conductive buffer interlay structure
US6703374B1 (en) 1997-10-30 2004-03-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Nucleosides for imaging and treatment applications
US7462605B2 (en) 1998-01-23 2008-12-09 Celmed Oncology (Usa), Inc. Phosphoramidate compounds and methods of use
WO1999037753A1 (en) 1998-01-23 1999-07-29 Newbiotics, Inc. Enzyme catalyzed therapeutic agents
PT1058686E (pt) 1998-02-25 2007-01-31 Raymond F Schinazi 2'-fluoronucleósidos
US6787305B1 (en) 1998-03-13 2004-09-07 Invitrogen Corporation Compositions and methods for enhanced synthesis of nucleic acid molecules
WO1999049873A1 (en) 1998-03-27 1999-10-07 Regents Of The University Of Minnesota Nucleosides with antiviral and anticancer activity
AU766597B2 (en) 1998-05-15 2003-10-16 Schering Corporation Combination therapy comprising ribavirin and interferon alpha in antiviral treatment naive patients having chronic hepatitis C infection
NZ508249A (en) 1998-06-08 2003-02-28 F Use of PEG-IFN-alpha conjugates in association with ribavirin for the treatment of chronic hepatitis C
GB9816358D0 (en) 1998-07-27 1998-09-23 Angeletti P Ist Richerche Bio Enzyme inhibitors
MXPA01001507A (es) 1998-08-10 2003-09-10 Novirio Pharmaceuticals Ltd °l-2'desoxi-nucleosidos para el tratamiento de hepatitis b.
GB9821058D0 (en) 1998-09-28 1998-11-18 Univ Cardiff Chemical compound
WO2000037110A2 (en) 1998-12-18 2000-06-29 Schering Corporation Ribavirin-pegylated interferon alfa induction hcv combination therapy
US6923966B2 (en) 1999-04-08 2005-08-02 Schering Corporation Melanoma therapy
AU775601B2 (en) 1999-07-22 2004-08-05 Celmed Oncology (Usa) Inc. Enzyme catalyzed therapeutic activation
US7388370B2 (en) 2005-07-29 2008-06-17 Automotive Systems Laboratory Systems, Inc. Magnetic crash sensor
US6566365B1 (en) 1999-11-04 2003-05-20 Biochem Pharma Inc. Method for the treatment of Flaviviridea viral infection using nucleoside analogues
US6495677B1 (en) 2000-02-15 2002-12-17 Kanda S. Ramasamy Nucleoside compounds
KR20030005197A (ko) 2000-02-18 2003-01-17 샤이어 바이오켐 인코포레이티드 뉴클레오시드유도체를 이용한 플라비바이러스 감염의 치료또는 예방 방법
US7094770B2 (en) 2000-04-13 2006-08-22 Pharmasset, Ltd. 3′-or 2′-hydroxymethyl substituted nucleoside derivatives for treatment of hepatitis virus infections
WO2001081359A1 (en) 2000-04-20 2001-11-01 Schering Corporation Ribavirin-interferon alfa combination therapy for eradicating detectable hcv-rna in patients having chronic hepatitis c infection
MY164523A (en) 2000-05-23 2017-12-29 Univ Degli Studi Cagliari Methods and compositions for treating hepatitis c virus
CN100490818C (zh) 2000-05-26 2009-05-27 诺瓦蒂斯有限公司 β-L-2′-脱氧核苷在制备用于治疗丁型肝炎病毒感染的药物中的用途
US6787526B1 (en) 2000-05-26 2004-09-07 Idenix Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating hepatitis delta virus infection with β-L-2′-deoxy-nucleosides
CA2410579C (en) 2000-05-26 2010-04-20 Jean-Pierre Sommadossi Methods and compositions for treating flaviviruses and pestiviruses
MY141594A (en) 2000-06-15 2010-05-14 Novirio Pharmaceuticals Ltd 3'-PRODRUGS OF 2'-DEOXY-ß-L-NUCLEOSIDES
US6815542B2 (en) 2000-06-16 2004-11-09 Ribapharm, Inc. Nucleoside compounds and uses thereof
UA72612C2 (en) 2000-07-06 2005-03-15 Pyrido[2.3-d]pyrimidine and pyrimido[4.5-d]pyrimidine nucleoside analogues, prodrugs and method for inhibiting growth of neoplastic cells
AR029851A1 (es) 2000-07-21 2003-07-16 Dendreon Corp Nuevos peptidos como inhibidores de ns3-serina proteasa del virus de hepatitis c
MXPA03000587A (es) 2000-07-21 2004-04-05 Gilead Sciences Inc Profarmacos de analogos de nucleotido de fosfonato y metodos para seleccionar y elaborar los mismos.
AR039558A1 (es) 2000-08-21 2005-02-23 Inspire Pharmaceuticals Inc Composiciones y metodo para el tratamiento de glaucoma o hipertension ocular
US20030008841A1 (en) 2000-08-30 2003-01-09 Rene Devos Anti-HCV nucleoside derivatives
KR20090089922A (ko) 2000-10-18 2009-08-24 파마셋 인코포레이티드 바이러스 감염 및 비정상적인 세포 증식의 치료를 위한 변형된 뉴클레오시드
AU2002213343A1 (en) 2000-10-18 2002-04-29 Schering Corporation Ribavirin-pegylated interferon alfa HCV combination therapy
US20040266723A1 (en) 2000-12-15 2004-12-30 Otto Michael J. Antiviral agents for treatment of Flaviviridae infections
SI1355916T1 (sl) 2001-01-22 2007-04-30 Merck & Co Inc Nukleozidni derivati kot inhibitorji RNA-odvisne RNA virusne polimeraze
US7105499B2 (en) 2001-01-22 2006-09-12 Merck & Co., Inc. Nucleoside derivatives as inhibitors of RNA-dependent RNA viral polymerase
GB0112617D0 (en) 2001-05-23 2001-07-18 Hoffmann La Roche Antiviral nucleoside derivatives
GB0114286D0 (en) 2001-06-12 2001-08-01 Hoffmann La Roche Nucleoside Derivatives
WO2003000713A1 (en) 2001-06-21 2003-01-03 Glaxo Group Limited Nucleoside compounds in hcv
JP4455056B2 (ja) 2001-07-11 2010-04-21 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 架橋二環式セリンプロテアーゼ阻害剤
EP2335700A1 (en) 2001-07-25 2011-06-22 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. Hepatitis C virus polymerase inhibitors with a heterobicylic structure
WO2003024461A1 (en) 2001-09-20 2003-03-27 Schering Corporation Hcv combination therapy
AU2002330154A1 (en) 2001-09-28 2003-04-07 Centre National De La Recherche Scientifique Methods and compositions for treating hepatitis c virus using 4'-modified nucleosides
ES2289161T3 (es) 2001-11-02 2008-02-01 Glaxo Group Limited Derivados de 4-(heteroaril de 6 miembros)-acil pirrolidina como inhibidores de hcv.
US7105527B2 (en) 2001-12-14 2006-09-12 Otto Michael J N4-acylcytosine nucleosides for treatment of viral infections
WO2003051899A1 (en) 2001-12-17 2003-06-26 Ribapharm Inc. Deazapurine nucleoside libraries and compounds
JP2005514401A (ja) 2001-12-21 2005-05-19 マイクロロジックス　バイオテック，インコーポレイテッド 抗ウイルス性７−デアザｌ−ヌクレオシド
WO2003062256A1 (en) 2002-01-17 2003-07-31 Ribapharm Inc. 2'-beta-modified-6-substituted adenosine analogs and their use as antiviral agents
US6642204B2 (en) 2002-02-01 2003-11-04 Boehringer Ingelheim International Gmbh Hepatitis C inhibitor tri-peptides
AU2003209045B2 (en) 2002-02-13 2006-12-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of inhibiting orthopoxvirus replication with nucleoside compounds
JP2005525358A (ja) 2002-02-28 2005-08-25 ビオタ インコーポレーティッド ヌクレオチド模倣体およびそのプロドラッグ
JP2005524662A (ja) 2002-02-28 2005-08-18 ビオタ インコーポレーティッド ヌクレオシド５’−一リン酸模倣物およびこれらのプロドラッグ
US20040014108A1 (en) 2002-05-24 2004-01-22 Eldrup Anne B. Oligonucleotides having modified nucleoside units
US7449488B2 (en) 2002-06-04 2008-11-11 Schering Corporation Pyrazolopyrimidines as protein kinase inhibitors
AU2003251524A1 (en) 2002-06-17 2003-12-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic nucleoside analogs as RNA-antivirals
AU2003248708A1 (en) 2002-06-17 2003-12-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds that include carbocyclic nucleosides and their use in gene modulation
JP2005530843A (ja) 2002-06-21 2005-10-13 メルク　エンド　カムパニー　インコーポレーテッド Ｒｎａ依存性ｒｎａウィルスポリメラーゼ阻害剤としてのヌクレオシド誘導体
EP1572945A2 (en) 2002-06-27 2005-09-14 Merck & Co., Inc. Nucleoside derivatives as inhibitors of rna-dependent rna viral polymerase
RS114004A (sr) 2002-06-28 2007-02-05 Idenix (Cayman) Limited, Modifikovani 2'i 3'-nukleozid prolekovi za lečenje flaviridae infekcija
CN1678326A (zh) 2002-06-28 2005-10-05 埃迪尼克斯(开曼)有限公司 用于治疗黄病毒感染的2'－c－甲基－3'－o－l－缬氨酸酯核糖呋喃基胞苷
US7608600B2 (en) 2002-06-28 2009-10-27 Idenix Pharmaceuticals, Inc. Modified 2′ and 3′-nucleoside prodrugs for treating Flaviviridae infections
AU2003263412A1 (en) 2002-06-28 2004-01-19 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) 1'-, 2'- and 3'- modified nucleoside derivatives for treating flaviviridae infections
US6973905B2 (en) 2002-07-01 2005-12-13 Cinetic Automation Corporation Valve lash adjustment apparatus and method
MXPA05000020A (es) 2002-07-01 2005-12-05 Pharmacia & Upjohn Co Llc Inhibidores de polimerasa ns5b de la infeccion del virus de la hepatitis c (hcv).
US6930106B2 (en) 2002-07-01 2005-08-16 Pharmacia & Upjohn Company Inhibitors of HCV NS5B polymerase
US20060264389A1 (en) 2002-07-16 2006-11-23 Balkrishen Bhat Nucleoside derivatives as inhibitors of rna-dependent rna viral polymerase
CA2493816A1 (en) 2002-07-24 2004-01-29 Ptc Therapeutics, Inc. Use of nucleoside compounds for nonsense suppression and the treatment of genetic diseases
WO2004009020A2 (en) 2002-07-24 2004-01-29 Merck & Co., Inc. Pyrrolopyrimidine thionucleoside analogs as antivirals
AU2003254657A1 (en) 2002-07-25 2004-02-16 Micrologix Biotech Inc. Anti-viral 7-deaza d-nucleosides and uses thereof
TWI244393B (en) 2002-08-06 2005-12-01 Idenix Pharmaceuticals Inc Crystalline and amorphous forms of beta-L-2'-deoxythymidine
WO2004014313A2 (en) 2002-08-12 2004-02-19 Bristol-Myers Squibb Company Combination pharmaceutical agents as inhibitors of hcv replication
WO2004024095A2 (en) 2002-09-13 2004-03-25 Idenix (Cayman) Limited ß-L-2'-DEOXYNUCLEOSIDES FOR THE TREATMENT OF RESISTANT HBV STRAINS AND COMBINATION THERAPIES
JP2006505571A (ja) 2002-10-15 2006-02-16 リゲル ファーマシューテイカルズ、インコーポレイテッド 置換されたインドール及びｈｃｖ阻害剤としてのその使用
US20040229840A1 (en) 2002-10-29 2004-11-18 Balkrishen Bhat Nucleoside derivatives as inhibitors of RNA-dependent RNA viral polymerase
BR0315937A (pt) 2002-11-01 2005-09-13 Viropharma Inc Composto, composição para a profilaxia ou tratamento de infecções virais, e, método para a profilaxia ou tratamento de infecções da hepatite c e doenças associadas com tais infecções em um hospedeiro vivo
WO2004044139A2 (en) 2002-11-05 2004-05-27 Isis Parmaceuticals, Inc. Modified oligonucleotides for use in rna interference
WO2004041889A2 (en) 2002-11-05 2004-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
JP2006519753A (ja) 2002-11-15 2006-08-31 イデニクス（ケイマン）リミテツド ２’−分枝ヌクレオシドおよびフラビウイルス科ウイルス突然変異
TWI332507B (en) 2002-11-19 2010-11-01 Hoffmann La Roche Antiviral nucleoside derivatives
US7223785B2 (en) 2003-01-22 2007-05-29 Boehringer Ingelheim International Gmbh Viral polymerase inhibitors
AU2003225705A1 (en) 2003-03-07 2004-09-30 Ribapharm Inc. Cytidine analogs and methods of use
JP4733023B2 (ja) 2003-04-16 2011-07-27 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｃ型肝炎ウイルスの大環状イソキノリンペプチド阻害剤
KR20060061930A (ko) 2003-04-25 2006-06-08 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 항암성 포스포네이트 유사체
DK1628685T3 (da) 2003-04-25 2011-03-21 Gilead Sciences Inc Antivirale phosphonatanaloge
US7407965B2 (en) 2003-04-25 2008-08-05 Gilead Sciences, Inc. Phosphonate analogs for treating metabolic diseases
US7470724B2 (en) 2003-04-25 2008-12-30 Gilead Sciences, Inc. Phosphonate compounds having immuno-modulatory activity
US7452901B2 (en) 2003-04-25 2008-11-18 Gilead Sciences, Inc. Anti-cancer phosphonate analogs
WO2005002626A2 (en) 2003-04-25 2005-01-13 Gilead Sciences, Inc. Therapeutic phosphonate compounds
US20050261237A1 (en) 2003-04-25 2005-11-24 Boojamra Constantine G Nucleoside phosphonate analogs
US20040259934A1 (en) 2003-05-01 2004-12-23 Olsen David B. Inhibiting Coronaviridae viral replication and treating Coronaviridae viral infection with nucleoside compounds
US20040229839A1 (en) 2003-05-14 2004-11-18 Biocryst Pharmaceuticals, Inc. Substituted nucleosides, preparation thereof and use as inhibitors of RNA viral polymerases
EP1656093A2 (en) 2003-05-14 2006-05-17 Idenix (Cayman) Limited Nucleosides for treatment of infection by corona viruses, toga viruses and picorna viruses
PL3521297T3 (pl) 2003-05-30 2022-04-04 Gilead Pharmasset Llc Zmodyfikowane fluorowane analogi nukleozydów
GB0317009D0 (en) 2003-07-21 2003-08-27 Univ Cardiff Chemical compounds
WO2005009418A2 (en) 2003-07-25 2005-02-03 Idenix (Cayman) Limited Purine nucleoside analogues for treating diseases caused by flaviviridae including hepatitis c
ES2355565T3 (es) 2003-08-27 2011-03-29 Biota Scientific Management Pty. Ltd. Nuevos nucleósidos o nucleótidos tricíclos como agentes terapéuticos.
US20050119189A1 (en) 2003-09-18 2005-06-02 Cottrell Kevin M. Inhibitors of serine proteases, particularly HCV NS3-NS4A protease
US20050148534A1 (en) 2003-09-22 2005-07-07 Castellino Angelo J. Small molecule compositions and methods for increasing drug efficiency using compositions thereof
WO2005036994A1 (en) 2003-10-14 2005-04-28 Lyco Manufacturing, Inc. High speed food product peeling or cleaning machine and method
US20060003942A1 (en) 2003-10-27 2006-01-05 Roger Tung Combinations for HCV treatment
US7026339B2 (en) 2003-11-07 2006-04-11 Fan Yang Inhibitors of HCV NS5B polymerase
TW200528459A (en) 2004-01-06 2005-09-01 Achillion Pharmaceuticals Inc Azabenzofuran substituted thioureas; inhibitors of viral replication
AU2005216971A1 (en) 2004-02-25 2005-09-09 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Office Of Technology Transfer Methylation inhibitor compounds
JP5236286B2 (ja) 2004-05-07 2013-07-17 セレラ コーポレーション 肝線維症に関連する遺伝的多型、その検出方法および使用
WO2005121372A2 (en) 2004-06-03 2005-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double strand compositions comprising differentially modified strands for use in gene modulation
US8394947B2 (en) 2004-06-03 2013-03-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Positionally modified siRNA constructs
WO2005121634A1 (ja) 2004-06-08 2005-12-22 Tokyo Gas Co., Ltd. ガス吸着容器
US7534767B2 (en) 2004-06-15 2009-05-19 Merck & Co., Inc. C-purine nucleoside analogs as inhibitors of RNA-dependent RNA viral polymerase
JP2008503562A (ja) 2004-06-23 2008-02-07 イデニクス（ケイマン）リミテツド フラビウイルス科による感染症を治療するための５−アザ−７−デアザプリン誘導体
US20070265222A1 (en) 2004-06-24 2007-11-15 Maccoss Malcolm Nucleoside Aryl Phosphoramidates for the Treatment of Rna-Dependent Rna Viral Infection
NZ552927A (en) 2004-07-21 2010-05-28 Pharmasset Inc Preparation of alkyl-substituted 2-deoxy-2-fluoro-D-ribofuranosyl pyrimidines and purines and their derivatives
CN101023094B (zh) 2004-07-21 2011-05-18 法莫赛特股份有限公司 烷基取代的2-脱氧-2-氟代-d-呋喃核糖基嘧啶和嘌呤及其衍生物的制备
AU2005330489B2 (en) 2004-07-27 2011-08-25 Gilead Sciences, Inc. Nucleoside phosphonate conjugates as anti HIV agents
US7153848B2 (en) 2004-08-09 2006-12-26 Bristol-Myers Squibb Company Inhibitors of HCV replication
US7348425B2 (en) 2004-08-09 2008-03-25 Bristol-Myers Squibb Company Inhibitors of HCV replication
DE602005015732D1 (de) 2004-08-23 2009-09-10 Hoffmann La Roche Heterozyklische antivirale verbindungen
EP1794172B1 (en) 2004-08-23 2009-07-15 F.Hoffmann-La Roche Ag Antiviral 4'-azido-nucleosides
WO2006029081A2 (en) 2004-09-02 2006-03-16 Neopharm, Inc. Nucleoside-lipid conjugates, their method of preparation and uses thereof
JP5001842B2 (ja) 2004-09-14 2012-08-15 ギリアド ファーマセット エルエルシー ２’−フルオロ−２’−アルキル−置換又は他の置換されていてもよいリボフラノシルピリミジン類及びプリン類並びにそれらの誘導体の製造
RU2007115419A (ru) 2004-09-24 2008-10-27 Айденикс (Кайман) Лимитед (Ky) Способы и композиции для лечения флавивирусов, пестивирусов и гепацивируса
KR20070058602A (ko) 2004-09-30 2007-06-08 티보텍 파마슈티칼즈 리미티드 Ｈｃｖ 저해 바이-사이클릭 피리미딘
AU2005317081A1 (en) 2004-10-21 2006-06-22 Merck & Co., Inc. Fluorinated pyrrolo[2,3-d]pyrimidine nucleosides for the treatment of RNA-dependent RNA viral infection
AU2005302448B2 (en) 2004-10-29 2012-07-19 Biocryst Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic furopyrimidines and thienopyrimidines
US20060110724A1 (en) 2004-11-19 2006-05-25 Burkhardt William Iii Quantitative real-time assay for noroviruses and enteroviruses with built in quality control standard
EP1674104A1 (en) 2004-12-24 2006-06-28 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Uridine derivatives as antiviral drugs against a flaviviridae, especially HCV
WO2006093801A1 (en) 2005-02-25 2006-09-08 Abbott Laboratories Thiadiazine derivatives useful as anti-infective agents
US7524825B2 (en) 2005-02-28 2009-04-28 Smithkline Beecham Corporation Tricyclic-nucleoside compounds for treating viral infections
JP2008534479A (ja) 2005-03-25 2008-08-28 テイボテク・フアーマシユーチカルズ・リミテツド Ｈｃｖの複素二環式阻害剤
US7405204B2 (en) 2005-04-25 2008-07-29 Genelabs Technologies, Inc. Nucleoside compounds for treating viral infections
WO2006121820A1 (en) 2005-05-05 2006-11-16 Valeant Research & Development Phosphoramidate prodrugs for treatment of viral infection
AR056347A1 (es) 2005-05-12 2007-10-03 Tibotec Pharm Ltd Uso de compuestos de pteridina para fabricar medicamentos y composiciones farmaceuticas
US20060276405A1 (en) 2005-06-02 2006-12-07 Schering Corporation Methods for treating hepatitis C
US8143288B2 (en) 2005-06-06 2012-03-27 Bristol-Myers Squibb Company Inhibitors of HCV replication
US20060293752A1 (en) 2005-06-27 2006-12-28 Missoum Moumene Intervertebral disc prosthesis and associated methods
NZ565059A (en) 2005-07-25 2011-08-26 Intermune Inc Novel macrocyclic inhibitors of hepatitus C virus replication
DK1919904T3 (da) 2005-07-29 2014-04-07 Janssen R & D Ireland Makrocykliske inhibitorer af hepatitis-c-virus
PE20070211A1 (es) 2005-07-29 2007-05-12 Medivir Ab Compuestos macrociclicos como inhibidores del virus de hepatitis c
AR055361A1 (es) 2005-07-29 2007-08-22 Medivir Ab Inhibidores macrociclicos del virus de la hepatitis c
AR055105A1 (es) 2005-07-29 2007-08-08 Tibotec Pharm Ltd Inhibidores macrociclicos del virus de la hepatitis c
DK1919898T3 (da) 2005-07-29 2011-05-02 Tibotec Pharm Ltd Makrocykliske inhibitorer af hepatitis-C-virus
CN101287472B (zh) 2005-08-15 2011-10-12 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 抗病毒的4'-取代前核苷酸的氨基磷酸酯类化合物
EP3159351A3 (en) 2005-09-26 2017-05-17 Gilead Pharmasset LLC Modified 3'-azido-4'-ethynyl-nucleosides as antiviral agents
JP5116687B2 (ja) 2005-11-02 2013-01-09 バイエル・ファルマ・アクチェンゲゼルシャフト がんおよび他の過剰増殖性疾患の処置のためのピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−４−イルアミンＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤
MY150667A (en) 2005-12-09 2014-02-28 Gilead Pharmasset Llc Antiviral nucleosides
AU2006326494A1 (en) 2005-12-12 2007-06-21 Genelabs Technologies, Inc. N-(6-membered aromatic ring)-amido anti-viral compounds
EP1979349B1 (en) 2005-12-21 2010-07-28 Abbott Laboratories Anti-viral compounds
NZ569817A (en) 2005-12-21 2011-10-28 Abbott Lab Anti-viral compounds
US7879815B2 (en) 2006-02-14 2011-02-01 Merck Sharp & Dohme Corp. Nucleoside aryl phosphoramidates for the treatment of RNA-dependent RNA viral infection
JP2009528989A (ja) 2006-02-17 2009-08-13 ファイザー・リミテッド Ｔｌｒ７変調剤としての３−デアザプリン誘導体
US8895531B2 (en) 2006-03-23 2014-11-25 Rfs Pharma Llc 2′-fluoronucleoside phosphonates as antiviral agents
US7521442B2 (en) 2006-05-25 2009-04-21 Bristol-Myers Squibb Company Cyclopropyl fused indolobenzazepine HCV NS5B inhibitors
EP2029606B1 (en) 2006-05-25 2010-05-26 Brystol-Myers Squibb Company Cyclopropyl fused indolobenzazepine hcv ns5b inhibitors
WO2008005555A1 (en) 2006-07-07 2008-01-10 Gilead Sciences, Inc. Modulators of toll-like receptor 7
ATE554776T1 (de) 2006-07-07 2012-05-15 Gilead Sciences Inc Antivirale phosphinatverbindungen
SI2049506T2 (sl) 2006-07-07 2024-07-31 Gilead Sciences, Inc. Modulatorji farmakokinetičnih lastnosti terapevtikov
ES2339298T3 (es) 2006-07-07 2010-05-18 Gilead Sciences, Inc. Compuesto de piridazina novedoso y uso del mismo.
US7759495B2 (en) 2006-08-11 2010-07-20 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus inhibitors
US8329159B2 (en) 2006-08-11 2012-12-11 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus inhibitors
US7659270B2 (en) 2006-08-11 2010-02-09 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus inhibitors
US8303944B2 (en) 2006-08-11 2012-11-06 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus inhibitors
JP5252459B2 (ja) 2006-10-10 2013-07-31 ギリアド ファーマセット エルエルシー リボフラノシルピリミジンヌクレオシドの調製
PL216525B1 (pl) 2006-10-17 2014-04-30 Ct Badań Molekularnych I Makromolekularnych Polskiej Akademii Nauk 5'-O-[(N-acylo)amidoditiofosforano] nukleozydy oraz sposób wytwarzania 5'-O-[(N-acylo)amidofosforano]-,5'-O-[(N-acylo)amidotiofosforano]-, 5'-O-[(N-acylo)amidoditiofosforano]nukleozydów
EP2120565B1 (en) 2006-12-20 2012-11-28 Merck Sharp & Dohme Corp. Nucleoside cyclic phosphoramidates for the treatment of rna-dependent rna viral infection
US7951789B2 (en) 2006-12-28 2011-05-31 Idenix Pharmaceuticals, Inc. Compounds and pharmaceutical compositions for the treatment of viral infections
US8071568B2 (en) 2007-01-05 2011-12-06 Merck Sharp & Dohme Corp. Nucleoside aryl phosphoramidates for the treatment of RNA-dependent RNA viral infection
US7964580B2 (en) 2007-03-30 2011-06-21 Pharmasset, Inc. Nucleoside phosphoramidate prodrugs
JP2010526143A (ja) * 2007-05-04 2010-07-29 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｈｃｖ感染の処置のための併用療法
US7741347B2 (en) 2007-05-17 2010-06-22 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus inhibitors
GB0709791D0 (en) 2007-05-22 2007-06-27 Angeletti P Ist Richerche Bio Antiviral agents
EP2168959A1 (en) 2007-06-19 2010-03-31 Kyorin Pharmaceutical Co., Ltd. Pyridazinone derivative and pde inhibitor containing the same as active ingredient
US8513186B2 (en) 2007-06-29 2013-08-20 Gilead Sciences, Inc. Antiviral compounds
MX2009013832A (es) 2007-06-29 2010-03-10 Gilead Sciences Inc Derivados de purina y su uso como moduladores del receptor 7 similar a un puente.
MX2009013827A (es) 2007-06-29 2010-03-01 Gilead Sciences Inc Compuestos antivirales.
UA99466C2 (en) 2007-07-06 2012-08-27 Гилиад Сайенсиз, Инк. Crystalline pyridazine compound
CN101108870A (zh) 2007-08-03 2008-01-23 冷一欣 核苷磷酸酯类化合物及制备方法和应用
US7728027B2 (en) 2007-08-08 2010-06-01 Bristol-Myers Squibb Company Process for synthesizing compounds useful for treating hepatitis C
US8629171B2 (en) 2007-08-08 2014-01-14 Bristol-Myers Squibb Company Crystalline form of methyl ((1S)-1-((25)-2-(5-(4'-(2-((25)-1((2S)-2-((methoxycarbonyl)amino)-3-methylbutanoyl)-2-pyrrolidinyl)-1H-imidazol-2-yl)-1-pyrrolidinyl)carbonyl)-2-methylpropyl)carbamate dihydrochloride salt
SI2061513T1 (sl) 2007-09-14 2011-11-30 Schering Corp Postopek zdravljenja pacientov s hepatitisom c
JO2778B1 (en) 2007-10-16 2014-03-15 ايساي انك Certain Compounds, Compositions and Methods
DE102007052070A1 (de) 2007-10-30 2009-05-07 Tiefenbacher Pharmachemikalien Alfred E. Tiefenbacher Gmbh & Co. Kg Candesartancilexetil
JP5238939B2 (ja) 2007-11-07 2013-07-17 三菱化学株式会社 長繊維強化複合樹脂組成物および成形品
NZ587282A (en) 2008-01-11 2012-09-28 Antaria Ltd Visibly transparent uv photoprotective compositions containing mesoporous zinc oxide aggregates
PT2250163E (pt) 2008-02-12 2012-06-01 Bristol Myers Squibb Co Inibidores do vírus da hepatite c
US7704992B2 (en) 2008-02-13 2010-04-27 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus inhibitors
DK2242752T3 (da) 2008-02-13 2012-11-19 Bristol Myers Squibb Co Imidazolyl-biphenylimidazoler som hepatitis C-virus-inhibitorer
US8147818B2 (en) 2008-02-13 2012-04-03 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus inhibitors
US8227431B2 (en) 2008-03-17 2012-07-24 Hetero Drugs Limited Nucleoside derivatives
WO2009120878A2 (en) 2008-03-26 2009-10-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Non-natural ribonucleotides, and methods of use thereof
CA2720729A1 (en) 2008-04-15 2009-11-26 Intermune, Inc. Novel macrocyclic inhibitors of hepatitis c virus replication
WO2009129120A2 (en) 2008-04-15 2009-10-22 Rfs Pharma, Llc Nucleoside derivatives for treatment of caliciviridae infections, including norovirus infections
CN102015714B (zh) 2008-04-23 2014-09-24 吉里德科学公司 用于抗病毒治疗的1’-取代的carba-核苷类似物
US8173621B2 (en) 2008-06-11 2012-05-08 Gilead Pharmasset Llc Nucleoside cyclicphosphates
US20110269734A1 (en) 2008-07-10 2011-11-03 Prosidion Limited Piperidinyl gpcr agonists
US7906655B2 (en) 2008-08-07 2011-03-15 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus inhibitors
US7921612B2 (en) 2008-08-31 2011-04-12 United Construction Products, Inc. Method and device for supporting a structure
US8383094B2 (en) 2008-10-01 2013-02-26 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus inhibitors
DE102008057284A1 (de) 2008-11-14 2010-05-20 Ratiopharm Gmbh Tabletten enthaltend Lenalidomid und Adhäsionsverstärker
US8729077B2 (en) 2008-11-28 2014-05-20 Glaxosmithkline Llc Anti-viral compounds, compositions, and methods of use
AU2009322400A1 (en) 2008-12-03 2011-06-30 Presidio Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of HCV NS5A
JP5762971B2 (ja) 2008-12-03 2015-08-12 プレシディオ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｈｃｖｎｓ５ａの阻害剤
CA2745295C (en) 2008-12-09 2017-01-10 Gilead Sciences, Inc. Modulators of toll-like receptors
CL2009002207A1 (es) 2008-12-23 2011-02-18 Gilead Pharmasset Llc Compuestos derivados de 3-hidroxi-5-(9h-purin-9-il)tetrahidrofuran-2-il, inhibidor de la replicacion de arn viral dependiente de arn; composicion farmaceutica; uso para el tratamiento de hepatitis c.
CL2009002208A1 (es) 2008-12-23 2010-10-29 Gilead Pharmasset Llc Un compuesto (2s)-2-((((2r,3r,4r,5r)-5-(2-amino-6-etoxi-9h-purin-9-il)-4-fluoro-3-hidroxi-4-metiltetrahidrofuran-2-il)metoxi)(hidroxi)fosforilamino)propanoico, inhibidores de la replicacion de arn viral; composicion farmaceutica; y su uso en el tratamiento de infeccion por hepatitis c, virus del nilo occidental, entre otras.
KR20110104074A (ko) 2008-12-23 2011-09-21 파마셋 인코포레이티드 퓨린 뉴클레오시드의 합성
MX2011007194A (es) 2009-01-07 2013-07-12 Scynexis Inc Combinacion de un derivado ciclosporina y nucleosidos para tratar virus de hepatitis c (vhc).
WO2010081082A2 (en) 2009-01-09 2010-07-15 University College Of Cardiff Consultants Limited Phosphoramidate derivatives of guanosine nucleoside compounds for treatment of viral infections
WO2010091413A1 (en) 2009-02-09 2010-08-12 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Linked dibenzimidazole derivatives
WO2010096462A1 (en) 2009-02-17 2010-08-26 Enanta Pharmaceuticals, Inc Linked diimidazole derivatives
TWI438200B (zh) 2009-02-17 2014-05-21 必治妥美雅史谷比公司 Ｃ型肝炎病毒抑制劑
WO2010096777A1 (en) 2009-02-23 2010-08-26 Presidio Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of hcv ns5a
WO2010094977A1 (en) 2009-02-23 2010-08-26 Arrow Therapeutics Limited Novel biphenyl compounds useful for the treatment of hepatitis c
CA2753382C (en) 2009-02-27 2014-12-23 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Hepatitis c virus inhibitors
WO2010108140A1 (en) 2009-03-20 2010-09-23 Alios Biopharma, Inc. Substituted nucleoside and nucleotide analogs
CN109651342A (zh) 2009-03-27 2019-04-19 默沙东公司 丙型肝炎病毒复制的抑制剂
MX2011010132A (es) 2009-03-27 2011-10-14 Presidio Pharmaceuticals Inc Inhibidores de anillo fusionado de hepatitis c.
US8709999B2 (en) 2009-03-27 2014-04-29 Presidio Pharmaceuticals, Inc. Substituted bicyclic HCV inhibitors
US8796466B2 (en) 2009-03-30 2014-08-05 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus inhibitors
TWI476190B (zh) 2009-03-30 2015-03-11 必治妥美雅史谷比公司 Ｃ型肝炎病毒抑制劑
DE102009015702A1 (de) 2009-03-31 2010-10-07 Ratiopharm Gmbh Tabletten enthaltend Dapoxetin und Trockenverarbeitungsverfahren zu deren Herstellung
TW201038559A (en) 2009-04-09 2010-11-01 Bristol Myers Squibb Co Hepatitis C virus inhibitors
US8143414B2 (en) 2009-04-13 2012-03-27 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus inhibitors
SG175144A1 (en) 2009-04-15 2011-11-28 Abbott Lab Anti-viral compounds
BRPI1016172A2 (pt) 2009-04-24 2016-04-19 Tibotec Pharm Ltd éteres diarílicos
EP2430015B1 (en) 2009-05-12 2015-06-17 Merck Sharp & Dohme Corp. Fused tricyclic compounds useful for the treatment of viral diseases
BRPI1010795B1 (pt) 2009-05-13 2018-12-11 Gilead Pharmasset Llc compostos antivirais, seu uso e composição farmacêutica compreendendo os mesmos
US8618076B2 (en) 2009-05-20 2013-12-31 Gilead Pharmasset Llc Nucleoside phosphoramidates
TWI583692B (zh) 2009-05-20 2017-05-21 基利法瑪席特有限責任公司 核苷磷醯胺
US8138215B2 (en) 2009-05-29 2012-03-20 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus inhibitors
CA2763140A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 Schering Corporation Antiviral compounds composed of three linked aryl moieties to treat diseases such as hepatitis c
US8211928B2 (en) 2009-05-29 2012-07-03 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus inhibitors
WO2010138790A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 Schering Corporation Antiviral compounds composed of three aligned aryl moieties to treat diseases such as hepatitis c
PE20110679A1 (es) 2009-06-11 2011-10-20 Abbvie Bahamas Ltd Derivados de (4-tert-butilfenil)pirrolidin-2,5-difenil como inhibidores del hcv
WO2010148006A1 (en) 2009-06-16 2010-12-23 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Hepatitis c virus inhibitors
US8221737B2 (en) 2009-06-16 2012-07-17 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Hepatitis C virus inhibitors
WO2011004276A1 (en) 2009-07-06 2011-01-13 Pfizer Limited Hepatitis c virus inhibitors
CN102712700B (zh) 2009-07-13 2016-04-27 株式会社美你康 具有广谱抗菌活性的作为涂布剂的壳聚糖水凝胶衍生物
CN102656160A (zh) 2009-07-16 2012-09-05 顶点制药公司 用于治疗或预防黄病毒感染的苯并咪唑类似物
WO2011009961A1 (en) 2009-07-24 2011-01-27 Virologik Gmbh Combination of proteasome inhibitors and anti-hepatitis medication for treating hepatitis
EP2462136A1 (en) 2009-08-07 2012-06-13 Janssen R&D Ireland Phenyl ethynyl derivatives as hepatitis c virus inhibitors
EP2462135A1 (en) 2009-08-07 2012-06-13 Janssen R&D Ireland Bis-benzimidazole derivatives as hepatitis c virus inhibitors
FR2949465B1 (fr) 2009-09-01 2011-08-12 Pf Medicament Derives chromones, leur procede de preparation et leurs applications therapeutiques
BR112012004969A2 (pt) 2009-09-03 2019-09-24 Tibotec Pharm Ltd derivados de bis-benzimidazol
CN102480971B (zh) 2009-09-04 2014-11-26 杨森制药公司 化合物
WO2011031934A1 (en) 2009-09-11 2011-03-17 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Hepatitis c virus inhibitors
US9156818B2 (en) 2009-09-11 2015-10-13 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Hepatitis C virus inhibitors
SMT201700091T1 (it) 2009-09-21 2017-03-08 Gilead Sciences Inc ANALOGHI CARBA-NUCLEOSIDlCI2'-FLUORO SOSTITUITI PER TRATTAMENTO ANTIVIRALE
US8415374B2 (en) 2009-10-12 2013-04-09 Bristol-Myers Squibb Company Combinations of hepatitis C virus inhibitors
WO2011050146A1 (en) 2009-10-23 2011-04-28 Glaxosmithkline Llc Chemical compounds
UA108211C2 (uk) 2009-11-04 2015-04-10 Янссен Рід Айрленд Бензімідазолімідазольні похідні
CN102055717B (zh) 2009-11-09 2014-08-13 华为技术有限公司 快速播放的方法、终端及服务器
US20110274648A1 (en) 2009-11-11 2011-11-10 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C Virus Inhibitors
US20110269956A1 (en) 2009-11-11 2011-11-03 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C Virus Inhibitors
US20110281910A1 (en) 2009-11-12 2011-11-17 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C Virus Inhibitors
EP2503881B1 (en) 2009-11-25 2015-05-13 Merck Sharp & Dohme Corp. Fused tricyclic compounds and derivatives thereof useful for the treatment of viral diseases
US20110137633A1 (en) 2009-12-03 2011-06-09 Abbott Laboratories Anti-viral compounds and methods of identifying the same
EP2512480A4 (en) 2009-12-14 2013-05-15 Enanta Pharm Inc HEPATITIS C-VIRUS HEMMER
US8377980B2 (en) 2009-12-16 2013-02-19 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus inhibitors
US20110152246A1 (en) 2009-12-18 2011-06-23 Intermune, Inc. Novel inhibitors of hepatitis c virus replication
US20130029904A1 (en) * 2009-12-18 2013-01-31 Boehringer Ingelheim International Gmbh Hcv combination therapy
RU2554087C2 (ru) 2009-12-18 2015-06-27 Айденикс Фармасьютикалз, Инк. 5,5-конденсированные ариленовые или гетероариленовые ингибиторы вируса гепатита с
JP2013515068A (ja) 2009-12-22 2013-05-02 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーション ウイルス性疾患の治療のための縮合三環式化合物およびその使用方法
WO2011079327A1 (en) 2009-12-24 2011-06-30 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Analogues for the treatment or prevention of flavivirus infections
US8362020B2 (en) 2009-12-30 2013-01-29 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus inhibitors
ES2626150T3 (es) * 2010-01-15 2017-07-24 Gilead Sciences, Inc. Inhibidores de virus flaviviridae
WO2011091446A1 (en) 2010-01-22 2011-07-28 Glaxosmithkline Llc Chemical compounds
CN102918049A (zh) 2010-03-09 2013-02-06 默沙东公司 稠合三环甲硅烷基化合物及其用于治疗病毒性疾病的方法
MX2012011171A (es) 2010-03-31 2013-02-01 Gilead Pharmasset Llc Fosforamidatos de nucleosido.
SI2609923T1 (sl) 2010-03-31 2017-10-30 Gilead Pharmasset Llc Postopek za kristalizacijo (s)-izopropil 2-(((s)-(perfluorofenoksi) (fenoksi)fosforil)amino)propanoata
PL3290428T3 (pl) 2010-03-31 2022-02-07 Gilead Pharmasset Llc Tabletka zawierająca krystaliczny (S)-2-(((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-diokso-3,4-dihydropirymidyn-1(2H)-ylo)-4-fluoro-3-hydroksy-4-metylotetrahydrofuran-2-ylo)metoksy)(fenoksy)fosforylo)amino)propanian izopropylu
CN102869792A (zh) 2010-04-13 2013-01-09 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 预测hcv治疗中的早期病毒学应答
US20110312996A1 (en) 2010-05-17 2011-12-22 Intermune, Inc. Novel inhibitors of hepatitis c virus replication
TW201201815A (en) 2010-05-28 2012-01-16 Gilead Sciences Inc 1'-substituted-carba-nucleoside prodrugs for antiviral treatment
TW201211047A (en) 2010-06-10 2012-03-16 Gilead Sciences Inc Methods for treating HCV
PT2596004E (pt) 2010-07-19 2014-11-28 Gilead Sciences Inc Métodos para a preparação de pró-fármacos de fosforamidato diastereomericamente puros
WO2012027712A2 (en) 2010-08-26 2012-03-01 Rfs Pharma, Llc Potent and selective inhibitors of hepatitis c virus
PH12013500311B1 (en) 2010-09-20 2017-11-08 Gilead Sciences Inc 2' -fluoro substituted carba-nucleoside analogs for antiviral treatment
MX2013003631A (es) 2010-09-29 2013-10-01 Merck Sharp & Dohme Derivados de indol tetraciclicos y sus métodos para el tratamiento de enfermedades virales.
WO2012048421A1 (en) 2010-10-14 2012-04-19 Boehringer Ingelheim International Gmbh Hepatitis c inhibitor compounds
US20120107278A1 (en) 2010-10-29 2012-05-03 Pharmasset, Inc. Abbreviated hcv therapy for hcv infected patients with il28b c/c genotype
SG10201509456SA (en) 2010-11-17 2015-12-30 Gilead Pharmasset Llc Antiviral compounds
AU2011336632B2 (en) 2010-11-30 2015-09-03 Gilead Pharmasset Llc Compounds
AU2011349844B2 (en) 2010-12-20 2017-06-01 Gilead Sciences, Inc. Combinations for treating HCV
WO2012087976A2 (en) 2010-12-21 2012-06-28 Intermune, Inc. Novel inhibitors of hepatitis c virus replication
US8655250B2 (en) 2011-03-31 2014-02-18 Xerox Corporation Apparatus and method for marking material fix level control in a printing apparatus
CA2830112A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Selection of hcv treatment
WO2013000855A1 (en) 2011-06-30 2013-01-03 Santaris Pharma A/S Hcv combination therapy
AP2014007575A0 (en) 2011-09-16 2012-04-30 Gilead Pharmasset Llc Methods for treating HCV
ES2529143B1 (es) 2011-10-21 2015-10-26 Abbvie Inc. Combinación de al menos dos agentes antivirales de acción directa, ribavirina pero no interferón para uso de tratamiento del vhc
US8492386B2 (en) 2011-10-21 2013-07-23 Abbvie Inc. Methods for treating HCV
US8466159B2 (en) 2011-10-21 2013-06-18 Abbvie Inc. Methods for treating HCV
CH707030B1 (de) 2011-10-21 2015-03-13 Abbvie Inc Kombinationsbehandlung von DAAs zur Verwendung in der Behandlung von HCV
US20130109647A1 (en) 2011-10-31 2013-05-02 Gilead Pharmasset Llc Methods and compositions for treating hepatitis c virus
BR112014010295A2 (pt) 2011-10-31 2017-04-18 Gilead Pharmassett Llc métodos e composições para o tratamento de vírus de hepatite c
SMT201800470T1 (it) 2011-11-16 2018-11-09 Gilead Pharmasset Llc Imidazolilimidazoli condensati come composti antivirali
US8889159B2 (en) 2011-11-29 2014-11-18 Gilead Pharmasset Llc Compositions and methods for treating hepatitis C virus
MD4430C1 (ro) 2011-11-29 2017-03-31 Gilead Pharmasset Llc Compoziţii şi metode de tratament al hepatitei virale C
EP2907505A3 (en) 2011-12-29 2015-12-30 Abbvie Inc. Solid compositions comprising an HCV inhibitor
WO2013106639A1 (en) 2012-01-13 2013-07-18 Gilead Pharmasset Llc Crysral structure of hcv polymerase complexes and methods of use
US9056860B2 (en) 2012-06-05 2015-06-16 Gilead Pharmasset Llc Synthesis of antiviral compound
US8969588B2 (en) 2012-06-05 2015-03-03 Gilead Pharmasset Llc Solid forms of an antiviral compound
SG11201506021XA (en) 2013-01-31 2015-08-28 Gilead Pharmasset Llc Combination formulation of two antiviral compounds
TW201446286A (zh) 2013-01-31 2014-12-16 Gilead Pharmasset Llc 抗病毒化合物之固態分散調製劑
US20140249101A1 (en) 2013-03-04 2014-09-04 Gilead Pharmasset Llc Methods for treating hepatitis c virus infection
US20140343008A1 (en) 2013-05-16 2014-11-20 Gilead Pharmasset Llc Hepatitis c treatment

Also Published As

Publication number Publication date
RS56975B1 (sr) 2018-05-31
US20160354425A1 (en) 2016-12-08
HUE036588T2 (hu) 2018-07-30
PH12014500557A1 (en) 2014-05-26
BR112014006324B1 (pt) 2018-12-26
HRP20180237T1 (hr) 2018-03-09
WO2013040492A3 (en) 2013-07-25
MX2014003145A (es) 2014-04-30
SI2709613T1 (en) 2018-01-31
AU2012308295A1 (en) 2014-04-17
SI2709613T2 (sl) 2020-12-31
NZ720391A (en) 2017-10-27
CN104244945A (zh) 2014-12-24
DK2709613T3 (en) 2018-02-26
KR20140096029A (ko) 2014-08-04
EP2709613B2 (en) 2020-08-12
CY1119896T1 (el) 2018-06-27
JP6073897B2 (ja) 2017-02-01
IL231515A (en) 2017-05-29
US9393256B2 (en) 2016-07-19
KR20190075142A (ko) 2019-06-28
PL2709613T5 (pl) 2020-12-14
BR112014006324B8 (pt) 2019-02-12
SG11201400664WA (en) 2014-04-28
DK2709613T4 (da) 2020-11-16
EA201490588A1 (ru) 2015-01-30
MX354958B (es) 2018-03-27
HK1231378A1 (zh) 2017-12-22
BR112014006324A2 (pt) 2016-06-07
ES2659216T5 (es) 2021-06-09
WO2013040492A2 (en) 2013-03-21
JP6220994B2 (ja) 2017-10-25
EP2709613A2 (en) 2014-03-26
US20170189439A1 (en) 2017-07-06
EA026667B1 (ru) 2017-05-31
JP2014526516A (ja) 2014-10-06
US20130243726A1 (en) 2013-09-19
DE202012013074U1 (de) 2014-10-29
NZ623396A (en) 2016-07-29
US10456414B2 (en) 2019-10-29
CA2840242C (en) 2019-03-26
CN106166160A (zh) 2016-11-30
DE202012013074U8 (de) 2015-02-19
HRP20180237T4 (hr) 2020-12-11
PL2709613T3 (pl) 2018-05-30
KR101991298B1 (ko) 2019-06-21
ES2659216T3 (es) 2018-03-14
CO6930366A2 (es) 2014-04-28
EP2709613B1 (en) 2017-11-29
SG10201602044WA (en) 2016-04-28
CN104244945B (zh) 2016-08-31
MD4589B1 (ro) 2018-08-31
ME03009B (me) 2018-10-20
CA2840242A1 (en) 2013-03-21
ECSP14013312A (es) 2014-06-30
DE202012013382U1 (de) 2016-08-23
MX336580B (es) 2016-01-22
PE20141056A1 (es) 2014-09-05
IL231515A0 (en) 2014-04-30
CL2014000630A1 (es) 2014-11-07
PT2709613T (pt) 2018-02-16
LT2709613T (lt) 2018-02-12
MD20140035A2 (ro) 2014-08-31
AP2014007575A0 (en) 2012-04-30
AU2012308295B2 (en) 2017-10-26
UA116087C2 (uk) 2018-02-12
SMT201800087T1 (it) 2018-03-08
TR201802537T4 (tr) 2018-03-21
EA026667B9 (ru) 2017-07-31
CR20140177A (es) 2014-08-18
JP2017057230A (ja) 2017-03-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6220994B2 (ja) Ｈｃｖを処置するための方法
JP6162206B2 (ja) Ｈｃｖを処置するための組合せ
AU2011349844A1 (en) Combinations for treating HCV
HK1194692B (en) Methods for treating hcv
HK1194692A (en) Methods for treating hcv
NZ720391B2 (en) Methods for treating HCV

Legal Events

Date Code Title Description
FG4A Patent for invention issued
KA4A Patent for invention lapsed due to non-payment of fees (with right of restoration)
MM4A Patent for invention definitely lapsed due to non-payment of fees