CN102869792A - 预测hcv治疗中的早期病毒学应答 - Google Patents

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Abstract

本发明基于这样的发现，即19号染色体上的单核苷酸多态性(SNP)和接受基于干扰素的治疗的丙型肝炎病毒(HCV)患者的多样性群体中的病毒学结果之间的相关性。

Description

预测HCV治疗中的早期病毒学应答
本发明涉及预测丙型肝炎病毒(HCV)感染患者对药物治疗的应答的有用的方法。
发明背景
慢性丙型肝炎的标准护理是PEG干扰素加利巴韦林(ribavirin)的组合1。在用标准护理治疗后，整体的持续的病毒学应答(SVR)率是约50％2-4，尽管难以预测单个患者是否将实现SVR。
实现SVR的可能性随许多患者和病毒因子而改变。例如，较年轻的患者、高加索人和亚洲患者，以及没有晚期肝纤维样变性的个体更易于在治疗后清除HCV感染5-8。类似地，感染2型或3型基因型，而非1型基因型HCV的患者，以及血清中具有低基线HCV RNA水平的患者具有最佳的治愈机会2-4，6，8。
目前，仅在开始治疗后才可能更精确地预测SVR。不论HCV基因型，在治疗4或12周后清除了HCV RNA的个体比具有持续性病毒血症的患者有更好的实现SVR的机会9。快速的病毒学应答(RVR，在第4周无法检测到HCV RNA)是SVR的有力预示；相反，不能实现早期的病毒学应答(EVR，在第12周HCV RNA下降大于2倍对数log)是无应答的有力预示，不依赖于预处理的特征10。
预期地区分标准护理的潜在应答者和无应答者的能力对慢性丙型肝炎患者的护理具有巨大影响。可以基于患者应答标准护理的可能性来个性化治疗决策。例如，具有用现有的护理标准实现SVR的最低可能性的患者可以推迟治疗，直到可获得直接作用的抗病毒剂。相反，具有实现SVR的高可能性的患者可优选用已知的治疗方案立即开始疗法。
除宿主和病毒因子外，宿主的遗传多样性也影响对标准护理治疗的应答11。基因组范围的关联性研究的现有证据提示：在IL-28b基因的启动子区域中的单核苷酸多态性(SNP)强烈影响用PEG干扰素加利巴韦林治疗的患者中的SVR的可能性12-14。本分析的目标是探索在多个患者同龄组中与早期病毒学应答(EVR)和SVR均相关的SNP，所述患者包括首次接受治疗的个体，以及对先前的PEG干扰素α-2b(12KD)加利巴韦林的疗程的无应答者，所述无应答者接受过PEG干扰素α-2a(40KD)单一疗法、或用PEG干扰素α-2a(40KD)或常规干扰素加利巴韦林的组合疗法。
发明概述
本发明基于这样的发现，即在rs12979860位置处的SNP基因型和用基于干扰素的方案来治疗的患者中的EVR和SVR之间的强烈相关性。在一个实施方案中，本发明提供了预测感染了HCV的人类对象对基于干扰素的治疗的早期病毒学应答的方法，所述方法包括提供来自所述人类对象的样品，鉴定存在于单核苷酸多态性rs12979860处的核苷酸，其中，所述对象在rs12979860处存在至少一个C等位基因表示相对于在rs12979860处存在两个T等位基因的对象的更高的早期病毒学应答的可能性。
在另一个实施方案中，本发明提供了预测感染了HCV的人类对象对基于干扰素的治疗的早期病毒学应答的方法，所述方法包括提供来自所述人类对象的样品，鉴定存在于单核苷酸多态性rs12979860处的核苷酸，其中，所述对象在rs12979860处存在两个T等位基因表示相对于在rs12979860处存在至少一个C等位基因的对象的更高的无早期病毒学应答的可能性。
在另一个实施方案中，本发明提供了选择在感染了HCV的人类对象中实现持续的病毒学应答的基于干扰素的治疗的持续时间的方法，其中所述基于干扰素的治疗选自PEG干扰素α-2a与利巴韦林、PEG干扰素α-2a与直接作用的抗病毒剂、PEG干扰素α-2a与利巴韦林和直接作用的抗病毒剂，或利巴韦林与直接作用的抗病毒剂(与内源性干扰素)，所述方法包括提供来自所述人类对象的样品，鉴定存在于单核苷酸多态性rs12979860处的核苷酸，其中，所述对象在rs12979860处存在至少一个C等位基因表示相对于在rs12979860处存在两个T等位基因的对象，基于干扰素的治疗在更短的持续时间内实现持续的病毒学应答。
在另一个实施方案中，本发明提供了预测感染了HCV的人类对象对于使用PEG干扰素α-2a、利巴韦林与直接作用的抗病毒剂的治疗的应答的方法，所述方法包括提供来自所述人类对象的样品，鉴定存在于单核苷酸多态性rs12979860处的核苷酸，其中，所述对象在rs12979860处存在至少一个C等位基因表示相对于在rs12979860处存在两个T等位基因的对象，所述对象实现对所述治疗的早期病毒学应答或持续的病毒学应答的更高的可能性。
在另一个实施方案中，本发明提供了预测感染了HCV的人类对象对于使用PEG干扰素α-2A、利巴韦林与直接作用的抗病毒剂的治疗的应答的方法，所述方法包括提供来自所述人类对象的样品，鉴定存在于单核苷酸多态性rs12979860处的核苷酸，其中，所述对象在rs12979860处存在两个T等位基因表示相对于在rs12979860处存在至少一个C等位基因的对象，所述对象无法实现对所述治疗的早期病毒学应答或持续的病毒学应答的更高的可能性。
附图简介
图1：在整体1型基因型群体中，通过染色体针对rs12979860调整后的(a)SVR(b)EVR)和(c)SVR的基因组范围的关联性结果。
图2：(a)SVR和(b)EVR)的测试统计值分布的分位值-分位值图。灰色圆圈表示预期的p值，蓝色圆圈表示观察到的p值。
图3：在高加索人1型基因型群体的IL-28区域中的显著SNP(p＜10-5)的连锁不平衡。
发明详述
定义
为了便于理解本发明，下文定义了多个术语。本文中定义的术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。术语如单数形式“a”、“an”和“the”并不意在仅表示单数实体，也包括具体实例可用于示例的一般类型。本文中的术语是用于描述本发明的具体实施方案，但是除非概括在权利要求中，否则它们的使用不限定本发明。
术语对使用干扰素的治疗的“应答”是对施用活性剂的理想应答。病毒学终点包括“早期病毒学应答”(EVR)，定义为从基线至第12周血清HCV RNA下降≥2-log(由Cobas Amplicor HCV Monitor Test，v2.0，定量限制为600IU/mL)；完全EVR(cEVR)，定义为在血清中无法检测到HCV RNA(由Cobas Amplicor HCV Test，2.0版，定量限制为50IU/mL)；或和“持续的病毒学应答”(SVR)，定义为24周的未治疗随访期结束时，无法检测到HCV RNA(＜50IU/mL)。
术语“样品”或“生物学样品”指从个体分离的组织或液体样品，包括但不限于组织活体检查、血浆、血清、全血、脊髓液、淋巴液、皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的外切片、泪液、唾液、乳汁、血细胞、肿瘤、器官。还包括体外细胞培养物成分的样品(包括但不限于从培养基中的细胞生长获得的条件培养基、推定感染病毒的细胞、重组细胞和细胞组分)。
术语“干扰素”和“干扰素-α”在本文中可互换的使用，指抑制病毒复制和细胞增殖，并调节免疫应答的高度同源的物种特异性蛋白质家族。典型的合适干扰素包括但不限于重组干扰素α-2b(例如可获得自ScheringCorporation，Kenilworth，N.J.的
Figure BDA00002256478300041
A干扰素)、重组干扰素α-2a(例如可获得自Hoffmann-La Roche，Nutley，N.J.的
Figure BDA00002256478300042
-A干扰素)、重组干扰素α-2C(例如可获得自Boehringer Ingelheim Pharmaceutical，Inc.，Ridgefield，Conn.的
Figure BDA00002256478300043
α2干扰素)、干扰素α-n1，纯化的天然α干扰素的掺合物(例如可获得自Sumitomo，Japan的
Figure BDA00002256478300044
或可获得自Glaxo-Wellcome Ltd.，London，Great Britain的
Figure BDA00002256478300045
干扰素α-n1(INS))、或者共有α干扰素(例如在美国专利号4,897,471和4,695,623中描述的那些(特别地其实施例7、8或9)，或可获得自Amgen，Inc.，Newbury Park，Calif.的特定产品)、或者干扰素α-n3，由干扰素Sciences生产的天然α干扰素的混合物，可以商标名Alferon获得自PurdueFrederick Co.，Norwalk，Conn.。使用干扰素α-2a或α-2b是优选的。干扰素可包括下文定义的PEG化的干扰素。
术语“PEG化干扰素”、“PEG化干扰素α”和“PEG干扰素”在本文中可互换的使用，意指干扰素α(优选干扰素α-2a和α-2b)的聚乙二醇修饰的缀合物。典型的合适PEG化干扰素α包括但不限于
Figure BDA00002256478300051
和
Figure BDA00002256478300052
术语“利巴韦林”指化合物1-((2R，3R，4S，5R)-3，4-二羟-5-羟甲基-四氢-呋喃-2-基)-1H-[1，2，4]三唑-3-羧酸酰胺，其是合成的、非干扰素诱导型的、广谱抗病毒核苷类似物，可以名称
Figure BDA00002256478300053
和
Figure BDA00002256478300054
获得。
“直接作用的抗病毒剂”产生不依赖于免疫功能的特定抗病毒效应。用于HCV的直接作用的抗病毒剂的实例包括但不限于蛋白酶抑制剂、聚合酶抑制剂、NS5A抑制剂、IRES抑制剂和解旋酶抑制剂。
目前为慢性丙型肝炎患者推荐的第一线治疗是在携带1型或4型基因型病毒的患者中，用PEG化干扰素α与利巴韦林组合达48周，而在携带2型或3型基因型病毒的患者中达24周。发现在一个或多个干扰素α疗程后复发的患者中，以及之前未受治疗的患者中，用利巴韦林的组合治疗比干扰素α单一疗法更有效。然而，利巴韦林表现出显著的副作用，包括致畸性和致癌性。此外，利巴韦林导致溶血性贫血，需要在约10-20％的患者中降低剂量或中断利巴韦林疗法，这可能与利巴韦林三磷酸在红细胞中的积累有关。因此，为了降低治疗成本和负面事件的发生，将治疗调整为较短的持续时间同时不损害疗效是理想的。对于1型基因型患者，使用PEG化干扰素α和利巴韦林的缩短的“治疗持续时间”可以是例如24周。对于1型基因型患者，使用PEG化干扰素α和利巴韦林与直接作用的抗病毒剂组合的缩短的治疗持续时间可短至8周、12周或16周。
在本文中，术语“等位基因”和“等位变体”指基因的备选形式，包括内含子、外显子、内含子/外显子接点和与基因或其部分相关的3′和/或5′非翻译区。一般而言，等位基因占据了同源染色体上的相同基因座或位置。当对象具有基因的两个相同的等位基因时，称所述对象对于所述基因或等位基因是纯合的。当对象具有基因的两个不同的等位基因时，称所述对象对于所述基因是杂合的。特定基因的等位基因可以在单个核苷酸或若干个核苷酸处彼此不同，并且可以包括核苷酸的替换、缺失和插入。
在本文中，术语“多态性”指共存一个以上的核酸形式，包括外显子和内含子，或其部分(例如，等位变体)。具有至少2个不同形式的基因部分(即，两种不同的核苷酸序列)被称为基因的多态性区域。多态性区域可以是单个核苷酸，即“单核苷酸多态性”或“SNP”，所述单个核苷酸在不同等位基因中是不同的。多态性区域还可以是若干个核苷酸长。
多种用于检测多态性的方法是已知的并可与本发明联合使用。一般而言，包括直接(例如原位杂交)或间接(鉴定次级分子的改变，例如蛋白质序列或蛋白质结合)地鉴定下层(underlying)核酸序列中的一个或多个突变。
检测多态性的一种普遍已知的方法是使用探针进行等位基因特异性杂交，所述探针与突变或多态性位点重叠，并具有突变或多态性区域周围的约5、10、20、25或30个核苷酸。为了在试剂盒中使用，向使用者提供例如若干个能够与等位基因变体(如单核苷酸多态性)特异性杂交的探针，或者所述探针甚至附着在固相支持物(例如珠或芯片)上。
单核苷酸多态性“rs12979860”指通过其在SNP数据库(dbSNP，www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)中的登录号鉴定的SNP，它位于人的19号染色体的IL28b基因的启动子区域中。
对来自两个大型多国研究的数据进行此分析的结果(描述在实施例章节中)验证并拓展了由Ge等人首次报道12的IL28b区域中的SNP和用PEG干扰素加利巴韦林治疗后的SVR之间的显著关联。在本分析中，最佳SNP(rs1297980)与EVR(p＝5.0×10-26)和SVR(p＝1.4×10-21)均关联。本研究的独有优点在于包括了下文所述的患者，以及具有良好谱系的大型亚组的无应答者的本质，所述患者不仅在用PEG干扰素α-2a(40KD)加利巴韦林治疗后实现了SVR，还在用PEG干扰素α-2a(40KD)单一疗法和常规干扰素加利巴韦林的组合的治疗后实现了SVR。
本研究允许产生若干个独特的提示。首先，我们提示了rs12979860的作用最可能是对EVR而非SVR产生的。与EVR而非SVR的关联性是在之前的对治疗无应答者中，和在用PEG干扰素α-2a(40KD)单一疗法或用常规干扰素加利巴韦林来治疗的患者中观察到的。我们将此解释为意味着该SNP发挥作用的机制与血清HCV RNA水平中的快速第一期下降相关，而不与较慢第二期下降或肝细胞转化相关。HCV RNA的第一期下降是经过充分描述的现象，其在基于干扰素的疗法起始后不久发生，提示为是特别的患者对干扰素的敏感性的标志19。
之后，该研究中使用的特别的芯片允许我们对除rs12979860外的一系列SNP的显著性等级进行排序，所有的SNP都是在之前的研究中鉴定的12-14，20，21。虽然在IL28b区域中鉴定了若干高度显著的标志物，在针对rs1297980调整后它们却无一与SVR显著相关。在针对rs12979860调整后，仅一个SNP(rs8099917)与EVR统计显著相关；然而，在针对多重比较调整后，上述关联性也不被视为是显著的。
此外，通过针对rs12979860调整，我们能够开始探索潜在的基因-基因相互作用，所述相互作用可以影响实现病毒学应答的可能性。如前所述，在此方法之后，在初步分析中在IL28b区域中鉴定的的其他高度显著的SNP无一保留；然而，揭示了位于4号染色体上的一系列之前未报道过的SNP。
在包括上述研究在内的多个回顾性研究中获得的一致结果12-14，20-23允许我们自信地认为在IL28b的启动子区域中的SNP与使用基于干扰素的疗法的治疗结果高度相关。已经提示在该区域中多个启动子之一中的变化改变了干扰素入的肝细胞表达。干扰素入是III型干扰素，触发与I型干扰素(包括干扰素α)的Jak/Stat途径重叠的信号传递途径24-26。我们假设在具有“允许的(permissive)”SNP的患者中，HCV感染诱导局部生产干扰素，包括III型干扰素(例如IL28)。这导致在肝脏中干扰素诱导的基因表达。该假设与之前的报道一致，即对基于干扰素的疗法的无应答者在疗法开始前，其肝脏中具有增加的干扰素刺激型基因(ISG)的肝表达，并且处于明显的“预活化”状态27。尚未能清楚解释在内源性ISG诱导水平和随后对干扰素疗法的应答之间的明显矛盾的关系。一些研究人员推测与蛋白激酶PKR相似的ISG诱导对轴的某些下游效应可能通过磷酸化真核起始因子2α(eIF2α)抑制内源性蛋白质生产，并导致对外源性干扰素的进一步刺激不应的(refractory)的肝细胞不能进一步减弱蛋白质生产28。HCV RNA通过内部的核糖体进入位点被翻译，且部分地不依赖于eIF2a。因此，尽管是“预活化的”状态，可以不减弱地继续HCV RNA的复制和其他病毒粒子的装配28。该假设解释了为何在我们的分析中，较之更可治疗的基因型，弱应答的GWAS基因型与更低的病毒负载相关，尽管之前的分析提示增加的基线病毒负载是差的治疗结果的标志6。干扰素的内源性生产部分地损害了病毒复制，但同时也损害了这些患者中的宿主细胞蛋白质合成。可能存在这样的阈值，在所述阈值之上，宿主细胞不能进一步减少蛋白质生产或增加ISG的刺激。因此，外源性干扰素不能增强宿主应答。然而，与此相矛盾的是，施用外源性PEG化干扰素可以“拯救”对内源性干扰素较不敏感的患者。遗传多态性可能在ISG表达中发挥作用。这致使我们推测最终可能能够选择性地靶向干扰素途径，以生产导致根除HCV的更有利的ISG谱。
更具有挑战性地是解释4号染色体中的SNP与SVR而不与EVR相关的可能机制。最简单的解释可能需要该区域中的基因涉及仅与SVR相关的现象，例如肝细胞转化。该机制还可能涉及额外的宿主-宿主或宿主-病毒基因相互作用，藉此两个基因座都产生其效应，并需要进一步的仔细评估。
在IL28b区域中发现的干扰素治疗易感性基因座对使用现有的护理标准(SOC)的疗法(即，PEG干扰素加利巴韦林)具有启示作用。在不久的将来，可以设想在一些患者中，在疗法开始前确定IL28b基因型，并且将所述患者不仅通过HCV基因型分类(如目前推荐的1)，而且通过人的基因型分类。与目前的治疗规范相反，初始治疗方案将基于病毒的和人的基因型。需要在预期的试验中论述利巴韦林在上下文中的推定的作用。
该发现还对正在进行的用于HCV疗法的直接作用的抗病毒剂研发项目具有启示作用。直接作用的抗病毒剂产生不依赖于免疫功能的特定抗病毒效应，但认为至少一些研发中的药物类型可受益于累加的(如果不是协同的)先天性免疫调节效应。实际上，基于干扰素的疗法很可能将保留治疗的骨架，因为需要阻止出现抗性HCV.29HCV RNA编码可以抑制I型干扰素的诱导的蛋白质。例如，HCV的NS3-4A蛋白酶通过干扰干扰素调控因子-3(IRF-3)的磷酸化作用，阻断dsRNA-诱导的干扰素生产30。因此，NS3-4A蛋白酶是双治疗靶，抑制其可以阻断病毒复制和恢复IRF-3对HCV RNA复制的控制。当与第二种小分子或标准护理组合施用时具有强抗病毒效应的蛋白酶抑制剂(例如特拉匹韦(Telaprevir))还抑制HCV籍以损害宿主干扰素应答的蛋白酶的功能。重要的是观察当在具有干扰素不应的和干扰素敏感的IL28b表现型的患者中组合直接作用的抗病毒剂与PEG干扰素加利巴韦林时，治疗结果是否相似。干扰素不应的患者对三重疗法(直接作用的抗病毒剂加PEG干扰素加利巴韦林)的应答可能与其仅接受使用直接作用的抗病毒剂的单一疗法相似。如果情况如上所述，则在用药物(例如特拉匹韦)治疗的过程中，具有干扰素不应的IL28b表现型的患者对抗性突变的选择更易感31。这些可能性提示了这样的情形，其中具有干扰素易感的SNP(rs12979860)的患者可能受益于使用PEG干扰素和利巴韦林的缩短的治疗，而具有干扰素不应的基因型的患者可能是延长的治疗持续时间和/或更密集的治疗方案的候选对象。备选地，对于具有干扰素不应的基因型的患者而言，直接作用的抗病毒剂的不含干扰素的组合方案可为更恰当的。
我们独特的数据集突出了rs12979860SNP与EVR而非SVR的关联，所述数据集包括对先前对使用PEG化干扰素标准护理的无应答者的患者的PEG干扰素α-2a加利巴韦林疗法的注册试验。换言之，该SNP定义了患者对干扰素的应答，而不是对疗法的最终应答，并由于他们实现EVR的可能性因此帮助鉴定可能或不太可能经历SVR的患者。它不太可能独立于EVR来预测SVR。这对于一起使用直接作用的抗病毒剂与干扰素具有巨大的启示作用。
利用干扰素应答的基线遗传预示允许调整直接作用的抗病毒疗法，以及干扰素的标准护理。被定义为干扰素应答性低下的患者(即，在rs12979860中2个T等位基因)可以是下文所述的小分子治疗剂的差的候选对象，所述小分子治疗剂依赖于内源性或外源性干扰素介导的途径的累积或协同效应——特别地如果其是作为除SOC外的单种活性剂提供的。应关心的是由于有效的单一疗法的结果，这些患者具有增加的出现药物抗性突变的风险。
相反，具有干扰素应答表现型(即，在rs12979860中2个C等位基因)的患者是对只使用SOC或与小分子的组合的疗法的较短疗程的优秀候选对象。干扰素应答性的遗传素质(predisposition)所允许的其他考虑是“协调”直接作用的抗病毒剂的组合。预测具有可接受的内源性干扰素应答的患者可以是靶向病毒功能的药物(例如，对内源性干扰素应答也具有抑制性作用的蛋白酶抑制剂)的优秀候选对象，以及减少病毒PAMP(病原体相关分子模式)量的药物(例如，聚合酶抑制剂)的较差的候选对象，因其可损害患者通过患者的内源性干扰素应答来促进自身治愈的能力。类似地，较之单独的直接作用的抗病毒剂，或三重疗法(SOC与一种DAA)，预测具有低下的干扰素应答的患者可为以“四重”疗法作为第一线疗法(2种直接作用的抗病毒剂，加入到PEG干扰素和利巴韦林)的候选对象。
实施例
方法
患者样品收集和病毒学终点
分析2次大型的多国随机性III期试验中招募的患有慢性丙型肝炎患者亚群的样品3，15。在一个研究中，首次接受干扰素的患者随机接受为其48周的仅使用PEG干扰素α-2a(40KD)，或与利巴韦林组合，或常规干扰素α-2b加利巴韦林的治疗3。仅前12周疗程中对PEG干扰素α-2b(12KD)加利巴韦林的无应答者有资格进行第二个试验，其中，使患者随机接受为期48或72周的、使用PEG干扰素α-2a(40KD)的标准或诱导剂量方案的治疗15(全部患者接受标准剂量的利巴韦林)。研究设计、入选和排除标准以及这些试验的初步结果公开在别处3，15。
从同意参与遗传分析的患者收集的血液样品储藏在罗氏临床样品储藏库(Roche Clinical Sample repository)中。在罗氏临床样品储藏库中提取DNA，并归一化为50ng/μL。使用Y染色体特异性TaqMan测定(AppliedBiosystems，Foster City，CA)首先对样品进行质量检查，评估DNA量和性别与符合临床数据。
病毒学终点包括定义为从基线至第12周血清中无法检测到HCV RNA(由Cobas Amplicor HCV Test，2.0版，检测限制50IU/mL)或血清HCVRNA下降≥2-log(由Cobas Amplicor HCV Monitor Test，2.0版，定量限制600IU/mL)的早期病毒学应答(EVR)和定义为在24周的未治疗随访期结束时，无法检测到HCV RNA(＜50IU/mL)的持续的病毒学应答(SVR)。
在SVR的GWAS分析中，应答者组由来自首次接受干扰素的研究群体的具有SVR的全部1型基因型患者组成。无应答者由1)来自由PEG化干扰素治疗再次攻击的研究群体的全部1型基因型非SVR患者，和2)来自用PEG化干扰素和利巴韦林治疗的首次接受干扰素的研究群体的1型基因型的非SVR患者组成。
因此，来自由PEG化干扰素再次攻击的研究群体的群体的全部应答者被排除在本分析之外。
在EVR的GWAS分析中，EVR组由来自首次接受干扰素的研究群体的具有EVR的全部1型基因型患者组成。非EVR组由1)来自用PEG化干扰素再次攻击的患者群体的全部患者，和2)来自首次接受治疗的研究群体的用PEG化干扰素+利巴韦林治疗的1型基因型非EVR患者组成。
分别在每个试验中，在非1型基因型的患者中的自报道的高加索人的IL28B区域SNP中进行额外的探索性研究。(参见结果章节的细节)。
基因分型数据分析
使用HumanOmni1Quad(v1.0)芯片和iScan扫描仪，在Illumina
Figure BDA00002256478300121
HD Assay Super上对样品的1,016,423个标志物进行基因分型。实施初始质量控制以由于重复样品间的不一致的定型(call)、过剩杂合性、低定型率(＜0.95)、簇分离、GenTrain分数、强度和簇宽度来消除SNP。共计25个样品未能通过初始质量检查或后续的基因分型尝试。在质量控制后，生成了具有基因型定型的1,002,139个SNP。计算自报告的高加索人群体的每条染色体的SNP数、等位基因频率分布和哈迪温伯格平衡。
统计学分析
在单变量逻辑回归模型中评估病毒学应答(EVR或SVR)和基线变量(年龄、体重指数[BMI]、HCV RNA水平和ALT商作为连续变量输入；性别、HCV基因型、组织学诊断(存在或不存在肝硬化)和人种作为分类变量输入)之间的关联性。
在针对基线BMI、性别、年龄、病毒负载、ALT商和主成分分析(PCA)组分调整后，使用逻辑回归(PROC LOGISTIC，SAS v9.2)测试个体SNP和应答/不应答之间的关联性。
如Purcell等人提出的16，使用以总群体(“pgt”)创造的祖先数据集，基于PCA进行祖先分析。总群体补充了来自11个不同种族的对象集的HapMap III期创立者，并在SAS JMP Genomics(SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA)中进行分析。比较具有或没有异常值的PCA组分。异常值被定义为这样的个体，所述个体的祖先距离在前十个推断的变异轴之一上的平均值至少6倍标准差。
去除位于X和Y染色体或线粒体DNA上的SNP，以及在HapMap III期创立者中没有基因分型的SNP(释放数27)，或者在具有已知的高度连锁不平衡的区域(Chr5，44-51.5Mb；Chr6，24-36Mb；Chr8，8-12Mb；Chr11，42-58Mb；Chr17，40-43Mb)中的SNP。使用窗口大小1000，r2＜0.25和窗口偏移100的PLINK16使剩余的SNP稀疏。
通过逻辑回归分析来测试在病毒学应答(EVR和SVR)和单个SNP之间的关联性。针对基线特征(BMI、性别、年龄、基线HCV RNA水平、ALT商数和PCA组分)进行调整。通过似然比测试(LRT)评估显著性。
无效模型定义如下：
病毒学应答＝BMI+性别+年龄+HCV RNA水平+ALT商+PCA组分。
在无效模型中，假定SNP的遗传效应为0.
备选模型定义如下
病毒学应答＝BMI+性别+年龄+HCV RNA水平+ALT商+PCA组分+SNP。
使用LRT比较每个备选模型(即，含SNP的)的最大可能性估计量与相应的无效模型(即，不含SNP的)，其具有χ平方分布和等于不同参数数量的自由度。SNP作为连续变量(0、1、2)输入模型中。PCA组分代表分析群体中最高的5个组分。在自报告的高加索人群体和非1型基因型群体中运行相似的模型。
在高加索人“pgt”群体的IL-28区域中的显著SNP(p＜10-5)中计算连锁不平衡(LD)。在Haploview v4.117中生成r2的LD图，LD块是通过Gabriel等人的方法18推断的。
结果
可获得共计406名首次接受治疗的患者和426名未对之前用PEG干扰素α-2b(12KD)治疗的过程应答的患者的样品。EVR分析基于来自800名患者的数据，包括363名实现了EVR的个体(45％)和437名未实现EVR的个体(55％)。SVR分析基于来自663名患者的数据，包括245名实现了SVR的个体(37％)和418名未实现SVR的个体(63％)。表1中显示了包括在EVR和SVR分析中的患者的基线特征。
基线因子的单变量逻辑回归模型显示HCV基因型(p＝1.50×10-25)、年龄(5.80×10-18)、ALT商(p＝7.50×10-10)、人种(p＝9.20×10-7)、BMI(p＝4.70×10-5)和组织学诊断(p＝1.30×10-5)与EVR显著相关，而HCV因型(p＝4.30×10-27)、年龄(p＝5.50×10-18)、ALT商(p＝2.10×10-8)、人种(p＝2.10×10-8)、组织学诊断(p＝5.40×10-7)、BMI(p＝7.20×10-6)和HCV RNA水平(p＝0.0022)与SVR显著相关。应注意的是，性别既不与EVR也不与SVR显著相关，而HCV RNA水平不与SVR显著相关。
全体1型基因型群体中的GWAS结果
由于高的血缘关系系数(表示高度的亲缘关系)，排除了共计4个分析了基因型的样品。来自1型基因型患者的数据的分析包括了627名具有已知的EVR状态的患者(215名应答者[34.3％]和412名无应答者[65.7％])和516名具有已知的SVR状态的患者(128名应答者[24.8％]和388名无应答者[75.2％])。
图1中通过染色体展示了SVR和EVR的基因组范围关联性的结果。在19号染色体的IL-28区域中鉴定出一系列高度显著的p值。分位值-分位值图显示预期的p值和观察的p值紧密符合，除了与19号染色体相关的p值的一些大的偏差(图2)。对SVR和EVR的逻辑回归分析分别揭示了12和19个SNP，p＜10-5(表2)。
与SVR和EVR分别相关的前6个SNP是相同的，都落入了19号染色体的IL-28区域内。SVR和EVR的前2个SNP是rs12979860(分别为p＝1.4×10-21和p＝5.0×10-26)和rs12980275(分别为p＝5.8×10-18和p＝4.9×10-23)。与SVR相关的剩余的6个SNP中(表2)，无一与EVR相关，无一位于19号染色体上，且4个(rs943897、rs17671102、rs4961441和rs1892723)可能是由于稀有纯合子类别中的少数观察结果(BB＜10名个体)的假相关。在与EVR相关的剩余的13个SNP中(表2)，无一与SVR相关，仅1个位于19号染色体上，且2个(rs1189800和rs4975629)可能是假相关。
表3中显示了总群体和自报告的高加索人亚群的任何SVR和EVR模型的p＜10-5的全部SNP的逻辑回归分析。当在针对rs12979860的效应进行调整之后重复分析时，无一标志物与SVR显著相关，且仅1个标志物与EVR显著相关(rs8099917，p＝0.0130)。
表3中显示的对IL-28区域中的SNP之间的连锁不平衡的后续研究表明了一个具有高度连锁不平衡的簇(在rs12979860和rs12980275之间，r2＝0.98)和下游的包含rs12980275、rs12979860、rs8109886和rs8099917的第二个SNP簇(图3)。
图1c中显示了针对rs12979860调整后的SVR的基因组范围的结果。在针对rs12979860调整并选入了额外的无应答者之后的逻辑回归分析结果揭示了p＜10-5的另外10个SNP(表4)。令人感兴趣的是，最显著的5个中的3个(rs10009948、rs10023606和rs7673763)位于4号染色体上。令人好奇的是，这些仅与SVR相关而不与EVR相关。
解释性分析在高加索人自报告群体中的rs12979860
为了更好地表征和理解在IL28B之间的相关性，首先在自报告的高加索人群体中的非1型基因型中探索了rs12979860之间的相关性。使用与GWAS相同的逻辑回归模型，以5％名义第一类错误，在SVR和rs12979860C等位基因数量之间观察到了临界的显著相关性(OR＝1.88，95％CI＝[0.97；3.67]，p＝0.06)。类似地，在EVR和rs12979860C等位基因数量之间的显著相关性(OR＝2.27，95％CI[1.12；4.70]，p＝0.02)。
此外，还2个试验中分别描述了rs12979860之间的相关性。在首次接受治疗的群体中，观察到了EVR和rs12979860C等位基因之间的相关性，OR为大约5(OR＝4.9895％CI[2.35；10.53]，p＝2.6×10-5)。在全部3个治疗层次中都持续观察到了相关性。
在PEG化干扰素疗法失败的患者群体中，没有发现与持续性病毒应答的相关性。然而，当比较EVR(N＝185)和无EVR(N＝154)时，与rs12979860的相关性持续存在(OR＝1.91[1.22；2.96]，p＝0.003)。相关性不依赖于基线时的病毒负载、性别、年龄、治疗和ALT商。
根据本公开内容，可以在不进行过多的实验的条件下，制备和执行本文中公开和要求保护的全部组合物和/或方法。虽然本发明的组合物和方法是按照优选的实施方案描述的，但对本领域技术人员显而易见的是可以在不脱离本发明的主旨、范围和概念范围内，对本文描述的组合物和/或方法、方法中的步骤或步骤的顺序进行改变。对本领域技术人员显而易见的全部此类相似的取代和修改都被视为落入由所附权利要求限定的本发明的主旨、范围和概念范围内。
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Claims (21)

1.预测感染了HCV的人类对象对于基于干扰素的治疗的早期病毒学应答的方法，所述方法包括：
提供来自所述人类对象的样品并鉴定存在于单核苷酸多态性rs12979860处的核苷酸，其中，所述对象中rs12979860处存在至少一个C等位基因表示相对于rs12979860处存在两个T等位基因的对象的更高的早期病毒学应答的可能性。
2.权利要求1的方法，其中所述对象感染了1型基因型HCV。
3.权利要求2的方法，其中先前没有用干扰素治疗过所述对象。
4.权利要求3的方法，其中所述基于干扰素的治疗包含选自PEG干扰素α-2a单一疗法、PEG干扰素α-2a与利巴韦林，或干扰素α-2b与利巴韦林的治疗。
5.权利要求2的方法，其中所述对象没有从先前的PEG干扰素α-2b与利巴韦林的治疗中实现早期病毒学应答。
6.权利要求5的方法，其中所述基于干扰素的治疗包含PEG干扰素α-2a与利巴韦林。
7.预测感染了HCV的人类对象对于基于干扰素的治疗的早期病毒学应答的方法，所述方法包括：
提供来自所述人类对象的样品并鉴定存在于单核苷酸多态性rs12979860处的核苷酸，其中，所述对象中rs12979860处存在两个T等位基因表示相对于rs12979860处存在至少一个C等位基因的对象的更高的无早期病毒学应答的可能性。
8.权利要求7的方法，其中所述对象感染了1型基因型HCV。
9.权利要求8的方法，其中先前没有用干扰素治疗过所述对象。
10.权利要求9的方法，其中所述基于干扰素的治疗包含选自PEG干扰素α-2a单一疗法、PEG干扰素α-2a与利巴韦林，或干扰素α-2b与利巴韦林的治疗。
11.权利要求8的方法，其中所述对象没有从先前的PEG干扰素α-2b与利巴韦林的治疗中实现早期病毒学应答。
12.权利要求11的方法，其中所述基于干扰素的治疗包含PEG干扰素α-2a与利巴韦林。
13.选择在感染了HCV的人类对象中实现持续的病毒学应答的基于干扰素的治疗的持续时间的方法，其中所述基于干扰素的治疗选自PEG干扰素α-2a与利巴韦林，PEG干扰素α-2a与直接作用的抗病毒剂、PEG干扰素α-2a与利巴韦林和直接作用的抗病毒剂，或利巴韦林与直接作用的抗病毒剂(以及内源性干扰素)，所述方法包括：
提供来自所述人类对象的样品并鉴定存在于单核苷酸多态性rs12979860处的核苷酸，其中，所述对象中rs12979860处存在至少一个C等位基因表示相对于rs12979860处存在两个T等位基因的对象，所述基于干扰素的治疗在更短的持续时间内实现持续的病毒学应答。
14.权利要求13的方法，其中所述对象感染了1型基因型HCV。
15.权利要求14的方法，其中所述直接作用的抗病毒剂是HCV蛋白酶抑制剂。
16.预测感染了HCV的人类对象对于使用PEG干扰素α-2a、利巴韦林与直接作用的抗病毒剂治疗的应答的方法，所述方法包括：
提供来自所述人类对象的样品并鉴定存在于单核苷酸多态性rs12979860处的核苷酸，其中，所述对象中rs12979860处存在至少一个C等位基因表示相对于在rs12979860处存在两个T等位基因的对象，所述对象对于所述治疗实现早期病毒学应答或持续的病毒学应答的更高的可能性。
17.权利要求16的方法，其中所述对象感染了1型基因型HCV。
18.权利要求17的方法，其中所述直接作用的抗病毒剂是HCV蛋白酶抑制剂。
19.预测感染了HCV的人类对象对于使用PEG干扰素α-2A、利巴韦林与直接作用的抗病毒剂治疗的应答的方法，所述方法包括：
提供来自所述人类对象的样品并鉴定存在于单核苷酸多态性rs12979860处的核苷酸，其中，所述对象中rs12979860处存在两个T等位基因表示相对于rs12979860处存在至少一个C等位基因的对象，所述对象对于所述治疗无法实现早期病毒学应答或持续的病毒学应答的更高的可能性。
20.权利要求19的方法，其中所述对象感染了1型基因型HCV。
21.权利要求20的方法，其中所述直接作用的抗病毒剂是HCV蛋白酶抑制剂。
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